BRPI0916355B1 - Vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo isolado, e, método para produzir um precursor de piripiropeno a - Google Patents
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Abstract
POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR RECOMBINANTE, TRANSFORMANTE, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRECURSOR DE PIRIPIROPENO A São revelados um polinucleotídeo inédito isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo envolvido na biossíntese de piripiropeno A, um vetor recombinante compreendendo o polinucleotídeo e uni transformante compreendendo o polinucleotídeo. Pela presente invenção, são fornecidos um gene biossintético de piripiropeno A usado para a produção de um análogo de piripiropeno inédito, melhoria da produtividade de uma bactéria produtora de piripiropeno A, produção de um agente inseticida para microrganismos, criação de uma planta resistente a pestes de insetos ou similares.
Description
[0001] Este pedido de patente reivindica a prioridade do pedido de patente Japonesa 190862/2008, que foi depositado em 24 de julho de 2008, pedido de patente Japonesa 270294/2008, que foi depositada em 20 de outubro de 2008, e pedido de patente Japonesa 20591/2009, que foi depositado em 30 de janeiro de 2009, e os conteúdos totalmente revelados de todos são aqui incorporados como parte da revelação do presente pedido pela referência.
[0002] A presente invenção diz respeito a um gene biossintético de piripiropeno A.
[0003] Da maneira revelada em pedido de patente submetido à inspeção pública 360895/1992 (Documento da patente 1) e Journal of Antibiotics (1993), 46(7), 1168-9 (documento não relacionado à patente 1), piripiropeno A apresenta uma atividade inibitória contra ACAT (acil CoA colesterol aciltransferase). A aplicação desta no tratamento de doenças causadas por acúmulo de colesterol ou similares é esperada.
[0004] Adicionalmente, no Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japão (1998), Vol. 56, No. 6, 478-488 (documento não relacionado à patente 2), WO94/09147 (Documento da patente 2), pedido de patente submetido à inspeção pública 184158/1994 (Documento da patente 3), pedido de patente submetido à inspeção pública 239385/1996 (Documento da patente 4), pedido de patente submetido à inspeção pública 259569/1996 (Documento da patente 5), pedido de patente submetido à inspeção pública 269062/1996 (Documento da patente 6), pedido de patente submetido à inspeção pública 269063/1996 (Documento da patente 7), pedido de patente submetido à inspeção pública 269064/1996 (Documento da patente 8), pedido de patente submetido à inspeção pública 269065/1996 (Documento da patente 9), pedido de patente submetido à inspeção pública 269066/1996 (Documento da patente 10), pedido de patente submetido à inspeção pública 291164/1996 (Documento da patente 11) e no Journal of Antibiotics (1997), 50(3), 229-36 (documento não relacionado à patente 3), análogos e derivados de piripiropeno, bem como atividades inibitórias de ACAT destes foram revelados.
[0005] Adicionalmente, Applied and Environmental Microbiology (1995), 61(12), 4429-35 (documento não relacionado à patente 4) revelou que piripiropeno A apresenta uma atividade inseticida contra a larva Helicoverpa armigera. Ainda adicionalmente, WO2004/060065 (Documento da patente 12) revelou que piripiropeno A apresenta atividades de inseticida contra larva de traça das crucíferas e Tenebrio molitor.
[0006] Além do mais, WO2006/129714 (Documento da patente 13) e WO2008/066153 (Documento da patente 14) revelaram que os análogos de piripiropeno apresentam atividades de inseticida contra afídios.
[0007] Além do mais, como uma bactéria produtora de piripiropeno A, a cepa de Aspergillus fumigatus FO-1289 é revelada no pedido de patente submetido à inspeção pública 360895/1992 (Documento da patente 1); a cepa de Eupenicillium reticulosporum NRRL-3446 está em Applied and Environmental Microbiology (1995), 61(12), 4429-35 (documento não relacionado à patente 4); e a cepa de Penicillium griseofulvum F1959 está em WO2004/060065 (Documento da patente 12); e a cepa de Penicillium coprobium PF1169 está no Journal of Technical Disclosure 500997/2008 (Documento da patente 15).
[0008] Igualmente, como uma via biossintética de piripiropeno A, Journal of Organic Chemistry (1996), 61, 882-886 (Documento não relacionado à patente 5) e Chemical Review (2005), 105, 4559-4580 (Documento não relacionado à patente 6) revelaram uma via biossintética putativa na cepa de Aspergillus fumigatus FO-1289. Estes documentos revelaram que, na cepa de Aspergillus fumigatus FO-1289, estruturas parciais sintetizadas individualmente por policetídeo sintase e preniltransferase são ligadas para sintetizar piripiropeno A por uma ciclase.
[0009] [Documento da patente 1] pedido de patente submetido à inspeção pública 360895/1992
[0010] [Documento da patente 2] WO94/09147
[0011] [Documento da patente 3] pedido de patente submetido à inspeção pública 184158/1994
[0012] [Documento da patente 4] pedido de patente submetido à inspeção pública 239385/1996
[0013] [Documento da patente 5] pedido de patente submetido à inspeção pública 259569/1996
[0014] [Documento da patente 6] pedido de patente submetido à inspeção pública 269062/1996
[0015] [Documento da patente 7] pedido de patente submetido à inspeção pública 269063/1996
[0016] [Documento da patente 8] pedido de patente submetido à inspeção pública 269064/1996
[0017] [Documento da patente 9] pedido de patente submetido à inspeção pública 269065/1996
[0018] [Documento da patente 10] pedido de patente submetido à inspeção pública 269066/1996
[0019] [Documento da patente 11] pedido de patente submetido à inspeção pública 291164/1996
[0020] [Documento da patente 12] WO2004/060065
[0021] [Documento da patente 13] WO2006/129714
[0022] [Documento da patente 14] WO2008/066153
[0023] [Documento da patente 15] Journal of Technical Disclosure 500997/2008
[0024] [Documento não relacionado à patente 1] Journal of Antibiotics (1993), 46(7), 1168-9
[0025] [Documento não relacionado à patente 2] Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japão (1998), Vol. 56, No. 6, 478-488
[0026] [Documento não relacionado à patente 3] Journal of Antibiotics (1997), 50(3), 229-36
[0027] [Documento não relacionado à patente 4] Applied and Environmental Microbiology (1995), 61(12), 4429-35
[0028] [Documento não relacionado à patente 5] Journal of Organic Chemistry (1996), 61, 882-886
[0029] [Documento não relacionado à patente 6] Chemical Review (2005), 105, 4559-4580
[0030] Os presentes inventores observam agora uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo envolvido na biossíntese de piripiropeno A. A presente invenção foi realizada com base em tais achados.
[0031] Dessa maneira, um objetivo da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo inédito isolado com uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo envolvido na biossíntese de piripiropeno A, um vetor recombinante compreendendo o polinucleotídeo, e um transformante compreendendo o polinucleotídeo.
[0032] Adicionalmente de acordo com uma modalidade da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado que é
[0033] (a) um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:266,
[0034] (b) um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:266 em condições adversas, ou
[0035] (c) um polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotídeos que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs:267 a 274, ou sequência de aminoácidos substancialmente equivalente a mesma.
[0036] Igualmente de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado que apresenta pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada da sequência de nucleotídeos em qualquer de (1) ou (2) a seguir:
[0037] (1) uma sequência de nucleotídeos em qualquer de (a) a (h) a seguir:
[0038] (a) uma sequência de nucleotídeos de 3342 a 5158 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0039] (b) uma sequência de nucleotídeos de 5382 a 12777 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0040] (c) uma sequência de nucleotídeos de 13266 a 15144 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0041] (d) uma sequência de nucleotídeos de 16220 a 18018 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0042] (e) uma sequência de nucleotídeos de 18506 a 19296 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0043] (f) uma sequência de nucleotídeos de 19779 a 21389 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0044] (g) uma sequência de nucleotídeos de 21793 a 22877 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0045] (h) uma sequência de nucleotídeos de 23205 a 24773 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266;
[0046] (2) uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar em uma sequência de nucleotídeos em (1) em condições adversas.
[0047] Adicionalmente de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo envolvido na biossíntese de piripiropeno A.
[0048] Além do mais de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com qualquer uma ou mais atividades da atividade de policetídeo sintase, atividade de preniltransferase, atividade de hidroxilase, atividade de acetiltransferase ou atividade de adenilato sintetase.
[0049] Ainda adicionalmente de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo que é derivado da cepa de Penicillium coprobium PF1169.
[0050] Adicionalmente de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um vetor recombinante compreendendo o polinucleotídeo anteriormente mencionado.
[0051] Ainda adicionalmente de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um transformante compreendendo o polinucleotídeo anteriormente mencionado.
[0052] Além do mais de acordo com uma modalidade da presente invenção, é fornecido um método para produzir um precursor de piripiropeno A, caracterizado pela cultura de um transformante em que um polinucleotídeo com sequência de nucleotídeos de (c) ou (d) anteriormente mencionada é incorporado simultânea ou separadamente, e pelo isolamento do precursor de piripiropeno A a partir de piripiropeno E, representado pela fórmula a seguir:
[0053] Fórmula química 1
[0054] piripiropeno E
[0055] Ainda adicionalmente, é fornecido um método de produção em que o precursor de piripiropeno A anteriormente mencionado é aquele representado pela fórmula a seguir (I):
[0056] Fórmula química 2
[0057] fórmula (I)
[0058] Igualmente, é fornecido um método para produzir um precursor de piripiropeno A, caracterizado pelo cultivo do transformante anteriormente mencionado e pelo isolamento do precursor de piripiropeno A a partir do piripiropeno O representado pela fórmula a seguir:
[0059] Fórmula química 3
[0060] piripiropeno O
[0061] Ainda adicionalmente, é fornecido um método de produção em que o precursor de piripiropeno A anteriormente mencionado é um composto representado pela fórmula a seguir (II):
[0062] Fórmula química 4
[0063] fórmula (II)
[0064] De acordo com uma modalidade da presente invenção, são análogo de piripiropeno inédito, melhoria da produtividade de uma bactéria produtora de piripiropeno A, produção de um agente inseticida inédito para microrganismos, criação de uma planta inédita resistente a pestes de insetos ou similares.
[0065] A figura 1 mostra um padrão de eletroforese de produtos de PCR em gel de agarose. Para a eletroforese, os produtos amplificados de PCR que usam os oligonucleotídeos iniciadores a seguir foram usados: M: marcador de peso molecular (ladder de 100 bp), canaleta 1: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:1 e 2, canaleta 2: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:239 e 240, canaleta 3: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:237 e 238, canaleta 4 oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:241 e 242, canaleta 5 oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:247 e 248, canaleta 6 oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:251 e 252, canaleta 7 oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:245 e 246, canaleta 8 oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:243 e 244, canaleta 9 oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:249 e 250, canaleta 10oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:235 e 236, canaleta 11oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:233 e 234, canaleta 12oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:227 e 228, canaleta 13oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:229 e 230, canaleta 14oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:231 e 232.
[0066] Similarmente à figura 1, a figura 2 mostra um padrão de eletroforese de produtos de PCR em gel de agarose. Para a eletroforese, os produtos amplificados de PCR que usam os oligonucleotídeos iniciadores a seguir foram usados: M: marcador de peso molecular (ladder de 100 bp), canaleta 1:oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:253 e 254, canaleta 2oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:257 e 258, canaleta 3oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:259 e 260, canaleta 4oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:255 e 256, canaleta 5oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:261 e 262.
[0067] Similarmente à figura 1, a figura 3 mostra um padrão de eletroforese de produtos de PCR em gel de agarose. Para a eletroforese, os produtos amplificados de PCR que usam os oligonucleotídeos iniciadores a seguir foram usados: canaleta 1: marcador de peso molecular (ladder de 100 bp), canaleta 2: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:264 e 265 (fragmento amplificado de 400 bp).
[0068] A figura 4 mostra o mapa do plasmídeo de pUSA.
[0069] A figura 5 mostra o mapa do plasmídeo de pPP2.
[0070] A Figura 6 mostra um esquema da amplificação de P450-2 DNAc.
[0071] A figura 7 mostra o mapa do plasmídeo de pPP3.
[0072] A figura 8 mostra o espectro de 1H-NMR de piripiropeno E em acetonitrila deuterada.
[0073] A figura 9 mostra o espectro de 1H-NMR em acetonitrila deuterada de um produto da cultura de Aspergillus oryzae transformado com plasmídeo pPP2.
[0074] A figura 10 mostra o espectro de 1H-NMR de piripiropeno O em acetonitrila deuterada.
[0075] A figura 11 mostra o espectro de 1H-NMR em acetonitrila deuterada de um produto da cultura de Aspergillus oryzae transformado com plasmídeo pPP3.
[0076] Escherichia coli (Escherichia coli EPI300TM-T1R) transformada com plasmídeo pCC1-PP1 foi depositada em International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Address: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão, 305-8566), com número de acesso FERM BP-11133 (convertido a partir da depósito não oficial com o número de acesso FERM P-21704) (referência de identificação pelos requerentes: Escherichia coli EPI300TM-T1R/pCC1-PP1) desde 9 de outubro de 2008 (data de depósito original).
[0077] Aspergillus oryzae transformado com plasmídeo pPP2 foi depositado no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Address: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão, 305-8566), com número de acesso FERM BP-11137 (referência de identificação pelos requerentes: Aspergillus oryzae PP2-1) desde 23 de junho de 2009.
[0078] Aspergillus oryzae transformado com plasmídeo pPP3 foi depositado em International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Address: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão, 305-8566), com o número de acesso FERM BP-11141 (referência de identificação pelos requerentes: Aspergillus oryzae PP3-2) desde 3 de julho de 2009.
[0079] A presente invenção é um polinucleotídeo isolado. O polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção é (a) um polinucleotídeo com o sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:266; (b) um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:266 em condições adversas, ou (c) um polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotídeos que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs:267 to 274 ou sequência de aminoácidos substancialmente equivalente a mesma. O polinucleotídeo anteriormente mencionado isolado apresenta preferivelmente uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo que apresenta uma atividade enzimática envolvida na biossíntese de piripiropeno A.
[0080] Na presente invenção, “sequência de aminoácidos substancialmente equivalente” significa uma sequência de aminoácidos que não afeta uma atividade de um polipeptídeo, apesar do fato de que um ou mais aminoácidos são alterados por substituição, deleção, adição ou inserção. O número de resíduos de aminoácido alterado é preferivelmente 1 a 40 resíduos, mais preferivelmente 1 a vários resíduos, ainda mais preferivelmente 1 a 8 resíduos, acima de tudo preferivelmente 1 a 4 resíduos.
[0081] Adicionalmente, um exemplo da alteração que não afeta a atividade inclui substituição conservativa. O termo “substituição conservativa” significa substituição de um ou mais resíduos de aminoácido com outros resíduos de aminoácido quimicamente similares, de maneira tal que a atividade de um polipeptídeo não seja substancialmente alterada. Exemplos destes incluem casos onde um certo resíduo de aminoácido hidrofóbico é substituído por um outro resíduo de aminoácido hidrofóbico, e casos onde um certo resíduo de aminoácido polar é substituído por um outro resíduo de aminoácido polar com as mesmas cargas. Os aminoácidos funcionalmente similares capazes de uma substituição como esta são conhecidos na técnica para cada aminoácido. De maneira concreta, exemplos de aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptofano, fenilalanina, metionina e similares. Exemplos de aminoácidos polares (neutros) incluem glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina, cisteína e similares. Exemplos de aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, histidina, lisina e similares. Exemplos de aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico, ácido glutâmico e similares.
[0082] Igualmente, o polinucleotídeo isolado da presente invenção pode ser um polinucleotídeo com pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada da sequência de nucleotídeos em qualquer de (1) ou (2) a seguir:
[0083] (1) uma sequência de polinucleotídeos em qualquer de (a) a (h) a seguir:
[0084] (a) uma sequência de nucleotídeos de 3342 a 5158 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0085] (b) uma sequência de nucleotídeos de 5382 a 12777 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0086] (c) uma sequência de nucleotídeos de 13266 a 15144 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0087] (d) uma sequência de nucleotídeos de 16220 a 18018 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0088] (e) uma sequência de nucleotídeos de 18506 a 19296 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0089] (f) uma sequência de nucleotídeos de 19779 a 21389 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0090] (g) uma sequência de nucleotídeos de 21793 a 22877 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
[0091] (h) uma sequência de nucleotídeos de 23205 a 24773 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266;
[0092] (2) uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar em uma sequência de nucleotídeos em (1) em condições adversas.
[0093] Um polinucleotídeo, com pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada da sequência de nucleotídeos em qualquer de (1) ou (2) anteriormente mencionada, codifica preferivelmente pelo menos um polipeptídeo com uma atividade enzimática envolvida na biossíntese de piripiropeno A.
[0094] O termo “condições adversas”, na presente invenção, significa condições onde uma operação de lavagem de membranas após a hibridização é realizada em altas temperaturas, em uma solução com baixas concentrações de sal, por exemplo, condições de lavagem em uma solução com concentração 2*SSC (IxSSC: citrato de trissódio 15 mM, cloreto de sódio 150 mM) e SDS 0,5 % a 60°C por 20 minutos.
[0095] O polinucleotídeo com pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada da sequência de nucleotídeos em qualquer de (1) ou (2) anteriormente mencionada de acordo com a presente invenção, é aquele que codifica um polipeptídeo com qualquer uma ou mais atividades da atividade de policetídeo sintase, atividade de preniltransferase, atividade de hidroxilase, atividade de acetiltransferase ou atividade de adenilato sintetase e, em particular, aquele que codifica um polipeptídeo com a atividade de hidroxilase.
[0096] Adicionalmente de acordo com uma modalidade da presente invenção, o polinucleotídeo anteriormente mencionado é aquele que codifica um polipeptídeo com uma atividade para hidroxilar a posição 7 e/ou a posição 13 do piripiropeno E ou O anteriormente mencionado, ou aquele que codifica um polipeptídeo com uma atividade para hidroxilar a posição 11 do piripiropeno E anteriormente mencionado.
[0097] O método para obter o polinucleotídeo isolado da presente invenção não é particularmente restrito. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser isolado da cepa Penicillium coprobium PF1169 ou bactéria filamentosa pelo método a seguir.
[0098] Com base em uma homologia de sequência obtida pelo método do exemplo 9 a seguir ou similares, os oligonucleotídeos iniciadores capazes de amplificar especificamente um gene de policetídeo sintase são sintetizados. O PCR é realizado for uma biblioteca genômica de fosmídeo da cepa Penicillium coprobium PF1169 que é preparada separadamente, seguido por hibridização de colônia. Um vetor recombinante é obtido por meio disso e a sequência base de um DNA inserido neste é determinada.
[0099] Igualmente, com base na homologia de sequência obtida pelo método do exemplo 9 a seguir ou similar, os oligonucleotídeos iniciadores capazes de amplificar especificamente um gene de preniltransferase são sintetizados. Adicionalmente, a sequência base de um DNA inserido é determinada da mesma maneira como anteriormente.
[00100] Adicionalmente, com base na homologia de sequência obtida pelo método do exemplo 9 a seguir ou similar, os oligonucleotídeos iniciadores capazes de amplificar especificamente qualquer um ou ambos de um gene de policetídeo sintase e gene de preniltransferase são sintetizados. Adicionalmente, a sequência base de um DNA inserido é determinada da mesma maneira como anteriormente.
[00101] Além do mais, com base na homologia de sequência de pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada de SEQ ID NO:266, e a sequência de nucleotídeos em qualquer de (1) ou (2) anteriormente mencionada de acordo com a presente invenção, os oligonucleotídeos iniciadores capazes de amplificar especificamente qualquer um ou mais de um gene de policetídeo sintase, gene de preniltransferase, gene de hidroxilase, gene de acetiltransferase ou gene de adenilato sintetase, preferivelmente o gene de hidroxilase, são sintetizados. Adicionalmente, a sequência base de um DNA inserido é determinada da mesma maneira como anteriormente.
[00102] Ainda adicionalmente, com base em uma sequência de aminoácidos conservada entre vários policetídeo sintases de bactéria filamentosa, os oligonucleotídeos iniciadores degenerados para amplificação foram sintetizados e a sequência base de um DNA inserido é determinada.
[00103] Em geral, exemplos de um método para melhorar a produtividade de um produto do metabolismo secundário por recombinação genética incluem melhorar a expressão de um gene que codifica uma proteína que catalisa uma reação biossintética, que é uma taxa de reação limitante, melhorar a expressão ou romper um gene que regula a expressão de um gene biossintético, bloquear um sistema de metabolismo secundário desnecessário e similares. Portanto, especificar o gene biossintético torna possível melhorar a produtividade do produto do metabolismo secundário ligando o gene a um vetor apropriado e introduzindo o vetor em uma bactéria de produção.
[00104] Entretanto, a fim de criar uma substância ativa inédita por recombinação genética, a alteração do domínio de policetídeo sintase [Ikada e Ohmura, “PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME” Vol. 43, p. 1265-1277, 1998], [Carreras, C.W. e Santi, D.V., “Current Opinion in Biotechnology”, (UK), 1998, Vol. 9, p. 403-411], [Hutchinson, C. R., “Current Opinion in Microbiology”, (UK), 1998, Vol. 1, p. 319-329], [Katz, L. e McDaniel, R., “Medicinal Research Reviews”, (USA), 1999, Vol. 19, p. 543-558]; rompimento de um gene biossintético; introdução de um gene de enzima de modificação a partir de outros organismos [Hutchinson, C. R., “Bio/Technology”, (USA), 1994, Vol. 12, p. 375-380] e similares são realizadas. Assim, especificar o gene biossintético torna possível criar a substância ativa inédita ligando o gene a um vetor apropriado e introduzindo o vetor em uma bactéria que produz um produto do metabolismo secundário.
[00105] Portanto, piripiropeno A pode ser produzido ou a produtividade deste pode ser melhorada ligando o polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção ao vetor apropriado, introduzindo o vetor em um hospedeiro, expressando- o, melhorando a expressão deste, ou realizando o rompimento do gene de parte do polinucleotídeo isolado usando recombinação homóloga e prejudicando as funções deste.
[00106] O rompimento de gene que usa recombinação homóloga pode ser realizada de acordo com um método convencional. A preparação de um vetor usado para o rompimento de gene e introdução do vetor em um hospedeiro são aparentes para os versados na técnica.
[00107] O vetor recombinante de acordo com a presente invenção compreende preferivelmente qualquer um ou mais de polinucleotídeos com a sequência de nucleotídeos em SEQ ID NO:266 e a (1) anteriormente mencionada; um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar na sequência de nucleotídeos em SEQ ID NO:266 e a (1) anteriormente mencionada em condições adversas, ou um polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotídeos que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs:267 to 274 ou sequência de aminoácidos substancialmente equivalente a mesma. Mais preferivelmente, o vetor recombinante de acordo com a presente invenção é aquele em que o polipeptídeo anteriormente mencionado compreende um polinucleotídeo que hidroxila a posição 7 e/ou a posição 13 do piripiropeno E ou O, e o polipeptídeo anteriormente mencionado compreende um polinucleotídeo que hidroxila a posição 11 do piripiropeno E.
[00108] Um vetor recombinante para introdução de gene pode ser preparado modificando o polinucleotídeo fornecido pela presente invenção em uma forma apropriada, dependendo de um objeto e ligando-o à um vetor de acordo com um método convencional, por exemplo, técnicas de recombinação de gene descritas em [Sambrook, J. et al., “Molecular cloning: a laboratory manual”, (USA), 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989].
[00109] O vetor recombinante usado na presente invenção pode ser selecionado de maneira apropriada a partir de vetores de vírus, plasmídeo, fosmídeo, cosmídeo ou similares. Por exemplo, quando uma célula hospedeira é Escherichia coli, exemplos destes incluem bacteriófago a base de fago À e plasmídeos a base de pBR e pUC. No caso de um Bacillus subtilis, os exemplos incluem plasmídeos a base de pUB. No caso de levedura, os exemplos incluem plasmídeos a base de YEp, YRp, YCp e YIp.
[00110] Além do mais, é preferível que pelo menos um plasmídeo entre os plasmídeos usados compreenda um marcador de seleção para selecionar um transformante. Como o marcador de seleção, um gene que codifica resistência a medicamento e gene que complementa auxotrofia podem ser usados. Exemplos concretos preferidos destes incluem, quando um hospedeiro a ser usado é bactéria, genes de resistência à amplicilina, genes de resistência à canamicina, gene de resistência à tetraciclina e similares; no caso de levedura, gene biossintético de triptofano (TRP1), gene biossintético de uracila (URA3), gene biossintético de leucina (LEU2) e similares; no caso de um fungo, genes de resistência à higromicina, genes de resistência à bialafos, genes de resistência à bleomicina, genes de resistência à aureobasidina e similares; e no caso de uma planta, genes de resistência à canamicina, genes de resistência à bialafos e similares.
[00111] Adicionalmente, moléculas de DNA, que funcionam como um vetor de expressão, usadas na presente invenção apresentam preferivelmente sequências de DNA necessárias para expressar cada gene, sinais regulatórios de transcrição e sinais regulatórios de tradução tais como promotores, sinais de início de transcrição, sítios de ligação de ribossomo, sinais de final de tradução, finalizadores. Exemplos preferidos dos promotores incluem promotores de operon de lactose, operon de triptofano e similares em Escherichia coli; promotores do gene de álcool desidrogenase, gene de fosfatase ácida, gene que metaboliza a galactose, gene de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ou similares em levedura; promotores do gene de α-amilase, gene de glucoamilase, gene de celobioidrolase, gene de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, gene abp1 ou similares em fungos; um promotor CaMV 35S RNA, um promotor CaMV 19S RNA ou um promotor de gene de nopalina sintetase em plantas.
[00112] Um hospedeiro, em que o polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção é introduzido, pode ser selecionado de maneira apropriada, dependendo do tipo do vetor usado, a partir de actinomicetos, Escherichia coli, Bacillus subtilis, levedura, bactérias filamentosas, células de plantas ou similares.
[00113] Um método de introduzir um vetor recombinante em um hospedeiro pode ser selecionado, dependendo de uma célula hospedeira em teste, a partir da transferência conjugal, transdução por fago, bem como métodos de transformação tais como um método de íon cátion, um método de íon lítio, um método de eletroporação, um método PEG, um método de Agrobacterium ou um método de arma de partícula.
[00114] Em casos onde uma pluralidade de genes é introduzida em célula hospedeiras na presente invenção, os genes podem estar contidos em uma molécula única de DNA ou individualmente em diferentes moléculas de DNA. Adicionalmente, quando uma célula hospedeira é uma bactéria, cada gene pode ser assim designado para ser expresso como RNAm policistrônico e preparado em uma molécula de DNA.
[00115] O transformante de acordo com a presente invenção, compreende preferivelmente qualquer um ou mais de polinucleotídeos com a sequência de nucleotídeos em SEQ ID NO:266 e a (1) anteriormente mencionada; um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar na sequência de nucleotídeos em SEQ ID NO:266 e a (1) anteriormente mencionada em condições adversas, ou um polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotídeos que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs:267 a 274 ou sequência de aminoácidos substancialmente equivalente a mesma.
[00116] O transformante obtido pode ser cultivado por um método convencional e características recentemente obtidas podem ser estudadas. Assim como o meio, componentes comumente usados, por exemplo, tal como fontes de carbono, glicose, sacarose, xarope da amido, dextrina, amido, glicerol, melaço, óleos animais e vegetais ou similares podem ser usados. Igualmente, como fontes de nitrogênio, flor de soja, gérmen de trigo, água de maceração de milho, farelo de algodão, extrato de carne, polipeptona, extrato de malte, extrato de levedura, sulfato de amônio, nitrato de sódio, uréia ou similares podem ser usados. Além disso, da maneira exigida, a adição de sódio, potássio, cálcio, magnésio, cobalto, cloro, ácido fosfórico (fosfato dipotássio de hidrogênio ou similares), ácido sulfúrico (sulfato de magnésio ou similares) ou sais inorgânicos que podem gerar outros íons é efetiva. Igualmente, da maneira exigida, várias vitaminas tal como tiamina (cloridrato de tiamina ou similares), aminoácidos tal como ácido glutâmico (glutamato de sódio ou similares) ou asparagina (DL-asparagina ou similares), nutrientes traço tais como nucleotídeos, ou agentes de seleção tais como antibióticos podem ser adicionados. Adicionalmente, substâncias orgânicas ou substâncias inorgânicas que auxiliam o crescimento de uma bactéria e promovem a produção de piripiropeno A podem ser adicionadas de maneira apropriada.
[00117] O pH do meio é, por exemplo, cerca de pH 5,5 a pH 8. Assim como o método para cultivo, o cultivo sólido em condições aeróbicas, cultivo com agitação, cultivo com aeração ou cultivo aeróbico na parte inferior podem ser empregados e, em particular, o cultivo aeróbico na parte inferior é mais apropriado. A temperatura apropriada para o cultivo é 15°C a 40°C e, em muitos casos, o crescimento ocorre em torno de 22°C a 30°C. A produção de piripiropeno A varia dependendo do meio e condições de cultivo, ou do hospedeiro usado. Em qualquer método de cultivo, o acúmulo atinge em geral um pico em 2 dias a 10 dias. O cultivo é finalizado durante o período em que o acúmulo de piripiropeno A na cultura atinge o pico e uma substância desejada é isolada e purificada a partir da cultura.
[00118] Para isolar piripiropeno A a partir da cultura, ele pode ser extraído e purificado por um meio de separação comum usando propriedades deste, tais como um método de extração de solvente, um método de resina de troca iônica, um método de cromatografia em coluna de distribuição ou adsorção, um método de filtração em gel, diálise, um método de precipitação, um método de cristalização, que pode ser individualmente usado ou apropriadamente usado em combinação.
[00119] A fim de isolar piripiropeno A, o piripiropeno A pode ser isolado de um precursor de piripiropeno A usando um método conhecido. Um exemplo do método conhecido inclui o método de WO2009/022702. Cultivando um microrganismo contendo um vetor que contém um ou mais dos anteriores, o precursor de piripiropeno A pode ser isolado de piripiropeno E. O precursor de piripiropeno A pode ser, por exemplo, o composto representado pela fórmula (I) anteriormente mencionado.
[00120] Igualmente, cultivando um microrganismo compreendendo um vetor que contém um ou mais, o precursor de piripiropeno A pode ser isolado de piripiropeno O. Um exemplo pode ser o composto representado pela fórmula (II) anteriormente mencionada.
[00121] A presente invenção será ilustrada adicionalmente em detalhes pelos exemplos a seguir, que não são pretendidos para restringir a presente invenção.
[00122] O meio NB esterilizado (500 mL) foi colocado em um frasco de Erlenmeyer (1 L). A cepa de Penicillium coprobium PF1169 (Journal of Technical Disclosure No. 500997/2008 (Documento da patente 15)) pré-cultivada em meio de 1/2 CMMY a 28DC por 4 dias foi adicionada ao meio mencionado anteriormente e submetida a cultura líquida a 28DC por 4 dias. A filtração foi realizada com Miracloth para obter 5 g de células bacterianas. A partir destas células bacterianas, 30 μg de DNA genômico foram obtidos de acordo com o manual anexado ao estojo de purificação de DNA Genomic-tip 100/G (produzido pela Qiagen K.K.).
[00123] A presente invenção será ilustrada adicionalmente em detalhes pelos exemplos a seguir, que não são pretendidos para restringir a presente invenção.
[00124] Com base em uma sequência de aminoácidos conservada entre várias policetídeo sintases de bactéria filamentosa, os oligonucleotídeos iniciadores a seguir foram desenhados e sintetizados como oligonucleotídeos iniciadores degenerados para amplificação:
[00125] LC1: GAYCCIMGITTYTTYAAYATG (SEQ ID NO:1)
[00126] LC2c: GTICCIGTICCRTGCATYTC (SEQ ID NO:2)
[00127] (em que R=A/G, Y=C/T, M=A/C, I=inosina).
[00128] Usando estes oligonucleotídeos iniciadores degenerados, o DNA genômico preparado no exemplo 1 e ExTaq polimerase (produzidos pela Takara Bio Inc.) reagiram naturalmente de acordo com o manual anexado. Um fragmento amplificado de cerca de 700 bp foi detectado (ver figura 1). Adicionalmente, o fragmento amplificado anteriormente mencionado foi analisado para especificar a sequência de seus 500 bp internos (SEQ ID NO:3).
[00129] O DNA genômico da cepa Penicillium coprobium PF1169 obtido no exemplo 1 foi submetido a sequenciamento em larga escala e pesquisa de homologia para sequências de aminoácidos. Especificamente, parte dos 50 μg de DNA genômico foram pré-tratados e posteriormente submetidos ao sequenciador de DNA Roche 454FLX para obter cerca de 250 bp, 103 mil das sequências de fragmento (no total, 49 Mb de sequência).
[00130] Para estas sequências, assim como as sequências entre policetídeo sintases e preniltransferases, as cinco sequências a seguir (sequências derivadas de policetídeo sintases: PKS 2146 a.a. de Aspergillus(A.) fumigatus e ácido 6- metilsalicílico sintase 1744 a.a. de Penicillium(P.) griseofluvum; bem como preniltransferases: Preniltransferase de Aspergillus (A.) fumigatus, Preniltransferase de Aspergillus(A.) fumigatus (4-hidroxibezoato octapreniltransferase) e Preniltransferase de Penicillium(P.) marneffei) foram selecionadas e a pesquisa por software de pesquisa homologia de sequência blastx foi realizada, obtendo por meio disso 89, 86, 2, 1 e 3 de homologia de sequências, respectivamente (ver tabela 1). Adicionalmente, a partir da homologia de sequências de PKS 2146 a.a. de A. fumigatus e ácido 6-metilsalicílico sintase 1744 a.a. de P. griseofluvum, 19 e 23 de sequências em formato fasta foram respectivamente obtidas (as sequências em formato fasta de PKS 2146 a.a. de A. fumigatus: SEQ ID NOs:179 a 197; as sequências em formato fasta de ácido 6-metilsalicílico sintase 1744 a.a. de P. griseofluvum: SEQ ID NOs:198 a 220) (ver tabela 1).
[00131] Tabela 1
[00132] A partir dos resultados da pesquisa de blastx obtidos no exemplo 3, para policetídeo sintases, 13 tipos de pares de oligonucleotídeo iniciador mostrados em SEQ ID NOs:227 a 252 foram sintetizados. Similarmente, para preniltransferases, 5 tipos de pares de oligonucleotídeo iniciador mostrados em SEQ ID NOs:253 a 262 foram sintetizados. Quando o PCR foi realizado com o DNA genômico, usando estes oligonucleotídeos iniciadores, os fragmentos amplificados com o tamanho esperado foram observados para todos os pares de oligonucleotídeo iniciador (ver figura 1 e figura 2).
[00133] Uma biblioteca genômica de fago À da cepa Penicillium coprobium PF1169 foi construída usando o estojo ÀBlueSTAR Xho I Half-site Arms (produzido pela Takara Bio Inc., Cat. No. 69242-3) de acordo com o manual em anexo. Isto é, o DNA genômico foi parcialmente digerido usando uma enzima de restrição, Sau3A1. O fragmento de DNA com cerca de 20 kb (0,5 μg) foi ligado a 0,5 μg de DNA ÀBlueSTAR anexado ao estojo. Esta solução de ligação foi submetida, in vitro, ao empacotamento usando estojo de empacotamento Lambda INN (produzido pela Nippon Gene Co., Ltd.) com base no manual anexado ao estojo para obter 1 mL de uma solução. Esta solução com fagos empacotados (10 μL) foi infectada em 100 μL da cepa de E. coli ER1647 e cultivada em um meio formador de placa a 37°C por toda a noite, obtendo por meio disso cerca de 500 clones de placas. Assim, foi construída a biblioteca genômica composta de cerca de 50.000 clones de fagos, em que 10 a 20 kb do DNA genômico da cepa de Penicillium coprobium PF1169 foram introduzidos por infecção.
[00134] Para 10.000 clones da biblioteca de fago preparados no exemplo 5, a seleção primária foi realizada por hibridização de placa usando, como uma sonda, o produto amplificado de PCR por par de oligonucleotídeo iniciador LC1-LC2c preparado anteriormente. Para marcação e detecção e da sonda, o sistema de detecção e marcação direta AlkPhos com CDP-Star (produzido pela GE Healthcare, Cat. No. RPN3690) foi usado. A hibridização anteriormente mencionada foi realizada de acordo com o manual em anexo.
[00135] Pela seleção primária, 6 clones permaneceram como candidatos. Adicionalmente, como o resultado da seleção secundária por hibridização de placa, 4 clones foram obtidos. Estes clones positivos foram infectados na cepa de E. coli BM25.8 e os fagos foram convertidos em plasmídeos de acordo com o manual em anexo, obtendo por meio disso 4 tipos de plasmídeos contendo uma região desejada.
[00136] Uma biblioteca genômica da cepa Penicillium coprobium PF1169 foi construída usando estojo de produção de biblioteca de fosmídeo CopyControl (produzido pela EPICENTRE, Cat. No. CCFOS110) de acordo com o manual em anexo. Isto é, 0,25 μg de fragmento de DNA de cerca de 40 kb de DNA genômico com extremidade cega foi então incorporado no vetor de fosmídeo pCCFOS (produzido pela Epicentre). Esta solução de ligação foi submetida, in vitro, ao empacotamento usando extrato para empacotamento MaxPlax Lambda anexado ao estojo com base no manual anexado ao estojo. Esta solução com vírus empacotado (10 μL) foi infectada em 100 μL de cepa E. coli EPI300TM-T1R e cultivada em um meio contendo cloranfenicol a 37°C por toda a noite e selecionada, obtendo por meio disso cerca de 300 clones de placas. Assim, cerca de 30.000 clones dos fosmídeos, em que 40 kb do DNA genômico da cepa de Penicillium coprobium PF1169 foram introduzidos por infecção, foram obtidos. Eles foram aliquotados em uma placa de 96 poços, de maneira tal que sejam cerca de 50 clones por poço. Assim, a biblioteca genômica composta de 96 agrupamentos e cerca de 4.800 clones foi construída.
[00137] De acordo com o manual anexado ao fosmídeo, os DNAs de plasmídeo foram preparados individualmente a partir dos 96 agrupamentos da biblioteca preparada no exemplo 7. Usando os oligonucleotídeos iniciadores degenerados para amplificação de policetídeo sintase sintetizada no exemplo 2, o PCR foi realizado para os 96 agrupamentos destas amostras de DNA de plasmídeo. Como um resultado, os fragmentos de DNA de cerca de 700 bp foram amplificados a partir dos 9 agrupamentos. Adicionalmente, uma placa de Petri contendo colônias de cerca de 300 clones ou mais foi preparada a partir dos agrupamentos positivos e a re-seleção foi realizada por hibridização de colônia. Como um resultado, usando o par de oligonucleotídeo iniciador LC1-LC2c, 9 tipos de fosmídeos foram obtidos de cerca de 4.800 clones.
[00138] O DNA genômico da cepa de Penicillium coprobium PF1169 obtido no exemplo 1 foi submetido a sequenciamento em larga escala e pesquisa de homologia para sequências de aminoácidos. Especificamente, parte de 50 μg do DNA genômico foi pré-tratado e então submetido ao sequenciador de DNA Roche 454FLX para obter sequências do fragmento 1405 com uma média de comprimento das sequências no formato fasta de 19,621 kb (sequência de um comprimento de base total de 27,568160 Mb).
[00139] Para estas sequências, assim como sequências conhecidas entre policetídeo sintases e preniltransferases, as cinco sequências a seguir (sequências derivadas de policetídeo sintases: ácido 6-metilsalicílico sintase 1744 a.a. de Penicillium(P.) griseofluvum (P22367) e PKS 2146 a.a. de Aspergillus(A.) fumigatus (Q4WZA8); bem como preniltransferases: preniltransferase de Penicillium(P.) marneffei (Q0MRO8), preniltransferase de Aspergillus (A.) fumigatus (Q4WBI5) e preniltransferase de Aspergillus(A.) fumigatus (4-hidroxibezoato octapreniltransferase) (Q4WLD0)) foram selecionadas e a pesquisa pelo software de pesquisa de homologia de sequência blastx foi realizada, obtendo por meio disso 22 (P22367), 21 (Q4WZA8), 2 (Q0MRO8), 3 (Q4WBI5) e 3 (Q4WLD0) das sequências homólogas, respectivamente.
[00140] De acordo com o manual anexado a um estojo de fosmídeo (produzido pela EPICENTRE, CopyControl Fosmid Library Production Kit), os DNAs de plasmídeo foram preparados individualmente a partir de 96 agrupamentos da biblioteca preparada no exemplo 7. Com base nas bases de sequências de base determinadas pelo sequenciador de DNA Roche 454FLX, a pesquisa de homologia para sequências de aminoácidos foi realizada para procurar regiões adjacentes à policetídeo sintase e preniltransferase. Com base na sequência base de preniltransferase da região obtida, um par de oligonucleotídeo iniciador (No. 27) capaz de amplificar fragmento de DNA de 400 bp foi sintetizado. Usando os oligonucleotídeos iniciadores, o PCR foi realizado para estes 48 agrupamentos de amostras de DNA de plasmídeo. Como um resultado, os fragmentos de DNA esperados de cerca de 400 bp (SEQ ID NO:263) foram amplificados a partir de 11 agrupamentos (ver figura 3). Adicionalmente, uma placa de Petri contendo colônias de cerca de 300 clones ou mais foi preparada a partir de 6 agrupamentos dos agrupamentos positivos e a re-seleção foi realizada por hibridização de colônia. Como um resultado, usando o par de oligonucleotídeo iniciador 27F + 27R (oligonucleotídeo iniciador 27F: SEQ ID NO:264, oligonucleotídeo iniciador 27R: SEQ ID NO:265), 4 tipos de fosmídeos foram obtidos a partir de cerca de 4.800 clones. Um deles foi denominado pCC1-PP1 e a sequência total do fragmento inserido foi determinada (SEQ ID NO:266).
[00141] O opCC1-PP1 obtido foi transformado na cepa Escherichia coli EPI300TM-T1R (incluída no estojo do fosmídeo), obtendo por meio disso a cepa Escherichia coli EPI300TM-T1R /pCC1-PP1.
[00142] Quando uma pesquisa de homologia foi realizada entre a sequência de SEQ ID NO:266 anteriormente mencionada e cada uma da enzima formadora de adenilato; policetídeo sintase do tipo LovB; citocromo P450 mono-oxigenase, proteína integral de membrana, mono-oxigenase dependente de FAD, que são hidroxilases; preniltransferase do tipo; acetiltransferase, proteína de biossíntese de toxina Tri7, que são acetiltransferases; e ATPase transportadora de cátion (as enzimas anteriormente mencionadas são todas derivadas da cepa Aspergillus fumigatus Af293), uma alta homologia de 70 % ou mais foi observada em qualquer pesquisa.
[00143] Os nucleotídeos 3342 a 5158 de SEQ ID NO:266 codificam enzima formadora de adenilato e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:267; os nucleotídeos 5382 a 12777 de SEQ ID NO:266 codificam policetídeo sintase do tipo LovB e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:268; os nucleotídeos 13266 a 15144 de SEQ ID NO:266 (posteriormente, uma proteína codificada por esta sequência de polinucleotídeos (P450-1) é referida como citocromo P450 mono-oxigenase (1)) e os nucleotídeos 16220 a 18018 (posteriormente, uma proteína codificada por esta sequência de polinucleotídeos (P450-2) é referida como citocromo P450 mono- oxigenase (2)) codificam citocromo P450 mono-oxigenases e os polipeptídeos correspondentes são mostrados com as sequências de aminoácidos representadas em SEQ ID NOs:269 e 270, respectivamente; os nucleotídeos 18506 a 19296 de SEQ ID NO:266 codificam proteína integral de membrana e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:271; os nucleotídeos 19779 a 21389 de SEQ ID NO:266 codificam mono- oxigenase dependente de FAD e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:272; os nucleotídeos 21793 a 22877 de SEQ ID NO:266 codificam preniltransferase do tipo UbiA e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:273; os nucleotídeos 23205 a 24773 de SEQ ID NO:266 codificam acetiltransferase e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:274; os nucleotídeos 25824 a 27178 de SEQ ID NO:266 codificam proteína de biossíntese de toxina Tri7 e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:275; e os nucleotídeos 27798 a 31855 de SEQ ID NO:266 codificam ATPase transportadora de cátion e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:276.
[00144] O piripiropeno E usado a seguir pode ser produzido, por exemplo, por um método para cultivar um microrganismo com base no método descrito no pedido de patente submetido à inspeção pública 239385/1996 (Documento da patente 4), WO94/09147 ou patente U.S. 5597835, ou no método de síntese total descrito em Tetrahedron Letters, vol. 37, No. 36, 6461-6464, 1996. Igualmente, o piripiropeno O usado a seguir pode ser produzido, por exemplo, por um método para cultivar um microrganismo com base no método descrito em J. Antibiotics 49, 292-298, 1996 ou WO94/09147.
[00145] pUSA (Figura 4) e pHSG399 (Takara Bio Inc.) foram digeridos individualmente com KpnI e ligados obtendo por meio disso pUSA-HSG. Este plasmídeo foi digerido com SmaI e KpnI na ordem mencionada, e submetido a purificação em gel, obtendo por meio disso um vetor linear de DNA com uma extremidade coesiva KpnI e extremidade cega SmaI.
[00146] Com o fosmídeo pCC1-PP1 como um molde, o polinucleotídeo da P450-1 anteriormente mencionada foi amplificado usando um par de oligonucleotídeo iniciador P450-1 com Kpn F (SEQ ID NO:277)/P450-1 com Swa R (SEQ ID NO:278). O fragmento purificado de DNA foi clonado em pCR-Blunt (Invitorogen, Cat. No. K2700-20). O plasmídeo obtido foi digerido com KpnI e SwaI. P fragmento de P450-1 anteriormente mencionado foi ligado ao vetor pUSA-HSG anteriormente descrito, obtendo por meio disso um plasmídeo pPP2 mostrado na figura 5.
[00147] Com o fosmídeo pCC1-PP1 como um molde de acordo com o fluxo mostrado na figura 6, éxons sozinhos foram amplificados primeiro usando pares de oligonucleotídeo iniciador F1(SEQ ID NO:279)/R1(SEQ ID NO:280), F2(SEQ ID NO:281)/R2(SEQ ID NO:282), F3(SEQ ID NO:283)/R3(SEQ ID NO:284), F4(SEQ ID NO:285)/R4(SEQ ID NO:286), F5(SEQ ID NO:287)/R5(SEQ ID NO:288) e F6(SEQ ID NO:289)/R6(SEQ ID NO:290), obtendo por meio disso seis fragmentos. A seguir, a amplificação foi realizada com estes fragmentos como moldes usando pares de oligonucleotídeo iniciador de F1/R2, F3/R4 e F5/R6, obtendo por meio disso fragmentos maiores. Adicionalmente, repetindo a amplificação que usa pares de oligonucleotídeo iniciador de F1/R4 e F1/R6, o DNAc que não contém introns do polinucleotídeo da P450-2 anteriormente mencionada foi preparado. Este fragmento de DNAc foi inserido em pCR-Blunt (Invitorogen, Cat. No. K2700-20) e o plasmídeo obtido foi usado como um molde para amplificação por um par de oligonucleotídeo iniciador, infusão F de P450-2-DNAc (SEQ ID NO:291)/infusão R de P450-2-DNAc (SEQ ID NO:292). Com base no manual do estojo, um plasmídeo pPP3 mostrado na figura 7 foi obtido usando estojo In-Fusion Advantage PCR (Clontech).
[00148] Em um meio de ágar CD-Met (contendo L-Metionina 40μg/mL), A. oryzae (cepa HL-1105) foi cultivada a 30°C por uma semana. A partir desta placa de Petri, os conídios (>108) foram coletados e semeados em 100 mL de meio líquido YPD em um frasco de 500 mL. Após cultivo de 20 horas (30°C, 180 rpm), as células bacterianas com um forma de bola de musgo foram obtidas. As células bacterianas foram coletadas com um filtro de vidro 3G-1, lavadas com NaCl 0,8 M, e a água foi igualmente removida. O resultante foi suspenso com solução TF I (solução de formação de protoplasto) e a seguir agitado a 30°C, em 60 rpm por 2 horas. Em um intervalo de 30 minutos, foi realizada observação em microscópio e a presença de protoplastos foi conferida. Posteriormente, o meio de cultura foi filtrado e submetido a centrifugação (2.000 rpm, 5 minutos) para coletar protoplastos, que foram então lavados com solução de TF II. Após a lavagem, um volume de 0,8 de solução TF II e volume de 0,2 de TF solução III foram adicionados e misturados, obtendo por meio disso uma suspensão de protoplasto.
[00149] À 200 μL desta suspensão, foi adicionado 10 μg de DNA de plasmídeo (pPP2 ou pPP3). A mistura ficou no gelo 30 minutos e foi adicionada com a solução TF III (1 mL). A mistura resultante foi gentilmente misturada e a seguir ficou em temperatura ambiente por 15 minutos. Posteriormente, o DNA de plasmídeo foi introduzido nos protoplastos anteriormente mencionados. A este, a solução TF II (8 mL) foi adicionada e submetida à centrifugação (a 2.000 rpm por 5 minutos). Adicionalmente, os protoplastos foram então recuperados com 1 a 2 mL que sobraram. A solução de protoplasto recuperada foi liberada em um meio de regeneração (camada inferior) e o meio de regeneração (camada superior) foi vertido. O resultante foi misturado girando uma placa de Petri e então cultivado a 30°C por 4 a 5 dias. Os clones gerados foram isolados no meio de regeneração (camada inferior), subcultivados e purificados, obtendo por meio disso um transformante (Aspergillus oryzae PP2-1 e Aspergillus oryzae PP3-2).
[00150] A solução TF I anteriormente mencionada (solução de formação de protoplasto) foi preparada com as composições a seguir.
[00151] Após as composições anteriormente mencioandas (pH5,5) serem preparadas, foi realizada esterilização em filtro.
[00152] A solução TF II anteriormente mencionada foi preparada com as composições a seguir.
[00153] Após as composições anteriormente mencionadas serem preparadas, foi realizada esterilização por autoclave.
[00154] A solução TF III anteriormente mencionada foi preparada com as composições a seguir.
[00155] Após as composições anteriormente mencionadas serem preparadas, foi realizada esterilização por filtro.
[00156] O meio de regeneração anteriormente mencionado foi preparado com as composições a seguir.
[00157] Após as composições anteriormente mencioandas (pH5,5) serem preparadas, foi realizada esterilização por autoclave.
[00158] Além do mais, a solução de elementos traço usada anteriormente foi preparada com a composição a seguir.
[00159] Após as composições anteriormente mencionadas serem preparadas, foi realizada esterilização por autoclave.
[00160] A um meio YPD (extrato de levedura 1 % (p/v), peptona 2 % (p/v), dextrose 2 % (p/v)) contendo maltose 1 % (p/v), um volume 1/100 de 2 mg/mL de solução de sulfóxido de dimetila de piripiropeno E foi adicionado para fornecer o meio A. A partir da flora de Aspergillus oryzae PP2-1 cultivada em meio de ágar Czapek Dox, os conídios desta foram coletados e suspensos em água esterilizada. Esta suspensão de conídios foi ajustada para 104 esporos/mL. Adicionalmente, 100 μL desta suspensão de conídios ajustada foram adicionados a 10 mL do meio A e cultivados com agitação a 25°C por 96 horas. A esta solução de cultura, 10 mL de acetona foram adicionados e a mistura foi homogeneizada igualmente. Posteriormente, a acetona foi removida usando uma centrífuga concentradora. A esta, 10 mL de acetato de etila foram adicionados e a mistura resultante foi homogeneizada igualmente, e a seguir apenas a camada de acetato de etila foi recuperada. Um produto seco obtido removendo acetato de etila usando a centrífuga concentradora foi dissolvido em 1.000 μL de metanol. Isto foi usado como uma amostra e analisado por LC-MS (Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, módulo de separação 2695 module, Coluna: Waters XTerra C18 (Φ 4,5x50 mm, 5 μm)) e LC- NMR (Avance500 produzido pela Burker Daltonik).
[00161] Como os resultados da medição LC-MS anteriormente mencionada, confirmou-se que o composto obtido foi o composto A único que aumentou por um peso molecular de 16 comparado com piripiropeno E. Além do mais, como os resultados da medição LC-NMR, confirmou-se que este composto A foi um hidróxido na posição 11 de piripiropeno E. Confirmou-se que a citocromo P450 mono- oxigenase anteriormente mencionada (1) foi uma enzima que hidroxila a posição 11 de piripiropeno E, com piripiropeno E como um substrato.
[00162] As propriedades químicas do composto A anteriormente mencionadas são mostradas a seguir:
[00163] 1. Espectro de massa: ES-MS 468M/Z (M+H)+
[00164] 2. Fórmula molecular: C27H33NO6
[00165] 3. HPLC: Coluna: Waters XTerra Coluna C18 (5 μm, 4,6 mmx50 mm), 40°C, fase móvel: A partir da solução de acetonitrila aquosa a 20 % à acetonitrila a 100 % em 10 minutos (gradiente linear), Fluxo: 0,8 mL/min, Detecção: tempo de retenção 6,696 minutos em UV 323 nm
[00166] 4. Espectro de 1H-NMR (CD3CN, 2H: 3.134, 3.157 H-11)
[00167] Os quadros do espectro de 1H-NMR de piripiropeno E e espectro de 1H-NMR de acordo com os 4 descritos anteriormente são mostrados na figura 8 e figura 9, respectivamente.
[00168] A um meio YPD (extrato de levedura 1 % (p/v), peptona 2 % (p/v), dextrose 2 % (p/v)) contendo maltose 1 % (p/v), um volume 1/100 de 2 mg/mL de solução de sulfóxido de dimetila de piripiropeno E foi adicionado para fornecer o meio B, e similarmente um volume 1/100 de 2 mg/mL de solução de sulfóxido de dimetila de piripiropeno O foi adicionado para fornecer o meio C. A partir da flora de Aspergillus oryzae PP3-2 cultivada em meio de ágar Czapek Dox, os conídios deste foram coletados e suspensos em água esterilizada. Esta suspensão de conídios foi ajustada a 104 esporos/mL. Adicionalmente, 500 μL da suspensão ajustada de conídios foram adicionados a 50 mL do meio B ou meio C e cultivados com agitação a 25°C por 96 horas. A esta solução de cultura, 50 mL de acetona foram adicionados e a mistura foi homogeneizada igualmente. Posteriormente, a acetona foi removida usando uma centrífuga concentradora. A esta, 50 mL de acetato de etila foram adicionados e a mistura resultante foi homogeneizada igualmente e então apenas a camada de acetato de etila foi recuperada. Um produto seco obtido removendo o acetato de etila usando a centrífuga concentradora foi dissolvido em 1.500 μL de metanol. Este foi usado como uma amostra e analisado por LC-MS (produzido pela Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, módulo de separação 2695, Coluna: Waters XTerra C18 (Φ 4,5x50 mm, 5 μm)) e LC-NMR (produzido pela Burker Daltonik, Avance500). Como os resultados da medição LC-MS, a partir de uma amostra obtida do meio B, o composto B que aumentou por um peso molecular de 32 comparado com piripiropeno E foi detectado. Igualmente, a partir de uma amostra obtida do meio C, o composto C que aumentou por um peso molecular de 32 comparado com piripiropeno O foi detectado. Adicionalmente, como os resultados da medição LC-NMR, confirmou-se que o composto C foi um hidróxido de piripiropeno O na posição 7 e posição 13. Confirmou-se que a citocromo P450 mono-oxigenase (2) anteriormente mencionada foi uma enzima que hidroxila a posição 7 e posição 13 de cada um de piripiropeno E ou piripiropeno O.
[00169] As propriedades físico-químicas do composto B anteriormente mencionadas são mostradas a seguir:
[00170] 1. Espectro de massa: ES-MS 484M/Z (M+H)+
[00171] 2. Fórmula molecular: C27H33NO7
[00172] 3. Coluna de HPLC: coluna Waters XTerra C18 (5 μm, 4,6 mm*50 mm), 40°C, fase móvel: A partir da solução de acetonitrila aquosa a 20 % à acetonitrila a 100 % em 10 minutos (gradiente linear), fluxo: 0,8 mL/min, Detecção: tempo de retenção 5,614 minutos a UV 323 nm.
[00173] As propriedades físico-químicas do composto C anteriormente mencionados são mostrados a seguir:
[00174] 1. Espectro de massa: ES-MS 542M/Z (M+H)+
[00175] 2. Fórmula molecular fórmula: C29H35NO9
[00176] 3. Coluna de HPLC: Coluna Waters XTerra C18 (5 μm, 4,6 mm×50 mm), 40°C, fase móvel: A partir da solução de acetonitrila aquosa a 20 % à acetonitrila a 100 % em 10 minutos (gradiente linear), Vazão: 0,8 mL/min, Detecção: tempo de retenção 5,165 minutos em UV 323 nm
[00177] 4. Espectro de 1H-NMR (CD3CN, 1H 4.858 H-13), (CD3CN, 1H 3.65 H-7)
[00178] Os quadros do espectro de 1H-NMR de piripiropeno O e o compost C anteriormente mencionado são mostrados na figura 10 e figura 11,respectivamente.
[00179] Números de acesso:
[00180] FERM BP-11133
[00181] FERM BP-11137
[0001] FERM BP-11141
Claims (11)
1. Vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que é:(a) um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:266, eem que o vetor recombinante compreende ainda um marcador de seleção.
2. Vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é derivado da cepa Penicillium coprobium PF1169.
3. Vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que apresenta pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada da sequência de nucleotídeos em qualquer de (I) a (VIII) a seguir:(I) uma sequência de nucleotídeos de 3342 a 5158 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,(II) uma sequência de nucleotídeos de 5382 a 12777 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,(III) uma sequência de nucleotídeos de 13266 a 15144 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,(IV) uma sequência de nucleotídeos de 16220 a 18018 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,(V) uma sequência de nucleotídeos de 18506 a 19296 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,(VI) uma sequência de nucleotídeos de 19779 a 21389 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,(VII) uma sequência de nucleotídeos de 21793 a 22877 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,(VIII) uma sequência de nucleotídeos de 23205 a 24773 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, e em que o vetor recombinante compreende ainda um marcador de seleção.
4. Vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo de acordo a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é derivado da cepa Penicillium coprobium PF1169.
5. Vetor recombinante compreendendo o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é um cDNA.
6. Método para produzir um precursor de piripiropeno A, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microrganismo compreendendo qualquer um dos ditos vetores como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e isolar o precursor de piripiropeno A a partir do piripiropeno E.
7. Método para produzir um precursor de piripiropeno A, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um transformante compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 3 e sendo Aspergillus oryzae compreendendo nucleotídeos 13266 a 15144 da SEQ ID NO: 266 ligado ao vetor pUSA-HSG plasmídeo pPP2 e um transformante compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 3 e sendo Aspergillus oryzae compreendendo um cDNA dos nucleotídeos 16220 a 18018 da SEQ ID NO: 266 ligado ao vetor pUSA-HSGplasmídeo pPP3 simultânea ou separadamente, e isolar o precursor de piripiropeno A a partir do piripiropeno E.
8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o dito precursor de piripiropeno A é representado pela fórmula (I) a seguir: Fórmula química 1
9. Método para produzir um precursor de piripiropeno A, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microrganismo compreendendo qualquer um dos ditos vetores como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e isolar o precursor de piripiropeno A a partir do piripiropeno O.
10. Método para produzir um precursor de piripiropeno A, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um transformante compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 3 e sendo Aspergillus oryzae compreendendo um cDNA dos nucleotídeos 16220 a 18018 da SEQ ID NO: 266 ligado ao vetor pUSA-HSGplasmídeo pPP3 e isolar o precursor de piripiropeno A a partir do piripiropeno O.
11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o dito precursor de piripiropeno A é representado pela fórmula (II) a seguir: Fórmula química 2
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