BRPI0916355A2 - polinucleotídeo isolado, vetor recombinante, transformante, e, método para produzir um precursor de piripiropeno a. - Google Patents
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Abstract
POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR RECOMBINANTE, TRANSFORMANTE, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRECURSOR DE PIRIPIROPENO A
São revelados um polinucleotídeo inédito isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo envolvido na biossíntese de piripiropeno A, um vetor recombinante compreendendo o polinucleotídeo e uni transformante compreendendo o polinucleotídeo. Pela presente invenção, são fornecidos um gene biossintético de piripiropeno A usado para a produção de um análogo de piripiropeno inédito, melhoria da produtividade de uma bactéria produtora de piripiropeno A, produção de um agente inseticida para microrganismos, criação de uma planta resistente a pestes de insetos ou similares.
Description
REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO 5 Este pedido de patente reivindica a prioridade do pedido de patente Japonesa 190862/2008, que foi depositado em 24 de julho de 2008, pedido de patente Japonesa 270294/2008, que foi depositada em 20 de outubro de 2008, e pedido de patente Japonesa 20591/2009, que foi depositado em 30 de janeiro de 2009, e os conteúdos totalmente revelados de todos são aqui incorporados como parte da revelação do presente pedido pela referência.
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a um gene biossintético de piripiropeno A.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA Da maneira revelada em pedido de patente submetido à inspeção pública 360895/1992 (Documento da patente 1) e Journal of Antibiotics (1993), 46(7), 1168-9 (documento não relacionado à patente 1), piripiropeno A apresenta uma atividade inibitói'ia contra ACAT (acil COA colesterol aciltransferase). A aplicação desta no trataínento de doenças causadas por acúmulo de colesterol ou siinilares é esperada. Adicionalrnente, no Joumal of Synthetic Organic Chelnishy, Japão (1998), Vol. 56, No. 6, 478-488 (documento não relacionado à patente 2), WO94/09l47 (Documento da patente 2), pedido de patente submetido à inspeção pública 184158/1994 (Documento da patente 3), pedido de patente submetido à inspeção pública 239385/1996 (Documento da patente 4), pedido de patente submetido à inspeção pública 259569/1996 (Docurnento da patente 5), pedido de patente subinetido à inspeção pública 269062/1996 (Documento da patente 6), pedido de patente submetido à inspeção pública 269063/1996 (Documento da patente 7), pedido de patente submetido à inspeção pública 269064/1996 (Documento da patente 8), pedido de patente subnietido à inspeção pública 269065/1996 (Documento da patente 9), pedido de patente submetido à inspeção pública 269066/1996 (Docurnento da patente 10), pedido de patente submetido à inspeção pública 29 1164/1996 (Docuniento da patente 11) e no Journal of AntibIotics (1997), 50(3), 229-36 (docimento não relacionado à patente 3), análogos e derivados de piripiropeno, bem como atividades inibitórias de ACAT destes foram revelados.
Adicionalinente, Applied and Environmental Microbiology (1995), 61(12), 4429-35 (documento não relacionado à patente 4) revelou que piripiropeno A apresenta uma atividade i11seticida contra a larva Helicoveijpa armigera.
Ainda adicionalmente, WO2004/060065 (Documento da patente 12) revelou que piripiropeno A apresenta atividades de inseticida contra Iarva de traça das crucíferas e Tenebrio molitor.
Além do mais, WO2006/129714 (Documento da patente 13) e WO2008/066153 (Documento da patente 14) revelaram que os análogos de piripiropeno apresentam atividades de inseticida contra afidios.
Além do mais, como uma bactéria produtora de piripiropeno A, a cepa de Aspergillus./iimigat'us FO-1289 é revelada no pedido de patente submetido à inspeção pública 360895/1992 (Documento da patente 1); a cepa de Eupen.icillium. reticu/osporum NRRL-3446 está em Applied and Environmental Microbiology (1995), 61(12), 4429-35 (documento nào relacionado à patente 4); e a cepa de Penicillium griseofulvuin F1959 está em WO2004/060065 (Documento da patente 12); e a cepa de Penicillium coprobi'um PFl169 está no Joumal of Technical Disclosure 500997/2008 (Documento da patente 15). Iguahnente, como uma via biossintética de piripiropeno A, Joumal of Organic Cheinistry (1996), 61, 882-886 (Documento não relacionado à patente 5) e C.hemical Review (2005), 105, 4559-4580 (Documento não relacionado à patente 6) revelarain uma via biossintética putativa na cepa de Aspergil/us .fumigatus FO-1289. Estes documentos revelaram que, na cepa de Aspe/^gi//llLg.fu/??iBaat'us FO-1289, estruturas parciais 5 sintetizadas individuahnente por policetídeo smtase e preniltransferase são ligadas para sintetizar piripiropeno A por uma ciclase.
DOCUMENTOS DAS PATENTES [Documento da patente 1] pedido de patente submetido à inspeção pública 360895/1992 [Documento da patente 2] WO94/09l47 [Documento da patente 3] pedido de patente submetido à mspeçào pública 184158/1994 [DoclI1]]ento da patente 4] pedido de patente submetido à mspeçào pública 239385/1996 [DoclI1]]ento da patente 5] pedido de patente submetido à mspeçào pública 259569/1996 [DoclI1]]ento da patente 6] pedido de patente submetido à mspeçào pública 269062/1996 [DoclI1]]ento da patente 7] pedido de patente submetido à mspeçào pública 269063/1996 [DoclI1]]ento da patente 8] pedido de patente submetido à inspeção pública 269064/1996 [Documento da patente 9] pedido de patente submetido à inspeção pública 269065/1996 [Documento da patente 10] pedido de patente submetido à inspeção pública 269066/1996 [Documento da patente ll] pedido de patente submetido à inspeção pública 291164/1996
[Doeumento da patente 12] WO2004/060065 [Docume.nto da patente 13] WO2006/l29714 [Documento da patente 14] WO2008/066l53 [Documento da patente 15] Journal of Technical Disclosure 5 500997/2008
DOCUMENTOS NÃO RELACIONADO À PATENTE [Documento não relacionado à patente 1] Joumal of Antibiotics (1993), 46(7), 1168-9 [Documento não relacionado à patente 2] Joumal of Synthetic Organic Cheinistry, Japão (1998), Vol. 56, No. 6, 478-488 [Documento não relacionado à patente 3] Joumal of Antibiotics (1997), 50(3), 229-36 [Documento não relacionado à patente 4] Applied and Environmental Microbiology (1995), 61(12), 4429-35 [Documento não relacionado à patente 5] Joumal of Organic Chemistry (1996), 61, 882-886 [Documento não relacionado à patente 6] Chemical Review (2005), 105, 4559-4580
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Os presentes inventores observani agora uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo envolvido na biossíntese de piripiropeno A. A presente invenção foi realizada com base em tais achados- Dessa maneira, um objetivo da presente invenção é fomecer um polinucleotídeo inédito isolado com uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo envolvido na biossíntese de piripiropeno A, um vetor recombinante compreendendo o polinucleotídeo, e um transfonnante compreendendo o poIinueleotídeo. Adicionalmente de acordo com uma modalidade da presente mvenção, é fomecido um polmucleotídeo isolado que é (a) um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:266, (b) um poLinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos 5 que é capaz de hibridizar na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:266 em condições adversas, ou (c) um polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotídeos que codifica pelo menos urna sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs:267 a 274, ou sequência de aminoácidos substancialinente equivalente a mesma.
Iguahnente de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fòrnecido uni polinucleotídeo isolado que apresenta pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada da sequência de nucleotídeos em qualquer de (1) ou (2) a seguir: (1) uma sequência de nucleotideos em qualquer de (a) a (h) a seguir: (a) uma sequência de nucleotideos de 3342 a 5158 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (b) uma sequência de nucleotídeos de 5382 a 12777 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (C) uma sequência de nucleotídeos de 13266 a 15144 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (d) uma sequência de nucleotídeos de 16220 a 18018 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (e) uma sequência de nucleotideos de 18506 a 19296 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (f) uma sequência de nucleotídeos de 19779 a 21389 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (g) uma sequência de nucleotídeos de 21793 a 22877 de uma sequência de nucleotídeos mostrada eni SEQ ID NO:266, (h) uma sequência de nucleotídeos de 23205 a 24773 de uma sequência de nucleotídeos mostrada eni SEQ ID NO:266; (2) uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar 5 em uma sequência de nucleotídeos em (1) em condições adversas.
Adicionalinente de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fomecido um polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo envolvido na biossíntese de púipiropeno A.
Além do mais de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo que codifica uni polipeptídeo com qualquer uma ou mais atividades da atividade de policetídeo sintase, atividade de preniltransferase, atividade de hidroxilase, atividade de acetiltransferase ou atividade de adenilato sintetase.
Ainda adicionalmente de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fomecido um polinucleotídeo que é derivado da cepa de Penicilliuní coprobium PFll69. Adicionahnente de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fomecido um vetor reconibinante compreendendo o polinucleotídeo anteriormente mencionado.
Ainda adicionahnente de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é fomecido Lllll transformante compreendendo o polinucleotídeo anteriormente mencionado.
Além do mais de acordo com urna modalidade da presente invenção, é fomecido um método para produzir um precursor de piripiropeno A, caracterizado pela cultura de um transfonnante em que um polinucleotídeo com sequência de nucleotídeos de (c) ou (d) anteriorrnente mencionada é inc'oIporado simultânea ou separadamente, e pelo isolamento do precursor de piripiropeno A a partir de pinpi1"openo E, representado pela fórmula a seguir:
FÓrinula quhnica 1 Á&TQ' ACO~ " piripiropeno E Ainda adicionahnente, é fornecido um método de produção em que o precursor de piripiropeno A anterionnente mencionado é aquele representado pela fÓrmula a seguir (I): Fórmula química 2
O N HOÀ3
OH HOíl fórinula (I) Iguahnente, é fomecido um método para produzir um precursor de piripiropeno A, caracterizado pelo cultivo do transfo11nante anteriormente mencionado e pelo isolamento do precursor de piripiropeno A a partir do piripiropeno O representado pela fórmula a seguir:
FÓrinula quhnica 3 ojya ^y4ò AcO""Y " ACO" piripiropeno O Ainda adicionalmente, é fornecido um método de produção em que o precursor de piripiropeno A anteriormente mencionado é um composto representado pela fórmula a seguir (II): Fórmula quiinica 4 ll
N Ho,m -JÀLÒ 1 ACO" "Y"
OH ACO";] fónnula (II) De acordo com uma modalidade da presente invenção, são fomecidas a produção de iun análogo de piripiropeno inédito, inelhoria da produtividade de uma bactéria produtora de piripiropeno A, produção de um agente inseticida inédito para microrganismos, criação de uma pIanta inédita resistente a pestes de insetos ou similares.
A figura 1 mostra um padrão de eletroforese de produtos de PCR ein gel de agarose.
Para a eletroforese, os produtos amplificados de PCR que usam os oligonucleotídeos iniciadores a seguir foram usados: M: 5 marcador de peso molecular (líder de 100 bp), canaleta 1: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:l e 2, canaleta 2: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOS:239 e 240, canaleta 3: oligonucleotídeos iiúciadores de SEQ ID NOS:237 e 238, canaleta 4: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:24l e 242, canaleta 5: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:247 e 248, canaleta 6: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:25l e 252, canaleta 7: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:245 e 246, canaleta 8: oligonucleotídeos iniciadores de SF.Q ID NOS:243 e 244, canaleta 9: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOS:249 e 250, canaleta 10: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:235 e 236, canaleta ll: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:233 e 234, canaleta 12: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:227 e 228, canaleta 13: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOS:229 e 230, canaleta 14: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:23 ] e 232. Similarmente à figura 1, a fígura 2 mostra um padrão de eletroforese de produtos de PCR em gel de agarose.
Para a eletroforese, os produtos amplificados de PCR que usam os oligonucleotídeos iniciadores a seguir foram usados: M: marcador de peso molecular (líder de 100 bp), canaleta 1: oligonucleotídeos miciadores de SEQ ID NOs:253 e 254, canaleta 2: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:257 e 258, canaleta 3: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:259 e 260, canaleta 4: oligonueleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:255 e 256, canaleta 5: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ ID NOs:26l e 262. Similarinente à figura 1, a figura 3 mostra um padrão de eletroforese de produtos de PCR em gel de agarose.
Para a eletroforese, os produtos amplificados de PCR que usam os oligonucleotídeos iniciadores a seguir foram usados: canaleta l: marcador de peso molecular (líder de 100 bp), canaleta 2: oligonucleotídeos iniciadores de SEQ IÍD NOS:264 e 265 (Kaginento amplificado de 400 bp). 5 A figura 4 mostra o niapa do plasniídeo de pUSA. A figura 5 mostra o mapa do plasniídeo de pPP2. A Figura 6 mostra um esquema da amplificação de P450-2 DNAc. A figura 7 mostra o niapa do plasniídeo de pPP3. A figura 8 niostra o espectro de ih-nmr de piripiropeno E em acetonitrila deuterada. A figura 9 mostra o espectro de lH-NMjR em acetonitrila deuterada de uin produto da cultura de Aspergi//us orvzae transformado com j plasmídeo pPP2. A figura 10 mostra o espectro de 'H-NMR de piripiropeno O em acetonitrila deuterada. A figura 11 mostra o espectro de lH-NjMR em acetonitrila deuterada de um produto da cultura de Aspergillus oíyzae transformado co'm plasmídeo pPP3.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Depósito de núcrorganismos Escherichia coli (Escherichia coli EPI300tm-T1 ") transformada com plasmídeo pCCl-PPl foi depositada em Intemational Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Address: AIST Tsukuba Central 6, l-l-l Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão, 305-8566), coni número de acesso FERM BP-l1l33 (convertido a partir da depósito não oficial com o número de acesso FERM P- 21704) (referência de identifíeação pelos requerentes: Escherichia coli EPI300'"-T1"/pCC1-PPI) desde 9 de outubro de 2008 (data de depósito ll origmal)- Aspergillus oryzae transformado com plasmídeo pPP2 fòi depositado no Ihtemational Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Address: AIST Tsukuba 5 Central 6, 1-1-1 Higaslii, Tsukuba, Ibaraki, Japão, 305-8566), com número de acesso FERM BP-lll37 (referência de identificação pelos requerentes: Aspergi/lus oryzae PP2-1) desde 23 de junho de 2009. Aspergillus oryzae transformado com plasniídeo pPP3 foi depositado em International Patent Organism Depositary, Nationaj Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Address: AIST Tsukuba Central 6, l-l-l Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão, 305-8566), com o número de acesso FERM BP-l1l4l (referência de identificação pelos requerentes: Aspergi/lus oiyzae PP3-2) desde 3 de julho de 2009. Polinucleotídeo isolado A presente invenção é um polinucleotídeo isolado.
O polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção é (a) uin polin'ucleotídeo com o sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:266; (b) um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:266 em condições adversas, ou (C) um polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotídeos que codifica pelo menos uma sequência de ammoácidos selecionada de SEQ ID NOs:267 to 274 ou sequência de aniinoácidos substanciahnente equivalente a mesma.
O polinucleotídeo anterioimente mencionado isolado apresenta preferivehnente uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo que apresenta uma atividade enzimática envolvida na biossíntese de piripiropeno A.
Na presente invenção, "sequência de aminoácidos substancialmente equivalente" significa uma sequência de aminoácidos que não afeta uma atividade de um polipeptídeo, apesar do fato de que um ou mais aminoácidos são alterados por substituição, deleçâo, adiçào ou inserção.
O número de resíduos de aminoácido alterado é preferivehnente 1 a 40 resíduos, mais preferivelmente ] a vários resíduos, ainda mais prefeiivehnente l a 8 resíduos, acima de tudo preferivelmente 1 a 4 resíduos.
5 Adicionahnente, um exemplo da alteração que não afeta a atividade inclui substituição conservativa. O termo "substituição conservativa" significa substituição de um ou rnais resíduos de aniinoácido com outros resíduos de aminoácido quiinicamente similares, de inaneira tal que a atividade de um polipeptídeo não seja substancialniente alterada.
Exemplos destes induein casos onde um certo resíduo de aminoácido hidrofóbico é substituído por um outro resíduo de aminoácido hidrofóbico, e casos onde um certo resíduo de arninoácido polar é substituído por um outro resíduo de aminoácido poIar coni as mesmas cargas. Os aminoácidos fílnciol1aln]ente siinilares capazes de uma substituição como esta são conhecidos na técnica para cada aniinoácido. De maneira concreta, exemplos de aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptofano, fenilalanina, metionina e similares.
Exemplos de aminoácidos polares (neutros) incluem glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina, cisteína e similares. Exemplos de aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, histidina, lisina e similares. Exemplos de aniinoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico, ácido gjutâmico e siínilares.
Iguahnente, o polinucleotídeo isolado da presente invenção pode ser um polinucleotídeo com pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada da sequência de nucleotídeos em qualquer de (I) ou (2) a seguir: (1) uma sequência de polinucleotídeos em qualquer de (a) a (h) a seguir: (a) uma sequência de nudeotídeos de 3342 a 5158 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
(b) uma sequência de nucleotídeos de 5382 a 12777 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (C) uma sequência de nucleotídeos de 13266 a 15144 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, 5 (d) uina sequência de nucleotídeos de 16220 a 18018 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (e) uma sequência de nucleotídeos de 18506 a 19296 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (f) uma sequência de nucleotídeos de 19779 a 21389 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (g) uina sequência de nucleotídeos de 21793 a 22877 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (h) uina sequência de nucleotídeos de 23205 a 24773 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266; (2) urna sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar em uma sequência de nucleotídeos em (1) em condições adversas.
Um polinucleotídeo, com pelo rnenos uma sequência de nucleotídeos selecionada da sequência de nucleotídeos em qualquer de (1) ou (2) anteriormente mencionada, codifica preferivehnente pelo menos um polipeptídeo com uma atividade enzirnática envolvida na biossíntese de piripiropeno A.
O termo "condições adversas", na presente invenção, significa condições onde uma operação de lavagem de membranas após a hibridização é realizada ein altas temperaturas, ern uma solução com baixas concentrações de sal, por exemplo, condições de lavagem em uma solução com concentração 2xSSC (P'SSC: citrato de trissÓdio 15 niM, cloreto de sódio 150 niM) e SDS 0,5 °/, a 60°C por 20 ininutos.
O poIinucleotídeo com pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada da sequência de nucleotídeos em qualquer de (1) ou
(2) anterionnente mencionada de acordo com a presente mvenção, é aquele que codifica um polipeptídeo com qualquer uma ou mais atividades da atividade de policetídeo sintase, atividade de preniltransferase, atividade de hidroxilase, atividade de acetiltransferase ou atividade de adenilato sintetase 5 e, em particular, aquele que codifica um polipeptídeo com a atividade de hidroxilase.
Adicionahnente de acordo com uma niodalidade da presente invenção, o polinucleotídeo anterionnente mencionado é aquele que codifica um polipeptídeo com uma atividade para hidroxilar a posição 7 e/ou a posição 13 do piripiropeno E ou O anteriormente inencionado, ou aquele que codifica um polipeptídeo com uma atividade para hidroxilar a posição 11 do piripiropeno E antelior1nente mencionado.
Obtenção de polinucleotídeo isolado O método para obter o polinucleotídeo isolado da presente mvenção não é particlllam1ente restrito.
Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser isolado da cepa Penici//ium. coprobiuni PF 1169 ou bactéria filainentosa pelo método a seguir.
Com base em uma homologia de sequência obtida pelo método do exemplo 9 a seguir ou similares, os oligonucleotídeos iniciadores capazes de amplificar especificamente um gene de policetídeo sintase são sintetizados.
O PCR é realizado for unia biblioteca genômica de fosmídeo da cepa Penicillium coprobiIl/n PFl169 que é preparada separadainente, seguido por hibridização de colônia- Um vetor recornbinante é obtido por meio disso e a sequência base de um DNA inserido neste é determinada.
Igualmente, com base na homologia de sequência obtida pelo método do exemplo 9 a seguir ou siinilar, os oligonucleotídeos iniciadores capazes de amplificar especifícamente um gene de preniltransferase são sintetizados.
Adicionahnente, a sequência base de um DNA inserido é determinada da mesma maneira como anterionnente.
Adicionahnente, com base na homologia de sequência obtida pelo método do exemplo 9 a seguir ou similar, os oligonucleotídeos miciadores capazes de amplificar especificamente qualquer urn ou ambos de um gene de policetídeo sintase e gene de preniltransferase são sintetizados. 5 Adicionalmente, a sequência base de uni DNA inserido é detenninada da mesma maneira como anteriormente.
Além do mais, corn base na homologia de sequência de pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada de SEQ ID NO:266, e a sequência de nucleotídeos em qualquer de (1) ou (2) anteriormente mencionada de acordo com a presente invenção, os oligonucleotídeos iniciadores capazes de amplificar especificamente qualquer um Oll mais de uin gene de policetídeo sintase, gene de preniltransferase, gene de hidroxilase, gene de acetiltransferase ou gene de adenilato sintetase, preferivehnente o gene de hidroxilase, são sintetizados.
Adicionalmente, a sequência base de um DNA inserido é detemiinada da mesma maneira como anterionnente.
Ainda adicionahnente, com base eni uma sequência de aminoácidos conservada entre vários policetídeo sintases de bactéria filamentosa, os oligonucleotídeos iniciadores degenerados para amplificação foram sintetizados e a sequência base de um DNA inserido é determinada.
Transfonnante Em geral, exemplos de um método para melhorar a produtividade de um produto do nietabolismo secundário por recombinação genética incluem melhorar a expressão de um gene que codifíca urria proteína que catalisa uma reação biossintética, que é uma taxa de reação liniitante, melhorar a expressão ou romper um gene que regula a expressão de um gene biossintético, bloquear um sistema de metabolisnio secundário desnecessário e similares.
Portanto, especificar o gene biossintético toma possível melhorar a produtividade do produto do metabolismo secundário ligando o gene a um vetor apropriado e introduzindo o vetor em uma bactéria de produção.
Entretanto, a fim de criar uma substância ativa inédita por recombinação genética, a alteração do domínio de policetídeo sintase [Ikada e Ohmura, "PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME" Vol. 43, p. 1265- 1277, 1998], [Carreras, C.W. e Santi, D.V., "Current Opinion in 5 Biotechnology", (UK), 1998, Vol. 9, p. 403 -4 l1], [Ilutchinson, C.
R., "Current Opinion in Microbiology", (UK), 1998, Vol. 1, p. 3 19-329], [Katz, L. e McDaniel, R., "Medicinal Research Reviews", (USA), 1999, Vol. 19, p. 543-558]; ron]pilnento de um gene biossintético; introdução de um gene de enzima de modificação a partir de outros organismos [Hutchinson, C.
R., "Bio/Technology", (USA), 1994, Vol. 12, p. 375-380] e similares são realizadas.
Assim, especificar o gene biossintético torna possível criar a substância ativa inédita ligando o gene a um vetor apropriado e mtroduzindo o vetor em uma bactéria que produz um produto do metabolismo secundário.
Portanto, pil"il)iropeno A pode ser produzido ou a produtividade deste pode ser melhorada ligando o polinucleotídeo isolado de acordo coni a presente invenção ao vetor apropriado, introduzindo o vetor eni um hospedeiro, expressando-o, melhorando a expressão deste, Oll realizando o ronipimento do gene de parte do polinucleotídeo isolado usando recombinação homóloga e prejudicando as fiinções deste.
O roLnpiLne1]to de gene que usa reconibinação "homóloga pode ser realizada de acordo com um rnétodo convencional.
A preparação de um vetor usado para o rompiniento de gene e introdução do vetor em um hospedeiro são aparentes para os versados na técnica.
O vetor reconibinante de acordo com a presente invenção compreende prefeiivelmente qualquer um ou mais de polinucleotídeos com a sequência de nueleotídeos em SEQ ID NO:266 e a (I) anteriormente mencionada; um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar na sequência de nucleotídeos em SEQ ID NO:266 e a (1) anteriormente mencionada em condições adversas, ou um polinucleotideo com uma sequência de polinucleotídeos que codifica pelo menos uma sequência de aniinoácidos selecionada de SEQ ID NOS:267 to 274 ou sequência de aininoácidos substanciahnente equivalente a mesma.
Mais prefeiivehnente, o vetor recolnbmante de acordo com a presente invenção é 5 aquele em que o polipeptídeo anteriormente mencionado compreende um polinucleotídeo que hidroxila a posição 7 e/ou a posição 13 do piripiropeno E ou O, e o polipeptídeo anteriormente mencionado compreende Lllll polinucleotídeo que hidroxila a posição ll do piripiropeno E.
Um vetor recombmante para introdução de gene pode ser preparado modificando o polinucleotídeo fomecido pela presente invenção em uma forma apropriada, dependendo de um objeto e ligando-o à um vetor de acordo com um método convencional, por exemplo, técnicas de recombinação de gene descritas em [Sambrook, J. et al., "Molecidar cloning: a laboratory manual", (USA), 2" edição.
CoId Spring Harbor Laboratory, 1989]. O vetor reconibinante usado na presente invenção pode ser selecionado de maneira apropriada a partir de vetores de vírus, plasmideo, fosmídeo, cosmídeo ou sirnilares.
Por exen]plo, quando uma célula hospedeira é Escherichia coli, exemplos destes incluem bacteriófago a base de fago A e plasmídeos a base de pBR e pUC.
No caso de um Bacillus subti/is, os exemplos incluem plasmídeos a base de pUB.
No caso de levedura, os exemplos incluem plasmídeos a base de YEp, YRp, YCp e YIp.
Além do mais, é preferível que pelo menos um plasmídeo entre os plasinídeos usados compreenda uin marcador de seleção para selecionar um transfomiante.
Como o marcador de seleção, um gene que codifica resistência a medicamento e gene que complementa auxotrofia podem ser usados.
Exemplos concretos preferidos destes incluern, quando um hospedeiro a ser usado é bactéria, genes de resistêneia à amplicilina, genes de resistência à canamicina, gene de resistência à tetraciclina e similares; no caso de levedura, gene biossintético de triptofano (TRPI), gene biossintético de uracila (URA3), gene biossintético de leucina (LEU2) e similares; no caso de um fíungo, genes de resistência à higromicina, genes de resistência à bialafos, genes de resistência à bleomicina, genes de resistência à aureobasidina e 5 similares; e no caso de uma planta, genes de resistência à canaÍnicma, genes de resistência à bialafos e similares.
Adicionahnente, moléculas de DNA, que fúncionam como um vetor de expressão, usadas na presente invenção apresentam preferivehnente sequências de DNA necessárias para expressar cada gene, sinais regulatórios de transcrição e sinais regulatórios de tradução tais como promotores, sinais de início de transcrição, sítios de ligação de ribossomo, sinais de final de tradução, finalizadores.
Exeniplos preferidos dos promotores incluem promotores de operon de Iactose, operon de triptofano e similares ein Escherichia coli; proniotores do gene de álcool desidrogenase, gene de fosfatase ácida, gene que metaboliza a galactose, gene de gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase ou siinilares em levedura; proinotores do gene de a- amilase, gene de glucoamilase, gene de celobioidrolase, gene de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, gene abpl ou siniilares em fúngos; um promotor CahliV 35S RNA, um proniotor CaMV 19S RNA ou um promotor de gene de nopalina sintetase em plantas.
Um hospedeiro, em que o polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção é introduzido, pode ser selecionado de maneira apropriada, dependendo do tipo do vetor usado, a partir de actinomicetos, Escherichia co/i, Bacillus subtilis, levedura, bactérias filamentosas, células de plantas ou sirnilares.
Um método de introduzir um vetor recombinante em um hospedeiro pode ser selecionado, dependendo de uma célula hospedeira em teste, a partir da transferência conjugal, transdução por fago, bern como métodos de transformação tais como um método de íon cátion, um método de íon litio, ll111 método de eletroporação, iun método PEG, um método de Agrobacterium ou um método de arma de partícula.
Em casos onde uma pluralidade de genes é introduzida ern célula hospedeiras na presente invenção, os genes podem estar contidos em 5 uma molécula única de DNA ou individualmente em diferentes moléculas de DNA.
Adicionahnente, quando uma célula hospedeira é uma bactéria, cada gene pode ser assiin designado para ser expresso como RNAin policistrônico e preparado em uma molécula de DNA.
O transfomiante de acordo com a presente invenção, compreende preferivehnente qualquer un] ou mais de polinucleotídeos com a sequência de nucleotídeos em SEQ ID NO:266 e a (1) anteriormente mencionada; uni polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar na sequência de nucleotídeos em SEQ ID NO:266 e a (1) anterionnente mencionada em condições adversas, ou um polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotideos que codifica pelo menos uma sequência de aniinoácidos selecionada de SEQ ID NOs:267 a 274 ou sequência de aniinoácidos substanciahnente equivalente a mesma.
O tra11sfol1nal1te obtido pode ser cultivado por um método convencional e características recentemente obtidas podem ser estudadas.
Assim como o meio, componentes coniumente usados, por exemplo, tal como fontes de carbono, glicose, sacarose, xarope da arnido, dextrina, amido, glicerol, melaço, óIeos aniinais e vegetais ou similares podem ser usados.
Igualmente, como fontes de nitrogênio, flor de soja, gérmen de trigo, água de maeeração de inilho, farelo de algodão, extrato de eame, polipeptona, extrato de malte, extrato de levedura, sulfato de amônio, nitrato de sódio, uréia ou similares podem ser usados.
Além disso, da maneira exigida, a adição de sódio, potássio, cálcio, magnésio, cobalto, cloro, ácido fosfórico (fosfato dipotássio de hidrogênio ou sirnilares), ácido sulfürico (sulfato de magnésio ou similares) ou sais inorgânicos que podem gerar outros íons é efetiva.
Iguahnente, da maneira exigida, várias vitaniinas tal como tiamina (cloridrato de tiamina ou similares), aminoácidos tal conio ácido glutâmico (glutamato de sódio ou siniilares) ou asparagina (DL-asparagina Oll similares), nutrientes traço tais como nucleotídeos, ou agentes de seleção tais como antibióticos 5 podem ser adicionados.
Adicionalmente, substâncias orgânicas ou s"ubstâncias inorgânicas que auxiliam o cresciinento de uma bactéria e proinovern a produção de piripiropeno A podem ser adicionadas de maneira apropriada.
O pH do meio é, por exemplo, cerca de pH 5,5 a pH 8. Assim como o método para cultivo, o cultivo sólido em condições aeróbicas, cultivo com agitação, cultivo com aeração ou cultivo aeróbico na parte inferior podem ser empregados e, em particular, o cultivo aeróbico na parte inferior é rnais apropriado.
A temperatura apropriada para o cultivo é 15°C a 40°C e, em muitos casos, o cresciinento ocorre em tomo de 22°C a 30°C.
A produção de piripiropeno A varia dependendo do meio e condições de cultivo, ou do hospedeiro usado.
Em qualquer método de cultivo, o acúmulo atinge em geral um pico em 2 dias a 10 dias.
O cultivo é fínalizado durante o período em que o acúmulo de piripiropeno A na cultura atinge o pico e uma substância desejada é isolada e purificada a partir da cultura.
Para isolar piripiropeno A a partir da cultura, ele pode ser extraído e purificado por um meio de separação comum usando propriedades deste, tais como um método de extração de solvente, um método de resina de troca iônica, um método de cromatografia em coluna de distribuição ou adsorção, um método de filtração em gel, diálise, uin método de precipitação, um método de cristalização, que pode ser individualmente usado ou aprQpriadamente usado em combinação.
Método para produzir precursor de piripiropeno A A fim de isolar piripiropeno A, o piripiropeno A pode ser isolado de um preeursor de piripiropeno A usando um niétodo conhecido.
Um exemplo do método conhecido inclui o método de WO2009/022702.
Cultivando um microrganismo contendo um vetor que contém um Oll mais dos anteriores, o precursor de piripiropeno A pode ser isolado de piiipiropeno E. O precursor de piripiropeno A pode ser, por exemplo, o composto representado pela fórmula (I) anterionnente Lnel1cionado. 5 Iguahnente, cultivando um microrganismo compreendendo um vetor que contém um ou mais, o precursor de pi1"il)n"openo A pode ser isolado de piripiropeno O. Um exemplo pode ser o composto representado pela fórmula (II) al1terior1nente niencionada.
EXEMPLOS A presente invenção será ilustrada adicionahnente em detalhes pelos exernplos a seguir, que não são pretendidos para restringir a presente invenção. Exemplo 1: Preparação de DNA genômico da cepa de Penicilli'um coprobium PFll69 O ineio NB esterilizado (500 niL) foi colocado em um Fasco de Erlenmeyer (l L). A cepa de Penici//ium coprobium PFl169 (Joumal of Teehnical Disclosure No. 500997/2008 (Dociunento da patente 15)) pré- cultivada em meio de 1/2 CMMY a 28°C por 4 dias foi adicionada ao meio mencionado anteriormente e submetida a cidtura líquida a 28°C por 4 dias. A fíltração foi realizada com Miracloth para obter 5 g de células bacterianas. A partir destas células bacterianas, 30 µg de DNA genÔmico foram obtidos de acordo com o manual anexado ao estojo de purificação de DNA Genomic-tip lOO/G (produzido pela Qiagen K.K.)- Exemplo 2: Oligonucleotídeos iniciadores degenerados para amplificação de Policetídeo Sintase (PKS) e Ragmento amplificado destes Com base em uma sequência de aminoácidos conservada entre várias policetídeo sintases de bactéria filamentosa, os oligonucleotídeos iniciadores a seguir foram desenhados e sintetizados eomo oligonucleotídeos iniciadores degenerados para amplificação:
LCl: GAYCCIMGITTYTTYAAYATG (SEQ ID NO:l) LC2C: GTICCIGTICCRTGCATYTC (SEQ ID NO:2) (ein que R=A/G, Y=C/T, M=A/C, I=inosina).
Usando estes oligonucleotídeos iniciadores degenerados, o DNA genômico preparado no exemplo [ e ExTaq polimerase (produzidos pela Takara Bio lnc.) reagiram naturalmente de acordo com o manual 5 anexado. Um Hagmento amplificado de cerca de 700 bp foi detectado (ver figura 1). Adicionalmente, o h"aginento ainplificado anteriormente mencionado foi analisado para especificar a sequência de seus 500 bp intemos (SEQ ID NO:3).
Exemplo 3: Sequenciamento de DNA genômico em larga escala e pesquisa de homologia de sequência de aminoácidos O DNA genômico da cepa Penicillium coprobium PFl169 obtido no exemplo 1 foi submetido a sequenciamento em larga escala e pesquisa de honiologia para sequências de aininoácidos. Especificamente, parte dos 50 µg de DNA genômico foram pré-tratados e posteriorinente submetidos ao sequenciador de DNA Roche 454FLX para obter cerca de 250 bp, 103 mil das sequências de fi"aginento (no total, 49 Mb de sequência).
Para estas sequências, assim como as sequências entre policetídeo sintases e preniltransf"erases, as cinco sequências a seguir (sequências derivadas de policetídeo sintases: PKS 2 146 a.a. de Aspergillus(A.) jiimigat'us e ácido 6-metilsalicílico sintase 1744 a.a. de Penici/lium(P-) griseq/7I/vun7; bern como preniltransferases: Preniltransferase de Aspe/^g:lllcl.g (A.) Jíunigatus, Preniltransferase de Aspergillus(A.) jiímigatu.s (4-hidroxibezoato octapreniltransferase) e Preniltransferase de Penicilliuní(P-) marneÜèi) fòrani selecionadas e a pesquisa por software de pesquisa homologia de sequência blastx foi realizada, obtendo por meio disso 89, 86, 2, l e 3 de homologia de sequências, respectivaniente (ver tabela 1).
Adicionalmente, a partir da homologia de sequências de PKS 2146 a.a. de A.
.fúmigatus e ácido 6-metilsalicílico sintase 1744 a.a. de P. griseo/7uvum, 19 e 23 de sequências em formato fàsta foram respectivamente obtidas (as sequências em formato fasta de PKS 2146 a.a. de A. ./i//nigatus: SEQ ID NOS: 179 a 197; as sequências em formato fasta de ácido 6-metilsalicí]jco 5 sintase 1744 a.a. de P. grl'seo/7uvll/n: SEQ ID NOs:198 a 220) (ver tabela 1). Tabela 1 Número de Homologia I SEQ ID NO. Nome da enzima I Origem de sequências PKS 2 146 a.a. de A.Jiunigatus 89 i 4-92 jÁcido 6-metilsalicílico sintase l 744 a.a.
| de P. griseo//uvum 86 I 93-178 PoIieetideo Sintases I PKS 2 146 a.a. de A.fumigatus' :9 (Sequàicias em I 179-197 ormato fasta) | Ácido 6-meti]saljcí|icQ sintase 1744 a.a 23 (Sequências em I 198-220 I de P. griseQ/7uvunL formato fasta) I Preniltransferase de A. Jiimigatus 2 i 221,222 I Pre1li]transferase de A- júmigatu.s Preniltrànsferases I (4-hidroxibezoato de 223 | octaprenilti"ansferase) I Pre11üt1"aL1sferaRe de P. ma/'7'le/Tèi 3 224-226 Exemplo 4: Am,plificação por PCR a parti do DNA genômico A partir dos resultados da pesquisa de blastx obtidos no exemplo 3, para policetídeo sintases, 13 tipos de pares de oligonucleotídeo miciador mostrados em SEQ ID NOs:227 a 252 foram sintetizados. Sünilannente, para preniltransferases, 5 tipos de pares de oligonucleotídeo miciador mostrados em SEQ ID NOs:253 a 262 foram sintetizados. Quando o PCR foi realizado com o DNA genômico, usando estes oligonucleotídeos miciadores, os fi"agmentos arnplificados com o tamanho esperado foram observados para todos os pares de oligonucleotídeo iniciador (ver figura 1 e figura 2). Exemplo 5: Construção de biblioteca genômica de fago Uma biblioteca genômica de fago À da cepa Penicilliuní coprobium PF1169 foi construi'da usando o estojo ABlueSTAR Xho IÍ Half-site Arms (produzido pela Takara Bio Inc., Cat. No. 69242-3) de acordo com o manual em anexo. Iisto é, o DNA genôrnico foi parcialniente digerido usando uma enzima de restrição, Sau3A1. O fraginento de DNA com cerca de 20 kb
(0,5 µg) foi ligado a 0,5 µg de DNA ÀBlueSTAR anexado ao estojo.
Esta solução de ligação foi submetida, in vitro, ao empacotamento usando estojo de empacotaniento Lambda INN (produzido pela Nippon Gene Co., Ltd.) com base no rnanual anexado ao estojo para obter l mL de uma solução.
Esta 5 solução com fagos empacotados (10 µL) foi infectada em 100 µL da cepa de E. coli ER1647 e cultivada em um nieio formador de placa a 37°C por toda a noite, obtendo por meio disso cerca de 500 clones de placas.
Assim, foi eonstruída a biblioteca genômica cornposta de cerca de 50.000 clones de fagos, em que lO a 20 kb do DNA genômico da cepa de Penicillium coprobium PFl169 foram introduzidos por infecção.
Exemplo 6: Seleção da biblioteca de fago Para 10.000 clones da biblioteca de fago preparados no exemplo 5, a seleção prirnária foi realizada por hibridização de placa usando, como uma sonda, o produto amplificado de PCR por par de oligonucleotídeo miciador LC.I-LC2c preparado anterionnente.
Para marcação e detecção e da sonda, o sistema de detecção e marcação direta AlkPhos com CDP-Star (produzido pela GE Healthcare, Cat.
No.
RPN3690) foi usado.
A hibridização anterionnente mencionada foi realizada de acordo com o manual em anexo.
Pela seleção primária, 6 clones permaneceram como candidatos.
Adicionalmente, como o resultado da seleção secundária por hibridização de placa, 4 clones foram obtidos.
Estes clones positivos forain infectados na cepa de E. co/i BM25.8 e os fagos foram convertidos em plasmídeos de acordo com o manual em anexo, obtendo por meio disso 4 tipos de plasmideos contendo uma região desejada.
Exemplo 7: Preparação de biblioteca de genoma de fosmídeo Uma biblioteca genôrniea da cepa Penici//iuin coprobium PF1169 foi construída usando estojo de produção de biblioteca de fosmídeo CopyControl (produzido pela EPICENTRE, Cat.
No.
CCFOSllO) de acordo com o manual em anexo.
Isto é, 0,25 µg de Ragmento de DNA de cerca de 40 kb de DNA genômico com extreniidade cega foi entào incorporado no vetor de fomnídeo pCCFOS (produzido pela Epicentre). Esta solução de ligação foi submetida, in vitro, ao empacotamento usando extrato para empacotamento MaxPlax Lambda anexado ao estojo com base no manual anexado ao estojo. 5 Esta solução com vírus empacotado (10 µL) foi infectada ern 100 µL de cepa E. coli EpI300tm Tl r e cultivada em uni meio contendo cloranfenicol a 37°C por toda a noite e selecionada, obtendo por ineio disso cerca de 300 clones de placas.
Assim, cerca de 30.000 clones dos fosrnídeos, em que 40 kb do DNA genômico da cepa de Penici//ium coprobiuní PFl169 foram introduzidos por infecção, foram obtidos.
Eles foram aliquotados em uma placa de 96 poços, de maneira tal que sejam cerca de 50 clones por poço.
Assim, a biblioteca genômica composta de 96 agrupamentos e cerca de 4.800 clones foi eonstruída.
Exemplo 8: Seleção de biblioteca de fosmídeo De acordo com o manual anexado ao fosmideo, os DNAs de plasmídeo foram preparados individualmente a partir dos 96 agrupainentos da biblioteca preparada no exemplo 7. Usando os oligonucleotídeos iniciadores degenerados para ainplificação de poIicetídeo sintase sintetizada no exeniplo 2, o PCR foi realizado para os 96 agrupamentos destas amostras de DNA de plasmídeo.
Como um resultado, os fraginentos de DNA de cerca de 700 bp foram amplificados a partir dos 9 agrupamentos.
Adicionahnente, uma placa de Petri contendo colônias de cerca de 300 clones ou mais foi preparada a partir dos agrupamentos positivos e a re-seleção foi realizada por hibridização de colônia.
Como um resultado, usando o par de oligonucleotídeo iniciador LC1-LC2c, 9 tipos de fosmídeos foram obtidos de cerca de 4.800 clones.
Exemplo 9: Sequenciamento de DNA genômico em larga escala e pesquisa de homologia de sequência de aminoácidos O DNA genômico da cepa de Penici/liunz c'oprobium PFl169 obtido no exemplo l foi submetido a sequenciamento em larga escala e pesquisa de homologia para sequências de aminoácidos.
Especificamente, parte de 50 µg do DNA genômico foi pré-tratado e então submetido ao sequenciador de DNA Roche 454FLX para obter sequências do Ragmento 1405 com uma média de cotnpri1]]ento das sequências no formato fasta de 5 19,62 l kb (sequência de um comprimento de base total de 27,568 160 Mb). Para estas sequências, assim como sequências conhecidas entre policetídeo sint.ases e preniltransferases, as cmco sequèncias a seguir (sequências derivadas de policetídeo sintases: ácido 6-metilsahcíhco sintase 1744 a.a. de Penicillium(P.) griseo/7uvuni (P22367) e PKS 2146 a.a. de Aspergillus(A.) júmigatus (Q4WZA8); bem conio preniltransferases: preni/transferase de Penici/lium(P-) marnef/ei (QOMRO8), preniltransferase de ASpergillu.ç (A-) .fúmigatus (Q4WBI5) e preniltransferase de Aspergi/lus(A.) jiln?igatus (4-hidroxibezoato octapreniltransferase) (Q4WLDO)) foram selecionadas e a pesquisa pelo software de pesquisa de homologia de sequência blastx foi realizada, obtendo por meio disso 22 (P22367), 21 (Q4WZA8), 2 (QOMRO8), 3 (Q4WBI5) e 3 (Q4WLDO) das sequências honiólogas, respectivamente.
Exemplo 10: Seleção de biblioteca de fosmídeo e análise de sequência de genes em amlpan1ento De acordo com o manual anexado a um estojo de fosmídeo (produzido pela EPICENTRE, CopyControl Fosmid Library Production Kit), os DNAs de plasmídeo foram preparados individualmente a partir de 96 agrupamentos da biblioteca preparada no exemplo 7. Com base nas bases de sequências de base determinadas pelo sequenciador de DNA Roche 454FLX, a pesquisa de homologia para sequências de aminoácidos foi realizada para procurar regiões adjacentes à policetídeo sintase e preniltransferase.
Com base na sequência base de preniltransferase da região obtida, uin par de oligonueleotídeo iniciador (No. 27) capaz de amplificar hagmento de DNA de 400 bp foi sintetizado.
Usando os oligonucleotídeos miciadores, o PCR foi realizado para estes 48 agrupamentos de amostras de DNA de plasmideo. Como um resujtado, os fi"aginentos de DNA esperados de cerca de 400 bp (SEQ ID NO:263) foram ainplificados a partir de ll agrupamentos (ver figura 3). Adicionalniente, uma placa de Petri contendo colônias de cerca de 300 5 clones ou mais foi preparada a partir de 6 agrupainentos dos agrupamentos positivos e a re-seleção foi realizada por hibridização de colônia. Como um resultado, usando o par de oligonucleotídeo hiiciador 27F + 27R (oligonudeotídeo iniciador 27F: SEQ ID NO:264, oIigonucleotídeo iniciador 27R: SEQ ID NO:265), 4 tipos de fosmídeos foram obtidos a partir de cerca de 4.800 clones. Um deles foi denoniinado pCCl-PPl e a sequência total do üagmento inserido foi determinada (SEQ ID NO:266). O opCCl-PPl obtido foi transformado na cepa Escherichia coli EPI300tm~T1r (incluída no estojo do fosmídeo), obtendo por meio disso a cepa Escherichia coli EPI300"-TI ' lpCC l-PPl.
Quando uma pesquisa de homologia foi realizada entre a sequência de SEQ ID NO:266 anteriormente mencionada e cada uma da enzima formadora de adenilato; policetídeo sintase do tipo LovB; citocromo P450 mono-oxigenase, proteína integral de meinbrana, mono-oxigenase dependente de FAD, que são hidroxilases; preniltransferase do tipo; acetiltransferase, proteína de biossíntese de toxina Tti7, que são acetiltransferases; e ATPase transportadora de cátion (as enzimas anterionnente mencionadas são todas derivadas da cepa Áspergillus fumigatus Af293), uma alta homologia de 70 °/) ou mais foi observada em qualquer pesquisa. Os nucleotídeos 3342 a 5158 de SEQ ID NO:266 codificam enzima formadora de adenilato e o polipeptídeo eorrespondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:267; os nucleotídeos 5382 a 12777 de SEQ ID NO:266 codificam policetídeo sintase do tipo LovB e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:268; os nucleotídeos 13266 a 15144 de SEQ ID NO:266 (posteiiormente, uma proteína codificada por esta sequência de polinucleotídeos (P450-1) é referida como citocromo P450 mono-oxigenase (1)) e os nucleotídeos 16220 a 18018 (posteliorn1ente, uma 5 proteína codificada por esta sequência de polinucleotídeos (P450-2) é referida como citocromo P450 mono-oxigenase (2)) codificam citocromo P450 mono- oxigenases e os polipeptídeos correspondentes são mostrados com as sequências de aminoácidos representadas em SEQ ID NOs:269 e 270, respectivamente; os nucleotídeos 18506 a 19296 de SEQ ID NO:266 codificam proteína integral de nienibrana e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de arninoácidos representada em SEQ ID NO:271; os nucleotídeos 19779 a 21389 de SEQ ID NO:266 codificam mono- oxigenase dependente de FAD e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:272; os nucleotídeos 21793 a 22877 de SEQ ID NO:266 codificain preniltransferase do tipo IjbiA e o poIipeptídeo correspondente é inostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:273; os nucleotídeos 23205 a 24773 de SEQ ID NO:266 codificam acetiltransferase e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:274; os nucleotídeos 25824 a 27178 de SEQ ID NO:266 codificam proteína de biossmtese de toxina Tri7 e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:275; e os nucleotídeos 27798 a 31855 de SEQ ID NO:266 codihcam ATPase transportadora de cátion e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:276. Exemplo ll: Hidroxilação de piripiropeno E ou piripiropeno O por transfomiação de Aspergi//us On'zae O piripiropeno E usado a seguir pode ser produzido, por exemplo, por um método para cultivar um microrganismo com base no método descrito no pedido de pat'ente submetido à inspeção pública 239385/1996 (Documento da patente 4), WO94/09147 ou patente U.S. 5597835, ou no método de síntese total descrito em Tetrahedron Letters, vol.
37, No. 36, 6461-6464, 1996. Igualmente, o piiipiropeno O usado a seguir 5 pode ser produzido, por exemplo, por um método para cultivar ll111 microrganisino com base no método descrito em J. Antibiotics 49, 292-298, 1996 ou WO94/09l47.
(1) Preparação de vetor de expressão para introduzir em bactéria filamentosa pUSA (Figura 4) e pHSG399 (Takara Bio Inc.) foram digeridos individuahnente com Kpnl e ligados obtendo por nieio disso pUSA- HSG. Este plasmídeo foi digerido com Smal e Kpnl na ordem mencionada, e submetido a purificação eni gel, obtendo por rneio disso um vetor linear de DNA 'com uma extremidade coesiva Kpnl e extreniidade cega Smal. (2) Preparação de plasmídeo pPP2 Com o fosmídeo pCCl-PPl como uni molde, o polinucleotídeo da P450- ] anteriormente rnencionada foi amplificado usando um par de oligonucleotídeo iniciador P450-1 coni Kpn F (SEQ ID NO:277)/P450-l com Swa R (SEQ ID NO:278). O Hagmento purificado de DNA foi clonado em pCR-Blunt (Invitorogen, Cat. No. K2700-20). O plasmídeo obtido foI digerido com Kpnl e Swal. P Nagmento de P450-1 anterionnente niencionado foi ligado ao vetor pUSA-HSG anteriorinente descrito, obtendo por meio disso um plasmídeo pPP2 mostrado na figura 5- (3) Preparação de Plasrnídeo pPP3 Com o fosmídeo pCCl-PPl como um molde de acordo com o fluxo mostrado na figura 6, éxons sozinhos foram amplificados primeiro usando pares de oligonucleotídeo iniciador F1(SEQ ID NO:279)/R1(SEQ ID NO:280), F2(SEQ TD NO:281)/R2(SEQ ID NO:282), F3(SEQ ID NO:283)/R3(SEQ ID NO:284), F4(SEQ ID NO:285)/R4(SEQ ID NO:286),
F5(SEQ ID NO:287)/R5(SEQ ID NO:288) e F6(SEQ ID NO:289)/R6(SEQ ID NO:290), obtendo por meio disso seis Nagmentos.
A seguir, a amplificação foi realizada com estes hagmentos como moldes usando pares de oligonucleotídeo iniciador de F1/R2, F3/R4 e F5/R6, obtendo por meio 5 disso fragmentos maiores.
Adicionalmente, repetindo a amplificação que usa pares de oIigonucleotídeo iniciador de F1/R4 e F1/R6, o DNAc que não contém introns do polinucleotídeo da P450-2 anteriormente mencionada foi preparado.
Este fagnento de DNAc foi inserido eni pCR-Blunt (Invitorogen, Cat.
No.
K2700-20) e o plasrnídeo obtido foi usado como um molde para amplificação por um par de oIigonucleotídeo iniciador, infüsão F de P450-2- DNAc (SEQ ID NO:291)/infúsào R de P450-2-DNAc (SEQ ID NO:292). Com base no nianual do estojo, um plasmídeo pPP3 mostrado na figura 7 fòi obtido usando estojo ln-Fusion Advantage PCR (Clontech). (4) Transforniação de Aspergillus Oryzae (A. oryzae) Em um meio de ágar C1)-Met (contendo L-Metionina 40µg/niL), A. otyzae (cepa HL- 1105) foi cultivada a 30°C por uma semana.
A partir desta placa de Petri, os conídios (> 1 08) foram coletados e semeados em
100 niL de nieio h'quido YPD em um fi"asco de 500 nil- Após cultivo de 20 horas (30°C, 180 ipm), as células bacterianas com um forina de bola de musgo forani obtidas.
As células bacterianas fòram coletadas com um filtro de vidro 3G-l, lavadas com NaCl 0,8 M, e a água foi iguahnente removida.
O resultante fiji suspenso com soIução TF I (solução de formação de protoplasto) e a seguir agitado a 30°C, em 60 rpm por 2 horas.
Em um intervalo de 30 minutos, foi realizada observação em microscópio e a presença de protoplastos foi conferida.
Posteriormente, o meio de cultura foi filtrado e submetido a centrifügação (2.000 rpm, 5 niinutos) para coletar protoplastos, que forain então lavados coin solução de TF II.
Após a lavagem,
um volume de 0,8 de solução TF II e volume de 0,2 de TF solução III foram adicionados e misturados, obtendo por meio disso uma suspensão de protoplasto.
À 200 µL desta suspensão, foi adicionado lO µg de DNA de plasmídeo (pPP2 ou pPP3). A mistura ficou no gelo 30 niinutos e foi adicionada corn a solução TF III (1 niL). A mistura resultante foi gentilmente 5 nn)sturada e a seguir ficou em temperatura ambiente por 15 minutos.
Posterionnente, o DNA de plasmídeo foi introduzido nos protoplastos anteriomiente mencionados.
A este, a solução TF II (8 ML) foi adicionada e submetida à centrifúgação (a 2.000 rpin por 5 minutos). Adicionahnente, os protoplastos foram entào recuperados com 1 a 2 nil- que sobraram.
A solução de protoplasto recuperada foi liberada em um ineio de regeneração (camada mferior) e o meio de regeneração (camada superior) foi vertido.
O resultante foi inisturado girando uma placa de Petri e então cultivado a 30°C por 4 a 5 dias.
Os clones gerados foram isolados no meio de regeneração (camada inferior), subcultivados e purificados, obtendo por meio disso uni transfomiante (Aspergi//us otyzae PP2-l e Aspergi//us oryzae PP3-2)- A solução TF I anterion]]ente mencionada (solução de formação de protoplasto) foi preparada com as coniposições a seguir.
Nome do composto Concentração Yatalase (produzida por Takara Bio Inc.) 20 mg/rnl Sulfato de Aniônio 0.6 M Ácido maléico-NaOH 50 niM
Após as composições anteriormente mencioandas (pH5,5) serem preparadas, foi realizada esterilização em Mro.
A solução TF Il anteriormente mencionada foi preparada com as composições a seguir.
Nome de Composto Sorbitol 1,2 M (MW=182,17) 43,72 g 50 niM CaCl, 10 ml- CaCl,l M (1/20) 35 rnM NaCl 1,4niLNaCl5M
Tris-llã 10 mM 2 niL Tris-líCl 1 M (1/100) Até o volume total 200 ml- Após as composições anteriormente mencionadas serem preparadas, foi realizada esterilização por autoclave. 5 A solução TF III anteriormente mencionada foi preparada com as composições a seguir. Nome de Composto 60 °/, PEG4000 6g CaCl, 50 rríM 500 µL ] M CaCl, (1/20) Tris-HCl 50 niM 500 µL 1 M Tris-HCl(l/l0O) Até o volume total lO niL Após as composições anteriormente mencionadas serem preparadas, foi realizada esterilização por íiltro.
O meio de regeneração anterionnente mencionado foi preparado com as composições a seguir. Nome de Con]posto Concentração Sorbitol (MW=182.17) 218,6 g 1,2 M NaNO, 3,0 g 0,3 °4(p/v) KCl 2,0 g 0,2 °4 (p/v) KFI,PO, 1,0 g 0,l°/)(p/v) MgSO,·7lil,O 2 niL de MgSO4 ] M 0,05°/o2lnM Solução de elementos traço 1 inlj GIicose 20.0 g 2°4(p/v) Até o volume total 1L Após as composições anterionnente mencioandas (pH5,5) serem preparadas, foi realizada esterilização por autoclave. Além do inais, a solução de elementos traço usada ànteriormente foi preparada com a composição a seguir. Nome de Composto
FeSO4'7H,O 1,0 g
ZnSO,·71il,O 8,8 g
CuSO,·5H,O 0,4 g
Na,B4O,'l0H,O 0,1 g
5 (NH4)6Mo,O,,·4H,O 0,05 g
Até o voluine total 1L Após as composições anteriorrnente mencionadas serem preparadas, foi realizada esterilização por autoclave. (5) Análise da fúnção e adição teste de cultura de P450-1 A um meio YPD (extrato de levedura 1 °/, (p/v), peptona 2 °/, (p/v), dextrose 2 °/) (p/v)) c.ontendo maltose l °/) (p/v), um volume 1/100 de 2 ing/niL de solução de sulfóxido de dimetila de piripiropeno E foi adicionado para fornecer o meio A.
A partir da flora de Aspergi/lus on'zae PP2-1 cultivada em meio de ágar Czapek Dox, os conídios desta fòram coletados e suspensos em água esteriliz.ada.
Esta suspensão de conídios foi ajustada para 104 esporos/inL.
Adicionalmente, 100 µL desta suspensão de conídios ajustada foram adicionados a 10 rnL do meio A e cultivados com agitação a 25°C por 96 horas.
A esta solução de cultura, 10 niL de acetona forain adicionados e a niistura foi homogeneizada igualmente.
Posterionnente, a acetona foi removida usando uma centrífúga concentradora.
A esta, lO rriL de acetato de etila foram adicionados e a mistura resultante foi homogeneizada igualmente, e a seguir apenas a caniada de acetato de etila foi recuperada.
Uni produto seco obtido removendo acetato de etila usando a centrífúga concentradora foi dissolvido em 1.000 µL de inetanol.
Isto foi usado como uma amostra e analisado por LC-MS (Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, módulo de separação 2695 module, Coluna: Waters XTerra Cl8 ('D 4,5x50 InIn, 5 µm)) e LC-NMR (Avance500 produzido pela Burker Daltonik)-
Como os resultados da medição LC-MS anteriorinente mencionada, confimiou-se que o composto obtido foi o composto A único que aumentou por um peso niolecular de 16 comparado com piripiropeno E. Além do niais, como os resultados da medição LC-NMR, confirmou-se que este composto A foi um hidróxido na posição 11 de piripiropeno E. Co11f1nnou-se que a citocromo P450 mono-oxigenase anteriorinente 5 mencionada (1) foi uma enzinia que hidroxila a posição 11 de piripiropeno E, com piripiropeno E como um substrato. As propriedades químicas do composto A anteriomente mencionadas são mostradas a seguir:
1. Espectro de massa: ES-MS 468M/Z (M+H)"
2. Fórinula molecular: C27H33NO6
3. HPLC: Coluna: Waters XTerra Coluna Cl8 (5 µm, 4,6 mmx5,0 mm), 40°C, fase móvel: A partir da solução de acetonitrila aquosa a 20 °/) à acetonitrila a 100 °/) em 10 rninutos (gradiente linear), Fluxo: 0,8 niL/min, Detecção: tempo de retenção 6,696 minutos em UV 323 nm
4. Espectro de 'H-NMR (CD,CN, 2H: 3.134, 3.157 H-ll) Os quadros do espectro de 'H-NMR de piripiropeno E e espectro de ]H-NMR de acordo com os 4 descritos anteriomente são mostrados na fígura 8 e figura 9, respectivamente. (6) Análise de fúnção e adição de cultura teste de P450-2 A um meio YPD (extrato de levedura 1 °/) (p/v), peptona 2 °/, (p/v), dextrose 2 °/) (p/v)) c.ontendo maltose l °/) (p/v), Lllll voliune l/lOO de 2 ing/niL de solução de sulfóxido de dimetila de piripiropeno E foi adicionado para fomecer o meio B, e similarmente um volume l/lOO de 2 mg/mL de solução de sulfóxido de dimetila de pihpiropeno O foi adicionado para fomecer o meio C. A partir da flora de Aspergillus oryzae PP3-2 cultivada em meio de ágar Czapek Dox, os conídios deste foram coletados e suspensos em água esterilizada. Esta suspensão de conídios foi qjustada a 104 esporos/niL.
Adicionahnente, 500 µL da suspensão ajustada de conídios foram adicionados a 50 niL do meio B ou meio C e cultivados com agitação a 25°C por 96 horas.
A esta solução de cultura, 50 rnL de acetona foram adicionados e a InistLlra foi homogeneizada iguahnente. Posteiiormente, a acetona foi removida usando 'uma centrífuga concentradora. A esta, 50 nil- de acetato de etila forain adicionados e a niistura resultante foi homogeneizada igualmente e entào 5 apenas a camada de acetato de etila foi recuperada. Um produto seco obtido removendo o acetato de etila usando a centrífüga concentradora foi dissolvido em 1.500 µL de metanol. Este foi usado como uma amostra e analisado por LC-MS (produzido pela Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, módulo de separação 2695, Coluna: Waters XTerra Cl8 ('1) 4,5'<50 mrn, 5 µm)) e LC- lO NMR (produzido pela Burker Daltonik, Avance500). Como os resultados da medição LC-MS, a partir de uma amostra obtida do meio B, o composto B que aumentou por um peso molecular de 32 comparado com piiipiropeno E foi detectado. Iguahnente, a partir de uma arnostra obtida do meio C, o composto C que aumentou por uin peso molecular de 32 comparado com piripiropeno O foi detectado. Adicionalmente, como os resultados da medição LC-NMR, co11finnou-se que o coniposto C foi uni hidróxido de piripiropeno O na posição 7 e posição 13. Confinnou-se que a citocromo P450 mono- oxigenase (2) anteriormente mencionada foi uma enzima que hidroxila a posição 7 e posição 13 de cada um de piripiropeno E ou piripiropeno O. As propriedades físico-químicas do composto B aI1teriormente mencionadas são mostradas a seguir:
1. Espectro de massa: ES-MS 484M/Z (M+H)"
2. FÓrmula molecular: C27H33NO7
3. Coluna de HPLC: coluna Waters XTerra Cl8 (5 µm, 4,6 mmx50 mm), 40°C, fase móvel: A partir da solução de acetonitrila aquosa a '2'0 °'6 à acetonitrila a 100 °/) em 10 minutos (gradiente linear), fluxo: 0,8 niL/min, Detecção: tempo de retenção 5,614 minutos a UV 323 nm- As propriedades físico-químicas do composto C anteriorinente me'ncionados são mostrados a seguir:
1. Espectro d'e massa: ES-MS 542M/Z (M+H)"
2. Fórmula molecular fómmla: C29H35NO9
3. Coluna de HPLC: Coluna Waters XTerra Cl8 (5 µm, 4,6 mmx50 mm), 40°C, fase móvel: A partir da solução de acetonitrila aquosa a 20 °/, à acetonitrila a 100 °/, ein 10 niinutos (gradiente linear), Vazão: 0,8 mL/min, Detecção: tempo de retenção 5,165 minutos eni UV 323 nm
4. Espectro de 'H-NMR (CD,CN, III 4.858 H-l3), (CD,CN, 1H3.65 H-7) Os quadros do espectro de 'H-NMR de piripiropeno O e o composto C anteriormente mencionado são mostrados na figura 10 e figura 11, respectivamente. Números de acesso: FERM BP-l113'3 FERM BP-l1l37 FERM BP-l1141
Claims (27)
1. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fa.to de que é: (a) um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:266, 5 (b) um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibiidizar na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:266 em condições adversas, ou (C) um polinucleotídeo com uma sequência de polinucleotídeos que codifica pelo menos tuna sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs:267 a 274 ou sequência de aininoácidos substancialmente equivalente a mesma.
2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo fato de que codifica pelo menos um polipeptídeo envolvido na biossíntese de piripiropeno A.
3. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptídeo com qualquer uma ou mais atividades da atividade de policetídeo sintase, atividade de preniltransferase, atividade de hidroxilase, atividade de acetiltransferase ou atividade de adenilato sintetase.
4. Polinucleotídeo de acordo coni qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é derivado da cepa Penicillium coprobium PFll69.
5. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que apresenta pelo menos unia sequêneia de nucleotídeos selecionada da sequência de nucleotídeos em qualquer de (1) ou (2) a seguir: (1) uma sequência de nucleotídeos em qualquer de (a) a (h) a seguir: (a) uma sequêneia de nucleotídeos de 3342 a 5158 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266,
(b) uma sequência de nucleotídeos de 5382 a 12777 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (C) uma sequência de nucleotídeos de 13266 a 15144 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, 5 (d) uina sequência de nucleotídeos de 16220 a 18018 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (e) uma sequência de nucleotídeos de 18506 a 19296 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (f) uma sequência de nucleotídeos de 19779 a 21389 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (g) uina sequência de nucleotídeos de 21793 a 22877 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266, (h) uina sequência de nucleotídeos de 23205 a 24773 de uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:266; (2) urna sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar na sequência de nucleotídeos em (1) em condições adversas.
6. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 5, earacterizado pelo fato de que codifica pelo menos um polipeptídeo envolvido na biossíntese de piripiropeno A.
7. PoIinucleotídeo de acordo coni a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptídeo com qualquer uma ou mais atividades da atividade de policetídeo sintase, atividade de preniltransferase, atividade de hidroxilase, atividade de acetiltransferase ou atividade de adenilato sintetase.
8. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptídeo com atividade de hidroxilase.
9. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que é derivado da cepa
Penici/lium coprobium PF1169.
1 0. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptídeo com atividade para hidroxilar a posição 7 e/ou a posição 13 de piripiropeno E 5 ou piripiropeno O.
1 l. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptídeo com atividade para hidroxilar a posição ll de piripiropeno E.
12. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uni ou mais do dito polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou reivmdicação 5.
13. Vetor recombinante de acordo coin a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende tun polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade para hidroxilar a posição 7 e/ou a posição 13 de piripiropeno E ou piripIropeno O.
14. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende tun polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo com atividade para hidroxilar a posição ll de piripiropeno E.
15. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 12, '20 ¢'aracterizado pelo fato de que o dito vetor recombinante é plasmídeo pCCl- PPl,
16. Vetor recombinante de acordo coin a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito vetor recombinante é plasmídeo pPP2.
17. Vetor recombinante de acordo eoin a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito vetor recombinante é plasmídeo pPP3.
1 8. Transformante, caracterizado pelo fato de que compreende qualquer um ou mais dos ditos polinucleotídeos como definidos na reivindicação 1 ou reivindicação 5.
1 9. Transformante de acordo com a reivindicação 18,
caracterizado pelo fato de que o dito transformante é Escherichia coli eompreendendo plasmídeo pCCl-PPl.
20. Transformante de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dito transformante é Aspergillus oryzae 5 compreendendo plasrnideo pPP2.
2 1. Transfonnante de acordo coni a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dito transformante é Aspergillu.s o/yzae compreendendo plasmídeo pPP3.
22. Método para produzir um precursor de piripiropeno A, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um núcrorganismo compreendendo qualquer um ou mais dos ditos vetores como definidos em qualquer uma das reivindicações 12 a 1 7, e isolar o precursor de piripiropeno A a partir do piripiropeno E.
23. Método para produzir um precursor de piripiropeno A, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o dito transformante como definido na reivindicação 20 e o dito transformante como definido na reivindicação 21 simultânea ou separadamente, e isolar o precursor de piripiropeno A a partir do piripiropeno E.
24. Método de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o dito precursor de piripiropeno A é representado pela fórmula (I) a seguir: FÓrmula química 1 Ho,:í:Úa A, O =Ó, H HoíI fórinula (I)
25. Método para produzir um precursor de piripi]rop'en|o A, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microrganis'mo compreendendo qualquer um ou mais dos ditos vetores como definidos em qualquer uma das reivindicações 12 a 17, e isolar o precursor de piripiropeno A a partir do piripiropeno O.
26. Método para produzir um precursor de piripiropeno A, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o dito transformante como definido na reivindicação 21, e isolar o precursor de piripiropeno A a partir do piripiropeno O.
27. Método de acordo coni a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o dito precursor de piripiropeno A é representado pela fórniula (II) a seguir: Fórmula quhnica 2 ,,,8rrQ' ,~'¥' ACO : OH AcO"il fórmula (IT)
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