CN1509334B

CN1509334B - 生产pf1022物质衍生物的转化体及其制备方法以及新型生物合成基因

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Publication number: CN1509334B
Application number: CN028100409A
Authority: CN
Inventors: 矢内耕二; 隅田奈绪美; 渡边学; 守屋达树; 村上健
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2010-04-28
Anticipated expiration: 2022-03-22
Also published as: KR100853891B1; AU2002241272B2; US7432102B2; DE60234091D1; ATE446369T1; JP4104985B2; NO20034072L; CA2441346A1; NZ528268A; EP1380649A1; JPWO2002077244A1; CN1509334A; KR20030093244A; EP1380649B1; NO20034072D0; US20040214274A1; EP1380649A4; WO2002077244A1

Abstract

本发明的目的在于：提供通过直接发酵法制备PF1022物质衍生物、特别是PF1022-220和PF1022-260的方法，以及该方法中所使用的转化体。根据本发明还提供：可以通过将参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因导入由生产PF1022物质的生物诱导的苯丙氨酸营养缺陷型宿主中而获得的生产PF1022物质衍生物的转化体。根据本发明又提供：PF1022物质衍生物的制备方法，所述方法包含培养上述转化体，并且收集PF1022物质衍生物的步骤。

Description

生产PF1022物质衍生物的转化体及其制备方法以及新型生物合成基因

发明背景

发明领域

本发明涉及生产PF1022物质衍生物的转化体以及使用该转化体制备PF1022物质衍生物的方法。本发明还涉及参与由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途径的新型基因。

背景技术

PF1022物质具有驱虫活性，是有望应用于药物、动物药领域的物质。PF1022物质是式(I)

所示的环状缩肽，已知可通过发酵法制备(特开平3-35796号)

该PF1022物质是由L-N-甲基亮氨酸[(CH₃)₂CHCH₂CH(NHCH₃)COOH](缩写H-L-MeLeu-OH)、D-乳酸[CH₃CH(OH)COOH](缩写H-D-Lac-OH)和D-苯基乳酸[C₆H₅CH₂CH(OH)COOH](缩写H-D-PhLac-OH)通过酯键和酰胺键连接而构成的环状缩肽。

另外，PF1022物质也可以以式(II)表示。

式(II)：环(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac)

关于PF1022物质衍生物，已报道可通过发酵法制备PF1022B、PF1022C、PF1022D、PF1022E、PF1022F、PF1022G和PF1022H7种衍生物(特开平5-170749号、特开平6-184126号、WO98/05655号)。另外通过化学合成方法也可以制备具有驱虫活性的各种PF1022物质衍生物(WO94/19334号、WO97/11064号、特许第2874342号)。其中式(III)

或式(IV)：环(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NO₂PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NO₂PhLac)[式中，D-p-NO₂PhLac表示D-对硝基苯基乳酸。]表示的PF1022物质衍生物PF1022-220和式(V)

或式(VI)：环(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NH₂PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NH₂PhLac)[式中，D-p-NH₂PhLac表示D-对氨基苯基乳酸。]表示的PF1022物质衍生物PF1022-260不仅其自身具驱虫活性，作为其他具有强力驱虫活性的PF1022物质衍生物的合成原料也是非常有用的物质(特许第2874342号)。

不过，PF1022-220和PF1022-260只能通过化学合成的方法制备。制备像PF1022物质那样具有复杂的环状母核的环状缩肽时，发酵法的制备方法与化学合成的制备方法相比，通常在实施时，在所需的全部时间、劳力、经费及其它方面有利，且便于实施。因此，对于PF1022-220和PF1022-260所代表的PF1022物质衍生物，也希望采用直接发酵法来制备。

本发明人已将参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因导入生产具有对位未被含氮原子的官能团取代的苯环骨架的次级代谢产物的生物中，获得了转化体，并已进一步确立了使用该转化体制备具有对位被含氮原子的官能团取代的苯环骨架的次级代谢产物的方法(WO01/23542号)。

发明概要

本发明人在将WO01/23542号所记载的方法用于生产PF1022物质的宿主时，可以证明得到的转化体制备式(VII)

或式(VIII)：环(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NO₂PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac)所示的PF1022物质衍生物PF1022-268，以及式(IX)

或式(X)：环(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NH₂PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac)所示的PF1022物质衍生物PF1022-269，但不能证实可制备PF1022-220和PF1022-260。

另一方面，本发明人从生产PF1022物质的生物中诱导了苯丙氨酸营养突变型菌株，用含有参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的多个基因的DNA转化该突变菌株，成功地获得了新型生产PF1022物质衍生物PF1022-220和PF1022-260的转化体。本发明基于上述认识。

本发明的目的在于：提供通过直接发酵法制备PF1022物质衍生物、特别是制备PF1022-220和PF1022-260的方法，以及该方法所使用的转化体。

根据本发明，提供生产PF1022物质衍生物、特别是PF1022-220(式(III))和PF1022-260(式(V))的转化体，所述转化体可通过将参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因(生物合成基因)导入从生产式(I)

所示的PF1022物质的生物中诱导的苯丙氨酸营养缺陷型宿主中而获得。

根据本发明，还提供PF1022物质衍生物的制备方法，其特征在于：培养上述转化体，收集PF1022物质衍生物。

本发明的目的还在于提供与由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途径有关的新型基因。

本发明的新型基因是编码SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列或具有分支酸变位酶活性的其修饰序列的多核苷酸，以及

编码SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列或具有预苯酸脱水酶活性的其修饰序列的多核苷酸。

附图简述

图1显示从委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)中分离的DNA片段的限制性酶切图谱和可读框(ORF)的位置。

图2显示质粒pTrc-papA的构建。

图3显示用于检出papA基因产物的酶活性的氨基酸分析仪的色谱图。

图4显示质粒pTrc-papB的构建。

图5显示用于检出papB基因产物的酶活性的氨基酸分析仪的色谱

图。

图6显示质粒pET-papC1的构建。

图7显示用于检出papC基因产物的酶活性的氨基酸分析仪的色谱图。

图8显示质粒pPF260-A3和质粒pPF260-A4的构建。

图9显示含有Abp1基因的6kb HindIII片段的限制性酶切图谱。

图10显示质粒pABPd的限制性酶切图谱。

图11显示质粒pPF260-B3的构建。

图12显示质粒pPF260-C3的构建。

图13显示XbaI DNA片段的限制性酶切图谱和分支酸变位酶基因的位置。

图14显示质粒pCMHRV4的构建。

图15显示用于检出PF1022物质衍生物PF1022-220的HPLC色谱图。A显示PF1022-220标准品的色谱图、B显示从转化体中制备的试样的色谱图、C显示从转化体中制备的试样和PF1022-220标准品的色谱图。

图16显示用于检出PF1022物质衍生物PF1022-260的HPLC色谱图。A显示PF1022-260标准品的色谱图、B显示从转化体中制备的试样的色谱图。

图17显示从PF1022菌株(FERM BP-2671)的基因组DNA中分离的SacI片段的限制性酶切图谱和PDT基因的位置。

图18显示质粒pDPDT的限制性酶切图谱。

图19显示用于检出PF1022物质衍生物PF1022-220的HPLC色谱图。A显示从TF-57菌株中制备的试样的色谱图、B显示从TF-45菌株中制备的试样的色谱图。

发明详述

微生物保藏

PF1022菌株于1989年1月24日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)。保藏号为FERM BP-2671。

由质粒pUC118-papA转化的大肠杆菌(大肠杆菌JM109)于1999年9月17日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)。保藏号为FERM BP-7256。

由质粒pTrc-papB转化的大肠杆菌(大肠杆菌JM109)于1999年9月17日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)。保藏号为FERM BP-7257。

由质粒pET-papC转化的大肠杆菌(大肠杆菌JM109)于1999年9月17日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)。保藏号为FERM BP-7258。

由质粒pMK01转化的大肠杆菌(大肠杆菌JM109)于1996年7月12日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)。保藏号为FERM BP-5974。

苯丙氨酸营养缺陷型宿主

本发明所使用的苯丙氨酸营养缺陷型宿主是指：通过对原本生产PF1022物质的生物(以下简称为PF1022物质生产菌)实施后面描述的突变处理操作，从该生物中诱导出的苯丙氨酸营养突变型菌株。

优选的苯丙氨酸营养缺陷型宿主有PF1022物质生产菌的突变型菌株，所述突变型菌株是通过使与由分支酸到氨基苯丙酮酸的生物合成途径有关的酶活性，更具体地说，是分支酸变位酶和/或预苯酸脱水酶活性基本上完全丧失、或使它们的酶活性较亲株显著降低，而显示苯丙氨酸营养缺陷型。

显示苯丙氨酸营养缺陷型的突变型菌株可通过紫外线照射、或用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸等诱变剂处理PF1022物质生产菌，然后从实施了上述处理的生物中选择在基本培养基中培养时不能生长，但通过添加苯丙氨酸则可以恢复生长的突变型菌株而得到。

突变型菌株还可以通过利用重组DNA技术而获得。即，可从PF1022物质生产菌中分离编码分支酸变位酶或预苯酸脱水酶的基因，用分离出的基因进行同源重组，来破坏染色体上的靶基因，从而获得目标突变型菌株。基因破坏可以按照公知的方法进行。

利用同源重组进行的基因破坏的方法，大致包括一步基因破坏方法和两步基因破坏方法两种方法。下面，以分支酸变位酶基因为例进行说明。

在一步基因破坏方法中，利用插入型载体或置换型载体。

作为插入型载体，首先要准备含失活的分支酸变位酶基因和用于选择转化体的选择性标记基因的载体。失活的分支酸变位酶基因可以是除了将可单独使分支酸变位酶基因失活的突变导入基因2个不相同的位点之外，其余部位均与原来的分支酸变位酶基因相同的基因。将上述插入型载体导入细胞中，选择在两处突变位点之间的区发生了与染色体上的靶分支酸变位酶基因同源重组的转化体。在这样的转化体中，染色体上分支酸变位酶基因变为2个拷贝。不过，对于任意一个分支酸变位酶基因分别有一个位点导入了突变，因此可以使染色体上的分支酸变位酶基因失活。

作为置换型载体，要准备含有分支酸变位酶基因的载体，所述基因由于选择性标记基因插入分支酸变位酶基因内部从而被选择性标记基因断开。将该置换型载体导入细胞，选择在选择性标记基因的两侧、来源于分支酸变位酶基因的区发生了同源重组的转化体。这样的转化体中，由于染色体上的靶分支酸变位酶基因与插入了选择性标记基因的基因置换，因此可以使染色体上的分支酸变位酶基因失活。

另一方面，在两步基因破坏法中，其中的第一步是构建由分支酸变位酶和选择性标记基因构成的载体，所述分支酸变位酶基因中至少导入了一个以上、可单独使分支酸变位酶基因失活的突变。将上述载体导入细胞，使其在分支酸变位酶基因上的突变部位的上游区与染色体上的靶分支酸变位酶基因发生同源重组。结果，在染色体上，形成2个拷贝的靶分支酸变位酶基因夹住含选择性标记基因的载体本身的形式，在2个拷贝的靶分支酸变位酶基因中，产生了含突变和不含突变的基因。

接着，夹于2个拷贝的靶分支酸变位酶基因之间的载体部分环出，在突变位点的下游区再次发生同源重组，结果，含选择性标记基因的载体和1个拷贝的靶分支酸变位酶基因丢失，染色体上的分支酸变位酶基因被置换为含有突变的靶分支酸变位酶基因，从而可使染色体上的分支酸变位酶基因失活。发生上述重组的菌株可以以标记基因丢失为指标进行选择。此时，显然作为第一步，在突变位点的下游区发生同源重组，即使接着在上游区发生同源重组，也可得到同样的结果。

本发明中优选的苯丙氨酸营养缺陷型宿主的例子有：从属于无孢目(Agonomycetales)的丝状菌诱导的苯丙氨酸营养突变型菌株，优选从无孢菌类(Mycelia sterilia)诱导的苯丙氨酸营养突变型菌株，更优选从以保藏号FERM BP-2671保藏于原生命工学技术研究所的PF1022菌株诱导的苯丙氨酸营养突变型菌株。最优选从无孢菌类诱导、且其苯丙氨酸营养缺陷型的特征为由内源性分支酸变位酶活性和/或预苯酸脱水酶活性丧失而引起的苯丙氨酸营养突变型菌株。

生物合成基因

参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成的酶有：4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶、4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶和4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶(Blanc，V.等，Mol.Microbiol.，23，191-202(1997))。由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径大致如下所述。

4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶作用于分支酸，生成4-氨基-4-脱氧分支酸，4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶作用于生成的4-氨基-4-脱氧分支酸，生成4-氨基-4-脱氧预苯酸，4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶作用于生成的4-氨基-4-脱氧预苯酸，生成对氨基苯丙酮酸。

这里所说的4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶是指作用于分支酸、将其转化为4-氨基-4-脱氧分支酸的酶。4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶作为从分支酸到对氨基苯甲酸生物合成系统的一部分，广泛存在于生物界。对氨基苯甲酸由分支酸经两步反应生成。其中，4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶催化第一步反应，4-氨基-4-脱氧分支酸裂合酶催化之后的反应(

，J.M和Nichols，B.P.，J.Biol.Chem.，266，12971-12975(1991))。

已报道的编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因有：来源于大肠杆菌(Escherichia coli)(Kaplan，J.B.和Nichols，B.P.，J.Mol.Biol.，168，451-468(1983)、Goncharoff，P.和Nichols，B.P.，J.Bacteriol.，159，57-62(1984))、枯草杆菌(Bacillus subtilis)(Slock，J.等，J.Bacteriol.，172，7211-7226(1990))、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(Kaplan，J.B.等，J.Mol.Biol.，183，327-340(1985)、Goncharoff，P.和Nichols，B.P.，Mol.Biol.Evol.，5，531-548(1988))、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)(Blanc，V.等，Mol.Microbiol.，23，191-202(1997))、委内瑞拉链霉菌(Brown，M.P.等，Microbiology.，142，1345-1355(1996))、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Edman，J.C.等，Yeast.，9，669-675(1993))的基因，可以使用这些基因。也可以按照常规方法，从具有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶活性的生物中分离除上述之外的编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因来使用。

另一方面，4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶有：如来源于大肠杆菌、枯草杆菌、肺炎克雷伯氏菌那样的被分成2条多肽的酶，和如来源于部分放线菌和酿酒酵母那样的由1条多肽构成的酶。本发明中，由于需要将多个基因导入宿主，因此，优选使用编码由1条多肽构成的4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因。

本发明中，编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因的优选例子有：编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶活性的其修饰序列的基因。更优选含有SEQ ID NO.1所示的DNA序列的基因。

本发明中，“修饰序列”是指具有选自置换、缺失、插入和添加中的1个以上、例如1～数个修饰的序列。

本发明中，对于修饰氨基酸序列是否具有4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶活性，可以使由该氨基酸序列构成的蛋白质作用于底物，通过检测反应产物来评价。例如可以按照后面描述的实施例2的方法进行评价。

这里所说的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶是指作用于4-氨基-4-脱氧分支酸，并将其转化为4-氨基-4-脱氧预苯酸的酶。

这里所说的4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶是指作用于4-氨基-4-脱氧预苯酸，并将其转化为对氨基苯丙酮酸的酶。

编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶和4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶的基因可以从可生物合成对氨基苯丙酮酸的生物中获得。更具体地说，可例举有：生产原始霉素I的始旋链霉菌、生产春霉素B的劳意德链霉菌(Streptomyces loidens)、生产棒杆菌素(corynesin)的石蜡诺卡氏菌(Nocardia parafinnica)和解烃棒杆菌(Corynebacteriumhydrocarboclastus)、生产氯霉素的委内瑞拉链霉菌等。

其中，已经从始旋链霉菌中分离出推断为编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶和4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶的基因，其核苷酸序列也已确定(V.Blanc等，Mol.Microbiol.，23，191-202(1997))，可以用于本发明。

编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶的基因大多已经从细菌、酵母、植物等中分离出来，可以以这些为基础，利用蛋白质工程技术或进化工程技术来进行修饰，通过置换、缺失或添加适当的氨基酸，使其具有4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶活性和4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶活性，修饰后的基因也可以用于本发明。

编码本发明所使用的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因的优选例子有：编码SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶活性的其修饰序列的基因，更优选含有SEQ ID NO.3所示的DNA序列的基因。

本发明中，对于修饰氨基酸序列是否具有4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶活性，可以使由该氨基酸序列构成的蛋白质作用于底物，通过检测反应产物来评价。例如可以按照后面描述的实施例3的方法进行评价。

编码本发明所使用的4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶的基因的优选例子有：编码SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列或具有4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶活性的其修饰序列的基因。更优选含有SEQ ID NO.5所示的DNA序列的基因。

本发明中，对于修饰氨基酸序列是否具有4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶活性，可以使由该氨基酸序列构成的蛋白质作用于底物，通过检测反应产物来评价。例如可以按照后面描述的实施例4的方法进行评价。

本发明中，如果给出参与生物合成的酶的氨基酸序列，则很容易确定编码该序列的核苷酸序列，可以选择编码SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的各种核苷酸序列。

因此，用于本发明的生物合成基因是指：除SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.5所示DNA序列的部分或完整序列之外，也包括编码相同氨基酸的DNA序列，即含有简并密码子的DNA序列。还包含与此对应的RNA序列。

转化体

本发明的转化体是指包含参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的多个基因(生物合成基因)的宿主。向宿主导入的基因是指在宿主细胞内可复制、且所述多个基因是可表达状态的DNA分子，特别指表达载体。

将包含参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的多个基因的DNA导入该宿主，可获得转化了的生物。本发明中，将多个生物合成基因导入宿主时，各基因可以包含在相同或不同的DNA分子中。并且，当宿主细胞是细菌时，可以设计为使各基因作为多顺反子mRNA表达，也可以作为1个DNA分子。

这里所说的表达载体，可以参考所用宿主细胞的种类，从病毒、质粒、粘粒载体等中适当选择。例如：当宿主细胞为大肠杆菌时，可以选择λ噬菌体类的噬菌体、pBR、pUC系列的质粒；为枯草杆菌时，选择pUB系列质粒；为酵母时，例如，有YEp、YRp、Ycp、YIp系列的质粒载体。

另外，优选所使用的质粒中至少一个含有用于选择转化体的选择标记，选择标记可以使用抗药性基因、与营养缺陷型互补的基因。其优选的具体例子有：当所用的宿主为细菌时，包括氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因等；为酵母时，包括色氨酸生物合成基因(trpI)、尿嘧啶生物合成基因(ura3)、亮氨酸生物合成基因(leu2)等；为霉菌时，包括潮霉素B抗性基因、双丙氨膦抗性基因、博来霉素抗性基因、金担子素抗性基因等。

并且，在表达载体中，各基因表达所需的DNA序列例如启动子、转录起始信号、核糖体结合位点、翻译终止信号、转录终止信号等转录调节信号、翻译调节信号等也可以可操作地连接到生物合成基因上。调节序列的选择和连接可以按照常规方法进行。

作为启动子，可以选择大肠杆菌中的乳糖操纵子、色氨酸操纵子等启动子；酵母中的醇脱氢酶基因、酸性磷酸酶基因、半乳糖利用基因、甘油醛三磷酸脱氢酶基因等启动子；霉菌中的α-淀粉酶基因、葡糖淀粉酶基因、纤维二糖水解酶基因、甘油醛三磷酸脱氢酶基因、Abp1基因等启动子。

转化宿主时所用的方法，可以采用钙离子法、锂离子法、电穿孔法、PEG法、农杆菌法、基因枪法等常规方法，可以根据转化的宿主来选择。

本发明的转化体优选生产式(III)或式(V)所示的PF1022物质衍生物的转化体，其特征在于：(a)来源于生产式(I)所示的PF1022物质的无孢菌类，(b)通过基因破坏，使内源性分支酸变位酶基因和/或预苯酸脱水酶基因破坏，(c)参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因被导入所述转化体中。

PF1022物质衍生物的制备

在本发明中，可通过培养本发明的转化体，获得该培养物来获得所需的PF1022物质衍生物。本发明的转化体的培养可以按照常规方法，适当选择培养基、培养条件等来进行。

培养基中可以添加本发明的转化体可同化的碳源、可利用的氮源、无机盐类、各种维生素、谷氨酸或天冬氨酸等各种氨基酸、核苷酸等微量营养素、抗生素等选择剂。

另外，还可以适当添加有助于本发明的转化体的生长、促进本发明的PF1022物质衍生物的生产的有机物和无机物。并且，可根据需要使用适当含有其它营养物质的合成培养基或天然培养基。

作为培养基所用的碳源和氮源，只要是本发明的转化体可利用的，可以是任意种类。可同化的碳源可以利用例如：蔗糖、葡萄糖、淀粉、甘油、果糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖、核糖、糊精、动物油、植物油或它们的水解物等各种碳水化合物。其浓度通常优选相对于培养基为0.1～5％。

作为可利用的氮源，也可以使用例如蛋白胨、肉膏、玉米浆、脱脂豆粉等动植物体成分；浸膏类；琥珀酸铵盐类、酒石酸铵等有机酸铵类；尿素或其它各种无机酸或有机酸等的含氮化合物。

另外，无机盐类可以适当使用例如可生成钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸、硫酸或其它离子的盐类。

含有其它成分例如酵母等微生物菌体、浸液和浸膏等以及植物体粉末的培养基，只要不妨碍本发明的转化体的生长和本发明的PF1022物质衍生物的生产累积，均可适当使用。另外，培养显示营养需求型的突变菌株时，需将满足该营养需求的物质加入培养基中，但当使用含有天然物质的培养基时，有时无需特别添加这些营养素。

培养基的pH为例如约pH 6～pH 8。培养方法可以通过有氧条件下的振荡培养、通气搅拌培养法或有氧浸没培养法进行。

培养所适宜的温度为15℃～40℃，多在26℃～37℃附近生长。

本发明的PF1022物质衍生物的生产根据培养基、培养条件或所使用的宿主不同而不同，但通常任何一种培养方法均在2天～25天内积累达到最高。在本发明的PF1022物质衍生物的量达到最高时终止培养，从培养物中分离、纯化目标物质。

毋庸置言，需要根据所使用的转化体以及外部条件等，适当调整、选择这些培养基的组成、培养基的流动性、培养温度、搅拌速度、通气量等培养条件，以获得优选的结果。液体培养过程中，如果培养基起泡，可适当使用硅酮油、植物油、矿物油、表面活性剂等消泡剂。

这样得到的培养物中所积累的本发明的PF1022物质衍生物含在本发明的转化体内和培养滤液中，因此，可将培养物离心，使培养物与转化体分离，从各自中收集本发明的PF1022物质衍生物。

从培养滤液中收集本发明的PF1022物质衍生物时，可以按照常规方法，将从培养物中收集本发明的PF1022物质衍生物时所用的方法单独或以任意的顺序组合或反复使用进行。即，可以使用例如提取过滤、离心、透析、浓缩、干燥、冷冻、吸附、解吸、利用对各种溶剂的溶解度差的方法(例如沉淀、结晶、重结晶、反向溶解、逆流分布法、层析等)等方法。

另外，可从本发明的转化体内的培养物中获得本发明的PF1022物质衍生物。根据常规方法，可采用例如从培养物中提取(磨碎处理、加压破碎等)、回收(过滤、离心等)及纯化(盐析、溶剂沉淀法等)等方法。

得到的粗制物质可根据常规方法例如使用硅胶、氧化铝等载体的柱层析或使用ODS载体的反相层析进行纯化。通过上述所示方法或将其适当组合，可从本发明转化体的培养物中获得纯的本发明的目标PF1022物质衍生物。

参与由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途径的酶基因

本发明的目的在于：提供参与由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途径的酶的新型基因。下面，概略描述由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途径：分支酸变位酶作用于分支酸，生成预苯酸，预苯酸脱水酶作用于生成的预苯酸，生成苯丙酮酸。

本发明的新型基因是编码SEQ ID NO.27所述的氨基酸序列或具有分支变位酶活性的其修饰序列的多核苷酸，优选由SEQ ID NO.26所述的DNA序列构成的多核苷酸。

本发明中，对于多核苷酸是否编码具有分支酸变位酶活性的修饰氨基酸序列，可以按照公知的基因重组技术，将该多核苷酸导入宿主(例如大肠杆菌)并表达，使得到的蛋白质作用于底物，通过检测反应产物来评价(参照实施例2、3、4和9)。

本发明的新型基因还是编码SEQ ID NO.38所述的氨基酸序列或具有预苯酸脱水酶活性的其修饰序列的多核苷酸，优选由SEQ ID NO.37所述的DNA序列构成的多核苷酸。

本发明中，对于多核苷酸是否编码具有预苯酸脱水酶活性的修饰氨基酸序列，可以按照公知的基因重组技术，将该多核苷酸导入宿主(例如大肠杆菌)并表达，使得到的蛋白质作用于底物，通过检测反应产物来评价(参照实施例2、3、4和17)。

本发明中，若给出参与由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途径的酶的氨基酸序列，则很容易确定编码该序列的核苷酸序列，可以选择编码SEQ ID NO.27和38所示的氨基酸序列的各种核苷酸序列。因此，本发明的参与由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途径的基因是指：除SEQID NO.26和37所示的DNA序列的部分或完整序列之外，也包括编码相同氨基酸的DNA序列，即含有简并密码子的DNA序列。还包含与此对应的RNA序列。

实施例

以下例举本发明的实施例，这只是举例，并不因此限定本发明，本发明包括在此未例示的多种改变或修饰的方法的全部。

实施例1：由委内瑞拉链霉菌中分离编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因和编码4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶的基因

(1)探针DNA片段的制备

在250ml容积的三角烧瓶中制备50ml为1份的液体培养基(2％可溶性淀粉、1％聚胨、0.3％肉膏、0.05％磷酸二氢钾、pH 7.0)。分别将委内瑞拉链霉菌ISP5230菌株和140-5菌株接种于上述培养基中，在28℃下培养24小时。培养结束后，通过离心，从培养液中收集菌体，按照Genetic Manipulation of Streptomyces，A Laboratory Manual(D.A.Hopwood等，The John Innes Foundation，p.71～78，1985)记载的方法从该菌体中制备染色体DNA。

接着，以上述委内瑞拉链霉菌ISP5230菌株的染色体DNA为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的寡核苷酸为引物进行PCR。使用TaKaRa LA PCR^TM kit Ver.2.1(宝酒造公司)，用GeneAmp PCRSystem 2400(Perkin-Elmer)进行PCR。反应液包括：1μl染色体DNA(相当于0.62μg的量)、5μl随试剂盒附带的10倍浓度反应用缓冲液、8μl2.5mM dNTP溶液、调节为100pmol/μl浓度的上述引物各0.5μl、5μl二甲基亚砜(和光纯药公司)、0.5μl TaKaRa LA-Taq(2.5U)、29.5μl无菌水，配制为50μl。反应条件是：94℃下预处理10分钟后，进行94℃ 1分钟、50℃ 1分钟、72℃ 3分钟的保温，共进行25个循环。反应结束后，取部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明：约2kbp的DNA片段得到特异性扩增。将余下的反应液用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取，用乙醇沉淀。将沉淀重新溶解于无菌水，60μl所得溶液用限制酶BamHI进行消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法，切下约2kbp的条带，回收DNA片段。

将该DNA片段克隆到质粒pTrcHis B(Invitrogen公司)的BamHI位点。得到的质粒中的插入片段的限制性酶切图谱与Brown等(M.P.Brown等，MicrobiologY，142，1345-1355(1996))报道的pabAB基因(U21728)的一致，因此可判断克隆了pabAB基因，将该质粒命名为pTH-PAB。用限制酶BamHI消化质粒pTH-PAB，然后用琼脂糖凝胶电泳分离、回收，将得到的插入片段作为探针，用于后面描述的染色体DNA文库的筛选。

(2)染色体DNA文库的筛选与基因的分离

用限制酶Sau3AI部分消化约10μg委内瑞拉链霉菌140-5菌株的染色体DNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳，分离并回收10kbp～20kbp的DNA片段。

将约0.5μg上述回收的10kbp～20kbp的DNA片段和1μg事先用限制酶BamHI和XhoI双重消化的λDASH II用T4DNA连接酶连接，使用Gigapack III包装提取物(Stratagene)，进行体外包装，构建染色体DNA文库。使其感染大肠杆菌XLI-Blue MRA，形成噬菌斑。

以(1)中分离的约2kbp DNA片段作为探针，使用ECL直接DNA/RNA标记检测系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行噬菌斑杂交，筛选了约24000个噬菌斑。对获得的阳性克隆中的10个进行2次筛选，纯化阳性克隆，然后制备噬菌体DNA。

将这些噬菌体DNA用限制酶BamHI消化，进行DNA印迹分析，结果表明：探针与约1.8kbp和约3.4kbp 2种DNA片段进行了杂交。另外，从噬菌体DNA的限制性酶切图谱的分析中可知：这2种DNA片段在染色体上是相邻的片段。

使用荧光DNA测序仪ABI PRISM 377(Perkin-Elmer)测定这2种DNA片段的全长核苷酸序列。搜索可读框(ORF)，结果如图1所示，可以发现ORFI～IV的ORF。

利用数据库，对由各ORF推断的氨基酸序列与已知氨基酸序列进行同源性搜索，结果表明：ORF I与对氨基苯甲酸合成酶、ORF II与预苯酸脱氢酶，ORF III与分支酸变位酶显示同源性。这里，将ORF I、II和III的基因分别命名为papA、papC和papB。papA编码的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示，papB编码的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.3所示，papC编码的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQID NO.5所示。

实施例2：papA基因在大肠杆菌中的表达

为了获得papA基因的翻译区，以来源于实施例1所示的阳性克隆的噬菌体DNA为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所记载的寡核苷酸为引物，进行PCR。使用KOD Dash(东洋纺织)作为作为DNA聚合酶，用GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer)进行PCR。反应液包括：1μl噬菌体DNA(相当于1μg的量)、5μl随酶附带的10倍浓度反应用缓冲液、5μl 2mM dNTP溶液、调节为100pmol/μl浓度的上述引物各1μl、5μl二甲基亚砜(和光纯药)、1μl KOD Dash、31μl无菌水，配制为50μl。反应条件是：94℃下预处理5分钟后，进行94 ℃30秒、50℃ 2秒、72℃ 30秒的保温，共进行15次循环。将得到的反应液用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取，进行乙醇沉淀。将沉淀重新溶解于无菌水，用DNA平端化试剂盒(宝酒造)使DNA末端产生平端。再用T4DNA激酶(和光纯药)使5’末端磷酸化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切下约2kbp DNA片段并回收，将其克隆到质粒pUC118的SmaI位点，得到质粒pUC118-papA(FERM BP-7256)。

用荧光DNA测序仪ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Perkin-Elmer)测定pUC118-papA(FERM BP-7256)中插入片段的核苷酸序列，结果显示：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中第2043号的胞嘧啶被置换为腺嘌呤。这可推断是由于PCR扩增DNA片段时发生错误，但所编码的氨基酸序列并无变化，因此，可以将pUC118-papA(FERM BP-7256)的插入片段用于后面的实验。

将pUC118-papA(FERM BP-7256)导入大肠杆菌JM110，按照常规方法，从获得的转化体中制备质粒。将该质粒用限制酶BclI消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，分离并回收约2kbp的BclI DNA片段。

另一方面，用限制酶NcoI消化质粒pTrc99A(Amersham PharmaciaBiotech)，用绿豆核酸酶(和光纯药)使DNA末端产生平端。进一步用限制酶SmaI消化该质粒，用T4DNA连接酶进行自身连接，得到质粒pTrc101。

用限制酶BamHI消化pTrc101，用碱性磷酸酶(宝酒造)进行处理后，与上述的2kbp的BclI DNA片段连接。选择相对于pTrc中包含的启动子，papA基因正向插入的质粒，命名为pTrc-papA。上述的质粒构建步骤如图2所示。

将带有pTrc-papA的大肠杆菌JM109菌株接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(1％细菌培养用胰蛋白胨、0.5％酵母膏、0.5％氯化钠)中，在37℃下培养过夜。将1ml得到的培养液接种于100ml的相同培养基中，在30℃下培养4小时，然后添加1ml 100mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，再在30℃下培养3小时。培养后，通过离心，从培养液中收集菌体，使其悬浮于4ml细胞破碎用缓冲液(50mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0)、5mM EDTA、10％甘油)，然后通过超声波破碎细胞。破碎后，通过离心得到上清液，以此作为细胞提取液。另外，对带有质粒pTrc101的大肠杆菌JM109菌株也进行同样的处理，制备细胞提取液。

使用如上所述制备的细胞提取液测定酶活性。即，将100μl细胞提取液、400μl蒸馏水、500μl底物溶液(10mM分支酸钡(Sigma)、10mM谷氨酰胺(和光纯药)、10mM氯化镁、100mM MOPS(和光纯药)、pH 7.5)混合，在30℃下反应2小时。反应结束后，将部分反应液用全自动氨基分析仪JLC-500/V(日本电子株式会社)进行分析。

结果如图3所示，在使用由带有pTrc-papA的大肠杆菌制备的细胞提取液的情况下，在与按照Chia-Yu P.Teng等的方法(Chia-Yu P.Teng等，J.Am.Chem.Soc.，107，5008-5009(1985))合成的4-氨基-4-脱氧分支酸标准品相同保留时间的位置检出了峰。另一方面，在使用煮沸处理的细胞提取液和从带有pTrc101的大肠杆菌中制备的细胞提取液的情况下，则在该位置未检出峰。上述结果表明：papA基因编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶。

实施例3：papB基因在大肠杆菌中的表达

为了获得papB基因的翻译区，以来源于实施例1所示的阳性克隆的噬菌体DNA为模板，以SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所记载的寡核苷酸为引物，进行PCR。使用KOD Dash(东洋纺织)作为DNA聚合酶，用GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer)进行PCR。反应液包括：1μl噬菌体DNA(相当于1μg的量)、5μl随酶附带的10倍浓度反应用缓冲液、5μl 2mM dNTP溶液、调节为100pmol/μl浓度的上述引物各1μl、5μl二甲基亚砜(和光纯药)、1μl KOD Dash、31μl无菌水，配制为50μl。反应条件是：94℃下预处理5分钟后，进行94℃ 30秒、50℃2秒、72℃30秒的保温，共进行15次循环。将得到的反应液用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取，进行乙醇沉淀。将沉淀重新溶解于无菌水，用限制酶BamHI消化后进行琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法切下约0.3kbp的条带，回收DNA片段。

用限制酶BamHI消化pTrc101，用碱性磷酸酶(宝酒造)进行处理后，用T4DNA连接酶与上述0.3kbp的BamHI DNA片段连接。选择相对于pTrc101中包含的启动子papB基因正向插入的质粒，命名为pTrc-papB(FERM BP-7257)(图4)。用荧光DNA测序仪ABI PRISM 310Genetic Analyzer(Perkin-Elmer)测定pTrc-papB(FERM BP-7257)中插入片段的核苷酸序列，结果证实：与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列一致。

将带有pTrc-papB(FERM BP-7257)的大肠杆菌JM109菌株接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(1％细菌培养用胰蛋白胨、0.5％酵母膏、0.5％氯化钠)中，在37℃下培养过夜。将1ml得到的培养液接种于100ml的相同培养基中，在37℃下培养2小时，然后添加1ml100mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，再在37℃下培养5小时。培养后，通过离心，从培养液中收集菌体，使其悬浮于4ml细胞破碎用缓冲液(50mM Tris-盐酸(pH 8.0)、5mM EDTA、10％甘油)，然后通过超声波处理破碎细胞。破碎后，通过离心得到上清液，以此作为细胞提取液。另外，对带有质粒pTrc101的大肠杆菌JM109也进行同样的处理，制备细胞提取液。

使用如上所述制备的细胞提取液测定酶活性。即，将50μl细胞提取液、200μl蒸馏水、250μl底物溶液(2mg/ml 4-氨基-4-脱氧分支酸、10mM氯化镁、100mM MOPS(和光纯药)、pH 7.5)混合，在30℃下反应1小时。反应结束后，将部分反应液用全自动氨基酸分析仪JLC-500/V(日本电子株式会社)进行分析。

结果如图5所示，在使用由带有pTrc-papB(FERM BP-7257)的大肠杆菌制备的细胞提取液的情况下，4-氨基-4-脱氧分支酸的峰减小，新检出了4-氨基-4-脱氧预苯酸的峰。另外，使用煮沸处理5分钟的细胞提取液时也得到了同样的结果。

另一方面，在使用由带有pTrc101的大肠杆菌制备的细胞提取液的情况下，4-氨基-4-脱氧分支酸的峰无变化，也未检出4-氨基-4-脱氧预苯酸的峰。上述结果显示：papB基因编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶，以及papB基因所编码的4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶具有即使煮沸处理5分钟也不会失活的耐热性。

实施例4：papC基因在大肠杆菌中的表达

为了获得papC基因的翻译区，以来源于实施例1所示的阳性克隆的噬菌体DNA为模板，以SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所记载的寡核苷酸为引物，进行PCR。使用KOD Dash(东洋纺织)作为DNA聚合酶，用GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer)进行PCR。反应液包括：1μl噬菌体DNA(相当于1μg的量)、5μl随酶附带的10倍浓度反应用缓冲液、5μl 2mM dNTP溶液、调节为100pmol/μl浓度的上述引物各1μl、5μl二甲基亚砜(和光纯药)、1μl KOD Dash、31μl无菌水，配制为50μl。反应条件是：94℃下预处理5分钟后，进行94℃30秒、50℃2秒、72℃30秒的保温，共进行15次循环。将得到的反应液用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取，进行乙醇沉淀。将沉淀重新溶解于无菌水，用限制酶BamHI消化后进行琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法切下约1kbp的条带，回收DNA片段。

用限制酶BamHI消化质粒pET-11c(Stratagene)，用碱性磷酸酶(宝酒造)进行处理后，通过T4DNA连接酶与上述1kbp的BamHI DNA片段连接。选择相对于pET-11c中包含的启动子，papC基因正向插入的质粒，命名为pET-papC(FERM BP-7258)。

用荧光DNA测序仪ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Perkin-Elmer)测定pET-papC(FERM BP-7258)中插入片段的核苷酸序列，结果证实：与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列一致。

另一方面，使用pET-papC(FERM BP-7258)使papC基因表达时，由来源于载体的14个氨基酸构成的肽添加到papC基因产物的N末端一侧，因此，可以推测不能正确地评价papC基因产物的性质。因此，用限制酶NdeI消化pET-papC(FERM BP-7258)后，用T4 DNA连接酶进行自身连接，得到质粒pET-papC1。通过使用pET-papC1，在大肠杆菌中不是生产融合蛋白质，而是生产papC基因产物本身。上述的质粒构建步骤如图6所示。

将带有pET-papC1的大肠杆菌BL21(DE3)菌株在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(1％细菌培养用胰蛋白胨、0.5％酵母膏、0.5％氯化钠)中，在37℃下培养过夜。将1ml得到的培养液接种于100ml的相同培养基中，在37℃下培养2小时，然后添加1ml 100mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，再在37℃下培养5小时。培养后，通过离心收集菌体，使其悬浮于4ml细胞破碎用缓冲液(50mM Tris-盐酸(pH 8.0)、5mM EDTA、10％甘油)，然后用超声波处理破碎细胞。破碎后，通过离心得到上清液，以此作为细胞提取液。另外，对带有质粒pET-11c的大肠杆菌BL21(DE3)也进行同样的处理，制备细胞提取液。

使用如上所述制备的细胞提取液测定酶活性。即，将40μl细胞提取液、10μl从带有实施例3中记载的pTrc-papB(FERM BP-7257)的大肠杆菌中制备且煮沸处理了的细胞提取液、190μl蒸馏水、10μl 10mMNAD溶液、250μl底物溶液(2mg/ml 4-氨基-4-脱氧分支酸、10mM氯化镁、100mM MOPS(和光纯药)、pH 7.5)混合，在30℃下反应1小时。反应结束后，将部分反应液用全自动氨基酸分析仪JLC-500/V(日本电子株式会社)进行分析。

结果如图7所示，在使用从带有pET-papC1的大肠杆菌中制备的细胞提取液的情况下，4-氨基-4-脱氧分支酸的峰减小，由papB基因产物产生的4-氨基-4-脱氧预苯酸的峰也消失。全自动氨基酸分析仪JLC-500/V未检出对氨基苯丙酮酸，因此不能直接确证其生成。

但是，检出了对氨基苯丙氨酸的峰，可以推测这是由papC基因产物产生的对氨基苯丙酮酸被大肠杆菌的转氨酶氨基化而产生的。另外，在使用经煮沸处理的细胞提取液和从带有pET-11c的大肠杆菌中制备的细胞提取液的情况下，由papB基因产物产生的4-氨基-4-脱氧预苯酸的峰无变化。上述结果显示：papC基因编码4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶。

实施例5：构建用于导入苯丙氨酸营养缺陷型宿主的质粒pPF260-A3 和pPF260-A4

如图8所示，构建用于使papA基因在苯丙氨酸营养缺陷型宿主中表达的质粒pPF260-A3和pPF260-A4。

构建PF1022物质生产菌用的表达载体pABPd，然后，将从实施例2中记载的质粒pUC118-papA(FERM BP-7256)中得到的DNA片段连接在上述载体上，构建表达载体。表达载体的构建方法具体如下。

PF1022物质生产菌的基因组DNA的分离

按照(H.Horiuchi等，J.Bacteriol，170，272-278，(1988))记载的方法，进行PF1022菌株(FERM BP-2671)的基因组DNA的分离。具体步骤如下。首先将PF1022菌株(FERM BP-2671)在种子培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨、0.6％麦胚、0.3％酵母膏、0.2％豆饼和0.2％碳酸钙；灭菌前为pH 7.0；参照国际公开WO97/00944号实施例1)上培养2天，离心(3500rpm、10分钟)回收菌体。

然后，将得到的菌体冷冻干燥，悬浮于TE缓冲液(10mM Tris-盐酸(pH 8.0)、1mM EDTA)，在3％SDS溶液中、60℃处理30分钟，然后用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取，除去菌体残渣。将提取液进行乙醇沉淀后，用RNA酶A(Sigma)和蛋白酶K(和光纯药)处理，进一步通过12％聚乙二醇6000使核酸沉淀。该沉淀用TE饱和苯酚提取，进行乙醇沉淀，将该沉淀溶解于TE缓冲液中，将其作为基因组DNA。

PF1022物质生产菌的基因组文库的构建

将如上制备的来源于PF1022菌株(FERM BP-2671)的基因组DNA用Sau3AI进行部分消化。用T4连接酶(宝酒造、连接试剂盒Ver.2)将其连接到噬菌体载体λEMBL3克隆试剂盒(Stratagene)中的BamHI臂上。将其进行乙醇沉淀，然后溶解于TE缓冲液。使用Gigapack III Plus包装试剂盒(Stratagene)，用全部的连接混合物感染大肠杆菌LE392菌株，形成噬菌斑。使用由该方法得到的1.3×10⁴个(2.6×10⁴PFU/ml)的噬菌体文库进行Abp1基因的克隆。

由来源于PF1022物质生产菌的基因组DNA进行的Abp1基因的克隆

通过PCR法扩增Abp1基因的翻译区作为探针使用。如上所述，以由PF1022物质生产菌制备的基因组DNA为模板，使用由8-73U和8-73R构成的合成引物，按照LETS GO PCR试剂盒(SAWADYTechnology)进行PCR。PCR的反应条件是：以94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒的步骤进行25个循环来进行扩增。以下显示8-73U和8-73R的DNA序列。

8-73U：CTCAAACCAGGAACTCTTTC (SEQ ID NO.15)

8-73R：GACATGTGGAAACCACATTTTG (SEQ ID NO.16)

这样得到的PCR产物用ECL Direct System(Amersham PharmaciaBiotech)进行标记。将如上所述制备的噬菌斑转移到Hybond N+尼龙转移膜(Amersham Pharmacia Biotech)上，进行碱变性处理后，用5×SSC(SSC：15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)洗净，使其干燥，固定DNA。按照试剂盒记载的方法，进行1小时的预杂交(42℃)，然后添加事先已标记的探针，进行16小时(42℃)的杂交。尼龙膜的洗涤按照上述试剂盒中所记载的方法。将洗涤后的尼龙膜浸于检测溶液中1分钟，然后使其对医用X胶片(富士写真胶片)曝光，得到1个阳性克隆。将该克隆进行DNA印迹分析，结果显示：至少6kb的HindIII片段与基因组DNA限制酶片段长度一致。该HindIII片段的限制性酶切图谱如图9所示。将HindIII片段亚克隆到pUC119(pRQHin/119)，用于后面的实验。

表达载体的构建

以pRQHin/119为模板，用PCR法扩增Abp1基因的启动子区和终止子区。启动子的扩增使用由ABP-Neco和ABP-Nbam构成的引物，终止子的扩增使用由ABP-Cbam和ABP-Cxba构成的引物，通过PCRSuper Mix High Fidelity(Lifetech Oriental Co.，Ltd.)进行PCR。反应条件是：以94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒的步骤进行25个循环来进行扩增。以下显示ABP-Neco、ABP-Nbam、ABP-Cbam和ABP-Cxba的DNA序列。

ABP-Neco：GGGGAATTCGTGGGTGGTGATATCATGGC (SEQ ID NO.17)

ABP-Nbam：GGGGGATCCTTGATGGGTTTTGGG (SEQ ID NO.18)

ABP-Cbam：GGGGGATCCTAAACTCCCATCTATAGC (SEQ ID NO.19)

ABP-Cxba：GGGTCTAGACGACTCATTGCAGTGAGTGG (SEQ ID NO.20)

各PCR产物用Microspin S-400柱(Amersham Pharmacia Biotech)纯化，进行乙醇沉淀后，启动子用EcoRI和BamHI消化，终止子用BamHI和XbaI消化，依次连接到用同样的酶消化的pBluesript II KS+上。将其用XbaI消化，插入来源于pMKD01(国际公开WO98/03667号，FERMBP-5974)的越霉素抗性盒中，构建pABPd(图10)。pABPd具有Abp1基因的启动子和终止子。

由实施例2中记载的质粒pUC118-papA(FERM BP-7256)中制备约2kbp的BclI DNA片段。将其插入PF1022物质生产菌用表达载体pABPd的BamHI位点，得到质粒pPF260-A。

接着，用限制酶PstI和BamHI双重消化pPF260-A，制备约1.7kbp的DNA片段。将其亚克隆到pUC119的PstI和BamHI位点，得到质粒pUC119-A。以pUC119-A为模板DNA，以SEQ ID NO.21所示的寡核苷酸为引物，使用Muta-Gene体外诱变试剂盒(Bio-Rad)进行定点诱变，得到质粒pUC119-A1。接着，用限制酶PstI和BamHI双重消化pUC119-A1和pPF260-A，分别制备约1.7kbp和约8.6kbp的DNA片段，将它们连接，得到质粒pPF260-A2。

进一步用限制酶XbaI消化pPF260-A2，然后用T4DNA连接酶进行自身连接，得到质粒pPF260-A3。接着，用限制酶XbaI消化质粒pDHBAR(Watanabe，M.等，Appl.Environ.Microbiol.，65，1036-1044(1999))，制备含双丙氨膦抗性基因的约2.5kbp的DNA片段，将其与事先用限制酶XbaI消化、用磷酸酶处理的pPF260-A3连接，得到质粒pPF260-A4。

实施例6：构建用于导入苯丙氨酸营养缺陷型宿主的质粒pPF260-B3

如图11所示，构建用于使papB基因在苯丙氨酸营养缺陷型宿主中表达的质粒pPF260-B3。

由实施例3中记载的质粒pTrc-papB(FERM BP-7257)中制备约0.3kbp的BamHI DNA片段。将其插入表达载体pABPd(实施例5)的BamHI位点，得到质粒pPF260-B。用限制酶XbaI消化pPF260-B，然后用T4DNA连接酶进行自身连接，得到质粒pPF260-B1。

接着，限制酶PstI消化pPF260-B1，制备约0.6kbp的DNA片段。将其亚克隆到pUC118的PstI位点，使papB基因的方向与lacZ’基因相同方向，得到质粒pUC118-B。以pUC118-B为模板DNA，以SEQ IDNO.22所示的寡核苷酸为引物，使用Muta-Gene体外诱变试剂盒(Bio-Rad)进行定点诱变，得到质粒pUC118-B1。

接着，用限制酶PstI消化pUC118-B1和pPF260-B1，分别制备约0.6kbp和约8.0kbp的DNA片段，将它们连接，得到质粒pPF260-B3。

实施例7：构建用于导入苯丙氨酸营养缺陷型宿主的质粒pPF260-C3

如图12所示，构建用于使papC基因在苯丙氨酸营养缺陷型宿主中表达的质粒pPF260-C3。

由实施例4中记载的质粒pET-papC(FERM BP-7258)中制备约1kbp的BamHI DNA片段。将其插入表达载体pABPd(实施例5)的BamHI位点，得到质粒pPF260-C。用限制酶XbaI消化pPF260-C，然后用T4DNA连接酶进行自身连接，得到质粒pPF260-C1。

接着，用限制酶PstI和SphI双重消化pPF260-C1，制备约1.7kbp的DNA片段。将其亚克隆到pUC118的PstI和SphI位点，得到质粒pUC118-C。以pUC118-C为模板DNA，以SEQ ID NO.23所示的寡核苷酸为引物，使用Muta-Gene体外诱变试剂盒(Bio-Rad)进行定点诱变，得到质粒pUC118-C1。

接着，用限制酶PstI和SphI双重消化pUC118-C1和pPF260-C1，分别制备约1.7kbp和约7.6kbp的DNA片段，用T4DNA连接酶将它们连接，得到质粒pPF260-C3。

实施例8：来源于PF1022物质生产菌的分支酸变位酶基因的分离

来源于PF1022物质生产菌的分支酸变位酶基因如下分离。

经PCR扩增部分基因片段

将来源于拟南芥(Arabidopsis thariana)和酿酒酵母的分支酸变位酶的氨基酸序列进行比较，搜索同源性高的部分。结果，在来源于酿酒酵母的分支酸变位酶的氨基酸序列中，第159号到第164号以及第244号到第249号的部分的同源性高，合成了由此推定的寡核苷酸。其序列如下。

CMUC-U：CAYTWYGGNAARTTYGT (SEQ ID NO.24)

CMUD-L：TAYTCNACYTSNACYTC (SEQ ID NO.25)

(N:A、G、C或T；R:A或G；S:G或C；W:A或T；Y:C或T)不过，CMUC-U中的第9号、CMUD-L中的第6号核苷酸分别用肌苷合成。接着，如下制备作为PCR模板使用的cDNA。

在实施例5记载的培养基、培养条件下培养PF1022菌株(FERM-2671)，离心(3000rpm、10分钟)回收菌体。用纯化水洗涤，在-80℃冷冻，然后在液氮存在下，用搅拌机(日本精机AM-3)粉碎。将其悬浮于变性溶液(4M硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、0.5％N-十二烷基肌氨酸钠、0.1M巯基乙醇)，在室温下搅拌5分钟，然后用2M乙酸钠(pH 4.5)中和，加入TE饱和苯酚进一步搅拌。向其中加入氯仿-异戊醇(24∶1)，搅拌后，通过离心，将用苯酚变性的菌体成分分离。回收上层(水层)，用异丙醇沉淀核酸。

将该沉淀溶解于TE缓冲液(10mM Tris-盐酸(pH 8.0)、1mMEDTA)，使核酸浓度为1mg/ml，用2.5M氯化锂沉淀(5℃、2小时)。离心回收该沉淀，用70％乙醇洗涤，然后重新溶解于TE缓冲液，以此作为总RNA级分。用mRNA纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)从总RNA级分中纯化mRNA。并以该mRNA为模板，使用Time SavercDNA合成试剂盒(Am ersham Pharmacia Biotech)合成cDNA。

以PF1022菌株(FERM-2671)的cDNA为模板，使用SuperTaq premixkit(Sawaday Technology)，进行降落PCR：在94℃进行1分钟的热变性处理后，以94℃ 1分钟、50℃ 2分钟、72℃ 2分钟进行7个循环，之后，每轮将退火温度下降3℃，共计进行28个循环。

结果，扩增了约270bp的片段。将其进行琼脂糖凝胶电泳，使用Sephagrass band prep Kit (Pharmacia Biotech)纯化目标片段。将其连接到pT7-blue T载体(Novagen)。用自动读取测序试剂盒和ALF DNA测序仪II(Pharmacia Biotech)进行序列分析，结果该PCR片段包含了编码SEQ ID NO.27的氨基酸序列中第171号到第251号的序列。

通过噬菌斑杂交进行分支酸变位酶基因的克隆

将实施例5记载的PF1022菌株(FERM-2671)的染色体DNA文库转移到HiBond-N+(Amersham)，以上述约270bp的PCR片段作为探针，通过DIG系统(Behringer Mannheim)进行噬菌斑杂交。结果得到6种阳性克隆。这6种阳性克隆中，将与PF1022菌株(FERM-2671)的染色体DNA的DNA印迹分析显示相同的限制酶片段长度的约7kbp的XbaI片段克隆到pUC18，得到质粒pCM-Xba。

利用该质粒，使用Applied Biosystems公司制造的ABIPRISM 377测序仪进行核苷酸序列的分析。XbaI片段的限制性酶切图谱和分支酸变位酶基因的位置如图13所示。从核苷酸序列的分析可推定分支酸变位酶基因中存在1个内含子，其存在可从cDNA的分析中证实。分支酸变位酶基因的核苷酸序列和由其推定的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.26和SEQ ID NO.27所示。

实施例9：PF1022物质生产菌的分支酸变位酶基因的破坏

如图14所示，构建分支酸变位酶基因破坏用的质粒。用限制酶XbaI消化实施例5中记载的质粒pABPd(图10)，制备含有越霉素抗性基因的约3kbp的DNA。将该DNA片段用绿豆核酸酶(Nippon Gene)处理，产生平端。接着，用限制酶HpaI消化实施例8中记载的质粒pCM-Xba，用磷酸酶处理后，与上述平端DNA片段连接，构建质粒pCMHRV4。

用限制酶XbaI消化pCMHRV4，通过琼脂糖凝胶电泳提取并纯化约10kbp的DNA，然后溶解于TE缓冲液(10mM Tris-盐酸(pH 8.0)、1mMEDTA)，使其浓度为1μg/μl。将该DNA溶液用于下面的转化实验。

PF1022物质生产菌的转化按照国际公开WO97/00944号的实施例1记载的方法进行。具体步骤如下：将PF1022菌株(FERM BP-2671)在实施例5中记载的种子培养基上、在26℃下培养48小时。之后，通过离心(3000rpm、10分钟)收集菌丝体，用0.5M蔗糖溶液洗涤。将得到的菌丝体置于含有3mg/ml β-葡糖醛酸糖苷酶(Sigma)、1mg/ml壳多糖酶(Sigma)和1mg/ml消解酶(生化学工业)的0.5M蔗糖溶液中，在30℃下振荡2小时，原生质体。将得到的混合物过滤，除去菌体残渣。用SUTC缓冲液(0.5M蔗糖、10mM Tris-盐酸(pH 7.5)、10mM氯化钙)通过2次离心(2500rpm、10分钟、4℃)洗涤原生质体，然后用SUTC缓冲液配制1×10⁷个/ml的原生质体悬浮液。

向100μl原生质体悬浮液中加入之前制备的DNA溶液，将得到的混合物在冰冷却下放置5分钟。之后，向该混合物中加入400μl聚乙二醇溶液(60％聚乙二醇4000(和光纯药)、10mM Tris-盐酸(pH 7.5)、10mM氯化钙)，将得到的混合物在冰冷却下放置20分钟。

用SUTC缓冲液洗涤如上处理的原生质体，然后重悬浮于相同的缓冲液中。将得到的悬浮液与马铃薯葡萄糖软琼脂培养基一起铺于含有25μg/ml的潮霉素B和0.5M蔗糖的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上。在26℃下培养5天，出现的菌落为转化体。

将得到的转化体接种于基本培养基(0.5％葡萄糖、0.67％酵母含氮碱(yeast nitrogen base)w/o氨基酸(amino acids)(Difco)、0.12％谷氨酸钠、0.14％天冬氨酸、2μg/ml氯化可啉、1.5％纯化琼脂(Sigma))时，存在不生长的菌株(V4M-11菌株)。另一方面也证实：将V4M-11菌株接种于添加了50μg/ml苯丙氨酸的基本培养基时，则恢复生长。因此表明，V4M-11菌株显示为苯丙氨酸营养缺陷型。

接着，如下测定V4M-11菌株的分支酸变位酶活性。将亲株和V4M-11菌株在实施例5中记载的条件下培养，然后离心收集菌体，将悬浮于破碎用缓冲液(50mM Tris-盐酸(pH 8.0)、5mM EDTA、1mMDTT、1mM PMSF、10％甘油)。将该悬浮液进行超声波处理后，离心收集上清液，以此作为细胞提取液。将30μl细胞提取液、20μl 1M Tris-盐酸(pH 8.0)、50μl 2mM分支酸钡(Sigma)混合，在30℃保温1小时。

接着，加入100μl 1N盐酸，在30℃保温15分钟，再加入800μl 1N氢氧化钠溶液，测定320nm下的溶液吸光度。以加入1N盐酸后加入2mM分支酸钡的试样作为对照。结果如以下表1所示。

表1

以上结果表明：V4M-11菌株丧失分支酸变位酶活性。

实施例10：PF1022物质生产菌分支酸变位酶基因破坏菌株(苯丙氨酸营养缺陷型宿主)的转化

将1μg pPF260-A4、3μg pPF260-A3、3μg pPF260-B3和3μgpPF260-C3混合，用乙醇沉淀后，重新溶解于10μl TE缓冲液(10mMTris-盐酸(pH 8.0)、1mM EDTA)。除添加50μg/ml双丙氨膦取代潮霉素B以外，使用上述制备的DNA溶液，按照实施例9记载的方法转化V4M-11菌株。

从得到的转化体中制备染色体DNA，以此为模板进行PCR，除了循环次数为25个循环以外，均按照实施例2、3和4记载的条件进行PCR，进行papA、papB和papC基因的检测。结果，选择出全部3种基因均被导入的转化体TF-57菌株。

实施例11：转化体的培养和PF1022-220的检测

将在实施例10中选择出的转化体TF-57菌株按照国际公开WO97/20945号记载的条件进行培养。即，在实施例5中记载的种子培养基中、在26℃下培养2天。将2ml得到的培养液接种于50ml生产培养基(0.6％麦胚、1.0％药物介质(pharma media)、2.6％可溶性淀粉、6.0％麦芽糖、0.2％MeSO₄·7H₂O、0.2％NaCl)，并在26℃下培养6天。培养结束后，从40ml培养液中离心收集菌体，用30ml的乙酸乙酯提取。将提取液浓缩干燥后，重新溶解于4ml的甲醇。取其中10μl进行HPLC分析。

HPLC的条件如下：

HPLC系统：岛津制作所LC-10ADVP

柱：Inertsil ODS-24.6×250mm

流动相：乙腈∶水＝70∶30

流速：1.0ml/min

柱温：40℃

检测器：岛津制作所紫外可见光检测器SPD-M10AVP

UV波长：272nm

如图15所示，在转化体TF-57菌株中检出与PF1022-220标准品(20.308min)的保留时间一致的峰(20.520min)。另外，在将来源于转化体的提取液与标准品混合之后进行的HPLC分析实验中，显示该峰与标准品的峰完全重叠(20.470min)。进一步使用LC-MS(四极台式LC/MS系统NAVIGATOR with aQa^TM(Thermoquest))对该峰所含的物质进行质谱分析，结果与标准品一致。上述结果表明：转化体TF-57菌株生产PF1022物质的衍生物PF1022-220。

实施例12：转化体的培养和PF1022-260的检测

将在实施例10中选择出的转化体TF-57菌株按照实施例11记载的条件进行培养。培养结束后，从500ml培养液中离心收集菌体，用500ml甲醇提取。将提取液浓缩干燥后，重新溶解于2ml的甲醇。取其中10μl进行HPLC分析。

HPLC的条件如下：

HPLC系统：岛津制作所LC-10ADVP

柱：Inertsil ODS-24.6×250mm

流动相：乙腈∶水＝55∶45

流速：1.0ml/min

柱温：40℃

检测器：岛津制作所紫外可见光检测器SPD-M10AVP

UV波长：245nm

如图16所示，在转化体TF-57菌株中检出与PF1022-260标准品(27.337min)的保留时间一致的峰(27.301min)。进一步使用LC-MS(四极台式LC/MS系统NAVIGATOR with aQa^TM(Thermoquest))对该峰所含的物质进行质谱分析，结果与标准品一致。上述结果表明：转化体TF-57菌株生产PF1022物质的衍生物PF1022-260。

实施例13：预苯酸脱水酶(PDT)的部分纯化

将PF1022菌株(FERM BP-2671)在实施例11中记载的培养基、培养条件下培养，从约700ml得到的培养液中离心(9000×g、30分钟)回收菌体，将沉淀悬浮于破碎用缓冲液(50mM Tris-盐酸(pH 8.0)、5mMEDTA、1mM DTT、1mM PMSF、20％甘油)，洗涤菌体。进一步进行离心(9000×g、30分钟)，将生成的沉淀重悬浮于800ml上述破碎用缓冲液，制成菌体悬浮液。

将菌体悬浮液用超声波处理(10分钟、3次)，然后离心(9000×g、30分钟、2次)，除去菌体残渣，制成细胞提取液。将该细胞提取液进行Q Sepharose Fast Flow柱层析(Amersham Pharmacia Biotech、2.6×32cm)。流速为1ml/分钟。之后，用540ml缓冲液A(50mM Tris-盐酸(PH 8.0)、1mM DTT、20％甘油)洗涤柱。进一步用含有1M氯化钠的缓冲液A，以总量为730ml的0-1.0M氯化钠的线性浓度梯度洗脱蛋白质。开始浓度梯度洗脱300分钟后，以20ml分部收集，如下测定各流分的PDT活性。即，将20μl 2mM预苯酸钡(Sigma)、8μl 1M Tris-HCl(pH 7.0)、12μl酶试样混合，在30℃下保温30分钟，然后加入360μl1N氢氧化钠溶液，测定320nm的吸光度。结果，在第13号到第16号的流分中检出强活性，将它们汇总，作为Q Sepharose流分(80ml)。

接着，向全量的Q Sepharose流分中加入19.36g硫酸铵，进行离心(20,000×g、15分钟)，除去沉淀，回收上清液。将上清液进行Butyl-Toyopearl 650S柱层析(Toso，1.6×25cm)。流速为1ml/分钟。用含有1.6M硫酸铵的缓冲液A洗涤柱，之后用缓冲液A进行总量为100ml的1.6-0M硫酸铵的线性浓度梯度洗脱，进一步用50ml缓冲液A洗脱蛋白质。浓度梯度洗脱开始50分钟后，以5ml分部收集，如下测定各流分的PDT活性。结果，在第8号到第15号的流分中检出活性，将它们汇总，作为Butyl-Toyopearl流分(40ml)。

向全量的Butyl-Toyopearl流分中加入13.48g硫酸铵，离心(20,000×g、15分钟)回收生成的沉淀。将该沉淀溶解于1ml缓冲液B(50mM磷酸钠(pH 7.0)、1mM DTT、20％甘油)，进行HiLoad 26/60Superdex200pg(Amersham Pharmacia Biotech、2.6×60cm)，用缓冲液B进行洗脱。流速为1ml/分钟。填入试样后，在第160分钟到第220分钟之间以5ml分部收集，测定各流分的PDT活性。结果，在第4号到第8号的流分中检出活性，将它们汇总，作为Superdex200流分(25ml)。

将全量的Superdex200流分进行Macro-Prep Hydroxyapatite(羟基磷灰石)柱层析(Bio-Rad，0.5×20cm)，用缓冲液B进行洗脱。流速为0.5ml/分钟。填入试样后以2ml分部收集，测定各流分的PDT活性。结果，在第2号到第25号的流分中检出活性，将它们汇总，作为羟基磷灰石流分(38ml)。

将全量羟基磷灰石流分用CENTRICON PLUS-20(Millipore)浓缩，进行HiTrap Blue HP(Amersham Pharmacia Biotech、5ml)层析，用缓冲液B进行洗脱。流速为1ml/分钟。填入试样后以2ml分部收集，测定各流分的PDT活性。结果，在第6号到第22号的流分中检出活性，将它们汇总，作为HiTrap Blue流分(34ml)。

将全量HiTrap Blue流分用CENTRICON PLUS-20和Microcon-10(Amicon)浓缩后，进行Superdex75 HR(Amersham Pharmacia Biotech，1.0×30cm)层析，用缓冲液B进行洗脱。流速为0.25ml/分钟。填入试样20分钟后，以0.5ml分部收集，测定各流分的PDT活性。结果，在第7号到第11号的流分中检出活性。通过SDS-PAGE对第5号到第13号的流分进行分析，结果由于约35kDa蛋白质的条带的强弱与酶活性的强弱一致，因此鉴定所得到的蛋白质为PDT。

实施例14：PDT的部分氨基酸序列的测定

(1)N末端氨基酸序列

将实施例13中得到的活性流分进行SDS-PAGE(TEFCO)，用Multifor II(Amersham Pharmacia Biotech)将蛋白质电转印到PVDF膜(Immobilon-PSQ：Millipore)，用考马斯亮蓝-G250(Nakarai Tesque)染色后，水洗风干。从其中切下分子量约为35kDa的条带，用蛋白质测序仪Model 492(Applied Biosystems)分析N末端氨基酸序列。结果得到下述序列。X表示未确定的氨基酸。

N末端氨基酸序列：GHTSAGDAGSKPVVXFLGPISSY(23个残基)(SEQ ID NO.28)

(2)内部氨基酸序列分析(肽作图)

将实施例13中纯化的活性流分进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝-R250(Nakarai Tesque)染色后，切下约为35kDa的条带，在用50％乙腈配制的0.2M碳酸氢铵缓冲液(pH 8.0)中，在30℃下使其完全脱色，在室温下风干2小时。用含0.02％吐温20的0.2M碳酸氢铵缓冲液(pH 8.0)润湿该小凝胶片，加入相对于蛋白质的1/50摩尔的胰蛋白酶(Promega)，在37℃下放置10分钟，然后浸于上述缓冲液，在37℃下反应2天。回收反应后的上清液，进一步用60％乙腈、0.1％三氟乙酸从凝胶片中回收分解产物，与反应上清液合并、浓缩，使用Model 172μ制备型HPLC系统(Applied Biosystems)进行柱层析(RP.300 AquaporeC18，220×2.1mm，0.1％三氟乙酸、5％乙腈～0.085％三氟乙酸、35％乙腈的浓度梯度)，分部收集4种肽。将得到的肽用蛋白质测序仪测定序列。

T-19.4：GVETVDVSSTSR (12个残基)(SEQ ID NO.29)

T-21.0：TLDHFADR (8个残基)(SEQ ID NO.30)

T-33.4：FFVLR (5个残基)(SEQ ID NO.31)

T-47.1：AFPLEQFDLMPVTTIK (16个残基)(SEQ ID NO.32)

实施例15：PDT基因的分离

以实施例14中测定的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO.28)中第4号到第9号的氨基酸序列(PDTN-4，5，6)为基础，合成下述5’一侧的引物。

PDTN-4：TCYGCNGGNGAYGCNGG (SEQ ID NO.33)

PDTN-5：TCRGCNGGNGAYGCNGG (SEQID NO.34)

PDTN-6：AGYGCNGGNGAYGCNGG (SEQID NO.35)

另外，以SEQ ID NO.32氨基酸序列中第5号到第11号的氨基酸序列为基础，合成下述3’一侧的引物。

PDTC-3：GGCATNARRTCRAAYTGYTC (SEQ ID NO.36)

使用上述引物，以PDTN-4×PDTC-3、PDTN-5×PDTC-3、PDTN-6×PDTC-3的组合进行PCR。PCR反应使用KOD Dash(东洋纺织)作为DNA聚合酶，用PERKIN ELMER GenAmp PCR System 9700进行。反应液包括：1μl用实施例5中记载的方法制备的PF1022菌株(FERMBP-2671)的基因组DNA(相当于1μg的量)、5μl随酶附带的10倍浓度反应用缓冲液、5μl 2mM dNTP溶液、调节为100pmol/μl浓度的上述引物各1μl、5μl二甲基亚砜(特级，和光纯药)、1μl KOD Dash、31μl无菌水，配制为50μl。反应条件是：94℃下预处理5分钟后，进行94℃30秒、55℃30秒、74℃30秒的保温，共进行30次循环。将得到的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果发现，以PDTN-6×PDTC-3组合特异性扩增了约200bp的DNA片段。

接着，从琼脂糖凝胶中切下该约200bp的DNA片段，提取、纯化后，用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆。用Perkin Elmer公司制造的荧光DNA测序仪ABI PRISM 310 Genetic Analyzer对得到的质粒的插入片段进行核苷酸序列分析，结果表明：该片段编码的序列与从N末端和肽测定的部分氨基酸序列一致，显示得到的DNA片段是PDT基因的一部分。

以该DNA片段作为探针，用Alkphos Direct Labelling and DetectionSystem(Amersham Pharmacia Biotech)筛选实施例5中构建的PF1022物质生产菌的基因组文库。从得到的阳性克隆中提取噬菌体DNA，用限制酶进行分析，结果表明：作为与上述探针杂交的DNA片段，存在约8.2kbp的SacI片段，因此将该DNA片段亚克隆到pUC118中，得到了质粒pUC-PDT。利用该质粒，采用Applied Biosystems公司制造的ABI PRISM 377测序仪进行核苷酸序列分析。图17显示了SacI片段的限制性酶切图谱和PDT基因的位置。由核苷酸序列分析可以推断PDT基因中存在2个内含子，其存在已由cDNA分析得到证实。PDT基因的核苷酸序列和由其推断的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.37和SEQ IDNO.38所示。SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列中，第91～192号和第254～380号的核苷酸序列分别是内含子。

实施例16：构建PF1022物质生产菌的PDT基因破坏用质粒

PDT基因破坏用的质粒pDPDT如下所示进行构建。

首先，以含有市售的杀稻瘟素S抗性基因(BSD)的质粒pUCSV-BSD(Funakoshi)作为模板DNA，以SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40记载的寡核苷酸作为引物，按照实施例2中记载的方法进行PCR。反应结束后，将部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果证实：特异性扩增了约0.4kbp的DNA片段。将余下的反应液用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取，进行乙醇沉淀。将沉淀重新溶解于无菌水，取60μl用限制酶ClaI和BglII消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法切下约0.4kbp的条带，回收DNA片段。

接着，用限制酶ClaI和BamHI消化质粒pDHBAR(Watanabe，M.等，Appl.Environ.Microbiol.，65，1036-1044(1999))，然后进行琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法切下约2kbp的条带，回收DNA片段。将该DNA片段与上述约0.4kbp的DNA片段连接，得到质粒pDHBSD。用限制酶XbaI消化该质粒，使用DNA平端化试剂盒(宝酒造)产生平端，然后进行琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法切下约2.4kbp的条带，回收DNA片段。

接着，用限制酶EcoRV部分消化实施例15中记载的质粒pUC-PDT，然后按照常规方法切下约11.1kbp的条带，回收DNA片段。将该DNA片段与上述约2.4kbp的DNA片段连接，得到质粒pDPDT(图18)。

实施例17：PF1022物质生产菌的PDT基因的破坏

用限制酶SacI消化实施例16中记载的质粒pDPDT，然后溶解于TE缓冲液(10mM Tris-盐酸(pH 8.0)、1mM EDTA)，使其浓度为1μg/μl。按照实施例9中记载的方法，用该DNA溶液转化TF-57菌株(记载于实施例10)。此时，使用100μg/ml的杀稻瘟素S代替潮霉素B作为选择转化体用的药剂。

将得到的约100株转化体在实施例5记载的条件下培养，离心收集菌体，将其悬浮于破碎用缓冲液(50mM Tris-盐酸(pH 8.0)、5mMEDTA、1mM DTT、1mM PMSF、10％甘油)。将该悬浮液用超声波处理后离心收集上清液，以此作为细胞提取液。使用该细胞提取液，按照实施例13记载的方法测定PDT活性，结果有5株未检出PDT活性，表明这些菌株丧失了PDT活性。

从这些菌株中选择TF-45菌株，与亲株TF-57菌株一起按照实施例1记载的方法培养，进行PF1022-220的检测。结果如图19所示。TF-57菌株在20.303分钟的位置、TF-45菌株在20.294分钟的位置分别检出PF1022-220，TF-45菌株的该峰面积是TF-57菌株约4倍。以上结果表明，通过使PDT活性丧失，可以提高PF1022-220的生产率。

序列表

<110>明治制果株式会社(Meiji Seika Kaisha，Ltd.)

<120>生产PF1022衍生物的转化体和生产所述衍生物的方法以及新型生物合成基因

<130>135522PX

<140>

<141>

<150>82227/2001

<151>2001-03-22

<160>40

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>2061

<212>DNA

<213>Streptomyces venezuelae

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2058)

<400>1

atg cgc acg ctt ctg atc gac aac tac gac tcg ttc acc cac aac ctg 48

Met Arg Thr Leu Leu Ile Asp Asn Tyr Asp Ser Phe Thr His Asn Leu

1 5 10 15

ttc cag tac atc ggc gag gcc acc ggg caa ccc ccc gtc gtc gtg ccc 96

Phe Gln Tyr Ile Gly Glu Ala Thr Gly Gln Pro Pro Val Val Val Pro

20 25 30

aac gac gcc gac tgg tcg cgg ctg ccc gtc gag gac ttc gac gcg atc 144

Asn Asp Ala Asp Trp Ser Arg Leu Pro Val Glu Asp Phe Asp Ala Ile

35 40 45

gtc gtg tcc ccg ggc ccc ggc agc ccc gac cgg gaa cgg gac ttc gga 192

Val Val Ser Pro Gly Pro Gly Ser Pro Asp Arg Glu Arg Asp Phe Gly

50 55 60

atc agc cgc cgg gcg atc acc gac agc ggc ctg ccc gtc ctc ggc gtc 240

Ile Ser Arg Arg Ala Ile Thr Asp Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Val

65 70 75 80

tgc ctc ggc cac cag ggc atc gcc cag ctc ttc ggc gga acc gtc ggc 288

Cys Leu Gly His Gln Gly Ile Ala Gln Leu Phe Gly Gly Thr Val Gly

85 90 95

ctc gcc ccg gaa ccc atg cac ggc cgg gtc tcc gag gtg cgg cac acc 336

Leu Ala Pro Glu Pro Met His Gly Arg Val Ser Glu Val Arg His Thr

100 105 110

ggc gag gac gtc ttc cgg ggc ctc ccc tcg ccg ttc acc gcc gtg cgc 384

Gly Glu Asp Val Phe Arg Gly Leu Pro Ser Pro Phe Thr Ala Val Arg

115 120 125

tac cac tcc ctg gcc gcc acc gac ctc ccc gac gag ctc gaa ccc ctc 432

Tyr His Ser Leu Ala Ala Thr Asp Leu Pro Asp Glu Leu Glu Pro Leu

130 135 140

gcc tgg agc gac gac ggg gtc gtc atg ggc ctg cgg cac cgc gag aag 480

Ala Trp Ser Asp Asp Gly Val Val Met Gly Leu Arg His Arg Glu Lys

145 150 155 160

ccg ctg tgg ggc gtc cag ttc cac ccg gag tcc atc ggc agc gac ttc 528

Pro Leu Trp Gly Val Gln Phe His Pro Glu Ser Ile Gly Ser Asp Phe

165 170 175

ggc cgg gag atc atg gcc aac ttc cgc gac ctc gcc ctc gcc cac cac 576

Gly Arg Glu Ile Met Ala Asn Phe Arg Asp Leu Ala Leu Ala His His

180 185 190

cgg gca cgg cgc cac ggg gcc gac tcc ccg tac gaa ctc cac gtg cgc 624

Arg Ala Arg Arg His Gly Ala Asp Ser Pro Tyr Glu Leu His Val Arg

195 200 205

cgc gtc gac gtg ctg ccg gac gcc gaa gag gta cgc cgc ggc tgc ctg 672

Arg Val Asp Val Leu Pro Asp Ala Glu Glu Val Arg Arg Gly Cys Leu

210 215 220

ccc ggc gag ggc acc acg ttc tgg ctg gac agc agc tcc gtc ctc gaa 720

Pro Gly Glu Gly Thr Thr Phe Trp Leu Asp Ser Ser Ser Val Leu Glu

225 230 235 240

ggc gcc tcg cgc ttc tcc ttc ctc ggc gac gac cgc ggc ccg ctc gcc 768

Gly Ala Ser Arg Phe Ser Phe Leu Gly Asp Asp Arg Gly Pro Leu Ala

245 250 255

gag tac ctc acc tac cgc gtc gcc gac ggc gtc gtc tcc gtc cgc ggc 816

Glu Tyr Leu Thr Tyr Arg Val Ala Asp Gly Val Val Ser Val Arg Gly

260 265 270

tcc gac ggc acc acg acc cgg acg cgg cgc ccc ttc ttc aac tac ctg 864

Ser Asp Gly Thr Thr Thr Arg Thr Arg Arg Pro Phe Phe Asn Tyr Leu

275 280 285

gag gag cag ctc gaa cgc cga cgg gtc ccc gtc gcc ccc gaa ctg ccc 912

Glu Glu Gln Leu Glu Arg Arg Arg Val Pro Val Ala Pro Glu Leu Pro

290 295 300

ttc gag ttc aac ctc ggc tac gtc ggc tac ctc ggc tac gag ctg aag 960

Phe Glu Phe Asn Leu Gly Tyr Val Gly Tyr Leu Gly Tyr Glu Leu Lys

305 310 315 320

gcg gag acc acc ggc gac ccc gcg cac cgg tcc ccg cac ccc gac gcc 1008

Ala Glu Thr Thr Gly Asp Pro Ala His Arg Ser Pro His Pro Asp Ala

325 330 335

gcg ttc ctc ttc gcc gac cgc gcc atc gcc ctc gac cac cag gaa ggc 1056

Ala Phe Leu Phe Ala Asp Arg Ala Ile Ala Leu Asp His Gln Glu Gly

340 345 350

tgc tgc tac ctg ctg gcc ctc gac cgc cgg ggc cac gac gac ggc gcc 1104

Cys Cys Tyr Leu Leu Ala Leu Asp Arg Arg Gly His Asp Asp Gly Ala

355 360 365

cgc gcc tgg ctg cgg gag acg gcc gag acc ctc acc ggc ctg gcc gtc 1152

Arg Ala Trp Leu Arg Glu Thr Ala Glu Thr Leu Thr Gly Leu Ala Val

370 375 380

cgc gcc ccg gcc gag ccg acc ccc gcc atg gtc ttc ggg atc ccc gag 1200

Arg Ala Pro Ala Glu Pro Thr Pro Ala Met Val Phe Gly Ile Pro Glu

385 390 395 400

gcg gcg gcc ggc ttc ggc ccc ctg gcc cgc gcg cgc cac gac aag gac 1248

Ala Ala Ala Gly Phe Gly Pro Leu Ala Arg Ala Arg His Asp Lys Asp

405 410 415

gcc tac ctc aag cgc atc gac gag tgc ctc aag gag atc cgc aac ggc 1296

Ala Tyr Leu Lys Arg Ile Asp Glu Cys Leu Lys Glu Ile Arg Asn Gly

420 425 430

gag tcg tac gag atc tgc ctg acc aac atg gtc acc gcg ccg acc gag 1344

Glu Ser Tyr Glu Ile Cys Leu Thr Asn Met Val Thr Ala Pro Thr Glu

435 440 445

gcg acg gcc ctg ccg ctc tac tcc gcg ctg cgc gcc atc agc ccc gtc 1392

Ala Thr Ala Leu Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Arg Ala Ile Ser Pro Val

450 455 460

ccg tac ggc gcc ctg ctc gag ttc ccc gaa ctg tcg gtg ctg agc gcc 1440

Pro Tyr Gly Ala Leu Leu Glu Phe Pro Glu Leu Ser Val Leu Ser Ala

465 470 475 480

tcg ccc gag cgg ttc ctc acg atc ggc gcc gac ggc ggc gtc gag tcc 1488

Ser Pro Glu Arg Phe Leu Thr Ile Gly Ala Asp Gly Gly Val Glu Ser

485 490 495

aag ccc atc aag ggg acc cgc ccc cgg ggc ggc acc gcg gag gag gac 1536

Lys Pro Ile Lys Gly Thr Arg Pro Arg Gly Gly Thr Ala Glu Glu Asp

500 505 510

gag cgg ctc cgc gcc gac ctg gcc ggc cgg gag aag gac cgg gcc gag 1584

Glu Arg Leu Arg Ala Asp Leu Ala Gly Arg Glu Lys Asp Arg Ala Glu

515 520 525

aac ctg atg atc gtc gac ctg gtc cgc aac gac ctc aac agc gtc tgc 1632

Asn Leu Met Ile Val Asp Leu Val Arg Asn Asp Leu Asn Ser Val Cys

530 535 540

gcg atc ggc tcc gtc cac gtg ccc cgg ctc ttc gag gtg gag acc tac 1680

Ala Ile Gly Ser Val His Val Pro Arg Leu Phe Glu Val Glu Thr Tyr

545 550 555 560

gcg ccc gtg cac cag ctg gtg tcg acc atc cgg gga cgg ctg cgg ccc 1728

Ala Pro Val His Gln Leu Val Ser Thr Ile Arg Gly Arg Leu Arg Pro

565 570 575

ggc acc agc acc gcc gcc tgc gta cgc gcc gcc ttc ccc ggc ggc tcc 1776

Gly Thr Ser Thr Ala Ala Cys Val Arg Ala Ala Phe Pro Gly Gly Ser

580 585 590

atg acc ggc gcg ccc aag aag cgc acc atg gag atc atc gac cgc ctg 1824

Met Thr Gly Ala Pro Lys Lys Arg Thr Met Glu Ile Ile Asp Arg Leu

595 600 605

gag gaa ggc ccc cgg ggc gtc tac tcc ggg gcg ctc gga tgg ttc gcc 1872

Glu Glu Gly Pro Arg Gly Val Tyr Ser Gly Ala Leu Gly Trp Phe Ala

610 615 620

ctc agc ggc gcc gcc gac ctc agc atc gtc atc cgc acc atc gtg ctg 1920

Leu Ser Gly Ala Ala Asp Leu Ser Ile Val Ile Arg Thr Ile Val Leu

625 630 635 640

gcc gac ggc cag gcg gag ttc ggc gtc ggc ggg gcg atc gtg tcc ctc 1968

Ala Asp Gly Gln Ala Glu Phe Gly Val Gly Gly Ala Ile Val Ser Leu

645 650 655

tcc gac cag gag gag gag ttc acc gag acc gtg gta aag gcc cgc gcc 2016

Ser Asp Gln Glu Glu Glu Phe Thr Glu Thr Val Val Lys Ala Arg Ala

660 665 670

atg gtc acc gcc ctc gac ggc agc gcc gtg gcg ggc gcc cga tga 2061

Met Val Thr Ala Leu Asp Gly Ser Ala Val Ala Gly Ala Arg

675 680 685

<210>2

<211>686

<212>PRT

<213>Streptomyces venezuelae

<400>2

Met Arg Thr Leu Leu Ile Asp Asn Tyr Asp Ser Phe Thr His Asn Leu

1 5 10 15

Phe Gln Tyr Ile Gly Glu Ala Thr Gly Gln Pro Pro Val Val Val Pro

20 25 30

Asn Asp Ala Asp Trp Ser Arg Leu Pro Val Glu AspPhe Asp Ala Ile

35 4 045

Val Val Ser ProGly Pro Gly Ser Pro Asp Arg Glu Arg Asp Phe Gly

50 55 60

Ile Ser Arg Arg Ala Ile Thr Asp Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Val

65 70 75 80

Cys Leu Gly His Gln Gly Ile Ala Gln Leu Phe Gly Gly Thr Val Gly

85 90 95

Leu Ala Pro Glu Pro Met His Gly Arg Val Ser Glu Val Arg His Thr

100 105 110

Gly Glu Asp Val Phe Arg Gly Leu Pro Ser Pro Phe Thr Ala Val Arg

115 120 125

Tyr His Ser Leu Ala Ala Thr Asp Leu Pro Asp Glu Leu Glu Pro Leu

130 135 140

Ala Trp Ser Asp Asp Gly Val Val Met Gly Leu Arg His Arg Glu Lys

145 150 155 160

Pro Leu Trp Gly Val Gln Phe His Pro Glu Ser Ile Gly Ser Asp Phe

165 170 175

Gly Arg Glu Ile Met Ala Asn Phe Arg Asp Leu Ala Leu Ala His His

180 185 190

Arg Ala Arg Arg His Gly Ala Asp Ser Pro Tyr Glu Leu His Val Arg

195 200 205

Arg Val Asp Val Leu Pro Asp Ala Glu Glu Val Arg Arg Gly Cys Leu

210 215 220

Pro Gly Glu Gly Thr Thr Phe Trp Leu Asp Ser Ser Ser Val Leu Glu

225 230 235 240

Gly Ala Ser Arg Phe Ser Phe Leu Gly Asp Asp Arg Gly Pro Leu Ala

245 250 255

Glu Tyr Leu Thr Tyr Arg Val Ala Asp Gly Val Val Ser Val Arg Gly

260 265 270

Ser Asp Gly Thr Thr Thr Arg Thr Arg Arg Pro Phe Phe Asn Tyr Leu

275 280 285

Glu Glu Gln Leu Glu Arg Arg Arg Val Pro Val Ala Pro Glu Leu Pro

290 295 300

Phe Glu Phe Asn Leu Gly Tyr Val Gly Tyr Leu Gly Tyr Glu Leu Lys

305 310 315 320

Ala Glu Thr Thr Gly Asp Pro Ala His Arg Ser Pro His Pro Asp Ala

32 5330 335

Ala Phe Leu Phe Ala Asp Arg Ala Ile Ala Leu Asp His Gln Glu Gly

340 345 350

Cys Cys Tyr Leu Leu Ala Leu Asp Arg Arg Gly His Asp Asp Gly Ala

355 360 365

Arg Ala Trp Leu Arg Glu Thr Ala Glu Thr Leu Thr Gly Leu Ala Val

370 375 380

Arg Ala Pro Ala Glu Pro Thr Pro Ala Met Val Phe Gly Ile Pro Glu

385 390 395 400

Ala Ala Ala Gly Phe Gly Pro Leu Ala Arg Ala Arg His Asp Lys Asp

405 410 415

Ala Tyr Leu Lys Arg Ile Asp Glu Cys Leu Lys Glu Ile Arg Asn Gly

420 425 430

Glu Ser Tyr Glu Ile Cys Leu Thr Asn Met Val Thr Ala Pro Thr Glu

435 440 445

Ala Thr Ala Leu Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Arg Ala Ile Ser Pro Val

450 455 460

Pro Tyr Gly Ala Leu Leu Glu Phe Pro Glu Leu Ser Val Leu Ser Ala

465 470 475 480

Ser Pro Glu Arg Phe Leu Thr Ile Gly Ala Asp Gly Gly Val Glu Ser

485 490 495

Lys Pro Ile Lys Gly Thr Arg Pro Arg Gly Gly Thr Ala Glu Glu Asp

500 505 510

Glu Arg Leu Arg Ala Asp Leu Ala Gly Arg Glu Lys Asp Arg Ala Glu

515 520 525

Asn Leu Met Ile Val Asp Leu Val Arg Asn Asp Leu Asn Ser Val Cys

530 535 540

Ala Ile Gly Ser Val His Val Pro Arg Leu Phe Glu Val Glu Thr Tyr

545 550 555 560

Ala Pro Val His Gln Leu Val Ser Thr Ile Arg Gly Arg Leu Arg Pro

565 570 575

Gly Thr Ser Thr Ala Ala Cys Val Arg Ala Ala Phe Pro Gly Gly Ser

580 585 590

Met Thr Gly Ala Pro Lys Lys Arg Thr Met Glu Ile Ile Asp Arg Leu

595 600 605

Glu Glu Gly Pro Arg Gly Val Tyr Ser Gly Ala Leu Gly Trp Phe Ala

610 615 620

Leu Ser Gly Ala Ala Asp Leu Ser Ile Val Ile Arg Thr Ile Val Leu

625 630 635 640

Ala Asp Gly Gln Ala Glu Phe Gly Val Gly Gly Ala Ile Val Ser Leu

645 650 655

Ser Asp Gln Glu Glu Glu Phe Thr Glu Thr Val Val Lys Ala Arg Ala

660 665 670

Met Val Thr Ala Leu Asp Gly Ser Ala Val Ala Gly Ala Arg

675 680 685

<210>3

<211>312

<212>DNA

<213>Streptomyces venezuelae

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(309)

<400>3

atg acc gag cag aac gag ctg cag cgg ctg cgc gcg gag ctc gac gcc 48

Met Thr Glu Gln Asn Glu Leu Gln Arg Leu Arg Ala Glu Leu Asp Ala

1 5 10 15

ctc gac ggg acg ctc ctg gac acg gtg cgg cgc cgc atc gac ctc ggt 96

Leu Asp Gly Thr Leu Leu Asp Thr Val Arg Arg Arg Ile Asp Leu Gly

20 25 30

gtc cgc atc gcg cgg tac aag tcc cgg cac ggc gtc ccg atg atg cag 144

Val Arg Ile Ala Arg Tyr Lys Ser Arg His Gly Val Pro Met Met Gln

35 40 45

ccc ggc cgg gtc agc ctg gtc aag gac agg gcc gcc cgc tac gcc gcc 192

Pro Gly Arg Val Ser Leu Val Lys Asp Arg Ala Ala Arg Tyr Ala Ala

50 55 60

gac cac ggc ctc gac gaa tcg ttc ctg gtg aac ctc tac gac gtg atc 240

Asp His Gly Leu Asp Glu Ser Phe Leu Val Asn Leu Tyr Asp Val Ile

65 70 75 80

atc acg gag atg tgc cgc gtc gag gac ctg gtg atg agc cgg gag agc 288

Ile Thr Glu Met Cys Arg Val Glu Asp Leu Val Met Ser Arg Glu Ser

85 90 95

ctg acg gcc gag gac cgg cgg tga 312

Leu Thr Ala Glu Asp Arg Arg

100

<210>4

<211>103

<212>PRT

<213>Streptomyces venezuelae

<400>4

Met Thr Glu Gln Asn Glu Leu Gln Arg Leu Arg Ala Glu Leu Asp Ala

1 5 10 15

Leu Asp Gly Thr Leu Leu Asp Thr Val Arg Arg Arg Ile Asp Leu Gly

20 25 30

Val Arg Ile Ala Arg Tyr Lys Ser Arg His Gly Val Pro Met Met Gln

35 40 45

Pro Gly Arg Val Ser Leu Val Lys Asp Arg Ala Ala Arg Tyr Ala Ala

50 55 60

Asp His Gly Leu Asp Glu Ser Phe Leu Val Asn Leu Tyr Asp Val Ile

65 70 75 80

Ile Thr Glu Met Cys Arg Val Glu AspLeu Val Met Ser Arg Glu Ser

85 90 95

Leu Thr Ala Glu Asp Arg Arg

100

<210>5

<211>969

<212>DNA

<213>Streptomyces venezuelae

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(966)

<400>5

atg agc ggc ttc ccc cgc agc gtc gtc gtc ggc ggc agc ggg gcg gtg 48

Met Ser Gly Phe Pro Arg Ser Val Val Val Gly Gly Ser Gly Ala Val

1 5 10 15

ggc ggc atg ttc gcc ggg ctg ctg cgg gag gcg ggc agc cgc acg ctc 96

Gly Gly Met Phe Ala Gly Leu Leu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Thr Leu

20 25 30

gtc gtc gac ctc gta ccg ccg ccg gga cgg ccg gac gcc tgc ctg gtg 144

Val Val Asp Leu Val Pro Pro Pro Gly Arg Pro Asp Ala Cys Leu Val

35 40 45

ggc gac gtc acc gcg ccg ggg ccc gaa ctc gcg gcc gcc ctc cgg gac 192

Gly Asp Val Thr Ala Pro Gly Pro Glu Leu Ala Ala Ala Leu Arg Asp

50 55 60

gcg gac ctc gtc ctg ctc gcc gta cac gag gac gtg gcc ctc aag gcc 240

Ala Asp Leu Val Leu Leu Ala Val His Glu Asp Val Ala Leu Lys Ala

65 70 75 80

gtg gcg ccc gtg acc cgg ctc atg cgg ccg ggc gcg ctg ctc gcc gac 288

Val Ala Pro Val Thr Arg Leu Met Arg Pro Gly Ala Leu Leu Ala Asp

85 90 95

acc ctg tcc gtc cgg acg ggc atg gcc gcg gag ctc gcg gcc cac gcc 336

Thr Leu Ser Val Arg Thr Gly Met Ala Ala Glu Leu Ala Ala His Ala

100 105 110

ccc ggc gtc cag cac gtg ggc ctc aac ccg atg ttc gcc ccc gcc gcc 384

Pro Gly Val Gln His Val Gly Leu Asn Pro Met Phe Ala Pro Ala Ala

115 120 125

ggc atg acc ggc cga ccc gtg gcc gcc gtg gtc acc agg gac ggg ccg 432

Gly Met Thr Gly Arg Pro Val Ala Ala Val Val Thr Arg Asp Gly Pro

130 135 140

ggc gtc acg gcc ctg ctg cgg ctc gtc gag ggc ggc ggc ggc agg ccc 480

Gly Val Thr Ala Leu Leu Arg Leu Val Glu Gly Gly Gly Gly Arg Pro

145 150 155 160

gta cgg ctc acg gcg gag gag cac gac cgg acg acg gcg gcc acc cag 528

Val Arg Leu Thr Ala Glu Glu His Asp Arg Thr Thr Ala Ala Thr Gln

165 170 175

gcc ctg acg cac gcc gtg ctc ctc tcc ttc ggg ctc gcc ctc gcc cgc 576

Ala Leu Thr His Ala Val Leu Leu Ser Phe Gly Leu Ala Leu Ala Arg

180 185 190

ctc ggc gtc gac gtc cgg gcc ctg gcg gcg acg gca ccg ccg ccc cac 624

Leu Gly Val Asp Val Arg ala Leu Ala Ala Thr Ala Pro Pro Pro His

195 200 205

cag gtg ctg ctc gcc ctc ctg gcc cgt gtg ctc ggc ggc agc ccc gag 672

Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Arg Val Leu Gly Gly Ser Pro Glu

210 215 220

gtg tac ggg gac atc cag cgg tcc aac ccc cgg gcg gcg tcc gcg cgc 720

Val Tyr Gly Asp Ile Gln Arg Ser Asn Pro Arg Ala Ala Ser Ala Arg

225 230 235 240

cgg gcg ctc gcc gag gcc ctg cgc tcc ttc gcc gcg ctg gtc ggc gac 768

Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Arg Ser Phe Ala Ala Leu Val Gly Asp

245 250 255

gac ccg gac cgt gcc gac gcc ccc ggg cgc gcc gac gcc ccc ggc cat 816

Asp Pro Asp Arg Ala Asp Ala Pro Gly Arg Ala Asp Ala Pro Gly His

260 265 270

ccc ggg gga tgc gac ggc gcc ggg aac ctc gac ggc gtc ttc ggg gaa 864

Pro Gly Gly Cys Asp Gly Ala Gly Asn Leu Asp Gly Val Phe Gly Glu

275 280 285

ctc cgc cgg ctc atg gga ccg gag ctc gcg gcg ggc cag gac cac tgc 912

Leu Arg Arg Leu Met Gly Pro Glu Leu Ala Ala Gly Gln Asp His Cys

290 295 300

cag gag ctg ttc cgc acc ctc cac cgc acc gac gac gaa ggc gag aag 960

Gln Glu Leu Phe Arg Thr Leu His Arg Thr Asp Asp Glu Gly Glu Lys

305 310 315 320

gac cga tga 969

Asp Arg

<210>6

<211>322

<212>PRT

<213>Streptomyces venezuelae

<400>6

Met Ser Gly Phe Pro Arg Ser Val Val Val Gly Gly Ser Gly Ala Val

1 5 10 15

Gly Gly Met Phe Ala Gly Leu Leu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Thr Leu

20 25 30

Val Val Asp Leu Val Pro Pro Pro Gly Arg Pro Asp Ala Cys Leu Val

35 40 45

Gly Asp Val Thr Ala Pro Gly Pro Glu Leu Ala Ala Ala Leu Arg Asp

50 55 60

Ala Asp Leu Val Leu Leu Ala Val His Glu Asp Val Ala Leu Lys Ala

65 70 75 80

Val Ala Pro Val Thr Arg Leu Met Arg Pro Gly Ala Leu Leu Ala Asp

85 90 95

Thr Leu Ser Val Arg Thr Gly Met Ala Ala Glu Leu Ala Ala His Ala

100 105 110

Pro Gly Val Gln His Val Gly Leu Asn Pro Met Phe Ala Pro Ala Ala

115 120 125

Gly Met Thr Gly Arg ProVal Ala Ala Val Val Thr Arg Asp Gly Pro

130 135 140

Gly Val Thr Ala Leu Leu Arg Leu Val Glu Gly Gly Gly Gly Arg Pro

145 150 155 160

Val Arg Leu Thr Ala Glu Glu His Asp Arg Thr Thr Ala Ala Thr Gln

165 170 175

Ala Leu Thr His Ala Val Leu Leu Ser Phe Gly Leu Ala Leu Ala Arg

180 185 190

Leu Gly Val Asp Val Arg Ala Leu Ala Ala Thr Ala Pro Pro Pro His

195 200 205

Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Arg Val Leu Gly Gly Ser Pro Glu

210 215 220

Val Tyr Gly Asp Ile Gln Arg Ser Asn Pro Arg Ala Ala Ser Ala Arg

225 230 235 240

Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Arg Ser Phe Ala Ala Leu Val Gly Asp

245 250 255

Asp Pro Asp Arg Ala Asp Ala Pro Gly Arg Ala Asp Ala Pro Gly His

260 265 270

Pro Gly Gly Cys Asp Gly Ala Gly Asn Leu Asp Gly Val Phe Gly Glu

275 280 285

Leu Arg Arg Leu Met Gly Pro Glu Leu Ala Ala Gly Gln Asp His Cys

290 295 300

Gln Glu Leu Phe Arg Thr Leu His Arg Thr Asp Asp Glu Gly Glu Lys

305 310 315 320

Asp Arg

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：pabAB基因的PCR引物

<400>7

ggggggatcc tatgcgcacg cttctgatcg ac 32

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：pabAB基因的PCR引物

<400>8

ggggggatcc tcatcgggcg cccgccactg cg 32

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：papA基因的PCR引物

<400>9

ggtgatcata tgcgcacgct tctgatcgac 30

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：papA基因的PCR引物

<400>10

ggtgatcatc atcgggcgcc cgccacggcg 30

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：papB基因的PCR引物

<400>11

gcggatccat atgaccgagc agaacgagct g 31

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：papB基因的PCR引物

<400>12

gcggatcctc accgccggtc ctcggc 26

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：papC基因的PCR引物

<400>13

gcggatccat atgagcggct tcccccgca 29

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：papC基因的PCR引物

<400>14

gcggatcctc atcggtcctt ctcgccttc 29

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Abp1基因的PCR引物

<400>15

ctcaaaccag gaactctttc 20

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Abp1基因的PCR引物

<400>16

gacatgtgga aaccacattt tg 22

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Abp1基因的PCR引物

<400>17

ggggaattcg tgggtggtga tatcatggc 29

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Abp1基因的PCR引物

<400>18

gggggatcct tgatgggttt tggg 24

<210>19

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Abp1基因的PCR引物

<400>19

gggggatcct aaactcccat ctatagc 27

<210>20

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Abp1基因的PCR引物

<400>20

gggtctagac gactcattgc agtgagtgg 29

<210>21

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于定点诱变的引物

<400>21

gatcagaagc gtgcgcattg ttaggttgat tgatgggttt tgggaattg 49

<210>22

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于定点诱变的引物

<400>22

ctcgttctgc tcggtcattg ttaggttgat tgatgggttt tgggaattg 49

<210>23

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于定点诱变的引物

<400>23

cgggggaagc cgctcattgt taggttgatt gatgggtttt gggaattg 48

<210>24

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：分支酸变位酶基因的PCR引物

<400>24

caytwyggna arttygt 17

<210>25

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：分支酸变位酶基因的PCR引物

<400>25

taytcnacyt snacytc 17

<210>26

<211>869

<212>DNA

<213>Mycelia sterilia

<220>

<221>内含子

<222>(72)..(148)

<400>26

atggatacta taatcgatct gaaagatgcc tccaaggcgc ttgacttggg caacatccgc 60

ttccaactca tgtaagtggc tagcctcacc gctaccctgt atgccactgg gtgtgttcat 120

gtatgcttac tatccctctt catactagac gcctcgaaga cacaatcacc tttcacttga 180

tcgagcgggt gcaatttccc ttgaacaagt cgatctacca gccgggtgcc atcgcgctgg 240

gctcggatgc gaatttgagc ttcatggact ggtacctgca ggaacaagag aagctgcagt 300

cgttgatccg acgttacgaa gcgccggacg agtacccatt cttcccggat gcgctacaga 360

agccgatcct gaagccgctc gactacccca agatcctgca ccctaacgac gttaacgtga 420

acgagaagat caagcgcttc tacatcgagc gtttcctgcc cgccgtgtgt ccggacttcg 480

gccgcggcga cggcggcgag ttggatgaga actacggatc ctcggccacc tgcgacatcg 540

cctgtctcca ggccctctcc cgtcgtatcc atttcggcaa gttcgtcgcc gagtccaagt 600

tccagtccga cccggagctc tacacgagac tgatcaaggc cggcgatcgc gacggcatcg 660

gcgagtccat caccaacgcg gccgtcgaga agcaggtgct cgcccggctt cgtctcaagg 720

cgcagacata tggcacggac ccttcgtcca ctaataccac cggcgcggga aagatcaatg 780

ccgatgcggt tgagtccatg tacagggatt tcgtgatccc catcaccaaa gaggtcgaag 840

tagagtacct catgcaacga ctagagtag 869

<210>27

<211>263

<212>PRT

<213>Mycelia sterilia

<400>27

Met Asp Thr Ile Ile Asp Leu Lys Asp Ala Ser Lys Ala Leu Asp Leu

1 5 10 15

Gly Asn Ile Arg Phe Gln Leu Ile Arg Leu Glu Asp Thr Ile Thr Phe

20 25 30

His Leu Ile Glu Arg Val Gln Phe Pro Leu Asn Lys Ser Ile Tyr Gln

35 40 45

Pro Gly Ala Ile Ala Leu Gly Ser Asp Ala Asn Leu Ser Phe Met Asp

50 55 60

Trp Tyr Leu Gln Glu Gln Glu Lys Leu Gln Ser Leu Ile Arg Arg Tyr

65 70 75 80

Glu Ala Pro Asp Glu Tyr Pro Phe Phe Pro Asp Ala Leu Gln Lys Pro

85 90 95

Ile Leu Lys Pro Leu Asp Tyr ProLys Ile Leu His Pro Asn Asp Val

100 105 110

Asn Val Asn Glu Lys Ile Lys Arg Phe Tyr Ile Glu Arg Phe Leu Pro

115 120 125

Ala Val Cys Pro Asp Phe Gly Arg Gly Asp Gly Gly Glu Leu Asp Glu

130 135 140

Asn Tyr Gly Ser Ser Ala Thr Cys Asp Ile Ala Cys Leu Gln Ala Leu

145 150 155 160

Ser Arg Arg Ile His Phe Gly Lys Phe Val Ala Glu Ser Lys Phe Gln

165 170 175

Ser Asp Pro Glu Leu Tyr Thr Arg Leu Ile Lys Ala Gly Asp Arg Asp

180 185 190

Gly Ile Gly Glu Ser Ile Thr Asn Ala Ala Val Glu Lys Gln Val Leu

195 200 205

Ala Arg Leu Arg Leu Lys Ala Gln Thr Tyr Gly Thr Asp Pro Ser Ser

210 215 220

Thr Asn Thr Thr Gly Ala Gly Lys Ile Asn Ala Asp Ala Val Glu Ser

225 230 235 240

Met Tyr Arg Asp Phe Val Ile Pro Ile Thr Lys Glu Val Glu Val Glu

245 250 255

Tyr Leu Met Gln Arg Leu Glu

260

<210>28

<211>23

<212>PRT

<213>Myceria sterilia

<400>28

Gly His Thr Ser Ala Gly Asp Ala Gly Ser Lys Pro Val Val Xaa Phe

1 5 10 15

Leu Gly Pro Ile Ser Ser Tyr

20

<210>29

<211>12

<212>PRT

<213>Myceria sterilia

<400>29

Gly Val Glu Thr Val Asp Val Ser Ser Thr Ser Arg

1 5 10

<210>30

<211>8

<212>PRT

<213>Myceria sterilia

<400>30

Thr Leu Asp His Phe Ala Asp Arg

1 5

<210>31

<211>5

<212>PRT

<213>Myceria sterilia

<400>31

Phe Phe Val Leu Arg

1 5

<210>32

<211>16

<212>PRT

<213>Myceria sterilia

<400>32

Ala Phe Pro Leu Glu Gln Phe Asp Leu Met Pro Val Thr Thr Ile Lys

1 5 10 15

<210>33

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于筛选PDT基因的PCR引物

<400>33

tcygcnggng aygcngg 17

<210>34

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于筛选PDT基因的PCR引物

<400>34

tcrgcnggng aygcngg 17

<210>35

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于筛选PDT基因的PCR引物

<400>35

agygcnggng aygcngg 17

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于筛选PDT基因的PCR引物

<400>36

ggcatnarrt craaytgytc 20

<210>37

<211>1366

<212>DNA

<213>Myceria sterilia

<220>

<221>内含子

<222>(91)..(192)

<220>

<221>内含子

<222>(254)..(380)

<400>37

atggaggcga gcggtcatac cagcgctgga gatgcaggct ccaaacctgt cgtctgtttc 60

ttggggccga tatcgtccta tacacatcag gtatgcacaa tgcactcact tcaagatttc 120

gtttttaaat aaacccgtgt ctcattatgc ctatcatcaa ctaataattg agttctcatg 180

agttatgtat aggcgacgct gaaagctttt ccactagagc aatttgattt gatgcccgtg 240

accacaatca aaggtgtgta acgaatctca agactgactg ttcctttata atgctattgg 300

ttcgatatca tatcgatatt attattatta tatatatgtc acgttatgtc aggagtattc 360

aagctaatac gtgaagcaag atatctttga cacaacacaa tccggcgccg cgacatacgg 420

cgtggtccca ttcgagaact ccaccaacgg ctccgtggtc ttcaccctcg accacttcgc 480

cgaccggtcc gggctctacc cggacctcaa cgtctgcagg gagatctacc tagacgtgca 540

ccactgcctg ctcggccacg catcatcatc atcctcctcc cccactaact caaactcgga 600

ccccatatcc cgcctccgcc gcgtatacag ccacccgcaa gccttcgggc aatgcacgct 660

attcctaggc tcgcggctcc cccgcggcgt cgaaaccgtc gacgtgagca gcacgagccg 720

cgcagcggaa ctcgcgtccg cggatacatc gggcgagagc gccgccatta gctctgctgc 780

tgctgccgag ctgctcggcc tcgatgtgtt ggtgagtaat atcgaggacc gcgaggataa 840

tactacgagg ttctttgtgc ttaggagggg tgtgctgggt gattgcgatg ggtctgcgga 900

aaaaggggaa gaggaagagg gggaacggga tggggggaaa ggagaaggag atgacgacga 960

cgcggccctc ctatcgagca cgaaatccct cctctccttc accgtgccgc atcgtagccc 1020

gggggccctc gccgacgtac tctcgtgctt tcgccgtggc gggctgaatc tcacgagcat 1080

taatagccgg cctagtctca ccactaccac ctccacttct accacttcca cttctactac 1140

caccacttct actactggta ctggtactgg tactggtact gggtcaggct cgggctcggg 1200

ctccgtttcc gcggccttcg aatacatctt cttcgtcgag ttcgagggcc atcggttccg 1260

cgaccccaag ggcagggtcg cccgggtcct cgccgacgtc gctgctggcg cggcctcgtc 1320

gaggtggctt gggagctggg agaatatgcg ggcgagcgtg gggtga 1366

<210>38

<211>378

<212>PRT

<213>Myceria sterilia

<400>38

Met Glu Ala Ser Gly His Thr Ser Ala Gly Asp Ala Gly Ser Lys Pro

1 5 10 15

Val Val Cys Phe Leu Gly Pro Ile Ser Ser Tyr Thr His Gln Ala Thr

20 25 30

Leu Lys Ala Phe Pro Leu Glu Gln Phe Asp Leu Met Pro Val Thr Thr

35 40 45

Ile Lys Asp Ile Phe Asp Thr Thr Gln Ser Gly Ala Ala Thr Tyr Gly

50 55 60

Val Val Pro Phe Glu Asn Ser Thr Asn Gly Ser Val Val Phe Thr Leu

65 70 75 80

Asp His Phe Ala Asp Arg Ser Gly Leu Tyr Pro Asp Leu Asn Val Cys

85 90 95

Arg Glu Ile Tyr Leu Asp Val His His Cys Leu Leu Gly His Ala Ser

100 105 110

Ser Ser Ser Ser Ser Pro Thr Asn Ser Asn Ser Asp Pro Ile Ser Arg

115 120 125

Leu Arg Arg Val Tyr Ser His Pro Gln Ala Phe Gly Gln Cys Thr Leu

130 135 140

Phe Leu Gly Ser Arg Leu Pro Arg Gly Val Glu Thr Val Asp Val Ser

145 150 155 160

Ser Thr Ser Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Ala Asp Thr Ser Gly Glu

165 170 175

Ser Ala Ala Ile Ser Ser Ala Ala Ala Ala Glu Leu Leu Gly Leu Asp

180 185 190

Val Leu Val Ser AsnIle Glu Asp Arg Glu Asp Asn Thr Thr Arg Phe

195 200 205

Phe Val Leu Arg Arg Gly Val Leu Gly Asp Cys Asp Gly Ser Ala Glu

210 215 220

Lys Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Arg Asp Gly Gly Lys Gly Glu Gly

225 230 235 240

Asp Asp Asp Asp Ala Ala Leu Leu Ser Ser Thr Lys Ser Leu Leu Ser

245 250 255

Phe Thr Val Pro His Arg Ser Pro Gly Ala Leu Ala Asp Val Leu Ser

260 265 270

Cys Phe Arg Arg Gly Gly Leu Asn Leu Thr Ser Ile Asn Ser Arg Pro

275 280 285

Ser Leu Thr Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr

290 295 300

Thr Thr Ser Thr Thr Gly Thr Gly Thr Gly Thr Gly Thr Gly Ser Gly

305 310 315 320

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Ala Phe Glu Tyr Ile Phe Phe Val

325 330 335

Glu Phe Glu Gly His Arg Phe Arg Asp Pro Lys Gly Arg Val Ala Arg

340 345 350

Val Leu Ala Asp Val Ala Ala Gly Ala Ala Ser Ser Arg Trp Leu Gly

355 360 365

Ser Trp Glu Asn Met Arg Ala Ser Val Gly

370 375

<210>39

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：BSD基因的PCR引物

<400>39

gcatcgatgc ctttgtctca agaag 25

<210>40

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：BSD基因的PCR引物

<400>40

gcagatctta gccctcccac acataa 26

Claims

1.生产PF1022物质衍生物的转化体，所述转化体可通过将参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因即生物合成基因导入由生产式(I)

所示的PF1022物质的生物诱导出的苯丙氨酸营养缺陷型宿主中而获得，

其中所述苯丙氨酸营养缺陷型宿主丧失内源性分支酸变位酶活性和/或预苯酸脱水酶活性，

所述PF1022物质衍生物是式(III)

或式(V)

所述生物合成基因包含编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因和编码4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶的基因。

2.权利要求1的转化体，其特征在于：所述苯丙氨酸营养缺陷型宿主是通过破坏内源性分支酸变位酶基因和/或预苯酸脱水酶基因而获得的。

3.权利要求2的转化体，其特征在于：通过同源重组使分支酸变位酶基因和/或预苯酸脱水酶基因破坏。

4.权利要求1～3的任一项的转化体，其特征在于：所述苯丙氨酸营养缺陷型宿主是由属于无孢目(Agonomycetales)的丝状菌诱导的。

5.权利要求1～3的任一项的转化体，其特征在于：所述苯丙氨酸营养缺陷型宿主是由无孢菌类(Mycelia sterilia)诱导的。

6.权利要求5的转化体，其中所述无孢菌类是保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的PF1022菌株，其保藏号为FERMBP-2671。

7.权利要求1的转化体，其特征在于：所述苯丙氨酸营养缺陷型宿主由无孢菌类诱导，且丧失内源性分支酸变位酶活性和/或预苯酸脱水酶活性。

8.权利要求1～3的任一项的转化体，其中所述包含编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因和编码4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶的基因的生物合成基因中的至少一个是来源于链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)或棒杆菌属(Corynebacterium)的基因。

9.权利要求1～3的任一项的转化体，其特征在于：所述编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因包含编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多核苷酸。

10.权利要求1～3的任一项的转化体，其特征在于：所述编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因包含SEQ ID NO.1的DNA序列。

11.权利要求1～3的任一项的转化体，其特征在于：所述编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因包含编码SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多核苷酸。

12.权利要求1～3的任一项的转化体，其特征在于：所述编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因包含SEQ ID NO.3的DNA序列。

13.权利要求1～3的任一项的转化体，其特征在于：所述编码4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶的基因包含编码SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多核苷酸。

14.权利要求1～3的任一项的转化体，其特征在于：所述编码4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶的基因包含SEQ ID NO.5的DNA序列。

15.权利要求1～3的任一项的转化体，其特征在于：所述编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因和编码4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶的基因分别包含编码SEQID NO.2所示的氨基酸序列的多核苷酸、编码SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多核苷酸、以及编码SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多核苷酸。

16.权利要求1～3的任一项的转化体，其特征在于：所述编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、编码4-氨基-4-脱氧分支酸变位酶的基因和编码4-氨基-4-脱氧预苯酸脱氢酶的基因分别包含SEQ IDNO.1的DNA序列、SEQ ID NO.3的DNA序列和SEQ ID NO.5的DNA序列。

17.PF1022物质衍生物的制备方法，其特征在于：培养权利要求1～16的任一项的转化体，并且收集PF1022物质衍生物。

18.权利要求17的PF1022物质衍生物的制备方法，其特征在于：所述PF1022物质衍生物是式(III)

或式(V)

19.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列。

20.权利要求19的多核苷酸，所述多核苷酸由SEQ ID NO.26所示的DNA序列组成。