CN105418602B - 一种海洋肽类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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本发明属医药技术领域，具体的说是一种肽类化合物及其制备方法和应用。具体结构式1如图所示，其制备方法为将海洋链霉菌Streptomyces sp.223经发酵积累粗提物，利用大孔吸附树脂提取，并采用多种色谱技术分离得到，命名为6R‑6‑hydroxymethyl‑7‑hydroxyl‑8‑methoxy‑9‑methyl‑tetrahydroisoquinoline[2,3‑f]pyrazine‑3‑met hyl‑4‑one。本发明化合物对人肝癌细胞株SMCC7721和人结肠癌细胞Colon38具有抑制作用，为临床提供了新型药物或先导化合物。

Description

一种海洋肽类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属医药技术领域，具体的说是一种海洋肽类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
放线菌是一类最重要的药源微生物。100年来，放线菌资源的研究和开发利用取得了极其辉煌的成就。从放线菌发现的生物活性物质大约有12000种，占整个天然生物活性物质的50％左右，其中从链霉菌一个属就发现近万种。目前临床和农业上使用的150多种抗生素中，有100至120种是由放线菌产生的。(文献1：János Bérdy.Bioactive microbialmetabolites,a personal review.J Antibiot.2005,58(1):1-26.)
海洋生态环境的特殊性造就了巨大的生物多样性和独特的化学多样性，由此而形成的次生代谢产物复杂独特的结构及其特异高效的活性，使得海洋生物资源已成为创新药物发现的重要源泉，海洋已经成为发现新种甚至新属微生物的重要场所，并且是新颖生物活性物质的新来源。美国哥伦比亚大学斯克里普斯海洋研究所海洋生物技术与生物药物研究中心的Fenicial等2005年报道了第一株专性海洋放线菌，为一个新属Salinispora属。同时，对100多株Salinispora属的放线菌进行了生物活性评估，发现80％具有抑制人体肿瘤细胞的生长的作用，35％对人类病原体耐药菌具有抑制作用。并成功的从S.tropica CNB-392的发酵液中分离到了一个新颖结构的潜在的抗肿瘤药物salinisporamide A。salinisporamide A与蛋白酶抑制剂omuralide结构相似，但是抑制20S蛋白酶的活性是后者的35倍(IC50＝1.3nM)，目前已经作为抗多发性骨髓瘤药物进入I期临床阶段(文献2：Fenical,W.&Jensen,P.R.Developing a new resource for drugdiscovery:marineactinomycete bacteria.Nat.Chem.Biol.2006(2):666-673.)。因此，海洋放线菌是新颖的活性先导化合物的新的重要来源。
二酮哌嗪类化合物(DKPs)的基本结构是由两个氨基酸缩合而成的环二肽，因其骨架具有稳定的六元环结构，且有两个氢键给体和两个氢键受体，使得DKPs具有广泛而显著的生物活性和药理活性，如：抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗菌及抗心律失常、抗高血压等，在药物化学中成为一个重要的药效团。(文献3：C.Cornacchia,etal.,2,5-Diketopiperazinesas neuroprotective agents,Mini-Reviews in Medicinal Chemistry,2012,12(1):1-11)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋放线菌来源的肽类化合物及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种海洋环肽类化合物，有如下化学结构，如式1：
其制备方法如下：
1)将海洋链霉菌Streptomyces sp.223划线接种于M2 +固体培养基上，28～35℃培养3～4d，直至长出白色的孢子；
2)取步骤1)中所述白色孢子丝到400液体培养基，28～35℃温度下进行摇床培养，转速为90～220r/min，培养4～8d收获发酵产物；
3)将步骤2)中发酵产物过滤，发酵液经大孔吸附树脂吸附，甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩后直接用乙酸乙酯萃取3次，收集的菌丝体用乙酸乙酯萃取3次，合并以上乙酸乙酯浸提液，浓缩蒸干，即得膏状粗提物；
4)取步骤3)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
5)收集步骤4)中以洗脱液体积比98:2梯度的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行凝胶柱层析、硅胶柱层析和制备型薄层层析分离纯化，收集Rf值为0.2～0.3的组分，即得肽类化合物1。
步骤1)中的M2 +固体培养基组成为每升含麦芽浸粉10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，海水500mL，去离子水500mL，琼脂15g，pH值7.8。步骤2)中所述400液体培养基组成为每升含葡萄糖10g，蛋白胨3g，牛肉浸膏3g，酵母浸提物5g，可溶性淀粉20g，CaCO33g，海水500mL，去离子水500mL，pH值7.8。步骤3)中所述大孔吸附树脂为Amberblite XAD16聚苯乙烯型大孔吸附树脂。步骤4)中的有机溶剂为二氯甲烷-甲醇。步骤5)所述凝胶柱层析洗脱液为甲醇；硅胶柱层析洗脱液为水和甲醇体积百分比为100/0～0/100。步骤5)所述凝胶柱层析时收集经TLC检测为深褐色斑点的组分；硅胶柱层析时收集水和甲醇体积百分比为60/40的洗脱液；制备型薄层层析展开剂为体积比98/2的二氯甲烷-甲醇。
本发明具有以下优点：
1.本发明充分利用尚未深入开发的丰富的海洋放线菌资源，本发明化合物是一个海洋来源的新颖肽类化合物。
2.本发明化合物具有抗肿瘤活性，在1.66mM时，对人肝癌细胞株SMCC7721和人结肠癌细胞Colon38的抑制率分别为97.5％和98.75％，为临床提供了新型药物或先导化合物。
具体实施方式
下面结合实施实例对本发明做进一步的阐述。
实施例一
如1所示的环二肽类化合物的制备方法：
从烟台莱州湾采集海泥样品，在实验室利用高氏一号培养基，通过梯度稀释培养法纯化到一株链霉菌Streptomyces sp.223。所述高氏一号培养基组成为每升含可溶性淀粉2.0g，MgSO4·7H2O0.05g，K2HPO40.05g，KNO30.1g，FeSO4·7H2O0.001g，琼脂粉15g，海水500mL，去离子水500mL，调整pH值为7.8。
将菌株Streptomyces sp.223划线接种于M2 +固体培养基上，28℃恒温培养3d，直到长出白色孢子；取8-10mm2大小的菌苔2块接入已灭菌的装有200mL M2 2培养基的1000mL三角瓶中，共计20L，28℃，以180r/min转速，摇床培养6d，收集发酵产物。
发酵产物经过滤后分别获得菌液和菌丝体，发酵液直接经过装5千克的Amberblite XAD16聚苯乙烯型大孔吸附树脂层析柱，流速为2L/h，先用20L去离子水冲洗，去除糖和蛋白，再用10L甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩后得到甲醇浸膏，甲醇浸膏加1L水悬浮后，用等体积的乙酸乙酯萃取3次；菌丝体用2L乙酸乙酯提取3次，合并以上乙酸乙酯浸提液，浓缩蒸干，得膏状粗提物5g。
粗提物经100～200目的硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇以100:0，99:1，98:2，97:3，95:5，93:7，90:10，80:20到50:50的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测(薄层层析检测时用体积比为15:85的硫酸：甲醇作为显色剂)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，共获得7个组分(1-7)。将组分2即以二氯甲烷-甲醇体积比为98:2梯度洗脱下的组分再经过凝胶柱、反相硅胶柱和薄层层析分离，凝胶柱层析时的洗脱液为甲醇，洗脱下的组分经TLC检测采用二氯甲烷-甲醇为展开剂，收集深褐色斑点的组分，硅胶柱层析时用水和甲醇体积百分比为100/0～0/100的梯度进行洗脱，收集水/甲醇体积百分比为60/40洗脱下的组分，利用制备型薄层层析，以二氯甲烷/甲醇(98：2)为展开剂，收集Rf值为0.2～0.3的组分，得式(I)所示的环二肽类化合物(43mg)，经TLC检测，呈单个、均匀深褐色斑点，确定为纯化合物。其结构式如1所示。
化合物1具有以下理化和波谱特性：
深褐色固体，[α]D–60(c0.001,MeOH),HRESIMSm/z(M+H)+＝303.1342,分子式为C16H18N2O4。
表1化合物1的1H，13C，COSY和HMBCNMR数据(CDCl3)
实施例二
化合物1的抗肿瘤活性实验：
四氮唑盐(Methyl-Thiazol-Tetrozolium,MTT)还原法：
取生长良好的肝癌细胞株SMCC7721和人结肠癌细胞Colon38，经胰酶消化后10％胎牛血清1640悬浮200μL，调细胞数为2×105mL-1，加至96孔平底细胞培养板，0.1mL/孔，于37℃，5％CO2培养箱中温育24h使细胞长成单层，将化合物制备成浓度为500μg/mL的溶液加入细胞孔中，设4个平行孔，作用72h后加MTT20μL(5mg/mLIPMI-1640培养基溶液)，继续培养4h，离心，甩去上清，加溶解液DMSO150μL，振荡5～10min，待结晶完全溶解，酶标仪测570nm处的OD值。抑制率计算公式如下：
抑制率＝(A对照组－A实验组)/(A对照组-A空白组)×100％
实验结果：专利化合物在1.66mM的浓度下，对肝癌细胞株SMCC7721和人结肠癌细胞Colon38的抑制率为：97.5％和98.75％。

Claims (6)

1.一种海洋肽类化合物，化学结构如式1所示
。
2.权利要求1所述的海洋肽类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)将海洋链霉菌Streptomyces sp.223划线接种于成分为含麦芽浸粉10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，海水500mL，去离子水500mL，琼脂15g，pH 7.8的M2+固体培养基上，28～35℃培养3～4d，直至长出白色孢子；
2)取步骤1)中所述白色孢子到成分为葡萄糖10g，蛋白胨3g，牛肉浸膏3g，酵母浸提物5g，可溶性淀粉20g，CaCO3 3g，海水500mL，去离子水500mL，pH 7.8的400液体培养基，28～35℃温度下进行摇床培养，转速为90～220r/min，培养4～8d收获发酵产物；
3)将步骤2)中发酵产物过滤，发酵液经大孔吸附树脂吸附，甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩后直接用乙酸乙酯萃取3次，收集的菌丝体用乙酸乙酯萃取3次，合并以上乙酸乙酯萃取液，浓缩蒸干，即得膏状粗提物；
4)取步骤3)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂二氯甲烷-甲醇以100:0，99:1，98:2，97:3，95:5，93:7，90:10，80:20到50:50的梯度进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
5)收集步骤4)中以洗脱液二氯甲烷-甲醇体积比98:2的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行凝胶柱层析、硅胶柱层析和制备型薄层层析分离纯化，收集Rf值为0.2～0.3的组分，即得肽类化合物1。
3.根据权利要求2所述的海洋肽类化合物的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述大孔吸附树脂为Amberlite XAD16聚苯乙烯型大孔吸附树脂。
4.根据权利要求2所述的海洋肽类化合物的制备方法，其特征在于：步骤5)所述的凝胶柱层析洗脱液为甲醇；硅胶柱层析洗脱液为水和甲醇体积百分比为100/0～0/100。
5.根据权利要求2所述的海洋肽类化合物的制备方法，其特征在于：步骤5)所述凝胶柱层析时收集经TLC检测为深褐色斑点的组分；硅胶柱层析时收集水和甲醇体积百分比为60/40的洗脱液；制备型薄层层析展开剂为体积比98/2的二氯甲烷-甲醇。
6.权利要求1所述的海洋肽类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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