CN102286071B

CN102286071B - 一种环四肽化合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102286071B
Application number: CN2011101570691A
Authority: CN
Inventors: 吴振; 肖湘; 丘鹰昆; 汤熙翔; 陈春晓; 易志伟; 蔡振世
Original assignee: Xiamen University; Third Institute of Oceanography SOA
Current assignee: Xiamen University; Third Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2011-06-13
Filing date: 2011-06-13
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-06-13
Also published as: CN102286071A

Abstract

一种环四肽化合物及其制备方法和用途。属于药物化学领域，提供一种环四肽化合物及其制备方法和用途。环四肽化合物命名为CFP，分子式为C₂₉H₃₆N₄O₆，相对分子质量为536。制备方法包括：大肠杆菌25E4接种至培养基中进行发酵，收集发酵后的发酵液，分离纯化发酵液即得CFP。CFP结构独特，具有很强的抗肿瘤活性，可显著地抑制鼻咽癌CNE2细胞、人纤维肉瘤HT1080细胞和人肝癌Bel-7402细胞的生长，具有开发为抗肿瘤药物的潜能，在制备抗肿瘤药物上具有广泛的应用。

Description

一种环四肽化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于药物化学领域，涉及一种环四肽化合物及其制备方法与用途。

背景技术

癌症是当前危害人类健康的主要疾病之一，我国已上市(或仍在研制阶段)的一系列抗肿瘤药(含人体免疫剂)大多数为天然草药中提取的成分。陆地资源的不断开发，发现新的代谢物的可能性日趋减少，资源丰富的海洋成为研究热点。海洋覆盖着地球表面积的71％，是生命的发源地，其生物多样性远远超过陆地生物的多样性。海洋环境条件恶劣，具有高盐、高压、低温、低照、寡营养等特点，由于其生态环境的特殊性，决定了深海微生物具有一些特异的代谢途径和遗传背景，导致深海微生物次生代谢产物具有化学结构奇特、新颖，生物活性多样等特点(1、Kosta S，Jain R，and Tiwari A.Marine Fungi：Potential Source ofPharmacological Compounds[J].Pharmacologyonline，2008，1(1)：1-3.)。特殊结构化合物对发现药物先导化合物、研究药物作用新靶点、新机理等具有重要科学意义。然而，环境中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1％，宏基因组文库既包含了可培养的又包含了未可培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间，增加了获得新的生物活性物质的机会(2、Venter JC，Remington K，Heidelberg JF et al.(2004)Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea[J]Science 304：66-74.)。随着宏基因组学技术和色谱技术的发展和完善，在不久的将来第一个宏基因组药物必将推向市场。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种环四肽化合物。

本发明的第二目的在于提供一种环四肽化合物的制备方法。

本发明的第三目的在于提供一种环四肽化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述一种环四肽化合物命名为CFP，分子式为C₂₉H₃₆N₄O₆，相对分子质量为536，结构式为：

所述一种环四肽化合物的制备方法包括以下步骤：

1)大肠杆菌25E4接种至培养基中进行发酵，收集发酵后的发酵液；所述大肠杆菌25E4(Escherichia coli 25E4)于2010年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2010325，保藏地址为中国.武汉.武汉大学；

2)将发酵液加入大孔吸附树脂，水洗除去杂质，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，回收乙醇即得浸膏；

3)将步骤2)所得浸膏进行硅胶柱层析，以氯仿洗脱，在氯仿中添加甲醇，进行硅胶薄层层析检测流分，收集得到15个组分；将第8组分进行ODS柱层析，以甲醇和水作为流动相，10％甲醇至100％甲醇梯度洗脱，获得13个组分并收集第4组分；

4)将第4组分加至ODS制备柱，进行液相色谱制备，收集10.2min主峰，浓缩，干燥，即得CFP。

在步骤1)中，所述培养基可为LB培养基，所述发酵的条件为：温度37℃，培养时间10～36h。

在步骤3)中，所述氯仿与甲醇的体积比可为5∶1。

在步骤4)中，所述液相色谱制备可采用Varian型液相色谱仪，二极管阵列检测器的检测波长可为228nm，色谱柱：岛津C18 20×250mm，流动相：40％甲醇，流速可为10ml/min。

本发明利用从深海中提取的微生物进行发酵，分离纯化获得了一种环四肽化合物，并命名为CFP。CFP结构独特，具有很强的抗肿瘤活性，可显著地抑制鼻咽癌CNE2细胞、人纤维肉瘤HT1080细胞和人肺癌A549细胞的生长，具有开发为抗肿瘤药物的潜能，在制备抗肿瘤药物上具有广泛的应用。

具体实施方式

实施例1克隆子的筛选

1)深海沉积物样品DNA提取：取出4℃保存的采集于东太平洋5274m深海的沉积物样品10g，于人工海水放线菌富集培养基进行富集培养；

2)深海沉积物富集样品DNA提取：往深海沉积物富集样品中加入DNA提取缓冲液，使细胞裂解，提取DNA并纯化；

3)深海沉积物宏基因组文库的构建：所用质粒载体为pWEB cosmid，插入片段30～40kb，宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)，获得约3500个克隆子，其中编号为25E4的克隆子LB发酵液的乙酸乙酯粗提物在100ug/ml浓度下对HT1080、CNE2、A549肿瘤细胞具有良好细胞毒活性，分别为82.35％、89.12％、86.51％。

4)将包含克隆子25E4的大肠杆菌25E4(Escherichia coli 25E4)于2010年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2010325。

实施例2CFP的制备

1、包含克隆子25E4的大肠杆菌25E4发酵

大肠杆菌25E4接种至3ml培养基，37℃、200rpm培养10h。将初级培养物取1ml接种至500ml培养基，37℃、200rpm培养20h后，接种至100L发酵罐，37℃、60L/min通入空气，200rpm，200rpm，pH7.0发酵36h，利用连续流离心机分别收集菌体和菌液。

2、发酵液提取：

70L发酵液上大孔树脂(AB-8，10L)吸附，30L水洗至流出液体澄清，用30L 30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，回收30％乙醇得浸膏18g；

3、CFP的分离与纯化

1)将步骤2所得浸膏进行硅胶柱层析，采用干法上样，以氯仿洗脱，逐步在氯仿中添加甲醇直至氯仿与甲醇体积比为5∶1，硅胶薄层层析检测流分，收集得到15个组分；

2)根据薄层分析，收集氯仿-甲醇10∶1洗脱物第8组分进行ODS柱层析，样重0.522g，采用干法上样，以甲醇和水做为流动相，10％甲醇至100％甲醇梯度洗脱，反向薄层层析监测，收集13个组分。分析反向薄层板，第4组分分离效果良好且量较多，故选定其进行纯化；

3)第4组分上ODS制备柱进行高效液相色谱(HPLC)制备，仪器为Varian型液相色谱仪，二极管阵列检测器的检测波长228nm，色谱柱：岛津C1820×250mm，流动相：40％甲醇，流速10ml/min，收集10.2min主峰，浓缩，干燥，即得CFP。

4、CFP的鉴定

通过波谱和理化性质鉴定化合物，确定所得化合物为新的环四肽化合物，命名为CFP。其结构式如下：

CFP的理化数据：C₂₉H₃₆N₄O₆，相对分子质量536。ESI-MS：[M+H]⁺，537.2，[M+Na]⁺，559.1。UV MeOH max nm(logε)(MeOH)：235；IR_maxKBr 3300，2930，1720，1690，1660，1630，1541cm^-1。¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)H：9.09(1H，s，TyrOH)，9.06(1H，s，Tyr′OH)，7.90(2H，br.s，TyrNH and Tyr′NH)，7.74(1H，br.s，LeuNH)，6.92(2H，br.d，J＝8.4Hz，Tyr2，6)，6.78(2H，d，J＝8.2Hz，Tyr3，5)，6.5(4H，m，Tyr′H)，4.1(1H，t like，J＝4.3Hz，Proα)，3.92(2H，m，TyrαH andTyr′αH)，3.44(2H，m，LeuαH)，2.89(1H，dd，J＝13.7，3.7Hz，Tyrβ₁H)，2.78(2H，d，J＝9.2Hz，Tyr′βH)，2.55(1H，dd，J＝8.8，4.7Hz，Tyrβ₂H)，2.41(1H，m，Proδ₁)，2.31(1H，m，Proδ₂H)，1.85(1H，m，LeuγH)，1.58(2H，m，ProβH)，1.27(2H，m，ProγH)，0.61(1H，m，Leuβ₁H)，0.5(6H，m，LeuδH)，0.08(1H，m，Leuβ₂H)。¹³C-NMR(DMSO-d₆，100MHz)C：169.3，167.9，166.7，165.5，156.8，156.3，131.7，131.2，127.4，126.3，115.2，58.8，56.4，56.1，52.7，44.9，44.2，38.2，35.1，28.3，23.4，23.3，22.3，21.8。

实施例3CFP对肿瘤细胞生长的抑制作用

取对数生长期肿瘤细胞，包括鼻咽癌CNE2细胞、人纤维肉瘤HT1080细胞和人肺癌A549细胞，用0.25％胰酶消化后接种至96孔板，接种量10000个/孔。37℃、5％CO₂条件下培养过夜后加入待测物CFP，取6个浓度梯度，分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml，以紫衫醇为阳性对照，二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照，每个样品浓度做3个复孔。培养48h后，加入10μg CCK-8试剂(购自碧云天生物技术研究所)，培养2h，测定450nm吸光度，参比波长为600nm，并计算半数抑制率(IC₅₀)。

实验结果表明，CFP可抑制A549、HT1080、CNE2肿瘤细胞的生长，IC₅₀值分别为22.18μg/ml，39.44μg/ml和61.96μg/ml。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种环四肽化合物，其特征在于其命名为CFP，分子式为C₂₉H₃₆N₄O₆，相对分子质量为536，结构式为：

2.如权利要求1所述的一种环四肽化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）大肠杆菌25E4接种至培养基中进行发酵，收集发酵后的发酵液；所述大肠杆菌25E4于2010年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2010325；所述发酵的条件为：温度37℃，培养时间10～36h；所述培养基为LB培养基；

2）将发酵液加入大孔吸附树脂，水洗除去杂质，再用30%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，回收乙醇即得浸膏；

3）将步骤2）所得浸膏进行硅胶柱层析，以氯仿洗脱，逐步在氯仿中添加甲醇直至氯仿与甲醇体积比为5∶1，进行硅胶薄层层析检测流分，收集得到15个组分；将第8组分进行ODS柱层析，以甲醇和水作为流动相，10%甲醇至100%甲醇梯度洗脱，获得13个组分并收集第4组分；

4）将第4组分加至ODS制备柱，进行液相色谱制备，收集10.2min主峰，浓缩，干燥，即得环四肽化合物；所述液相色谱制备采用Varian型液相色谱仪，二极管阵列检测器的检测波长为228nm，色谱柱：岛津C1820×250mm，流动相：40%甲醇，流速为10mL/min。

3.如权利要求1所述的一种环四肽化合物在制备抑制肿瘤细胞药物中的应用，所述肿瘤细胞为鼻咽癌CNE2细胞、人纤维肉瘤HT1080细胞和人肺癌A549细胞。