CN105199989A

CN105199989A - 海洋链霉菌环二肽及其制备方法

Info

Publication number: CN105199989A
Application number: CN201510648674.7A
Authority: CN
Inventors: 赵晶; 赵院; 陈军; 罗联忠
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2015-10-09
Filing date: 2015-10-09
Publication date: 2015-12-30

Abstract

海洋链霉菌环二肽及其制备方法，涉及环二肽。链霉菌(Streptomyces？sp.)HNS054保藏编号：CGMCC？No.8946。两种海洋链霉菌环二肽分别是环(脯-酪)二肽和环(脯-缬)二肽。海洋链霉菌环二肽的制备方法：获得肽类粗提物；经乙腈-水浓度梯度反相HPLC制备，得多个组分，再经旋转蒸发浓缩后纯化，或再经冷冻干燥以粉末状态保存；将各组分通过乙腈-水等度反相HPLC分离得纯肽，经旋转蒸发和冷冻干燥后以粉末状态保存。环(脯-酪)二肽对乳腺癌、宫颈癌和结肠癌具有抑制作用，同时还有免疫活性、调节激素及调控能量代谢的作用；环(脯-缬)二肽具有抗鳗弧菌作用和体外抗肿瘤活性。

Description

海洋链霉菌环二肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及环二肽，尤其是涉及海洋链霉菌环二肽及其制备方法。

背景技术

环二肽，又称为2,5-二酮哌嗪，2,5-二氧哌嗪，或二肽酸酐，由两个氨基酸通过肽键环形成，其典型结构中包含一个二酮哌嗪。环二肽具有特别稳定的六元环结构和构象约束作用，这一结构在药物化学研究中是一类重要的药效团([1]McdowellRS,GadekTR.StructuralstudiesofpotentconstrainedRGDpeptides[J].JAmChemSoc,1992,114(24):9245；[2]赵喜梅.环二肽与一价金属离子的相互作用识别研究[D].郑州:郑州大学,2010:85.)。环二肽来源很广，有些是动植物中生来就有的，有些是通过发酵或者在食品加工过程中产生的。环二肽被发现普遍存在于蛋白及多肽水解物，以及动植物、酵母、原生生物、真菌、海洋生物中。由于来源不同，环二肽的生物活性也不同，目前发现的环二肽因其较强的生物活性而被人们广泛关注，例如，环二肽具有影响胞间信息传递、抑制毒素、促进癌细胞凋亡、镇痛、抑制致病微生物等作用([3]强薇,梅刚.真菌中环二肽及其衍生物的抗肿瘤活性研究进展[J].长沙：中南大学药学院,2014.25(21):2007-2009；[4]卢曦元,徐德昌.环二肽生物活性的研究进展[J].生物信息学,2011,9(4):289-291.)。

由于海洋环境存在低温、高压、寡营养、高盐等特点,使海洋微生物可能产生出结构新颖多样、活性独特的天然产物,因此引起了许多科学家的关注。目前已经从海洋细菌、海洋放线菌、海洋真菌、红树林叶内生真菌的代谢产物中已分离出大量的具有生物活性的环二肽类化合物。

目前国内外研究机构大多通过有机溶剂萃取、凝胶柱层析、一系列正相和反相色谱柱和高效液相色谱等现代分离技术来分离环二肽类化合物([5]宫俊,汤华,耿婉丽,刘宝姝,孙鹏,李玲,李志勇,张文.仿刺参共附生放线菌Brevibacteriumsp.中的环二肽成分的分离和鉴定[J].第二军医大学学报,2012,33(12):1284-1287)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种链霉菌(Streptomycessp.)HNS054。

本发明的第二目的在于提供两种海洋链霉菌环二肽及其制备方法。

本发明的第三目的在于提供两种海洋链霉菌环二肽的应用。

所述链霉菌(Streptomycessp.)HNS054已于2014年03月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.8946。

所述两种海洋链霉菌环二肽分别是环(脯-酪)二肽和环(脯-缬)二肽。

所述两种海洋链霉菌环二肽的制备方法如下：

1)获得肽类粗提物，具体方法为：

先发酵海洋链霉菌，得海洋链霉菌发酵液，再通过连续流离心，错流过滤，5K滤膜切向流过滤，得发酵液上清，发酵液上清经大孔树脂吸附和解吸附获得肽类粗提物；将肽类粗提物经旋转蒸发浓缩后直接进行纯化，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存；

2)经乙腈-水浓度梯度反相HPLC制备，获得多个组分，再经旋转蒸发浓缩后直接进行纯化，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存；

3)将各组分通过乙腈-水等度反相HPLC分离获得纯肽，经旋转蒸发和冷冻干燥后以粉末状态避光低温长期保存。

在步骤1)中，所述发酵海洋链霉菌所用的培养基可为2216E培养基，2216E培养基的配方为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.01g，琼脂：15～20g，pH：7.4～7.5，无菌海水1000ml，高压蒸汽灭菌：121℃，20min；发酵的条件为：28℃，165rmp，96h；

所述切向流过滤可采用PALLCentramate超滤系统，先用MWCO300K膜包滤去大分子，滤过液再用MWCO5K膜包滤过小分子蛋白/肽类；需要注意的是膜包标称的滤过或截留孔径大小要经过实验验证，标称10K的膜包在实际中会滤过部分10～20K的蛋白；

所述大孔树脂可采用型号为NKA-9的大孔树脂，可采用郑州勤实科技有限公司产品；

所述大孔树脂吸附和解吸附的流程是：将处理好的大孔树脂以1∶(3～20)体积比与切向流滤过液混合，4℃下，通过摇床、磁力搅拌、机械搅拌等方式连续搅拌10～14h，之后用去离子水漂洗大孔树脂5次以上，将大孔树脂装入层析柱用层析系统在280nm或215nm波长检测肽类洗脱过程，洗脱中逐步提高乙醇质量百分浓度至75％，最后用50mMNaOH洗脱，收集40％～75％乙醇洗脱组分。

在步骤2)中，所述乙腈-水浓度梯度反相HPLC制备可采用C18反相柱WelchUltimataXB-C18，内径30mm，高度250mm，填料粒径10μm，孔径所用的流动相按质量百分比含0.1％三氟乙酸；上样样品用起始乙腈浓度的含0.1％三氟乙酸的水溶液溶解。

在步骤3)中，所述乙腈-水等度反相HPLC分离可采用反相柱YMC-PackODS-A250×10mm，填料粒径5μm；每次上样40ul，流速1.0mL/min；16％乙腈等度洗脱；检测波长280nm、210nm、254nm、230nm。

所述环(脯-酪)二肽对乳腺癌、宫颈癌和结肠癌有抑制作用，同时还有免疫活性、调节激素及调控能量代谢的作用；所述环(脯-缬)二肽抗鳗弧菌作用(MIC为0.05)；体外抗肿瘤活性(13.3±1.6)％(5ug/ml)；质量浓度为50μg/ml时对前列腺癌细胞的生长抑制率约为53％；对肝癌细胞的抑制率约为17％。

本发明以链霉菌(Streptomycessp.)HNS054为菌种，经过斜面培养、平板培养、液体发酵培养、分离和提纯，最后获得本发明的两种环二肽。

本发明提供一种大孔树脂NKA-9吸附和解吸附与高效液相色谱法相结合的分离环二肽的方法。本发明步骤简洁，操作简单，整个分离流程仅需96h便可获得纯环二肽；本发明所用NKA-9大孔树脂相较于传统分离方法所用的凝胶、C18或C8等材料价格低廉。本发明提供的分离环二肽方法能高效低能的分离出纯环二肽，对环二肽类物质的研究具有重要意义。

本发明所用菌株产次级代谢物周期短，所产代谢物活力高，是一株生产性能优良的菌种。本发明涉及到的海洋链霉菌环二肽制备方法高效而廉价、处理通量高，易于放大。

附图说明

图1为实施例2大孔吸附树脂NKA-9的洗脱曲线。

图2为实施例2第二级分离洗脱曲线。

图3为实施例3中化合物C-1-0的¹H-NMR数据图。

图4为实施例3中化合物C-1-0的¹³C-NMR数据图。

图5为实施例3中化合物C-1-0的质谱信息。

图6为实施例3中化合物C-1-0化学结构。

图7为实施例3中化合物C-1-1的¹H-NMR数据图。

图8为实施例3中化合物C-1-1的¹³C-NMR数据图。

图9为实施例3中化合物C-1-1的质谱信息。

图10为实施例3中化合物C-1-1的化学结构。

具体实施方式

实施例1

1、菌种：海洋链霉菌(Streptomycessp.)HNS054，保藏号为CGMCCNo.8946。

2、发酵及发酵条件：

(1)、平板培养基：酵母膏：4g，麦芽浸膏：10g，葡萄糖：4g，琼脂：20g，无菌海水：1L，pH：7.3，高压蒸汽灭菌：110℃，30min。

平板培养条件：28℃培养5～7d。

(2)种子培养基：蛋白胨：5g，酵母膏：1g，磷酸高铁：0.01g，琼脂：15～20g，无菌海水：1000ml，pH：7.4～7.5。

培养条件：转速为：165rmp，28℃震荡培养3d，作为液体种子。

(3)发酵培养基：蛋白胨：5g，酵母膏：1g，磷酸高铁：0.01g，琼脂：15～20g，无菌海水：1000ml，pH：7.4～7.5。

培养条件：转速为165rmp，28℃震荡发酵4d。

实施例2

1、斜面培养同实施例1；

2、种子培养同实施例1；

3、发酵培养同实施例1；

4、海洋链霉菌环二肽的分离纯化：

(1)、HNS054在5L锥形瓶中发酵3L×5瓶，连续流离心，错流过滤，5K滤膜切向流过滤得发酵液上清。

(2)、在4℃层析柜中，约13LMWCO5K膜包滤过液与500mLNKA-9大孔吸附树脂磁力搅拌过夜(10h)，吸附后的大孔树脂用500mL去离子水漂洗10次；

(3)、将树脂装入5.5cm×50cm层析柱，纯水3mL/min继续漂洗300ml，然后依次以10％、25％、40％乙醇3mL/min各300ml，50％、60％乙醇3mL/min各100ml，75％乙醇洗脱300ml，50mMNaOH3mL/min洗脱300mL，A280检测信号峰，获400mL洗脱液(洗脱曲线见图1)；

(4)、旋转蒸发浓缩至30ml，加乙腈至3％，取1ml冻干24hr，称重为8.01mg，故计算得一级组分240.3mg。

(5)、第一级粗提物加0.1％三氟乙酸，用Millipore0.22μm水系滤膜过滤；

(6)、第二级反相HPLC采用WelchUltimataXB-C1830mm×250mm不锈钢柱，填料粒径10μm,孔径梯度程序为：0～30min，3％→50％乙腈；30～32min，50％→100％乙腈；32～40min，100％乙腈；40～45min，100％→3％乙腈。流速27mL/min，检测波长280nm，每次上样3mL，共9次，收集如图2所示2个组分；分别标记为C-1、C-2。各组分旋转蒸发除去乙腈，冻干。实施例2得到的第二级组分质量见表1。

表1

组分	1	2
			质量(mg)	80.13	62.16

(7)、第三级反相HPLC采用YMC-PackODS-A250mm×10.0mm，填料粒径5μm。等度程序为：0～35min，16％乙腈，流速1.0mL/min，检测波长280nm、230nm、210nm、254nm，取二级组分C-1每次上样40uL，共10次，收集到两个组分。两个组分标记为C-1-0、C-1-1。

(9)、各组分旋转蒸发除去乙腈，冻干。实施例2得到的第三级组分质量见表2。

表2

组分	C-1-0	C-1-1	C-1-2
				质量(mg)	1	16.7	5

实施例3

1、斜面培养同实施例1；

2、种子培养同实施例1；

3、发酵培养同实施例1；

4、海洋链霉菌环二肽的分离纯化同实施例2；

5、三个化合物C-1-0、C-1-1、C-1-2的理化性质和核磁数据如下：

(1)、化合物C-1-0：黄色粉末。ESI-MS中显示有[M+Na]+峰283、[2M+Na]+峰543，确定其分子量为260。结合¹H-NMR(见图3)、¹³C-NMR(见图4)以及质谱信息(见图5)，确定化合物的分子式为C₁₄H₁₆N₂O₃。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ:4.14(1H,t,J＝15.2Hz)，2.62～2.59(1H，m),2.08～2.04(1H,m),1.92～1.88(2H,m),4.04～4.02(1H,m),3.84～3.82(1H,m),4.14(1H,dd,J＝9.4,2.8Hz),3.56～3.51(H,m),2.89～2.86(1H,m),6.98(2H,d,J＝8.3Hz),6.73(2H,d,J＝8.4Hz)。¹³C-NMR(600MHz,CDCl₃)δ:166.18,58.51(d),28.44(t),21.05(t),44.68(t),170.02，57.77(d),38.8(t),130.9(s),125.55(d),114.97(d),156.85(s)。结合¹H-NMR、¹³C-NMR确定该化合物的结构为环(脯-酪)二肽。其结构式见图6。

(2)、化合物C-1-1：白色针晶。ESI-MS中显示有[M+Na]+峰219、[2M+Na]+峰415，确定其分子量为196。结合¹H-NMR(见图7)、¹³C-NMR(见图8)以及质谱信息(见图9)，确定化合物的分子式为C₁₀H₁₆N₂O₂。¹H-NMR(600MHz,CD4O)δ:8.17(1H,t,J＝14.6Hz),6.46～6.43(1H,m),5.99～5.95(1H,m),6.07～6.06(1H,m),5.94～5.89(1H,m),7.54～7.51(1H,m),7.48～7.45(1H,m),8.81(1H),8(1H),6.31～6.28(1H,m),5.06～5.05(3H,d,J＝7.2Hz),4.91～4.89(3H,d,J＝6.8Hz)。¹³C-NMR(600MHz,CD4O)δ:166.17,58.64(d),28.49(t),21.85(t),44.77(t),171.17,60.12(d),28.12(d),17.43(q),15.25(q)。由¹H-NMR、¹³C-NMR，确定该化合物的结构为环(脯-缬)二肽。其化学结构式见图10。

本发明提供了2种海洋链霉菌环二肽及其制备方法流程，相关环二肽的制备流程分为3个阶段。第一阶段获得肽类粗提物，先大量发酵海洋链霉菌，通过连续流离心，错流过滤，5K滤膜切向流过滤，获得发酵液上清，发酵液上清经大孔树脂NKA-9吸附和解吸附获得环二肽粗提物。第二阶段是经乙腈-水浓度梯度反相HPLC制备，获得2个第二级组分。第三阶段是将各第二级组分通过乙腈-水等度反相HPLC精细分离获得纯环二肽。本发明可以高效低费用制备海洋放线菌肽类，极大便利海洋微生物活性肽类的药物开发。

Claims

1.链霉菌(Streptomycessp.)HNS054，已于2014年03月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.8946。

2.两种海洋链霉菌环二肽分别是环(脯-酪)二肽和环(脯-缬)二肽。

3.如权利要求2所述两种海洋链霉菌环二肽的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

1)获得肽类粗提物；

4.如权利要求3所述两种海洋链霉菌环二肽的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述获得肽类粗提物的具体方法为：先发酵海洋链霉菌，得海洋链霉菌发酵液，再通过连续流离心，错流过滤，5K滤膜切向流过滤，得发酵液上清，发酵液上清经大孔树脂吸附和解吸附获得肽类粗提物；将肽类粗提物经旋转蒸发浓缩后直接进行纯化，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存。

5.如权利要求4所述两种海洋链霉菌环二肽的制备方法，其特征在于所述发酵海洋链霉菌所用的培养基为2216E培养基，2216E培养基的配方为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.01g，琼脂：15～20g，pH：7.4～7.5，无菌海水1000ml，高压蒸汽灭菌：121℃，20min；发酵的条件为：28℃，165rmp，96h。

6.如权利要求4所述两种海洋链霉菌环二肽的制备方法，其特征在于所述切向流过滤采用PALLCentramate超滤系统，先用MWCO300K膜包滤去大分子，滤过液再用MWCO5K膜包滤过小分子蛋白/肽类。

7.如权利要求4所述两种海洋链霉菌环二肽的制备方法，其特征在于所述大孔树脂吸附和解吸附的流程是：将处理好的大孔树脂以1∶(3～20)体积比与切向流滤过液混合，4℃下，通过摇床、磁力搅拌、机械搅拌等方式连续搅拌10～14h，之后用去离子水漂洗大孔树脂5次以上，将大孔树脂装入层析柱用层析系统在280nm或215nm波长检测肽类洗脱过程，洗脱中逐步提高乙醇质量百分浓度至75％，最后用50mMNaOH洗脱，收集40％～75％乙醇洗脱组分。

8.如权利要求3所述两种海洋链霉菌环二肽的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述乙腈-水浓度梯度反相HPLC制备是采用C18反相柱WelchUltimataXB-C18，内径30mm，高度250mm，填料粒径10μm，孔径所用的流动相按质量百分比含0.1％三氟乙酸；上样样品用起始乙腈浓度的含0.1％三氟乙酸的水溶液溶解。

9.如权利要求3所述两种海洋链霉菌环二肽的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述乙腈-水等度反相HPLC分离是采用反相柱YMC-PackODS-A250×10mm，填料粒径5μm；每次上样40ul，流速1.0mL/min；16％乙腈等度洗脱；检测波长280nm、210nm、254nm、230nm。

10.如权利要求2所述环(脯-酪)二肽在制备治疗乳腺癌、宫颈癌和结肠癌药物中应用，以及在制备免疫活性、调节激素及调控能量代谢药物中应用；所述环(脯-缬)二肽在制备抗鳗弧菌药物中应用，以及在制备抗肿瘤药物中应用。