CN104558101A - 一种海绵动物水溶性肽类的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，涉及一种肽类制备方法。将海绵动物破碎，用提取缓冲液浸泡，超声，离心后获得可溶解蛋白/肽类水溶液，过滤后进行吸附/解吸附，获得脱盐后的肽类第一级粗提物；将肽类第一级粗提物经旋转蒸发浓缩后进行第二级纯化，获得10～30个第二级组分，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存，第二级纯化的具体方法是采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，获得10～30个第二级组分；将第二级组分中主成分小于95％的二级组分经旋转蒸发浓缩后进行第三级纯化，获得海绵动物水溶性肽类，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存。可增加肽的种类、提高处理规模和分离效率，以便利海绵活性肽类药物开发。

Description

一种海绵动物水溶性肽类的制备方法

技术领域

本发明涉及一种肽类制备方法，尤其是涉及一种海绵动物水溶性肽类的制备方法。

背景技术

人们已经从海洋生物中分离出20,000余种天然产物，包括肽类、蛋白质类、多糖类、生物碱类、萜类、大环聚酯类等，其中数量庞大的一类化合物是肽类，相较于大蛋白，肽类的分子量小、无免疫原性、结构简单、副作用小、生物活性高。又由于海洋生物生存的特定环境，海洋肽类的结构与陆生动植物肽有很大不同，海洋肽类的开发日益成为海洋药物研究的热点。

海绵属于多孔动物门，是动物中最低等的多细胞无脊椎动物，也是最具开发潜力的药源海洋生物。在目前发现的海洋天然产物中，有7,000多种来自海绵，并以每年200余种新化合物的发现速度递增。其中的新型肽类不仅占了较高比例，某些还极具药用开发潜力。比如海绵来源的一种三肽化合物Hemiasterlin是微管蛋白的解聚物，能诱导有丝分裂阻滞和细胞凋亡，具有良好的开发为抗癌药物的潜力(Bai,R.,Durso,N.A.,Sackett,D.L.and Hamel,E.(1999)Interactions of the sponge-derived antimitotic tripeptide hemiasterlin with tubulin:comparison with dolastatin 10and cryptophycin 1.Biochemistry,38,14302-1431)。从蒂壳海绵属Theonella sp.中分离得到双环肽类Theonellamide A-F，它们有强烈的抗真菌活性(Wada,S.,Matsunaga,S.,Fusetani,N.and Watabe,S.(1999)Theonellamide F,a Bicyclic Peptide MarineToxin,Induces Formation of Vacuoles in 3Y1Rat Embryonic Fibroblast.Mar Biotechnol(NY),1,337-341；3.Wada,S.,Matsunaga,S.,Fusetani,N.and Watabe,S.(2000)Interaction of CytotoxicBicyclic Peptides,Theonellamides A and F,with Glutamate Dehydrogenase and17beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase IV.Mar Biotechnol(NY),2,285-292)。这些例子表明海绵肽类的开发前景良好。但是已发现的海绵肽类主要是通过有机萃取获得的，肽类通常与其他类别的化合物混杂在一起，目前还没有一个系统富集和分离海绵肽类的方法，肽的种类、分离效率和规模受到极大限制。

发明内容

本发明的目的是提供可增加肽的种类、提高处理规模和分离效率，以便利海绵活性肽类药物开发的一种海绵动物水溶性肽类的制备方法。

本发明包括以下步骤：

1)将海绵动物破碎，用提取缓冲液浸泡，超声，离心后获得可溶解蛋白/肽类水溶液，过滤后进行吸附/解吸附，获得脱盐后的肽类第一级粗提物；

2)将肽类第一级粗提物经旋转蒸发浓缩后进行第二级纯化得10～30个第二级组分，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存；

3)将第二级组分中主成分小于95％的二级组分经旋转蒸发浓缩后进行第三级纯化得海绵动物水溶性肽类，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存。

在步骤1)中，所述破碎可采用冷冻破碎或冻干后破碎；所述冷冻破碎可在液氮温度下用粉碎机破碎海绵动物组织块；所述冻干后破碎可将海绵冻干后用粉碎机破碎；

所述提取缓冲液的配方可为：水，10％乙醇，20mM Tris-HCl pH7.5，5mM EDTA，0.5％Triton X-100或NP-40，临用时加1mMβ-巯基乙醇、20μM苯硫脲、1mM PMSF和10μg/mL抑肽酶，每隔1h加一次PMSF；

所述浸泡可于4℃层析柜中以2～4倍海绵动物质量的提取缓冲液浸泡，浸泡时间为1～2h；所述离心可于8000×g离心30min；所述过滤可采用切向流过滤，所述切向流过滤可采用PALLCentramate超滤系统，先用MWCO300K膜包滤去大分子蛋白，滤过液再用MWCO5K或MWCO1K膜包滤过小分子蛋白/肽类，需要注意的是膜包标称的滤过或截留孔径大小要经过实验验证，标称10K的膜包在实际中会滤过部分10～20K的蛋白；

所述吸附/解吸附流程可采用大孔吸附树脂吸附，将处理好的大孔吸附树脂与切向流滤过液混合，4℃下，通过摇床、磁力搅拌、机械搅拌等方式连续搅拌10～14h，之后用去离子水漂洗大孔吸附树脂至少5次，再将大孔吸附树脂装入层析柱用层析系统在280nm或215nm波长检测肽类洗脱过程，洗脱中逐步提高乙醇浓度到75％，最后用50mM NaOH洗脱，最大量的组分在60％～75％乙醇区间洗脱，收集10％～50乙醇洗脱组分和50mM NaOH洗脱组分；所述大孔吸附树脂与切向流滤过液的体积比可为1∶(3～20)；所述大孔吸附树脂可采用型号为DA201-C、NKA-9、AB-8或D101等大孔吸附树脂中的一种，优选型号为DA201-C大孔吸附树脂。

在步骤2)中，所述第二级纯化的具体方法是采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，乙腈-水梯度反相HPLC方法采用C18反相柱Welch Ultimata XB-C18，内径30mm，高度250mm，填料粒径10μm，孔径或同类型产品；所用的流动相含0.1％三氟乙酸；上样样品用起始乙腈浓度含0.1％三氟乙酸的水溶液溶解；第二级纯化的HPLC每次上样3.5mL，梯度程序为：0～40min，3％→70％乙腈；40～43min，70％→100％乙腈；43～53min，100％乙腈，流速27mL/min，检测波长280nm或215nm。

在步骤3)中，所述第三级纯化的具体方法可采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，乙腈-水梯度反相HPLC方法采用C18反相柱Welch Ultimata XB-C18，内径30mm，高度250mm，填料粒径10μm，孔径或同类型产品；所用的流动相含0.1％三氟乙酸；上样样品用起始乙腈浓度含0.1％三氟乙酸的水溶液溶解；第三级纯化的HPLC每次上样0.5～1.0mL，以二级组分收集点的乙腈浓度减3％的乙腈-水溶液等度洗脱40min；40→45min，乙腈浓度升到100％；45→55min，100％乙腈，流速13.5mL/min，检测波长280nm或215nm。

本发明的优点在于：

1.高效而廉价。水溶性肽类提取的难点在于脱盐，许多寡肽的分子量小于1000，很难与水溶液中的盐类分开。脱盐可采取凝胶过滤、固相萃取或纳滤方法。凝胶过滤填料贵，上样量少，每次耗时长。以价格1万元的凝胶过滤柱处理1kg湿重海绵溶出的水溶性肽合计用时15天以上，并随处理量的增加而等比例增加，这么长的处理时间在效率上、在肽类的活性保留上是非常不利的。另一类脱盐方法是C18或C8固相萃取，但这类固相萃取填料与水溶液不亲和，水系溶液不易通过，升以上的操作很难开展。实验室通用的离心纳滤也可小规模地脱盐，但L级以上的脱盐在成本上不可承受。本发明以大孔吸附树脂方法脱盐，在规模、成本和时间上有很大优势。大孔吸附树脂对肽类的吸附量高，操作便捷，而价格仅为凝胶过滤填料、C18固相萃取填料的1/150～1/100。花费时间上，处理3～30L水提液耗时均不超过2天；在耗材、能源消耗上，比凝胶过滤方法节约10倍以上；在得率上，本发明的方法略低于凝胶过滤，约为后者的70％～85％，但由于高效，可以加大初始原材料的量来弥补。

2.处理通量高，易于放大。海绵肽类的药物开发涉及活性筛选、结构测定和各种体外体内实验，至少需提纯到100mg以上的纯肽才能开展这些实验。这就要求分离提纯的通量要高，容易放大。本发明很容易就能放大规模，一次能获得50g级别的粗提物，足以支撑几十种肽类的各类实验。

3.本发明富集的肽的种类极为丰富。对苔海绵第一级肽类粗提物的液相色谱串联质谱分析，在分子量1060～2850区间鉴定出了262种能在转录组找到序列的肽(见实施例2)。

4.本发明系统地富集了肽类，可以与转录组学、蛋白质组学等组学方法联用，快速对各分离组分中的肽类定性定量，极大便利活性组分的成分分析。

附图说明

图1为切向流过滤对海绵水溶性蛋白的分组。M.分子量标记；1.总水溶性蛋白；2.30K膜包滤过、10K膜包截留；3.10K膜包滤过、1K膜包截留。

图2为实施例1大孔吸附树脂的洗脱曲线。

图3为实施例1的第二级分离洗脱曲线。

图4为实施例2进行液相色谱串联质谱分析得到的总离子流色谱图。

图5为实施例2质荷比为745.06的峰组分的二级质谱测序谱，解释得肽段序列为：ENVKLNRFTNITVYDHNR。

图6为实施例4大孔吸附树脂洗脱曲线。

图7为实施例5编号为MP4-29的二级组分的第三级纯化。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

从湿重1.3kg的喘水苔海绵(Tedania anhelans(Lieberkuhn,1859))中二级分离水溶性肽类。

海区采样获得的苔海绵保存于-80℃冰箱，按照以下方法提取海绵水溶性肽类第一级粗提物：

1)称取冷冻苔海绵约1300g，敲碎至不超过3cm见方；

2)倒入适量液氮，高速粉碎机将冰冻海绵块粉碎为粉末，每次粉碎时间<60s，粉末倒出后，适当融化，再加入液氮使之重新结块，再次粉碎；

3)加入2L裂解缓冲液，磁力搅拌45min，超声30min；

4)4℃8000×g离心30min，离心后得2.4L上清液，Lowry法测得21.6g总蛋白；

5)PALL Centramate超滤系统切向流过滤，第一轮以两个MWCO300K膜包并联过滤，滤过液再以两个MWCO5K膜包并联过滤，获得三个组分：大于300kD部分约440mL，Lowry法测得27mg/mL；5～300kD部分约240mL，Lowry法测得8.9mg/mL；小于5kD部分2480mL，Lowry法测得1.7mg/mL。总蛋白量18.4g，切向流得率85％。从步骤1)～5)耗时12h；

6)在4℃层析柜中，2480mL MWCO5K膜包滤过液与300mL DA201-C大孔吸附树脂磁力搅拌过夜(10h)，吸附后的大孔树脂用500mL去离子水漂洗10次，500mL 20％乙醇漂洗5次；

7)将树脂装入5.5cm×30cm层析柱，20％乙醇5mL/min继续漂洗1h，然后依次以30％、40％、50％、60％乙醇5mL/min各20min提高乙醇浓度直至75％乙醇洗脱，A280检测信号峰，获400mL洗脱液(洗脱曲线见图2)，Lowry法测得共1.6g蛋白/肽类，回收率38％，此步骤耗时4h；

8)旋转蒸发脱乙醇2h，冻干24h，得1.8g干粉。

以上步骤总耗时54h。接着按照以下方法获得第二级组分：

9)1.5g第一级粗提物溶解于20mL 3％乙腈(含0.1％三氟乙酸)，在4℃层析柜中震荡助溶6hr，4℃8000×g离心20min，上清用Millipore 0.22μm水系滤膜过滤；

10)反相HPLC采用Welch Ultimata XB-C1830×250mm不锈钢柱，填料粒径10μm,孔径梯度程序为：0～40min，3％→70％乙腈；40～43min，70％→100％乙腈；43～53min，100％乙腈。流速27mL/min，检测波长280nm，每次上样3.5mL，共6次，收集如图3所示10个组分；

11)各组分旋转蒸发除去乙腈，冻干。各组分干重见表1，总质量823mg，回收率55％。第一级肽粗提物冻干重溶时出现难溶沉淀，降低了回收率。

表1.实施例1得到的第二级组分质量

组分	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											质量(mg)	102	83	96	20	41	142	158	61	79	40

实施例2

4种大孔吸附树脂对苔海绵水溶性肽类的静态吸附率和解吸附率。

1)湿重165g苔海绵按照实施例1步骤1)～5)，获得MWCO5K膜包滤过液350mL，Lowry法测得0.44mg/mL；

2)按照树脂说明处理四种大孔吸附树脂：DA201-C，D101，NKA-9，AB-8，各取1mL树脂与5mL MWCO5K膜包滤过液混合，4℃层析柜中摇床震荡；

3)在混合后2h、4h、6h、16h各取50μL上清，Lowry法测定浓度；

4)16h后去上清，纯水洗涤5次，吸干液体，加5mL 75％乙醇，震荡1h，Lowry法测定上清浓度。

5)结果如表2所示，DA201-C对海绵肽类有较好的吸附解吸附特性，综合回收率43％；AB-8次之，综合回收率32％。

表2.实施例2的4种大孔吸附树脂对海绵水溶性肽类的吸附率和解吸附率

	DA201-C	D101	NKA-9	AB-8
					吸附前肽质量(mg)	2.20	2.20	2.20	2.20
吸附2h后上清肽质量(mg)	0.70	0.98	1.42	0.95
					吸附4h后上清肽质量(mg)	0.72	1.06	1.52	0.74
吸附6h后上清肽质量(mg)	0.70	1.03	1.54	0.90
					吸附16h后上清肽质量(mg)	0.69	1.24	1.39	1.08
75％乙醇解吸附上清肽质量(mg)	0.95	0.51	0.17	0.71
					2h吸附率(％)	68.1	55.4	35.4	56.9
75％乙醇解吸附率(％)	63.4	41.8	21.8	56.7
					综合回收率(％)	43	23	7.7	32

表3.实施例2测定的262个肽类匹配到67个非冗余基因。

注：后验错误概率越低表示测定越准确。

实施例3

海绵水溶性肽类一级粗提物的液相色谱串联质谱分析。

实施例1步骤8)得到的第一级肽类粗提物溶解于0.1％甲酸5％乙腈溶液，浓度0.3μg/μl，用LTQ orbitrap Elite液质联用仪配备戴安ultramate 3000nano-UPLC进行液相色谱串联质谱分析。液相参数：上机量10μl,首先进入保护柱(C18PepMap100,300μm×1mm，5μm，)，随后进行分析柱(Acclaim PepMap C18,15cm×75μm，2μm，)以流速0.2μl/min进行分析，流动相梯度为5％～45％流动相B(乙腈，0.1％甲酸)以150min进行检测。质谱参数：阳离子模式，CID碰撞模式，120000分辨率，质量范围1060～2850,NCE为35％，前top15离子强度用于MS/MS分析(图4和5)。搜索本实验室测定的苔海绵转录组数据，从分子量1064～2850区间的物质中鉴定出262个肽类匹配到67个推测的蛋白(表3)。表明本发明获得的第一级粗提物肽类种类丰富，确实做到了对海绵水溶性肽类的富集。

实施例4

从湿重11.5kg的喘水苔海绵中二级分离水溶性肽类。

1)称取冷冻苔海绵11.5kg，敲碎，冷冻破碎，加入20L提取缓冲液，4℃持续搅拌2h，8000×g连续流离心，获约25L上清，Lowry法测得208g总蛋白/肽类，此步骤耗时6h；

2)同实施例1步骤5)，两次切向流过滤得MWCO5K滤过部分28L，Lowry法测得小蛋白/肽类约33g，此步骤耗时36hr；

3)在4℃层析柜中，切向流滤过液与3800mL DA201-C大孔吸附树脂混合搅拌12h，树脂用去离子水洗涤5次后，装入10cm×50cm层析柱，用纯水以30mL/min流速洗涤2h，然后15mL/min依次以10％、25％、40％、50％、60％乙醇30min将乙醇浓度逐步提高到75％，75％乙醇洗脱1.5h，最后50mM NaOH洗脱2h，收集各组分(图6)。Lowry法测得小蛋白/肽类共约23g，其中10％～50％乙醇洗脱组分6g，60％～75％乙醇组分14g，50mM NaOH组分3g，回收率70％。对10％～50％乙醇洗脱组分和50mM NaOH组分回收后显著提高了回收率。此步骤耗时11h；

4)将NaOH组分用稀盐酸调整pH至中性，各组分旋转蒸发，冻干，完成第一级纯化，此阶段共耗时6天；

5)将以上3个组分分别溶于60mL、140mL、30mL 0.1％三氟乙酸3％乙腈溶液中，低温震荡充分溶解12h，离心、过滤；

6)按实施例1步骤10)第二级分离，分别获得10、12、7个二级组分，各二级组分旋转蒸发、冻干。此阶段耗时25天。

实施例5

从干重380g的叶片山海绵(Mycale(Mycale)phylophylla Hentschel,1911)中三级分离水溶性肽类。

1)将山海绵冻干，称取380g，高速粉碎机破碎；

2)用1.2L提取液浸泡，100W超声30min，8000×g离心，沉淀再用1.2L提取液重悬，超声，离心。如此对沉淀反复超声4次，得合并的上清约4.5L；

3)同实施例1步骤5)，得MWCO1K膜包滤过液约6L；

4)MWCO1K膜包滤过液与2L DA201-C大孔吸附树脂搅拌结合过夜，20L纯水漂洗树脂，装入5.5cm×100cm层析柱，按实施例1步骤7)、实施例4步骤3)洗脱收集肽类；

5)按实施例4步骤4)～6)获得38个二级组分；

6)对编号为MP4-29的二级组分进行第三级纯化。柱型号：YMC-PACK PROTEIN-RP 20×250mm S-5μm每次上样50mg，共350mg，洗脱条件：5％ACN 0～40min，5％～100％ACN40～50min，分离出4个单峰(图7)，旋干冻干后得4个纯度>99％的肽类，最小量14mg，最大量130mg，回收率81％。

本发明公开了一种系统地制备海绵动物水溶性肽类的方法流程，此流程分为3个阶段。第一阶段获得脱盐的肽类粗提物，先通过冷冻破碎、冻干粉碎和超声破碎等方法破碎海绵细胞，提取总的水溶性蛋白和肽类，再通过离心和超滤去除大蛋白，滤过液经大孔树脂吸附和解吸附获得脱盐后的肽类粗提物。第二阶段是将肽类粗提物经乙腈-水浓度梯度反相HPLC制备，获得10个以上的第二级组分。第三阶段是将各第二级组分通过乙腈-水等度反相HPLC精细分离获得纯肽。本发明可以高效率低费用地制备50g级规模的海绵动物水溶性肽类粗提物和100mg级的纯肽，极大便利海绵活性肽类的药物开发。

名词表：

HPLC：高效液相色谱

PMSF：苯甲基磺酰氟

Triton X-100：一种常用非离子性去垢剂

NP-40：Nonidet P-40，一种常用非离子性去垢剂

Lowry法：又称Folin酚试剂法，测量蛋白/肽类浓度的常用方法

CID：二级质谱中的碰撞诱导裂解

NEC：规一化碰撞能技术，消除离子阱质谱仪二级质谱实验中的质量歧视效应

MS：质谱

MS/MS：二级质谱。

Claims (10)

1.一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将海绵动物破碎，用提取缓冲液浸泡，超声，离心后获得可溶解蛋白/肽类水溶液，过滤后进行吸附/解吸附，获得脱盐后的肽类第一级粗提物；

2)将肽类第一级粗提物经旋转蒸发浓缩后进行第二级纯化得10～30个第二级组分，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存；

3)将第二级组分中主成分小于95％的二级组分经旋转蒸发浓缩后进行第三级纯化得海绵动物水溶性肽类，或再经冷冻干燥以粉末状态避光低温长期保存。

2.如权利要求1所述一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述破碎采用冷冻破碎或冻干后破碎；所述冷冻破碎可在液氮温度下用粉碎机破碎海绵动物组织块；所述冻干后破碎可将海绵冻干后用粉碎机破碎。

3.如权利要求1所述一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述提取缓冲液的配方为：水，10％乙醇，20mM Tris-HCl pH7.5，5mM EDTA，0.5％TritonX-100或NP-40，临用时加1mMβ-巯基乙醇、20μM苯硫脲、1mM PMSF和10μg/mL抑肽酶，每隔1h加一次PMSF。

4.如权利要求1所述一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述浸泡是于4℃层析柜中以2～4倍海绵动物质量的提取缓冲液浸泡，浸泡时间为1～2h；所述离心可于8000×g离心30min。

5.如权利要求1所述一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述过滤采用切向流过滤，所述切向流过滤可采用PALL Centramate超滤系统，先用MWCO300K膜包滤去大分子蛋白，滤过液再用MWCO5K或MWCO1K膜包滤过小分子蛋白/肽类。

6.如权利要求1所述一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述吸附/解吸附流程采用大孔吸附树脂吸附，将处理好的大孔吸附树脂与切向流滤过液混合，4℃下，通过摇床、磁力搅拌、机械搅拌等方式连续搅拌10～14h，之后用去离子水漂洗大孔吸附树脂至少5次，再将大孔吸附树脂装入层析柱用层析系统在280nm或215nm波长检测肽类洗脱过程，洗脱中逐步提高乙醇浓度到75％，最后用50mM NaOH洗脱，最大量的组分在60％～75％乙醇区间洗脱，收集10％～50乙醇洗脱组分和50mM NaOH洗脱组分。

7.如权利要求6所述一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，其特征在于所述大孔吸附树脂与切向流滤过液的体积比为1∶(3～20)。

8.如权利要求6所述一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，其特征在于所述大孔吸附树脂采用型号为DA201-C、NKA-9、AB-8或D101大孔吸附树脂中的一种，优选型号为DA201-C大孔吸附树脂。

9.如权利要求1所述一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述第二级纯化的具体方法是采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，乙腈-水梯度反相HPLC方法采用C18反相柱Welch Ultimata XB-C18，内径30mm，高度250mm，填料粒径10μm，孔径所用的流动相含0.1％三氟乙酸；上样样品用起始乙腈浓度含0.1％三氟乙酸的水溶液溶解；第二级纯化的HPLC每次上样3.5mL，梯度程序为：0～40min，3％→70％乙腈；40～43min，70％→100％乙腈；43～53min，100％乙腈，流速27mL/min，检测波长280nm或215nm。

10.如权利要求1所述一种海绵动物水溶性肽类的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述第三级纯化的具体方法是采用乙腈-水梯度反相HPLC方法，乙腈-水梯度反相HPLC方法采用C18反相柱Welch Ultimata XB-C18，内径30mm，高度250mm，填料粒径10μm，孔径或同类型产品；所用的流动相含0.1％三氟乙酸；上样样品用起始乙腈浓度含0.1％三氟乙酸的水溶液溶解；第三级纯化的HPLC每次上样0.5～1.0mL，以二级组分收集点的乙腈浓度减3％的乙腈-水溶液等度洗脱40min；40→45min，乙腈浓度升到100％；45→55min，100％乙腈，流速13.5mL/min，检测波长280nm或215nm。