CN106831943B - 一种低成本纯化透皮肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低成本纯化透皮肽的方法，该方法采用高效液相色谱，先用反相聚合物柱对大批量的透皮肽粗品进行纯化，除去透皮肽粗品中的杂质，再用弱阴离子交换柱将三氟乙酸型的透皮肽转化成醋酸型透皮肽。本发明纯化方法简单，不仅能得到纯度大于99％的透皮肽，而且能达到透皮肽成本低、收率高、产业化的要求。

Description

一种低成本纯化透皮肽的方法
技术领域
本发明属于多肽纯化技术领域，具体涉及一种透皮肽的纯化方法。
背景技术
透皮肽是一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽，可有效携带比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞，并对宿主细胞没有显著毒副作用。透皮肽存在多种穿膜机制，诸如直接渗透到细胞膜，通过易位形成的一个暂时性的结构和内吞作用介导入膜等。具体的穿膜机制还不清楚，但普遍认为透皮肽与细胞表面负电荷物质的直接接触是必不可少的。透皮肽的穿膜性质，使其在分子生物学、药学、细胞生物学、疫苗学甚至影像学上有广泛的应用前景。
透皮肽作为原料时HPLC纯度≥99％，然而通过合成得到的透皮肽粗品中含有很多杂质，需要进一步提纯。传统纯化透皮肽的方法纯化效率低，得到的透皮肽纯度低，且所使用的流动相为乙腈，乙腈的用量大、价格昂贵。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有透皮肽纯化方法存在的缺点，提供一种成本低、纯度高，适合产业化的透皮肽纯化方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、溶样
将透皮肽粗品粗品溶解于蒸馏水中，用滤膜过滤，收集滤液。
2、粗纯
采用高效液相色谱法，用反相聚合物柱对滤液进行粗纯，填料为F型SBC MCI GEI反相色谱填料，流动相A为0.1mol/L三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1mol/L三氟乙酸甲醇溶液，进行梯度洗脱纯化，流动相梯度选择A:B由(70～60):(30～40)到(65～50):(35～50)，收集粗纯后的透皮肽溶液，减压浓缩。
3、转盐
将步骤2得到的浓缩液用弱阴离子交换柱去除三氟乙酸，并转换成醋酸型透皮肽，填料为DEAE高流速琼脂糖微球，流动相为体积浓度2％的醋酸水溶液，收集醋酸型透皮肽溶液，减压浓缩，得到纯度大于99％的醋酸型透皮肽。
上述步骤1中，优选透皮肽粗品与蒸馏水的质量体积比为1g:15～50mL。
上述步骤2中，流动相梯度优选0到20分钟A:B由100:0到65:35，20到40分钟A:B由65:35到60:40，然后按A:B为60:40恒流。
上述步骤2中，所述F型SBC MCI GEI反相色谱填料的粒径是30～50μm。
上述步骤3中，所述DEAE高流速琼脂糖微球的粒径是50～160μm。
上述步骤2和3中，所述流动相的流速优选4～10mL/分钟，上样和洗脱的柱温优选35～45℃。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明方法打破了直接运用反相高效液相色谱法进行反复纯化的传统多肽纯化方法，将反相聚合物柱与弱阴离子交换柱结合使用，先对透皮肽进行粗纯，除去了大部分杂质，再用弱阴离子交换柱进行脱盐，将三氟乙酸型透皮肽转换成醋酸型透皮肽，并进一步纯化了多肽，极大地提高了纯化效率。
2、本发明方法粗纯过程中使用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸甲醇溶液做为动相，甲醇用量少且价格低廉，对环境污染小，节省了整个纯化过程中流动相的成本，且纯化工艺较为环保。
3、本发明方法两种柱子交替使用，有效地弥补了单一柱子难以完全分离粗肽中不同结构、不同化学性质的杂质，得到的透皮肽纯度高(大于99％)，且收率高。
4、本发明方法易于工业放大，能达到透皮肽成本低、收率高、产业化的要求。
附图说明
图1是实施例1纯化后的透皮肽的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、溶样
将0.3g固相合成的透皮肽粗品加入5mL蒸馏水中，超声分散使其完全溶解，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。
2、粗纯
采用高效液相色谱法，用反相聚合物柱对滤液进行粗纯，填料是粒径为30～50μm的F型SBC MCI GEI反相色谱填料(由成都科谱生物有限公司提供)，柱子填装体积为30mL，流动相A为0.1mol/L三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1mol/L三氟乙酸甲醇溶液，流速为4mL/分钟，柱温为40℃，检测波长为215nm，进样前反相聚合物柱先用0.1mol/L三氟乙酸水溶液平衡至电导率恒定不变，然后上样，对样品进行梯度洗脱纯化，流动相梯度选择0到20分钟A:B由100:0到65:35，20到40分钟A:B由65:35到60:40，然后按A:B为60:40恒流，收集粗纯后的透皮肽溶液，将粗纯后的透皮肽溶液在40℃减压旋蒸浓缩，浓缩至透皮肽含量为30～50mg/mL。
3、转盐
将步骤2得到的浓缩液用弱阴离子交换柱去除三氟乙酸，转换成醋酸型透皮肽，填料是粒径为50～160μm的DEAE高流速琼脂糖微球(由西安交大保赛生物技术股份有限公司提供)，柱子填装体积为30mL，流动相是体积浓度为2％的醋酸水溶液，流速为4mL/分钟，柱温为40℃，检测波长为215nm，进样前弱阴离子交换柱先用体积浓度为2％的醋酸水溶液平衡至电导率恒定不变，平衡后上样，收集醋酸型透皮肽溶液，将醋酸型透皮肽溶液在40℃减压旋蒸浓缩后，冷冻干燥，得到纯度大于99％的醋酸型透皮肽，透皮肽的纯化收率为81％。其色谱图见图1。
实施例2
本实施例的溶样步骤1中，将1g固相合成的透皮肽粗品加入50mL蒸馏水中，超声分散使其完全溶解，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。其他步骤与实施例1相同，得到纯度大于99％的醋酸型透皮肽，透皮肽的纯化收率为78％。
实施例3
本实施例的粗纯步骤2中，流动相梯度选择0到20分钟A:B由95:5到60:40，20到40分钟A:B由60:40到55:45，其他步骤与实施例2相同，得到纯度大于99％的醋酸型透皮肽，透皮肽的纯化收率为76％。
实施例4
本实施例的溶样步骤1中，将5g固相合成的透皮肽粗品加入100mL蒸馏水中，超声分散使其完全溶解，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。其他步骤与实施例1相同，得到纯度大于99％的醋酸型透皮肽，透皮肽的纯化收率为78％。

Claims (1)

1.一种低成本纯化透皮肽的方法，其特征在于它由下述步骤组成：
（1）溶样
将透皮肽粗品溶解于蒸馏水中，透皮肽粗品与蒸馏水的质量体积比为1g:15～50mL，用滤膜过滤，收集滤液；
（2）粗纯
采用高效液相色谱法，用反相聚合物柱对滤液进行粗纯，填料为粒径30～50μm的F型SBC MCI GEI反相色谱填料，流动相A为0.1mol/L 三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1mol/L三氟乙酸甲醇溶液，流动相的流速为4～10mL/分钟，上样和洗脱的柱温为35～45℃，进行梯度洗脱纯化，流动相梯度选择0到20分钟 A:B由100:0到65:35，20到40分钟A:B由65:35到60:40，然后按A:B为60:40恒流，收集粗纯后的透皮肽溶液，减压浓缩；
（3）转盐
将步骤（2）得到的浓缩液用弱阴离子交换柱去除三氟乙酸，并转换成醋酸型透皮肽，填料为粒径50～160μm的DEAE高流速琼脂糖微球，流动相为体积浓度2%的醋酸水溶液，流动相的流速为4～10mL/分钟，上样和洗脱的柱温为35～45℃，收集醋酸型透皮肽溶液，减压浓缩，得到纯度大于99%的醋酸型透皮肽。
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