CN106542999A - 一种迷迭香酸的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种天然产物的分离技术，具体说是迷迭香酸的纯化方法。它的特点是先将含有迷迭香酸的粗品用碱性缓冲液溶解，过滤，得到样品溶液；再将样品溶液加载至硼酸亲和柱上，先用碱性缓冲液冲洗硼酸亲和柱，再用酸性缓冲液对硼酸亲和柱进行洗脱，得到亲和洗脱液；然后，将亲和洗脱液加载至大孔树脂柱上，先用纯化水冲洗大孔树脂柱，再用乙醇水溶液进行洗脱，得到乙醇水溶液洗脱液；最后，对乙醇水溶液洗脱液进行减压干燥，得到纯化的迷迭香酸产品。采用该方法对迷迭香酸进行分离纯化，制备工艺简单，无需使用有毒有害的有机溶剂，纯化效率高，产品纯度高，适用于工业化生产。

Description

一种迷迭香酸的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种天然产物的分离技术，具体说是利用亲和层析分离技术对迷迭香酸进行纯化的方法。

背景技术

迷迭香酸（Rosmarinic acid，结构如下）是一种多元酚酸类物质，在自然界中主要存在于紫草科、唇形科、五加科、葫芦科、梧桐科等多种植物及其亚属中。迷迭香酸作为抗氧化剂，具有极强的清除体内自由基的活性和抗氧化作用，其抗氧化活性强于咖啡酸、绿原酸、叶酸、维生素E等；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及立枯丝合菌的生长有明显的抑制作用；具有抗病毒、抗炎活性、免疫抑制活性、抗血栓作用和抗抑郁活性等药理作用。它的化学结构属于咖啡酸的二聚体衍生物，分子式为C18H16O8，其结构式如图1所示。

中国发明专利申请201110330595.3公开了一种从藏丹参中分离纯化迷迭香酸的制备方法。其操作步骤为：将药材粉碎后用70%乙醇水提取，提取液调pH至2.5-3.5，上大孔树脂柱，依次用水、60%乙醇水洗脱，收集洗脱液浓缩，喷雾干燥得纯度为 30% 左右的迷迭香酸。

中国发明专利申请200710017142.9公开了一种以紫苏叶制备迷迭香酸的方法。将紫苏叶用pH为3的柠檬酸水浸泡，过滤后提取液上大孔树脂，依次用醇水溶液洗脱，将收集液浓缩，获得纯度为10%的粗品。

中国发明专利申请201010130287.1公开了一种迷迭香酸的制备工艺。其采用阳离子交换过滤，大孔树脂吸附，分别用石油醚、乙酸乙酯、乙醇等溶剂洗脱，最后通过活性炭脱色和纳滤浓缩等步骤制备迷迭香酸的方法。

中国发明专利ZL200710067381.5公开了一种迷迭香酸的制备方法和应用。其采用大孔树脂和反相柱层析联合技术制备迷迭香酸的方法，经过3次反复洗脱最终获得纯度大于90%的迷迭香酸。

中国发明专利ZL200410075747.X公开了一种紫苏迷迭香酸的生产工艺。其利用大孔树脂吸附，10%馏分用石油醚萃取获得50% 纯度的迷迭香酸，然后再次用大孔树脂进行纯化，最终获得纯度>95%的迷迭香酸产品。

中国发明专利ZL200510131129.7公开了一种迷迭香酸的制备方法。其将含迷迭香酸的药材以醇水浸渍、渗漉或超声提取后，提取液加入抗氧化剂后上聚酰胺柱层析，先用低浓度30%乙醇洗脱杂质，然后用 60%浓度乙醇洗脱迷迭香酸成分，经结晶、干燥得到高纯度的迷迭香酸。

中国发明专利ZL201210499594.6公开了一种从植物油粕中制备迷迭香酸的方法。其利用两步大孔树脂或离子交换树脂或聚酰胺树脂进行迷迭香酸的纯化。

中国发明专利ZL201410270399.5发明了一种利用高速逆流色谱分离纯化制备丹酚酸B和迷迭香酸的方法。将经过大孔吸附树脂富集得到粗提物进行高速逆流色谱分离，再用不同浓度的溶剂进行梯度洗脱，最终获得纯度90%以上的迷迭香酸。

中国发明专利ZL201510274646.3公开了一种从三种高山鼠尾草植物中制备迷迭香酸化学对照品的方法。步骤包括微孔树脂除杂、硅胶柱富集、亲水液相制备色谱精制，最终获得纯度大于98%的迷迭香酸产品。

上述技术大都采用大孔树脂或聚酰胺树脂进行富集，以不同浓度的有机溶剂进行除杂和洗脱，获得较高纯度的迷迭香酸。但这类大孔树脂选择性较差，通常将粗品中的大部分杂质也吸附到柱上，只能通过梯度洗脱来纯化，且需要用到大量的有机溶剂，不够环保。而上文中涉及到的其他色谱方法，如高速逆流色谱、硅胶柱、亲水液相色谱等，则存在处理量太小、难以放大至工业生产规模等问题，且仍需要使用大量有机溶剂。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种迷迭香酸的纯化方法，采用该方法对迷迭香酸进行分离纯化，制备工艺简单，无需使用有毒有害的有机溶剂，纯化效率高，产品纯度高，适用于工业化生产。

为解决上述问题，采取以下技术方案：

本发明的迷迭香酸的纯化方法的特点是包括以下步骤：

第一步，样品溶液准备：将含有迷迭香酸的粗品用碱性缓冲液溶解，调整溶液的pH值在8~10的范围内，并过滤掉溶液中颗粒状的杂质，得到样品溶液。

第二步，硼酸亲和纯化：将硼酸亲和柱先用碱性缓冲液平衡，再将样品溶液加载至硼酸亲和柱上，然后用碱性缓冲液冲洗硼酸亲和柱3-8个柱体积，最终用酸性缓冲液对硼酸亲和柱进行洗脱，收集得到亲和洗脱液。

第三步，大孔树脂脱盐精制：将大孔树脂柱用无水乙醇再生后用纯化水平衡，再将亲和洗脱液加载至大孔树脂柱上，用纯化水冲洗大孔树脂柱，除去亲和洗脱液中含有的缓冲盐和杂质，然后用乙醇水溶液进行洗脱，收集得到乙醇水溶液洗脱液。

第四步，减压干燥：对乙醇水溶液洗脱液进行减压干燥，得到纯化的迷迭香酸产品。

其中，所述迷迭香酸的粗品是含有迷迭香酸的植物组织浸提液或者经过加工过的富含迷迭香酸的原料。

所述碱性缓冲液是含有摩尔浓度为10-100 mM的磷酸钠盐或磷酸钾盐或甘氨酸氢氧化钠或碳酸钠的水溶液，其pH值为8~10。

第一步中的过滤操作是通过正压或者负压以滤膜或者滤纸滤去溶液中不溶解的颗粒状物质。

所述硼酸亲和柱是装填了配基为苯硼酸的亲和填料的玻璃层析柱。

所述酸性缓冲液是含有摩尔浓度为10-100mM的醋酸钠或磷酸钠盐或磷酸钾盐或柠檬酸盐的水溶液，其pH值为3~5。

所述大孔树脂柱是装填了大孔树脂的玻璃层析柱。

所述乙醇水溶液是含有体积百分比为20%-60%乙醇的水溶液。

采取上述方案，具有以下优点：

本发明的迷迭香酸的纯化方法通过对含有迷迭香酸的粗品进行溶解、过滤，得到样品溶液；再将样品溶液加载至硼酸亲和柱上并进行洗脱，得到亲和洗脱液；然后将亲和洗脱液加载至大孔树脂柱上再次进行洗脱，得到乙醇水溶液洗脱液；最后对乙醇水溶液洗脱液进行浓缩、干燥，即可得到纯化的迷迭香酸产品。与背景技术相比，该方法制备工艺简单，整个纯化过程仅使用含有缓冲盐的水溶液以及少量低浓度的乙醇水溶液，不涉及具有毒性、不环保的有机溶剂，有效减少有机废水的产生。同时，硼酸亲和柱能够非常专一的与具有顺式二醇结构的迷迭香酸产生亲和作用，高效吸附样品中的迷迭香酸，而不具有该结构的杂质不会被填料吸附，经过硼酸亲和一步纯化，可将粗品中低含量的迷迭香酸提高至纯度80%-90%，回收率可达70-90%，大大提高了迷迭香酸的纯化效率和最终的产品纯度。该纯化方法能够对迷迭香酸的粗品进行大批量的处理，适用于工业化生产。

附图说明

图1是迷迭香酸的分子结构式；

图2为本发明实施例一迷迭香酸粗品的HPLC分析图谱；

图3为本发明实施例一经过硼酸亲和纯化后的洗脱液的HPLC分析图谱；

图4为本发明实施例一经过大孔树脂脱盐精制后的迷迭香酸产品的HPLC分析图谱；

图5是硼酸亲和纯化的原理图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例一

本发明的迷迭香酸的纯化方法包括以下步骤：

第一步，样品溶液准备：将含有10%迷迭香酸的粗品150g用20L的pH值为8、浓度为50mM的磷酸钠缓冲液溶解，调整溶液的pH值在8.5±0.1的范围内，并过滤掉溶液中颗粒状的杂质，得到样品溶液，其HPLC分析图谱如图2所示。

第二步，硼酸亲和纯化：将柱体积为5L的硼酸亲和柱（ID200mm×160mm）先用pH值为8、浓度为50mM的磷酸钠缓冲液平衡，再将样品溶液加载至硼酸亲和柱上，然后用上述缓冲液冲洗硼酸亲和柱8个柱体积（即40L），最终用pH值为3、浓度为50mM的磷酸钠缓冲液对硼酸亲和柱进行洗脱，收集得到亲和洗脱液10L，其HPLC分析图谱如图3所示。

第三步，大孔树脂脱盐精制：将装填体积为1L的HB60大孔树脂的玻璃柱（ID75mm×700mm）用无水乙醇再生后用纯化水平衡，再将10L亲和洗脱液加载至大孔树脂柱上，用纯化水冲洗大孔树脂柱，除去亲和洗脱液中含有的缓冲盐和杂质，然后用20%乙醇水溶液进行洗脱，收集得到乙醇水溶液洗脱液1.8L，其HPLC分析图谱如图4所示。

第四步，减压干燥：对乙醇水溶液洗脱液进行真空度为 0.1 MPa、温度为 60 ℃减压干燥，得到纯化的迷迭香酸产品8.4g，经过HPLC分析，纯度为98.4%。

实施例二

本发明的迷迭香酸的纯化方法包括以下步骤：

第一步，样品溶液准备：将含有15%迷迭香酸的粗品150g用20L的pH值为10、浓度为10mM的碳酸钠缓冲液溶解，调整溶液的pH值在9.5±0.1的范围内，并过滤掉溶液中颗粒状的杂质，得到样品溶液。

第二步，硼酸亲和纯化：将柱体积为5L的硼酸亲和柱（ID200mm×160mm）先用pH值为10、浓度为10mM的碳酸钠缓冲液平衡，再将样品溶液加载至硼酸亲和柱上，然后用上述缓冲液冲洗硼酸亲和柱5个柱体积，最终用pH值为5、浓度为50mM的磷酸钾缓冲液对硼酸亲和柱进行洗脱，收集得到亲和洗脱液11.5L。

第三步，大孔树脂脱盐精制：将装填体积为1L的HB60大孔树脂的玻璃柱（ID75mm×700mm）用无水乙醇再生后用纯化水平衡，再将11.5L亲和洗脱液加载至大孔树脂柱上，用纯化水冲洗大孔树脂柱，除去亲和洗脱液中含有的缓冲盐和杂质，然后用40%乙醇水溶液进行洗脱，收集得到乙醇水溶液洗脱液1.4L。

第四步，减压干燥：对乙醇水溶液洗脱液进行真空度为 0.1 MPa、温度为 60 ℃减压干燥，得到纯化的迷迭香酸产品13.2g，经过HPLC分析，纯度为95.8%。

实施例三

本发明的迷迭香酸的纯化方法包括以下步骤：

第一步，样品溶液准备：将含有20%迷迭香酸的粗品100g用20L的pH值为9、浓度为100mM的磷酸钾缓冲液溶解，调整溶液的pH值在9.0±0.1的范围内，并过滤掉溶液中颗粒状的杂质，得到样品溶液。

第二步，硼酸亲和纯化：将柱体积为5L的硼酸亲和柱先（ID200mm×160mm）用pH值为9、浓度为100mM的磷酸钾缓冲液平衡，再将样品溶液加载至硼酸亲和柱上，然后用上述缓冲液冲洗硼酸亲和柱3个柱体积，最终用pH值为4、浓度为100mM的磷酸钾缓冲液对硼酸亲和柱进行洗脱，收集得到亲和洗脱液12L。

第三步，大孔树脂脱盐精制：将装填体积为1L的HB60大孔树脂的玻璃柱（ID75mm×700mm）用无水乙醇再生后用纯化水平衡，再将12L亲和洗脱液加载至大孔树脂柱上，用纯化水冲洗大孔树脂柱，除去亲和洗脱液中含有的缓冲盐和杂质，然后用60%乙醇水溶液进行洗脱，收集得到乙醇水溶液洗脱液1.1L。

第四步，减压干燥：对乙醇水溶液洗脱液进行真空度为 0.1 MPa、温度为 60 ℃减压干燥，得到纯化的迷迭香酸产品11.7g，经过HPLC分析，纯度为97.1%。

上述三个实施例中所述硼酸亲和柱都是装填了配基为苯硼酸的亲和填料的玻璃层析柱。硼酸亲和纯化的原理是：在碱性环境下，硼酸基团与环境中的氢氧根络合，带有负电荷的四面体型的硼酸基团可以与顺式邻位二醇或苯环上的邻位二酚发生共价反应，形成稳定的五元或六元环酯；在酸性条件下，反应逆向进行，酯化反应所形成的两个共价键发生水解，还原成硼酸基团和顺式邻位二醇，如图5所示。

本发明所用的硼酸亲和层析法，相对于现有仅以大孔吸附树脂为代表的层析方法，具有以下优点：

1）选择性高。硼酸亲和填料能够非常专一的与具有顺式二醇结构的迷迭香酸产生亲和作用，高效吸附样品中的迷迭香酸，而不具有该结构的杂质不会被填料吸附；

2）整个纯化过程仅使用含有缓冲盐的水溶液以及少量低浓度的乙醇水溶液，不涉及具有毒性，不环保的有机溶剂，有效减少有机废水的产生；

3）产品纯度高。经过硼酸亲和一步纯化，可将粗品中低含量的迷迭香酸提高至纯度80%-90%，回收率可达70-90%，再经过大孔树脂脱盐精制，纯度可达到95%-98%。

Claims (8)

1.一种迷迭香酸的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，样品溶液准备：

将含有迷迭香酸的粗品用碱性缓冲液溶解，调整溶液的pH值在8~10的范围内，并过滤掉溶液中颗粒状的杂质，得到样品溶液；

第二步，硼酸亲和纯化：

将硼酸亲和柱先用碱性缓冲液平衡，再将样品溶液加载至硼酸亲和柱上，然后用碱性缓冲液冲洗硼酸亲和柱3-8个柱体积，最终用酸性缓冲液对硼酸亲和柱进行洗脱，收集得到亲和洗脱液；

第三步，大孔树脂脱盐精制：

将大孔树脂柱用无水乙醇再生后用纯化水平衡，再将亲和洗脱液加载至大孔树脂柱上，用纯化水冲洗大孔树脂柱，除去亲和洗脱液中含有的缓冲盐和杂质，然后用乙醇水溶液进行洗脱，收集得到乙醇水溶液洗脱液；

第四步，减压干燥：

对乙醇水溶液洗脱液进行减压干燥，得到纯化的迷迭香酸产品。

2.如权利要求1所述的迷迭香酸的纯化方法，其特征在于所述迷迭香酸的粗品是含有迷迭香酸的植物组织浸提液或者经过加工过的富含迷迭香酸的原料。

3.如权利要求1所述的迷迭香酸的纯化方法，其特征在于所述碱性缓冲液是含有摩尔浓度为10-100 mM的磷酸钠盐或磷酸钾盐或甘氨酸氢氧化钠或碳酸钠的水溶液，其pH值为8~10。

4.如权利要求1所述的迷迭香酸的纯化方法，其特征在于第一步中的过滤操作是通过正压或者负压以滤膜或者滤纸滤去溶液中不溶解的颗粒状物质。

5.如权利要求1所述的迷迭香酸的纯化方法，其特征在于所述硼酸亲和柱是装填了配基为苯硼酸的亲和填料的玻璃层析柱。

6.如权利要求1所述的迷迭香酸的纯化方法，其特征在于所述酸性缓冲液是含有摩尔浓度为10-100mM的醋酸钠或磷酸钠盐或磷酸钾盐或柠檬酸盐的水溶液，其pH值为3~5。

7.如权利要求1所述的迷迭香酸的纯化方法，其特征在于所述大孔树脂柱是装填了大孔树脂的玻璃层析柱。

8.如权利要求1所述的迷迭香酸的纯化方法，其特征在于所述乙醇水溶液是含有体积百分比为20%-60%乙醇的水溶液。