CN102702150B - 一种羟基红花黄色素a的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高收率、高纯度的从中药材红花中提取、分离和纯化羟基红花黄色素A的制备方法，其包括红花药材的超声波水提取、HZ801型大孔吸附树脂分离、LH-20型葡聚糖凝胶层析分离、超滤和冷冻干燥的步骤，制得羟基红花黄色素A干粉，产品含量达99.8％，羟基红花黄色素A收率达到62.7％。

Description

一种羟基红花黄色素A的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种羟基红花黄色素A的制备方法和应用，具体地说，涉及从中药材红花中提取羟基红花黄色素A的制备方法。属于天然药物化学领域。

背景技术

红花为菊科红花属植物红花的干燥花，具有活血止痛的功效。红花活血的有效成分主要集中在水溶性的红花黄色素。红花黄色素是三种水溶性成分的混合物，即羟基红花黄色素A、羟基红花黄色素B和羟基红花黄色素C。其中，羟基红花黄色素A是含量最高的，而且是红花药理功效的最有效水溶性成分。

现有技术中，关于羟基红花黄色素A的药理作用、临床药物制剂已有很多报道。从红花药材中提取、分离和纯化羟基红花黄色素A的方法，也有很多报道。CN1475272公开了红花经水提取、柱层析分离、醇沉淀、再经柱层析分离、超滤膜除菌和冷冻干燥步骤，制备得到羟基红花黄色素A干粉。该方法虽然保证了羟基红花黄色素A的纯度，但采用醇沉工艺，导致羟基红花黄色素A流失大，最终制备得到羟基红花黄色素A的收率很低，不到2％，不利于工业化生产，工艺无生产实际应用价值。CN101195647A公开了羟基红花黄色素A的制备方法，药材红花经水煮提取、大孔吸附树脂柱层析分离、葡聚糖凝胶柱层析分离和微孔滤膜过后，喷雾干燥制得羟基红花黄色素A干粉。该方法生产羟基红花黄色素A的纯度和收率，整体上而言，比之前现有技术均大大提高。然而，现有技术从红花中生产羟基红花黄色素A的方法，羟基红花黄色素A的收率还是不够理想，其不利于红花药材的充分利用，以及造成羟基红花黄色素A在生产工艺中被大量流失。

发明内容

本发明目的在于提供一种高纯度、高收率的从红花中提取、分离和纯化羟基红花黄色素A的方法。为实现本发明目的，本发明技术方案如下：

本发明提供了一种制备羟基红花黄色素A的方法，其包括红花药材的提取、大孔树脂分离、葡聚糖凝胶层析分离和超滤的步骤，其特征在于：

所述的提取是红花药材以水为提取溶剂，于40～60℃超声波频率40KHZ进行超声波提取40-60分钟；

所述的大孔树脂分离是用大孔吸附树脂HZ801；

所述的葡聚糖凝胶层析分离是用葡聚糖凝胶LH-20；

所述的超滤是用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜。

上述所述的方法，其中所述的大孔树脂分离，大孔吸附树脂柱的柱内径与柱高的比值为1∶8～15。

上述所述的方法，其中所述的大孔树脂分离，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速10～30ml/min。

上述所述的方法，其中所述的葡聚糖凝胶层析分离，层析柱的径高比为1∶5～10.

上述所述的方法，其中所述的葡聚糖凝胶层析分离，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速控制线性流速为1～10cm/h。

作为优选，本发明提供了一种制备羟基红花黄色素A的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)提取：取红花药材，粉碎，加水10～15倍，于40～60℃超声波频率40KHZ进行超声波提取40-60分钟，得到红花水提取物；

(2)大孔吸附树脂分离：步骤(1)得到的红花水提取物用大孔吸附树脂HZ801柱分离，大孔吸附树脂柱的柱内径与柱高的比值为1∶8～15，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速10～30ml/min，收集洗脱液，减压浓缩，得红花黄色素浓缩液粗品；

(3)葡聚糖凝胶层析分离：步骤(2)得到的红花黄色素浓缩液粗品过滤或离心后用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析分离，层析柱的径高比为1∶5～10，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速控制线性流速为1～10cm/h，收集含羟基红花黄色素A洗脱液，减压浓缩得浓缩液；

(4)超滤：步骤(3)所得浓缩液经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液；

(5)冻干：步骤(4)所得超滤液经冷冻干燥，即得羟基红花黄色素A。

本发明通过对红花药材提取羟基红花黄色素A的大量提取工艺研究，令人意外地发现，采用中药材超声波提取技术，在一定的温度和超声波频率下，即于40～60℃超声波频率40KHZ进行超声波提取40-60分钟，能从红花药材中最大限度地提取出羟基红花黄色素A，而且提取时间短，提取出的杂质成分少，不仅提取效率高，而且有利于后续的分离和纯化步骤，大大提高羟基红花黄色素A的收率和得率水平。

表1：超声频率对比表

试验结果表明，本发明超声波频率40KHZ进行超声波提取可以提高提取率。

表2：温度对比表

试验结果表明，本发明选择40-60℃超声波频率40KHZ进行超声波提取可以提高提取率。

表3：超声时间对比表

试验结果表明，本发明优选40-60℃超声波频率40KHZ进行提取40-60分钟。

大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶常应用于羟基红花黄色素的分离和纯化。在先现有技术CN101195647A中，公开了采用D101型大孔吸附树脂进行初分离效果好，用低浓度乙醇洗脱剂，在精制分离中，优选采用葡聚糖凝胶G-25作为吸附剂，柱床径高比为1∶7-17(优选1∶12)有利于羟基红花黄色素A的精制纯化。本发明令人意外地发现，红花药材经超声波提取技术所得到的水提取物，采用大孔吸附树脂HZ801作为初分离的柱层析吸附剂，羟基红花黄色素A的选择性、吸附容量和解析率更好，提高了初分离的效果，而且，使用纯水作为洗脱剂，不仅降低洗脱剂成本，更易更加环保，避免了羟基红花黄色素A有机溶剂残留问题。经过大孔吸附树脂初分离后的羟基红花黄色素A粗品，以葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离精制和纯化，具有更好的吸附容量和解析率，并且纯化得到的羟基红花黄色素A含量达到99.8％。

对比试验：

1、按照实施例1相同方法制备羟基红花黄色素A，其中采用D4020大孔吸附树脂分离柱；

2、按照实施例1相同方法制备羟基红花黄色素A，其中采用B201大孔吸附树脂分离柱；

3、按照实施例1相同方法制备羟基红花黄色素A，其中采用AB-8大孔吸附树脂分离柱；

4、按照实施例1相同方法制备羟基红花黄色素A，其中采用X-5大孔吸附树脂分离柱；

工艺指标：A-吸附量(mg/g)、B-解吸率(％)、C-羟基红花黄色素含量(％)D-羟基红花黄色素A收率％

表4：不同大孔吸附树脂工艺结果

	A	B	C	D
					实施例1	120	92.5	99.8	62.7
对比试验1	110	88.6	89.4	56.7
					对比试验2	105	85.6	77.2	55.1
对比试验3	96	83.3	71.3	55.5
					对比试验4	84	92.8	78.5	53.3

试验结果表明，本发明采用HZ801大孔吸附树脂可以显著提高工艺效率。

本发明通过考察红花黄色素在制备过程中的稳定性实验研究，采用高效液相色谱法，以羟基红花黄色素A(HSYA)的含量为指标，40℃、60℃、80℃真空干燥，HSYA损失率分别为4.23％、26.83％、87.34％；冷冻干燥HSYA损失率为2.85％，从而得出结论HSYA对热不稳定。本发明采用冷冻干燥，虽然干燥时间长，但它的优点包括可以使药物保持原有的理化性质和生理活性，且有效成分损失极少。此外，冻干制剂特有的疏松多孔结构，可以使药物易于复水而恢复活性，而且冻干制剂含水量低，易长期稳定保存。且设备简单，操作温度低，生产量大，是最柔和的干燥方法。

层析浓缩液经过滤或离心后采用截留8000-10000分子量的超滤膜超滤。超滤是以多孔性半透膜为过滤介质，常温下依靠施压和流速，使提取液流经膜面而使高分子杂质被截留，达到除去杂质，提高药液澄明度的一种膜分离技术。可以保证有效成份的通过，而将分子量数万至数百万的杂质和热原阻截，可达到除去杂质和大分子蛋白、保留有效成份、去除细菌内毒素、进一步纯化提取液的目的。

总体上说，本发明的从红花中提取、分离和纯化羟基红花黄色素A的生产方法，与在先现有技术相比较，是一种高纯度、高收率的羟基红花黄色素A的生产方法，本发明方法更加适合于工业化生产，工艺环保、绿色，更加高效地从红花中提取得到羟基红花黄色素A，有利于红花药材和药用活性价值成分的充分提取和被利用。

具体实施方式

实施例1：

称取红花，粉碎，加10-13倍药材重量的纯化水，于40-60℃、40KHZ超声波频率提取50分钟，过滤，提取液冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。

将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的HZ801(大孔吸附树脂HZ801购自华东理工大学)大孔吸附树脂柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的纯化水以每分钟20ml的流速洗脱。收集富含红花黄色素的洗脱液，洗脱离液在温度低于80℃下减压浓缩，得红花黄色素粗品浓缩液，以红花计，每公斤红花得红花黄色素粗品浓缩液100ml。

红花黄色素粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，注射用水为洗脱剂洗脱，洗脱流速为每分钟5ml，收集含红花黄色素部分。收集液在温度低于80℃下减压浓缩后，得红花黄色素精品浓缩液，经过滤后采用截留8000-10000分子量的超滤膜控制进膜压力0.3MPa超滤，以红花计，每公斤红花得红花黄色素精品浓缩液80-100ml。再经冷冻干燥，即得羟基红花黄色素A干粉，经HPLC检测，羟基红花黄色素A含量为99.8％，计算得羟基红花黄色素A收率为62.7％。

Claims (1)

1.一种制备羟基红花黄色素A的方法，其特征在于包括如下步骤： 

(1)提取：取红花药材，粉碎，加水10～13倍，于40～60℃超声波频率40KHz进行超声波提取50分钟，得到红花水提取物； 

(2)大孔吸附树脂分离：步骤(1)得到的红花水提取物用大孔吸附树脂HZ801柱分离，大孔吸附树脂柱的柱内径与柱高的比值为1∶12，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速20m1/min，收集洗脱液，减压浓缩，得红花黄色素浓缩液粗品； 

(3)葡聚糖凝胶层析分离：步骤(2)得到的红花黄色素浓缩液粗品过滤或离心后用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析分离，层析柱的径高比为1∶5，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速控制线性流速为每分钟5m1，收集含羟基红花黄色素A洗脱液，减压浓缩得浓缩液； 

(4)超滤：步骤(3)所得浓缩液经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜控制进膜压力0.3MPa进行超滤得到超滤液； 

(5)冻干：步骤(4)所得超滤液经冷冻干燥，即得羟基红花黄色素A。