CN106632612B - 一种成骨生长肽的低成本纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种成骨生长肽的纯化方法，包括：粗纯：将成骨生长肽粗品水溶液上样至反相聚合物柱，用流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液并减压浓缩得到浓缩液；和转盐：将浓缩液上样至弱阴离子交换柱，用醋酸洗脱，收集醋酸型成骨生长肽溶液，减压浓缩与冷冻干燥得到成骨生长肽。本发明的方法成本低，得到的成骨生长肽纯度高，适合产业化的纯化成骨生长肽。

Description

一种成骨生长肽的低成本纯化方法
技术领域
本发明属于多肽纯化技术领域，具体地，本发明涉及一种成骨生长肽的纯化方法。
背景技术
成骨生长肽(Osteogenic Growth Peptide，OGP)是一种能促进骨细胞生长的14-氨基酸多肽，序列为Ala-Leu-Lys-Arg-Glu-Arg-Gly-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，它通过作用于成骨细胞系的ROS、MC3T3、E1和NH3T3成纤维细胞，促进成骨细胞的活性，提高骨量，在骨质疏松症和骨折的预防及治疗方面有广阔的应用前景。
OGP在大鼠骨质疏松模型的实验研究结果表明，OGP的作用机理是通过成骨的增加来提高骨量峰值，减缓骨丢失，从而达到治疗骨质疏松的效果。与目前临床上使用的通过抑制破骨细胞活性来达到提高骨量的鲑鱼降钙素相比，其作用机制完全不同，具有显著的优势。
OGP作为治疗骨质疏松症的药物时HPLC纯度≥99％，然而通过合成得到的OGP粗品中含有很多杂质，需要进一步提纯后才可以作为药用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有成骨生长肽纯化方法存在的缺点，提供一种成本低、纯度高，适合产业化的成骨生长肽纯化方法。
更具体来说，本发明通过如下技术方案实现的。
本发明提供了一种一种成骨生长肽的纯化方法，包括：(1)粗纯：将成骨生长肽粗品水溶液上样至反相聚合物柱，用酸性流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液并减压浓缩得到浓缩液；(2)转盐：将步骤(1)得到的浓缩液上样至弱阴离子交换柱，用醋酸洗脱，收集醋酸型成骨生长肽溶液，减压浓缩与冷冻干燥得到成骨生长肽。
前述的纯化方法，所述成骨生长肽粗品水溶液通过将成骨生长肽粗品溶解于水，超声分散，用滤膜过滤并收集滤液来制备；优选地，成骨生长肽粗品与水的比率是(0.3g～5g):(5ml～100ml)。
前述的纯化方法，所述反相聚合物柱是填料为F型SBC MCI GEI反相色谱填料的反相聚合物柱；优选地，所述F型SBC MCI GEI反相色谱填料的粒径是30～50μm。
前述的纯化方法，所述弱阴离子交换柱是填料为DEAE高流速琼脂糖微球的弱阴离子交换柱；优选地，所述DEAE高流速琼脂糖微球的粒径是50～160μm。
前述的纯化方法，所述酸性流动相由流动相A和流动相B组成；其中，流动相A是三氟乙酸-水溶液，流动相B是三氟乙酸-甲醇溶液；优选地，流动相A是0.1mol/L三氟乙酸-水溶液，流动相B是0.1mol/L三氟乙酸-甲醇溶液。
前述的纯化方法，步骤(1)中，所述酸性流动相梯度选择流动相A:流动相B由(90～85):(10～15)到(70～65):(30～35)。
前述的纯化方法，步骤(1)中，所述酸性流动相梯度选择0到15分钟流动相A:流动相B由(90～95):(10～5)到(85～80):(15～20)，15到65分钟流动相A:流动相B由(85～80):(15～20)到(70～65):(30～35)。
前述的纯化方法，步骤(1)得到的浓缩液中成骨生长肽的含量是30～50mg/ml。
前述的纯化方法，所述酸性流动相的流速是4ml/min，所述醋酸的流速是4ml/min。
前述的纯化方法，上样和洗脱时的柱温为35-45℃，优选40℃。
采用本发明的技术方案，至少具有如下有益效果：
1.本发明方法打破了直接运用反相高效液相色谱法进行反复纯化的传统多肽纯化方法，将反相聚合物柱与弱阴离子交换柱结合使用，先对成骨生长肽进行粗纯，除去了大部分杂质，再用弱阴离子交换柱进行脱盐，将三氟乙酸型成骨生长肽转换成醋酸型成骨生长肽，并进一步纯化了多肽，极大地提高了纯化效率。
2.本发明方法节省了整个纯化过程中流动相的成本，且纯化工艺较为环保。本方法粗纯过程中使用三氟乙酸-水溶液做流动相，用量少且价格低廉，对环境污染小。
3.本发明方法两种柱子交替使用，有效地弥补了单一柱子难以完全分离粗肽中不同结构、不同化学性质的杂质，得到的成骨生长肽纯度高(大于99％)，且收率高。
附图说明
图1是实施例1纯化后的成骨生长肽的质谱图。
图2是实施例1纯化后的成骨生长肽的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不限于这些实施例。除非另有说明，实施例中使用的原料和仪器均是商购获得的，是本领域常规使用的仪器和原料，只要其能满足实验需要即可。
实施例1
溶样：将0.3g固相合成的OGP粗品溶解于5ml水溶液中，超声分散，待溶液完全溶解后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
粗纯：用反相聚合物柱对滤液进行粗纯，填料是F型粒径为30～50μm的SBC MCIGEI反相色谱填料(由成都科谱生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填装体积为30mL，流动相A为0.1mol/L三氟乙酸-水溶液，流动相B为0.1mol/L的三氟乙酸-甲醇溶液，流速为4ml/min，柱温为40℃，检测波长为215nm，进样前反相聚合物柱先用0.1mol/L三氟乙酸-水溶液平衡至电导率恒定不变，然后上样，上样量为0.3g，对样品进行梯度洗脱纯化，流动相梯度选择0到15分钟A:B由90:10到85:15，15到65分钟A：B由85:15到70:30，收集粗纯后的OGP溶液，将粗纯后的OGP溶液在40℃减压旋蒸浓缩，浓缩至OGP含量为30～50mg/mL后收集待用。
转盐：将粗纯步骤得到的浓缩液用弱阴离子柱进行脱盐，转换成醋酸型的成骨生长肽，填料是50～160μm的DEAE高流速琼脂糖微球(由西安交大保赛生物技术股份有限公司提供)柱子填装体积为30mL，流动相为2％的醋酸，流速为4mL/min，柱温为40℃，检测波长为215nm，进样前弱阴离子柱先用超纯水平衡，平衡后上样，上样后用2％的醋酸洗脱。收集醋酸化的OGP溶液，将醋酸化的OGP溶液在40℃减压旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到纯度大于99％的OGP，OGP的纯化收率为72％。其质谱表征结果见图1，色谱图见图2。
实施例2
溶样：将1g固相合成的OGP粗品溶解于50ml水溶液中，超声分散，待溶液完全溶解后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
粗纯：用反相聚合物柱对滤液进行粗纯，填料是F型粒径为30～50μm的SBC MCIGEI反相色谱填料(由成都科谱生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填装体积为30mL，流动相A为0.1mol/L三氟乙酸-水溶液，流动相B为0.1mol/L的三氟乙酸-甲醇溶液，流速为4ml/min，柱温为40℃，检测波长为215nm，进样前反相聚合物柱先用0.1mol/L三氟乙酸-水溶液平衡至电导率恒定不变，然后上样，上样量为1g，对样品进行梯度洗脱纯化，流动相梯度选择0到15分钟A:B由90:10到85:15，15到65分钟A：B由85:15到70:30，收集粗纯后的OGP溶液，将粗纯后的OGP溶液在40℃减压旋蒸浓缩，浓缩至OGP含量为30～50mg/mL后收集待用。
转盐：将粗纯步骤得到的浓缩液用弱阴离子柱进行脱盐，转换成醋酸型的成骨生长肽，填料是50～160μm的DEAE高流速琼脂糖微球(由西安交大保赛生物技术股份有限公司提供)柱子填装体积为30mL，流动相为2％的醋酸，流速为4mL/min，柱温为40℃，检测波长为215nm，进样前弱阴离子柱先用超纯水平衡，平衡后上样，上样后用2％的醋酸洗脱。收集醋酸化的OGP溶液，将醋酸化的OGP溶液在40℃减压旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到纯度大于99％的OGP，OGP的纯化收率为69％。
实施例3
溶样：将1g固相合成的OGP粗品溶解于50ml水溶液中，超声分散，待溶液完全溶解后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；
粗纯：用反相聚合物柱对滤液进行粗纯，填料是F型粒径为30～50μm的SBC MCIGEI反相色谱填料(由成都科谱生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填装体积为30mL，流动相A为0.1mol/L三氟乙酸-水溶液，流动相B为0.1mol/L的三氟乙酸-甲醇溶液，流速为4ml/min，柱温为40℃，检测波长为215nm，进样前反相聚合物柱先用0.1mol/L三氟乙酸-水溶液平衡至电导率恒定不变，然后上样，上样量为1g，对样品进行梯度洗脱纯化，流动相梯度选择0到15分钟A:B由95:5到80:20，15到65分钟A：B由80:20到65:35，收集粗纯后的OGP溶液，将粗纯后的OGP溶液在40℃减压旋蒸浓缩，浓缩至OGP含量为30～50mg/mL后收集待用。
转盐：将粗纯步骤得到的浓缩液用弱阴离子柱进行脱盐，转换成醋酸型的成骨生长肽，填料是50～160μm的DEAE高流速琼脂糖微球(由西安交大保赛生物技术股份有限公司提供)柱子填装体积为30mL，流动相为2％的醋酸，流速为4mL/min，柱温为40℃，检测波长为215nm，进样前弱阴离子柱先用超纯水平衡，平衡后上样，上样后用2％的醋酸洗脱。收集醋酸化的OGP溶液，将醋酸化的OGP溶液在40℃减压旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到纯度大于95％的OGP，OGP的纯化收率为73％。
实施例4
溶样：将5g固相合成的OGP粗品溶解于100ml水溶液中，超声分散，待溶液完全溶解后用0.45um滤膜过滤，收集滤液；
粗纯：用反相聚合物柱对滤液进行粗纯，填料是F型粒径为30～50μm的SBC MCIGEI反相色谱填料(由成都科谱生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填装体积为300mL，流动相A为0.1mol/L三氟乙酸-水溶液，流动相B为0.1mol/L的三氟乙酸-甲醇溶液，流速为4ml/min，柱温为40℃，检测波长为215nm，进样前反相聚合物柱先用0.1mol/L三氟乙酸-水溶液平衡至电导率恒定不变，然后上样，上样量为5g，对样品进行梯度洗脱纯化，流动相梯度选择0到15分钟A:B由90:10到85:15，15到65分钟A：B由85:15到70:30，收集粗纯后的OGP溶液，将粗纯后的OGP溶液在40℃减压旋蒸浓缩，浓缩至OGP含量为30～50mg/mL后收集待用。
转盐：将粗纯步骤得到的浓缩液用弱阴离子柱进行脱盐，转换成醋酸型的成骨生长肽，填料是50～160μm的DEAE高流速琼脂糖微球(由西安交大保赛生物技术股份有限公司提供)柱子填装体积为300mL，流动相为2％的醋酸，流速为4mL/min，柱温为40℃，检测波长为215nm，进样前弱阴离子柱先用超纯水平衡，平衡后上样，上样后用2％的醋酸洗脱。收集醋酸化的OGP溶液，将醋酸化的OGP溶液在40℃减压旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到纯度大于99％的OGP，OGP的纯化收率为65％。
最后，需要注意的是：以上列举的仅是本发明的具体实施例，当然本领域的技术人员可以对本发明进行改动和变型，倘若这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种成骨生长肽的纯化方法，其特征在于，包括：
(1)粗纯：将成骨生长肽粗品水溶液上样至反相聚合物柱，用酸性流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液并减压浓缩得到浓缩液；
(2)转盐：将步骤(1)得到的浓缩液上样至弱阴离子交换柱，用醋酸洗脱，收集醋酸型成骨生长肽溶液，减压浓缩与冷冻干燥得到成骨生长肽；
其中，所述反相聚合物柱是填料为F型SBC MCI GEI反相色谱填料的反相聚合物柱；所述弱阴离子交换柱是填料为DEAE高流速琼脂糖微球的弱阴离子交换柱；所述酸性流动相由流动相A和流动相B组成；流动相A是三氟乙酸-水溶液，流动相B是三氟乙酸-甲醇溶液。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述成骨生长肽粗品水溶液通过将成骨生长肽粗品溶解于水，超声分散，用滤膜过滤并收集滤液来制备。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，成骨生长肽粗品与水的比率是(0.3g～5g):(5ml～100ml)。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述F型SBC MCI GEI反相色谱填料的粒径是30～50μm。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述DEAE高流速琼脂糖微球的粒径是50～160μm。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，流动相A是0.1mol/L三氟乙酸-水溶液，流动相B是0.1mol/L三氟乙酸-甲醇溶液。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酸性流动相梯度选择0到15分钟流动相A:流动相B由(90～95):(10～5)到(85～80):(15～20)，15到65分钟流动相A:流动相B由(85～80):(15～20)到(70～65):(30～35)。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)得到的浓缩液中成骨生长肽的含量是30～50mg/ml。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述酸性流动相的流速是4ml/min，所述醋酸的流速是4ml/min。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，上样和洗脱时的柱温为35-45℃。
11.根据权利要求10所述的纯化方法，其特征在于，上样和洗脱时的柱温为40℃。
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