CN101584853B - 一种地龙蛋白多肽制剂 - Google Patents
一种地龙蛋白多肽制剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101584853B CN101584853B CN2009100334995A CN200910033499A CN101584853B CN 101584853 B CN101584853 B CN 101584853B CN 2009100334995 A CN2009100334995 A CN 2009100334995A CN 200910033499 A CN200910033499 A CN 200910033499A CN 101584853 B CN101584853 B CN 101584853B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pheretima
- concentration
- protein polypeptide
- minutes
- add
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种地龙蛋白多肽制剂及其制备方法和应用，该制剂通过对地龙匀浆粗提液进行酶水解得到水解的蛋白多肽，或者把地龙匀浆粗提液先通过酶水解得到水解的蛋白多肽，水解产物再通过采用不同孔径的超滤膜分离，得到不同分子量的蛋白多肽类成分。实验表明本发明提供的地龙蛋白多肽制剂经酶水解后具有更好的抑制血管紧张素转换酶的作用，能够有效地防治高血压，并且本发明提供的地龙蛋白多肽制剂的制备方法，可操作性强，效率高，可实现工业化大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白多肽制剂，具体是涉及一种地龙蛋白多肽制剂，及其制备方法和其在防治高血压疾病中应用
背景技术
地龙，性寒味咸，具清热熄风、平喘、通络、利尿之功，用于高热神昏，关节痹通、肢体麻木，肺热喘咳，高血压等症，药理研究发现，它不但抗凝、抑制血小板聚集、抗心律失常、而且还有抗癌和镇痛的作用，地龙匀浆得到的粗提物成分复杂，分子量在12000至80000D范围内，除了上述大分子外，地龙还含有一些小分子，如地龙素、地龙解热碱，核酸衍生物及维生素和无机盐等，目前地龙的临床用药主要是地龙匀浆得到的粗提物。
现有技术中分离地龙中蛋白类成分成分，通常采用匀浆液进行盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析等生化分离手段，虽然具有一定的可行性，但步骤繁杂，实验条件要求高，不适合大规模生产，且与中医辨证用药大相径庭。
蛋白多肽类成分是地龙的主要有效成分，由于蛋白多肽类成分性质不稳定，对环境要求较高，酸、碱、离子强度、温度或光照对其活性均会产生影响，因而传统的以水煎入药，影响了其药效的发挥。
发明内容：
发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种抗高血压效果好的地龙蛋白多肽制剂，本发明另一个目的是提供该地龙蛋白多肽制剂的制备方法和其在防治高血压疾病中应用。
技术方案：为了实现以上目的，本发明提供的地龙蛋白多肽制剂，它由以下方法制备得到：
①取地龙，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到的地龙上清液，加入浓度为200至250U/mg的胰蛋白酶，浓度为800至1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为20至30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％至5％，然后加入氢氧化钠调pH值至7.8至8.0，在45至50℃水浴酶解1至6小时；
③取步骤②得到的酶解液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
本发明提供的地龙蛋白多肽制剂，其中步骤①加入的蒸馏水为二次蒸馏，加入量为药材量的3倍，匀浆时间为10分钟，4℃下以11000r/min离心20分钟。
作为优选方案，其中步骤②加入浓度为200U/mg的胰蛋白酶、浓度为1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时。
本发明提供的以上地龙蛋白多肽制剂的制备方法包括以下步骤：
①取地龙，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到的地龙上清液，加入浓度为200至250U/mg的胰蛋白酶，浓度为800至1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为20至30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％至5％，然后加入氢氧化钠调pH值至7.8至8.0，在45至50℃水浴酶解1至6小时；
③取步骤②得到的酶解液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
作为优选方案，以上制备方法中步骤①加入的蒸馏水为二次蒸馏，加入量为药材量的3倍，匀浆时间为10分钟，4℃下以11000r/min离心20分钟。其中步骤②加入浓度为200U/mg的胰蛋白酶、浓度为1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时。
本发明提供的另一种地龙蛋白多肽制剂，它由以下方法制备得到：
①取地龙，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到地龙上清液，加入浓度为200至250U/mg的胰蛋白酶、浓度为800至1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为20至30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％至5％，然后加入氢氧化钠调pH值至7.8至8.0，以45至50℃水浴酶解1至6小时；
③取步骤②得到的酶解液，在酶解液温度为30至50℃、操作压力为0.25至0.5MPa、表面转速为200至300r/min的条件下，依次用孔径为五万、三万、一万和四千的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到五万、三万、一万和四千孔径超滤膜的截留液和滤过液；
④取步骤③得到的一万孔径的超滤膜滤过液或四千孔径的超滤膜滤过液或截留液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
本发明提供的另一种地龙蛋白多肽制剂，作为优选方案，步骤①加入3倍量的二次蒸馏水，匀浆10分钟，在4℃下以11000r/min离心20分钟，步骤②加入浓度为200U/mg的胰蛋白酶、浓度为1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时，步骤③超滤膜过滤的操作条件为：酶解液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min。
本发明提供的另一种地龙蛋白多肽制剂的制备方法，包括以下步骤：
①取地龙，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到地龙上清液，加入浓度为200至250U/mg的胰蛋白酶、浓度为800至1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为20至30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％至5％，然后加入氢氧化钠调pH值至7.8至8.0，以45至50℃水浴酶解1至6小时；
③取步骤②得到的酶解液，在酶解液温度为30至50℃、操作压力为0.25至0.5MPa、表面转速为200至300r/min的条件下，依次用孔径为五万、三万、一万和四千的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到五万、三万、一万和四千孔径超滤膜的截留液和滤过液；
④取步骤③得到的一万孔径的超滤膜滤过液或四千孔径的超滤膜滤过液或截留液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
作为优选方案，以上制备方法，其中步骤①加入3倍量的二次蒸馏水，匀浆10分钟，在4℃下以11000r/min离心20分钟。步骤②加入浓度为250U/mg的胰蛋白酶、浓度为1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时。步骤③超滤膜过滤的操作条件为：酶解液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min。
本发明提供的地龙蛋白多肽制剂可以用于防治高血压疾病治疗中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明提供的地龙蛋白多肽制剂的优点有：
1、本发明提供的地龙蛋白多肽制剂，地龙主要活性成分蛋白多肽经过酶水解后，经实验表明，其抑制血管紧张素转换酶(ACE)活性增强，能有效抑制血管紧张素I转变为具有升高血压作用的物质血管紧张素II，从而达到降压的作用。
2、本发明提供的地龙蛋白多肽制剂，地龙匀浆粗提体物通过酶水解得到水解产物，水解产物再经过不同孔径超滤膜过滤，分离得到不同分子量蛋白多肽，其成分更清楚，活性成分浓度更高，经实验表明，通过孔径为四千超滤膜过滤得到的滤过液其抑制血管紧张素转换酶(ACE)活性最强，能更有效地抑制血管紧张素I转变为具有升高血压作用的物质血管紧张素II，从而达到更好的降压的作用。
3、本发明提供的地龙蛋白多肽制剂的制备方法，采用酶水解的方法把蛋白多肽水解，能有效提高地龙匀浆粗体物的降压作用，并且本发明还采用膜分离技术对水解后的地龙蛋白多肽类活性成分进行分离，采用本发明提供的膜分离技术，通过不同孔径的膜截留得到不同分子量值的蛋白多肽成分，从而将活性蛋白多肽物质进行分离提纯，在膜分离过程中活性物质不发生相变，分离系数较大，可在常温下进行，无需添加其它酸、碱、盐试剂，可操作性强、较传统的分离纯化方法分离效率更高、更方便。
附图说明
图1是标准品马尿酸的峰面积对浓度的标准曲线图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1地龙蛋白多肽制剂的制备
①取地龙100g，加入500ml的二次蒸馏水，匀浆30分钟，在4℃下，以15000r/min离心30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到的地龙上清液60ml(含蛋白约74.4mg)，加入浓度为250U/mg的胰蛋白酶0.7mg，浓度为1000U/mg的糜蛋白酶0.7mg和浓度为30U/mg的弹性蛋白酶0.7mg，使混合酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，在50℃水浴酶解5小时；
③取步骤②得到的酶解液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
本发明得到的地龙蛋白多肽酶解液和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊、软膏剂剂型的药物，做成片剂或胶囊剂时加入乳糖和淀粉，必要时加入润滑剂硬脂酸镁，整粒、干燥、制成颗粒剂或压片制成片剂或装胶囊制成胶囊剂；或装微囊做成微囊剂；做成软膏剂时加入吐温、蜂蜡或聚乙二醇，混匀，制成软膏剂。
实施例2地龙蛋白多肽制剂的制备
①取地龙100g，加入300ml的二次蒸馏水，匀浆10分钟，在4℃下，以11000r/min离心20分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到的地龙上清液60ml(含蛋白约74.4mg)，加入浓度为200U/mg的胰蛋白酶1.5mg，浓度为800U/mg的糜蛋白酶1mg和浓度为20U/mg的弹性蛋白酶1.2mg，使混合酶的重量百分比达到5％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，在50℃水浴酶解2小时；
③取步骤②得到的酶解液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
本发明得到的地龙蛋白多肽酶解液和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊、软膏剂剂型的药物，做成片剂或胶囊剂时加入乳糖和淀粉，必要时加入润滑剂硬脂酸镁，整粒、干燥、制成颗粒剂或压片制成片剂或装胶囊制成胶囊剂；或装微囊做成微囊剂；做成软膏剂时加入吐温、蜂蜡或聚乙二醇，混匀，制成软膏剂。
实施例3地龙蛋白多肽制剂的制备
①取地龙100g加入300ml的蒸馏水，匀浆20分钟，在4℃下以12000r/min离心30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到的地龙上清液100ml(含蛋白约92.5克)，加入浓度为250U/mg的胰蛋白酶0.9mg，浓度为1000U/mg的糜蛋白酶0.9mg和浓度为30U/mg的弹性蛋白酶0.9mg，使混合酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时；
③取步骤②得到的酶解液100ml，在酶解液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min的条件下，依次用孔径为五万、三万、一万和四千的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到五万、三万、一万和四千孔径超滤膜的截留液和滤过液；
④取步骤③得到的四千孔径的超滤膜滤过液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
本发明得到的地龙蛋白多肽酶解液和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊、软膏剂剂型的药物，做成片剂或胶囊剂时加入乳糖和淀粉，必要时加入润滑剂硬脂酸镁，整粒、干燥、制成颗粒剂或压片制成片剂或装胶囊制成胶囊剂；或装微囊做成微囊剂；做成软膏剂时加入吐温、蜂蜡或聚乙二醇，混匀，制成软膏剂。
实施例4地龙蛋白多肽制剂的制备
①取地龙100g加入300ml的蒸馏水，匀浆20分钟，在4℃下以12000r/min离心30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到的地龙上清液100ml(含蛋白约92.5克)，加入浓度为250U/mg的胰蛋白酶0.9mg，浓度为1000U/mg的糜蛋白酶0.9mg和浓度为30U/mg的弹性蛋白酶0.9mg，使混合酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时；
③取步骤②得到的酶解液100ml，在酶解液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min的条件下，依次用孔径为五万、三万、一万和四千的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到五万、三万、一万和四千孔径超滤膜的截留液和滤过液；
④取步骤③得到的四千孔径的超滤膜截留液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
本发明得到的地龙蛋白多肽酶解液和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊、软膏剂剂型的药物，做成片剂或胶囊剂时加入乳糖和淀粉，必要时加入润滑剂硬脂酸镁，整粒、干燥、制成颗粒剂或压片制成片剂或装胶囊制成胶囊剂；或装微囊做成微囊剂；做成软膏剂时加入吐温、蜂蜡或聚乙二醇，混匀，制成软膏剂。
实施例5地龙蛋白多肽制剂的制备
①取地龙100g加入300ml的蒸馏水，匀浆20分钟，在4℃下以12000r/min离心30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到的地龙上清液100ml(含蛋白约92.5克)，加入浓度为250U/mg的胰蛋白酶0.9mg，浓度为1000U/mg的糜蛋白酶0.9mg和浓度为30U/mg的弹性蛋白酶0.9mg，使混合酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时；
③取步骤②得到的酶解液100ml，在酶解液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min的条件下，依次用孔径为五万、三万、一万和四千的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到五万、三万、一万和四千孔径超滤膜的截留液和滤过液；
④取步骤③得到的一万孔径的超滤膜滤过液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
本发明得到的地龙蛋白多肽酶解液和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊、软膏剂剂型的药物，做成片剂或胶囊剂时加入乳糖和淀粉，必要时加入润滑剂硬脂酸镁，整粒、干燥、制成颗粒剂或压片制成片剂或装胶囊制成胶囊剂；或装微囊做成微囊剂；做成软膏剂时加入吐温、蜂蜡或聚乙二醇，混匀，制成软膏剂。
实施例6地龙蛋白多肽制剂的制备
①取地龙100g加入300ml的蒸馏水，匀浆20分钟，在4℃下以12000r/min离心30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到的地龙上清液100ml(含蛋白约92.5克)，加入浓度为200U/mg的胰蛋白酶1.5mg，浓度为800U/mg的糜蛋白酶1.2mg和浓度为20U/mg的弹性蛋白酶2mg，使混合酶的重量百分比达到5％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时；
③取步骤②得到的酶解液100ml，在酶解液温度为30℃、操作压力为0.5MPa、表面转速为300r/min的条件下，依次用孔径为五万、三万、一万和四千的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到五万、三万、一万和四千孔径超滤膜的截留液和滤过液；
④取步骤③得到的一万孔径的超滤膜滤过液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
本发明得到的地龙蛋白多肽酶解液和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊、软膏剂剂型的药物，做成片剂或胶囊剂时加入乳糖和淀粉，必要时加入润滑剂硬脂酸镁，整粒、干燥、制成颗粒剂或压片制成片剂或装胶囊制成胶囊剂；或装微囊做成微囊剂；做成软膏剂时加入吐温、蜂蜡或聚乙二醇，混匀，制成软膏剂。
实施例7地龙蛋白多肽抑制血管紧张素转换酶(ACE)的实验研究
血管紧张素转换酶(ACE)在调节体内血压中发挥着重要作用。ACE能催化血管紧张素I转变为具有升高血压作用的物质血管紧张素II，同时ACE将具有降压作用的物质舒缓激肽降解，使之失去降压作用。地龙中含有的蛋白多肽对ACE的亲合度比血管紧张素肽I或舒缓激肽还要强，而且也较不易从ACE结合区释放，从而阻碍ACE催化血管紧张素I水解成为血管紧张素II，以及催化舒缓激肽水解成为失活片段的2种生化反应过程，起降血压作用。
地龙蛋白多肽的活性检测体系中，主要包括体外检测(ACE抑制活性检测)和体内检测(动物试验检测)。本研究采用高效液相色谱直接定量快速测定地龙中具有降血压作用的蛋白多肽对ACE抑制活性。马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)在ACE的催化下快速地分解产生马尿酸和二肽，当加入ACE抑制剂时，ACE活性受到抑制，马尿酰组氨酰亮氨酸分解降低，马尿酸和二肽的生成量减少，因此可通过测定马尿酸的生成量来评价降血压肽对ACE的抑制活性。
1、高效液相色谱条件
色谱柱：Symmetry C18分析型色谱柱，检测波长：228nm；流速：0.8mL/min；流动相A：水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：乙睛含0.05％三氟乙酸)；进样量：6μL，自动进样；柱温：25℃；梯度洗脱条件：10％～60％B(10min)；60％～10％B(2min)。
2、实验方法
2.1试剂的配置
ACE溶液：取1U ACE溶于10mL 0.1mol/L硼酸缓冲液(pH8.3)。
马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)溶液：取HHL适量，以0.1mol/L硼酸缓冲液(pH8.3)硼酸缓冲液溶解配成5mmol/LHHL溶液。
马尿酸标准液的制备：取马尿酸标准品适量，用去离子水配制不同浓度的马尿酸标准液。
2.2实验步骤
取120μL HHL底物液，加入20μL抑制剂混合均匀，在(37±0.5)℃恒温水浴中预热3～5min，然后加入10μL ACE液充分混合，37℃保温60min后，再加入150μL的1mol/L HCl终止反应，得到反应液。该反应液用0.45μm滤膜过滤后直接在HPLC系统自动进样分析。同时用10μL pH值为8.3的硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组。ACE抑制活性计算公式如下：
式中：M为空白对照组中马尿酸的峰面积(mAU·s)；N为添加抑制剂组中马尿酸的峰面积(mAU·s)。
3、实验结果
3.1将标准马尿酸溶液按照最佳色谱分离条件，在高效液相色谱系统上样分析，分析后结果见表1和图1。
表1标准马尿酸溶液保留时间和峰面积表
3.2地龙匀浆液酶解前后和酶解后过膜所得的地龙蛋白多肽对ACE抑制活性测定结果
用上表峰面积对浓度做回归方程为：Y＝28879X+17116，通过标准曲线计算加入抑制剂前后马尿酸峰面积(或含量)的变化量可间接地测定抑制剂的ACE抑制活性，具体实验结果如表2所示。
表2不同样品ACE抑制活性(n＝3)
对水解前后的结果进行比较发现，水解后匀浆液产物的抑制率得到提高，水解液中大分子地龙蛋白多肽被水解成小分子量的蛋白多肽，因此分子量在5万以上的蛋白多肽其ACE抑制活性只有28.4％，分子量在3万以上的蛋白多肽其ACE抑制活性只有56.3％，分子量在1万以上的蛋白多肽，其ACE抑制活性为66.5％，与水解前相比均有所下降，而分子量在4千以上1万以下的蛋白多肽，其ACE抑制活性达到了76.6％，分子量在4千以下的蛋白多肽，其ACE抑制活性达到了80.2％，均高于未水解产物。由以上结果得出地龙蛋白多肽经酶水解后其ACE抑制活性明显增强，说明酶解有利于提高地龙蛋白产物的ACE抑制活性，特别是水解后通过孔径为4千的膜过滤液，其对ACE抑制活性达到了80.2％。
因此，本发明提供的地龙蛋白多肽制剂能很好的抑制血管紧张素转换酶(ACE)的活性，有望开发成为新一代的防治高血压的制剂。
Claims (9)
1.一种地龙蛋白多肽制剂，其特征在于，它由以下方法制备得到：
①取地龙，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到的地龙上清液，加入浓度为200至250U/mg的胰蛋白酶，浓度为800至1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为20至30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％至5％，然后加入氢氧化钠调pH值至7.8至8.0，在45至50℃水浴酶解1至6小时；
③取步骤②得到的酶解液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
2.根据权利要求1所述的地龙蛋白多肽制剂，其特征在于，步骤①加入3倍量的二次蒸馏水，匀浆10分钟，在4℃下以11000r/min离心20分钟，步骤②加入浓度为200U/mg的胰蛋白酶、浓度为1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时。
3.一种地龙蛋白多肽制剂，其特征在于，它由以下方法制备得到：
①取地龙，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到地龙上清液，加入浓度为200至250U/mg的胰蛋白酶、浓度为800至1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为20至30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％至5％，然后加入氢氧化钠调pH值至7.8至8.0，以45至50℃水浴酶解1至6小时；
③取步骤②得到的酶解液，在酶解液温度为30至50℃、操作压力为0.25至0.5MPa、表面转速为200至300r/min的条件下，依次用孔径为五万、三万、一万和四千的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到五万、三万、一万和四千孔径超滤膜的截留液和滤过液；
④取步骤③得到的一万孔径的超滤膜滤过液或四千孔径的超滤膜滤过液或截留液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
4.根据权利要求3所述的地龙蛋白多肽制剂，其特征在于，步骤①加入3倍量的二次蒸馏水，匀浆10分钟，在4℃下以11000r/min离心20分钟，步骤②加入浓度为200U/mg的胰蛋白酶、浓度为1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时，步骤③超滤膜过滤的操作条件为：酶解液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min。
5.一种制备权利要求1所述的地龙蛋白多肽制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
①取地龙，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到的地龙上清液，加入浓度为200至250U/mg的胰蛋白酶，浓度为800至1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为20至30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％至5％，然后加入氢氧化钠调pH值至7.8至8.0，在45至50℃水浴酶解1至6小时；
③取步骤②得到的酶解液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
6.根据权利要求5所述的地龙蛋白多肽制剂的制备方法，其特征在于，步骤①中加入3倍量的二次蒸馏水，匀浆时间为10分钟，在4℃下以11000r/min离心20分钟，步骤②加入浓度为200至250U/mg的胰蛋白酶、浓度为800至1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为20至30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时。
7.一种制备权利要求3所述的地龙蛋白多肽制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
①取地龙，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的地龙上清液，备用；
②取步骤①得到地龙上清液，加入浓度为200至250U/mg的胰蛋白酶、浓度为800至1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为20至30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％至5％，然后加入氢氧化钠调pH值至7.8至8.0，以45至50℃水浴酶解1至6小时；
③取步骤②得到的酶解液，在酶解液温度为30至50℃、操作压力为0.25至0.5MPa、表面转速为200至300r/min的条件下，依次用孔径为五万、三万、一万和四千的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到五万、三万、一万和四千孔径超滤膜的截留液和滤过液；
④取步骤③得到的一万孔径的超滤膜滤过液或四千孔径的超滤膜滤过液或截留液和药学上可接受的载体制备得到地龙蛋白多肽制剂。
8.根据权利要求7所述的一种制备地龙蛋白多肽制剂的方法，其特征在于，步骤②加入浓度为250U/mg的胰蛋白酶、浓度为1000U/mg的糜蛋白酶和浓度为30U/mg的弹性蛋白酶，使酶的重量百分比达到3％，然后加入氢氧化钠调pH值至8.0，以50℃水浴酶解5小时。
9.根据权利要求7或8所述的一种制备地龙蛋白多肽制剂的方法，其特征在于，步骤③超滤膜过滤的操作条件为：酶解液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100334995A CN101584853B (zh) | 2009-06-15 | 2009-06-15 | 一种地龙蛋白多肽制剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100334995A CN101584853B (zh) | 2009-06-15 | 2009-06-15 | 一种地龙蛋白多肽制剂 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101584853A CN101584853A (zh) | 2009-11-25 |
| CN101584853B true CN101584853B (zh) | 2012-12-19 |
Family
ID=41369422
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009100334995A Expired - Fee Related CN101584853B (zh) | 2009-06-15 | 2009-06-15 | 一种地龙蛋白多肽制剂 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101584853B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102389442B (zh) * | 2011-11-23 | 2013-03-13 | 南京中医药大学 | 一种具有抗血栓作用的地龙提取物 |
| CN102578362B (zh) * | 2012-03-28 | 2013-06-26 | 常熟市汇康食品厂 | 一种蚯蚓复合蛋白粉 |
| CN102920738B (zh) * | 2012-12-04 | 2014-04-09 | 周维官 | 一种活性地龙蛋白的生产方法 |
| CN103845272B (zh) * | 2014-03-14 | 2017-06-30 | 江苏隆力奇生物科技股份有限公司 | 具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物及其制备方法和应用 |
| CN106722934B (zh) * | 2016-11-25 | 2020-10-30 | 济南睿呋康生物科技有限公司 | 一种含地龙、沙蚕含肽提取物的抗衰保健食品 |
| CN107974478A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-05-01 | 海盐县凌特生物科技有限公司 | 一种地龙蛋白多肽的制备方法 |
| CN107641638A (zh) * | 2017-11-08 | 2018-01-30 | 安徽生物肽产业研究院有限公司 | 一种由地龙蛋白制备的富有机微量元素地龙肽的工业生产方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2716472B2 (ja) * | 1987-09-17 | 1998-02-18 | 恒 美原 | 新規なプロテアーゼ製剤 |
| CN1566356A (zh) * | 2003-06-20 | 2005-01-19 | 陈训高 | 蚯蚓活性肽和蚯蚓生物微肥的制备方法及其用途 |
| CN1651079A (zh) * | 2004-12-23 | 2005-08-10 | 吴梅春 | 一种疏血通冻干粉针制剂及其制备方法 |
-
2009
- 2009-06-15 CN CN2009100334995A patent/CN101584853B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2716472B2 (ja) * | 1987-09-17 | 1998-02-18 | 恒 美原 | 新規なプロテアーゼ製剤 |
| CN1566356A (zh) * | 2003-06-20 | 2005-01-19 | 陈训高 | 蚯蚓活性肽和蚯蚓生物微肥的制备方法及其用途 |
| CN1651079A (zh) * | 2004-12-23 | 2005-08-10 | 吴梅春 | 一种疏血通冻干粉针制剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 樊文玲等.超滤膜分离地龙匀浆液中蛋白物质的操作条件优化研究.《中成药》.2007,第29卷(第11期),1598-1601. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101584853A (zh) | 2009-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101584853B (zh) | 一种地龙蛋白多肽制剂 | |
| CN104004806B (zh) | 一种具有抗凝血与溶血栓地龙多肽及其酶解制备方法与应用 | |
| CN109400678A (zh) | 一种刺参来源的抗氧化和dpp-iv抑制活性肽 | |
| CN107779489B (zh) | 一种具有抗氧化和ace抑制功能的蚕蛹蛋白肽 | |
| CN103539831B (zh) | 山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途 | |
| CN101117642B (zh) | 一种可降血压的多肽及其制备方法 | |
| CN109320588A (zh) | 一种刺参来源的ace抑制活性肽 | |
| CN110105431B (zh) | 一种芝麻多肽及其提取方法和在制备抗氧化和/或降血压药物中的应用 | |
| NO146818B (no) | Fremgangsmaate for aa danne kanaler med hoey fluidumledningsevne i en formasjon rundt et borehull | |
| CN106008669B (zh) | 一种榛仁ace抑制肽及其制备方法 | |
| CN103539833A (zh) | 高活性α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途 | |
| CN104163850B (zh) | 一种小分子抗体亲和肽及其应用 | |
| CN103740797B (zh) | 一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法 | |
| CN101456898B (zh) | 一种使用氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法 | |
| CN116589533A (zh) | 南极磷虾小分子活性肽及其制备方法和应用 | |
| CN103965291A (zh) | 奥曲肽、奥曲肽醋酸盐的制备方法 | |
| CN111825754B (zh) | 一种从芝麻蛋白中获得的具有降血压与降血糖活性的多肽 | |
| CN110734475A (zh) | 一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽及其应用 | |
| CN113493489B (zh) | 具有醒酒功能的多肽scgh及其用途 | |
| CN101628930A (zh) | 一种三羟甲基氨基甲烷配基琼脂糖介质分离多肽的方法 | |
| CN101590219A (zh) | 一种红地龙精制蛋白多肽制剂 | |
| CN108048518A (zh) | 鸡血球抗氧化肽及其酶解制备方法 | |
| KR101682093B1 (ko) | 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 혈압강하용 조성물 | |
| CN111920059A (zh) | 一种大豆ace抑制肽及其制备方法和应用 | |
| CN117567562B (zh) | 南极磷虾ace抑制肽及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121219 Termination date: 20150615 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |