CN101590219A - 一种红地龙精制蛋白多肽制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红地龙精制蛋白多肽制剂及其制备方法和应用，该制剂通过采用不同孔径的超滤膜分离技术对红地龙蛋白多肽类活性成分进行分离，其主要活性成分为分子量在十万以下五万以上的蛋白类成分，药理实验表明本发明提供的红地龙精制蛋白多肽制剂是一种具有很好溶解纤维蛋白，能有效的预防和治疗血栓、且无副作用的制剂。本发明提供的红地龙精制蛋白多肽制剂超滤膜分离的制备方法，在膜分离过程中活性物质不发生相变，分离系数较大，可在常温下进行，无需添加其它酸、碱、盐试剂，可操作性强、较传统的分离纯化方法分离效率更高。

Description

一种红地龙精制蛋白多肽制剂

技术领域

本发明涉及一种蛋白多肽制剂，具体是涉及一种红地龙精制蛋白多肽制剂，及其制备方法和其在防治血栓疾病中应用

背景技术

地龙，性寒味咸，具清热熄风、平喘、通络、利尿之功，用于高热神昏，关节痹通、肢体麻木，肺热喘咳，高血压等症，药理研究发现，它不但抗凝、抑制血小板聚集、抗心律失常、而且还有抗癌和镇痛的作用，这些功效表明其药效物质基础组成复杂，如抗凝成分，多为水溶性物质，分子量在12000至80000D范围内，除了上述大分子外，红地龙还含有一些小分子，如红地龙素、红地龙解热碱，核酸衍生物及维生素和无机盐等。目前红地龙的临床用药主要是红地龙匀浆得到的粗提物，用于治疗血栓，其粗提物中包括了分子量从几千到几万的各种组分，成分复杂，由于不同的组分的溶栓活性不同，而且红地龙中兼有抑制和促进血小板聚集的成分，因此一定程度上影响了其溶栓疗效。

现有技术中分离红地龙中蛋白类成分成分，通常采用匀浆液进行盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析等生化分离手段，虽然具有一定的可行性，但步骤繁杂，实验条件要求高，不适合大规模生产，且与中医辨证用药大相径庭。

蛋白多肽类成分是红地龙的主要有效成分，由于蛋白多肽类成分性质不稳定，对环境要求较高，酸、碱、离子强度、温度或光照对其活性均会产生影响，因而传统的以水煎入药，影响了其药效的发挥。

发明内容：

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种抗血栓效果好的红地龙精制蛋白多肽制剂，本发明另一个目的是提供该红地龙精制蛋白多肽制剂的制备方法和其在防治血栓疾病中应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明提供的红地龙精制蛋白多肽制剂，它由以下方法制备得到：

①取红地龙，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的红地龙上清液，备用；

②取步骤①得到的红地龙上清液100ml，在匀浆上清液温度为30至50℃、操作压力为0.25至0.5MPa、表面转速为200至300r/min、匀浆液上清液的pH值为6至7的条件下，依次用孔径为十万、五万、一万的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到十万、五万、一万孔径超滤膜的截留液；

③取步骤②得到的五万孔径超滤膜截留液和药学上可接受的载体制备得到红地龙精制蛋白多肽制剂。

本发明提供的红地龙精制蛋白多肽制剂，其中步骤①加入的蒸馏水为二次蒸馏，加入量为药材量的3倍，匀浆时间为10分钟，4℃下以11000r/min离心20分钟。

本发明提供的红地龙精制蛋白多肽制剂，其中步骤②超滤膜过滤的操作条件为：匀浆上清液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min、匀浆液上清液的pH值为6.7。

本发明提供的红地龙精制蛋白多肽制剂的制备方法包括以下步骤：

①取红地龙药材，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下，以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的红地龙上清液，备用；

②取步骤①得到的红地龙上清液100ml，在匀浆上清液温度为30至50℃、操作压力为0.25至0.5MPa、表面转速为200至300r/min、匀浆液上清液的pH值为6至7的条件下，依次用孔径为十万、五万、一万的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到十万、五万、一万孔径超滤膜的截留液；

③取步骤②得到的五万孔径超滤膜截留液和药学上可接受的载体制备得到红地龙精制蛋白多肽制剂。

其中步骤①加入的蒸馏水为二次蒸馏，加入量为药材量的3倍，匀浆时间为10分钟，4℃下以11000r/min离心20分钟。

作为优选方案，其中步骤②超滤膜过滤的操作条件为：匀浆上清液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min、匀浆液上清液的pH值为6.7。

本发明提供的红地龙精制蛋白多肽制剂可以用于血栓疾病治疗中的应用。

有益效果：本发明提供的红地龙精制蛋白多肽制剂，成分清楚，主要活性成分为分子量在十万以下五万以上的蛋白类成分，药理实验表明本发明提供的红地龙精制蛋白多肽制剂是一种具有很好溶解纤维蛋白，能有效的预防和治疗血栓、且无副作用的制剂。

本发明提供的红地龙精制蛋白多肽制剂的制备方法，采用膜分离技术对红地龙蛋白多肽类活性成分进行分离，采用本发明提供的膜分离技术，通过不同孔径的膜截留得到不同分子量值的蛋白多肽成分，从而将活性蛋白多肽物质进行分离提纯，在膜分离过程中活性物质不发生相变，分离系数较大，可在常温下进行，无需添加其它酸、碱、盐试剂，可操作性强、较传统的分离纯化方法分离效率更高、更方便，适合于红地龙中不同分子量的蛋白多肽类成分及小分子成分的分离纯化。通过本发明提供的膜分离技术将红地龙成分按分子量大小进行切割分离，从而得到纤溶活性高无副作用的活性组分。

附图说明

图1是操作压力对红地龙匀浆液膜通量的影响规律图。

图2是表面转速对红地龙匀浆液膜通量的影响规律图。

图3是操作温度对红地龙匀浆液膜通量的影响规律图。

图4是pH值对红地龙匀浆液膜通量的影响规律图。

图5是匀浆液浓度对红地龙匀浆液膜通量的影响规律图。

图6是离子浓度对红地龙匀浆液膜通量的影响规律图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1红地龙精制蛋白多肽的制备

①取红地龙100g，加入500ml的二次蒸馏水，匀浆30分钟，在4℃下，以15000r/min离心30分钟，取离心后的红地龙上清液，备用；

②取步骤①得到的红地龙上清液100ml，在匀浆上清液温度为40℃、操作压力为0.5MPa、表面转速为300r/min、匀浆液上清液的pH值为6的条件下，依次用孔径为十万、五万、一万的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到十万、五万、一万孔径超滤膜的截留液；

③取步骤②得到的五万孔径超滤膜截留液和药学上可接受的载体制备得到红地龙精制蛋白多肽制剂。

其中本发明提供的五万孔径超滤膜截留液能和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊、软膏剂剂型的药物，做成片剂或胶囊剂时加入乳糖和淀粉，必要时加入润滑剂硬脂酸镁，整粒、干燥、制成颗粒剂或压片制成片剂或装胶囊制成胶囊剂；或装微囊做成微囊剂；做成软膏剂时加入吐温、蜂蜡或聚乙二醇，混匀，制成软膏剂。

实施例2红地龙精制蛋白多肽的制备

①取红地龙200g，加入800ml的二次蒸馏水，匀浆20分钟，在4℃下，以12000r/min离心25分钟，取离心后的红地龙上清液，备用；

②取步骤①得到的红地龙上清液100ml，在匀浆上清液温度为45℃、操作压力为0.3MPa、表面转速为250r/min、匀浆液上清液的pH值为7的条件下，依次用孔径为十万、五万、一万的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到十万、五万、一万孔径超滤膜的截留液；

③取步骤②得到的五万孔径超滤膜截留液和药学上可接受的载体制备得到红地龙精制蛋白多肽制剂。

其中本发明提供的五万孔径超滤膜截留液能和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊、软膏剂剂型的药物，做成片剂或胶囊剂时加入乳糖和淀粉，必要时加入润滑剂硬脂酸镁，整粒、干燥、制成颗粒剂或压片制成片剂或装胶囊制成胶囊剂；或装微囊做成微囊剂；做成软膏剂时加入吐温、蜂蜡或聚乙二醇，混匀，制成软膏剂。

实施例3红地龙活性成分超滤膜过滤的条件筛选

1、红地龙匀浆液的制备

取100g的红地龙，加入300ml的二次蒸馏水，分次匀浆50min，得匀浆液，经管式离心机(20000r/min)离心，取匀浆上清液，放置冰箱冷藏备用。

2、活性组分的制备

取离心后的红地龙匀浆液，采用孔径为100000，膜材料为聚偏氟乙烯(PVDF)的超滤膜进行过滤，得到活性组分。

3、操作条件对红地龙匀浆液的膜通量的影响

以膜通量为指标考察操作压力、操作温度、膜表面流体转速、匀浆液的酸度(pH值)、浓度和盐度在超滤膜分离蛋白混合物的过程中对膜通量的影响。

3.1操作压力对膜通量的影响

在匀浆液温度为20℃，表面流体转速控制在200r/min的条件下，在0.05MPa至0.3MPa范围内调节操作压力，来考察操作压力对红地龙匀浆液膜通量的影响，实验结果见图1。

由图1所示，红地龙匀浆液的膜通量随压力的增大先增加后减小。在0.25MPa和0.28MPa时，膜通量相同，且基本达到了峰值，原因可能在于：操作压力的方向垂直于膜表面，操作压力的增大一方面加快匀浆液中蛋白质等大分子物质的传质速度，另一方面加快被截留大分子在膜表面聚集的速度，从而加重浓差极化，降低透膜的速度，在0.25MPa之前，第一方面占优势，膜通量呈上升趋势，在0.25MPa时，两方面呈均衡，膜通量达到峰值，在0.25MPa之后，第二方面占优势，膜通量呈下降趋势，考虑到动力消耗问题，最佳膜操作压力为0.25MPa。

3.2表面转速对膜通量的影响

在匀浆液温度为20℃，操作压力为0.25MPa的条件下，在100r/min至400r/min范围内调节表面转速，研究表面转速对红地龙匀浆液膜通量的影响，实验结果见图2。

由图2看出红地龙匀浆液的膜通量随膜表面转速的增大呈现先增大后减小的趋势，峰值出现在200r/min左右，其为最佳转速。流动速率的影响可分两方面，一是横向流动速率，二是切向流动速率，其中横向流动速率的变化对溶质的传质系数影响不大，因而膜的通量也没改善；而切向流动速率加大会有效地增加传质系数，减慢浓差极化层的形成，减小膜阻，从而使通量增加。对于该SCM超滤杯系统，通过转子旋转的带动，红地龙匀浆液在膜表面形成一切向流动，从而提高了膜通量；但另一方面转子旋转速度达到一定程度，导致液体有一部分不能与膜表面接触，使膜的有效面积减小，所以存在这一最佳表面流速。

3.3操作温度对膜通量的影响

随红地龙匀浆液温度的升高，料液的粘度降低，加大了蛋白质等大分子在溶液中的运动，使其不易在膜表面吸附，在表面转速控制在200r/min，操作压力为0.25MPa的条件下，匀浆液温度在20℃至50℃范围内调节，来研究操作温度对红地龙匀浆液膜通量的影响，实验结果见图3。由图3看出红地龙匀浆液的膜通量随温度的提高而显著改善，一直呈上升趋势，但温度过高红地龙蛋白活性成分会变性，影响药效，因此，确定膜过滤的温度为50℃。

3.4pH值对膜通量的的影响

匀浆液的酸度影响红地龙中蛋白质等大分子所带的荷电值和电性，进而影响其在膜上的吸附量，在一定的pH值条件下，吸附量是蛋白质所带的电荷与膜表面的电荷相互作用的结果。在匀浆液温度为50℃，操作压力为0.25MPa，表面转速控制在200r/min的条件下，溶液的pH在1至10范围内调节，研究匀浆液的pH对红地龙匀浆液膜通量的影响，实验结果如图4所示。由图4可看到，在匀浆液的酸度调节的过程中，匀浆液的膜通量出现两个峰值：pH＝3和pH＝6.7(原匀浆液的酸度)；低谷出现在pH＝5，在pH＝5时，匀浆液的颜色开始变浅，出现白色物质，可能是有些蛋白质已达到等电点，从而析出，匀浆液的混浊度增加。在PH＝3时，匀浆液的颜色最浅，出现白色物质最多，同时匀浆液的混浊度最大，随着pH值的进一步减小，出现白色物质减少，匀浆液的混浊度降低。由于酸度过高或过低都会对蛋白多肽类成分活性产生影响，综合各方面，选择PH＝6.7做为过膜的匀浆液酸度。

3.5匀浆液浓度对膜通量的影响

用二次蒸馏水对匀浆液进行稀释1倍、2倍、3倍和4倍，并以原匀浆液在稀释后的液体中所占的百分数为其浓度，则对应稀释后的匀浆液的浓度分别为50％、33％、25％和20％，而未被稀释的则为100％。在操作温度为50℃，操作压力为0.25MPa，表面转速200r/min的条件下，研究匀浆液的浓度对红地龙匀浆液膜通量的影响，实验结果如图5所示。从图5可看出，膜通量随红地龙匀浆液的稀释倍数的增加而逐渐提高，但增加的快慢不一样，未稀释到稀释一倍期间通量增加比较缓慢，稀释1倍到稀释3倍的过程膜通量稳步增加，稀释3倍到稀释4倍期间膜通量增加速度较快，考虑工作效率，确定红地龙匀浆液的稀释倍数为2倍，即匀浆液的浓度为33％。

3.6离子浓度(盐浓度)对膜通量的影响

离子强度(盐浓度)的大小影响超滤过程中蛋白质在膜上的通量及截留。一般认为，盐的加入主要有两方面的作用：(1)屏蔽膜表面的电荷，(2)屏蔽蛋白质分子表面的电荷。然而，盐的加入并非是越多越好，当盐的浓度超过某一特定值以后，有可能屏蔽掉有利于蛋白质分离的有效电荷，反而引起膜通量的下降。原红地龙匀浆液的盐度在20℃时为1.87ppt，向其中加入一定量的NaCl，配制成NaCl浓度分别为0.001mol/L，0.025mol/L和0.05mol/L的三种匀浆液，在转速为200r/min，操作压力为0.25MPa，分别在操作温度为20℃和50℃的条件下考察盐的含量对匀浆液膜通量的影响规律，实验结果见图6。从图6可看出：在同一温度下，匀浆液的膜通量随NaCl含量的提高而略微降低，这表明NaCl的加入不能达到改善膜通量的目的。同一盐浓度下，20℃条件下的膜通量要高于50℃。因此，不需加入NaCl来调节匀浆液中的盐浓度。

通过以上膜分离操作条件的筛选实验得出膜分离红地龙的最佳操作条件为：操作压力为0.25MPa，匀浆温度为50℃，表面转速为200r/min，匀浆液的酸度PH＝6.7，匀浆液浓度为33.3％(w∶w)，不加NaCl。

实施例4聚偏氟乙烯膜孔径的筛选和膜分离组分的纤溶酶活性的测定

1、膜分离实验

取100g红地龙，加入300ml的二次蒸馏水，匀浆10min，在4℃下，以11000r/min离心20min，取100ml离心后的红地龙上清液，在匀浆上清液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min、匀浆液上清液的pH值为6.7的操作条件下，依次用孔径为十万、五万、一万的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到十万、五万、一万孔径超滤膜的截留液和滤过液，留待测定其溶栓活性。

2、纤溶酶活性的测定：

将培养皿放在水平仪上调至水平，用1倍pH7.2的PBS缓冲液配置1％的琼脂糖，取5mL于65℃恒温，另取等体积缓冲液5mL，在25℃恒温箱中保温，加入1/4支纤维蛋白原和10U凝血酶，两种溶液迅速混匀，趁热倒入平板中，将气泡赶至边缘，室温下凝固。用直径6mm的打孔器打孔，将待测样品点在孔内，37℃保温5h。测量乳白色琼脂糖上形成的透明圈互相垂直的两个直径，以其乘积作为纤溶活性的大小指标。

3、实验结果：

3.1尿激酶纤溶标准曲线的测定：

分别用20U、40U、60U、80U、100U的尿激酶点样，测定溶圈的两个互相垂直的直径，相乘后作为溶圈面积。结果如表1所示：

表1尿激酶纤溶活性测定结果

以上述数据作图，溶圈直径的乘积和尿激酶的浓度成正相关，说明本方法灵敏可靠，能通过比较溶圈直径的乘积来判定纤溶作用的强弱。

3.2不同孔径超滤膜分离红地龙所得样品的纤溶活性测定：

分别将不同孔径的超滤膜分离的样品点样在纤维蛋白平板孔中，测定溶圈的两个互相垂直的直径，相乘后作为溶圈面积，具体实验结果如表2所示：

表2红地龙分离样品的纤溶活性测定结果

从表2中可以看出，孔径为10万的超滤膜对有效成分的截留效果差，孔径为5万的超滤膜的截留液溶圈直径最大，基本将具纤溶活性的成分全部截留，其滤过液再通过孔径为1万的超滤膜后的截留液基本已无纤溶活性。

从以上实验结果可知，采用孔径为5万的超滤膜分离红地龙匀浆中的活性蛋白成分，具有最佳的溶栓活性，溶栓效果较普通的红地龙粗提取物高。

本发明提供的超滤膜分离红地龙匀浆中的活性蛋白多肽类成分，可在常温下进行，无需添加其它酸、碱、盐试剂，可操作性强、较传统的分离纯化方法分离效率更高、更方便。制备得到的红地龙蛋白浓度高，成分较清楚，并且具有很好的溶栓活性，有望开发成为新一代的抗血栓制剂。

Claims (7)

1、一种红地龙精制蛋白多肽制剂，其特征在于，它由以下方法制备得到：

①取红地龙，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的红地龙上清液，备用；

②取步骤①得到的红地龙上清液100ml，在匀浆上清液温度为30至50℃、操作压力为0.25至0.5MPa、表面转速为200至300r/min、匀浆液上清液的pH值为6至7的条件下，依次用孔径为十万、五万、一万的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到十万、五万、一万孔径超滤膜的截留液；

③取步骤②得到的五万孔径超滤膜截留液和药学上可接受的载体制备得到红地龙精制蛋白多肽制剂。

2、根据权利要求1所述的红地龙精制蛋白多肽制剂，其特征在于，步骤①加入3倍量的二次蒸馏水，匀浆10分钟，在4℃下以11000r/min离心20分钟。

3、根据权利要求1所述的红地龙精制蛋白多肽制剂，其特征在于，步骤②超滤膜过滤的操作条件为：匀浆上清液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min、匀浆液上清液的pH值为6.7。

4、一种制备权利要求1所述的红地龙精制蛋白多肽制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

①取红地龙药材，加入3至5倍量的蒸馏水，匀浆10至30分钟，在4℃下，以11000至15000r/min离心20至30分钟，取离心后的红地龙上清液，备用；

②取步骤①得到的红地龙上清液100ml，在匀浆上清液温度为30至50℃、操作压力为0.25至0.5MPa、表面转速为200至300r/min、匀浆液上清液的pH值为6至7的条件下，依次用孔径为十万、五万、一万的超滤膜进行分级过滤，当滤过液为80ml时，往截留液中加入10ml蒸馏水，继续超滤，至滤过液体积为100ml，分别得到十万、五万、一万孔径超滤膜的截留液；

③取步骤②得到的五万孔径超滤膜截留液和药学上可接受的载体制备得到红地龙精制蛋白多肽制剂。

5、根据权利要求4所述的红地龙精制蛋白多肽制剂的制备方法，其特征在于，步骤①中加入3倍量的二次蒸馏水，匀浆时间10分钟，在4℃下以11000r/min离心20分钟。

6、根据权利要求4所述的红地龙精制蛋白多肽制剂的制备方法，其特征在于，步骤②超滤膜过滤的操作条件为：匀浆上清液温度为50℃、操作压力为0.25MPa、表面转速为200r/min、匀浆液上清液的pH值为6.7。

7、权利要求1所述的红地龙精制蛋白多肽制剂在防治血栓疾病中应用。

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