CN104560924B - 一种鼠妇纤溶酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鼠妇纤溶酶及其应用，涉及制药领域。所述鼠妇纤溶酶，具有溶栓和抗凝活性，采用如下方法制备：（1）将鼠妇采用湿法超微粉碎，获得提取液；（2）从所述提取液中提取分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分；（3）对步骤（2）所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分采用硫酸铵沉淀法进行纯化，获得粗蛋白；（4）将所述粗蛋白经凝胶过滤层析和阴离子交换层析，取具有溶栓活性的洗脱液，得到鼠妇纤溶酶。本发明首次发现了鼠妇纤溶酶PSLTro01，同时具有较强的溶栓和抗凝的活性，溶栓作用相对温和，可以用于制备治疗血栓性疾病药物。

Description

一种鼠妇纤溶酶及其应用
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种鼠妇纤溶酶及其应用。
背景技术
血栓性疾病是一类发病率较高、严重危害人类健康的疾病，主要包括心肌梗死，中风，脑栓塞，肺血栓等。血栓性疾病在全球范围内呈现渐增之势。据统计，全球每年平均约有1200万人死于心脑血管病，占所有死亡人数的1/4，而这些死者80%在发展中国家。预计在2020年全球每年将有2500万人死于心脑血管疾病。在中国这一比例更为惊人，据2010年《中国卫生统计提要》数据，心脑血管疾病导致的死亡人数已超过全国总死亡人数的40%，高居我国居民死因的首位。每年全国心脑血管病死亡人数达260万人，心脑血管病的复发率也很高，五年内复发率高达42%，存活的患者75%致残，其中40%以上重残。
目前，根据血栓形成的机制, 抗栓药物主要分为抗血小板药物，抗凝药物和溶栓药物。其中溶栓药物是广泛应用于临床治疗血栓最有效的药物，如尿激酶，链激酶，组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)等。虽然这些溶栓药物大幅度降低了血栓性疾病的致死率和致残率，但是仍然具有较多的缺点，例如尿激酶虽然具有非常好的溶栓活性，但是抗凝活性较差，因此尿激酶仅能用于溶栓，不能用于预防血栓的形成。目前市场上很少有药物同时具有溶栓和抗凝作用。因此，寻找一种副作用小，避免再阻塞和再梗死的天然溶栓抗凝药物势在必行。
鼠妇为甲壳纲等足目鼠妇科动物鼠妇Porcellio scaber Latreille的干燥虫体，别名潮虫，地虱，西瓜虫，豌豆虫等，始载于《神农本草》，具有破血利水，解毒止痛之功效。鼠妇作为一味传统的虫类中药，临床应用较为广泛，可用于治疗中重度癌性疼痛，扁平疣，痔疮，百日咳等，现代研究表明鼠妇具有镇痛，抗炎，抗肿瘤的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种鼠妇纤溶酶，同时具有溶栓和抗凝活性。
本发明的另一目的是提供所述鼠妇纤溶酶在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
一种鼠妇纤溶酶，具有溶栓和抗凝活性，采用如下方法制备：
（1）将鼠妇采用湿法超微粉碎，获得提取液；
（2）从所述提取液中提取分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分；
（3）对步骤（2）所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分采用硫酸铵沉淀法进行纯化，获得粗蛋白；
（4）将所述粗蛋白经凝胶过滤层析和阴离子交换层析，取具有溶栓活性的洗脱液，得到鼠妇纤溶酶。
在本发明中，步骤（1）中将鼠妇用6~10倍质量的水浸泡0.5~2 h，然后加入超微粉碎机中进行湿法超微粉碎。
优选的技术方案中，所述湿法超微粉碎的温度为0-40℃，时间为5~30 min。
在本发明中，步骤（2）中将所述提取液采用截留分子量为80kDa~100kDa的中空纤维膜进行分离，取透过液，采用截留分子量为4kDa的中空纤维膜进行分离，取截留液，得到分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分。
在本发明中，步骤（3）中所述硫酸铵沉淀法具体为：在所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分中加入硫酸铵至饱和度为75-85%，静置后离心，取沉淀，得到粗蛋白。
优选的技术方案中，所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分中先加入硫酸铵至饱和度为35-65%，静置后离心，取上清液；然后在所述上清液中加入硫酸铵至饱和度为75-85%，静置后离心，取沉淀，得到粗蛋白。
最优选的技术方案中，所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分中先加入硫酸铵至饱和度为55-65%，静置后离心，取上清液；然后在所述上清液中加入硫酸铵至饱和度为75-85%，静置后离心，取沉淀，得到粗蛋白。
在本发明中，步骤（4）的具体方法为：所述粗蛋白依次经过Sephadex G-100凝胶过滤柱、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱、HiTrap Capto Q离子交换层析柱和Superose-12凝胶过滤柱，取具有溶栓活性的洗脱液，得到鼠妇纤溶酶。
在本发明中，所述鼠妇纤溶酶的分子量为37.5-38.5KDa，且自N端起第1-15位氨基酸残基的序列为：Asp – Ile – Asn – Gly – Gly – Gly – Ala – Thr – Leu – Pro –Gln – Pro – Leu – Tyr – Gln。本发明所述鼠妇纤溶酶，命名为PSLTro01。
本发明还提供所述鼠妇纤溶酶在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。
本发明首次发现了鼠妇纤溶酶PSLTro01，同时具有较强的溶栓和抗凝的活性。鼠妇纤溶酶PSLTro01的溶栓活性与尿激酶相比，0.1 mg·mL-1的鼠妇纤溶酶酶活力强于100U·mL-1尿激酶的纤溶活性。鼠妇纤溶酶PSLTro01的体外抗凝活性与肝素钠相比，浓度为20µg·mL-1活性鼠妇纤溶酶的TT、PT和APTT均长于1U·mL-1肝素钠，且APTT显著高于肝素钠，超过600s后仍未凝固。因此，本发明鼠妇纤溶酶不仅具有溶栓作用，同时还能预防血栓形成。鼠妇纤溶酶PSLTro01最适溶栓温度为40℃，最适溶栓pH为7.0；由于该鼠妇纤溶酶的最适溶栓温度、pH与人体温度和血液的pH相契合，因此可以在机体内发挥最大的溶栓活力。另外，本发明鼠妇纤溶酶并非是直接溶解纤维蛋白，而是通过激活纤溶酶原，使其转化为纤溶酶，进而溶解纤维蛋白，因此溶栓作用相对温和，用药后的出血倾向较低，可以降低了组织大出血的风险。
附图说明
图1 是Sephadex G-100凝胶过滤层析色谱图，其中纵坐标A280nm是指洗脱液在280nm处的吸光度，下同。
图2 是Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析色谱图。
图3 是HiTrap Capto Q离子交换柱层析色谱图。
图4 是Superose-12凝胶过滤层析色谱图。
图5 SDS-PAGE垂直电泳分析鼠妇纤溶酶的纯度及相对分子量，“还原”表示还原性SDS-PAGE垂直电泳，“非还原”表示非还原性SDS-PAGE垂直电泳。
图6 HPLC法对鼠妇纤溶酶纯度的分析。
图7 MALDI-TOF MS测定鼠妇纤维酶的分子量。
图8 显示鼠妇纤溶酶的最适反应温度。
图9 显示鼠妇纤溶酶的在不同温度下的稳定性。
图10显示鼠妇纤溶酶的最适反应pH。
图11 显示鼠妇纤溶酶在不同pH条件下的稳定性。
图12 显示了金属离子对鼠妇纤溶酶的影响。
图13 显示了酶抑制剂对鼠妇纤溶酶的影响图。
图14 显示阴、阳性平板中鼠妇纤溶酶的溶栓活性。
图15 显示鼠妇纤溶酶水解纤维蛋白原的过程，其中M表示蛋白分子量标准（Marker），5min、15min、30min、1h、4h、8h、16h、24h表示样品取样时间，C表示空白对照即不含鼠妇纤溶酶的纤维蛋白原。
图16 显示了鼠妇纤溶酶的溶栓活性。其中“a”对应的孔中加入浓度为0.1 mg•mL-1的鼠妇纤溶酶溶液，“b”对应的孔中加入了浓度为100 U•mL-1尿激酶溶液，“c”对应的孔中加入了浓度为50 U•mL-1溶液，“d”对应的孔中加入去离子水。
具体实施方式
实施本发明可以按如下实施例进行，但并不意味着对本发明范围的限制。
实施例1：鼠妇纤溶酶的制备
本发明鼠妇纤溶酶采用如下方法制备：
（1）湿法超微粉碎提取
称取一定量干燥鼠妇，加入鼠妇质量8倍、25℃的量蒸馏水浸泡1 h，放入超微粉碎机中在25℃条件下粉碎10 min。将得到的浆料在4 ℃条件下5000 r·min-1离心10 min，取上清液，即得提取液。
（2）采用中空纤维膜提取分子量为4kDa~80kDa的蛋白组分
将步骤（1）得到的提取液通过截留分子量为80kDa的PVDF（聚偏氟乙烯）中空纤维膜，操作压力为21.34 kPa ~21.56kPa，流速为8ml/min，取透过液。将该透过液通过截留分子量为4kDa的PES（聚醚砜）中空纤维膜，操作压力为74.21 kPa ~76.25kPa，流速为2.2ml·min-1，取截留液，得到分子量为4kDa~80kDa的蛋白组分。
（3）硫酸铵沉淀法提取
在步骤（2）所得截留液中加入 (NH4)2SO4饱和溶液至体系中硫酸铵的饱和度为60%，缓慢搅拌1h后，4℃静置2h，10000g离心10min，弃去杂蛋白沉淀；在上清液中继续加入(NH4)2SO4饱和溶液至体系中硫酸铵的饱和度为80%，缓慢搅拌1h后4℃静置2h，10000g离心10min，收集沉淀，得到粗蛋白。将粗蛋白复溶于20mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.2）缓冲液中，充分透析除盐后，透析液用Amicon® ultra-15（3K）超滤离心管浓缩。
（4）层析法获得鼠妇纤溶酶
①Sephadex G-100凝胶过滤层析：Sephadex G-100凝胶过滤柱用4个柱体积的洗脱缓冲液Ⅰ（pH 7.2、20 mmol·L-1的Tris-HCl缓冲液）平衡，流速为1.0 ml·min-1。取2ml经透析和浓缩后的粗蛋白溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤后缓慢加入到层析柱顶部进行凝胶层析法分离。用洗脱缓冲液Ⅰ进行洗脱，流速不变，每4mL为一管收集洗脱液，测定各管洗脱液在280nm处吸光度和纤溶活性（溶栓活性），将具有纤溶活性的洗脱液收集起来，用Amicon®ultra-15（3K）超滤离心管浓缩，得到活性蛋白提取物Ⅰ。
② Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析：Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱用4个柱体积的洗脱缓冲液Ⅰ（成分同上）平衡，流速为0.5 ml·min-1。将活性蛋白提取物Ⅰ缓慢加入到Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱顶部进行凝胶层析法分离。采用洗脱缓冲液Ⅰ以0.5ml·min-1进行洗脱，每3mL为一管收集洗脱液，测定各管洗脱液在280nm处吸光度和纤溶活性，将具有纤溶的洗脱液收集起来，用Amicon® ultra-15（3K）超滤离心管浓缩，得到活性蛋白提取物II。
③HiTrap Capto Q阴离子交换层析：HiTrap Capto Q阴离子交换层析柱用10个柱体积的平衡缓冲液Ⅲ（pH8.0、20 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液）进行平衡，平衡缓冲液Ⅲ的流速为1.0 ml·min-1。将活性蛋白提取物II缓慢加入到HiTrap Capto Q阴离子交换层析柱顶部，先用平衡缓冲液Ⅲ洗脱未吸附的蛋白，洗脱至基线后，采用平衡缓冲液Ⅲ和洗脱缓冲液Ⅲ（pH8.0，20m mol·L-1 Tris-HCl缓冲液中添加有终浓度为1 mol·L-1NaCl）进行阶段洗脱，第一阶段洗脱缓冲液Ⅲ的体积百分比为20%，第二阶段洗脱缓冲液Ⅲ的体积百分比为30%，第三阶段洗脱缓冲液Ⅲ的体积百分比为40%，第四阶段缓冲液Ⅲ的体积百分比为50%。阶段洗脱后再进行梯度洗脱，没有蛋白活性峰出现。洗脱过程中的流速保持1ml•min-1。每一阶段洗脱至洗脱峰结束时切换至下一阶段洗脱。每2mL为一管收集洗脱液。测定各管洗脱液在280nm处的吸光度和纤溶活性，将具有纤溶活性的洗脱液收集起来，用Amicon® ultra-15（3K）超滤离心管浓缩，得到活性蛋白提取物III。
④Superose-12凝胶过滤层析：Superose-12凝胶过滤柱用3个柱体积的洗脱缓冲液Ⅰ进行平衡，流速为1.0 ml·min-1；将活性蛋白提取物III缓慢加入到Superose-12凝胶过滤柱顶部进行凝胶层析法分离。用洗脱缓冲液Ⅰ进行洗脱，流速不变，每3mL为一管收集洗脱液，检测各管蛋白液在280nm处吸光度和溶栓活性，将具有溶栓活性的洗脱液收集起来，用Amicon® ultra-15 （3K）超滤离心管浓缩，之后用Zeba脱盐离心柱脱盐，冷冻干燥即得到鼠妇纤溶酶，将其命名为PSLTro01。
实施例2. 鼠妇纤溶酶PSLTro01的纯化结果
采用实施例1中方法纯化的结果如图1-4所示。其中Sephadex G-100凝胶过滤柱的分离范围为2 kDa-120 kDa，色谱图如图1所示，洗脱过程出现了一个大的洗脱峰和较长的肩峰，具有溶栓活性的蛋白先于其他组分流出色谱柱，提示具有溶栓活性的蛋白分子量可能大于10 kDa。图2显示了Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱的色谱图，出现2个主要的并列的峰，具有溶栓活性的蛋白主要集中在第2个洗脱峰的前段。在HiTrap Capto Q离子交换层析柱洗脱过程中，共有5个不同的蛋白洗脱峰，穿透峰、低盐洗脱（洗脱液中NaCl浓度为0.2mol·L-1和0.3 mol·L-1）及高盐洗脱（洗脱液中NaCl浓度为0.5 mol·L-1和1.0 mol·L-1NaCl）的得到峰组分均无溶栓活性，其活性检测结果显示具有溶栓活性的蛋白为第4个洗脱峰（洗脱液中NaCl浓度为0.4 mol·L-1）。在Superose-12凝胶过滤层析的色谱图（图4）中，只有一个明显的洗脱峰，该洗脱峰的组分也同时表现出了明显的溶栓活性。
纯化的具体结果见表1，本发明从蛋白量为1867.2 mg的提取液中分离纯化得到0.36 mg鼠妇纤溶酶PSLTro01，单位纤溶活力为1471.9 Uint·mg-1，回收率为6.7%，纯化倍数为342.3。
表1. 鼠妇纤溶酶的纯化结果
蛋白含量按照BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。
溶栓活性（纤溶活性）采用下述方法检测：
（1）纤维蛋白平板的制作：用20 mmol/mL的Tris-HCl缓冲液(pH7.8)分别配制5mg/mL牛血纤维蛋白原溶液、10 U/mL凝血酶溶液和1.0%的琼脂糖溶液。取琼脂糖溶液20 mL煮沸，冷却至50-60℃，向其中加入10 ml牛血纤维蛋白原溶液以及1mL凝血酶溶液，迅速摇匀，倒入直径为9 cm的培养皿中，室温静置使其充分凝固，并在其上打出若干直径约为2 mm的小孔。
(2)纤溶活性曲线的制作：将l0 µL浓度分别为0、10、20、40、60、80、100U·mL-1尿激酶标准品溶液点样于上述新配制的纤维蛋白平板上，37℃恒温培养18h后取出测定溶解圈直径并计算溶解圈面积。以尿激酶标准品溶液纤溶活力的对数为横坐标，以溶解圈面积的对数为纵坐标，绘制尿激酶纤溶标准曲线，其中标准曲线方程为y=0.1656x-0.0021 (R2=0.9943)。
（3）在纤维蛋白平板的小孔中加入l0 µL待测样品，放入37 ℃恒温培养箱中，18 h后观察纤维平板溶解圈变化，测量溶解圈直径，计算溶解圈面积。利用标准曲线方程和待测样品的溶解圈面积，计算待测样品的纤溶活力。
实施例3 鼠妇纤溶酶PSLTro01的纯度、相对分子质量及N-端氨基酸序列测定
1.纯度检测
（1）非还原性SDS-PAGE垂直电泳法纯度检测
非还原性SDS-PAGE垂直电泳中的分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为3.9%。取10µL实施例1制备的鼠妇纤溶酶PSLTro01和2µL的非还原性上样缓冲液（购自：碧云天生物技术研究所），充分混匀后，100℃煮沸5 min。在恒压80 V 条件下开始电泳，待溴酚蓝条带前沿进入分离胶后将电压调至120 V，直至溴酚蓝条带到达分离胶的底部，电泳结束后快速银染。如图5所示，非还原性SDS-PAGE电泳中仅显示单一的电泳条带，提示鼠妇纤溶酶已达到电泳纯。
（2）HPLC法纯度检测
采用Purospher® RP-18 endcapped (5μm) 色谱柱，流动相A为质量百分浓度为0.1%的TFA（三氟乙酸）水溶液，流动相 B 为质量百分浓度为0.1%的TFA乙腈溶液。洗脱梯度：0~5 min，流动相A等度洗脱；5~30 min，流动相A 100%～20%线性降低，流动相B 0～80%线性升高。洗脱过程中，流动相的流速为 1 mL·min-1，柱温30℃，检测波长254nm。结果如图6所示，在HPLC色谱图中有一个对称峰，峰面积积分结果表明实施例1分离纯化所得鼠妇纤溶酶PSLTro01的纯度为90.9%。
2.相对分子质量检测
（1）还原性SDS-PAGE垂直电泳法测定相对分子量测定
蛋白样品中加入含β-巯基乙醇的上样缓冲液，其他电泳条件同非还原SDS-PAGE垂直电泳。相对分子质量测定结果：图5显示还原性SDS-PAGE显示的单一条带即为目的蛋白，与蛋白分子量标准进行对比，并通过Band Scan软件进行分析，计算得出PSLTro01的相对分子量约为38 kDa。
（2）MALDI-TOF MS质谱法测定相对分子量测定
取1μL经Zip Tip C4 脱盐处理后的鼠妇纤溶酶PSLTro01，点至样品靶上，自然干燥后，再取0.6μL 质量百分含量为20%的SA(芥子酸)基质溶液（溶剂是体积比为1:1的乙腈和超纯水的混合物）,点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻位置点分子量标准品。在正离子模式下选择反射方法对样品测试范围进行校准测试，其中分子量标准品校准范围为：1046.542 ± 0.5、1533.858 ± 0.5、2465.199 ± 0.5、3494.651 ± 0.5。校准完成后在正离子模式下选择反射方法测试样品分子量。对5800 MALDI-TOF/TOF产生的原始数据及图谱由4000 Series Explorer V3.5软件导出，并进行分析。通过MALDI-TOF MS质谱解析，测得其相对分子量大小为38497.8555 Da , 如图7所示，与SDS-PAGE测定的相对分子量大小结果相一致。
3.N-端氨基酸序列测定
采用PPSQ-33A全自动蛋白质多肽测序仪测定鼠妇纤溶酶PSLTro01的N-端氨基酸序列。取 600 μL、质量百分浓度为0.1%的TFA水溶液加入含有待测样品的 PVDF 膜供试品管后，放入恒温混匀器中，600rpm振荡1分钟，去除上清，重复该步骤 3 次。取出，待自然晾干后剪切成 0.5cm2大小。将剪切好的PVDF膜供试品放置到反应器中，组装好反应器后将其放置于仪器固定位置，通过软件 PPSQ-30 Analysis 设置：样品名称、样品号、测试循环数、选择方法文件，设置完成后开始测试。 PPSQ-33A全自动蛋白质多肽测序仪产生的原始数据及图谱由PPSQ-30 Data Processing软件识别标峰并导出对应图谱。结果显示，PSLTro01自N端起第1-15位氨基酸残基的序列(SEQ ID NO:1)为：Asp–Ile–Asn–Gly–Gly–Gly–Ala–Thr–Leu–Pro–Gln–Pro–Leu–Tyr–Gln。
值得指出的是，仅仅将实施例1中硫酸铵沉淀法调整为：在所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分中加入硫酸铵至饱和度为75-85%，静置后离心，取沉淀，得到粗蛋白；其他步骤不变，仍然可以获得纯的鼠妇纤溶酶PSLTro01，不足之处在于硫酸铵沉淀所得粗蛋白中杂蛋白较多，对凝胶过滤柱及离子交换层析柱的寿命影响较大，且收率较低。
实施例4 鼠妇纤溶酶PSLTro01的酶学性质分析
检测实施例1制备的鼠妇纤溶酶PSLTro01的酶学性质。
（1）最适反应温度的测定
取10 µL鼠妇纤溶酶PSLTro01溶液（0.2 mg·mL-1）点样于纤维蛋白平板的孔中，将纤维蛋白平板分别置于10~70℃范围内的不同温度，18 h后测鼠妇纤溶酶PSLTro01的纤溶活性，剩余酶活力=样品酶活力/40℃条件下样品酶活力*100%。结果如图8所示，温度对鼠妇纤溶酶PSLTro01的纤溶活性影响很大，低于20 ℃及高于50 ℃时，PSLTro01均不能充分发挥其纤溶活性。在30 ℃~40 ℃范围内，该酶具有较高的纤溶活性，当温度达到40 ℃，其纤溶活性最大。
（2）温度稳定性的测定
将鼠妇纤溶酶PSLTro01（0.2 mg·ml-1）置于20 ~70℃范围内的不同温度恒温水浴中，各温度条件下保温4 h，在不同时间点取样10µL检测纤溶活性，考察鼠妇纤溶酶PSLTro01的温度稳定性，剩余酶活力=样品酶活力/最大样品酶活力*100%。结果如图9所示，在20℃~40℃范围内，PSLTro01能保持较好的稳定性，4 h后剩余酶活力均可以保持在70%以上，尤其当温度为20℃时，其活性几乎不随时间而发生变化，提示其应低温储存；而当温度高于50℃时，其剩余酶活力随温度的升高急剧下降，尤其当温度高达70℃时，在0.5 h时其剩余酶活力已降至10%以下，因此，在高于50℃的环境中，PSLTro01不能长时间稳定存在。
（3）最适pH的测定
分别用0.1 mol·L-1的CH3COONH4-HCl（pH 3.0~6.0）缓冲液，Tris-HCl缓冲液（pH7.0~9.0）和Glycine-NaOH缓冲液（pH 10.0~12.0），配制0.2 mg·mL-1鼠妇纤溶酶PSLTro01溶液，各取10 µL点样于纤维蛋白平板的孔中，37℃保温，18 h后测鼠妇纤溶酶纤溶活性，剩余酶活力=样品酶活力/最大样品酶活力*100%。结果如图10所示，在pH 6.0~10.0的近中性和弱碱性环境中，PSLTro01具有较高的纤溶活力，当pH为7.0时，纤溶活性达到最大；而在pH低于5.0的酸性环境及pH高于11.0的强碱性环境中，其纤溶活性均有下降，尤其在pH 3.0的强酸条件下，PSLTro01几乎无纤溶活性。
（4） pH稳定性测定
分别取适量标题（2）中缓冲液配制的鼠妇纤溶酶溶液，37 ℃保温12 h后，采用纤维蛋白平板检测鼠妇纤溶酶纤溶活性，剩余酶活力=样品酶活力/最大样品酶活力*100%。结果如图11所示，在低于pH 5.0的酸性环境中，随着pH的降低，其纤溶活性急剧下降；在低于pH4.0的环境中，1 h内其纤溶活性几乎完全丧失；而PSLTro01在中性及碱性环境中稳定性要高于在酸性环境中的稳定性。人体中血液的pH范围为7.34-7.45，体液也为弱碱性环境，这与PSLTro01的最适反应pH相吻合。
（5）金属离子及酶抑制剂对PSLTro01的影响
用20 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.2）缓冲液分别配制浓度为1 mmol·mL-1的CuSO4·5H2O，MnSO4·7H2O，MgSO4，FeSO4·7H2O，CaCl2，ZnCl2金属离子溶液及TLCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮,20 mmol·mL-1)， EDTA(乙二胺四乙酸，2 mmol·mL-1)， EGTA(乙二醇四乙酸，2 mmol·mL-1)， PMSF(苯甲基磺酰氟，1 mmol·mL-1)， Aprotinin(抑肽酶，0.2mmol·mL-1)， Pepstain A(胃酶抑A，1 mmol·mL-1)酶抑制剂溶液。各溶液分别与浓度为0.2mg·ml-1的鼠妇纤溶酶溶液按照体积比为1:1混合，37℃保温1h后, 检测鼠妇纤溶酶剩余纤溶活性。空白对照为中以20 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.2）缓冲液替代抑制剂。剩余酶活力=样品酶活力/空白对照酶活力*100%。金属离子对PSLTro01纤溶活性的影响从图12可以看出，K+对PSLTro01纤溶活性没有影响，Mg2+对其纤溶活性具有微弱的激活作用，而Ca2+，Cu2+，Fe2+，Mn2+，Zn2+对PSLTro01的纤溶活性均有不同程度的抑制作用；其中Fe2+能明显抑制器纤溶活性，其与鼠妇纤溶酶作用后，残余纤溶酶活力仅为空白对照的50.83%。酶抑制剂对PSLTro01纤溶活性的影响如图13所示，TLCK，EDTA，EGTA，PMSF， Aprotinin，Pepstain A 对PSLTro01纤溶活性均有抑制作用，抑制强度差别较大。其中EDTA，EGTA，PMSF抑制作用相对较弱，残余纤溶酶活力均高于60%，而Aprotinin，Pepstain A对PSLTro01纤溶活性则完全抑制。
实施例5溶栓特性及机理研究
（1）PSLTro01对发色底物专一性的确定
在96孔板中孔中分别加入175 µL的PSLTro01溶液（含有1µg的PSLTro01，溶剂为pH7.2、20 mmol·L-1的Tris-HCl缓冲液），然后加入25 µL浓度为0.5mmol·mL-1的凝血酶特异性发色底物S-2238（H-D-Phe-Pip-Arg-pNA）、纤溶酶特异性发色底物S-2251（H-D-Val-Leu-Lys-pNA）或尿激酶特异性发色底物S-2444（pyro-Glu-Gly-Arg-pNA）溶液（溶剂为pH 7.2、20 mmol·L-1的Tris-HCl缓冲液）（发色底物均购自法国HYPHEN BioMed 公司）。将96孔板放入EnSpire Multimode Plate Reader酶标仪控温测试区，测试区温度始终保持在37 ℃，保温5 min后，在405 nm紫外波长下连续扫描5 mim测定释放出的pNA（对硝基苯胺）的吸光度。通过各孔内溶液吸光度的变化来计算pNA的释放量。PSLTro01活性定义为：在37℃条件下，每毫克鼠妇纤溶酶在1 min内水解发色底物释放1 µmol pNA的酶的量为1U。
PSLTro01对三种发色底物均有水解作用，结果见表2。PSLTro01对纤溶酶最适底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA的水解活性最大，对凝血酶最适底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA和尿激酶最适底物pyro-Glu-Gly-Arg-pNA的水解活性相当，此结果表明PSLTro01的特异性水解底物为S-2251。
表2. PSLTro01作用于发色底物的酰胺水解活性
（2）PSLTro01溶栓机理探究
按照实施例2中方法制备纤维蛋白平板，又称为阳性平板；将阳性平板置85 ℃培养箱中保温30 min，使其中的纤溶酶原全部变性失活，制成去纤溶酶原纤维蛋白平板，即为阴性平板。在阳性平板和阴性平板中，分别打出若干直径约为2 mm的小孔。在阴阳性平板中分别考察鼠妇纤溶酶PSLTro01的溶圈。在a孔中加入去离子水，在b孔中加入10 µL浓度为0.075mg·ml-1鼠妇纤溶酶PSLTro01，在c孔中加入浓度为100U·ml-1尿激酶溶液。将加样后的平板放入37 ℃恒温培养箱中，18 h后观察纤维平板溶圈变化。
纤维蛋白原中往往含有微量的纤溶酶原，在实验条件下可被激活成纤溶酶干扰测定，因此阳性平板反映了样品直接溶解纤维蛋白和通过激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白的双重作用。但是阴性平板仅反映样品的直接纤溶活性。因此，通过比较样品在阴阳性平板中的纤溶活性，可以检测样品的溶栓活性是基于样品直接溶剂纤维蛋白性能还是通过激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白的性能。由图14所示，阳性平板上纤维蛋白的溶圈和阴性平板上具有较大差异。阳性平板上尿激酶和PSLTro01均表现出明显的溶栓活性，而在阴性板上两者均没有表现出溶栓活性，说明PSLTro01与尿激酶的溶栓作用方式是一致的，溶栓方式都是通过激活纤溶酶原，使其转化为纤溶酶，进而溶解纤维蛋白，而并非是直接溶解纤维蛋白。
（3）PSLTro01对纤维蛋白原的裂解
取100µL浓度为5 mg·mL-1的纤维蛋白原溶液和50 µL浓度为0.2 mg·mL-1的鼠妇纤溶酶PSLTro01溶液充分混合，置于37℃水浴中，在放置时间达到5 min、15 min、30 min、1h、4 h、8 h、16 h和24 h时分别取样10 µL，加入2µL上样缓冲液，按照上述相同方法进行还原性SDS-PAGE垂直电泳，电泳时以纤维蛋白原作为空白对照。电泳结束后凝胶成像，观察纤维蛋白原α、β和γ链的降解情况。
通过还原性SDS-APGE垂直电泳可以明显观察到PSLTro01对纤维蛋白原的降解过程，结果如如图15所示。在5min时纤维蛋白原的α链和β链均开始降解，15 min时可以明显观察到有一条新的蛋白条带产生，即为降解产物，其分子量约为30 kDa。30min后α链已经彻底降解，4 h后β链也完全消失，于此同时可以发现电泳胶条上逐渐显现出分子量小于25 kDa的蛋白条带，即为α链和β链的降解产物。与α链和β链相比，γ链降解速度慢，4 h后才开始缓慢降解，直到24 h才完全消失。因此，PSLTro01降解纤维蛋白是依次降解纤维蛋白原的α链、β链和γ链，与人纤溶酶的降解纤维蛋白原各亚基的顺序相似。
实施例6 体外溶栓及抗凝实验
（1）纤溶活性比较
按照以上方法制作纤维蛋白平板（阳性平板），并打出4个直径约为2 mm的小孔，a孔中加入0.1 mg·mL-1的鼠妇纤溶酶PSLTro01溶液，b孔中加入100 U·mL-1尿激酶溶液,c孔中加入50 U·mL-1尿激酶溶液，d孔中加入20 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）作为空白对照，放入37 ℃恒温培养箱中，18 h后观察纤维蛋白平板溶解圈变化。结果如图16所示，鼠妇纤溶酶表现出了较强的纤溶活性，0.1 mg·mL-1的鼠妇纤溶酶PSLTro01酶活力强于100 U·mL-1尿激酶。
（2）体外抗凝实验
选择新西兰雄性白兔，颈总动脉插管取血。按1：9比例，在兔血中混入3.8%的柠檬酸钠溶液，轻轻混匀，3000 r·min-1离心10 min，分离血浆。PT 、TT、APTT试剂盒购自北京中勤世帝科学仪器有限公司，批号分别为STY50101-52， STY50301-32， STY50201-39。按各试剂盒的要求进行凝血酶原时间(PT) 、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定，各测试区分别加入20µL的供试品溶液。检测中，鼠妇纤溶酶PSLTro01溶液分为小、中和大三个剂量组，PSLTro01的终浓度分别为5 µg·mL-1，10 µg·mL-1，20 µg·mL-1；空白对照组中加入去离子水，阳性对照组中加入肝素钠（终浓度为1 U·mL-1）。
通过检测鼠妇纤溶酶PSLTro01对凝血三项指标TT、PT和APTT的影响，来探究其抗凝作用，结果如表3所示。与空白对照组比较，随着鼠妇纤溶酶PSLTro01浓度的增大，TT、PT和APTT时间均有延长，呈现一定的量效关系，但PT延迟并不明显。当鼠妇纤溶酶PSLTro01浓度为10µg·mL-1时，其抗凝作用与1U·mL-1肝素钠的抗凝作用相当；而当鼠妇纤溶酶浓度为20 µg·mL-1时，APTT超过600s后仍未凝固，TT，PT，APTT均长于1U·mL-1肝素钠的抗凝时间，显示了优异的抗凝作用。
表3.鼠妇纤溶酶对TT,PT,APTT的影响
（注：与空白对照比:*P＜0.05，**P＜0.01）。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京中医药大学
<120> 一种鼠妇纤溶酶及其应用
<130> 20150127
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 鼠妇
<400> 1
Asp Ile Asn Gly Gly Gly Ala Thr Leu Pro Gln Pro Leu Tyr Gln
1 5 10 15

Claims (8)

1.一种鼠妇纤溶酶，其特征在于所述鼠妇纤溶酶具有溶栓和抗凝活性，分子量为37.5-38.5KDa，且自N端起第1-15位氨基酸残基的序列为：Asp – Ile – Asn – Gly – Gly – Gly– Ala – Thr – Leu – Pro – Gln – Pro – Leu – Tyr – Gln；所述鼠妇纤溶酶采用如下方法制备：
（1）将鼠妇采用湿法超微粉碎，获得提取液；
（2）从所述提取液中提取分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分；
（3）对步骤（2）所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分采用硫酸铵沉淀法进行纯化，获得粗蛋白；
（4）将所述粗蛋白经凝胶过滤层析和阴离子交换层析，取具有溶栓活性的洗脱液，得到鼠妇纤溶酶；步骤（4）的具体方法为：所述粗蛋白依次经过Sephadex G-100凝胶过滤柱、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱、HiTrap Capto Q离子交换层析柱和Superose-12凝胶过滤柱，取具有溶栓活性的洗脱液，得到鼠妇纤溶酶。
2.根据权利要求1所述鼠妇纤溶酶，其特征在于步骤（1）中将鼠妇用6~10倍质量的水浸泡0.5~2 h，然后加入超微粉碎机中进行湿法超微粉碎。
3.根据权利要求2所述鼠妇纤溶酶，其特征在于所述湿法超微粉碎的温度为0-40℃，时间为5~30 min。
4.根据权利要求2或3所述鼠妇纤溶酶，其特征在于步骤（2）中将所述提取液采用截留分子量为80kDa~100kDa的中空纤维膜进行分离，取透过液，采用截留分子量为4kDa的中空纤维膜进行分离，取截留液，得到分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分。
5.根据权利要求4所述鼠妇纤溶酶，其特征在于步骤（3）中所述硫酸铵沉淀法具体为：在所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分中加入硫酸铵至饱和度为75-85%，静置后离心，取沉淀，得到粗蛋白。
6.根据权利要求5所述鼠妇纤溶酶，其特征在于所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分中先加入硫酸铵至饱和度为35-65%，静置后离心，取上清液；然后在所述上清液中加入硫酸铵至饱和度为75-85%，静置后离心，取沉淀，得到粗蛋白。
7.根据权利要求6所述鼠妇纤溶酶，其特征在于所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分中先加入硫酸铵至饱和度为55-65%，静置后离心，取上清液；然后在所述上清液中加入硫酸铵至饱和度为75-85%，静置后离心，取沉淀，得到粗蛋白。
8.权利要求1所述鼠妇纤溶酶在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。
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