CN104672306B - 一种具有抗血栓活性多肽的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，公布了一种从尖吻蝮蛇蛇毒的中性蛋白酶酶解产物中分离得到的多肽ACH‑11，并公开了其制备方法以及作为抗血栓剂的应用。ACH‑11是应用凝胶过滤层析和反相高效液相色谱分离技术从尖吻蝮蛇蛇毒酶解产物中分离纯化得到的，分子量为1260.77Da，序列为Leu‑Thr‑Phe‑Pro‑Arg‑Ile‑Val‑Phe‑Val‑Leu‑Gly。体外兔血小板聚集实验表明该多肽能抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集作用，并且呈现剂量依赖性。体内动物实验表明该多肽对二磷酸腺苷诱导的急性肺血栓的形成具有保护作用，并且可以延长小鼠的凝血时间。

Description

一种具有抗血栓活性多肽的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，涉及由尖吻蝮蛇(Deinagkistrodonacutus)蛇毒的中性蛋白酶酶解产物中分离纯化的一种具有抗血栓活性的多肽，尤其涉及该多肽的制备方法以及作为抗血栓药物的应用。

背景技术

由于全球老龄化以及城市化的发展，心脑血管疾病的发病率和死亡率逐年增加，现已成为威胁人类健康的头号杀手。而血栓形成在心脑血管疾病如缺血性脑血管病、肺栓塞、心肌梗死以及各种动静脉血栓的形成过程中扮演着极其重要的角色。因此，研究开发抗血栓药物具有重要意义。

人体内的凝血途径分为内源性与外源性凝血两条途径。阻断凝血链，进而阻止血栓的形成是治疗和预防血栓性疾病的有效手段之一。另外，血小板在血栓形成的过程中也起到了非常重要的作用，当血管内皮出现损伤时，血小板会粘附、活化、分泌颗粒状内容物进而相互聚集，从而导致血栓的形成。近年来，大量国内外文献报道了从天然动植物和微生物如蜈蚣、大豆和食用真菌中分离纯化的具有抗血栓活性的蛋白质和多肽。

蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的一种液体，古今中医界常用其治疗一些疑难杂症。蛇毒中含多种具有生物活性的蛋白质、多肽和其他小分子物质，是典型的混合物。蛇毒除去水分以外，90％-95％为蛋白质和多肽，主要为酶类和毒素。已报道蛇毒在抗凝、溶栓、降压、镇痛、抗肿瘤、促进神经生长以及抗菌等方面均有良好的活性。其中蝮蛇蛇毒一直以来都是国内外研究的热点。蝮蛇毒的主要成分是蛋白类化合物，含有水解蛋白酶、精氨酸酶、磷酸二酯酶等多种酶类。目前在我国，云南尖吻蝮蛇毒制成的去纤酶、东北白眉蝮蛇毒制成的清栓酶、江浙尖吻蝮蛇毒制成的蕲蛇酶等已广泛运用于脑血栓、血栓闭塞性脉管炎、血栓静脉炎、心肌梗死以及肺栓塞等各类疾病的治疗。

随着多肽构效关系研究的不断发展，在蛋白质的多肽链内部发现了一些普遍存在的功能区，选择合适的蛋白酶水解这些多肽链，有可能将其释放出来，从而制备出具有各种功能特性的生物活性肽。蛋白水解物制备的活性肽类产品，具有易消化、易吸收、抗过敏、抗高血压、抗凝抗血栓等作用。目前国内外已从蛋白水解物中分离出多种具有生理活性的生物活性肽，例如促进钙吸收的酪蛋白磷酸肽、抗病毒肽、ACE(血管紧张素转化酶)抑制肽、抗凝血肽等，当前已有部分活性肽实现了工业化生产。

本发明从尖吻蝮蛇蛇毒的中性蛋白酶酶解产物中分离纯化出一个由十一个氨基酸组成的多肽，体外兔血小板聚集实验证实该多肽能抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集，且具有剂量依赖性。动物体内实验证实，该多肽对二磷酸腺苷诱导的小鼠急性肺血栓栓塞具有保护作用，并且可以延长小鼠的凝血时间。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有抗血栓活性的多肽及其制备方法与应用。该多肽具有较强的抗血栓活性，具有治疗血栓性疾病的价值。该多肽来源于尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)蛇毒的中性蛋白酶酶解产物。

本发明所提供的具有抗血栓活性的蛇毒多肽是利用二级质谱法测得其氨基酸序列的，其序列为Leu-Thr-Phe-Pro-Arg-Ile-Val-Phe-Val-Leu-Gly。

本发明所提供的具有抗血栓活性的蛇毒多肽，经质谱测定其分子量为1260.77Da。

本发明还涉及获得该多肽的方法。主要包含下述步骤：

1)取尖吻蝮蛇蛇毒粉末，用缓冲液溶解后煮沸以失活其内源性蛋白酶。

2)加入缓冲液溶解的中性蛋白酶，在最适温度和最适pH值下酶解3h。高温终止反应。酶解液离心后收集上清液并冻干，用缓冲液重新溶解，经Sephadex G-50凝胶过滤层析，得到活性峰C；

3)峰C部分再经过反相高效液相色谱纯化，得到活性峰C4，收集冻干，命名为ACH-11。

本发明所提供的多肽，经测试具有抗血小板聚集活性：在给药剂量100μg/ml至1000μg/ml范围内可以抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集，且呈现剂量依赖关系。

本发明所提供的多肽，经测试对小鼠急性肺血栓栓塞具有较好的保护作用，并且能延长小鼠的凝血时间。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明的发明范围。

图1为尖吻蝮蛇蛇毒用中性蛋白酶酶解后经Sephadex G-50凝胶过滤层析图：活性峰为峰C。

图2为峰C部分反向高效液相色谱图：活性色谱峰为峰C4，即ACH-11。

图3为活性峰C4(即ACH-11)的二级质谱图。

图4为ACH-11的化学结构式。

具体实施方式

实施例1：ACH-11的制备

1)取4g尖吻蝮蛇蛇毒(由中国江西省鹰潭市余江县彩虹养殖场提供)，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)溶解，使其终浓度为40mg/ml。煮沸10min以灭活内源性蛋白酶。待温度降至50℃后按照酶与底物比1％(W/W)添加中性蛋白酶溶液。在pH8.0，50℃条件下酶解3h。煮沸10min以终止酶解反应。

2)将酶解液离心，10000×g离心30min，取上清。将上清液减压浓缩后冻干。

3)将冻干后的酶解蛇毒粉末溶解于少量蒸馏水中，进行Sephadex G-50凝胶过滤层析分离。洗脱液为蒸馏水，流速为0.6ml/min，采用自动部分收集器收集，每个试管收集3.6ml。分别测定每个试管中的收集液在280nm波长下的吸光度，绘制吸光度曲线，得到5个色谱峰，收集第3个峰，即峰C，冻干(结果如图1所示)。

4)将峰C溶解于少量50％乙腈+0.1％三氟乙酸溶液中。采用C₁₈柱进行反向高效液相纯化。洗脱液A：水+0.1％三氟乙酸；B：乙腈+0.1％三氟乙酸。流速7ml/min。洗脱程序：0-15min，10％B；15-60min，10％B-30％B。检测波长为：214nm。得到8个峰，收集第4个峰，即峰C4，即ACH-11，冻干(结果如图2所示)。

5)ACH-11经质谱测定其分子量为1260.77Da，利用二级质谱法测得其氨基酸序列为Leu-Thr-Phe-Pro-Arg-Ile-Val-Phe-Val-Leu-Gly。其二级质谱图如图3所示，化学结构式如图4所示。

实施例2：ACH-11的体外抗血小板聚集活性

1)将雄性家兔麻醉，颈总动脉取血置于含有1ml的3.2％枸橼酸钠的15ml离心管中，(每管终体积约为10ml，保证兔血和抗凝剂体积比为9∶1)，20℃下120×g离心10min，得到上层液即富血小板血浆。余下血样以1600×g离心10min，得到贫血小板血浆。

2)吸取300μl贫血小板血浆置于血小板聚集仪测试区调零，再吸取270μl富血小板血浆置于预热槽中，分别加入20μl用二甲基亚砜配制的不同浓度梯度的ACH-11(100，250，500，1000μg/ml)，其中二甲基亚砜的终浓度均为5％。37℃预热5min后置于测试区，加入10μl诱导剂(二磷酸腺苷，终浓度10μM)和测试珠，测定5min内血小板最大聚集率。其中，空白对照为5％的二甲基亚砜。通过以下公式计算血小板聚集抑制率：[(X-Y)/X]×100％。X代表空白对照组血小板最大聚集率；Y代表各浓度多肽组血小板最大聚集率。

该多肽经血小板聚集实验，ACH-11能显著抑制二磷酸腺苷诱导的兔血小板聚集，呈现剂量依赖关系，其结果如下：

ACH-11对二磷酸腺苷诱导的兔血小板聚集的抑制作用

ACH-11(μg/ml)	100	250	500	1000
					抑制率(％)	32.82±3.50	46.83±0.32	63.98±2.82	76.70±0.99

从以上结果可以看出，ACH-11对二磷酸腺苷诱导的兔血小板聚集有抑制作用，呈现剂量依赖关系。

实施例3：ACH-11对小鼠急性肺血栓栓塞模型的保护作用

1)取健康ICR小鼠40只，体重18-22g，雌雄各半，按体重随机分为4组，每组10只。ACH-11用二甲基亚砜配制成不同的剂量：0.33，1和3mg/kg，其二甲基亚砜含量均为5％。阴性对照为5％二甲基亚砜。以上各组均尾静脉给药，给药容积为10ml/kg。

2)给药后15min，尾静脉注射300mg/kg的二磷酸腺苷诱导剂，形成急性肺血栓栓塞，记录注射诱导剂后15min内各组死亡或者偏瘫(30s内失去翻正反射)的小鼠的数量。通过以下公式计算急性肺血栓栓塞保护率：[1-(X/Y)]×100％。X代表各组死亡或者偏瘫的小鼠的数量；Y代表各组的小鼠总数量。

3)该多肽经小鼠急性肺血栓栓塞模型实验，ACH-11对小鼠死亡或偏瘫症状有较好的保护作用，且呈现剂量依赖关系，其结果如下：

4)ACH-11对小鼠急性肺血栓栓塞模型的保护作用

从以上结果可以看出，ACH-11在给药剂量为0.33、1和3mg/kg时，对小鼠死亡或偏瘫症状的保护率分别为30％、60％和90％，明显高于5％的二甲基亚砜组。ACH-11对小鼠急性肺血栓栓塞模型有较好的保护作用，呈现剂量依赖关系。

实施例4：ACH-11对小鼠凝血时间的影响

取健康ICR小鼠40只，体重18-22g，雌雄各半，按体重随机分为4组，每组10只。即阴性对照组，ACH-11低剂量组，ACH-11中剂量组，ACH-11高剂量组。ACH-11用二甲基亚砜配制成不同的剂量：0.33，1和3mg/kg，其二甲基亚砜含量均为5％。阴性对照为5％二甲基亚砜。各组均尾静脉给药，容积为10ml/kg。一次/天，连续4天，末次给药15min后，将玻璃毛细管插入小鼠眼眶内使血液自行流出，用干棉球擦去第一滴血，再分别将血滴滴于清洁载玻片的两端，血滴直径5-10mm，立即开始计时。此后每隔30s，用干燥的针头挑动血液1次，至针头能挑起纤维蛋白为止。

该多肽经小鼠凝血实验，ACH-11对小鼠凝血时间有显著的延长作用，且呈现剂量依赖关系，其结果如下：

ACH-11对小鼠的凝血时间有延长作用

从以上结果可以看出，ACH-11在给药剂量为0.33、1和3mg/kg时，能显著延长小鼠的凝血时间，呈现剂量依赖关系。

Claims (2)

1.一种蛇毒酶解产物中的抗血栓多肽，其特征在于以尖吻蝮蛇蛇毒的中性蛋白酶酶解产物为原材料提取，氨基酸序列为Leu-Thr-Phe-Pro-Arg-Ile-Val-Phe-Val-Leu-Gly，分子量为1260.7Da。

2.一种如权利要求1所述多肽的应用，其特征在于，所述的多肽在制备抗血栓药物中的应用。