CN104017849A

CN104017849A - 水蛭纤溶蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104017849A
Application number: CN201410208481.5A
Authority: CN
Inventors: 吉爱国; 宋淑亮; 王晓晨; 孙倩倩
Original assignee: Shandong University Weihai
Current assignee: Shandong University Weihai
Priority date: 2014-05-16
Filing date: 2014-05-16
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2034-05-16
Also published as: CN104017849B

Abstract

本发明公开了一种水蛭纤溶蛋白，是通过以下方法制备得到的：(1)水蛭纤溶蛋白粗品的提取；(2)上述水蛭纤溶蛋白粗品提取液进行QSephroseFastFlow离子交换柱层析，用NaCl溶液线性洗脱，收集第五个洗脱峰所对应的洗脱液，浓缩并干燥，得水蛭纤溶粗蛋白；(3)将上述得到的水蛭纤溶粗蛋白用蒸馏水溶解，SephacrylS-200凝胶过滤层析，蒸馏水洗脱，取第一个洗脱峰所对应的洗脱液，浓缩并干燥，即得水蛭纤溶蛋白。本发明进行了水蛭纤溶蛋白的体外纤溶试验以及动物体内溶栓试验，结果表明：本发明的水蛭纤溶蛋白对凝血过程中形成的纤维蛋白有明显的溶解作用；对模型小鼠体内的血栓有溶解作用。预示水蛭纤溶蛋白在制备溶栓药物中有很大的开发应用前景。

Description

水蛭纤溶蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及水蛭纤溶蛋白及其制备方法与应用，属于医药领域。

背景技术

血栓性疾病多发于心房室腔、动脉、静脉和微血管，主要危害心、脑、肺的血管系统，造成成年人死亡或残疾。血栓性疾病的传统治疗策略主要包括外科手术、抗凝和溶栓三大类。肝素、小分子肝素、发华林等以大量的临床运用显示了良好的效果，但其副作用也一直是临床长期使用的困扰。

随着心脑血管疾病中中药应用研究的深入，单味中药的研究亦得到重视。水蛭是一味传统中药，中医认为其有破血、逐瘀、通经的功能。近年来，对水蛭的医用研究越来越广泛，尤其是在治疗血栓性疾病方面的研究。目前报道的从水蛭中提取得到的活性成分有：具有抗凝活性的水蛭素、Granulin、Theromin，可以抑制血小板聚集的糖蛋白待可森、Calin以及多种具有抗凝活性的小分子寡肽等。提取方法包括加热水提、有机物提取、胃蛋白酶酶解法等。但从宽体金线蛭中通过胰蛋白酶酶解法分离纯化出分子量在2万到3万的具有纤溶活性的蛋白，尚未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种提取分离水蛭纤溶蛋白的胰蛋白酶酶解技术；并提供了一种具有药用价值的水蛭蛋白。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种水蛭纤溶蛋白，是通过以下方法制备得到的：

(1)水蛭纤溶蛋白粗品的提取：取宽体金线蛭干品，粉碎得水蛭干品粉末，加入15～25重量倍(优选20倍量)的水浸泡40～60小时(优选48小时)后匀浆，得匀浆液；匀浆液用胰蛋白酶和粗酶酶解；酶解完毕后，向酶解液中加无水乙醇或体积百分数≥90的乙醇溶液，至乙醇的体积百分数达60％～80％(优选75％)，静置10～15小时(优选12小时；醇沉的同时灭酶活)，抽滤得上清液，上清液减压浓缩(优选的，浓缩至原体积的十分之一)，得水蛭纤溶蛋白粗品提取液；

(2)上述水蛭纤溶蛋白粗品提取液进行QSephroseFastFlow离子交换柱层析，用0.14mol/L～2mol/L的NaCl溶液线性洗脱(连续梯度洗脱，初始NaCl浓度为0，终浓度为0.14mol/L～2mol/L)，得到七个洗脱峰，收集第五个洗脱峰(按洗脱先后顺序计)所对应的洗脱液(见图1，左起第五个)，浓缩并干燥，得水蛭纤溶粗蛋白；

(3)将上述得到的水蛭纤溶粗蛋白用蒸馏水溶解(优选的，水的用量为浓缩干燥前体积的十分之一)，SephacrylS-200凝胶过滤层析，蒸馏水洗脱，得到四个洗脱峰，取第一个洗脱峰(按洗脱先后顺序计)所对应的洗脱液(见图2，左起第一个)，浓缩并干燥，即得水蛭纤溶蛋白，以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，其分子量在20000Da～30000Da。

所述步骤(1)中，用胰蛋白酶和粗酶酶解时，胰蛋白酶酶量为水蛭干品粉末重量的1％，粗酶酶量为水蛭干品粉末重量的5％，酶解条件为：pH8.2～8.5，温度50℃，时间9h(酶解5h后，补加胰蛋白酶，补加的酶量为水蛭干品粉末重量的1％)。

所述粗酶是由胰蛋白酶、α-淀粉酶和ATGL脂肪甘油三酯脂肪酶组成的，三者的配比关系为1:7:2(质量比)。

本发明的水蛭纤溶蛋白在制备溶栓药物中的应用。

本发明进行了水蛭纤溶蛋白的体外纤溶试验以及动物体内溶栓试验，结果表明：本发明的水蛭纤溶蛋白对凝血过程中形成的纤维蛋白有明显的溶解作用；对模型小鼠体内的血栓有溶解作用。预示水蛭纤溶蛋白在制备溶栓药物中有很大的开发应用前景。

附图说明

图1：水蛭纤溶蛋白粗品QSepharoseFastFlow离子柱洗脱曲线(280nm)，其中，曲线1表示电导率，曲线2表示NaCl洗脱浓度。

图2：HAP-5组分SephacrylS-200凝胶柱洗脱曲线(280nm)，其中，曲线1表示HAP-5中盐的洗脱峰。

图3：水蛭纤溶蛋白纤溶活性测定结果图，其中，X表示阴性对照①，生理盐水；1表示阴性对照②，0.24mol/L的NaCl溶液(HAP-5的洗脱浓度)；2表示醇沉后水蛭纤溶蛋白粗提物溶液；3表示HAP-5；4表示HAP-5-1。

图4：水蛭纤溶蛋白与水蛭提取物(专利号ZL200810138936.5所涉及的水蛭提取物)纤溶活性的比较结果图，其中，Ⅰ表示实验室前期实验所得水蛭提取物(专利号ZL200810138936.5，公开号为101332211A的专利说明书实施例1所制备得到的水蛭提取物)；Ⅱ表示水蛭纤溶蛋白提取物HAP-5；Ⅲ表示水蛭纤溶蛋白HAP-5-1；其余两个孔中均为阴性对照生理盐水。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1从干水蛭中提取水蛭纤溶蛋白

步骤如下：

(1)称取水蛭干品，粉碎机粉碎，加入20倍的水在4℃条件下浸泡48h后匀浆，匀浆液中加入干水蛭重1％的胰蛋白酶和5％的粗酶进行酶解(pH8.2～8.5，温度50℃)，5h后补加干水蛭重1％的胰蛋白酶继续酶解4h；酶解完毕，温度恢复至室温，向酶解液中加无水乙醇至75％，4℃静置过夜(12小时)，抽滤得上清液，减压浓缩(浓缩至原体积的十分之一)得水蛭蛋白粗品提取液；

(2)上述水蛭纤溶蛋白粗品提取液进行QSephroseFastFlow离子交换柱层析，用2mol/L的NaCl溶液线性洗脱(连续梯度洗脱，初始NaCl浓度为0，终浓度为2mol/L)，280nm在线检测，洗脱结果如图1所示，最后得到七个洗脱峰，收集第五个洗脱峰(详见附图1，左起第五个)所对应的洗脱液，浓缩并干燥，得水蛭纤溶粗蛋白，命名为HAP-5；其余的洗脱峰所对应的洗脱液也进行浓缩干燥，所得产物依次命名为：HAP-1，HAP-2，HAP-3，HAP-4，HAP-6，HAP-7；

(3)将上述命名为HAP-5的水蛭纤溶粗蛋白用2ml蒸馏水溶解，SephacrylS-200凝胶过滤层析，蒸馏水洗脱，280nm在线检测，洗脱结果如图2所示，得到四个洗脱峰，取第一个洗脱峰(按洗脱先后顺序计)所对应的洗脱液(见图2，左起第一个)，浓缩并干燥，即得水蛭纤溶蛋白，命名HAP-5-1，以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，其分子量在20000Da～30000Da。

实施例2水蛭纤溶蛋白对纤维蛋白的溶解作用

具体步骤如下：

纤维蛋白板的制备：称取琼脂糖125mg，加入23ml生理盐水中，煮沸溶胀后在55℃～60℃水浴中平衡；平衡后加入14ul100U/ml的凝血酶和2.2ml6mg/ml的纤维蛋白原溶液，不停摇匀至浑浊，浑浊后立即倒入直径为8cm的平板中，水平放置充分凝固后，置于4℃放置30min后打孔。

纤溶活性的测定：在孔中加入10ul水蛭纤溶蛋白溶液(实施例1制备的水蛭纤溶蛋白，水蛭纤溶蛋白溶液的浓度为0.87mg/ml)，37℃孵育24h后，对纤维蛋白的溶解情况进行观察测量。纤溶结果如图3所示，由图3可知，醇沉后的水蛭纤溶蛋白粗提物，HAP-5，HAP-5-1均有纤溶活性。

实施例3水蛭纤溶蛋白对模型小鼠体内血栓的溶解作用

具体步骤如下：

用昆明种小鼠(体重20±1.0g)40只，随机分为4组，每组10只，雌雄各半且分开培养。依次为空白对照组，模型对照组，水蛭纤溶蛋白粗提物组，HAP-5-1组。

除空白对照组外，其余三组制造血栓模型。用乙醚将小鼠轻微麻醉，用70％乙醇在腰背部消毒，以100mg/kg的剂量腰背部皮下注射10mg/mL角叉菜胶溶液，注射完成后将小鼠置于温度低于18℃的环境中饲喂，注意观察小鼠尾巴变化。小鼠尾尖在4～24h期间出现暗红色血栓形成区，并逐渐向尾根部扩大，48h后变紫黑色，与正常尾部分界明显。空白对照组在小鼠相同部位注射生理盐水。

造模后次日起，空白对照组和模型对照组腹腔注射生理盐水，实验组分别注射水蛭纤溶粗蛋白即HAP-5200mg/kg与HAP-5-1100mg/kg，连续注射15天，在5、10、15d测量实验组和模型对照组小鼠的血栓形成长度，按照L＝L₁/L₂计算小鼠血栓形成的相对长度，L₁表示血栓形成长度，L₂表示小鼠尾巴总长度。结果见表1。

表1水蛭纤溶蛋白对模型小鼠血栓的溶栓作用

注：与模型对照组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01

从表1中可以看出，水蛭纤溶蛋白粗提物和HAP-5-1对血栓模型小鼠尾部血栓有明显的溶解作用。

实施例4水蛭纤溶蛋白与水蛭提取物(专利号ZL200810138936.5所涉及的水蛭提取物)纤溶活性的比较

具体步骤如下：

纤维蛋白板的制备：称取琼脂糖125mg于23ml生理盐水中，煮沸溶胀后在55℃～60℃水浴中平衡；平衡后加入14ul100U/ml的凝血酶和2.2ml6mg/ml的纤维蛋白原溶液，不停摇匀至浑浊，浑浊后立即倒入直径为8cm的平板中，水平放置充分凝固后，置于4℃放置30min后打孔。

纤溶活性的测定比较：在孔中加入10ul浓缩的水蛭纤溶蛋白溶液以及10ul水蛭提取物(专利号ZL200810138936.5中实施例1所制备的水蛭提取物)，37℃孵育24h后，对纤维蛋白的溶解情况进行观察测量。纤溶结果如图4所示。从图4中可以得出，本发明制备的水蛭纤溶蛋白溶解环的直径是水蛭提取物(专利号ZL200810138936.5中实施例1所制备的水蛭提取物)溶解环直径的1.4倍，即本发明制备的水蛭纤溶蛋白纤溶活性较高。

Claims

1.一种水蛭纤溶蛋白，其特征在于：是通过以下方法制备得到的：

(1)水蛭纤溶蛋白粗品的提取：取宽体金线蛭干品，粉碎得水蛭干品粉末，加入15～25重量倍的水浸泡40～60小时后匀浆，得匀浆液；匀浆液用胰蛋白酶和粗酶酶解；酶解完毕后，向酶解液中加无水乙醇或体积百分数≥90的乙醇溶液，至乙醇的体积百分数达60％～80％，静置10～15小时，抽滤得上清液，上清液减压浓缩，得水蛭纤溶蛋白粗品提取液；

(2)上述水蛭纤溶蛋白粗品提取液进行QSephroseFastFlow离子交换柱层析，用0.14mol/L～2mol/L的NaCl溶液线性洗脱，得到七个洗脱峰，收集第五个洗脱峰所对应的洗脱液，浓缩并干燥，得水蛭纤溶粗蛋白；

(3)将上述得到的水蛭纤溶粗蛋白用蒸馏水溶解，SephacrylS-200凝胶过滤层析，蒸馏水洗脱，得到四个洗脱峰，取第一个洗脱峰所对应的洗脱液，浓缩并干燥，即得水蛭纤溶蛋白。

2.根据权利要求1所述的水蛭纤溶蛋白，其特征在于：所述步骤(1)中，用胰蛋白酶和粗酶酶解时，胰蛋白酶酶量为水蛭干品粉末重量的1％，粗酶酶量为水蛭干品粉末重量的5％，酶解条件为：pH8.2～8.5，温度50℃，时间9h，酶解5h后，补加胰蛋白酶，补加的酶量为水蛭干品粉末重量的1％。

3.根据权利要求1所述的水蛭纤溶蛋白，其特征在于：所述粗酶是由胰蛋白酶、α-淀粉酶和ATGL脂肪甘油三酯脂肪酶组成的，三者的配比关系为1:7:2。

4.权利要求1～3中任一项所述的水蛭纤溶蛋白的制备方法，其特征在于：步骤如下：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，用胰蛋白酶和粗酶酶解时，胰蛋白酶酶量为水蛭干品粉末重量的1％，粗酶酶量为水蛭干品粉末重量的5％，酶解条件为：pH8.2～8.5，温度50℃，时间9h，酶解5h后，补加胰蛋白酶，补加的酶量为水蛭干品粉末重量的1％。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述粗酶是由胰蛋白酶、α-淀粉酶和ATGL脂肪甘油三酯脂肪酶组成的，三者的配比关系为1:7:2。

7.权利要求1～3中任一项所述的水蛭纤溶蛋白在制备溶栓药物中的应用。