CN102115478A - 一种呋喃并吲哚类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种呋喃并吲哚类化合物及其制备方法和其作为溶血栓治疗药物的用途。该化合物通过分离的海洋微生物斜面菌株FG216经种子培养、发酵培养、甲醇提取、HPLC分离、冷冻干燥而得到。该化合物的溶解微血栓作用在分子水平反应体系、in vitro反应体系体现出来。该化合物是通过纤溶疗法用于治疗和/或预防微血栓性疾病，没有急性毒性作用，可以做成固体片剂和液体制剂。作为溶血栓制剂能临床治疗慢性血栓、急性血栓症状的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓性疾病，以及作为链激酶、尿激酶、瑞替普酶的协同或辅助治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种呋喃并吲哚类化合物，该化合物是溶解微血栓的海洋微生物的代谢产物，还涉及呋喃并吲哚类化合物的制备方法，和该化合物对治疗和/或预防各种缺血性疾病的用途，该化合物作为溶血栓治疗药物。
背景技术
血栓病是人类的常见多发病，心脑血管疾病中有很大比例是血栓病，溶栓疗法是治疗血栓性疾病的重要方法之一。一直以来，溶血栓药物都被作为心肌梗塞、脑栓塞、肺血栓等重笃血栓症急性期的治疗药物，其治疗目的主要是溶解血管内血栓和改善血液循环，溶血栓药是治疗血栓性疾病的关键药物。早期的溶血栓药为链激酶(Strepto kinase，SK)、尿激酶(Urokinase，UK)、蚓激酶(Lumbrukinase)、尿激酶原(Pro-urokinase)、葡激酶(Staphylokinase)、甲氧苯甲酰纤溶酶原-链激酶激活剂复合物(Anisoylatedplasminogen-streptokinase activator complex，APSAC))、蛇毒抗栓酶(Fibrinoenase from snake venom)，最近使用的溶血栓药为阿替普酶(Alteplase)、瑞替普酶(Reteplase)等。
围绕着血栓疾病的治疗既纤溶作用，在临床上使用的溶血栓药物会带来出血的重大危险性，由于上述药物的安全问题，自20世纪90年代开始，一些研究者开始探索用组织型纤溶酶原激活剂变异体(如TNKase、Monteplase、La noteplase)、脂质化合物用于血栓疾病的治疗。研究发现，相比组织型纤溶酶原激活剂分子量小的活性化血液蛋白质C具有抗凝血作用和促进纤溶作用；血小板膜特异性糖蛋白的抑制药物阿昔单抗作为小分子量的短肽抗凝血药物已经用于临床；血液凝固因子Xa的低分子抑制化合物作为药物正处于开发阶段。但已经用于临床或正在试验阶段的抗凝血药物除了都有程度不同的出血危险性以外，阿昔单抗的使用已经带来了像阿司匹林投与后的血小板减 少的副作用。因此，在这一治疗领域正急待着出血危险性小、不损伤血液因子、活性能够简单调控的低分子化合物作为血栓疾病治疗药物的出现。
发明内容
本发明要解决的问题是为采用纤溶疗法进行血栓疾病的治疗和/或预防提供效果明显、不存在出血危险性的临床药物。
为了在血栓疾病治疗领域发现出血危险性小、不损伤血液因子、活性能够简单调控的低分子化合物的药物，发明人从海洋和陆地的微生物、动植物的代谢产物进行了筛选和广泛而深入的研究，结果发现：用化合物(1)呋喃并吲哚类化合物(furan-p-indole compounds，FPIC)，该化合物是溶解微血栓的海洋微生物的代谢产物，该化合物作为溶血栓药即能为微血栓疾病的治疗和/或预防提供效果明显、不存在出血危险性的临床药物，从而完成本发明。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
作为本发明的第一方面，一种呋喃并吲哚类化合物，其特征在于，所述化合物具有结构式(1)，
式中，R为氨基酸残基或苯甲酸类似物(2)或苯基甘氨酸类似物(3)或二聚体类似物(4)。
所述氨基酸残基包括色氨酸残基、蛋氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、丙氨酸残基、苯丙氨酸残基、胱氨酸残基、半胱氨酸残基、精氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基、酪氨酸残基、谷氨酸残基、天门冬氨酸残基。
所述苯甲酸类似物包含对苯甲酸残基、间苯甲酸残基、间羟基苯甲酸残基、邻羟基苯甲酸残基、对羟基苯甲酸残基，具有结构式(2)，
所述苯基甘氨酸类似物包含苯基甘氨酸残基、对羟基苯甘氨酸残基和间羟基苯甘氨酸残基，每个残基又分S构型和R构型，具有结构式(3)，
所述二聚体类似物的R结构具有结构式(4)，
作为本发明的第二方面，一种呋喃并吲哚类化合物的制备方法，其特征在于，分离的海洋微生物斜面菌株FG216，所述菌株FG216分离自舟山群岛海域，属于小单胞菌属(Micromonospora sp.)，
菌株FG216(Micromonospora sp.EQZS 216)，包藏于中国典型培养物保藏中心。保藏地址：中国湖北省武汉市武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山，邮编430072。保藏日期2010年3月30日。保藏编号CCTCC NO：C22010068。
菌株FG216经种子培养、发酵培养、甲醇提取、HPLC分离(即高效液相色谱分离)、冷冻干燥步骤而得到具有溶血栓促进作用的化合物。
所述种子培养步骤：接种斜面菌株FG216的种子培养基是改良的查氏培养基，该培养基每1000ml人工海水中含有蔗糖50g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、酵母提取物1g、氯化钴0.0025g、硫酸亚铁0.015g、氯化钙0.0065g，pH 5.8经灭菌后使用。每1000ml人工海水含有氯化钠24.72g、氯化钾0.67g、氯化钙1.36g、氯化镁4.66g、硫酸镁6.29g、碳酸氢钠0.18g。
所述发酵培养步骤：上述FG216种子培养液按照1-5％的接种量分别接种于含有改良的查氏培养基的三角瓶，在25-30℃、180-240r·min-1的恒温摇床上培养4天后，添加培养基体积1％重量的赖氨酸或苯丙氨酸或鸟氨酸，培养24小时后，完成发酵培养。
所述甲醇提取步骤：培养结束后，三角瓶中加入等体积的甲醇，超声5-15min，在转速10000rpm条件下离心10-15min，弃除沉淀，上清液40-60℃条件下减压蒸馏蒸干，浓缩物真空干燥8-12h，干固物溶于少量甲醇，过滤弃除沉淀，收集上清液，再减压浓缩真空干燥，所得干固物既为含有溶血栓作用呋喃并吲哚类化合物的微生物代谢产物提取物。
所述HPLC分离步骤：上述的微生物代谢产物提取物溶于甲醇，溶解后的溶液在流动相甲醇和0.05M乙酸铵(70-85∶30-15)、流速8-10ml/min、检测波长265nm的条件下被色谱柱Sepax HP-C18柱(21.2mm×250mm，10μm)，分离出呋喃并吲哚类化合物。
所述冷冻干燥步骤：分离化合物的洗脱峰部分在50-60℃被旋转蒸发仪减压浓缩，经冷冻干燥后得到纯化的促进微血栓溶解的呋喃并吲哚类化合物。
作为本发明的第三方面，一种呋喃并吲哚类化合物的应用，其特征在于，所述呋喃并吲哚类化合物在制备治疗和/或预防缺血性疾病的药物中的应用。
所述呋喃并吲哚类化合物在制备治疗微血栓的药物中的应用。
本发明的呋喃并吲哚类化合物是通过纤溶疗法用于治疗和/或预防微血栓性疾病。纤溶疗法是指利用药物激活或提高人体的纤溶因子的活性，溶解心血管内的血栓，消除血栓性疾病症状的一种临床治疗方法。微血栓主要是指血液在人体血管内或心脏内通过内源性凝固作用形成的易于随血液流动的血栓和沉积在血管壁上影响血管壁弹性的血栓。微血栓在机体内将发展成缺血性疾病或由此引起的各种疾病，脑梗塞、脑中风等脑血管障碍及由此引起的脑功能低下、血管性痴呆、年龄伴随性脑血管组织病变等各种脑疾病。
本发明关于促进微血栓溶解的呋喃并吲哚类化合物的药理试验如下：
使用96孔圆底酶标板，在5-20μmol/L纤溶酶原、5-20μmol/L单链尿激酶型纤溶酶原激活剂、100μg/ml SUK 
构成的50-100μl[TBS(Tris-HCl Buffer Solution)/BSA(Bovine Serum Albumin，50mM Tris-HCl，100mM NaCl，and 2mg/ml BAS，pH7.4)]反应体系中，添加FPIC，在405nm连续100分钟测定游离硝基苯胺的生成引起的吸光度的增加，与对照相比，用吸光度值体现的纤溶作用被提高了2.5倍以上，该反应体系FPICl在0.08-200μmol/L范围内浓度的增加与吸光度值的增加相一致。
在含有10％血浆(不含有血小板)的in vitro(在生物体外)反应体系中，FPIC促进了纤维蛋白的降解，纤维蛋白的降解被促进了1.8倍以上。溶解于0.1-0.5mol/L碳酸氢钠(pH9.0)的100-360μl(10mg/ml)的纤维蛋白原和溶解于磷酸盐缓冲液的10-36μl(10mg/ml)FITC(fluorescein isothiocyanate isomer I)制成混合液，在25℃下保温1小时，使用由磷酸盐缓冲液平衡的葡聚糖层析柱层析该混合液，得到了FITC-纤维蛋白，即FITC-Fbg(fibrinogen)。
含有20-30μg FITC-Fbg的磷酸盐缓冲液50-100μl被分注到96孔平底酶标板的孔中，在37-40℃下保温12-24小时至干燥，向干燥的穴孔里添加25-75μl凝血酶[0.68U/ml in NaCl/NaPi(150mM NaCl and 20mM sodium phosphate， pH7.4)]，在37℃下维持1-3小时后，用含有0.1-0.6％Tween 80的NaCl/NaPi和不含有0.1-0.6％Tween 80的NaCl/NaPi分别洗净2次和1次，随后添加5mg/ml胎儿皮肤胶原蛋白的NaCl/NaPi溶液200μl，在37-40℃下保温0.5-1小时，弃除缓冲液后被用于纤溶活性的测定。
含有10％血浆(不含有血小板)的TBS/BSA 100μl、0.1nM单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和样品(0-14μg/ml)被顺次添加到上述穴孔里，每一个样品重复3次，在37℃下保温1小时，使用荧光分光光度计在激发波长494nm和检测波长520nm测定了FITC-纤维蛋白(FITC-Fbg)的分解量，与对照相比，6.0μM以上FPIC提高FITC-Fbg的降解1.8倍以上。
本发明的化合物的溶血栓作用如下：
利用FITC-Fbg建立肺血栓大白鼠模型，将本发明的呋喃并吲哚类化合物从尾静脉投与肺血栓大白鼠，发现大白鼠血浆中荧光强度和血栓降解产物的经时变化，从组织形态学能观察到肺血栓的溶解。
将本发明的化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/k g注射到大白鼠肺栓塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的血浆荧光值在0.75-24h发生了显著地变化。本发明的活性呋喃并吲哚类化合物被投与FITC-Fbg肺血栓动物模型后，与对照相比血浆荧光值迅速升高，在浓度适宜时(如5mg/kg)，血浆荧光值会维持在较高的水平，更高浓度(10mg/kg)的本发明的化合物带来了血浆荧光值的更大增加。阳性对照的血浆荧光值的变化和添加本化合物的荧光值的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓被溶解。
将本发明的呋喃并吲哚类化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/kg注射到大白鼠肺栓塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的血栓降解产物体现于电泳图谱上在0.75-24h发生了显著的变化。本发明的活性呋喃并吲哚类化合物被投与FITC-Fbg肺血栓动物模型后，与对照相比血栓降解产物增多，用本发明的化合物处理时间越长降解产物越多。阳性对照的血栓降解产物的变化和添加本化合物的血栓降解产物的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓通过电泳图谱显示出被溶解。
将本发明的化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/kg注射到大白鼠肺栓塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的组织形态学显示了本发明的化合物促 进了肺血栓溶解。从肺组织切片图中，观察到对照组肺泡轮廓清晰、肺泡结构完整、肺毛细血管内无血栓、肺组织无出血斑。用本发明的化合物处理的大白鼠肺栓塞动物模型与对照相比肺泡壁有增厚现象，但毛细血管内没有血栓存在，能够认为形成的血栓在纤溶活性呋喃并吲哚类化合物的作用下被溶解，但残存着肺血栓引起的组织损伤的痕迹。阳性对照的肺组织形态学的变化和添加本化合物的肺组织形态学的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓被溶解。
本发明的化合物没有急性毒性作用。
所述呋喃并吲哚类化合物制备临床治疗微血栓、急性血栓症状的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓性疾病的溶血栓制剂，以及作为临床上广泛使用的链激酶、尿激酶、瑞替普酶的协同或辅助治疗药物。
呋喃并吲哚类化合物(FPIC)具有能溶于水、易溶于多种有机溶剂的特点，针对临床上的急性血栓症状和微血栓症状，呋喃并吲哚类化合物能被做成胃肠道给药剂型和非胃肠道给药剂型，适宜于制作成溶液型或固体分散型，这两种剂型针对血栓症状，具有最大的有效性、充分的安全性、良好的可控性和优良的稳定性，能顺应病人和医护人员对这种血栓治疗药物的接受。FPIC的注射制剂以氯化钠为等渗调节剂溶于水中，溶液的浓度为1-2mg/ml，最大血药浓度应该在2-5mg/L以下的范围。固体分散型的片剂制作时以乳糖、糖粉、淀粉浆、海藻酸钠为赋型剂，每片含FPIC4-10mg。
本发明的有益效果：
本发明的呋喃并吲哚类化合物是通过纤溶疗法用于治疗和/或预防微血栓性疾病。本发明的化合物作为溶血栓制剂能临床治疗微血栓、急性血栓症状的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓性疾病，以及作为临床上广泛使用的链激酶、尿激酶、瑞替普酶的协同或辅助治疗药物。
呋喃并吲哚类化合物(FPIC)具有能溶于水、易溶于多种有机溶剂的特点，针对临床上的急性血栓症状和微血栓症状，FPIC能被做成胃肠道给药剂型和非胃肠道给药剂型，适宜于制作成溶液型或固体分散型。
本发明的化合物没有急性毒性作用。
菌株FG216 Micromonospora sp.EQZS 216。
保藏日期2010年3月30日。
保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC。
保藏编号CCTCC NO：C22010068。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
分离的海洋微生物斜面菌株FG216(分离自舟山群岛海域，属于小单胞菌属(Micromonospora sp.))经种子培养、发酵培养、甲醇提取、HPLC分离、冷冻干燥而得到具有溶血栓促进作用的化合物。
接种斜面菌株FG216的种子培养基是改良的查氏培养基，该培养基每1000ml人工海水中含有蔗糖50g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、酵母提取物1g、氯化钴0.0025g、硫酸亚铁0.015g、氯化钙0.0065g，pH 5.8经灭菌后使用。每1000ml人工海水含有氯化钠24.72g、氯化钾0.67g、氯化钙1.36g、氯化镁4.66g、硫酸镁6.29g、碳酸氢钠0.18g。
上述FG216种子培养液按照1％的接种量分别接种于含有改良的查氏培养基的三角瓶，在25℃、180r·min-1的恒温摇床上培养4天后，添加培养基体积1％重量的鸟氨酸，培养24小时后，完成发酵培养。
培养结束后，三角瓶中加入等体积的甲醇，超声15min，在转速10000rpm条件下离心15min，弃除沉淀，上清液在60℃条件下减压蒸馏蒸干，浓缩物真空干燥8h，干固物溶于少量甲醇，过滤弃除沉淀，收集上清液，再减压浓缩真空干燥，所得干固物既为含有溶血栓作用的呋喃并吲哚类化合物的微生物代谢产物提取物。
上述的微生物代谢产物提取物溶于甲醇，将溶解后的溶液过柱，流动相 甲醇和0.05M乙酸铵(70∶30)、流速10ml/min、检测波长265nm的条件下被色谱柱Sepax HP-C18柱(21.2mm×250mm，10μm)分离，目标溶血栓促进的呋喃并吲哚类化合物的保留时间是32min。
目标呋喃并吲哚类化合物的洗脱峰部分在50℃被旋转蒸发仪减压浓缩，经冷冻干燥后得到纯化的呋喃并吲哚类化合物FPIC1，如(5)所示。
本化合物促进血栓溶解的药理试验如下：
使用96孔圆底酶标板，在20μmol/L纤溶酶原、20μmol/L单链尿激酶型纤溶酶原激活剂、100μg/ml SUK 
构成的50μl[TBS(Tris-HCl Buffer Solution)/BSA(Bovine Serum Albumin，50mM Tris-HCl，100mM NaCl，and 2mg/ml BAS，pH7.4)]反应体系中，添加FPIC1，在405nm连续100分钟测定游离硝基苯胺的生成引起的吸光度的增加，与对照相比，用吸光度值体现的溶血栓作用被提高了2.5倍以上，该反应体系FPICl在0.08-200μmol/L范围内浓度的增加与吸光度值的增加相一致。
在含有10％血浆(不含有血小板)的in vitro反应体系中，FPIC1促进了纤维蛋白的降解，纤维蛋白的降解被促进了1.8倍以上。溶解于0.1mol/L碳酸氢钠(pH9.0)的360μl(10mg/ml)的纤维蛋白原和溶解于磷酸盐缓冲液的36μl(10mg/ml)FITC(fluorescein isothiocyanate isomer I)混合，在25℃下保温1小时，使用由磷酸盐缓冲液平衡的葡聚糖层析柱层析该混合液，得到了FITC-Fbg(fibrinogen)。
含有20μg FITC-Fbg的磷酸盐缓冲液100μl被分注到96孔平底酶标板的孔中，在37℃下保温12小时至干燥，向干燥的穴孔里添加25μl凝血酶[0.68 U/ml in NaCl/NaPi(150mM NaCl and 20mM sodium phosphate，pH7.4)]，在37℃下维持3小时后，用含有0.1％Tween 80的NaCl/NaPi和不含有0.1％Tween 80的NaCl/NaPi分别洗净2次和1次，随后添加5mg/ml胎儿皮肤胶原蛋白的NaCl/NaPi溶液200μl，在37℃下保温1小时，弃除缓冲液后被用于纤溶活性的测定。
含有10％血浆(不含有血小板)的TBS/BSA 100μl、0.1nM单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和样品(0-14μg/ml)被顺次添加到上述穴孔里，每一个样品重复3次，在37℃下保温1小时，使用荧光分光光度计在激发波长494nm和检测波长520nm测定了FITC-纤维蛋白的分解量，与对照相比，6.0μM以上FPIC1提高FITC-Fibrin的降解1.8倍以上。
本发明的化合物的溶血栓作用如下：
利用FITC-Fbg建立肺血栓大白鼠模型，将本发明的化合物FPIC从尾静脉投与肺血栓大白鼠，发现大白鼠血浆中荧光强度和血栓降解产物的经时变化，从组织形态学能观察到肺血栓的溶解。
将本发明的化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/kg注射到大白鼠肺栓塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的血浆荧光值在0.75-24h发生了显著地变化。本发明的活性化合物被投与FITC-Fbg肺血栓动物模型后，与对照相比血浆荧光值迅速升高，在浓度适宜时(如5mg/kg)，血浆荧光值会维持在较高的水平，更高浓度(10mg/kg)的本发明的化合物带来了血浆荧光值的更大增加。阳性对照的血浆荧光值的变化和添加本化合物的荧光值的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓被溶解。
将本发明的化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/kg注射到大白鼠肺栓塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的血栓降解产物体现于电泳图谱上在0.75-24h发生了显著的变化。本发明的活性化合物被投与FITC-Fbg肺血栓动物模型后，与对照相比血栓降解产物增多，用本发明的化合物处理时间越长降解产物越多。阳性对照的血栓降解产物的变化和添加本化合物的血栓降解产物的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓通过电泳图谱显示出被溶解。
将本发明的化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/kg注射到大白鼠肺栓 塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的组织形态学显示了本发明的化合物促进了肺血栓溶解。从肺组织切片图中，观察到对照组肺泡轮廓清晰、肺泡结构完整、肺毛细血管内无血栓、肺组织无出血斑。用本发明的化合物处理的大白鼠肺栓塞动物模型与对照相比肺泡壁有增厚现象，但毛细血管内没有血栓存在，能够认为形成的血栓在纤溶活性化合物FPIC的作用下被溶解，但残存着肺血栓引起的组织损伤的痕迹。阳性对照的肺组织形态学的变化和添加本化合物的肺组织形态学的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓被溶解。
本发明的化合物没有急性毒性作用。
本发明的化合物作为溶血栓制剂能临床治疗微血栓、急性血栓症状的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓性疾病，以及作为临床上广泛使用的链激酶、尿激酶、瑞替普酶的协同或辅助治疗药物。
FPIC1具有能溶于水、易溶于多种有机溶剂的特点，针对临床上的急性血栓症状和微血栓症状，FPIC1能被做成胃肠道给药剂型和非胃肠道给药剂型，适宜于制作成溶液型或固体分散型，这两种剂型针对血栓症状，具有最大的有效性、充分的安全性、良好的可控性和优良的稳定性，能顺应病人和医护人员对这种血栓治疗药物的接受。FPIC1的注射制剂以氯化钠为等渗调节剂溶于水中，溶液的浓度为1-2mg/ml，最大血药浓度应该在2-5mg/L以下的范围。固体分散型的片剂制作时以乳糖、糖粉、淀粉浆、海藻酸钠为赋型剂，每片含FPIC4-10mg。
FPIC 1在模拟纤溶反应体系和in vitro纤溶反应体系的特异性纤溶促进作用，并且模拟纤溶反应体系对纤溶作用的代表性和in vitro纤溶反应体系作为体内纤溶作用的真实性，保证FPIC1作为溶血栓药物能临床治疗微血栓、急性血栓的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓疾病，以及作为临床上广泛使用的链激酶、尿激酶、瑞普替酶的协同或辅助治疗药物。
液体制剂的制备过程是：取处方总量1/2-3/4量的水500-750ml，加入称量的FPIC1000-2000mg，加入等渗调节剂氯化钠5-9g，过滤，通过过滤器加水至1000ml，灌封于5ml的安瓿中，在100℃流通蒸汽中灭菌30min。
固体分散剂的片剂制备过程是：将乳糖88.8g、糖粉38.0g和适量的17％ 淀粉糖浆制成空白颗粒，将FPIC1制成10-20％的乙醇溶液，拌于空白颗粒的细粉中，于30-40℃干燥50-60min，在与事先制成的空白颗粒及海藻酸钠混匀，压片，得到FPIC1的药物片剂。
实施例2
分离的海洋微生物斜面菌株FG216(分离自舟山群岛海域，属于小单胞菌属(Micromonospora sp.))经种子培养、发酵培养、甲醇提取、HPLC分离、冷冻干燥而得到具有溶血栓促进作用的化合物。
接种斜面菌株FG216的种子培养基是改良的查氏培养基，该培养基每1000ml人工海水中含有蔗糖50g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、酵母提取物1g、氯化钴0.0025g、硫酸亚铁0.015g、氯化钙0.0065g，pH 5.8经灭菌后使用。每1000ml人工海水含有氯化钠24.72g、氯化钾0.67g、氯化钙1.36g、氯化镁4.66g、硫酸镁6.29g、碳酸氢钠0.18g。
上述FG216种子培养液按照1％的接种量分别接种于含有改良的查氏培养基的三角瓶，在25℃、180r·min-1的恒温摇床上培养4天后，添加培养基体积1％重量的赖氨酸，培养24小时后，完成发酵培养。
培养结束后，三角瓶中加入等体积的甲醇，超声10min，在转速10000rpm条件下离心10min，弃除沉淀，上清液在60℃条件下减压蒸馏蒸干，浓缩物真空干燥12h，干固物溶于少量甲醇，过滤弃除沉淀，收集上清液，再减压浓缩真空干燥，所得干固物既为含有溶血栓作用化合物的微生物代谢产物提取物。
上述的微生物代谢产物提取物溶于甲醇，将溶解后的溶液过柱，在流动相甲醇和0.05M乙酸铵(85∶15)、流速10ml/min、检测波长265nm的条件下被色谱柱Sepax HP-C18柱(21.2mm×250mm，10μm)分离，目标溶血栓促进化合物的保留时间是17min。
目标溶血栓促进化合物的洗脱峰部分在50℃被旋转蒸发仪减压浓缩，经冷冻干燥后得到纯化的促进微血栓溶解的化合物FPIC2，如(6)所示。
本化合物促进血栓溶解的药理试验如下：
使用96孔圆底酶标板，在20μmol/L纤溶酶原、20μmol/L单链尿激酶型纤溶酶原激活剂、100μg/ml SUK 
构成的50μl[TBS(Tris-HCl Buffer Solution)/BSA(Bovine Serum Albumin，50mM Tris-HCl，100mM NaCl，and 2mg/ml BAS，pH7.4)]反应体系中，添加FPIC2，在405nm连续100分钟测定游离硝基苯胺的生成引起的吸光度的增加，与对照相比，用吸光度值体现的溶血栓作用被提高了2.5倍以上，该反应体系FPIC2在0.08-200μmol/L范围内浓度的增加与吸光度值的增加相一致。
在含有10％血浆(不含有血小板)的in vitro反应体系中，FPIC2促进了纤维蛋白的降解，纤维蛋白的降解被促进了1.9倍以上。溶解于0.1mol/L碳酸氢钠(pH9.0)的360μl(10mg/ml)的纤维蛋白原和溶解于磷酸盐缓冲液的36μl(10mg/ml)FITC(fluorescein isothiocyanate isomer I)混合，在25℃下保温0.5小时，使用由磷酸盐缓冲液平衡的葡聚糖层析柱层析该混合液，得到了FITC-Fbg(fibrinogen)。
含有20μg FITC-Fbg的磷酸盐缓冲液100μl被分注到96孔平底酶标板的孔中，在37℃下保温12小时至干燥，向干燥的穴孔里添加25μl凝血酶[0.68U/ml in NaCl/NaPi(150mM NaCl and 20mM sodium phosphate，pH7.4)]，在37℃下维持3小时后，用含有0.1％Tween 80的NaCl/NaPi和不含有0.1％Tween 80的NaCl/NaPi分别洗净2次和1次，随后添加5mg/ml胎儿皮肤胶原蛋白的NaCl/NaPi溶液200μl，在37℃下保温1小时，弃除缓冲液后被用于纤溶活性的测定。
含有10％血浆(不含有血小板)的TBS/BSA 100μl、0.1nM单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和样品(0-14μg/ml)被顺次添加到上述穴孔里，每 一个样品重复3次，在37℃下保温1小时，使用荧光分光光度计在激发波长494nm和检测波长520nm测定了FITC-纤维蛋白的分解量，与对照相比，6.0μM以上FPIC2提高FITC-Fibrin的降解1.9倍以上。
本发明的化合物的溶血栓作用如下：
利用FITC-Fbg建立肺血栓大白鼠模型，将本发明的化合物FPIC从尾静脉投与肺血栓大白鼠，发现大白鼠血浆中荧光强度和血栓降解产物的经时变化，从组织形态学能观察到肺血栓的溶解。
将本发明的化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/kg注射到大白鼠肺栓塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的血浆荧光值在0.75-24h发生了显著地变化。本发明的活性化合物被投与FITC-Fbg肺血栓动物模型后，与对照相比血浆荧光值迅速升高，在浓度适宜时(如5mg/kg)，血浆荧光值会维持在较高的水平，更高浓度(10mg/kg)的本发明的化合物带来了血浆荧光值的更大增加。阳性对照的血浆荧光值的变化和添加本化合物的荧光值的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓被溶解。
将本发明的化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/kg注射到大白鼠肺栓塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的血栓降解产物体现于电泳图谱上在0.75-24h发生了显著的变化。本发明的活性化合物被投与FITC-Fbg肺血栓动物模型后，与对照相比血栓降解产物增多，用本发明的化合物处理时间越长降解产物越多。阳性对照的血栓降解产物的变化和添加本化合物的血栓降解产物的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓通过电泳图谱显示出被溶解。
将本发明的化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/kg注射到大白鼠肺栓塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的组织形态学显示了本发明的化合物促进了肺血栓溶解。从肺组织切片图中，观察到对照组肺泡轮廓清晰、肺泡结构完整、肺毛细血管内无血栓、肺组织无出血斑。用本发明的化合物处理的大白鼠肺栓塞动物模型与对照相比肺泡壁有增厚现象，但毛细血管内没有血栓存在，能够认为形成的血栓在纤溶活性化合物FPIC的作用下被溶解，但残存着肺血栓引起的组织损伤的痕迹。阳性对照的肺组织形态 学的变化和添加本化合物的肺组织形态学的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓被溶解。
本发明的化合物没有急性毒性作用。
本发明的化合物作为溶血栓制剂能临床治疗微血栓、急性血栓症状的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓性疾病，以及作为临床上广泛使用的链激酶、尿激酶、瑞替普酶的协同或辅助治疗药物。
FPIC2具有能溶于水、易溶于多种有机溶剂的特点，针对临床上的急性血栓症状和微血栓症状，FPIC 1能被做成胃肠道给药剂型和非胃肠道给药剂型，适宜于制作成溶液型或固体分散型，这两种剂型针对血栓症状，具有最大的有效性、充分的安全性、良好的可控性和优良的稳定性，能顺应病人和医护人员对这种血栓治疗药物的接受。FPIC2的注射制剂以氯化钠为等渗调节剂溶于水中，溶液的浓度为1-2mg/ml，最大血药浓度应该在2-5mg/L以下的范围。固体分散型的片剂制作时以乳糖、糖粉、淀粉浆、海藻酸钠为赋型剂，每片含FPIC4-10mg。
FPIC2在模拟纤溶反应体系和in vitro纤溶反应体系的特异性纤溶促进作用，并且模拟纤溶反应体系对纤溶作用的代表性和in vitro纤溶反应体系作为体内纤溶作用的真实性，保证FPIC1作为溶血栓药物能临床治疗微血栓、急性血栓的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓疾病，以及作为临床上广泛使用的链激酶、尿激酶、瑞普替酶的协同或辅助治疗药物。
液体制剂的制备过程是：取处方总量1/2-3/4量的水500-750ml，加入称量的FPIC21000-2000mg，加入等渗调节剂氯化钠5-9g，过滤，通过过滤器加水至1000ml，灌封于5ml的安瓿中，在100℃流通蒸汽中灭菌30min。
固体分散剂的片剂制备过程是：将乳糖88.8g、糖粉38.0g和适量的17％淀粉糖浆制成空白颗粒，将FPIC2制成10-20％的乙醇溶液，拌于空白颗粒的细粉中，于40℃干燥50min，在与事先制成的空白颗粒及海藻酸钠混匀，压片，得到FPIC2的药物片剂。
实施例3
分离的海洋微生物斜面菌株FG216(分离自舟山群岛海域，属于小单胞菌属(Micromonospora sp.))经种子培养、发酵培养、甲醇提取、HPLC分离、冷冻干燥而得到具有溶血栓促进作用的化合物。
接种斜面菌株FG216的种子培养基是改良的查氏培养基，该培养基每1000ml人工海水中含有蔗糖50g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、酵母提取物1g、氯化钴0.0025g、硫酸亚铁0.015g、氯化钙0.0065g，pH 5.8经灭菌后使用。每1000ml人工海水含有氯化钠24.72g、氯化钾0.67g、氯化钙1.36g、氯化镁4.66g、硫酸镁6.29g、碳酸氢钠0.18g。
上述FG216种子培养液按照1％的接种量分别接种于含有改良的查氏培养基的三角瓶，在25℃、180r·min-1的恒温摇床上培养4天后，添加培养基体积1％重量的苯甲酸，培养24小时后，完成发酵培养。
培养结束后，三角瓶中加入等体积的甲醇，超声10min，在转速10000rpm条件下离心10min，弃除沉淀，上清液在60℃条件下减压蒸馏蒸干，浓缩物真空干燥12h，干固物溶于少量甲醇，过滤弃除沉淀，收集上清液，再减压浓缩真空干燥，所得干固物既为含有溶血栓作用化合物的微生物代谢产物提取物。
上述的微生物代谢产物提取物溶于甲醇得到的样品在流动相甲醇和0.05M乙酸铵(80∶20)、流速10ml/min、检测波长265nm的条件下被色谱柱Sepax HP-C18柱(21.2mm×250mm，10μm)分离，目标溶血栓促进化合物的保留时间是21min。
目标溶血栓促进化合物的洗脱峰部分在50℃被旋转蒸发仪减压浓缩，经冷冻干燥后得到纯化的促进微血栓溶解的化合物FPIC3，如(7)所示。
本化合物促进血栓溶解的药理试验如下：
使用96孔圆底酶标板，在20μmol/L纤溶酶原、20μmol/L单链尿激酶型纤溶酶原激活剂、100μg/ml SUK 构成的50μl[TBS(Tris-HCl Buffer Solution)/BSA(Bovine Serum Albumin，50mM Tris-HCl，100mM NaCl，and 2mg/ml BAS，pH7.4)]反应体系中，添加FPIC3，在405nm连续100分钟测定游离硝基苯胺的生成引起的吸光度的增加，与对照相比，用吸光度值体现的溶血栓作用被提高了2.1倍以上，该反应体系FPIC3在0.08-200μmol/L范围内浓度的增加与吸光度值的增加相一致。
在含有10％血浆(不含有血小板)的in vitro反应体系中，FPIC2促进了纤维蛋白的降解，纤维蛋白的降解被促进了2.1倍以上。溶解于0.1mol/L碳酸氢钠(pH9.0)的360μl(10mg/ml)的纤维蛋白原和溶解于磷酸盐缓冲液的36μl(10mg/ml)FITC(fluorescein isothiocyanate isomer I)混合，在25℃下保温0.5小时，使用由磷酸盐缓冲液平衡的葡聚糖层析柱层析该混合液，得到了FITC-Fbg(fibrinogen)。
含有20μg FITC-Fbg的磷酸盐缓冲液100μl被分注到96孔平底酶标板的孔中，在37℃下保温12小时至干燥，向干燥的穴孔里添加25μl凝血酶[0.68U/ml in NaCl/NaPi(150mM NaCl and 20mM sodium phosphate，pH7.4)]，在37℃下维持3小时后，用含有0.1％Tween 80的NaCl/NaPi和不含有0.1％Tween 80的NaCl/NaPi分别洗净2次和1次，随后添加5mg/ml胎儿皮肤胶原蛋白的NaCl/NaPi溶液200μl，在37℃下保温1小时，弃除缓冲液后被用于纤溶活性的测定。
含有10％血浆(不含有血小板)的TBS/BSA 100μl、0.1nM单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和样品(0-14μg/ml)被顺次添加到上述穴孔里，每一个样品重复3次，在37℃下保温1小时，使用荧光分光光度计在激发波长494nm和检测波长520nm测定了FITC-纤维蛋白的分解量，与对照相比，6.0μM以上FPIC3提高FITC-Fibrin的降解2.1倍以上。
本发明的化合物的溶血栓作用如下：
利用FITC-Fbg建立肺血栓大白鼠模型，将本发明的化合物FPIC从尾静脉投与肺血栓大白鼠，发现大白鼠血浆中荧光强度和血栓降解产物的经时变 化，从组织形态学能观察到肺血栓的溶解。
将本发明的化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/kg注射到大白鼠肺栓塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的血浆荧光值在0.75-24h发生了显著地变化。本发明的活性化合物被投与FITC-Fbg肺血栓动物模型后，与对照相比血浆荧光值迅速升高，在浓度适宜时(如5mg/kg)，血浆荧光值会维持在较高的水平，更高浓度(10mg/kg)的本发明的化合物带来了血浆荧光值的更大增加。阳性对照的血浆荧光值的变化和添加本化合物的荧光值的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓被溶解。
将本发明的化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/kg注射到大白鼠肺栓塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的血栓降解产物体现于电泳图谱上在0.75-24h发生了显著的变化。本发明的活性化合物被投与FITC-Fbg肺血栓动物模型后，与对照相比血栓降解产物增多，用本发明的化合物处理时间越长降解产物越多。阳性对照的血栓降解产物的变化和添加本化合物的血栓降解产物的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓通过电泳图谱显示出被溶解。
将本发明的化合物分别从尾静脉按体重2.5-10mg/kg注射到大白鼠肺栓塞动物模型，大白鼠肺栓塞动物模型的组织形态学显示了本发明的化合物促进了肺血栓溶解。从肺组织切片图中，观察到对照组肺泡轮廓清晰、肺泡结构完整、肺毛细血管内无血栓、肺组织无出血斑。用本发明的化合物处理的大白鼠肺栓塞动物模型与对照相比肺泡壁有增厚现象，但毛细血管内没有血栓存在，能够认为形成的血栓在纤溶活性化合物FPIC的作用下被溶解，但残存着肺血栓引起的组织损伤的痕迹。阳性对照的肺组织形态学的变化和添加本化合物的肺组织形态学的变化相一致。说明了添加本化合物后大白鼠肺栓塞动物模型中的血栓被溶解。
本发明的化合物没有急性毒性作用。
本发明的化合物作为溶血栓制剂能临床治疗微血栓、急性血栓症状的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓性疾病，以及作为临床上广泛使用的链激酶、尿激酶、瑞替普酶的协同或辅助治疗药物。
FPIC3具有能溶于水、易溶于多种有机溶剂的特点，针对临床上的急性血 栓症状和微血栓症状，FPIC1能被做成胃肠道给药剂型和非胃肠道给药剂型，适宜于制作成溶液型或固体分散型，这两种剂型针对血栓症状，具有最大的有效性、充分的安全性、良好的可控性和优良的稳定性，能顺应病人和医护人员对这种血栓治疗药物的接受。FPIC2的注射制剂以氯化钠为等渗调节剂溶于水中，溶液的浓度为1-2mg/ml，最大血药浓度应该在2-5mg/L以下的范围。固体分散型的片剂制作时以乳糖、糖粉、淀粉浆、海藻酸钠为赋型剂，每片含FPIC4-10mg。
FPIC3在模拟纤溶反应体系和in vitro纤溶反应体系的特异性纤溶促进作用，并且模拟纤溶反应体系对纤溶作用的代表性和in vitro纤溶反应体系作为体内纤溶作用的真实性，保证FPICl作为溶血栓药物能临床治疗微血栓、急性血栓的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓疾病，以及作为临床上广泛使用的链激酶、尿激酶、瑞普替酶的协同或辅助治疗药物。
液体制剂的制备过程是：取处方总量1/2-3/4量的水500-750ml，加入称量的FPIC3 1000-2000mg，加入等渗调节剂氯化钠5-9g，过滤，通过过滤器加水至1000ml，灌封于5ml的安瓿中，在100℃流通蒸汽中灭菌30min。
固体分散剂的片剂制备过程是：将乳糖88.8g、糖粉38.0g和适量的17％淀粉糖浆制成空白颗粒，将FPIC3制成10-20％的乙醇溶液，拌于空白颗粒的细粉中，于40℃干燥50min，在与事先制成的空白颗粒及海藻酸钠混匀，压片，得到FPIC3的药物片剂。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (15)
1.一种呋喃并吲哚类化合物，其特征在于，所述化合物具有结构式(1)，
式中，R为氨基酸残基或苯甲酸类似物或苯基甘氨酸类似物或二聚体类似物。
2.根据权利要求1所述的呋喃并吲哚类化合物，其特征在于，所述氨基酸残基包括色氨酸残基、蛋氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、丙氨酸残基、苯丙氨酸残基、胱氨酸残基、半胱氨酸残基、精氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基、酪氨酸残基、谷氨酸残基、天门冬氨酸残基。
3.根据权利要求1所述的呋喃并吲哚类化合物，其特征在于，所述苯甲酸类似物包含对苯甲酸残基、间苯甲酸残基、间羟基苯甲酸残基、邻羟基苯甲酸残基、对羟基苯甲酸残基，具有结构式(2)，
4.根据权利要求1所述的呋喃并吲哚类化合物，其特征在于，所述苯基甘氨酸类似物包含苯基甘氨酸残基、对羟基苯甘氨酸残基和间羟基苯甘氨酸残基，每个残基又分S构型和R构型，具有结构式(3)，
5.根据权利要求1所述的呋喃并吲哚类化合物，其特征在于，所述二聚体类似物的R结构具有结构式(4)，
6.一种如权利要求1所述的呋喃并吲哚类化合物的制备方法，其特征在于，分离的海洋微生物斜面菌株FG216，所述菌株FG216分离自舟山群岛海域，属于小单胞菌属(Micromonospora sp.)，经种子培养、发酵培养、甲醇提取、HPLC分离(即高效液相色谱分离)、冷冻干燥步骤而得到具有溶血栓促进作用的化合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养步骤：接种斜面菌株FG216的种子培养基是改良的查氏培养基，该培养基每1000ml人工海水中含有蔗糖50g、硝酸钠3g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、酵母提取物1g、氯化钴0.0025g、硫酸亚铁0.015g、氯化钙0.0065g，pH 5.8经灭菌后使用。每1000ml人工海水含有氯化钠24.72g、氯化钾0.67g、氯化钙1.36g、氯化镁4.66g、硫酸镁6.29g、碳酸氢钠0.18 g。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养步骤：上述FG216种子培养液按照1-5％的接种量分别接种于含有改良的查氏培养基的三角瓶，在25-30℃、180-240r·min-1的恒温摇床上培养4天后，添加培养基体积1％重量的赖氨酸或苯丙氨酸或鸟氨酸，培养24小时后，完成发酵培养。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述甲醇提取步骤：培养结束后，三角瓶中加入等体积的甲醇，超声5-15min，在转速10000rpm条件下离心10-15min，弃除沉淀，上清液40-60℃条件下减压蒸馏蒸干，浓缩物真空干燥8-12h，干固物溶于少量甲醇，过滤弃除沉淀，收集上清液，再减压浓缩真空干燥，所得干固物既为含有溶血栓作用呋喃并吲哚类化合物的微生物代谢产物提取物。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述HPLC分离步骤：上述的微生物代谢产物提取物溶于甲醇，溶解后的溶液在流动相甲醇和0.05M乙酸铵(70-85∶30-15)、流速8-10ml/min、检测波长265nm的条件下被色谱柱Sepax HP-C18柱(21.2mm×250mm，10μm)，分离出呋喃并吲哚类化合物。
11.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥步骤：分离化合物的洗脱峰部分在50-60℃被旋转蒸发仪减压浓缩，经冷冻干燥后得到纯化的促进微血栓溶解的呋喃并吲哚类化合物。
12.一种如权利要求1所述的呋喃并吲哚类化合物的应用，其特征在于，所述呋喃并吲哚类化合物在制备治疗和/或预防缺血性疾病的药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述呋喃并吲哚类化合物制备临床治疗微血栓、急性血栓症状的肺血栓、脑血栓和心肌梗塞等血栓性疾病的溶血栓制剂。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述呋喃并吲哚类化合物制作成溶液型。
15.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述呋喃并吲哚类化合物制作成固体分散型。
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