CN103391785A - 替萘普酶的药用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于治疗急性缺血性中风的与已知组合物相比具有最佳安全性和有效性的普奈普酶药用组合物。本发明组合物的发明基于采用不同量的TNK进行一系列试验，该试验还分离特定量的TNK，所述特定量为治疗急性缺血性中风所需的TNK的最佳量。

Description

替萘普酶的药用组合物
技术领域
本发明涉及被称为替萘普酶(TNK)的人组织纤溶酶原激活剂衍生物的药用组合物，该药用组合物用于治疗导致主要或次要类型的中风的脑动脉栓塞，例如急性缺血性中风(AIS)。本发明还涉及与已知治疗药物相比具有最佳效能和安全性的制剂，这可以通过对含有特定量的作为活性成分的TNK的所述组合物进行临床试验进行判断。
背景技术
组织纤溶酶原激活剂(TPA)参与了血液循环系统中非特定血凝块的分解。TNK是TPA的衍生物，其中对天然序列中的7个氨基酸进行了修饰从而使得新分子对纤维蛋白具有特异性并改变了其药代动力学特性，并由此使药效动力学效果发生了改变。TNK是分子量为70KDa的527个氨基酸的酸性糖蛋白。它已经被批准作为药物用于治疗急性心肌梗塞和某些其它血栓形成以及不同器官中与血管破裂有关的栓塞。最近，考虑其可以用于治疗急性缺血性中风，进行了该适应症的多个临床试验，但是这些试验对于TNK用于治疗AIS的安全且有效的剂量还没有获得任何结论性的证据。
纤溶酶原激活剂是能够激活纤溶酶原从而产生能够使得纤维蛋白降解的丝氨酸蛋白酶纤溶酶的酶。用作药物的纤溶酶原激活剂包括：a)链激酶[一种细菌蛋白]，b)尿激酶，[一种在肾脏中合成的酶]和c)人组织纤溶酶原激活剂[一种血管内皮组织产生的酶]。还有开发其它可能成为溶解纤维蛋白药物的酶。这些激活剂的作用机制有所不同：链激酶能够与产生纤溶酶活性的纤溶酶原形成复合物，尿激酶能够直接裂解纤溶酶原，TPA能够与纤维蛋白和纤溶酶原形成三元复合物使得纤溶酶原激活和凝块在位溶解。天然的人TPA血浆半衰期通常为8－10分钟。然而，希望延长半衰期从而可以在较短的时间内实施纤维蛋白溶解疗法，获得了更好的疗效。因此，多个氨基酸和蛋白质的缺失突变体被制备出来并对其超出TPA的改善特性进行了实验。TNK具有6个突变，与tPA相比，其半衰期延长2倍，达20－24分钟，改善了其特性，例如对纤维蛋白凝块的特异性提高，同时对纤溶酶原激活剂抑制剂-1的亲和力降低。
TNK首先公开于US5385732，它通过DNA重组技术采用已确立的哺乳动物细胞系制备。多个其它专利覆盖了TNK制备和应用的不同方面，包括US5728567、US5714145、US5366886、US5094953、US5407819和US6506598。US5407819公开了通过氨基酸序列中特定氨基酸的置换而制备TPA变异体的方法。US5612029公开了TPA的一种变异体，它可以在野生型人TPA序列的103－105上的任何位置糖基化并且在117位置上不存在功能性糖结构。US5520911公开了编码TPA变异体的DNA序列的制备。US5424198公开了通过采用突变型或野生型DHFR基因以及tPA基因组合转换而生产TPA的方法。这些和多个其它文件也涵盖了多种医学疾病或适应症，其中TNK可以用作药物治疗血栓形成。US20080107641包含的疾病之一为AIS。然而，该申请没有公开确定用于治疗人类患者AIS的安全和有效量的TNK的任何方法。相反，在无需给出对已确定的有效量进行测定和评价的任何具体方法的情况下，即可可以根据现有数据库的理论模型预测使用安全剂量。因此，目前的现有技术不能满足对TNK用于治疗AIS以及有效药用组合物(制剂)用于治疗AIS的安全和有效量判断的需要。本发明满足了上述需要并提供了用于在人类患者中治疗AIS的TNK的改善的且更有效的制剂，它是安全的并且易于在短时间内给药。
有许多研究提及了TNK在治疗AIS中的应用，然而，它们未能公开其中所含有的TNK的量与本申请公开的制剂具有相同安全性和有效性(相对于副作用而言)的TNK的任何制剂。另外，用于制备制剂的TNK采用灌流连续发酵系统(perfusion-based continuous fermentation system)的新技术制备，该技术以前没有被用于制备TNK蛋白质。
采用TNK治疗AIS的各种制剂是已知的。然而，到目前为止没有一种制剂经过风险效益分析被任何药品管理机构认可为是安全和有效的。由于认识到这种缺陷，所以本申请公开的TNK制剂具有治疗AIS的安全和有效药物所期望的特性。在本申请中公开的用于制备高纯度TNK的方法的某些方面在本领域中是已知的。然而，本申请中采用的用于生产、制备、筛选、试验并且特别是临床判断用于AIS治疗的TNK制剂的多个新原理在本领域中是未知的。
发明内容
本发明的主要目的是判断在人类患者中用于治疗AIS的TNK的有效和安全量。本发明的另一个目的是开发可以安全且有效地在人类患者中治疗AIS的TNK的制剂。本发明的另一个目的是进行临床试验以确定安全和有效治疗AIS的TNK的量。本发明的另一个目的是采用灌流发酵技术进行TNK的重组体生产以便于达到上述目的。
概述
通过在灌流连续发酵系统中采用重组DNA技术在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行TNK的生产。该方法提供了高质量和大规模生产蛋白质的方法，此外还具有可以被放大到工业化生产应用的优点。制备并筛选生产作为分泌蛋白的TNK的重组细胞系，用于生产具有期望特性的TNK，该TNK可以用于制备在人类患者中治疗AIS的TNK制剂。具有不同量的TNK的这些制剂在临床环境下进行试验以确定在人类患者中对AIS进行优化治疗所需要的TNK的安全和有效量。本发明公开了能够提供安全和有效地治疗AIS的TNK的量的临床试验数据。TNK采用灌流连续发酵系统制备。在第一部分中，采用分子和细胞生物学技术制备哺乳动物细胞系(CHO)。然后对这些细胞系分泌TNK的表达水平进行筛选，分离高TNK表达的细胞系，用于进一步开发药用级TNK的生产方法。在第二部分中，使产生TNK的细胞在灌流连续发酵系统中生长以用于大规模产生TNK，收集并储存已经使用过的培养液留待进一步处理。在第三部分中，收集物经色谱步骤纯化以获得高纯度和有效的TNK，该物质作为活性成分用于进一步制备临床用制剂。在第四部分中，制备了一系列TNK制剂并在生物学实验中研究了其各种参数，如稳定性、效能和其它药理学特性。在第五部分中，在临床试验中测试了制备的TNK制剂以确定在受某些疾病影响的患者中治疗AIS所需要的TNK的安全和有效量。这些研究确定了以可注射制剂安全和有效地使用TNK治疗AIS所需要的一系列参数。
详述
医学和药理学领域中的技术人员应当理解，为了获得安全和有效的药用组合物，较好的策略是开发活性成分与不同赋形剂结合的多种制剂并在目标疾病中对其进行试验，从而可以判断新药物对特定适应症的安全和有效剂量。赋形剂的作用是非常重要的，因为它们提供了额外的特性，例如稳定性、易于传递、体积等。本发明的主要目的是开发一种改良的TNK制剂，用作在人类患者中治疗急性缺血性中风的药用组合物，其安全和有效性超过现有制剂。本发明的另一个目的涉及采用具体量的TNK进行临床试验的用途，用于确定在治疗AIS时TNK的安全和有效量。另外，现在仍然无法完全理解重组DNA技术、工艺开发和生产等多方面的问题，它们影响了最终产品的产率和特性。因此，需要新的制备rDNA产品的方法，该方法对现有方法和技术进行了改良。本发明的目的是提供安全和有效的药用组合物/制剂，用于治疗人类急性缺血性中风，其中TNK制备自CHO细胞系，该细胞系为重新开发的并在灌流连续发酵系统中用于大规模生产TNK。
在第一部分中，制备以较高水平表达作为分泌蛋白的TNK的CHO细胞系。采用的分子生物学、生物化学和分析技术是本领域中的标准方法，已经被常规使用。用于制备表达细胞系的哺乳动物表达质粒含有CMV启动子/增强子元件，之后是TNK人工基因，然后是转录终止的SV40 poly-A尾部。相同的质粒也含有在SV40启动子控制下的DHFR基因，以SV40poly-A尾部作为结尾。该质粒被转染至对天然DHFR基因(CHO-DHFR-细胞系)阴性的(negative)CHO细胞中。分离一种具有高水平TNK表达的细胞系并将其进一步使用(实施例1和2)。
在第二部分中，采用表达TNK的CHO细胞在灌流连续发酵系统中大规模制备TNK。将约6－12×109个细胞固化在灌流生物反应器的反应器核芯中。使这些细胞在含有FBS的IMDM培养基中生长约数天，直到需要的细胞以恒化模式在约1－2gm/L的恒定葡萄糖浓度下成熟。在生产阶段，将培养基更换为不含FBS的CHO-S-SFM II，发酵在供给葡萄糖的条件下持续进行数月，同时在捕获培养基中产生一定浓度的粗品TNK产物，用于下游进一步处理。在无菌容器中收集捕获培养基并于4℃储存直到在随后的纯化步骤中使用(实施例3、5和7)。
在第三部分中，将含有粗品TNK的捕获培养基进行一系列色谱步骤处理。这些处理步骤包括染料－亲合捕获步骤、随后的赖氨酸－亲合纯化步骤以及最后的离子交换精化步骤。表A描述了色谱纯化的不同步骤，通过SDS－PAGE光密度法/HPSEC测定，说明该纯化使得纯化的蛋白的量增加了数倍。在捕获的液体培养基经纯化方法处理之前，它含有约80%的TNK蛋白。在最终的离子交换色谱步骤(IEC)结束时，蛋白的纯度至少为95%。在本申请所述方法中使用的用于亲合、离子交换和凝胶过滤步骤的树脂类型可以采用具有类似特性的其它树脂代替。本申请所述纯化方法是用于制备治疗AIS的TNK的纯化方法的举例说明，并非限定仅使用本申请公开的色谱树脂类型，其它分离介质同样可以有效地使用。该批TNK以约5mg/mL的浓度于-80℃储存(实施例4、5和7)。
表A：TNK纯度的提高
色谱步骤 TNK的量/ML TNK的纯度%
捕获 10μg ～80%
DAC-1 0.5mg ～90%
LAC-2 2mg ～92%
IEC-3 5mg ～95%
在第四部分中，在每10ml小瓶中以0.10－0.24mg/mL的浓度范围以冻干形式制备该批TNK溶液的各种制剂。在一类制剂中，各成分的比例为1份TNK、11份L-精氨酸、3.4份磷酸和0.086份聚山梨醇酯-20，制成冻干粉末。这些制剂经过常规实验，用于TNK治疗AIS的临床评价(实施例6)。
在第五部分中，在包括约35名受困扰的患者的多中心、开放标签试验中，评价了TNK制剂在治疗AIS的临床试验中的疗效。采用该试验获得的数据表明，获得了治疗AIS所需要的TNK的安全和有效量(实施例8)。
通过下面的实施例说明上面详述的本发明，以便于说明本发明的实用性。从制备与TNK类似的蛋白质的组合物/制剂的更广泛应用的意义上讲，下面的实施方案不以任何方式限制本发明。本发明的教导也可以用于tPA类似物蛋白质的制备。附图是说明性的，就制备和配制制剂的蛋白质的质量和纯度而言，这些附图不限制本发明的更广泛的应用。
附图说明
图1：在纯化组分中TNK含量的银染色的还原SDS－PAGE谱－1)分子量标记物(自底部开始分别为：21、31、45、66和96kDa)；2)捕获的液体培养基；3)DAC后的E-1；4)LAC后的E-2；5)IEC后的E-3；6)标准品。
图2：在纯化组分中TNK含量的银染色的非还原SDS－PAGE图－1)分子量标记物(自底部开始：21、31、45、66和96kDa)；2)捕获的液体培养基；3)DAC后的E-1；4)LAC后的E-2；5)IEC后的E-3；6)标准品。
图3：最终色谱步骤后非还原TNK的说明性HPSEC图：TNK肽(保留时间：26.653min.)的纯度超过99%。
图4：最终色谱步骤后还原TNK的说明性HPSEC图：TNK肽、单链(保留时间：25.093min.)，TNK肽、双链(保留时间：29.247min.)。
图5：用于TNK生物活性测定的说明性标准曲线。
具体实施方式
实施例
实施例1：分子生物学、生物化学和分析方法
在此过程中使用的通用分子生物学、生物化学和分析方法在本领域中是已知的。可以采用常规技术，因为在公开的文献中可以获知这些技术，因此不再加以描述。作为细菌宿主细胞的菌株可以获自E.coli K-12，用于制备表达载体的质粒和DNA元件可以自常规可获得的质粒获取，或者可以自己设计并合成，然后整合以制备需要的元件。用于制备人工TNK基因的肽序列为天然人类tPA序列，具有下列氨基酸改变：Thr103Asn、Asn117Gln、Lys296Ala、His297Ala、Age298Ala和Age299Ala
[MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRRGARSYQVICRDEKTQMIYQQHQSWLRPVLRSNRVEYCW
CNSGRAQCHSVPVKSCSEPRCFNGGTCQQALYFSDFVCQCPEGFAGKCCEIDTRATCYEDQGISYRGTWSTA
ESGAECTNWNSSALAQKPYSGRRPDAIRLGLGNHNYCRNPDRDSKPWCYVFKAGKYSSEFCSTPACSEGNS
DCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGNVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKN
RRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAH
CFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLP
PADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQAN
LHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP].所有后来合成的DNA元件均是基于该序列并采用标准方法整合至克隆和哺乳动物表达载体中。为了确认这些元件的同一性和完整性，进行DNA测序，手工校正序列。
实施例2：用于表达TNK的哺乳动物细胞系的制备
人工合成具有上述6个突变的人tPA基因的人工TNK DNA序列。将该序列在质粒载体中克隆，该载体具有能够在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中有效地过度表达蛋白质的元件，该蛋白在培养基中作为分泌蛋白产生。在载体中，CMV增强子/启动子元件后面是TNK人工基因，再后面是SV40polyA转录终止元件。相同的质粒也能够表达DHFR基因，该基因表达受到SV40早期启动子和作为独立顺反子的SV40polyA终止子的控制。DHFR基因在重组CHO细胞中也用作表达标识物，用于检测TNK阳性细胞。将载体转染至二氢叶酸还原酶(DHFR)阴性(negative)CHO细胞系(DUKxB11)，分离强劲表达分泌的TNK的基因组整合的稳定的克隆。采用Western印迹法和SDS－PAGE分析方法检测在各种选择的克隆中的TNK表达水平，随后通过定量RT－PCR方法建立能够稳定和强劲表达蛋白质的细胞系。采用具有良好TNK产率的一种细胞系创建主细胞库，然后自主细胞库制备工作细胞库，用于大规模灌流发酵上游过程。对每个克隆分泌的TNK的蛋白质的完整性和质量进行检测；根据每个药物应用的药典标准，也可以进行测定与该蛋白质有关的酶活性的实验。
实施例3：TNK在CHO细胞中的过度表达
在CMV启动子/增强子组成性表达系统的控制下，在CHO细胞中表达TNK氨基酸序列。本文采用被称为灌流生物反应器的新的连续发酵技术用于大规模生产蛋白质。生产TNK的CHO细胞在含有胎牛血清(FBS)的IMDM培养基[INVITROGEN]中生长。从约1×106个重组细胞的培养物中，在组织培养瓶和摇瓶中经过数天的时间以细胞系列扩增方式获得最终量为约6－12×109个的细胞。在细胞生成期间，所有步骤均保持以下培养条件：温度：36.5℃；CO2：5%；FBS：10%。细胞的汇合保持在>90%的培养瓶和摇瓶的生长表面积，然后捕获细胞用于下一步骤。定期进行显微镜检查和生化检验，测定正在生长的细胞的健康情况和完整性。然后将其经过温和的胰蛋白酶处理后转移至生物反应器中，该反应器配备pH和DO探针以及在反应器芯中的细胞支持介质以将细胞保持在反应器中。然后向无菌的5L反应器中接种6－12×109个细胞并使其进行3－4天，保持葡萄糖的浓度为约1－2gm/L。该过程使得细胞以健康状态沉积在反应器中。反应器参数为：温度：36.6℃；通气：1.0L/min；pH：7.2－7.4[采用CO2和饱和的碳酸氢钠水溶液保持]；搅拌：100rpm；溶解氧：30%。将细胞置于支持基质中后，培养基从含有FBS的IMDM更换为不含FBS的CHO-S-SFM II[INVITROGEN]。在整个生产阶段均采用该培养基。在生物反应器开始阶段，收集约100L初始培养基并弃去。然后在生产期间保持反应器温度在33.5℃，每天收集约100L的产量，同时保持反应器中葡萄糖的水平在0.3－1.5gm/L。在这些条件下，运行灌流生物反应器，在3－4个月时间内可以收集多至10,000L的产量。将捕获的液体培养基的各个批次通过0.45μm的滤器过滤，收集到无菌容器中，于2－8℃储存直到进一步处理。采用已确定的方法定期测试捕获液体培养基的容器中的TNK含量和无菌性(图1和2)。
实施例4：TNK的纯化
测试捕获的各批次液体培养基中TNK的含量、其完整性和无菌性。
[图1和2]。在单一1000L批次的纯化中，采用一系列的色谱步骤。在第一个步骤中，将一批含有TNK含量约10mg/L的约1000L捕获的液体培养基上样于快速液相色谱(FLC)系统的柱(300mm×500mm)上，该柱为11L的活化的染料亲和树脂(Blue Sepharose6FF树脂;GEHealthcare)。将该柱采用2倍柱体积(CVs)的平衡缓冲液-1(EB-1,磷酸钠:20mM,NaCl:0.15M,pH7.2)平衡，流速约100－150cm/h。将捕获物上样于柱上，线性流速约100－150cm/h，随后采用2倍CVs的EB-1以约100cm/h的流速通过柱。然后是2－3倍CVs的洗涤缓冲液(WB-1,磷酸钠:20mM,NaCl:2M,pH7.2)以100－150cm/h的流速通过柱。结合的靶蛋白通过约4倍CVs的洗脱缓冲液-1,(EUB-1,磷酸钠:20mM,NaCl:1M,脲:3M,pH7.2)洗脱，根据280nm处的吸光度收集。通过SDS-PAGE电泳法分析系统分析洗脱液(E-l)中的蛋白含量和纯度。在该步骤中，在总蛋白中的TNK含量约为90%。在第二步骤中，采用凝胶过滤色谱变换缓冲液。将E-1上样于采用25L凝胶过滤树脂(Sephadex G-25)的柱(300mm×750mm)上。然后将该柱用2倍CVs的交换树脂(磷酸钠:20mM,pH7.2)以约100－150cm/h的线性流速洗涤，在无菌容器中收集洗脱液(E-2)。在第三步骤中，将E-2上样于采用4.5L活化L-赖氨酸亲和树脂(Lysine HyperD树脂;Pall Corp.)的柱(200mm×500mm)上。然后将该柱采用2倍柱体积(CVs)的平衡缓冲液-2(EB-2,磷酸钠:20mM,聚山梨醇酯-20:0.043%,pH7.2)平衡，流速为约100－150cm/h，随后通过2倍CVs的WB-2(磷酸钠:20mM,NaCl:1M,聚山梨醇酯-20:0.043%,pH7.2)，流速为约100cm/h。结合的靶蛋白通过2倍CVs的洗脱缓冲液-2(EUB-2,精氨酸:0.5M,EACA(ε-氨基己酸):0.2M,聚山梨醇酯-20:0.043%,磷酸调节至pH7.8)洗脱，根据280nm处的吸光度收集。通过SDS-PAGE电泳法分析洗脱液(E-3)中的蛋白含量和纯度[图1和2]。在该步骤中，在总蛋白中的TNK含量超过95%。随后通过GFC将缓冲液变换为批量储存缓冲液(L-精氨酸:55g/L,磷酸:17g/L,聚山梨醇酯-20:430mg/L,pH7.6±0.2)。溶液中TNK的终浓度为约2mg/mL，将储存的溶液冷冻待用。该TNK溶液在制备制剂前可以采用阴离子交换树脂(Capto Q.树脂,GE Healthcare)浓缩至5mg/mL。
实施例5：分析实验
在生产和纯化过程中，通过标准还原和非还原SDS-PAGE法测定样品中TNK的在线(in-process)含量(图1和2)。制备10%的SDS-PAGE凝胶，将50μg的蛋白样品装样到每个孔中。为了测定样品中单链和单体的含量，可以分别采用还原和非还原HPSEC[高效排阻色谱]方法。用于HPSEC方法的柱子为硅胶类排阻色谱柱，分子量的分离范围为10－500KDa[图4和5]。标准和试验样品在同样的分析条件下进行。也进行定期在线生物活性分析以监测蛋白质的质量和完整性。
实施例6：TNK制剂
制备TNK的多种制剂以测试TNK在治疗AIS时的安全性和有效性。作为冻干产品的制剂中各成分的比例为1份TNK、11份L-精氨酸、3.4份磷酸和0.086份聚山梨醇酯-20。用于该制备的批TNK溶液的浓度为5mg/mL的TNK。将各成分混合直到溶液中没有任何沉淀的TNK，将制剂冷冻干燥为稳定的粉末状形式。当采用10ml注射用水重构时，制备一系列TNK的冻干制剂，浓度范围为每10mL小瓶中每ml含有0.10、0.14、0.18、0.20和0.24的TNK，于约4℃储存待用。对这些实验制剂进行不同的实验和稳定性研究，发现其含量和稳定性在一年的时间内是没有变化的。当冻干制剂采用10mL无菌注射用水重构时，可以获得上述每mL量的TNK的澄清溶液，用于临床试验中的测试。
实施例7：TNK的生物测定
通过快速比浊凝块溶解试验(rapid tubidimetric clot-lysis assay)(根据欧洲药典阿替普酶专论的方案开发的)测定批量和制成制剂的TNK的生物学效能。在透明的1.5mL多孔板中，加入20μl人纤溶酶原(1mg/mL)和1mL人纤维蛋白原(2mg/mL)溶液，混合并于0℃保存。在另一个1.5mL多孔板中，制备0.5mL人凝血酶(33lU/mL)和0.5mL试验或参比TNK(1mg/mL总蛋白)溶液，混合并温热至37℃。采用公开的溶剂缓冲液制备所有的稀释液。将200μl的参比/试验混合液加至纤溶酶原/纤维蛋白原混合物中，于37℃温育。在30秒内形成明显的浑浊凝块后，随后当凝块溶解开始时在试管中形成气泡，记录当加入纤溶酶原和试管中最后一个气泡升起的时间点，获得以秒为单位的凝块溶解时间。测定试验和参比TNK样品的凝块溶解时间，根据EP方案，采用生物活性试验测定以每mL国际单位(IU)计算该实施例中采用的批次的TNK的活性。图5显示了测定TNK生物活性的说明性标准曲线。本文中使用的批次的生物活性为203IU/mg。表B和C描述了在凝块溶解生物活性试验中所获得的TNK参比样品和试验样品的数量。
表B：TNK生物测定：参比样品
Figure BDA00003664052600111
表C：TNK生物测定：试验样品
实施例8：TNK制剂的试验和疗效
采用临床医学中使用的已建立的方法进行TNK制剂治疗AIS的临床试验。在多中心、开放标签的评价TNK治疗患者急性缺血性中风(AIS)的有效性和安全性的临床试验中，以随机化方案采用了两种剂量的TNK：0.1mg/kg IV(静脉注射)推注和0.2mg/kg IV推注，所述患者为发作4.5小时内的患者。采用CT扫描5－10秒以确定脑内无出血，以IV推注注射的方式注射TNK。14个患者接受0.1mg/kg IV的剂量，21个患者接受0.2mg/kgIV的剂量。采用NIH-SS(国立卫生研究院脑卒中评分)作为主要的疗效参数。在这两组中，早在24小时内，平均NIH-SS分数就有统计学意义上的显著改善(表1－3)。该改善在评价的7天内一直保持着。NIH-SS分数改善>4意味着在临床上有显著性改善(表2)。0.2mg/kg组显示该参数于24小时即有较高的疗效改善发生率(80.95%)，在第7天时达到95.24%。尽管两剂量组之间没有统计学意义上的显著差异，但数据显示0.2mg/kg的剂量更好。采用NIH-SS分数改善>8的较严格标准(表3)，0.2mg/kg组显示在第7天时改善的发生率在统计学意义上有显著增加(p=0.015)，这证实了0.2mg/kg的剂量是更好的。NIH-SS>4的TNK0.2mg/kg Iv疗效出现在80.95%的患者中，相比而言，在采用阿替普酶0.6mg/kg IV进行的JACT研究中为49.51%(p=0.0087)[Stroke2006;37(7):1810-5]，在采用阿替普酶0.9mg/kg IV进行的NINDS研究中为46.52%(p=0.0043)[NEJM1995;333(24):1581-87]，在采用阿替普酶0.9mg/kg IV进行的印度研究中为65.5%(p=0.0172)[Ann Indian Acad Neurol2008;11:221-4]。这些数据显示，0.2mg/kg IV的TNK剂量较阿替普酶具有明显更好的疗效。对于更严格的NIH-SS>8的标准，TNK在28.57%的患者中显示疗效，它在数字上高于Haley在2005年测定的TNK0.2mg/kg的数据(24%)[Stroke2005;36:607-612]，与Haley在2010年采用TNK0.25mg/kg[Stroke2010;41:707-11]的数据(35.5%)相比在统计学意义上没有显著性差异。两组均无ICHs(脑内出血)症状。对0.1mg/kg组的一个患者和0.2mg/kg组的2个患者用CT于48小时扫描检测无ICH症状。在总共3人(8.57%)中，无ICH症状事件的报道。据报道，有症状或无症状ICH的发生率在Haley2010TNK研究中为11.29%(=7/62)，在Haley2005TNK研究中为20%(=10/50)。据报道之前采用阿替普酶进行的研究在多至7%的患者中有症状ICH，在多至31%的患者中存在无症状ICH(NEJM1995,333,24,1581-7)。本公开的最新数据显示，在AIS的治疗中，TNK的疗效优于报道的采用阿替普酶的疗效。
表1：平均NIH-SS分数的改善
Figure BDA00003664052600121
#－p值，组间比较，T检验
－p值，基线与第7天的组比较，T检验
P<0.05－具有统计学意义上的显著性，NA－不适用，N＝患者数目
表2：NIH-SS改善≥4
Figure BDA00003664052600131
#－p值，组间比较
－p值，24小时与第7天的组比较
P<0.05－具有统计学意义上的显著性，NA－不适用，N＝患者数目
对于比例适用Fisher精确检验，n－患者的比例
表3：NIH-SS改善≥8
Figure BDA00003664052600132
#－p值，组间比较
－p值，24小时与第7天的组比较
P<0.05－具有统计学意义上的显著性，NA－不适用，N＝患者数目
对于比例适用Fisher精确检验，n－患者的比例。

Claims (15)

1.药用组合物，该药用组合物以静脉推注方式注射用于治疗人类患者的急性缺血性中风，该组合物包含：
a.有效和安全量的普奈普酶，它通过灌流连续发酵法制备；
b.可药用的无机缓冲剂；
c.可药用的稳定剂；和
d.任选的可药用的载体。
2.权利要求1的组合物，当给药时其中所述普奈普酶的有效和安全量为约0.10－0.24mg/kg体重。
3.权利要求1的组合物，当给药时其中所述普奈普酶的有效和安全量为约0.20mg/kg体重。
4.权利要求1的组合物，其中普奈普酶采用中国仓鼠卵细胞在连续灌流发酵系统中制备。
5.权利要求1的组合物，其中采用的缓冲剂优选为磷酸/磷酸盐缓冲液。
6.权利要求1的组合物，其中采用的稳定剂优选为L-精氨酸。
7.权利要求1的组合物，其中采用的另一个稳定剂优选为聚山梨醇酯。
8.权利要求1的组合物，其中各成分被冷冻干燥为粉末形式，在使用之前用注射用水重构。
9.权利要求1的组合物，其中组合物的总剂量在中风事件发作6小时内通过静脉推注在10秒内给予。
10.药用套盒，该套盒包括：
(a)含有冻干普奈普酶制剂的小瓶；和
(b)采用该制剂在人类患者中治疗急性缺血性中风的使用说明书，以静脉推注的方式在10秒内给予普奈普酶的剂量不超过0.20mg/kg体重。
11.权利要求10的套盒，其中当采用注射用水重构时普奈普酶的量为约2mg/mL。
12.权利要求10的套盒，其中总剂量应当在急性缺血性中风事件发作6小时内以静脉推注方式给予。
13.权利要求10的套盒，其中用于推注的最佳普奈普酶量为约0.20mg/kg体重。
14.权利要求10的套盒，其中推注总剂量应当在不超过10秒的时间给予。
15.基本上如实施例所述的普奈普酶的药用组合物及其套盒。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7086601B2 (ja) * 2014-10-21 2022-06-20 ジェンノヴァ バイオファーマシューティカルズ リミテッド 組換えｔｎｋ－ｔｐａ（テネクテプラーゼ）の単離及び商業生産のための新規精製方法
JP2020520386A (ja) * 2017-05-16 2020-07-09 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 急性虚血性脳卒中の処置のための方法及び医薬組成物
WO2019229764A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 Gennova Biopharmaceuticals Limited Process for production of recombinant tnk-tpa by packed-bed perfusion system

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070014779A1 (en) * 2002-11-14 2007-01-18 Genentech, Inc. Plasminogen activator variant formulations
WO2008070353A2 (en) * 2006-11-07 2008-06-12 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator variant uses
CN101505785A (zh) * 2006-08-29 2009-08-12 健泰科生物技术公司 替奈普酶用于治疗急性缺血性中风的用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10230752A1 (de) * 2002-07-09 2004-01-22 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue Arzneimittelkompositionen auf der Basis von Magnesiumsalzen und Fibrinolytika
US20070166299A1 (en) * 2005-03-02 2007-07-19 The Regents Of The University Of California Treatment for embolic stroke
WO2006094120A2 (en) * 2005-03-02 2006-09-08 The Regents Of The University Of California Treatment for embolic stroke
EP2014760A1 (en) * 2007-06-13 2009-01-14 CMC Biopharmaceuticals A/S A method for producing a biopolymer (e.g. polypeptide) in a continuous fermentation process

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070014779A1 (en) * 2002-11-14 2007-01-18 Genentech, Inc. Plasminogen activator variant formulations
CN101505785A (zh) * 2006-08-29 2009-08-12 健泰科生物技术公司 替奈普酶用于治疗急性缺血性中风的用途
WO2008070353A2 (en) * 2006-11-07 2008-06-12 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator variant uses

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