BR112013015914B1

BR112013015914B1 - composições farmacêuticas de tenecteplase

Info

Publication number: BR112013015914B1
Application number: BR112013015914-6A
Authority: BR
Inventors: Mishra Maheshwari Kumar; Bhandari Pritiranjan; Singh Sanjay
Original assignee: Gennova Biopharmaceuticals Ltd.
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2021-06-08
Also published as: PL2654770T3; DK2654770T3; EP2654770A4; JP2014502608A; EP2654770A1; NZ611706A; MX356199B; US20130323227A1; JP6375112B2; AU2011346515A1; US9943575B2; MY171723A; EP2654770B1; EA201300746A1; US20160310580A1; AU2011346515B2; ES2687850T3; CO6721059A2; CN103391785A; PT2654770T

Abstract

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DE TENECTEPLASE. São reveladas composições farmacêuticas de tenecteplase que são seguras e efetivas para o tratamento do ataque isquêmico agudo, comparadas com as composições conhecidas. As composições da invenção são inventadas com base em uma série de estudos de testes com diferentes quantidades de TNK e da quantidade específica de isolação que seja idealmente em termos de efeitos desejados de TNK para o tratamento do ataque isquêmico agudo.

Description

DESCRIÇÃO Campo da invenção

Esta invenção se refere às composições farmacêuticas de um derivado do ativador plasminogênio do tecido humano conhecido como tenecteplase (TNK) para o tratamento de bloqueios das artérias cerebrais que provocam os ataques dos tipos principais e secundários, como o ataque isquêmico agudo (AIS). A invenção também se refere a formulações que possuem a eficácia e segurança ideais quando comparadas com os agentes da terapia conhecida identificados nos estudos clínicos das referidas composições com quantidades específicas de TNK como princípio ativo.

Fundamentos da invenção

O ativador do plasminogênio tecidual (TPA) está envolvido com o rompimento dos coágulos sanguíneos não específicos no sistema de circulação sanguínea. O TNK é um derivado do TPA em que sete aminoácidos da sequência nativa sejam modificados, de maneira que a nova molécula tenha especificidade alterada para a proteína fibrina e as propriedades farmacocinéticas alteradas, levando a efeitos farmacodinâmicos alterados. A TNK é uma glicoproteína com 527 aminoácidos de peso molecular 70 KDa. Foi aprovada para o uso em produtos medicinais para o tratamento do infarto agudo do miocárdio e alguns outros rompimentos dos vasos sanguíneos relacionados com tromboses e embolias nos diferentes órgãos. Recentemente, foi considerado para o tratamento do ataque isquêmico agudo e vários estudos clínicos foram feitos com esta indicação, mas esses experimentos não produziram evidências conclusivas sobre a dose segura e efetiva do TNK para AIS.

Os ativadores de plasminogênio são enzimas que ativam o plasminogênio para gerar a plasmina protease serina que, por sua vez degrada a fibrina. Entre os ativadores de plasminogênio usados como medicamentos, estão: a) estreptoquinase [uma proteína bacteriana], b) uroquinase, [uma enzima sintetizada nos rins] e c) ativador plasminogênio do tecido humano [uma enzima produzida pelo endotélio vascular].

Existem também outras enzimas em desenvolvimento que são potenciais candidatas como medicamentos fibrinolíticos. Os mecanismos de ação desses ativadores diferem: a estreptoquinase forma um complexo com a atividade plasmina geradora de plasminogênio, a uroquinase cliva diretamente o plasminogênio e o TPA forma um complexo ternário com fibrina e plasminogênio que levam à ativação do plasminogênio e à dissolução de coágulos no local. O TPA humano natural tem uma meia vida plasmática tipicamente de 8-10 minutos. Entretanto, foi desejado ter maior meia vida, de maneira que a terapia fibrinolítica possa ser efetivamente administrada cm um curto período de tempo, com maiores resultados benéficos de eficácia. Portanto, foram criados vários mutantes aminoácidos e de deleção da proteína e testados em relação às características aperfeiçoadas com relação à TPA. A TNK tem seis mutações que dobraram a meia vida [para 20-24 min.] quando comparada à tPA e melhorou as características como maior especificidade do coágulo fibrina com concorrente menor afinidade para o inibidor-1 ativador de plasminogênio.

A TNK foi primeiramente revelada na US5385732 onde foi produzida por tecnologia DNA recombinante usando uma linha celular estabelecida de mamíferos. Várias outras patentes cobrem diferentes aspectos da produção e do uso da TNK, conforme US5728567, US5714145, US5366886, US5094953, US5407819 e US6506598. A US5407819 revela um método da preparação da variante TPA pelo deslocamento de um determinado aminoácido na sequência aminoácida. A US5612029 revela uma variante da TPA, que é glicosilada em qualquer das posições em 103-105 e isenta de estrutura de carboidratos funcionais na posição 117 da sequência TPA humana do tipo selvagem. A US5520911 revela a preparação de sequências DNA para codificar a variante TPA. A US5424198 revela um método para a produção da TPA pela transformação das células com genes DHFR mutantes ou do tipo selvagem em combinação com os genes TPA. Estes e vários outros documentos também cobrem as várias condições médicas ou indicações onde a TNK pode ser usada como medicamento para o tratamento relativo à formação de coágulos. Uma das condições cobertas pela US20080107641 é AIS. Entretanto, essa aplicação não revela qualquer método para a identificação de uma dose segura e efetiva de TNK para o tratamento da AIS em pacientes humanos. Ao contrário, prediz o uso seguro do medicamento com base em modelos teóricos das matrizes de dados existentes sem dar qualquer método específico de testes e qualificando as doses efetivas identificadas. Portanto, a técnica anterior atual não soluciona as necessidades da identificação de doses seguras e efetivas de TNK para o tratamento da AIS e as efetivas composições farmacêuticas (formulações) para o tratamento da AIS. A presente invenção focaliza a necessidade supramencionada e prove melhores e mais efetivas formulações de TNK para o tratamento da AIS em pacientes humanos, que sejam seguras, assim como de fácil administração em um curto período de tempo.

Existem alguns estudos que mencionam o uso da TNK para o tratamento da AIS; entretanto, não apresentam qualquer formulação de INK com quantidades de TNK que sejam seguras e efetivas como as reveladas na presente com relação a seus efeitos colaterais. Além disso, a TNK usada para a preparação de formulações feita usando a nova tecnologia do sistema de fermentação contínua baseada em perfusão não foi usada anteriormente para o preparo da proteína TNK.

São conhecidas várias formulações que usam TNK para o tratamento da AIS. Entretanto, até o presente nenhuma foi aprovada por qualquer regulador de medicamentos que seja seguro e eficaz quando comparada em uma análise risco/benefício. Tendo identificado essa falta, algumas formulações de TNK são reveladas na presente que possuem as desejadas propriedades necessárias para um medicamento seguro e efetivo para o tratamento da AIS. Alguns aspectos do método usado na presente revelação para a preparação da TNK de alta pureza são conhecidos na técnica anterior. Entretanto, são usados vários novos elementos na presente que não são conhecidos na técnica para a produção, preparação, seleção, testes e especialmente a qualificação clínica das formulações de INK para o tratamento da AIS.

Objetivos da invenção

O principal objetivo da invenção é identificar a quantidade efetiva e segura da TNK para o tratamento da AIS em pacientes humanos. Outro objetivo da invenção é desenvolver as formulações de TNK que sejam seguras e efetivas para o tratamento da AIS em pacientes humanos. Ainda outro objetivo da invenção é a realização de estudos clínicos para identificar a quantidade de TNK que seja segura e efetiva para o tratamento da AIS. Ainda outro objetivo da invenção é o uso da tecnologia de fermentação baseada em perfusão para a produção recombinante da TNK usada para obter os objetivos acima.

Sumário

A produção de INK foi feita por tecnologia DNA recombinante em Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) em um sistema de fermentação contínua baseada em perfusão. Este método permite uma produção de grande escala da proteína com maior qualidade e quantidade, além de ser escalável para aplicações industriais. A linha de células recombinantes que produz a TNK que tem uma proteína secretada foi preparada e selecionada para a natureza desejada da TNK, e usada para as formulações de TNK para o tratamento do AIS em pacientes humanos. Essas formulações tendo diferentes quantidades de TNK foram testadas em um estabelecimento clínico para identificar a quantidade segura e efetiva de TNK necessária para o tratamento ideal da AIS em pacientes humanos. Os dados do experimento clínico que forneceu a quantidade de TNK segura e eficaz para o tratamento da AIS são revelados na intervenção. E a TNK é preparada usando o sistema de fermentação contínua baseada em perfusão. Na primeira parte, linhas celulares de mamíferos (CHO) foram preparadas usando técnicas biológicas moleculares e celulares. Essas linhas celulares foram então triadas para o nível de expressão da TNK secretada e uma linha celular com alta expressão de TNK foi isolada para novos desenvolvimentos do processo em produção TNK de grau farmacêutico. Na segunda parte, as linhas de produção TNK foram cultivadas em um sistema de fermentação contínua baseada em perfusão para a produção em grande escala de TNK e o meio gasto coletado armazenado para novos processamentos. Na Terceira parte, a colheita foi submetida a etapas cromatográfícas para a obtenção de granel TNK altamente puro e potente como princípio ativo para outras preparações das formulações para aplicações clínicas. Na quarta parte, um conjunto de formulações da TNK foi preparado e estudado com vários parâmetros como estabilidade, potência e outras propriedades farmacológicas em bioensaios. Na quinta parte, as formulações de TNK preparadas foram examinadas em testes clínicos para identificar a quantidade segura e efetiva de TNK necessária para o tratamento da AIS em pacientes afetados em determinadas condições. Esses estudos identificaram um conjunto de parâmetros necessários para o uso seguro e efetivo da TNK para o tratamento da AIS sob a forma de formulações injetáveis.

Descrição detalhada

É conhecido pelos técnicos no assunto de medicina e farmacologia que para obter composições farmacêuticas seguras e efetivas, é uma boa estratégia o desenvolvimento de várias formulações da resistência do princípio ativo com diferentes excipientes e testá-las nas condições desejadas, de maneira que uma dose segura e efetiva de um novo medicamente para uma indicação específica possa ser identificado. O papel dos excipientes é importante, já que fornecem outras características como estabilidade, facilidade de aplicação, volume, etc. O principal objetivo da presente invenção é desenvolver uma melhor preparação da TNK para uso como composições farmacêuticas para o tratamento de ataque isquêmico agudo em pacientes humanos que seja segura e eficaz com relação às demais formulações. Outro objetivo desta invenção se refere ao uso de testes clínicos que usam quantidades específicas de TNK para determinar a quantidade segura e efetiva de TNK no tratamento da AIS. Além disso, permanece uma falta de entendimento em relação a muitos aspectos da tecnologia DNA recombinante, do desenvolvimento do processo e da produção, que afetam a produtividade e as características dos produtos finais. Portanto, existe a necessidade de novos métodos para a preparação de produtos com tecnologia rDNA que sejam aperfeiçoados com relação aos métodos e tecnologias existentes. O objetivo desta invenção é o desenvolvimento de formulações/composições farmacêuticas seguras e efetivas para o tratamento do ataque isquêmico agudo em humanos, em que a TNK seja produzida a partir de uma linha celular CHO desenvolvida de novo e usada em um sistema de fermentação contínua baseada em perfusão para a produção em grande escala da TNK.

Na primeira parte, foi preparada a linha celular CHO que expressa a TNK como uma proteína secretada em um maior nível. As técnicas analíticas de biologia e bioquímica molecular usadas são padrão na técnica e têm sido usadas de forma rotineira. O plasmídeo de expressão de mamíferos usado para a criação da linha celular de expressão continha um elemento promotor/ampliador CMV antes de um gene artificial da TNK seguido por uma cauda SV40 poli-A para o término da transcrição. O mesmo plasmídeo também continha um gene DHFR sob o controle do promotor SV40, finalizando com uma cauda SV40 poli-A. Esse plasmídeo foi transfectado em células CHO negativas para o gene nativo DHFR (linha celular CHO-DHFR). Uma linha celular com maiores níveis de expressão TNK foi isolada e depois usada [Exemplos 1 e 2], Na segunda parte, as células CHO que expressam a TNK foram usadas para a preparação em grande escala da TNK no sistema de fermentação contínua baseada em perfusão. Cerca de 6-12 x 109 células foram imobilizadas no núcleo do reator do biorreator de perfusão. Essas células puderam crescer em meio IMDM com FBS por cerca de alguns dias, até que a necessária massa celular fosse desenvolvida sob constante concentração de glicose de cerca de 1-2 gm/L em modo quimioestático. Durante a fase de produção, o meio foi alterado para CHO-S-SFM II sem FBS, e a fermentação prosseguiu por vários meses em condições de alimentação de glicose, enquanto uma determinada concentração do produto TNK cru era produzida no meio colhido para novos processamentos a jusante. O meio de colheita foi colhido em recipientes estéreis e armazenado a 4 °C e até novo uso nas subsequentes etapas de purificação [Exemplos 3, 5 e 7].

Na terceira parte, os meios colhidos contendo TNK cru foram submetidos a um conjunto de etapas cromatográficas em série. Isto incluiu uma etapa de captura de afinidade de colorações, seguida por uma etapa de purificação por afinidade de lisina e uma etapa de polimento final de troca iônica. A tabela A mostra diferentes etapas da purificação cromatográfica que leva a um aumento de várias vezes na quantidade de proteína purificada como determinado pela densitomctria SDS-PAGE / HPSEC. Antes de submeter o caldo colhido ao processo de purificação, este continha cerca de 80% de proteína TNK. No fim da etapa final de cromatografia por troca iônica (IEC), a pureza da proteína era pelo menos 95%. Os tipos de resinas usadas para as etapas de afinidade, troca iônica e filtração de gel usadas no método ora descrito podem ser substituídas por outras resinas com características similares. Os métodos de purificação descritos na presente são exibidos como exemplos da estratégia de purificação usada para a preparação de uma TNK para o tratamento da AIS, e não são limitados pelo uso dos tipos de resinas cromatográficas reveladas como outros meios similares de separação que também podem ser usados igualmente de forma efetiva. O TNK a granel foi armazenado em uma concentração de cerca de 5 mg/ml a -80°C [Exemplos 4,5 e 7].

Tabela A: Aumento na pureza da TNK

Na quarta parte, várias formulações da solução 'TNK a granel foram preparadas na faixa de 0,10 a 0,24 mg/ml por frasco de 10-sob a forma liofilizada. Em um tipo das formulações, a razão dos componentes foi de 1 parte de TNK, 11 partes de L-arginina, 3,4 partes de ácido fosfórico e 0,086 partes de polisorbato-20 como pó liofilizado. Essas formulações foram submetidas a testes de rotina e foram usadas na avaliação clínica da TNK para o tratamento da AIS [Exemplo 6],

Na quinta parte, os testes clínicos e a eficácia das formulações TNK no tratamento da AIS foram avaliados em um estudo multicêntrico de rótulo aberto envolvendo cerca de 35 pacientes afetados. A partir dos dados obtidos nesse estudo, foi obtida a quantidade segura e efetiva de TNK necessária para o tratamento da AIS [Exemplo 8].

A invenção acima detalhada é ilustrada pelos seguintes exemplos, com o propósito de mostrar a utilidade da invenção. As realizações abaixo não restringem a invenção de qualquer forma com relação a aplicações mais amplas para a preparação de composições/formulações das proteínas similares ao TNK. Os ensinamentos desta invenção podem também ser usados na preparação das proteínas que forem análogos tPA. As figuras são ilustrativas e não limitam aplicações mais abrangentes da invenção com relação à qualidade e pureza da proteína preparada e formulada.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Grama de SDS-PAGE reduzida com coloração prateada do conteúdo TNK em frações purificadas-1) marcador de peso molecular (do fundo: 21, 31, 45, 66, e 96 kDa); 2) caldo colhido; 3) E-l após DAC; 4) E-2 após LAC; 5) E-3 após IEC e 6) amostra padrão.

Figura 2: Grama de SDS-PAGE não reduzida com coloração prateada do conteúdo TNK em frações purificadas -1) marcador de peso molecular (do fundo: 21, 31, 45, 66, e 96 kDa); 2) caldo colhido; 3) E-l após DAC; 4) E-2 após LAC; 5) E-3 após IEC e 6) amostra padrão.

Figura 3: Um gráfico ilustrativo HPSEC de TNK não reduzido após a etapa cromatográfica final: peptídio TNK (tempo de retenção: 26,653 min.) é mais que 99% puro.

Figura 4: Um gráfico ilustrativo HPSEC de TNK reduzido após a etapa cromatográfica final: peptídio TNK, cadeia simples (tempo de retenção: 25,093 min.) e peptídio TNK, cadeia dupla (tempo de retenção: 29,247 min.).

Figura 5: Uma curva padrão ilustrativa das medições da bioatividade TNK.

EXEMPLOS Exemplo 1: Biologia molecular, bioquímica e métodos analíticos.

A biologia molecular geral, a bioquímica e os métodos analíticos usados durante o procedimento são conhecidos na técnica. Podem ser antecipadas técnicas rotineiras e não são descritas por estarem disponíveis na literatura pública. As cepas usadas como células hospedeiras bacterianas foram obtidas do E. coli K-12 e os plasmídios e elementos DNA usados para a preparação de vetores de expressão foram recuperados dos plasmídios comumente disponíveis ou projetados e sintetizados de forma doméstica e integrados para a criação dos elementos necessários. A sequência peptídica usada para a preparação do gene artificial TNK é a sequência tPA humana nativa tendo as alterações de aminoácidos como: Thrl03Asn, Asnll7Gln, Lys296Ala, His297Ala, Age298Ala e Age299Ala [MDAMKRGLCCVIJ.LCGAVIVSPSOEIllARITtRGARSYOVICRDEKrQMIYQOHQSWI.RPVLRSN PNYNG^CNSGRAQCHSVPVKSCREPRCFNGGTCQQALYFSDFVCQCPEGFAGKCCEIDTRATC YEDQG1SYRGTWSTAESGAECTNWNSSALAQKPYSGRRPDAIRLGLGNHNYCRNPDRDSKPWCY FFKTGÁTiÇFEFCÓTP^CSFGASDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGNVYTAQNP SAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGG LFADIASHPWQAAIFAKIIRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVTLGRTYRW PGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDfYDNDIAIEQLKSDSSRCAQESSWRTVCLPPADLQLPDW TECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHEINRTVIT)NMLCAGDTRSGGPQA NLHDACQGDSGGPLVCINDGRMfEVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNM RP]. Todos os elementos DNA sintéticos subsequentes se basearam nessa sequência e foram integrados aos vetores de clonagem e de expressão mamífera usando métodos padrão. Para confirmar a identidade e a integridade desses elementos, foi feito o sequenciamento DNA e as sequências curadas manualmente.

Exemplo 2: Preparação de uma linha celular de mamíferos para a expressão da TNK.

Uma sequência artificial TNK DNA de gene tPA humano com as seis mutações acima foi sintetizada artificialmente. Essa sequência foi clonada em um vetor plasmídio tendo os elementos para a sobre-expressão eficiente da proteína em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) como a proteína secretada no meio. No vetor, o elemento ampliador/promotor CMV foi seguido pelo gene TNK artificial seguido por um elemento de término de transcrição SV40 polyA. O mesmo plasmídio também expressou o gene DHFR controlado pelo promotor prévio SV40 e oterminador SV40 polyA como um cistron em separado. O gene DHFR foi também usado como o marcador de expressão nas células CHO recombinadas para a detecção das células positivas TNK. O vetor foi transfectado na linha celular CHO negativa (DHFR) de diidrofolato reductase (DUKxBll) e foram genomicamente isolados clones estáveis integrados com uma robusta expressão de TNK secretada. Foram testados os níveis de expressão da TNK em vários clones selecionados com análises Western blot e SDS-PAGE, seguidos por métodos quantitativos RT-PCR para estabelecer as linhas celulares com a expressão estável e robusta da proteína. Foi usada uma linha celular com uma boa produtividade de TNK para a criação do banco de células mestre, a partir do qual foi preparado o banco de células de trabalho e usado nos processos a montante de fermentação por perfusão em larga escala. A TNK secretada por cada clone foi testada em relação à qualidade e integridade da proteína; também foram feitos testes para determinar as atividades enzimáticas associadas a esta proteína de acordo com padrões de farmacopeia pata aplicações medicinais.

Exemplo 3: Sobre-expressão TNK em células CHO.

A sequência aminoácida TNK foi expressa sob o controle do sistema de expressão constitutiva promotor/ampliador CMV em células CHO. Aqui foi empregada uma nova tecnologia de fermentação contínua denominada biorreator de perfusão para a produção em grande escala da proteína. As células CHO produtoras de INK foram cultivadas em um meio IMDM [INVITROGEN] com soro fetal bovino (FBS). A partir de uma cultura de cerca de 1X106 células recombinantes,foi obtida uma quantidade final de cerca de 6-12 X 109 células com amplificação serial das células em frascos de cultura de tecidos e garrafas giratórias de cultura por um período de vários dias. As condições de cultura mantidas em todas as etapas durante a geração da massa celular foram: temperatura: 36,5°c, C02 : 5% e FBS: 10%. A confluência da célula foi mantida em >90% da área superficial de crescimento nos frascos e garrafas em todas as etapas antes da colheita das células para a próxima etapa. Foram feitas microscopias periódicas e testes biológicos para detectar a saúde e a integridade das células em cultura. Depois, foram removidas com tratamento suave de tripsina para a transferência para o biorreator, que foi equipado com sondas pH e DO e o meio de suporte celular no núcleo do reator para a retenção da célula no reator. O reator esterilizado 5-L foi então inoculado com 6-12 X 109 células e operado por 3-4 dias com concentração de glicose de cerca de 1-2 gm/L. Este processo levou a deposição das células no reator em condições saudáveis. Os parâmetros do reator foram: temperatura: 36.6°C, aeração: 1,0 L/min, pH: entre 7,2-7,4 [mantido usando C02 e solução de bicarbonato sódio saturado], agitação: 100 rpm, oxigênio dissolvido: 30%. Quando as células foram colocadas na matriz suporte, o meio foi mudado de IMDM com FBS para CHO-S-SFM II [INVITROGEN] sem FBS. Esse meio foi usado em todo o estágio do produto. No início da fase do biorreator, cerca de 100L do meio inicial foi colhido e descartado. Depois, a temperatura do reator foi mantida em 33.5°c durante a fase de produção e cerca de 100L da colheita coletada diariamente, mantendo o nível de glicose do reator entre 0,3-1,5 gm/1. Nessas condições, o biorreator de perfusão pode ser operado para coletar até cerca de 10,000L da colheita em um período de 3-4 meses. Os lotes do caldo colhido foram filtrados em filtros de 0,45 μm, coletados em recipientes estéreis e armazenados a 2-8°C até posterior processamento. Os conjuntos de caldos colhidos foram testados periodicamente com relação ao teor e esterilidade da TNK por métodos estabelecidos [Figuras 1 e 2], Exemplo 4: Purificação da TNK.

Os lotes do caldo colhido foram testados com relação ao conteúdo de TNK, sua integridade e esterilidade [Figuras 1 e 2], Em um único lote de 1000-L para purificação, foi usada uma série de etapas cromatográficas. Em uma primeira etapa, um lote de cerca de 1000 L de caldo colhido com conteúdo de TNK de cerca de 10 mg/L foi carregado em uma coluna de sistema de cromatografia líquida rápida (FLC) (300 mm X 500 mm) com 1 1L de resina de afinidade de corante ativado (Resina Blue Sepharose 6 FF; GE Healthcare). A coluna foi equilibrada com tampão-1 de equilíbrio (EB-1, fosfato de sódio: 20 mM, NaCL: 0,15 M, pH 7,2) passando 2 volumes de coluna (CVs) com vazão de cerca de 100-150 cm/h. A colheita foi carregada na coluna com uma vazão linear de cerca de 100-150 cm/h, seguida pela passagem de EB- 1 de 2 CVs em uma vazão de cerca de 100 cm/h. Isto foi seguido por 2-3 CVs do tampão de lavagem (WB-1, fosfato de sódio: 20 mM, NaCL: 2 M, pH 7,2) em uma vazão de 100-150 cm/h. A proteína alvo ligada foi eluída passando cerca de 4 CVs de tampão-1 de eluição, (EUB-1, fosfato de sódio: 20 mM, NaCL: 1M, uréia: 3 M, pH 7,2) e coletada com base na absorbância em 280 nm. O eluado (E-l) foi analisado com relação à quantidade e pureza da proteína por eletroforese SDS-PAGE. Nessa etapa, o conteúdo l'NK na proteína total é cerca de 90%. Na segunda etapa, o tampão foi mudado usando cromatografia de filtração de gel. E-l foi carregado na coluna (300 mm X 750 mm) com 25 L de resina para filtração de gel (Sephadex G-25). A coluna foi então lavada com 2 CVs do troca de tampão (fosfato de sódio: 20 mM, pH 7,2) com vazão linear de cerca de 100-150 cm/h, e o eluado (E-2) foi coletado em um recipiente estéril. Na terceira etapa, foi carregado E-2 em uma coluna (200 mm X 500 mm} com 4,5 L de resina de afinidade L-lisina ativada (Resina Lysine HyperD; Pall Corp.}. A coluna foi então equilibrada com o tampão-2 de equilíbrio (EB-2, fosfato de sódio: 20 mM, polisorbato-20: 0,043%, pH 7,2) passando 2 volumes de coluna(CVs) em uma vazão de cerca de 100-150 cm/h, seguida pela passagem de 2 CVs de WB-2 (fosfato de sódio: 20 mM, NaCL: 1M, polisorbato-20: 0,043%, pH 7,2) em uma vazão de cerca de 100 cm/h. A proteína alvo ligada foi eluída pela passagem de 2 CVs de tampão-2 de eluição (EUB-2, arginina: 0,5 M, EACA (ácido aminocapróico epsilon ): 0,2 M, polisorbato-20: 0,043%, pl I 7,8 ajustado com ácido fosfórico) e coletado com base na absorbância em 280 nm. O eluado (E-3) foi analisado com relação à quantidade e a pureza da proteína por eletroforese SDS-PAGE [Figuras 1 e 2], Nessa etapa, o conteúdo TNK das proteínas totais é maior que 95%. Isso foi seguido pela troca de tampão por GFC para tampão de armazenagem a granel (L-arginina: 55 g/L, ácido fosfórico: 17 g/L, polisorbato -20: 430 mg/L, pH 7,6 ± 0,2). A concentração final de TNK na solução foi cerca de 2 mg/ml, e a solução armazenada congelada até novo uso. Esta solução TNK foi ainda concentrada usando uma resina de troca de anion (Resina Capto Q, GE Healthcare) em 5 mg/ml antes da preparação das formulações.

Exemplo 5: Ensaios analíticos.

Durante os processos de produção e purificação, o conteúdo em processo da TNK nas amostras foi determinado por métodos SDS-PAGE padrão de redução e não redução [Figuras 1 e 2]. Foram preparados 10% dos géis SDS-PAGE e 50 μg da proteína amostra carregados em cada poço. Para a determinação do conteúdo de cadeia simples e monômero das amostras, foram usados métodos 1IPSEC de redução e de não redução [cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho] respectivamente. As colunas 5 usadas para os métodos HPSEC foram colunas de cromatografia de exclusão de tamanho baseadas em sílica para a faixa de separação da molécula 10-500 KDa [Figuras 4 e 5]. As amostras padrão e de teste foram operadas em condições idênticas de análise. Foi também feito um ensaio periódico de bioatividade em processo para monitorar a qualidade e a integridade da proteína.

Exemplo 6: Formulações de TNK.

As várias formulações de TNK foram preparadas para testar a segurança e eficácia da TNK no tratamento da AIS. As formulações se basearam nas razões de 1 parte de TNK, 11 partes de L arginina, 3,4 partes de ácido fosfórico e 0,086 partes de polisorbato-20 como produtos liofilizados. A concentração da solução TNK a granel usada para esta 15 preparação foi de 5 mg/ml de TNK. Após a mistura dos componentes sem qualquer precipitação de TNK na solução, as formulações foram liofilizadas para formas estáveis em pó. Foi preparado um conjunto de formulações liofilizadas com potência de TNK variando entre 0,10, 0,14, 0,18, 0,20, e 0,24 de TNK por ml por frasco de 10-ml quando reconstituídas com 10 ml de água para injeção, e armazenadas em cerca de 4°C 20 até uso posterior. Esse conjunto de formulações de testes foi submetido a diferentes testes e estudos de estabilidade, e determinados como comparáveis em conteúdo e sua estabilidade por cerca de um período de um ano. As formulações liofilizadas quando reconstituídas com 10 ml de água estéril para injeção para dar a quantidade supramencionada de TNK por ml em soluções claras para testes nos 25 testes clínicos.

Exemplo 7: Bioensaio de INK.

A potência biológica da TNK a granel e formulada foi determinada por meio de um ensaio rápido de coágulo-lise turbidimétrico desenvolvido a partir do protocolo da monografia da farmacopeia Européia para altcplase. Em uma placa multipoços 30 transparente de 1,5 ml, foram tomados 20 μL de soluções de plasminogênio humano (1 mg/ml) e 1 ml de fíbrinogênio humano (2 mg/ml), misturadas e mantidas a 0°C. Em uma placa multipoços separada de 1,5-ml, foram preparadas 0,5 ml de trombina humana (33 IU/ml) e 0,5 ml de soluções de TNK de teste ou de referência (1 mg/ml proteínas totais), misturadas e levadas a 37 °C. Todas as diluições foram preparadas com o tampão solvente como revelado. Foram adicionados 200 μL de misturas de referência/teste às misturas de plasminogênio/ fibrinogênio e incubadas a 37 °C. Após a formação de coágulos visivelmente túrbidos em 30 seg., formaram-se subsequentemente bolhas nos tubos com o prosseguimento do coágulo-lise. Foram registrados os pontos no tempo quando as misturas de trombina foram adicionadas e a última bolha subiu no tubo, o que deu os tempos de coágulo-lise em segundos. Foi determinado o tempo de coágulo-lise das amostras TNK de teste e referência eo lote TNK do teste de bioatividade foi calculado em unidades internacionais (IU) por ml do lote usado neste exemplo, de acordo com o protocolo EP. A Figura 5 mostra uma curva padrão ilustrativa para as medições da bioatividade da TNK.

A bioatividade do lote aqui usado foi de 203 IU/mg. As tabelas B e C mostram os números das amostras de referência e de teste da TNK obtida no ensaio de bioatividade coágulo-lise. Tabela B: Bioensaio TNK: amostras de referência

Tabela C: Bioensaio TNK: amostras de testes

Exemplo 8: Testes e eficácia das formulações TNK.

Os estudos clínicos das formulações TNK para AIS foram feitos usando os métodos estabelecidos usados na medicina clínica. Em um estudo clínico multicentros, de rótulo aberto sobre a eficácia e a segurança da TNK no tratamento do ataque isquêmico agudo (AIS) em pacientes comunicados dentro de 4,5 horas do início, foram usadas duas doses de TNK — 0,1 mg/kg IV (injeção intravenosa) em bolo e 0,2 mg/kg IV em bolo de acordo com um esquema randomizado. A TNK foi injetada como injeção bolo IV após a confirmação de não haver hemorragia intracerebral por meio de varreduras CT em um período de 5-10 segundos. A dose de 0,1 mg/kg IV foi recebida por 14 pacientes e a dose de 0,2 mg/kg IV foi recebida por 21 pacientes. O NIH-SS {National Institute of HealthStroke Scale)foi considerado como o principal parâmetro de eficácia. Em ambos os grupos, houve uma melhora estatisticamente significativa na classificação NIH-SS média dentro das recentes 24 horas (Tabelas 1-3). Essa melhora foi mantida em 7 dias de avaliação. A classificação NIH-SS de 4 foi considerada como clinicamente significativa (Tabela 2). O grupo 0,2 mg/kg mostrou maior incidência de eficácia nesse parâmetro em 24 horas (80.95%) o que aumentou para 95,24% no Dia 7. Apesar de não haver diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos de dosagem, esses dados sugeriram que a dose 0.2 mg/kg foi preferida. Usando os critérios mais rigorosos da classificação NIH- SS de melhora de >8, (Tabela 3), o grupo de 0,2 mg/kg mostrou um aumento estatisticamente significativo na incidência de melhora no Dia 7 (p=0,015) que confirmou que a dose de 0,2 mg/kg foi preferível. A eficácia da TNK 0,2 mg/kg IV para NIH-SS >4 foi vista em 80,95% de pacientes quando comparada a 49,51% no estudo JACT [Stroke 2006; 37(7):1810-5]com alteplase 0,6 mg/kg IV (p=0,0087), e 46,52% no estudo NINDS [NEJM 1995; 333(24): 1581-87] com alteplase 0,9 mg/kg IV (p=0,0043), e 65,5% no estudo indiano [Ann Indian Acad Neurol 2008:11:221-4]com alteplase em 0,9 mg/kg IV (p=0,0172). Esses dados mostraram que a dose de 0,2 mg/kg IV de TNK tern significativamente melhor eficácia que a alteplase. Com relação aos dados mais rigorosos da NIH-SS >8, a TNK mostrou eficácia em 28,57% dos pacientes que foi numericamente maior que os dados TNK 0,2 mg/kg (24%) de Haley 2005 [Stroke 2005; 36: 607-612] e estatisticamente não significativa quando comparada aos dados Haley 2010 [Stroke 2010; 41: 707-11] (35,5%) com TNK 0,25 mg/kg. Não houve ICHs sintomático (hemorragia intracerebral) em qualquer grupo. O ICH assintomático foi detectado por varredura CT em 48 horas em um paciente no grupo 0,1 mg/kg e em 2 pacientes no grupo 0,2 mg/kg. No total foram comunicados 3 (8,57%) incidentes ICH assintomáticos. A incidência de ICH sintomático ou assintomático foi comunicada como sendo 11,29% (=7/62) no estudo Haley 2010 e 20% (=10/50) no estudo Haley 2005 com TNK. Estudos anteriores com alteplase comunicaram ICH sintomático em até 7 % dos pacientes e ICH assintomático em até 31% dos pacientes {NEJM 1995, 333, 24, 1581-7). Os novos dados revelados mostraram que a eficácia da TNK foi melhor que a comunicada com alteplase no tratamento da AIS. Tabela 1: Melhoria na classificação NIH-SS média Grupos de Estudo Valor p*

5 # - valor p, quando comparado entre os grupos; aplicado o teste T. @ - valor p, quando comparado à linha de base e o valor do dia 7 dentro do grupo; aplicado o teste T. p<0,05 - estatisticamente significativo; NA - Não Aplicável. N+ Número de pacientes. Tabela 2: Melhoria NIH-SS « 4 pontos. Grupos de Estudo Valor p*

# - valor p, quando comparado entre os grupos. @ - valor p, quando comparado à linha de base e o valor do dia 7 dentro do grupo. p<0,05 - estatisticamente significativo; NA - Não Aplicável. N= Número de pacientes.

O Teste Exato de Fisher foi aplicado para proporções, n - Proporção de pacientes. Tabela 3: Melhoria NIH-SS H 8 pontos. Grupos de Estudo Valor p*

# - valor p, quando comparado entre os grupos. @ - valor p, quando comparado à linha de base e o valor do dia 7 dentro do grupo. p<0,05 - estatisticamente significativo; NA - Não Aplicável. N+ Número de pacientes.

O Teste Exato de Fisher foi aplicado para proporções, n - Proporção de pacientes.

Claims

1. Composição farmacêutica para o tratamento do ataque isquêmico agudo, caracterizada pelo fato de que compreende tenecteplase a uma concentração de 0,2 mg/kg de peso corporal juntamente com um tampão inorgânico, agentes estabilizadores e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que a proporção de tenecteplase: agentes estabilizadores é 1: 11.086.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dose efetiva e segura de tenecteplase é cerca de 0,10 a 0,24 mg/kg de peso corporal quando administrada.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os agentes estabilizantes são L-arginina e polissorbato ou uma mistura destes.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1 e 3, caracterizada pelo fato de que a proporção de L-arginina: polissorbato é 11: 0.086.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os componentes são liofilizados e reconstituídos antes do uso.