RU2809360C1

RU2809360C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-IFG144, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI JM109/pET32a-IFG144 - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА ИНТЕРФЕРОН ГАММА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

Info

Publication number: RU2809360C1
Application number: RU2022134306A
Authority: RU
Inventors: Георгий Георгиевич Чумбуридзе
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Фармаклон"
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2023-12-11

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается лекарственного средства, представляющего собой лиофилизат, содержащий маннит и высокоочищенный интерферон гамма (ИНФ-гамма) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, причем интерферон гамма получен культивированием штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144, где после 3-5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза рекомбинантного белка в клетках Escherichia coli JM109/рЕТ32а-IFG144 изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом и выдерживают 4-6 часов, с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего белок ИНФ-гамма, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента белка ИНФ-гамма, последующую очистку выделенного белка ИНФ-гамма, путем катионообменной хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию белка ИНФ-гамма путем последовательного дробного добавления денатурированного белка в буфер для ренатурации, содержащий L-аргинин, и очистку ренатурированного белка ИНФ-гамма катионообменной хроматографией в буфере, содержащем натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный и натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, где интерферон гамма имеет чистоту не менее 97% и удельную биологическую активность не менее 1,8×10⁷ ME на 1 мг белка, а штамм-продуцент получен путем трансформации родительского штамма Е. coli JM109 рекомбинантной плазмидой рЕТ32а-IFG144 размером 5806 пар оснований, содержащей структурные элементы: промотор Т7 и оператор lacO, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую белок ИНФ-гамма, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (LacIpromoter), при следующем соотношении компонентов (мас.%): интерферон гамма с удельной активностью не менее 1,8×10⁷ МЕ/мг и чистотой не менее 97% 0,03-0,13; натрий хлористый 3,2-10; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 6,4-20; натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,64-2; манит – остальное. Изобретение позволяет получить лекарственное средство, содержащее более чистый химически и биологически стабилизированный белок интерферона гамма, что повысило эффективность действия и уменьшило его побочное действие за счет оптимально подобранного как состава компонентов, так и их количества, а также позволило увеличить срок хранения лекарственного средства до 3-х лет при температуре от 2 до 25°С. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 12 пр.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии и касается нового штамма бактерий, который используется для получения рекомбинантного человеческого интерферона гамма, применяемого в медицинской промышленности, в частности для получения препарата на основе интерферона гамма, предназначенного для профилактики и лечения вирусных заболеваний, новообразований и расстройств иммунитета.

Известно, что рекомбинантный человеческий интерферон гамма (далее ИНФ-гамма, интерферон гамма) является полифункциональным белком, вырабатываемым клетками иммунной системы, обладает иммуностимулирующей, противоопухолевой и антивирусной активностями. Создание микроорганизмов-продуцентов человеческого ИНФ-гамма позволило получать биологически активный рекомбинантный белок в количествах, необходимых как для проведения широких структурно-функциональных исследований, так и для использования в медицинской практике. В настоящее время созданы лекарственные препараты на основе рекомбинантного ИНФ-гамма для лечения иммунных, онкологических и тяжелых вирусных заболеваний. В связи с этим разработка новых высокопродуктивных штаммов и эффективных способов получения рекомбинантного ИНФ-гамма является актуальной.

В природе, интерферон-гамма - это цитокин, вырабатываемый Т-лимфоцитами и естественными клетками-киллерами, который существует в виде гомодимера из двух нековалентно связанных полипептидных субъединиц. Зрелый гамма-интерферон человека представляет собой полипептид длиной 143 аминокислотных остатка и не содержит остатков цистеина Предшественник включает 166 аминокислотных остатков / Rinderkneht E., O'Connor В.Н., Rodriguez H. Natural human interferon-gamma: Complele aminoasids sequence and determination of sites of glycosilation. J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 6790-6797; "Structure of the human immune interferon gene." Gray P.W., Goeddel D.V. Nature 298:859-863(1982). EP 0077670, A2, A61K 35/14,1981; EP 0089676, A2, C07K 14/57,1983)

Биологически активной формой ИФН-гамма является нековалентно связанный димер, тепловая денатурация которого происходит при 52°С и сопровождается инактивацией и необратимым агрегированием. С-концевые остатки не участвуют в образовании третичной структуры белка и их делеция вплоть до 20 аминокислот не приводит к потере биологической активности (Slodowski О., Bohm J., Schone В., Otto В. Carboxy-terminal truncated rhuIFN-g with a substitution of Gln 133 or Ser 132 to leucine leads to higher biological activity than in the wild type. Eur. J. Biochem. 1991. V. 202. P. 1133-1140).

Известно о различных естественных или мутированных формах полипептидов субъединиц ИНФ-гамма, включая форму, содержащую N-концевую последовательность из аминокислот Cys-Tyr-Cys, форму, содержащую N-концевой метионин и различные укороченные с С-конца формы, содержащие 127-134 аминокислотных остатка. Показано, что удаление 1-15 аминокислотных остатков с С-конца не вызывает потери активности молекулы белка. К тому же известно о гетерогенности С-конца человеческого интерферона гамма (RU, 2296130, C1, C07K 14/57, 2002).

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению в отношении плазмиды, является патент (RU, 2214832, A61K 38/21, 2002), где описана рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез белка интерферона гамма, состоящего из 144 аминокислотных остатков. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGIF315 размером 3,15 тысяч пар нуклеотидов, кодирующая в клетках Escherichia coli рекомбинантный человеческий гамма-интерферон размером 144 аминокислотных остатка с молекулярной массой 16,9 кДа, характеризуется следующими свойствами: содержит между двумя сайтами рестриктазы EcoRI промотор А2 и между сайтами рестриктаз EcoRI и KpnI промотор A3 фага Т7, между сайтами рестриктаз KpnI и XbaI рибосомосвязывающий сайт, между сайтами рестриктаз XbaI и BgIII ген, кодирующий синтез рекомбинантного человеческого гамма-интерферона, между двумя сайтами рестриктазы XbaI терминатор транскрипции, имеет ген устойчивости к ампициллину.

Недостатками ближайшего аналога является то, что для получения биомассы, проводят трансформацию клеток Escherichia coli штамма SG 200-50 рекомбинантной плазмидой перед каждой ферментацией, штамм - продуцент на основе данной плазмиды не создан.

Наиболее близким аналогом в отношении заявляемого объекта штамм - является штамм С 600 Е. coli, который является штаммом-продуцентом ИФН-гамма человека Е. coli T3g., куда введена рекомбинантная плазмида pTTgKm2 (RU, 2097428, C1, C12N 15/23, 1996). Описанный штамм E. coli T3g продуцирует белок, состоящий из 144 аминокислотных остатков. Рекомбинантная плазмида pTTgKm2 сконструирована на основе плазмиды pUC 19, имеющей ген устойчивости к канамицину, триптофановый промотор, вслед за ним ген человеческого гамма-интерферона и терминаторы транскрипции rrnBT₁T₂. Недостатком аналога является использование в качестве штамма-продуцента рекомбинантного человеческого интерферона гамма штамма С 600 Е. coli, который не позволяет получить стабильный синтезируемый рекомбинантный белок с высоким выходим.

Недостатком является также то, что экспрессия гена человеческого интерферона-гамма с триптофанового промотора запускается в средах с дефицитом триптофана. В обычных питательных средах работа триптофанового промотора репрессирована. При этом в компонентах обычных питательных сред (таких как дрожжевой экстракт, гидролизаты казеина: триптон, пептон) содержание триптофана не ограничивается, поэтому поиск или приготовление сред с пониженным содержанием триптофана усложняет технологию и удорожает себестоимость этапа культивирования.

Также из уровня техники известны способы получения интерферона гамма.

Так, известно много способов получения рекомбинантного ИНФ-гамма человека, но все они трудоемки, дорогостоящи, описаны для выделения аналитических количеств белка и трудно масштабируемы (US, 4604284, A61K 37/02, 05.08.86; US, 4751078, A61K 45/02, 14.06.88;US, 4617378, C07K 15/26,14.10.86).

Известен способ, позволяющий получить интактный нативный ИНФ-гамма, который включает несколько стадий: химический лизис клеток штамма-продуцента E. coli и одновременную солюбилизацию ИНФ-гамма из телец включения раствором 7М гуанидинхлорида; удаление нерастворившихся компонентов центрифугированием; 10-кратное разбавление целевой фракции буфером рН 9,5 и отделение образующегося осадка белков центрифугированием; фракционирование белков на силикагеле (NuGel-952 АС); и, наконец, аффинная хроматография на сорбенте с моноклональными антителами. (US, 4681930, C07K 15/26, 1987) Полученный продукт находится в растворе 20 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 1М NaCl и 1М гуанидинхлорид (или 50% этиленгликоль), и представляет собой белок с молекулярной массой 18000, гомогенный по электорофорезу. Выход из 25 г клеток составляет 8 мг (25-32% от содержания в клеточном экстракте). Биологическая активность препарата по ингибированию цитопатического эффекта составляет 10⁷ ед/мг белка.

Недостатком этого способа является то, что одновременное разрушение клеток и солюбилизация не дают возможности использовать одно из преимуществ образования телец включения, заключающееся в легком отделении балластных водорастворимых белков бактериальной цитоплазмы от нерастворимого целевого продукта простым центрифугированием. Использование иммунного сорбента для очистки белка очень дорого, нетехнологично, трудно масштабируемо. Недостатком иммуносорбции в качестве способа очистки интерферона гамма является использование дорогостоящих, высокоспецифичных моноклональных антител, приготовление которых требует особой технологии. Кроме того, существует опасность загрязнения конечного продукта трансформирующими факторами и вирусами, происходящими от гибридомных линий. В результате могут возникать конформационные изменения интерферона гамма (денатурация), что приводит к снижению его биологической активности. Поэтому требуется дополнительный сложный анализ конечного продукта на отсутствие онкогенного материала родительской миеломной клетки, используемой при получении моноклональных антител.

Для очистки рекомбинантного ИНФ-гамма так же используют известный способ очистки, включающий осаждение полиэтиленимином, хроматографию на колонке с четвертичным аминоэтилом (QAE), хроматографию на колонке с фенилсефарозой, осаждение сульфатом аммония, хроматографию на колонке с Сефадексом G-100 и диализ (US,4751078, А, C07K 14/57, 1988).

Известен и другой способ очистки, основанный на серии хроматографических процедур, использующих три свойства ИНФ-гамма - высокую изоэлектрическую точку, отсутствие остатков цистеина и склонность к самоассоциации. (Arakawa, Т., Alton, K.N. and Hsu, R.Y. Preparation and characterization of recombinant DNA-derived human interferon-g. J. Biol. Chem. 260, 14 435-14 439,1985) При этом, не упоминается название какой-либо смолы, кроме Sephadex G-50, в качестве заключительной стадии очистки, которую необходимо проводить в 1 M мочевины, чтобы избежать адсорбции белка в колонке.

Так же известен способ, где используют центрифугирование в градиенте плотности для выделения тел включения и только одну колонну с сорбентом для гель-фильтрациии. (Vanderbrock, K, Martens E, Andrea S.D. and Billiau, Refolding and single step purification of Porcine interferon-gamma from Escherichia coli inclusion bodies: conditions for reconstitution of dimeric IFN-g. Eur. J. Biochem. 215,481-486, 1993) Эти способы страдают от проблем, связанных с процессом расширения масштабов.

Недостатком иммуносорбции как способа очистки ИНФ-гамма является использование дорогостоящих, высокоспецифичных моноклональных антител, получение которых требует отдельной технологии и существует опасность загрязнения конечного продукта трансформирующими факторами и вирусами, происходящими из гибридомных линий. (US,5278286A, C07K 1/113, 1994). Кроме того, рекомбинантный ИНФ-гамма, как и многие другие рекомбинантные белки, может быть легко агрегирован в растворах, которые не содержат денатурирующих или хаотропных агентов.

Так же известен способ получения интерферона гамма, предусматривающий ренатурацию за счет десятикратного разведения водой ИНФ-гамма, растворенного в 7 M растворе мочевины, а затем фракционирование и осаждение ИФН-гамма сульфатом аммония (RU, 2097428, C1,C12N15/23, 1996). Однако, это не технологично, так как операции с большими объемами растворов требуют большего расхода реагентов (того же сульфата аммония) и использования крупномасштабного оборудования. Кроме того, хроматографию осуществляют на анионообменнике, а ИФН-гамма имеет положительный заряд при рН от 0 до 10, поэтому интерферон гамма не может сорбироваться на положительно заряженные анионообменники. Кроме того, осаждение сульфатом аммония вызывает частичную необратимую денатурацию белка.

Известен способ, позволяющий получать большой выход правильно свернутого белка, но поскольку получение молекулярных шаперонов отнимает много времени, а для облегчения рефолдинга белка необходимы большие количества шаперонов при масштабировании производства этот способ не приемлем. (Yong-Gui Gao, Yi-Xin Guan, Shan-Jing Yao, Biotechnol. Prog. 2003, 19(3):915-20).

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению, в отношении объекта способа получения гамма- интерферона, является способ получения гамма-интерферона, который, включает: трансформацию подходящего штамма E. coli плазмидой pGIF315, культивирование клеток трансформированного штамма в обычной среде, лизис клеток и отмывку агрегированного белка, растворение ИФН-гамма в 7 М растворе мочевины, хроматографию на катионообменнике с одновременной ренатурацией. (RU, 2214832, А 61 К 38/21, 2002)

Недостатком известного способа является то, что проведение ренатурации одновременно с хроматографией не позволяет получать приемлемый выход правильно свернутой формы рекомбинантного белка.

Интерферон гамма представляет собой плейотропный лимфокин, обладающий множественным действием на рост и дифференцировку разных типов клеток, связанных с врожденным иммунитетом. ИНФ-гамма индуцирует дифференцировку миелоидньгх клеток, в результате чего они приобретают функциональные свойства более зрелых моноцитов, стимулирует экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса II и ГКГС класса I, является мощным активатором макрофагов, которые уничтожают проникшие в клетку антигенные молекулы. ИНФ-гамма широко применяют для лечения инфекционных, онкологических, аутоиммунных и аллергических заболеваний. Исследования свидетельствуют о том, что препараты ИФН-гамма могут с успехом использоваться для профилактики гриппа и острых респираторных заболеваний (ОРЗ) в период подъема заболеваемости, а также для лечения в первые дни/часы от начала болезни. (Сологуб Т.В., Мидикари А.С., Агафонов В.Н. и др. Эффективность и целесообразность использования рекомбинантного интерферона-гамма в комплексной терапии больных гриппом A(H1N1)pdm09 // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2017. Т. 22. №2. С. 58-63)

Способы приготовления готовых форм рекомбинантных белков известны из уровня техники. Известны лекарственные формы рекомбинантных белков, которые готовили с использованием сложных композиций, состоящих из комплекса аминокислот, хлорбутанола, бензилового спирта, бензалкониум хлорида и неорганических компонентов буферных растворов. (US, 5656730, A61K 035/14; 1996) Для получения готовой лекарственной формы, содержащей 10-2000 мкг/мл рекомбинантного белка, в указанном растворе растворяют соответствующее количество субстанции и используют полученный раствор в равной степени для приготовления жидкой или лиофилизованной формы. Существенным недостатком данного подхода является необходимость использования крайне сложной композиции, содержащей такие компоненты, как 1,1,1-трихлор-2-метил-2-пропанол, бензиловый спирт и бензалкониум хлорид.

Известен препарат стабилизированного интерферона гамма для получения которого использовали солевые буферы в области рН 4, 5 с добавлением человеческого (донорского) сывороточного альбумина в концентрации 15 мг/мл раствора и последующим сублимационным высушиванием раствора до остаточной влажности 2 5% (ЕР, 0196203, A3, A61K 38/21, 21.03.86) Однако, это приводит к риску заражения вирусами СПИДа и гепатита В, загрязняющими препараты альбумина, и в ряде случаев, особенно при лечении раковых больных большими дозами препарата интерферона гамма, к быстрой сенсибилизации организма больного к введенному белку и вследствие этого снижению эффективности препарата и даже возникновению аллергических состояний.

Так же известны две препаративные формы интерферона без человеческого сывороточного альбумина (CN, 1160355, С, A61K 47/34, 24.09.1997; CN, 1141808, С, A61K 9/08, 04.04.1996). Тем не менее, консервант имеет в норме большую или меньшую токсичность и побочные эффекты. Препаративные формы, содержащие консерванты, могут вызывать определенные виды раздражений в месте укола во время инъекции. Более того, большинство консервантов воздействуют на биологическую активность интерферона.

Так же известен препарат генно-инженерного интерферона гамма, на основе высокоочищенного интерферона гамма с мол. м. 16,7 кДа, состоящего из 144 аминокислотных остатков, имеющего удельную антивирусную активность не менее 2×10⁷ МЕ/мг и содержащего, по данным электрофореза в полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия, не менее 95% основного вещества в форме мономера, а в димерной форме не более 5% и имеющего в составе биологически инертный полимерный наполнитель и аминокислоту либо ее соль, поверхностно-активное вещество (ПАВ) и солевую буферную систему с рН 4,5-7,5 (RU, 2077336 C1, A61K 38/21, 1994). Однако, срок хранения этого препарата составляет всего 1 год при 4°С

Недостатками известных композиций является маленький срок хранения и сложный набор компонентов, в том числе консервантов (кислот, мочевины, спиртов), включаемых в состав для обеспечения стабильности противовирусных свойств и наличие других аллергенных вспомогательных веществ (ацетата - токоферола, ацетатных буферов, плазмозамещающих растворов и пр.) которые вызывают аллергические реакции у пациентов, что ограничивает терапевтические возможности.

Из всех известных интерферонов, интерферон гамма имеет самую низкую термическую стабильность. Такая низкая термическая стабильность интерферона гамма делает его трудно используемым в качестве активного компонента для производства различных средств.

Наиболее близким аналогом, в отношении заявляемого объекта лекарственное средство, является лиофилизированный препарат генно-инженерного интеферона гамма, состоящий из интерферона, наполнителя и соли. (RU, С1, 2214832, A61K 38/21, 2002) В качестве наполнителя используется шестиатомный спирт, относящийся к сахарам, маннит (маннитол). Препарат получали путем смешивания раствора очищенного интерферона гамма с 15%-ным стерильным раствором маннита и физиологическим раствором (150 мМ натрия хлористого), при этом интерферон гамма имеет электрофоретическую чистоту не менее 95%. Состав препарата включает в расчете на одну дозу: гамма-интерферона 5, 25 или 50 мкг (100000, 500000 и 1000000 ME соответственно), маннита, 2-1,5%, 150 мМ натрия хлористого до 1 мл. При этом препарат имеет срок хранения 1 год при температуре 4-8°С.

Недостатком данного препарата является то, что подобная рецептура не стабильна, что очень часто приводит к деградации белка после растворения. Это ведет к потере биологической активности белка и может вызвать проблемы при лечении. Из -за низкой чистоты интерферона гамма данное лекарственное средство обладает побочным действием. А также существенным недостатком является короткий срок годности и низкая температура хранения, которая требует специальных условий хранения и транспортировки.

В настоящее время любое лекарственное вещество не поступает в организм в чистом виде. Поэтому основным требованием к лекарственным средствам является их химическая и биологическая чистота. Присутствие даже в незначительном количестве органических и/или неорганических примесей может вызвать нежелательные побочные действия у пациентов. К сожалению, побочным действием обладает и интерферон гамма (В.В. Брюзгин, Л.В. Платинский. Роль цитокинов в химиотерапии злокачественных опухолей: практика применения цитокиновых препаратов Рефнот® и Ингарон® при распространенных опухолевых процессах с множественными метастазами. Современная онкология. 2014; 16(1):23-25).

При создании лекарственного средства необходимо учитывать, что человеческий рекомбинантный интерферон гамма должен обладать следующими параметрами, характерными для ИНФ-гамма:

- мономер интерферона гамма должен имеет молекулярную массу (16,9±0,2) кДа. Положение основной полосы мономера интерферона гамма на электрофореграмме испытуемой субстанции соответствует положению основной полосы мономера стандартного образца интерферона гамма CRS;

- положение основной полосы иммунокомплекса интерферона гамма со специфическими моноклональными антителами к интерферону гамма должно соответствовать положению полосы иммунокомплекса стандартного образца интерферона гамма (CRS) с специфическими моноклональными антителами к интерферону гамма (метод вестерн-блот);

- не более 3 мкг/мл остаточных белков клетки-хозяина;

- остаточная ДНК штамма-продуцента составляет не более 100 пкг/10⁶МЕ;

- бактериальные эндотоксины составляют не более 0,5 ЕЭ/10 ME;

- удельная биологическая активность не менее 1,7×10⁷ МЕ на 1 мг белка.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание штамма -продуцента белка интерферона гамма на основе сконструированной плазмиды, направляющей синтез интерферона гамма с целью повышения эффективности и снижения трудоемкости способа получения, увеличения выхода и чистоты белка ИНФ-гамма, имеющего аминокислотную последовательность из 144 аминокислотных остатков и соответствующего вышеуказанным характерным параметрам, а так же получение более химически и биологически чистого и стабильного при хранении лекарственного средства на основе рекомбинантного интерферона гамма, имеющего хорошую переносимость, минимальный побочный эффект, расширенный диапазон температуры хранения и обладающего высокой активностью при использовании в лечении различных заболеваний.

Поставленная задача достигается за счет создания рекомбинантной плазмиды pET32a-IFG144 размером 5806 пар оснований (п.о.), обеспечивающей синтез белка имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO1 размером 16,9 кДа и содержащей структурные элементы: промотор Т7 и оператор lacO, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую белок интерферон гамма, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (LacIpromoter).

Еще одним заявляемым объектом является штамм Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144 - продуцент белка интерферона гамма, полученный трансформацией родительского штамма Е. coli JM109 рекомбинантной плазмидой рЕТ32а- IFG144.

Так же заявляется способ получения ИНФ-гамма, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/ pET32a-IFG144 по п. 2, при этом после 3 -5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза рекомбинантного белка в клетках Escherichia coli JM109/ рЕТ32а- IFG144 изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом и выдерживают 4-6 часов, с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего белок ИНФ-гамма, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента белка ИНФ-гамма, последующую очистку выделенного белка ИНФ-гамма, путем катионообменной хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию белка ИНФ-гамма путем последовательного дробного добавления денатурированного белка в буфер для ренатурации, содержащий L-аргинин и очистку ренатурированного белка ИНФ-гамма катионообменной хроматографией в буфере, содержащем натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный и натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, с получением белка с чистотой не менее 97%.

При этом культивирование клеток Escherichia coli JM109/ рЕТ32а- IFG144 проводят в ростовой среде на протяжении по меньшей мере 8 часов, но не более 10 часов.

А ренатурацию денатурированного белка проводят в присутствии L -аргинина с концентрацией 0,3М - 0,5М, при этом ренатурацию проводят дробным добавлением денатурированного белка через каждые 1-2 часа инкубации.

Еще одним объектом заявленного изобретения является лекарственное средство, представляющее собой лиофилизат, содержащий маннит и высокоочищенный интерферон гамма (ИНФ-гамма) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, причем интерферон гамма получен культивированием штамма-продуцента Escherichia coli JM109/ pET32a-IFG144, где после 3 -5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза рекомбинантного белка в клетках Escherichia coli JM109/ рЕТ32а- IFG144 изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом и выдерживают 4-6 часов, с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего белок ИНФ-гамма, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента белка ИНФ-гамма, последующую очистку выделенного белка ИНФ-гамма, путем катионнообменной хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию белка ИНФ-гамма путем последовательного дробного добавления денатурированного белка в буфер для ренатурации, содержащий L-аргинин и очистку ренатурированного белка ИНФ-гамма катионообменной хроматографией в буфере, содержащем натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный и натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, где интерферон гамма имеет чистоту не менее 97% и удельную биологическую активность не менее 1,8×10⁷ МЕ на 1 мг белка, а штамм-продуцент получен путем трансформации родительского штамма Е. coli JM109 рекомбинантной плазмидой рЕТ32а- IFG144 размером 5806 пар оснований содержащей структурные элементы: промотор Т7 и оператор lacO, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую белок ИНФ-гамма, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (LacIpromoter), при следующем соотношении компонентов (масс %):

Интерферон гамма с удельной активностью не
менее 1,8×10⁷ МЕ/мг и чистотой не менее 97%	0,03-0,13
Натрий хлористый	3,2-10
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный	6,4-20
Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный	0,64-2
Маннит	остальное

При этом, после очистки белок ИНФ-гамма может быть заморожен и в последующем разморожен перед смешиванием с маннитом.

Таким образом, заявленная группа изобретений объединена единым изобретательским замыслом, направленным на создание лекарственного средства, которое получено с использованием рекомбинантной плазмиды рЕТ32а- IFG144, обеспечивающей синтез интерферона гамма, а также штаммом бактерий Escherichia coli JM109/pET32a- IFG144 продуцентом белка интерферон гамма, а также способом получения интерферона гамма

При производстве лекарственных средств, содержащих интерферон гамма, надо учитывать, что для обеспечения постоянства свойств лекарственного препарата, содержащего допустимые примеси в определенном диапазоне, должен соблюдаться целый ряд требований при ферментации, экспрессии белка и очистке.

Предложенный штамм Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144 имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с известными из уровня техники, в т.ч. ранее указанными источниками. Так, для ферментации, описанной в ближайшем источнике, используется трансформационная смесь, а не штамм. (RU, 2214832, А 61 К 38/21, 2002). Это не позволяет проводить процесс в строго определенных условиях, описанных в стандартных операционных процедурах, что сказывается на качестве получаемого белка, соответственно это сказывается и на лекарственном препарате. При этом, наращивание биомассы происходит до оптической плотности OD₆₀₀=4опт.ед. А наращивание биомассы с использованием заявляемого штамма JM109/pET32a-IFG144 происходит до OD₆₀₀=(30-35) опт.ед Что касается штамма-продуцента ИФН-гамма человека Е. coli T3g. RU, 2097428, С1, 1996), то недостатком является экспрессия гена человеческого интерферона-гамма с триптофанового промотора, который запускается в средах с дефицитом триптофана, что влечет за собой поиск или приготовление сред с пониженным содержанием триптофана усложняет технологию и удорожает себестоимость этапа культивирования. При этом количество белка составляет 7 г/л, в заявляемом изобретении -не менее 40 г/л.

Таким образом, создание штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144 позволяет получить эталонную культуру, заложить на хранение рабочую культуру клеток штамма и проводить процесс ферментации при стандартизованных условиях. В заявляемом изобретении выход биомассы с 1 л культуральной жидкости составляет от 40 до 60 г. А в вышеуказанных патентах получают биомассу 5-7 г/л. Соответственно, эффективность заявляемой ферментации увеличилась в 6-10 раз.

Необходимо отметить, что штамм Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144 задепонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-10280.

Настоящее изобретение относится к белку ИНФ-гамма, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1:

Нуклеотидная последовательность синтетического фрагмента, кодирующая ИНФ-гамма SEQ ID NO 2 представлена ниже:

Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами.

На Фиг. 1 изображена Карта плазмиды, содержащая:

f1 ori - ориджин репликации бактериофага f1,

AmpR - ген резистентности к ампициллину (ген β-лактамазы),

Ori - ориджин репликации colE1,

Т7 promoter - промотор бактериофага Т7,

INF-gamma - ген белка IFG144,

Т7 terminator - терминатор бактериофага Т7,

LacI - ген лактозного репрессора LaI.

На Фиг 2. представлена хроматограмма интерферона гамма, полученного по способу описанному в ближайшем аналоге.

На Фиг. 3 представлена хроматограмма заявленного интерферона гамма, полученного из заявляемого штамма Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144.

На Фиг. 4 представлена хроматограмма стандарта интерферона гамма (CRS).

При этом, представленные на Фиг. 2, Фиг. 3, Фиг. 4 результаты, получены методом высокоэффективной эксклюзионной хроматографии. Метод используется для определения качества белка по показателю «Чистота. Родственные соединения и посторонние примеси». В качестве раствора сравнения использовали стандартный образец интерферона гамма-1b CRS (ЕР CRS, кат. №10320330).

В заявляемом техническом решении поставленная задача решается посредством конструирования рекомбинантной плазмиды pET32a-IFG144 для экспрессии указанного белка, создания высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144, продуцирующего белок ИНФ-гамма, а также способа получения белка, позволяющего получать белок ИНФ-гамма с высоким выходом и высокой степенью химической и биологической чистоты, что позволяет использовать белок ИНФ-гамма в лекарственном средстве, обладающем длительным сроком хранения с сохранением биологической активности при отсутствии побочного действия на организм человека.

Так же в заявляемом техническом решении предложен упрощенный способ получения интерферона гамма, состоящий из культивирования клеток штамма-продуцента в обычной среде, лизис клеток, одностадийную отмывку агрегированного белка, растворение ИФН-гамма в 7 M растворе мочевины, хроматографию на катионообменнике в денатурирующих условиях, ренатурацию, очистку на катионообменнике.

Преимущество способа, согласно изобретению, состоит в том, что за счет высокоэффективной ренатурации увеличивается чистота получаемого продукта, а также увеличивается выход получаемого продукта. Неспецифическое агрегирование сильно влияет на конечный выход правильно свернутого интерферона гамма, обладающего большой гидрофобностью и не имеющего дисульфидных связей. Реакции агрегации ИНФ-гамма, которые происходят во время ренатурации белков, могут быть подавлены веществами, которые дестабилизируют неправильно свернутые или неправильно связанные молекулы. Неожиданно было обнаружено, что мочевина и L-аргинин, используемые в неденатурирующих концентрациях, являются мощным подавителем агрегации. Мы получили минимум 2-кратное увеличение выхода, а также удельной активности при проведении ренатурации с аргинином по сравнению с ренатурацией в его отсутствии. Присутствие 0,3-0,5 M L-аргинина в буфере для ренатурации позволило по меньшей мере трижды последовательно добавлять (каждые 1-2 ч) денатурированный белок в буфер, тем самым увеличивая выход функционального белка. Как показали наши исследования, частично свернутые белковые молекулы, по-видимому, защищены от неспецифической агрегации, поэтому денатурированный ИНФ-гамма добавляют поэтапно, позволяя каждой добавленной аликвоте достичь своего защищенного состояния перед добавлением следующей. Этот метод импульсной ренатурации позволяет эффективно использовать ренатурационный буфер за счет значительного уменьшения требуемых объемов реакции и сокращения времени процесса.

Также преимуществом способа является использование ионообменной хроматографии на катионообменнике, что снижает содержание эндотоксинов в конечной пробе. Известно, что большинство эндотоксинов имеют сильно отрицательный заряд и, таким образом, в наших хроматографических условиях не будут связываться с сорбентом СМ-сефарозой, в результате чего получается гамма-интерферон, содержащий эндотоксины в количествах ниже клинически приемлемых (менее 0,5 ЕС на мг).

Таким образом, заявляется рекомбинантный человеческий интерферон гамма с чистотой не менее 97%. Однако, как показали проведенные исследования чистота преимущеннно составляет величину не менее 99.5%. Что подтверждается представленной на Фиг. 4 хроматограммой интерферона гамма в методе высокоэффективной эксклюзионной хроматографии из которой видно, что его чистота составляет 100%.

Также заявленный интерферон гамма соответствует параметрам представленным выше и стабилен при рН от 5 до 8,5, при этом удельная активность составляет не менее 1,8×10⁷ ME на 1 мг белка.

Также преимуществом заявленного способа является возможность автоматизированного широкомасштабного производства с использованием недорогих технических средств и ионообменника, который может быть регенерирован и стерилизован при многократном промышленном использовании.

Лекарственное средство, полученное на основе полученного по данному изобретению интерферона гамма, нетоксично и апирогенно при испытаниях на острую и хроническую токсичность и пирогенность у мышей и кроликов, обладает контролируемой антивирусной активностью при испытаниях на культурах клеток человека. Не оказывает побочных эффектов. По всей видимости, это обусловлено отсутствием примесей белковой природы и эндотоксинов. Чистота интерферона гамма полученного из штамма Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144 по сравнению с аналогом представлена на Фиг. 3 и Фиг. 2.

На Фиг. 2 показаны результаты анализа интерферона гамма, полученного по ближайшему аналогу из штамма Escherichia coli SG 200-50 /pGIF315. Из представленной хроматограммы следует, что в интерфероне гамме присутствуют примеси белковой природы с молекулярным весом больше, чем интерферон гамма, количество которых составляет 4%. (Пики выхода на 7,26 минуте и 11,86 минуте). Таким образом, чистота целевого белка составляет 96%.

Результаты анализа интерферона гамма, полученного из заявленного штамма Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144 показаны на Фиг. 3. Как видно из хроматограммы, примеси белковой природы в данном образце отсутствуют и чистота интерферон гамма составляет 100%.

И в том и другом случае пик целевого белка совпадает с временем выхода пика стандартного образца (Фиг. 4) и представляет собой интерферон гамма.

Таким образом, высокоочищенный интерферон гамма, полученный по данному изобретению, не имеет в составе эндотоксинов, а так же отсутствуют ковалентные димеры и олигомеры, мономер и агрегаты, что подтверждается сравнением чистоты белка интерферона гамма, полученного из штамма Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144 с аналогом и стандартным образцом представлено на Фиг. 2, Фиг. 3, Фиг. 4.

Необходимо отметить, что за счет получения 100% чистого белка интерферона гаммы и за счет экспериментально подобранных компонентов: маннита, натрия хлористого, натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного и натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного, заявленное лекарственное средство не обладает побочным действием. Данный факт подтверждается проведенными исследованиями, ни у одного из испытуемых не возникло никакого побочного действия (зуда, жжения, воспаления в месте инъекции, аллергических реакций и т.п.), что подтверждается ниже приведенными примерами.

При создании лекарственного средства важным является не только чистота интерферона гамма, для снижения побочного действия, но и сохранение активности человеческого рекомбинантного интерферона гамма в активной форме в течение продолжительного периода времени в широком диапазоне температур.

Основной проблемой, связанной с любыми белковыми композициями, является преодоление физической неустойчивости белков. Физическая неустойчивость не вызывает изменений ковалентных связей в белках. Физическая неустойчивость скорее предполагает изменение структуры белков более высокого порядка, например, вторичной структуры. Такие изменения включают денатурацию, адсорбцию на поверхностях, агрегацию и осаждение.

Известно, что устойчивость белка можно улучшить, вводя в композицию соли соединений и их ионные разновидности. Такие соединения помогают устранить денатурацию белков, образуя неспецифические связи с белками и повышая термостабильность. Соли (например, NaCl, KCl), аминокислоты (например, гистидин, аргинин), уменьшают изменение вторичных структур белков. Другие примеры обычно используемых добавок включают многоатомные спирты, сахара, поверхностно-активные вещества. Однако, проведенные эксперименты показали, что введение различных добавок вызывают возникновение побочного действия лекарственных средств. Поэтому экспериментальным путем был определен количественный и компонентный состав, который с одной стороны стабилизирует высоочищенный рекомбинантный интерферон гамма в границах от 100000 до 500000 МЕ/мг, а с другой стороны не наносит вред организму человека.

Заявляемый состав обеспечивает высокую стабильность высокоочищенного рекомбинантного интерферонна гамма при хранении (см. Таблица 1-3), в широком диапазоне температур. При этом, срок годности препарата увеличен на 1 год по сравнению с аналогом (Таблица 1,4).

Из представленных результатов таблиц по стабильности видно, что при одних и тех же условиях хранения, дозировках срок годности заявляемого лекарственного средства составляет 3 года, без существенной потери активности, т.е. на 1 год больше по сравнению с ближайшим аналогом. Из Таблицы 3 следует, что при хранении при температуре 25°С активность лекарственного средства снижается не значительно. Таким образом, как следует из представленных данных, срок хранения и стабильность заявляемого лекарственного средства намного выше, чем у аналогового препарата.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение лекарственного средства содержащего более чистый химически и биологически стабилизированный белок интерферона гамма, что повысило эффективность действия и уменьшило его побочное действие, за счет оптимально подобранного как состава компонентов, так и их количества, а так же позволило увеличить срок хранения лекарственного средства до 3-х лет при температуре от 2 до 25°С. Так же техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности получения белка интерферона гамма, а именно, увеличение выхода белка из биомассы штамма с чистотой конечного продукта не менее 97%, за счет создания рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента ИНФ-гамма, полученного на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды, что обеспечивает повышенный выход ИНФ - гамма, за счет увеличения количества получаемой в ходе культивирования биомассы в 6-10 раз.

Указанный технический результат достигается созданием штамма на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды рЕТ32а -IFG144 и способом получения белка с использованием такого штамма.

Рекомбинантная плазмида pET32a-IFG144 для экспрессии белка ИНФ-гамма, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, длину 5806 пар оснований и состоит из следующих ключевых генетических элементов:

- промотора Т7 и оператора lacO;

- синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO 2, кодирующую белок IFG144;

- гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter);

- гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (LacIpromoter);

- ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori).

В качестве вектора экспрессии выбрана плазмида рЕТ32а. Для получения плазмиды по изобретению последовательность SEQ ID NO 2, полученную полным нуклеотидным синтезом, встраивают в плазмидный вектор рЕТ-32а по сайтам рестрикции XhoI и NdeI.

Структура указанной плазмидной ДНК (плазмиды), состоящей из указанных ключевых генетических элементов, представлена на Фиг. 2.

В вышеуказанной плазмиде ген AmpR предназначен для селекции стабильных клеток Escherichia coli. Бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter) предназначен для его экспрессии.

Ориджин репликации бактериофага f1 /Analysis of Genes and Genomes, John Wiley&Sons, 2004, S. 140 / широко используется для создания экспрессионных векторов.

Продуктом трансляции синтетической последовательности SEQ ID NO 2 является полипептид последовательности SEQ ID NO 1, представляющий интерферон гамма.

После клонирования синтезированной последовательности в составе вектора, полученной рекомбинантной плазмидой была проведена трансформация бактериальных клеток Escherichia coli JM109.

Исходным материалом для создания штамма-продуцента по изобретению является известный из уровня техники штамм JM109. Генотип: endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (r_k ^-, m_k ⁺), relA1, supE44, Δ(lac-proAB), [F' traD36,proAB, lacI^qZΔM15]. (Yanisch-Perron, J. Vieira, and J. Messing. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33(1):103-19, 1985).

Экспрессионной плазмидой длиной 5806 п.о., состоящей из ключевых генетических элементов, расположенных друг относительно друга так, как представлено на Фиг. 2, трансформируют клетки штамма JM109.

Для введения плазмиды в клетки Е. coli JM109 могут использоваться методы трансформации, известные из уровня техники, например, электропорация, метод с использованием полиэтиленгликоля, кальций-хлоридный метод. Также для целей настоящего изобретения для введения в клетки Е. coli JM109 плазмиды, представленной на Фиг. 2, могут использоваться и другие методы трансформации, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод трансформации клеток.

Так же указанный технический результат достигается созданием лекарственного средства на основе высокоочищенного интерферона гамма, при этом, интерферон гамма, полученный по данному изобретению практически не имеет в составе эндотоксинов, ковалентных димеров и олигомеров, мономеров и агрегатов, но и по заявленной совокупности объектов изобретения в процессе производства удалось не только получить интерферон гамма биологически и химически чистым, но и стабилизировать его, а так же увеличить срок хранения в расширенном температурном диапазоне, за счет оптимально подобранных компонентов.

При этом срок хранения и стабильность заявляемого лекарственного средства намного выше, чем у ближайшего аналога. Это подтверждается результатами изучения стабильности при увеличенном сроке хранения, представленными в Таблице 2 и Таблице 4.

По результатам комплексной оценки данных, заявленный интерферон гамма в процессе клинических исследований не показал ни одного случая побочного действия и демонстрирует благоприятный профиль местной токсичности, выражающийся, главным образом, в местных болевых и воспалительных реакциях при нарушении кожных покровов (локальная инъекционная терапия), что может быть объяснено противовоспалительными свойствами агента и может коррелировать с величиной наблюдаемого клинического эффекта

Изучались следующие способы применения гамма-интерферона: интраназальный, инъекционный, ингаляционный, интравезикулярный, периочаговый, интратуморальный, подконъюнктивальный, топикальный. По результатам оценки отмечена хорошая переносимость заявленного интерферона гамма, что подтверждается ниже указанными примерами.

Для лучшего понимания сущности заявляемой группы изобретений ниже приведены примеры.

Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам [Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuehi R., Horn G.T., Mullis K.B., Eriich H.A. Science, 1988. V. 239, №4839, p. 487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V. 74, p. 5463-5467.].

Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.

Для приготовления вектора ДНК плазмиды рЕТ32а (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl₂, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.

Олигонуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую белок SEQ ID NO 1, получают полным нуклеотидным синтезом. Полученную синтетическую последовательность SEQ ID NO 2 обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl₂, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Синтетический фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractll. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.

Описанный выше полученный синтетический фрагмент в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг, полученного из ДНК плазмиды рЕТ32а, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.

Помещают на лед пробирки с компетентными клетками (XL1-Blue, Евроген) до полного размораживания содержимого из расчета одна пробирка на трансформацию. Аккуратно перемешивают суспензию клеток легким встряхиванием. Добавляют в каждую пробирку полученную после обработки Т4-ДНК-лигазой алкивоту реакционной смеси, аккуратно перемешивают содержимое легким встряхиванием. Инкубируют пробирки во льду в течение 20-30 мин. Переносят пробирки в водяную баню (плюс 42°С) на 30-45 сек. Быстро переносят пробирки из водяной бани в лед и инкубируют в течение 3-5 мин. Добавляют не менее 3-х объемов предварительно подогретой до 37°С среды SOB и инкубируют при 37°С в течение 40-60 мин в орбитальном шейкере-инкубаторе (Multitron, Infors) при скорости 225-250 об/мин. Высеивают содержимое пробирок на чашки Петри диамтером 60 мм.

Аликвоту полученной плазмидной ДНК используют для трансформации компетентных клеток E. coli JM109.

Трансформанты высевают на чашки с агаризованной средой LB, в которую добавляют ампициллин до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pET32a-IFG144. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования.

Пример 2. Получение штамма-продуцента E. coli JM109/pET32a-IFG144 и определение уровня его продуктивности.

Плазмидой pET32a-IFG144 трансформируют компетентные клетки штамма E. coli JM109 и высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Предпочтительно (без ограничения), для введения указанной плазмиды в клетки штамма Е. coli JM109 используют метод электропорации, известный из уровня техники /Татага Kleber-Janke, Wolf-Meinhard Becker, Use of Modified JM109 Escherichia coli Cells for High-Level Expression of Recombinant Peanut Allergens Affected by Poor Codon Usage, Protein Expression and Purification, Volume 19, Issue 3,2000, 419-424/ и включенный в настоящее описание посредством ссылки. Отдельно локализованную колонию трижды пересевают на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Полученной моноклоновой культурой инокулируют 5 мл жидкой среды LB с ампициллином и инкубируют в течение ночи при интенсивном встряхивании при 37°С. Полученный штамм-продуцент E. coli JM109/pET32a-IFG144 хранят в 20% глицерине при минус 40°С. Для определения уровня индуцируемой экспрессии белка ночную культуру засевают в разведении 1:50 в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и растят до мутности 0,8 при 37°С на качалке при 200 об/мин. К культуре добавляют изопропил-β-D-1-тиогалактопираанозид до концентрации 1,0 мМ и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 3 час. Клетки собирают центрифугированием, осадок суспендируют в буфере, содержащем 62,5 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 3% додецилсульфата натрия, 5% 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина и 0,01% бромфенолового синего и прогревают 3 мин на кипящей водяной бане. Полученный лизат клеток анализируют электрофорезом в 15% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель окрашивают Coomassie R-250, сканируют и проводят его денситометрию. По данным денситометрии содержание белка составляет не менее 30% от общего белка клетки.

Новый штамм Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144 является продуцентом белка, содержащего аминокислотную последовательность интерферона гамма и характеризуется ниже приведенными признаками.

Морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1× 3,5 мкм, подвижные, с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза белка.

Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением.

Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при температуре от 4 до 42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы (bla).

Стабильность плазмиды в штамме. При поддержании клеток в течение нескольких месяцев на агаризованной среде LB, содержащей ампициллин, не наблюдаются потери или перестройки плазмиды, влияющие на экспрессию белка.

В новом штамме ИНФ-гамма после индуцированной экспрессии накапливается в виде телец включения, и его содержание составляет не менее 30% от общего белка клетки.

Пример 3. Культивирование штамма-продуцента

Приготовление ночной культуры штамма Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144

Для приготовления ночной культуры штамма-продуцента интерферона гамма было разморожено 3 криопробирки из рабочего банка, содержащих культуру штамма объемом 1,5 мл. Размороженная культура была полностью стерильно перенесена в качалочные колбы объемом 750 мл с 250 мл питательной среды, содержащие комплексную пептонную среду LB32 г/л, калия гидрофосфат тригидрат 6,3 г/л, калия дигидрофосфат 2,4 г/л, магния сульфат 0,5 г/л, глюкозы моногидрат 8,8 г/л и ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировалась при 37°С и 200 об/мин в течение 20 ч. Параметры ночной культуры после инкубации: OD₆₀₀ - 3.38; рН 5.28.

Приготовление инокулята для засева культуры штамма-продуцента в ферментер.

Для приготовления инокулята для засева культуры в ферментер ночная культура объемом по 125 мл была засеяна в 6 качалочных колб объемом 2000 мл с 1000 мл питательной среды, содержащей комплексную пептонную среду LB32 г/л, калия гидрофосфаттригидрат 6,3 г/л, калия дигидрофосфат 2,4 г/л, магния сульфат 0,5 г/л, глюкозы моногидрат 2,2 г/л и ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировалась при 37°С и 200 об/мин в течение 4 ч. После инкубации содержимое всех 6 колб было перенесено в две стерильные емкости объемом 3 л для засева в ферментер. Параметры инокулята после инкубации: OD₆₀₀ - 2.62; рН 6,36

Ферментация ИНФ- гамма в культуральной жидкости объемом 200 л.

Для ферментации культурой штамма-продуцента в ферментере с номинальным объемом 300 л в объеме среды 200 л в ферментер засевают полученный инокулят с общим объемом 6 л. Питательная среда для культивирования, содержащая комплексную пептонную среду LB 45 г/л, калия гидрофосфат тригидрат 8,8 г/л, калия дигидрофосфат 3,4 г/л, магния сульфат 1,1 г/л, глюкозы моногидрат 0,5 г/л и ампициллин (100 мкг/мл). Для предотвращения образования пены в питательную среду был добавлен пеногаситель «Лапрол ПД-1» в концентрации 0,3 г/л.

Перед внесением инокулята в питательную среду был добавлен раствор ампициллина до конечной концентрации 100 мкг/мл.

Наращивание биомассы продуцента в ферментере проводилят при 37°С в течение 3 часов до оптической плотности OD₆₀₀=(4,9-5,1)

Далее для синтеза белка в культуральную жидкость вносили индуктор 1ас-оперона изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) и дополнительную порцию антибиотика и проводили культивирование до фазы замедления роста в течение 5 ч. Конечная оптическая плотность культуральной жидкости составляла OD₆₀₀=31,2 оптических единиц. В течение индукции lac-промотора в культуральную жидкость вносили раствор 50% глюкозы. Для сбора биомассы штамма-продуцента IFN-гамма охлаждали культуральную жидкость до 15°С и подавали на сепаратор для отделения клеток от жидкости. Итого было собрано 8,1 кг биомассы штамма-продуцента. Необходимо отметить, что при ферментации, описанной в ближайшем аналоге, масса полученной биомассы составляла бы 1 кг. Таким образом, выход биомассы по заявленному изобретению увеличился в 8 раз.

Биомассу ресуспендировали в 40 л воды деминерализованной с помощью погружной мешалки. Затем довели объем суспензии до 80 л. Параметры суспензии: рН - 6,6, t- 6,7°С. Полученную суспензию центрифугировали на проточной центрифуге Сера Z81G при 16000 об/мин в течение 1 ч. Супернатант слили в приемник для утилизации. Масса полученного осадка составила 7,8 кг. Ресуспендированный в воде осадок в объеме 80 л гомогенизировали на гомогенизаторе GAULIN при давлении 600 бар с охлаждением суспензии. Далее дезинтеграт был отцентрифугирован на центрифуге СЕРА Z81G при 16000 об/мин. Осадок хранят при минус 70°С.

Масса полученного осадка тел включений ИНФ-гамма составляет 1920 г.

Пример 4. Культивирование штамма-продуцента

Приготовление ночной культуры штамма Escherichia coli JM109/ pET32a-IFG144

Для приготовления ночной культуры штамма-продуцента интерферона гамма было разморожено 3 криопробирки из рабочего банка, содержащих культуру штамма объемом 1,5 мл, размороженная культура была полностью стерильно перенесена в качалочные колбы объемом 750 мл с 250 мл питательной среды, содержащие комплексную пептонную среду LB32 г/л, калия гидрофосфат тригидрат 6,3 г/л, калия дигидрофосфат 2,4 г/л, магния сульфат 0,5 г/л, глюкозы моногидрат 8,8 г/л и ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировалась при 37°С и 600 об/мин в течение 20 ч. Параметры ночной культуры после инкубации: OD₆₀₀ - 3.36; рН 5.3.

Для приготовления инокулята для засева культуры в ферментер ночная культура объемом по 125 мл была засеяна в 6 качалочных колб объемом 2000 мл с 1000 мл питательной среды, содержащей комплексную пептонную среду LB 32 г/л, калия гидрофосфат тригидрат 6,3 г/л, калия дигидрофосфат 2,4 г/л, магния сульфат 0,5 г/л, глюкозы моногидрат 2,2 г/л и ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировалась при 37°С и 200 об/мин в течение 4 ч. После инкубации содержимое всех 6 колб было перенесено в две стерильные емкости объемом 3 л для засева в ферментер. Параметры инокулята после инкубации: OD₆₀₀ - 2.62; рН 6,36

Наращивание биомассы продуцента в ферментере проводилят при 37°С в течение 4 часов до оптической плотности OD₆₀₀=(4,9-5,1)

Далее для синтеза белка в культуральную жидкость вносили индуктор 1ас-оперона изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) и дополнительную порцию антибиотика и проводили культивирование до фазы замедления роста в течение 6 ч. Конечная оптическая плотность культуральной жидкости составляла OD₆₀₀=35 оптических единиц. В течение индукции lac-промотора в культуральную жидкость вносили раствор 50% глюкозы. Для сбора биомассы штамма-продуцента IFN-гамма охлаждали культуральную жидкость до 15°С и подавали на сепаратор для отделения клеток от жидкости. Итого было собрано 9 кг биомассы штамма-продуцента. Необходимо отметить, что при ферментации, описанной в ближайшем аналоге, масса полученной биомассы составляла бы 1 кг. Таким образом, выход биомассы по заявленному изобретению увеличился в 9 раз.

Биомассу ресуспендировали в 40 л воды деминерализованной с помощью погружной мешалки. Затем довели объем суспензии до 80 л. Параметры суспензии: рН - 6,6, t- 6,7°С. Полученную суспензию центрифугировали на проточной центрифуге Сера Z81G при 16000 об/мин в течение 1 ч. Супернатант слили в приемник для утилизации. Масса полученного осадка составила 8,5 кг. Ресуспендированный в воде осадок в объеме 80 л гомогенизировали на гомогенизаторе GAULIN при давлении 600 бар с охлаждением суспензии. Далее дезинтеграт был отцентрифугирован на центрифуге СЕРА Z81G при 16000 об/мин.. Осадок хранят при минус 70°С.

Масса полученного осадка тел включений ИНФ-гамма составляет 2000 г

Пример 5. Способ получения белка ИНФ-гамма

Растворение телец включений

100 г осадка телец включений по Примеру 3 в центрифужных стаканах ресуспендируют в 50 мМ натрий ацетатном буфере рН 6,0 с 7М мочевиной и переносят в блендер. Доливают буфер до 0,80 л и перемешивают в течение 10-15 мин. Переносят раствор в мерную емкость, доводят объем до 3,00 л тем же буфером. Раствор постоянно перемешивают на магнитной мешалке со скоростью 200 об/мин. Инкубируют при температуре не выше плюс 25°С, в течение от 16 до 20 часов. Раствор белков, входящих в состав телец включений, разливают по центрифужным стаканам вместимостью 250 мл. Центрифугируют материал в течение 45 минут при температуре плюс 4°С и скорости вращения ротора 14000 об/мин. Полученный после центрифугирования раствор белков, входящих в состав телец включений, фильтруют на фильтровальной установке с фильтром 0,45 мкм.

Проведение хроматографической очистки белка на сорбенте SepraPrepS

Раствор белка в денатурирующих условиях очищают на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep S и уравновешенной буфером 50 мМ ацетата аммония, 7 M мочевина, рН 7,5. Для очистки используют хроматографическую систему QuantaSep 1000 или любой другой хроматограф низкого давления. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером с 0,1 M NaCl и пропускают 4 л буфера 50 мМ ацетата аммония, 7 M мочевина, рН 7,5, 0,2М NaCl и 5 л буфера 50 мМ ацетата аммония, 7 M мочевина, рН 7,5, 0,3 M NaCl.

На дисплее компьютера отображается хроматограмма процесса с показаниями электропроводности и оптической плотности при длине волны 280 нм. Раствор белков с оптической плотностью до 0,3 о.е., после выхода из хроматографа, отбрасывают. Раствор десорбированых белков с оптической плотностью от 0,3 о.е. и выше, собирают фракциями по 0,40 л в емкости для сбора фракций. Фракции собирают до снижения оптической плотности при длине волны 280 нм до 0,2 оптических единиц.

Из каждой фракции белка отбирают пробу и проводят электрофорез в 17,5% ПААГ - ДНС. После получения результатов электрофореза фракции, содержащие белок с молекулярной массой (16,9±0,2) кДа, объединяют. Промеряют объем полученного раствора интерферона гамма в мочевине, отбирают пробу объемом 3,0 мл и проводят измерения на спектрофотометре при длинах волн 310 и 280 нм. Определяют концентрацию белка в растворе по формуле:

(OD₂₈₀-OD₃₁₀)/ ε, где

ε - коэффициент экстинкции, равный 0,64 (мл • мг^-1 • см^-1)

Итоговые показатели раствора интерферона гамма в мочевине должны удовлетворять следующим требованиям:

Количество белка со стадии	- не менее 2,2 г;
концентрация белка	- не менее 0,8 мг/мл;
рН	- 7,2-7,5;
объем	- от 2,5 до 3,5 л;

Ренатурация белка ИНФ-гамма

Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 27 л 0,05М аммоний ацетатный буфер с 0,1 M хлористым натрием, содержащий 0,5М L-аргинин, рН от 7,2 до 7,4 и охлаждают до плюс 12°С.

Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью 50 мл/мин раствор интерферона гамма в мочевине. При этом, после того, как пройдет 1,0 л насос останавливают и продолжают процесс через 2 часа. Затем продолжают подачу мочевинного раствора. Проводят остановку подачи после прохождения каждого литра раствора интерферона гамма.

После того, как весь раствор интерферона гамма в мочевине внесен в реактор, ренатурат инкубируют при работающей мешалке в течение 1 часа. С помощью системы охлаждения температуру раствора в реакторе поддерживают от 12 до 14°С. Общее время ренатурации составляет 6 часов.

Раствор ренатурированного интерферона гамма должен быть прозрачным или слегка опалесцирующим, бесцветным. рН раствора от 7,0 до 7,5.

Очистка на CM-Sepharose FF

Со скоростью 200-250 мл/мин из реактора на колонку с сорбентом CM-Sepharose FF подают раствор ренатурированного интерферона гамма. После окончания процесса нанесения белка подают на колонку 5,0 л 0,1 M фосфатного буфера рН 7,4. После того, как показания оптической плотности при 280 нм снизятся до 0,20 оптических единиц начинают элюцию целевого белка. Элюируют белок в 0,1 M фосфатном буфере рН 7,4, 0,25M NaCl

При оптической плотности при 280 нм от 0,3 о.е. и выше собирают фракции по 0,5 л. Фракции собирают до снижения оптической плотности при 280 нм до 0,20 оптических единиц. Из каждой фракции белка отбирают пробу и проводят электрофорез в 17,5% ПААГ-ДНС.

После получения результатов электрофореза материал, содержащий белок с молекулярной массой (16,9±0,2) кДа, объединяют доводят раствор до концентрации белка 0,150 мг/мл буфером для элюции.

Показатели раствора интерферона гамма высокоочищенного должны удовлетворять следующим требованиям:

количество белка	- не менее 2,1 г;
концентрация белка	- не менее 0,175 мг/мл;
рН	- от 7,3 до 7,5;

Полученный раствор интерферона гамма расфасовывают в полипропиленовые емкости и хранят при температуре не выше минус 18°С.

Определение активности

Определение проводят биологическим методом в соответствии с ГФ РФ, ОФС.1.7.2.0002.15 «Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток».

Специфическую активность определяют в реакции подавления интерфероном цитопатического действия вируса на культуре перевиваемых клеток, чувствительных к интерферону гамма.

Эталонный штамм «Индиана» вируса везикулярного стоматита получен из Подразделения Института вирусологии им. Д. И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (ГКБ29/1) с инфекционным титром от 10⁵ до 10⁷ ТЦД₅₀/мл.

Противовирусную активность испытуемого образца определяют в сравнении с противовирусной активностью международного стандартного образца (МСО) интерферона гамма рекомбинантного человеческого (NIBSC, Cod 87/586). Степень выраженности противовирусной защиты оценивается в ряду параллельных разведений стандартного и анализируемого образов для одинаковой дозы вируса. Полученная активность интерферона гамма выражается в международных единицах.

Подготовка клеточной культуры. Одну криопробирку с клетками тест-культуры достают из сосуда Дьюара с жидким азотом и помещают в водяную баню до полного оттаивания суспензии (не более чем на 2 минуты) при температуре 37°С. В ламинарном боксе в асептических условиях содержимое пробирки переносят в одноразовую стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 6 мл поддерживающей среды. После центрифугирования при 2000 об/мин 10 мин, надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 10 мл ростовой среды (см. примечание 3), осадок ресуспендируют и переносят суспензию во флакон площадью 25 см для культивирования. Флакон помещают в СО₂-инкубатор для культивирования в стандартных условиях (при температуре 37°С, и 5,0% углекислого газа) на 48-72 часа до образования монослоя.

После формирования монослоя на поверхности дна культурального флакона, проводят процедуру пассирования клеток, т.е. переноса части клеток монослоя во второй культуральный флакон со средой роста. Перенос клеток необходимо производить, не допуская образования плотного слоя для того, чтобы клетки находились в логарифмической фазе роста.

Из флакона со сформированным клеточным монослоем удаляют среду роста и трижды промывают его 5-6 мл 0,25% раствора Трипсин-ЭДТА, прогретым до температуры 37°С. Последнюю внесенную во флакон порцию раствора удаляют не полностью, а оставляют около 1 мл и равномерно распределяют по всей поверхности монослоя. Флакон с клетками помещают в СО₂-инкубатор до тех пор, пока клетки полностью не отслоятся от дна культурального флакона. Вносят 2 мл ростовой среды, суспендируют клетки пипетированием, переносят в чашку Петри и отбирают пробу для подсчета количества клеток в камере Горяева. Переносят 1-1,5 мл клеточной суспензии в новый флакон и добавляют ростовую среду 5-6 мл до посевной концентрации клеток 100 тыс.клеток/мл. После переноса отслоившихся клеток в новый флакон со средой роста, их оба помещают в стандартные условия культивирования на 24-48 часов. При образовании на дне флаконов монослоя, один флакон используют для повторного переноса клеток и определения специфической активности, а с другим повторяют процедуру снятия клеток для закладки в рабочий банк клеток. Перед каждой процедурой работы с клетками при помощи инвертированного микроскопа оценивают морфологию клеток и чистоту культуры в культуральном флаконе.

При отсутствии посторонней микрофлоры и нормальной морфологии клеток определяют культуру, как пригодную к использованию.

Для анализа используют клетки тест-культуры, прошедшие не менее 3-х и не более 30 пассажей после размораживания криопробирки рабочего банка. Для анализа берут клетки в логарифмической фазе роста.

Для определения противовирусной активности испытуемого раствора субстанции готовят 4 рабочих 96-луночных и 1 контрольный планшет с культурой клеток для определения титра вируса. Для этого во все планшеты вносят суспензию клеток и инкубируют 24-48 часов в стандартных условиях культивирования до образования полного, но не плотного монослоя.

После чего из лунок рабочих планшетов удаляют культуральную среду. Во все лунки рабочих планшетов вносят по 100 мкл поддерживающей среды кроме лунок 1 ряда.

Из ампулы МСО интерферона гамма рекомбинантного человеческого ((NIBSC, Cod 87/586) активностью 250 МЕ/ампула готовят раствор с активностью 50 МЕ/мл.

Пробирка МСО-50 будет содержать рабочий раствор стандартного образца с активностью 50 МЕ/мл.

Приготовление испытуемых образцов ИО-50

Пробирку с аликвотой интерферона гамма размораживают при комнатной температуре в течении 30 мин. Переносят 200 мкл в стерильную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл с 1000 мкл поддерживающей среды, тщательно перемешивают (разведение 1:6). Далее готовят последовательные десятикратные разведения испытуемого образца в поддерживающей среде до 1:60000.

В лунки А1, В1, С1 и D1 рабочих планшетов вносят по 200 мкл предварительно разведенного до 50 МЕ/мл стандарта (МСО-50), а в лунки E1, F1, G1, H1 вносят по 200 мкл предварительно разведенного исследуемого образца (ИО-50) в разведении 1:60000. На каждом рабочем планшете оставляют 10 ряд без интерферона для контроля целостности клеточного монослоя (клеточный контроль, К-).

В лунки с контрольными клетками вносят по 0,1 мл поддерживающей среды.

Рабочие и контрольный планшет инкубируют в течение 22-26 часов в СО₂-инкубаторе при стандартных условиях культивирования.

Визуально определяют степень разведения вируса, при которой монослой оказывается пораженным в 50% лунок. Концентрация вируса в этих лунках будет составлять 1 ТЦД₅₀.

Рассчитывают титр вируса (Т_В)по формуле:

значение степени вычисляют по формуле Спирмена-Кербера:

где:

lg ED₅₀ - десятичный логарифм титра вируса;

D_max - десятичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100% гибель клеток (+);

d - десятичный логарифм шага разведения (=1,0);

n - число лунок, приходящееся на каждое разведение вируса (=6);

p - число лунок, давших гибель (+) в разведении, ниже которого произошла 100% гибель клеток.

Титр вируса должен быть не менее 10⁶ ТЦД₅₀/мл или 10⁵ ТЦД₅₀/0,1 мл.

Учитывая полученный титр вируса, рассчитывают его рабочую дозу, которая должна составлять 100 ТЦД₅₀/на лунку при постановке теста на определение противовирусной активности. Т.е., для получения вируссодержащего материала с концентрацией 100 ТЦЦ₅₀/0,1 мл, исходную суспензию вируса разводят в (значение титра/100) раз.

После определения титра вируса и приготовления его рабочей дозы (РДВ), содержащей 100 ТЦД₅₀ в ОД мл (К+), готовят десятикратные разведения РДВ, содержащие 10^-1, 10^-2 и 10^-3 РДВ в 0,1 мл.

Из лунок рабочих планшет удаляют среду культивирования и вносят во все лунки (кроме контрольных лунок К-) по 0,1 мл РДВ. В лунки A11-Н11 и А12-Н12 рабочих планшет вносят по 0,1 мл разведения РДВ согласно рис. 1. В лунки А10-Н10 вносят по 0,1 мл поддерживающей среды для контроля клеточного монослоя (К-).

Планшеты инкубируют в течение 22-26 часов в СО₂-инкубаторе при стандартных условиях культивирования до проявления цитопатического действия в 50% лунок в разведении РДВ, соответствующем 1 ТЦД₅₀ в 0,1 мл.

Учет результатов визуальным методом

За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок оказалась полностью защищенной от цитопатического действия вируса.

Для каждого рабочего планшета рассчитывается титр испытуемого образца (Т_ИОi) и стандартного образца (T_MCOi) по формулам:

где i - номер планшета.

Значение степени вычисляют по формуле:

где:

D_max - двоичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100% защита;

d - двоичный логарифм шага разведений (=1,0);

n - количество лунок на каждую дозу;

p - количество лунок, дающих защиту (-) в D_max и последующих разведениях

Специфическую противовирусную активность образца в МЕ/мл для каждого планшета вычисляют по формуле:

где:

A_ИОi - противовирусная активность интерферона в исследуемом образце в МЕ/мл,

A_MCO - противовирусная активность восстановленного из лиофилизата международного стандартного образца в МЕ/мл,

Т_ИОi - титр испытуемого образца,

T_MCOi - титр международного стандартного образца.

Специфическую активность испытуемого образца вычисляют как среднее значение активности по 4 рабочим планшетам по формуле:

где:

А_ИО- средняя специфическая противовирусная активность образца в МЕ/мл в планшетах;

n_пл - количество планшетов.

Удельная активность

Расчет удельной активности (X) проводят по формуле:

где: А - специфическая активность образца субстанции, МЕ/мл;

В - концентрация белка в образце субстанции, мг/мл.

Получен интерферон гамма с чистотой 98% и специфической активностью 3,4×10⁶ МЕ/мл, при этом удельная биологическая активность составляет 1,95×10⁷ ME на 1 мг белка

Пример 6. Способ получения белка ИНФ-гамма

Растворение телец включений

100 г осадка телец включений по Примеру 4 в центрифужных стаканах ресуспендируют в 50 мМ натрий ацетатном буфере рН 6,0 с 7М мочевиной и переносят в блендер. Доливают буфер до 0,80 л и перемешивают в течение 10-15 мин. Переносят раствор в мерную емкость, доводят объем до 3,0 л тем же буфером. Раствор постоянно перемешивают на магнитной мешалке со скоростью 200 об/мин^-. Инкубируют при температуре не выше плюс 25°С, в течение от 16 до 20 часов. Раствор белков, входящих в состав телец включений, разливают по центрифужным стаканам вместимостью 250 мл. Центрифугируют материал в течение 45 минут при температуре плюс 4°С и скорости вращения ротора 14000 об/мин. Полученный после центрифугирования раствор белков, входящих в состав телец включений, фильтруют на фильтровальной установке с фильтром 0,45 мкм.

На дисплее компьютера отображается хроматограмма процесса с показаниями электропроводности и оптической плотности при длине волны 280 нм. Раствор белков с оптической плотностью до 0,3 о.е., после выхода из хроматографа, отбрасывают. Раствор десорбированых белков с оптической плотностью от 0,3 о.е. и выше, собирают фракциями по 0,4 л в емкости для сбора фракций. Фракции собирают до снижения оптической плотности при длине волны 280 нм до 0,2 оптических единиц.

(OD₂₈₀-OD₃₁₀)/ε, где

Ренатурация белка ИНФ-гамма

Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 27 л 0,05М аммоний ацетатный буфер с 0,1 M хлористым натрием, содержащий 0,3M L-аргинин, рН от 7,2 до 7,4 и охлаждают до плюс 12°С.

Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью 50 мл/мин раствор интерферона гамма в мочевине. При этом, после того, как пройдет 1,0 л насос останавливают и продолжают процесс через 1 час. Затем продолжают подачу мочевинного раствора. Проводят остановку подачи после прохождения каждого литра раствора интерферона гамма.

После того, как весь раствор интерферона гамма в мочевине внесен в реактор, ренатурат инкубируют при работающей мешалке в течение 1 часа. С помощью системы охлаждения температуру раствора в реакторе поддерживают от 12 до 14°С. Общее время ренатурации составляет 3 часа.

Очистка на сорбенте CM-SepharoseFF

Со скоростью 200-250 мл/мин из реактора на колонку с сорбентом CM-Sepharose FF подают раствор ренатурированного интерферона гамма. После окончания процесса нанесения белка подают на колонку 5,0 л 0,1М фосфатного буфера рН 7,4. После того, как показания оптической плотности при 280 нм снизятся до 0,2 оптических единиц начинают элюцию целевого белка. Элюируют белок 0,1 M фосфатным буфером рН 7,4, 0,25М NaCl

При оптической плотности при 280 нм от 0,3 о.е. и выше собирают фракции по 0,5 л. Фракции собирают до снижения оптической плотности при 280 нм до 0,2 оптических единиц. Из каждой фракции белка отбирают пробу и проводят электрофорез в 17,5% ПААГ - ДНС.

После получения результатов электрофореза материал, содержащий белок с молекулярной массой (16,9±0,2) кДа, объединяют, доводят раствор до концентрации белка 0,150 мг/мл буфером для элюции. Полученный раствор интерферона гамма расфасовывают в полипропиленовые емкости и хранят ри температуре не выше минус 18°С.

Показатели раствора интерферона гамма высокоочищенного очищенного должны удовлетворять следующим требованиям:

количество белка	- не менее 2,1 г;
концентрация белка	- не менее 0,15 мг/мл;
рН	- от 7,3 до 7,5;

Определяли активность, как описано в примере 5

Получен интерферон гамма с чистотой 97% и специфической активностью 2,7×10⁶ МЕ/мл, при этом удельная биологическая активность составляет 1,8×10⁷ ME на 1 мг белка

Пример 7. Лекарственное средство для интраназального применения с концентрацией интерферона гамма 100000МЕ/флакон

На весах взвешивают 0,392 кг маннита. Засыпают навеску в емкость. Затем добавляют в ту же емкость 2,0 л воды для инъекций и устанавливают емкость на магнитную мешалку. Перемешивание содержимого емкости проводят до полного растворения маннита, после чего объем растворенной навески доводят водой для инъекций до 5,0 л.

В реактор вносят 2 л воды для инъекций, затем количественно переносят 5,0 л раствора маннита.

Предварительно размораживают рассчитанное количество интерферона гамма, полученного по Примеру 6, при температуре от 8 до 10°С в течение 8-10 часов

Включают мешалку реактора, устанавливают скорость вращения мешалки в пределах от 80 до 100 об/мин. Раствор перемешивают не менее 10 минут. К содержимому реактора, осторожно, избегая вспенивания, приливают 1,05 л размороженного раствора интерферона гамма в фосфатном буфере.

Через 10 минут выключают мешалку реактора и контролируют рН раствора. Величина рН должна быть в пределах от 5,0 до 7,0 единиц. Если значение рН выходит за указанные пределы, проводят его корректировку. Затем доводят объем до 14,00 л водой для инъекций. Полученный материал передается на стадию стерилизующей фильтрации. Затем проводят асептический розлив препарата во флаконы по 0,5 мл на флакон. Далее, предукупореные и предварительно охлажденные до температуры от минус 2 до плюс 2°С флаконы, загружают в лиофилизатор.

Процесс сублимационной сушки препарата осуществляется в полуавтоматическом режиме и состоит из следующих этапов:

- замораживание продукта;

- выдержка замороженного продукта;

- проморозка продукта под вакуумом;

- сушка продукта;

- досушивание продукта;

- гашение вакуума.

Кассеты с предукупоренными флаконами с продуктом загружают на полки камеры лиофилизатора, предварительно охлажденные до температуры от минус 2 до плюс 2°С.

Фаза замораживания продукта начинается сразу же после его загрузки и длится 6 часов, температура полок при этом понижается ниже минус 45°С. Температура продукта ниже минус 35°С. При достижении на всех полках данных параметров, дают выдержку замороженного продукта в течение трех часов.

Через один час после начала фазы выдержки продукта в замороженном состоянии, включают компрессоры конденсатора. Температура в конденсаторе понижается до минус 65°С. Охлаждение в конденсаторе происходит за счет поступления фреона.

За полчаса до завершения выдержки включают вакуумные насосы. В системе «камера-конденсатор-вакуумный насос» создается вакуум глубиной до от 70 до 90 Па.

Далее наступает фаза проморозки продукта под вакуумом, которая длится два часа. Температура в конденсаторе снижается до минус 70°С, температура продукта понижается ниже минус 38°С. По окончании фазы проморозки продукта под вакуумом, начинают процесс сушки, при этом отключают охлаждение полок и включают нагрев. Сушка препарата идет в полуавтоматическом режиме по заданным программам. При достижении температуры плюс 20°С и истечении времени, основной процесс сушки заканчивается.

Далее производят досушивание продукта в ручном режиме в течение 3-5 часов, температура в системе нагрева полок лиофилизатора поддерживается постоянной от плюс 20 до 21°С. В процессе лиофилизации достигается остаточная влага в продукте не более 5%. Флаконы завальцовывают и хранят при температуре от 2 до 25°С.

Анализ полученного средства проводят согласно ГФ РФ ОФС.1.7.2.0002.15 «Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток». Специфическую активность препарата определяют в реакции подавления интерфероном цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на культуре клеток Vero.

Эталонный штамм «Индиана» вируса везикулярного стоматита получен из Подразделение Института вирусологии им. Д. И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (ГКБ29/1) с инфекционным титром не менее 10⁵ ТЦД₅₀/мл.

Получено лекарственное средство с активностью 100000 МЕ/флакон

Пример 8. Лекарственное средство для внутримышечного и подкожного введения с концентрацией интерферона гамма 10000МЕ/флакон

На весах взвешивают 0,420 кг маннита. Засыпают навеску в емкость. Затем добавляют в ту же емкость 2,0 л воды для инъекций и устанавливают емкость на магнитную мешалку. Перемешивание содержимого емкости проводят до полного растворения маннита, после чего объем растворенной навески доводят водой для инъекций до 5,0 л.

Предварительно размораживают рассчитанное количество интерферона гамма, полученного по Примеру 5, при температуре от 8 до 10°С в течение 8-10 часов.

Включают мешалку реактора, устанавливают скорость вращения мешалки в пределах от 80 до 100 об/мин. Раствор перемешивают не менее 10 минут. К содержимому реактора, осторожно, избегая вспенивания, приливают 0,83 л размороженного раствора интерферона гамма в фосфатном буфере, полученного из штамма Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144.

Через 10 минут выключают мешалку реактора и контролируют рН раствора. Величина рН должна быть в пределах от 7,5 до 8,5 единиц. Если значение рН выходит за указанные пределы, проводят его корректировку. Затем доводят объем до 14,00 л водой для инъекций. Полученный материал передается на стадию стерилизующей фильтрации. Затем проводят асептический розлив препарата во флаконы по 0,5 мл на флакон. Далее, предукупореные и предварительно охлажденные до температуры от минус 2 до плюс 2°С флаконы, загружают в лиофилизатор.

- замораживание продукта;

- выдержка замороженного продукта;

- проморозка продукта под вакуумом;

- сушка продукта;

- досушивание продукта;

- гашение вакуума.

Далее производят досушивание продукта в ручном режиме в течение 3-5 часов, температура в системе нагрева полок лиофилизатора поддерживается постоянной от плюс 20 до 21°С. В процессе лиофилизации достигается остаточная влага в продукте не более 5%. Флаконы завальцовывают и хранят при температуре от 2 до 8°С.

Специфическую активность препарата определяют как описано в примере 7.

Полученное лекарственное средство обладает активностью 100000 МЕ/флакон

Пример 9. Лекарственное средство для внутримышечного и подкожного введения с концентрацией интерферона гамма 500000МЕ/флакон

На весах взвешивают 0,448 кг маннита. Засыпают навеску в емкость. Затем добавляют в ту же емкость 2,0 л воды для инъекций и устанавливают емкость на магнитную мешалку. Перемешивание содержимого емкости проводят до полного растворения маннита, после чего объем растворенной навески доводят водой для инъекций до 5,0 л.

Предварительно размораживают рассчитанное количество интерферона гамма, полученного по Примеру 5, при температуре от 8 до 10°С в течение 8-10 часов

Включают мешалку реактора, устанавливают скорость вращения мешалки в пределах от 80 до 100 об/мин. Раствор перемешивают не менее 10 минут. К содержимому реактора, осторожно, избегая вспенивания, приливают 5,25 л размороженного раствора интерферона гамма в фосфатном буфере, полученного из штамма Escherichia coli JM109/pET32a-IFG144.

Через 10 минут выключают мешалку реактора и контролируют рН раствора. Величина рН должна быть в пределах от 7,5 до 8,5 единиц. Если значение рН выходит за указанные пределы, проводят его корректировку. Затем доводят объем до 14 л водой для инъекций. Полученный материал передается на стадию стерилизующей фильтрации. Затем проводят асептический розлив препарата во флаконы по 0,5 мл на флакон. Далее, предукупореные и предварительно охлажденные до температуры от минус 2 до плюс 2°С флаконы, загружают в лиофилизатор.

- замораживание продукта;

- выдержка замороженного продукта;

- проморозка продукта под вакуумом;

- сушка продукта;

- досушивание продукта;

- гашение вакуума.

Через один час после начала фазы выдержки продукта в замороженном состоянии, включают компрессоры конденсатора. Температура в конденсаторе понижается до минус 6°С. Охлаждение в конденсаторе происходит за счет поступления фреона.

Далее наступает фаза проморозки продукта под вакуумом, которая длится два часа. Температура в конденсаторе снижается до минус 70°С, температура продукта понижается ниже минус 38°С. По окончании фазы проморозки продукта под вакуумом, начинают процесс сушки, при этом отключают охлаждение полок и включают нагрев. Сушка препарата идет в полуавтоматическом режиме по заданным программам.

В процессе сушки температура в полках повышается быстрее, чем в продукте, но постепенно температура продукта приближается к температуре полок. При достижении температуры плюс 20°С и истечении времени, основной процесс сушки заканчивается.

Полученное лекарственное средство обладает активностью 500000 МЕ/флакон

Пример 10. Результаты применения лекарственного средства интерферона гамма для интраназального введения полученного по примеру 7

В период эпидемического подъема заболеваемости гриппом проведено многоцентровое сравнительное исследование по оценке эффективности и экономической целесообразности двух альтернативных схем лечения больных гриппом A(H1N1)pdm09. В исследование было включено 88 пациентов, имеющих лабораторно-подтвержденный диагноз гриппа A(H1N1)pdm09. Пациенты основной группы (n=46) получали комплексную терапию с использованием противовирусных (осельтамивир) и иммуномодулирующих (интерферон гамма) средств. Пациенты контрольной группы (n=40) получали только противовирусную терапию (осельтамивир). Для оценки эффективности и экономической целесообразности двух различных схем терапии проведен анализ исходов заболевания: выписка из стационара до 10 дня болезни и отсутствие симптомов заболевания к 3-6 дню лечения. Установлено, что включение рекомбинантного интерферона-гамма в схему лечения пациентов с гриппом A(H1N1)pdm09 способствует более быстрому купированию катаральных и респираторных симптомов заболевания: отсутствие сухого кашля к 3-6 дню лечения (ОР=1,43, 95% ДИ 0,86-2,38), ринита (ОР=1,21, 95% ДИ 1,05-1,40) и одышки (ОР=1,28, 95% ДИ 1,06-1,54). Кроме того, включение рекомбинантного интерферона-гамма в схему лечения больных гриппом A(H1N1)pdm09 способствовало существенному сокращению сроков выздоровления и выписки из стационара (ОР=1,39, 95% ДИ 0,97-2,00). Клиникоэкономический анализ применения двух альтернативных схем лечения показал, что включение рекомбинантного интерферона-гамма в терапию больных гриппом A(H1N1)pdm09 экономически целесообразно. Терапевтический курс с использованием лекарственного средства интерферон гамма человеческий рекомбинантный в течение 5 дней обеспечил уменьшение длительности основных синдромов заболевания: интоксикации в 2 раза, а лихорадки в 1,7 раза. В течение всего периода лечения побочные эффекты не были выявлены.

Пример 11. Результаты применения лекарственного средства интерферона гамма для внутримышечного и местного введения полученного по примеру 8

По данным доклинических исследований в остром опыте на белых беспородных мышах и белых беспородных крысах при однократном подкожном введении в дозах 71430, 711300 и 7 143000 МЕ/кг, превышающих терапевтическую для человека дозу соответственно в 10, 100 и 1000 раз, клинических симптомов интоксикации, местного раздражающего действия и гибели животных не отмечено. ЛД₅₀ субстанции и инъекционной лекарственной формы для мышей и для крыс превышает максимальную испытанную дозу 7143000 МЕ/кг. В хроническом эксперименте на белых беспородных крысах при подкожном введении ежедневно по 5 раз в неделю в течение месяца субстанции и инъекционной лекарственной формы в дозах 7143, 71430 и 714300 МЕ/кг (соответственно 1-, 10- и 100-кратных эквитерапевтической) по результатам оценки общего состояния животных, местного раздражающего действия, гематологических и биохимических показателей крови, биохимических показателей мочи и патоморфологических исследований негативного влияния не выявлено. Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней. Местное раздражающее действие субстанции и инъекционной лекарственной формы после однократного применения, а также на протяжении двух недель наблюдения, не обнаружено. По результатам вскрытия животных после окончания периода наблюдения в прилегающей к месту введения подкожной клетчатке абсцессы и гематомы не обнаружены, регионарные лимфоузлы не увеличены. По результатам оценки субстанция и инъекционная лекарственная форма при подкожном введении мышам и крысам в 1000-кратно превышающей для человека терапевтической дозе не вызывают местно-раздражающего действия.

Пример 12. Результаты сравнительной оценки безопасности и переносимости лекарственного средства интерферона гамма для интраназального введения, полученного по примеру 7 и препарата произведенного по ближайшему аналогу.

Полученное по примеру 7 лекарственное средство растворяли в 5 мл воды для инъекций, полученный раствор для интраназального введения имеет вид прозрачной жидкости. Лабораторные испытания средства на модели культур клеток экспериментальных животных показали, что оно нетоксично, сохраняет противовирусную активность в полном объеме.

Рандомизированное открытое клиническое исследование проводили на 20 пациентах в возрасте 20-25 лет, заболевших гриппом.

Одна группа из 10 человек применяла интраназально заявленное лекарственное средство, а вторая группа из 10 человек применяла интраназально препарат произведенный по ближайшему аналогу.

Режим дозирования в обеих группах для лечения ОРВИ был следующий: по 2-3 капли в каждый носовой ход через каждые 3-4 часа в течение 5 дней.

У первой группы заболевших жалоб и нежелательных явлений не было отмечено.

У второй группы было отмечено нежелательное явление: жжение слизистой.

Полученные результаты свидетельствуют о превосходящем профиле безопасности лекарственного средства заявляемого интерферон гамма для интраназального введения по сравнению с интерфероном гамма полученным по ближайшему аналогу.

Пример 13. Результаты сравнительной оценки безопасности и переносимости лекарственного средства интерферона гамма для интраназального введения, полученного по примеру 7 и препарата произведенному по ближайшему аналогу. Клинические случаи.

Описаны результаты оценки безопасности, полученные при применении лекарственного средства интерферон гамма для интраназального введения и препарата произведенного по ближайшему аналогу, с целью профилактики аллергического ринита в рамках многоцентрового рандомизированного открытого сравнительного исследования. Лекарственное средство интерферона гамма для интраназального введения и препарат произведенный по ближайшему аналогу, применялись в количестве 5 инсталляций в течение 10 дней (через день). Представлены два клинических случая.

1) Пациент применял лекарственного средство интерферон гамма для интраназального введения, согласно указанной схеме применения. Жалоб и нежелательных явлений не было отмечено.

2) Пациент применял препарат произведенный по ближайшему аналогу, лиофилизат для приготовления раствора для интраназального введения, согласно указанной схеме применения. Отмечены нежелательные явления: головная боль, миалгия, озноб. Все три нежелательных явления продолжались в течение одного дня, лекарственная терапия не применялась, исход - выздоровление без последствий.

Полученные результаты свидетельствуют о превосходящем профиле безопасности лекарственного средства интерферон гамма для интраназального введения.

Пример 14. Результаты сравнительной оценки безопасности и переносимости лекарственного средства интерферона гамма для внутримышечного и подкожного введения с концентрацией интерферона гамма 500000 МЕ/флакон, полученного по примеру 9 и препарата произведенного по ближайшему аналогу, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций для внутримышечного или подкожного введения 500000 ME у больных туберкулезом легких с лекарственной устойчивостью.

Полученное по примеру 9 лекарственное средство растворяли в 2 мл воды для инъекций, полученный раствор для внутримышечного и подкожного введения имеет вид прозрачной жидкости.

Клиническое исследование проводили на 20 пациентах в возрасте 19-73 лет с туберкулезом легких с лекарственной устойчивостью возбудителя с бактериовыделением.

Одна группа из 10 человек применяла внутримышечно заявленное лекарственное средство на фоне базовой противотуберкулезной терапии, а вторая группа из 10 человек применяла внутримышечно препарат произведенный по ближайшему аналогу на фоне базовой противотуберкулезной терапии.

Режим дозирования в обеих группах для лечения туберкулеза легких с лекарственной устойчивостью был следующий: 1 раз в день внутримышечно ежедневно в течение 3 месяцев.

По итогам трех месяцев в обеих группах применяемая терапия показала эффективность в лечении туберкулеза. По данным культурального исследования мокроты в первой группе процесс абациллирования наблюдался в среднем через месяц лечения, во второй группе через 21 день.

У первой группы пациентов жалоб и нежелательных явлений не было отмечено.

У второй группы были отмечены следующие нежелательные явления: миалгия, артралгия, чувство нехватки воздуха, повышение температуры тела, слабость, головокружение, снижение артериального давления, брадикардия, повышение уровня креатинина, повышение уровня мочевины, повышение уровня ACT, гиперурикемия, повышение уровня ГГТ, гипокалиемия, зуд, сыпь.

Полученные результаты свидетельствуют о более эффективном действии и превосходящем профиле безопасности заявленного лекарственного средства интерферон гамма для внутримышечного и подкожного введения с концентрацией интерферона гамма 500000 МЕ/флакон, по сравнению с интерфероном гамма полученным по ближайшему аналогу.

Пример 15. Результаты сравнительной оценки безопасности и переносимости лекарственного средства интерферона гамма для внутримышечного и подкожного введения с концентрацией интерферона гамма 500000 МЕ/флакон, полученного по примеру 9 и препарата произведенный по ближайшему аналогу, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций для внутримышечного или подкожного введения 500000 ME у больных туберкулезом легких с лекарственной устойчивостью. Клинические случаи.

Описаны результаты оценки безопасности, полученные при применении лекарственного средства интерферон гамма для внутримышечного и подкожного введения с концентрацией интерферона гамма 500000 МЕ/флакон, полученного по примеру 9 и препарата произведенному по ближайшему аналогу, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций для внутримышечного или подкожного введения 500000 ME в рамках клинического исследования у больных туберкулезом легких с лекарственной устойчивостью. Лекарственное средство интерферона гамма для внутримышечного и подкожного введения и препарат произведенный по ближайшему аналогу применялись 1 раз в день внутримышечно ежедневно в течение 3 месяцев. Представлены два клинических случая.

1) Пациент, женщина, 38 лет, применял лекарственного средство интерферон гамма для внутримышечного и подкожного введения, согласно указанной схеме применения. Жалоб и нежелательных явлений не было отмечено.

2) Пациент, мужчина, 60 лет, применял препарат произведенный по ближайшему аналогу, лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного и подкожного введения, согласно указанной схеме применения. Отмечены нежелательные явления: зуд, продолжался 5 дней, предпринятые меры -лекарственная терапия, исход - улучшение состояния, сыпь, продолжалась 5 дней, предпринятые меры - лекарственная терапия, исход - улучшение состояния.

Полученные результаты свидетельствуют о более эффективном действии и превосходящем профиле безопасности заявленного лекарственного средства интерферон гамма для внутримышечного и подкожного введения.

Пример 16. Клиническое испытание лиофилизированного лекарственного средства IFN гамма со специфической активностью 100000 МЕ/флакон. Заявленное в примере 8, лиофилизированное лекарственное средство применяли в слепом сравнительном, контролируемом, рандомизированном клиническом исследовании, в котором участвовало 80 пациентов с клиническим диагнозом: меланома кожи.

Больных разделили на две группы лечения.

Для групп I: Внутримышечно вводили растворенный в 2 мл воды для инъекций лиофилизат лекарственного средства 100000МЕ, полученный по примеру 8: первую и вторую недели ежедневно в течение 5 дней с перерывом 2 дня, в течение трех последующих недель 3 раза в неделю, до момента, в который оценивалась клиническая эффективность лечения.

Для группы II: Внутримышечно вводили растворенный в 2 мл воды для инъекций лиофилизат лекарственного средства 100000МЕ, произведенный по ближайшему аналогу: первую и вторую недели ежедневно в течение 5 дней с перерывом 2 дня, в течение трех последующих недель 3 раза в неделю, до момента, в который оценивалась клиническая эффективность лечения.

Полный эффект терапии в I группе был достигнут у 34 пациентов, частичный эффект был достигнут у 6 пациентов. Всего проведено 4, 5, 6 и 9 курсов лечения. Эффект при метастазах в мягкие ткани/ лимфатические узлы реализовался после 2, 5 и 7 мес. лечения. Во II группе полный эффект был достигнут у 30 пациентов, частичный эффект у 10 пациентов.

Таким образом, заявляемое лиофилизированное лекарственное средство, содержащее рекомбинантный IFN гамма показало превосходящую эффективность в терапии меланомы по сравнению с лиофилизированным лекарственным средством, произведенное по ближайшему аналогу.

Заявляемое лиофилизированное лекарственное средство, содержащее рекомбинантный IFN гамма показало лучшую переносимость по сравнению с лиофилизированным лекарственным средством, произведенному по ближайшему аналогу, число нежелательных явлений в группе I было ниже, чем в группе П. В обеих группах не было отмечено серьезных нежелательных явлений. Все возникшие нежелательные явления развивались после первых инъекций получаемого лечения, не требовали отмены терапии и поддавались коррекции лекарственными средствами с анальгезирующим и жаропонижающим действием. В большинстве случаев, температура тела не повышалась выше 37.5°С и купировалась самостоятельно.

Claims

1. Лекарственное средство, обладающее активностью интерферона гамма, представляющее собой лиофилизат, содержащий маннит и высокоочищенный интерферон гамма (ИНФ-гамма) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, причем интерферон гамма получен культивированием штамма-продуцента Escherichia coli JM109/рЕТ32а-IFG144, где после 3-5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза рекомбинантного белка в клетках Escherichia coli JM109/ рЕТ32а-IFG144 изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом и выдерживают 4-6 часов, с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего белок ИНФ-гамма, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента белка ИНФ-гамма, последующую очистку выделенного белка ИНФ-гамма путем катионообменной хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию белка ИНФ-гамма путем последовательного дробного добавления денатурированного белка в буфер для ренатурации, содержащий L-аргинин, и очистку ренатурированного белка ИНФ-гамма катионообменной хроматографией в фосфатном буфере, содержащем натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный и натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, где интерферон гамма имеет чистоту не менее 97% и удельную биологическую активность не менее 1,8×10⁷ ME на 1 мг белка, а штамм-продуцент получен путем трансформации родительского штамма Е. coli JM109 рекомбинантной плазмидой рЕТ32а-IFG144 размером 5806 пар оснований, содержащей структурные элементы: промотор Т7 и оператор lасО, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую белок ИНФ-гамма, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага fl (fl ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (Laclpromoter), при следующем соотношении компонентов (мас.%):

Интерферон-гамма с удельной активностью не менее 1,8×10⁷МЕ/мг и чистотой не менее 97% 0,03-0,13 Натрий хлористый 3,2-10 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 6,4-20 Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,64-2 Маннит остальное

2. Лекарственное средство по п. 1, отличающееся тем, что после очистки белок ИНФ-гамма может быть заморожен и в последующем разморожен перед смешиванием с маннитом.