JPS63164899A - インターロイキン―１α誘導体遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新しいポリペプチド、更に詳しくはインター
ロイキン１α（ＩＬ−１α）の新しい誘導体、ならびに
ＩＬ−１α及びＩＬ−１α誘導体の医薬用途に関する。

従来の技術 第２回国際リンホカインワークショップにおいて、かっ
てリンパ球活性化因子（Ｌ　ｙｍｐｈｏｃｙｔｅＡｃｔ
ｉｖａｔｉｎｇ　ｌ”ａｃｔｏｒ　：　Ｌ　Ａ　Ｆ　）
　、？イトジェニック　プロティン（Ｍｉｔｏｇｅｎｉ
ｃ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ）　、ヘルパーピーク−１（Ｈｅ
１ｐｅｒ　ｐｅａｋ　−１＞　、■リンバ球代替因子（
Ｔ−ｃｅｌｌ　　ｒｅｐｌａｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｌｌ
ｌ（ＴＲＦ−ｍ　）　、Ｔ−ｃｅｌｌ　　ｒｅｐｌａｃ
ｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒＭφ（ＴＲＦＭ＞）　、Ｂセルア
クチベーテイングファクター（３−ｃｅｌｌ　　ａｃｔ
ｉｖａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　）、Ｂリンパ球分化因
子（Ｂ−ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆ
ａｃｔｏｒ）などの呼称で報告されてきた生理活性物質
は、いずれもインターロイキン−１（ＩＬ−１）なる呼
称に統一されることが決定された（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、４８．４３３−４３６（１９７９）
）。この決定は、上記各生理活性物質は物質として区別
できず生理活性を異なる角度から把えて表現しているに
すぎないとの理由に基づいている。

上記ＩＬ−１は、更に例えばＴリンパ球やＢリンパ球を
活性化し、インターロイキン２の産生先進作用や抗体産
生を先進させる作用を有し、また肝細胞に作用して蛋白
質合成を先進させる作用、プロスタグランディン産生を
先進させる作用等を有することも報告されている（Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ　ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓ
ｅ、　Ｖｏｌ、　６．　Ｎｏ、１，５１−５９　（１９
８４）　、ＮｅｗＥｎａｌａｎｄ　　Ｊ、ｏｆＭｅｃｌ
、、３１１，１４１３　（１９８４＞等参照〕。

しかして、物質としてのＩＬ−１の本体に関しては現在
尚不明ではあるが、最近になってＬＡＦ活性を有するポ
リペプチドもしくはその前駆体をコードする遺伝子の存
在がようやく報告された（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、　８１　。

７９０７−７９１１　（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ　。

Ｖｏｌ、３１５，６４１　（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　Ｖｏｌ、　１３．
　　（１６）　。

５８６９　（１９８５））。

上記によれば、遺伝子組換え技術に従って得られた培養
上清のＬＡＦ活性の確認より、下式（Ａ＞で表わされる
ポリペプチドをＬＡＦ活性を有するポリペプチドである
と推定し、これをｒｌ−１α」と称している。

５ｅｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ　−ＬＪＳ−ＴＶｒ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−ＡｒｌＪ−Ｉ　ｌｅ−Ｉ　Ｉｅ
−ＬＪＳ−Ｔｙｒ−Ｇ　ＩＬＩ　−Ｐｈｅ−Ｉ　Ｉｅ−
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＡＳＤ−Ａ　ｌａ−１ｅｕ−Ａｓｎ−
Ｇ　Ｉｎ　−８ｅｒ　−１ｌｅ−Ｉ　ｌｅ−Ａｒｇ−Ａ
　Ｉａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　
−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−（ｅｕ−Ｈｊｓ−
Ａｓｎ−１ｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ　−ＬＶＳ　−３ｅｒ−８ｅｒ−ＩＪＳ−ＡＳＩ）−
ＡＳＩ）−Ａｌａ−ＩＪＳ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−
Ｉ　ｌｅ　−Ｌ　ｅｕ−Ａｒｑ　−Ｉ　Ｉｅ−８ｅｒ−
Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌ　ｅｕ−ＴＶｒ　−Ｖａｌ
−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＡＳｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−ＬＶ
Ｓ−Ｇ　ｌｕ−Ｍｅｔ　−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｉ　Ｉ
ｅ　−Ｐｒｏ　−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ　−Ｔ、　Ｉｅ−Ｔｈ
ｒ−ａｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｈｉｓ−ＧＩＶ−Ｔｈｒ−ＩＪｓ−Ａｓｎ　−Ｔｙｒ
−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｖａｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ−ｒ　１ｅ−Ａｌａ
−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−
Ｖａｌ−Ｃｙｓ　−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　
ｌｙ　−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ−８ｅｒ　−Ｉ　１ｅ−Ｔｈ
ｒ　−ＡＳＩ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ　　（Ａ）しかしながら
、上記活性物質は勿論のこと、従来より所謂ＩＬ−１と
して報告されている生理活性物質についても、之等が均
質な物質として製造単離された報告例はなく、勿論かか
る均質な物質の有する生理活性についての報告も皆無で
ある。

発明が解　しようとする問題点　′ 本発明者らは、従来より、均質な物質としてのＩＬ−１
αにつき鋭意研究を重ねた結果、既にその製造技術を確
立すると共にその物質としての特性、その有する生理活
性等をも明らかにした。この研究結果に伴い、本発明者
らはまた上記式（Ａ＞で表わされるポリペプチドがＬＡ
Ｆ活性を有する事実をも確認した。

しかしながら、該ポリペプチドは、前記報告の通り、生
体の遺伝子に対応するもめであるにも拘わらず、驚くべ
きことに、物質としては不安定であることを見出した。

本発明の目的は、従って、上記式（Ａ＞で表わされるポ
リペプチドとは、そのアミノ酸配列を異にし、物質とし
てより安定で、しかも医薬用途に好適な特性を有する新
しいポリペプチド（ＩＬ−１α誘導体）を提供すること
にある。

本発明の他の目的は、ＩＬ−１α誘導体を含有する医薬
組成物を提供することにある。

本発明は新しいＩＬ−１α誘導体をコードする遺伝子及
びこれを用いて遺伝子工学的手法でＩＬ−１α誘導体で
あるポリペプチドを製造する方法を提供しようとするも
のである。

更に本発明は、ＩＬ−１α自身の新しい医薬用途を提供
しようとするものである。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、式（Ａ＞ ５ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｔ　−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａ
ｓｎ　−ｐｈｅ−Ｍｅｔ−ＡＩ’（Ｊ　−ｉ　１Ｂ　−
）　ｉｅ　−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐｈｅ　
−Ｉ　Ｉｅ　−Ｌ　ｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａ　１ａ−
Ｌ　ｅｕ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉｎ　−３ｅｒ　−Ｉ　ｌｅ　
−Ｉ　ｌｅ−Ａｒｇ−Ａ　１ａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｎ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ−Ａｌａ−ＡＩａ−Ａ
ｌａ　−１−ｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
（３１ｕ　−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＬＶＳ−Ｐｈｅ−ＡＳｐ
−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−
３ｅｒ−ｔｙｓ−ＡＳｐ−Ａｓｌ）−Ａｌａ−ｉｙｓ　
−Ｉ　１ｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ　−Ｉ　ｌｅ−Ｌｅｕ−Ａ
ｒ（ｌＩ−Ｉ　Ｉｅ−８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−
ＡＳｆ）−Ｇｌｕ−ＡＳＩ）−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ　−
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ　−ｒ　Ｉｅ　−Ｐｒｏ　−Ｌ　ｙｓ　
−Ｔｈｒ＝　Ｉ　Ｉｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ
−ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ　−Ｔｈｒ−１−１ｉｓ−Ｇ
ＩＶ−Ｔｈｒ−ＬＪＳ−Ａｓｎ　−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｈｒ−８ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ａ　Ｉａ　−Ｔｈｒ−
Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｐ　−Ｔｙｒ　−Ｔｒｐ　−Ｖ
ａｌ　−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＧＩＶ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ　−ＡＳ＋）−
ｐｈｅ−Ｑｌｎ−ｉｅ−（ｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｉ
ｎ−Ａｌａ　　（Ａ）で表わされるＩ［−１αのアミノ
酸配列において、３６位ＡＳ＋１及び１４１位ｃｙｓの
少なくとも１つのアミノ酸が欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されてることにより特徴付けられる改変
されたアミノ酸配列を有するＩＬ−１α誘導体（ポリペ
プチド）が提供される。

上記及び以下の本明細書におけるアミノ酸及びポリペプ
チドの表示は、ＩＬＪＰＡＣ及びＩＬＩＰＡＣ−ＩＵＢ
による命名法又は規則における略号乃至当該分野で慣用
されている略号によるアミノ酸残基の表示法に従うもの
とし、塩基配列における核酸の表示も同様とする。

本発明のポリペプチドは、例えばＬＡＦ活性、腫瘍細胞
増殖抑制活性、即ち腫瘍細胞に対して特異的にその増殖
を抑制する活性、Ｃ３Ｆ（Ｃｏ１ｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌ
ａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　：　−］］ロー−刺激因子
、インターフェロン（ＩＦＮ＞、インターロイキン−２
（ＩＬ−２＞、インターロイキン−３（ＩＬ−３＞等の
種々のサイト力イン類産生促進活性、即ち例えばヒト細
胞に作用してそれらサイト力イン類の産生を著しく促進
させる活性、抗炎症活性、特に例えば関節炎モデル動物
に投与することによって関節炎の進行を効果的に抑制す
る活性、放射線障害防止作用、即ち骨髄移植時の放射線
全身照射、癌治療等における放射線照射、放射線事故時
等における生体障害乃至は重篤な副作用等を予防する作
用乃至防止する作用等を有する。

従ってこれは例えば抗体産生促進やワクチンの効果増強
等の免疫系刺激剤、抗腫瘍剤、Ｃ３Ｆ、ＩＬ−２、ＩＬ
−３等のサイトカイン産生促進剤、抗炎症剤、放射線障
害防止剤等の医薬品として有用である。殊に本発明のポ
リペプチドは、物質として極めて安定である特徴を有し
、しかも毒性も低く、之等の点でも上記医薬品として好
適でおる。

又、ＩＬ−１は、発熱性を有することが知られているが
、本発明ポリペプチドは、かかる副作用がより少ない点
においても優れている。

本発明ポリペプチドは、例えばこれをＣ３Ｆ産生促進剤
として、ヒトに投与゛するときには、ウィルス感染や抗
原抗体反応等の危険性を生じることなく、癌化学際法や
放射線療法後の骨髄低形成による顆粒球減少を有効に回
復できる（顆粒球減少治療薬）。また上記本発明ポリペ
プチドを利用したＣ３Ｆ産生促進剤は、その本来のＣ３
Ｆ産生促進作用により、Ｃ８Ｆの作用に基づく各種疾病
の予防及び治療剤としても有効に利用できる。例えば、
Ｃ３Ｆは顆粒球やマクロファージの機能を促進させる作
用がある〔ロペツツら（ＬｏｐｅＺ、　Ａ。

Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
、１３１　、２９８３（１９８３）、ハンダムら（Ｈａ
ｎｄａｍ　、　Ｅ、　ｅｔａｌ、）、同１２２，１１３
４　（１９７９）及びバダスら（Ｖａｄａｓ、　Ｍ、　
Ａ、　ｅｔ　ａｌ、）　、同１３０゜７９５　（１９８
３））ので、種々の感染症の予防及び治療薬として臨床
応用が期待されており、上記Ｃ８Ｆ産生促進剤も同様に
臨床応用が期待できる。

殊に、近年生体防御能が低下乃至障害された個体（ｃｏ
ｍｐｒｏｍｉｓｅｄ　ｈｏｓｔ）に、それまで無害であ
った病原体が病原性を発揮して惹起される、いわゆる日
和見感染症（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ　１ｎｆｅｃ
ｔｉｏｎ或いはｔｅｒｍｉｎａｌ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ
）は、臨床的に問題となる病原体（起炎筒）が、シュー
ドモナス （ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、セラティア（Ｓｅｒ
ｒａｔｉａ　）等のダラム陰性桿菌、ヘルペス（Ｈｅｒ
ｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ。

Ｈ３Ｖ＞　、バリセラーゾースタ（Ｖ　ａｒｉｃｅｌ　
Ｉａ−ｚｏｓｔｅｒ、　Ｖ　Ｚ　Ｖ　）　、サイトメガ
ロウィルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、　ＣＭ
Ｖ）等のウィルス、キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ　ａ
ｌｂｉｃａｎｓ　）　、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ＞　、ノカルディア（
Ｎ　ｏｃａｒｄｉａ　ａｓｔｅｒｏｉｄｅａ）等の真菌
、カリニ原虫（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎ
ｉｉ　）　、トキソプラズマ（Ｔ　ｏｘｏｐｌａｓｍａ
　ｇｏｎｄｉ　ｉ　＞等の原虫等であり、現用の抗生物
質は、之等の病原菌に対して充分な効果を奏し難く、該
日和見感染症に対する新しい薬剤の研究開発が切望され
ている。本発明ポリペプチドは、かかる日和見感染症の
予防及び治療剤としても有効であり、特にかかる日和見
感染症が高頻度に見られる抗癌剤投与時、即ち急性白血
病の化学療法や骨髄移植時等における各種の感染症、例
えばガンシダ症、クリプトコックス症、アスペルギルス
症、接合菌症、黒色真菌感染症、ウィルス感染症、サイ
トメガロウィルス肺炎、之等の合併症等の予防及び治療
剤として有用なものである。

また本発明ポリペプチドを有効成分とする抗炎症剤は、
関節炎等の予防及び治療剤として有効である。

更に、本発明ポリペプチドは、復配実施例に記載した方
法により測定される腫瘍細胞増殖抑制活性（以下これを
ｒＧＩＦ活性」という）を有しており、種々の腫瘍細胞
に対して特異的にそれらの増殖を抑制する作用を発揮す
る。従って、これを有効成分とする抗腫瘍剤は、癌の化
学療法剤として、特に各種抗悪性腫瘍剤との併用による
寛解強化療法、寛解維持療法に有利に用いられる。

更に本発明ポリペプチドは、上記医薬用途以外に、その
サイトカイン産生促進活性に基づいて、例えば細胞株か
らの各種有用サイト力インのインごトロ（ｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ）製造に際して極めて有効に使用し得る。かかる細
胞株からの天然型サイト力インの製造は、ことに糖蛋白
質でおるサイト力インにおいて着目されており、効率的
にかつ大量に有用サイト力インを収１醪することができ
る。

また本発明者の研究によれば、ＩＬ−１α自身の新しい
生理活性が見い出された。

即ち、ＩＬ−１αは、ＧＩＦ活性及びＣ３Ｆ産生促進活
性を有し、かかる生理活性に基づく上記の各種医薬用途
に用いることができる。

本発明のｌ−１α誘導体においては、前記式（Ａ＞で表
わされるＩＬ−１αの３６位ＡＳｒｌが少なくとも欠失
もしくは他のアミノ酸に置換されたアミの酸配列を有す
るポリペプチドがより好ましい。置換を行い得る他のア
ミノ酸としては、人体蛋白質を構成するα−アミノ酸で
あればいずれてもよいが、Ｃｙｓは、そのＳＨ基に基づ
いて分子間結合を形成することがあり、これを考慮ブれ
ば、該アミノ酸はＣｙｓ以外の上記アミノ酸であるのが
好ましい。特に好ましいものとしては、例えば、３６位
Ａｓｎの場合はＡＳｔ）を、１４１位ｃｙｓの場合は、
３ｅｒをそれぞれ例示することができる。

本発明ポリペプチドは、例えば遺伝子工学的手法により
製造することができる。即ち、前記本発明に係る特定の
ポリペプチドをコードする遺伝子を利用し、これを微生
物のベクターに組込んで該微生物細胞内で複製、転写、
翻訳させることによって製造することができる。この方
法は、特に大量生産が可能である点より有利である。

上記方法において用いられる遺伝子は、通常の方法、例
えばホスファイト　トリエステル法（ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ　＞　、　３１０．１０５（１９８４））等の
常法に従って、核酸の化学合成により全合成することも
できるが、ＩＬ−１αもしくはその前駆体をコードする
遺伝子を利用するのが簡便でおり、該遺伝子より、上記
化学合成手段を含む常法に従って、前記特定のアミノ酸
配列をコードする核酸配列に改変することにより容易に
製造できる。

ＩＬ−１α又はその前駆体をコードする遺伝子は、公知
（記述）でおり、我々も該遺伝子を得、これを用いて遺
伝子工学的手法でＩＬ−１αを収得した。之等の一連の
方法は後記参考例において明らかにする。

上記遺伝子の改変操作は目的とするポリペプチドのアミ
ノ酸配列に応じて公知方法に従い実施され得る（遺伝子
工学的手法としては、例えば、ＭＯｌｅｃｕｌａＰ　　
　Ｃｌ０ｎｉｎ（Ｉｆ、　　Ｃｏ１ｄ　　５ｔ）ｒｉｎ
（Ｊ　　ＨａｒｂｏｒＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　（１
９８２）が参照される）。例えば、ＤＮＡの切断、結合
、リン酸化等を目的とする、制限酵素、ＤＮＡリガーゼ
、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等の
各種酵素処理等の常套手段が採用でき、それらの酵素は
市販品として容易に入手できる。之等各操作における遺
伝子乃至核酸の単離、精製も常法、例えばアガロース電
気泳動法等に従えばよい。また得られる遺伝子の複製は
、一部後述するように通常のベクターを利用する方法に
従えばよい。また所望のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ断片や合成リンカ−は、上記した化学合成により容易
に製造できる。

尚、上記において所望のアミノ酸に対応するコドン自体
は公知であり、またその選択は任意でよく、例えば利用
する宿主のコドン使用傾度等を考慮した常法に従えばよ
い（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　。

９．４３−７４　（１９８１））。またこれらの核酸配
列のコドンを一部改変する操作には、例えば常法どおり
、１５〜３０マ一程度の所望の改変をコードする合成ヌ
クレオチドからなるプライマーを用いたサイト−スペシ
フィック　ミュータジエネシス（Ｓｉｔｅ　−５ｐｅｃ
ｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８ユ、５６６２−５６６６
　（１９８４＞）等の方法を採用することができる。

上記した方法により得られる所望の遺伝子は、例えばマ
キサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ　−Ｇ　
１ｌｂｅｒｔ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅ　ｎＺｙｍ、　、　６
５　。

４９９−５６０　（１９８０））やＭ１３ファージを用
いるジテオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎａ
、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、、Ｇｅｎｅ、１
９゜２６９−２７６　（１９８２））等により、その塩
基配列の決定及び確認を行なうことができる。

上記操作及び方法の具体例は、後記参考例及び実施例に
記述するが、該方法は特に限定されず、当業界において
周知の各種方法のいずれを採用してもよい。

かくして、本発明によれば前記した特定のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードする新規な遺伝子も提供
される（以下この遺伝子を［本発明遺伝子」という）。

本発明のポリペプチドは、上記特定の遺伝子（本発明遺
伝子〉を利用し、従来公知の一般的な遺伝子組換え技術
に従い製造できる。より詳細には、上記本発明遺伝子が
宿主細胞中で発現できるような粗換えＤＮＡを作成し、
これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を
培養すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいず
れをも用いることができる。該真核生物の細胞には、を
推動物、酵母等の細胞が含まれ、を推動物細胞としては
、例えばサルの細胞であるＣＯ５細胞（Ｙ、　Ｇｌｕｚ
ｍａｎ、　　Ｃｅ１ｌ、２３．　１７５−１８２（’１
９８１））やチャイニーズ・／’１ムスター卵巣細胞の
ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｇ、　Ｕｒｌａｕｂ
　ａｎｄ　Ｌ　、　Ａ、　Ｃｈａｓｉｎ　、　Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ、、ＬＩＳＡ、　７７．４
２１６−４２２０　（１９８０））等がよく用いられて
いるが、之等に限定される訳ではない。を推動物細胞の
発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の
上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位
、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するも
のを使用でき、これは更に必要により複製起源を保有し
ていてもよい。該発現ベクターの例としてはＳＶ４０の
初期プロモーターを保有するＩ）　ＳＶ　２６Ｍｒ　（
Ｓ、　Ｓｕｂｒａｍａｎｉ。

ＲｏＭｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｂｅｒｇ　、　
Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ。、１　（９）、８５４−８６４）等を例示で
゛きるが、これに限定されない。

また真核微生物としては酵母が一般によく用いられてお
り、その中でもサツカロミセス属酵母が有利に利用でき
る。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとして−は、
例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーター
を持つｐ　ＡＭ８２　（Ａ。

Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ　ｅｔ　　ａｌ、　ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ、。

ＵＳＡ、８０．１−５　（１９８３））等を好ましく利
用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく
用いられている。本発明では例えば該宿主菌中で複製可
能なプラスミ・ドベクターを用い、このベクター中に本
発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモ
ーター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基
配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した発現
プラスミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸菌と
しては、エシェリヒア−］す（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　ｃｏｔ　ｉ　）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベク
ターとしては一般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、
これに限定されず、公知の各種の菌株及びベクターがい
ずれも利用できる。プロモーターとしては、例えばトリ
プトファン・プロモーター、ＰＬプロモーター、Ｉａｃ
プロモーター、ｌｐｐプロモーター等を使用することが
でき、いずれの場合にも本発明遺伝子を発現させること
ができる。

トリプトファン・プロモーターを用いる場合を例にとり
詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトファン・プロ
モーター及びＳＤ配列を持つベクターｏＴＭ１（今本文
男、代謝、Ｖｏｌ、２２゜２８９　（１９８５））を使
用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ１ａＩ部位
に、必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポリペプチド
をコードする遺伝子を連結させればよい。

尚、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラクトンダーゼ
やβ−ラクタマーゼ等を利用する融合蛋白質発現系によ
ることもできる。

かくして得られる発現ベクターの宿主細胞への導入及び
これによる形質転換の方法としては、一般に用いられて
いる方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集め
、ＣａＣＱ２処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状
態にして、ベクターを取込ませる方法等を採用できる。

上記方法においては、通常知られているように形質転換
の効率を一層内上させるためにＭ（ＪＣＧ！２やＲｂ　
ＣＱを更に共存させることもできる。また、宿主細胞を
スフェロプラスト又はプロトプラスト化してから形質転
換させる方法も採用することができる。

かくして得られる所望の形質転換株は、常法に従い培養
することができ、該培養により、所望のポリペプチドが
生産、蓄積される。該培養に用いられる培地としては、
通常の細胞培養に慣用される各種の培地のいずれでもよ
く、その具体例としては、例えばし培地、Ｅ培地、Ｍ９
培地等及び之等に通常知られている各種の炭素源、窒素
源、無機塩、ビタミン類等を添加した培地を例示できる
。

尚、上記トリプトファン・プロモーターを用いた場合に
は、一般にプロモーターが動くようにするためにカザミ
ノ酸を添加した、例えばＭ９最小培地を用いて培養する
ことができ、該培地中には培養の適当な時期にインドー
ルアクリル酸等のトリプトファン・プロモーターの動き
を強めるための薬剤を添加することもできる。

このようにして得られる活性物質を含有する培養物から
の目的ポリペプチド、即ち本発明ポリペプチドの精製、
単離は常法に従って行なうことができる。尚、本発明ポ
リペプチドを宿主から抽出するに当っては、例えば浸透
圧ショック法等の温和な条件を採用するのが、その高次
構造保持の面からより好ましい。

上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチドの物理、化
学的性質を利用した各種の処理操作に従い実施すること
ができる（例えば「生化学データーブックＩＩＪｐｐ１
１７５〜１２５９、第１版第１印刷、１９８０年６月２
３日、株式会社東京化学同人発行参照）。該方法として
は、具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤による処理、限
外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、
液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、アフイ
ニテイクロマトグラフィー、透析法、之等の組合せ等を
採用できる。

より具体的には、上記操作は、例えば以下のごとくして
実施できる。即ち、まず培養上清より予め目的とするポ
リペプチドを部分精製する。この部分精製は、例えばア
セトン、メタノール、エタノール、プロパツール、ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ＞等の有機溶媒や酢酸、過塩
素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）等の酸を蛋
白沈澱剤として用いる処理、硫酸アンモニウム、硫酸ナ
トリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理及
び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外濾
過処理等により行なわれる。

之等の各処理の操作及び条件は、通常のこの種方法のそ
れらと同様のものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル濾過に付すこと
により目的物質の活性が認められる画分を収得する。こ
こで用いられるゲル濾過剤としては、特に限定はなく、
例えばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、ア
ガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロースゲル、
セルロース等を素材とするものをいずれも利用できる。

之等の具体例としては、セファデックスＧタイプ、同Ｌ
Ｈタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ（
以上、ファルマシア社）、セルロファイン（チッソ■）
、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオ−ラド社）
、ウルトロゲル（１３８社）、ＴＳＫ−Ｇタイプ（東洋
曹達■）等の市販品を例示できる。

目的とするポリペプチドは、上記ゲル濾過により得られ
る活性画分を、例えばハイドロキシアパタイトカラムを
用いたアフィニティークロマトグラフィー、ＤＥＡＥ法
、０Ｍ法、ＳＰ法等のイオン交換カラムクロマトグラフ
ィー、クロマトフオーカシング法、逆相高速液体クロマ
トグラフィー等に付すことにより、又は之等各操作の組
合せにより更に精製でき、均質な物質として単離できる
。

上記クロマトフオーカシング法は、公知の各種方法によ
り実施できる。カラムとしては、例えばＰＢＥ９４　（
ファルマシア社製）等を、開始緩衝液としては、例えば
イミダゾール−塩酸等を、また溶出液としては、例えば
ポリバッファー７４（ファルマシア社製）−塩酸（ｐ　
Ｈ４，０＞等を使用できる。

上記逆相高速液体クロマトグラフィーは、例えばＣ４ハ
イボア一逆相ＨＰＬＣカラム（バイオ−ラド社（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　）等を用
いて、移動剤としてアセトニトリル、トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ＞、水等及び之等の混合溶媒を用いて実施でき
る。かくして本発明のポリペプチドを単離、収得できる
。

又、ＩＬ−１αをコードする遺伝子から上記と同様にし
てＩＬ−１αを収得できる。

得られる本発明ポリペプチド又はＩＬ−１αは、これを
有効成分として、前述した各種の医薬用途に有用な医薬
製剤とすることができる。該医薬製剤は、通常本発明ポ
リペプチド又はＩＬ−１αと共に適当な医薬製剤担体を
配合して製剤組成物の形態に調製される。該製剤担体と
しては使用形態に応じた製剤を調製するのに通常慣用さ
れる充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活
性剤等の賦形剤乃至は希釈剤をいずれも使用できる。

製剤組成物の形態は、これが本発明ポリペプチド又はＩ
Ｌ−１αを効果的に含有する状態であれば、特に限定は
なく、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、火剤等の固剤であ
ってもよいが、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態
とするのが好適でめる。

またこれは使用前に適当な担体の添加によって液状とな
し得る乾燥品とすることもできる。２等製剤組成物はい
ずれも常法に従い調製され得る。

得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態に応じた適当
な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、
筋肉内、皮下、皮肉、腹腔的投与等により投与され、固
剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与され得る。医
薬製剤中の有効成分の岨及び該製剤の投与量は、該製剤
の投与方法、投与形態、使用目的、之を適用される患者
の症状等に応じて適宜選択され、一定ではないが、通常
有効成分を約１〜８０重量％程度含有する製剤形態に調
製して、この製剤をこれに含有される有効成分量が一日
成人一人当り約０．１μｇ〜１０ｍｇ程度となる範囲で
投与するのが望ましい。該投与は、−日１回でおる必要
はなく一日３〜４回に分けることもできる。

以下、参考例及び実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明する。

尚、以下の例において各種生理活性は、次の方法により
測定した。

〈活性の測定〉 （１）ＩＬ−１活性の測定 オツベンハインら（Ｊ、　Ｊ、　０１）Ｉ）ｅｎｈｅｉ
ｎ　ｅｔ　ａｌ）の方法（Ｊ、　　ｉｍｍｕｎｏｌ、、
１１６．１４６６（１９７６））に従い、０３Ｈ／Ｈｅ
　Ｊ系マウスの胸腺細胞を利用して測定したＬＡＦ活性
により表示した。

（２）ＧＩＦ活性の測定 ９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した供試液０．１ｍ１２を入れ、次に各ウェ
ルにヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を２Ｘ１０’個／ＩＩ
ＩＱの濃度で含有する１０％ＦＯ３を含むイーグルスＭ
ＥＭ浮遊液０．１ｍＧを加え、炭酸ガス培養器（ナフコ
社製）内で４日間培養する。

培養終了後、０．０５％ニュウトラルレッド（和光紬薬
社製＞０．０５１Ｔｌ１２を各ウェルに加え、３７°Ｃ
で２時間培養する。上澄液を除去した後、リン酸緩衝生
理食塩水０．３Ｉｔ？を各ウェルに静かに加えてウェル
を洗浄する。洗浄液を除去した後、各ウェルにリン酸１
ナトリウム−エタノール等量混合液０．１ｍｌを加え、
マイクロミキサーで数分間振盪し、細胞内に取込まれた
色素量を、９６ウ工ルーマイクロタイトレーシヨンプレ
ート用光度計（タイターチェックマルチスキャン、フロ
ララボラトリーズ社製）を用いて、吸光度５４０ｍμに
て測定し、増殖抑制活性を求める。対照群（コントロー
ル群）の細胞増殖の５０％抑制を示す試験群、即ち対照
群の吸光度測定値の１／２の吸光度測定値を示す試験群
、の希釈率の逆数をとり、これをＧＩＦ活性単位とする
。従って例えばこのＧＩＦ活性が１０単位の場合、この
供試液は１０倍希釈してもなお細胞増殖を５０％抑制す
る活性を有する。

参考例１ ■　Ｕ９３７細胞の培養 ヒトリンパ組織球腫Ｕ９３７細胞（ＡＳＣｅｎｓｏ。

Ｊ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、　１３１ｏｏｄ、　Ｖｏｌ、５
７．　ｌ）　１７０（１９８１））１．４Ｘ１０９個を
、１２−０−テトラデカノイルホルボ−ル− （ＴＰＡ＞（ファルマシア社’Ｉ）２５ｎＭｎ＋Ｑ、コ
ンカナバリンＡ　（ＣｏｎＡ）　　（シグマ社製＞１０
μｇ／ｍＱ及び１０％牛脂児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰ
ＭＩ−１　６４０培地に入れて、４Ｘ１０”個／脱の濃
度の細胞浮遊液を調製した。

この細胞浮遊液１０ｍＱずつを、直径ｇｃｍのシャーレ
（フアシヨン３００３）に分注し、５％炭酸ガス中、３
７°Ｃで３日間培養後、培僕上清をアスピレータ−にて
除去し、１０％ＦＣＳ、細菌リポポリサッカライド（Ｌ
ＰＳ）（ディフコ社製）１０／ｌ／ｍ（２、ムラミルジ
ペプチド（ＭＤＰ）（和光紬薬社製＞　１　μ（］　／
＋ｎ１２及びＴ　ＰＡ　１　ｎｃｌ／ＴｎＱを含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地１０１ｎ１２を、各シャーレに分注
した。この培地にて５％炭酸ガス中、３７℃で１８時間
培養し、シャーレ底部に付着したＵ９３７細胞をｍ　Ｒ
ＮＡ調製用の材料として利用した。

■　ｍＲＮＡの調製 ＲＮＡの抽出は、グアニジニウム／熱フェノール（ｇｕ
ａｎｉｄｉｕｍ　／ｈｏｔ　ｐｈｅｎｏｌ）法（　１：
　ｅｒａｍｉｓｃｏ。

Ｊ．　Ｒ，　ｅｔ　ａｌ．、　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、　Ｖｏｌ、２５７、ｐ　１１０２４　（１９８２
））とグアニジニウム／セシウムクロライド（ｇｕａｎ
ｉｄｉｎｉｕｍ　／ｃｅｓｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　
）法（Ｑｌｉｓｉｎ，Ｖ．ｅｔ　ａｌ．。

３ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　Ｖｏｌ．　　１　３，
　ｌ）　２６３３（１９７４））との組合せにより行な
った。

上記■で培養したＵ９３７細胞を洗浄するために、培養
上清を除去した後、各シャーレを５１１１１２のＰＢＳ
　（−）溶液にてすすぎ、その後、各シャーレに１鵬の
４Ｍ−グアニジン・イソチオシアネート混合液（４Ｍ−
グアニジンイソチオシアネート（　Ｆｌｕｋａ社１１）
　、５０ｍ　ＭトリスＨＣＱ　（ｐＨ７、６＞、１０ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ，２％ラウロイリルザルコシン酸ナトリ
ウム〕を添加し、細胞を溶解させた。溶解液をラバーポ
リスマンとパスツールピペットにて回収して、細胞溶解
液４２０ｍｌを得た。この溶解液を６０℃に保ち、１８
Ｇ注射針に通過させることにより、染色体ＤＮＡをせん
断し、その後６０℃に保温したフェノールを等量加え、
１８Ｇ注射針にて更に溶液を混合し、せん断した。次い
でこの混合液に０．１Ｍ酢酸ナトリウム−１０ｍＭトリ
スＨＣＱ　（ｐＨ７．４＞−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ液２１
０ｍＧとり００ホルム−イソアミルアルコール（２４　
：　１容積比）混液４２０ｍｌとを加え、６０’Ｃに保
温しながら、１５分間激しく撹拌した。混合液を水冷後
、３　０　０　０　ｐｐｍ、４°Ｃで２０分間遠心し、
水層を回収した。水層に２容のエタノールを加え、−７
０℃にて一夜放置後、粗ＲＮＡ沈澱を得た。該粗ＲＮＡ
を、６Ｍグアニジン・イソチオシアナート−５　ｍＭク
エン酸ナトリウム（ｐ　Ｈ７．０＞−０．１Ｍβ−メル
カプトエタノール−０．５％ラウロイリルザルコシン酸
ナトリウム液４８ｍＱに溶解させ、塩化セシウム１９．
２（］を添加して溶解させた。次にこの混合液７回ずつ
を、５．７Ｍ塩化セシウム−０，１Ｍ　　ＥＤＴＡ　（
ｐＨ７，５＞の４ｍ１２に重層し、ベックマン５Ｗ４０
Ｔｉローターにて、２５°ＣＣ１３１５００ｒｐで２０
時間遠・心して、ＲＮＡを分取した。

かくして得られたＲＮＡＩは９．７ｍＯであった。

次に上記で得られたＲＮＡからｍ　ＲＮＡを取得するた
めに、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（コラボレイテイブ
　リサーチ（Ｃｏｌ　１ａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅＳｅａ
ｒＣｈ、　ｌ　ｎＣ０社製）を用いて、カラムクロマト
グラフィーを行なった。吸着は１０ｍＭトリスＨＣ（１
！　（ｐ　Ｈ７，５＞−０，５Ｍ　　Ｎａ　ＣＱ−１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡにて行ない、溶出は１０ｍＭｔ’リスＨ
ＣＱ（＋）Ｈ７，５＞−１ｍＭ　　ＥＤＴＡにて行なっ
た。

この結果、得られたｍＲＮＡは、４００μｇでめった。

■　ｃ　ＤＮＡライブラリーの調製 ｃ　ＤＮＡライブラリーの調製は、以下の通り、ｃ　Ｄ
ＮＡが動物細胞において発現可能なオカヤマーベルグ（
Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ　）法により行なツタ。

即ち、ｃ　ＤＮＡクローニングに用いるｄＴ鎖の付加し
たベクター・プライマーは、プラスミドｐ　ＣＤＶｌよ
り、またｄＧ鎖の付加したリンカ−ＤＮＡは、プラスミ
ドｆ）Ｌｌより、各々オカヤマらの方法（Ｑｋａｌ／ａ
ｍａ、　Ｈ，ａｎｄ　ｐ、　３ｅｒｇ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　３
ｉｏ１ｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　３゜ｐ２８０　（１９８３
））に従って調製した。

次に上記■で得たｍＲＮＡ１５ｉを、５　ｍＭトリスＨ
ＣＱ　（＋）Ｈ７，５）−０，５ｍＭＥＤＴＡ　（ｐ　
Ｈ７，５）水溶液２０μＱに溶解し、６５°Ｃで５分間
、次いで３７°Ｃで５分間インキュベートした後、反応
液（全量４０μＱ）を、５０ｍＭトリスＨＣＱ　（＋）
Ｈ８，３＞、８　ｍＭＭ（ｌ　ＣＱ２．３０　ｍＭ　　
ＫＣＧ！、０．３　ｍＭジチオスレイトール、２　ｍＭ
の各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、ベクター・プライマーＤＮＡ２
．８μ（］　、ＲＮａＳｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ　　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製＞６０ユニツト、逆転写酵素
（バイオ−ラド社製＞４０ユニツトになるように調整し
て、３７℃で１時間インキュベートし、０．５Ｍ　　Ｅ
ＤＴＡ　（ｐ　Ｈ７，５＞２μＱ及び１０％５ＤＳ２μ
Ｑを加えて反応を停止させた。

その後、フェノール・クロロホルム抽出及びクロロホル
ム抽出を行い、エタノール沈澱としてベクター・プライ
マーｃＤＮＡ：　　ｍＲＮＡを回収した。

回収されたベクター・プライマーＣＤＮＡ：ｍＲＮＡを
、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリスＨ
Ｃ９（ｐ　Ｈ６，８＞、ｌ　　ｍＭＣａ　ＣＧ！２．０
．１　　ｍＭジチオスレイトール、０．３μ９ポリ（Ａ
＞、６６μＭ　　ｄＣＴＰ及び３８ユニツトのターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ファル
マシア社製）からなる反応液３０μＱ中で３７℃、５分
間インキュベートした後、０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐ
　Ｈ７，５）１．５μＱ及び１０％５Ｃ３１，５μＱを
加えて反応を停止させ、フェノール・クロロホルム抽出
及びクロロホルム抽出を行って、エタノール沈澱として
オリゴｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ：　　ｍＲＮＡ−ベクター・
プライマーを回収した。

この回収された核酸を、７ｍＭトリスＨＣＱ（ｐＨ７，
５＞　、７　ｍＭ　　ＭｇＣＱ２．６０　ｍＭＮ、ａＣ
９，１００μｇ／ｍｆ２牛血清アルブミン及び１２ユニ
ツトの制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ（日本ジーン社製）から
なる反応液２０μＱ中で、３７°Ｃで９０分間インキュ
ベートし、次いで０．５ＭＥＤＴＡ（ｐ　Ｈ７，５＞１
μＱ及び１０％５ＤＳ１μＱを加えて反応を停止させた
。その後、フェノール・クロロホルム抽出及びクロロホ
ルム抽出を行い、エタノール沈澱として、ｌ−１ｉｎｄ
ｌｌｉ分解されたオリゴｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ：　　ｍＲ
ＮＡ−ベクター・プライマーを回収した。これを１０ｍ
ＭトリスＨＣＱ　（＋）８７．５＞−１ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ（１）Ｈ７，５＞（ＴＥ　（ｐ　Ｈ７，５＞＞１０μ
Ｑに溶解させた。このうちの１μＱを用いて、上記ＴＥ
（ｐ　Ｈ７，５＞、０．１Ｍ　　へａＣＱ及びオリゴｄ
Ｃ鎖の付加されたリンカ−ＤＮＡ１４ｎＯからなる反応
液１０μＱ中で、６５°Ｃで２分間インキュベートし、
次いで４２℃で３０分間インキュベートした後、ＯｏＣ
に冷却した。

上記反応液を、更に２０ｍＭトリスＨＣＱ（ｐＨ７，５
＞、４　ｍＭ　　ＭＣＩ　ＣＯ２，１０ｍＭ（ＮＨ４＞
２　Ｓｏｄ　、０．１Ｍ　　ＫＯ２，５０μｇ／ｍＱ牛
血清アルブミン、０．１　ｍＭ　　β−ＮＡＤ　にコチ
ンアミド・アデニン・ジヌクレオチド、ファルマシア社
製〉及び０．６μＱのニジ　。

エリヒア・コリＤＮＡリガーゼ（ファルマシア社製）を
含む反応液１００μＱとなるように調整し、１２℃で一
夜インキユベートした。この反応液に、ｄＡＴＰＳ　ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの各々を４０μＭになる
ように、またβ−ＮＡＤを０．１５ｍＭになるようにそ
れぞれ加え、更にエシェリヒア・コリＤＮＡリガーゼの
０．４μｑ１エシエリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼ■
（べ一リンガー・マンハイム社製）の４．６ユニツト及
びエシェリヒア・コリＲＮａｓｅＨ（ファルマシア社製
）の１ユニツトを加え、１２°Ｃで１時間、次いで２５
℃で１時間インキュベートした。

上記で得られた反応液を用いて、エシェリヒア・コリＨ
８１０１株を形質転換させた。エシェリヒア・コリＨ８
１０１株のコンピテント・セルとしては、ベテスダ　リ
サーチ　ラボラトリーズ社（３ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　：　Ｂ　ＲＬ
　）の製品を使用し、該ＢＲＬ社のマニュアルに従って
、上記形質転換を行った。

かくして、約２１０００個からなるＣＤＮＡライブラリ
ーが得られた。

■　サルＣＯ３−１細胞へのトランスフェクション記■
で１ｑられたＣＤＮＡライブラリーを、１グループ当り
平均７０クローンのグループに分け、各グループからプ
ラスミドＤＮＡを調整した。

プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶菌法 （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　　ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　。

１９８２．１）３６８）に従い調製した。

かくして各グループから調製されたプラスミドＤＮＡを
、それぞれサル培養細胞のＣＯ３−１細胞（Ｇｌｕｚｍ
ａｎ、　Ｙ、、Ｃｅ１ｌ　、　Ｖｏｌ、　２３．　ｐ　
１７５（１９８１））にトランスフェクションした。

該トランスフェクションは、ＤＥＡＥ−デキストラン法
によった（Ｙｏｋｏｔａ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、Ｖｏｌ、　
８１゜ｐ　１０７０　（１９８４））。即ち、ＣＯ３−
１細胞をトリプシン処理により、１０％ＦＣ８を含むＲ
ＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させ、細胞数を１×１０６
個／ｌＴｌＩ２に調整後、１０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ
−１６４０培地を２鵬／ウェル加えた６ウエルプレート
に、各々５００μＱずつ分注した。

−晩３７℃で培養後、上清を除き、血清を含まない培地
で細胞を洗浄し、１０μｇ／脱プラスミドＤＮＡ、０．
４ｍＭｍ２ＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア社製
）、５０ｍＭトリスＨＣＱ（ｐ　Ｈ７，４＞及び１０％
ＦＣ３を含むＲＰＭＩ−１６４０培地をｉｌ＋！１２／
ウェル加えて、４．５時間３７℃で培養した。その後、
上清を除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄し、１５
０μＭクロロキン（シグマ社製）及び１０％ＦＣ３を含
むＲＰＭＩ−１６４０培地を２脱／ウェル加えて、更に
３７°Ｃで３時間培養した。上清を除き、血清を含まな
い培地で細胞を洗浄後、１０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ−
１６４０培地を３ｍＱ／ウェル加えて、３７℃で７２時
間培養した。上清を回収した後、１０％ＦＯ３を含むＲ
ＰＭＩ−１６４０培地を２ｍＱ／ウェル加え、凍結融解
を２回繰返し、細胞抽出液を回収した。この培養上清及
び細胞抽出液について、ＧＩＦ活性を測定した。

ＧＩＦ活性を示したグループを１０クローン／グループ
の２４グループに分け、上記と同様の操作を行ない、Ｇ
ＩＦ活性を測定し、活性を示したグループについて、更
にグループ内の各クローンにつき、上記と同様の操作を
行なって、ＧＩＦ活性を示すクローンを同定した。

カクシテ、ｐｃＤ−Ｇ　Ｉ　Ｆ　−１６及びｐＣＤ−Ｇ
ＩＦ−２０７の２種類のクローンを得た。

之等のクローンのＧＩＦ活性（Ｇ　Ｉ　Ｆ単位／ｍＱ＞
を第１表に示す。

第１表 クローン　　　　培養上清　　細胞抽出物１）ＣＤ−Ｇ
ＩＦ −１６４８，３１２０，７ １）ＣＤ−ＧＩＦ −２０７６２，６１９６，９ ｃＤＶ１ （対照）　　　　　　０　　　　　　０■　クローンの
解析 プラスミドｐｃＤ−Ｇ　Ｉ　Ｆ−１６及びｐＣＤ−ＧＩ
Ｆ−２０７のＣＤＮＡの制限酵素地図を第１図に示す。

また之等のＣＤＮＡの塩基配列を塩基特異的化学修飾法
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｑｙ、Ｖｏ
ｌ、　６５゜ｐ　４９９　（１９８０））及びファージ
Ｍ１３ベクター（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ、　１９．　Ｉ）　
２６９　（１９８２）　）を使用したジデオキシ・チェ
ーン・ターミネーション（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、、ＬＪＳＡ　、Ｖｏｌ。

７４　、ｐ　５４６３　（１９７７））により決定した
。

その結果、ｐｃＤ−Ｇ　Ｉ　Ｆ−２０７の有するＣＤＮ
Ａは、マーチらの報告するＩＬ−１α（Ｃａｒｔ　Ｊ、
　Ｍａｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ。

３１５、　ｐ６４１　（１９８５））の翻訳領域ＣＤＮ
Ａ配列と同一でめることが確認ざ゛れた。

上記ＩＬ−１α前駆体蛋白質をコードするＣＤＮＡを有
するプラスミド１）ＣＤ−ＧＩＦ−２０７をエツシエリ
ヒアコリχ１７７６株に保有させた株を工業技術院微生
物工業研究所に［エツジエリヒフ　コリχ１７７６／ｐ
ｃＤ−ＧＩＦ−２０７Ｊなる名称で微工研条奇第１２９
４号（ＦＥＲＭＢＰｌ　２９４＞として寄託した。

■　ポリペプチドの発現及び製造 上記プラスミドｐｃＤ−ＧＩ　Ｆ−２０７を、制限酵素
）−１ｉｎｄ［ｌ及びｌ−１ｉｎｃＩＩにより切断した
後、約０．６６ｋｂの）−１ｉｎｄ　ｍ−Ｈｌｎｃ　ｌ
ｌＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動法によ
り単離、精製した。このＤＮＡフラグメントを更に制限
酵素ＡＩｕＩで切断して、約０．５ｋｂのＡ　ＩｕＩ　
−Ｈ１ｎＣＩＩＤＮＡフラグメントを同様にして単離し
た。

次に、合成オリゴヌクレオチド（５’　　ＣＧＡＴＡＡ
ＴＧＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＧ　　３’及び５’　
　ＣＴＡＡＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＡＴ３’）の
各５′末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリ
ン酸化し、上記で得たＡＩｕＩ−Ｈｉｎｃ　ｌｌＤＮＡ
フラグメントに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、
制限酵素ＣＩａ■で切断し、得られた反応物をアガロー
スゲル電気泳動に付して、約０，５４ｋｂのＣｌａＩ　
−Ｃ１ａＩＤＮＡフラグメントを単離精製した。

他方、プラスミドｐＴＭＩ（今本文男１代謝。

Ｖｏｌ、２２，２８９　（１９８５））を、制限酵素Ｃ
１ａ■で切断し、子牛腸アルカリホスホターゼ（ＣＩ　
Ａ　Ｐ　：　ｃａｌｆ　１ｎｔｅｓｔｉｎｅ　ａｌｋａ
ｌ　ｉｎｅｐｈＯ５ｐｈａｔａｓｅ　）で反応させた後
、先に調製した約０．５４ｋｂのＣ１ａＩ−ＣｌａＩＤ
ＮＡ７ラグメントと、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結して目
的のポリペプチド発現用プラスミドｐｔｒｐ１．Ｌ−１
α−１１３を得た。

該プラスミドを、エシェリヒア・コリーＨＢ１０１にト
ランスフオームさせ、目的のトランスフォーマントを、
ボイリング法により得られるプラスミドＤＮＡの制限酵
素による切断フラグメントの大きざを解析することによ
り選択した。

以上の概略を第２図に示す。

上記で得たトランスフォーマントより、プラスミドＩ）
ｔｒＤＩＬ−１α−１１３を抽出し、これをエシェリヒ
ア・コリＷ３１１０にトランスホームして、エシェリヒ
ア−ｍｌす（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　−ｃｏｌ　ｉ
　）Ｗ３１１０／ｐｔｒｐ　ＩＬ−１α−１１３を得た
。

実施例１ （１）　形質転換体の培養 参考例１の■で得た形質転換体（エシェリヒア・コリＷ
３１１０／ｐｔｒｐ　ＩＬ−１α−１１３）を、アンピ
シリン５０μｇ／ｍｆ２及びＬ−トリプトファン２０μ
ｇ／ＩＩＩＱを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５
％酵母エキス及び０．５％Ｎａ　ＣＱ　）１０鵬中で、
３７°Ｃで一晩振盪培養し、この８ｍＱを５０μｇ／ｍ
１２アンピシリン及び１％カザミノ酸を含むＭ９最小培
地（０，６％Ｎａ２ＨＰＯ４，０，３％ＫＨ２ＰＯ４，
０，０５％Ｎａ　ＣＱ、０．１％ＮＨ４Ｃ９，２ｍＭ　
　Ｍｇ３０＆、０．２％グルコース及び０．１　　ｍＭ
　　Ｃａ　ＣＱ２）４００！Ｔ１１２中に植菌し、３７
℃で撮罎培養した。９時間後に大腸菌を１Ｍ　　Ｎａ２
ＨＰＯ４１０ｍ（？に懸濁させ、−夜冷至に放置した後
、１０ｍＭトリスＨＣＱ緩衝液（ｐＨ８，０＞に対して
２日間透析した。

得られた透析液を遠心分離し、上清と沈澱物とに分離し
た。得られた上清は２８ｍ１２であり、ＧｌＦ活性とし
て７．３Ｘ１０７ユニツトであった。

（２）　ポリペプチドの精製 上記（１）で得た上清の２戒を、ＧＴｉウルトロクロム
　バイパフォーマンス　リキッド　クロマトグラフィー
　システム（ＬＫＢ社製）を用いたイオン交換クロマト
グラフィー（ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣ）により、以下の条件
で精製した。

カラム：ＴＳＫゲルゲルＥＡＥニー５ＰＷ（７，５Ｘ７
５ｍｍ、東洋曹達社製） 溶離液Ａ：２０ｍＭトリスＨＣＱ緩衝液（ｐＨ８，０） 溶離液Ｂ：０．５Ｍ　　Ｎａ　ＣＱ含有２０ｍＭトリス
ＨＣＱ緩衝液（１）Ｈ８，Ｏ＞ 流速：１ｍ２／分 フラクション容１：１ｍ１２／分／チューブ濃度勾配二
　　時間（分）　　　％Ｂ Ｏ 上記ＤＥＡＥ−ＨＰＬｃの結果、ＧＩＦ活性画分は、リ
テンションタイム２６〜２８分及び３２．５〜３４．５
分の２カ所に認められた。以下この２６−’−２８分の
活性画分を「フラクション１」とし、３２．５〜３４．
５分のものを「フラクション２」とする。

上記各フラクションについて、再度ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣ
及び高速ゲルクロマトグラフィーを行なって、純粋なフ
ラクション１及びフラクション２のそれぞれを得た。

上記の通りＧＩＦ活性フラクションが分れて得られた為
、之等につき以下の確認試験を行った。

（３）　　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ） １−ａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、の方法（Ｎａｔｕｒｅ
　、　２７７゜６８０　（１９７０））に従い、上記フ
ラクション１及び２の５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。そ
の条件は次の通りで市る。

試　料二上記フラクション１又は２を乾固した後、ラエ
メリーのサンプルバッファー（１／２０体積の２−メル
カプトエタノールを含む（２ＭＥ”　））に溶解し、１
００℃で４分間処理した。

ゲ　ル：厚さ１．５ｍｍの１５％ポリアクリルアミドゲ
ルを使用した。

電気泳動装置：バイオ−ラド（３ｉｏ−Ｒａｄ）社製プ
ロチアンを用いた。

泳動条件：４０ｍＡの定電流で２時間泳動させた。

泳動後のゲルをバイオ−ラド社製シルバースタインキッ
ト（３１ｌｖｅｒ　５ｔａｉｎ　ｋｉｔ　）を用いて染
色した。その結果、フラクション１及び２の両方とも、
約１８．３ｋに単一のバンドとして泳動され、いずれも
遺伝子から予測される分子量１８ｋにほぼ一致した。

（４）　等電点電気泳動法（ＩＥＦ＞ 上記フラクション１及び２の等電点電気泳動を、ｐＨ範
囲３．５〜９．５のアンフオラインＰＡＧプレート（Ｌ
ＫＢ社製）及びモデル１４１５（パイオーラド社製）を
用いて行なった。その条件は次の通りでおる。

試　料：上記で得たフラクション１のＰＢＳ溶液で２日
間放置したもの、同２週間放置したもの、上記で得たフ
ラクション２のＰＢＳ溶液で２週間放置したもの、対照
のＰＢＳ溶液及び以下のマーカープロティン（ｐ　Ｉマ
ーカープロティン）の計５レーンを使用した。

〈マーカープロティン〉 アミログルコシダーゼ（３，５０＞、 大豆トリプシンインヒビター（４，５５＞、β−ラクト
グロブリンＡ　（５，２０＞、ウシ　カルボニック　ア
ンヒドラーゼ（ｂｏｖ　ｉ　ｎｅｃａｒｂｏｎｉｃ　ａ
ｎｈｙｄｒａｓｅ　）　３　（５、Ｆ３５　）、ヒト　
カルボニック　アンヒドラーゼ（ｈｕｍａｎｃａｒｂｏ
ｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ）　３　（５，５５）、ウ
マ　ミオグロビン−アシディックバンド（ｈｏｒｓｅ　
ｍｙｏｃ＋１ｏｂｉｎ−ａｃｉｄｉｃ　ｂａｎｄ　＞　
　（６，８５＞、ウマ　ミオグロビン−ペイシックバン
ド（ｈｏｒｓｅ　ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ−ｂａｓｉｃ　ｂ
ａｎｄ）　　（７、３５＞、レンチル　レクチン−アシ
ディックバンド（ｌｅｎｔｉｌ　Ｉｅｃｔｉｎ−ａｃｉ
ｄｉｃ　ｂａｎｄ　＞　　（８，１５＞、レンチル　レ
クチン−ミドルバンド（ｌｅｎｔｉｌＩｅｃｔｉｎ−ｍ
ｉｄｄｌｅ　ｂａｎｄ）　　（８、４５＞、レンチル　
レクチン−ペイシックバンド（ｌｅｎｔｉｌ　１ｅｃｔ
ｉｎ−ｂａｓｉｃ　ｂａｎｄ）　　（８，５５）及び トリプシノーゲン（９，３０＞。

電極液：陽極液＝１Ｍ　　Ｈ３Ｐｏｔ 陰極液＝１Ｍ　　ＮａＯＨ 泳動条件：定電力１　Ｗ／ｃｍゲル幅ゲル０分間冷却下
（１０℃）に泳動させた。

染　色：染色は、シルバー　スタイン　キットで行なっ
た。

上記泳動後、ゲルを１ｃｍ間隔でスライスし、蒸留水１
ｍ１２にて振盪抽出（２日）し、ｌ）Ｈを測定し、等電
点を算出した。

その結果、フラクション２の等電点（Ｉ）Ｉ＞は約５．
０であり、この位置に単一のバンドとして泳動された。

フラクション１においては等電点が約５．２及び約５．
０に２つのバンドとして泳動された。

（５）　アミノ酸組成 上記フラクション１及び２の各々３０μＱを、１２ｍｍ
ｘ　１２０ｍｍのパイレックス製肉厚硬質試験管の底部
に注意深く入れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケー
タ−にて減圧乾燥した。乾燥試料の入った試験管に４Ｎ
−メタンスルホン酸（０，２％の３−（２−アミノエチ
ル箇インドール含有、ピアース（ｐｉｅｒＣｅ　）社製
）５０ｕＱを加え、０．１〜０．２ｍｍＨＯで１分間脱
気後、減圧封管した。加水分解は１１８°Ｃのヒーター
中で２４時間を要して行なった。開管後、４Ｎ−水酸化
ナトリウム４６μＱで中和し、希釈用クエン酸緩衝液で
４５０μＱとした。

アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー（日立製作新製
、日立８３５型分析計）を用い、上記試料溶液２５０μ
Ｑを注入して行なった。分離されたアミノ酸は、オルト
フタルアルデヒド法で検出した。また定量は、試料の前
俊に分析した標準アミノ酸で作成した検量線によって行
なった。

その結果を、Ｐｈｅを基準（１０モル）として、各アミ
ノ酸の含有モル比で下記第２表に示す。尚、上記分析条
件下においては、ｐｒｏ及びＣｙｓは測定できない。

第２表 ア　ミ　ノ　酸　　フラクション２（モルｔ）ＡＳｔ）
及び／又はＡｓｎ　　　　　　２０．６Ｔｈｒ　　　　
　　　　　　　　１１．４Ｓｅｒ　　　　　　　　　　
　　１０．１Ｑｌｕ及び／又はＧｌｎ　　　　　　１６
．８Ｇ１１／　　　　　　　　　　　　　６．６７６、
ｌａ　　　　　　　　　　　　１４．４Ｖａｌ　　　　
　　　　　　　　　５．８Ｍｅｔ　　　　　　　　　　
　　　２．３１１ｅ　　　　　　　　　　　　　９．３
Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　１５．０Ｔｙｒ　　　
　　　　　　　　　　６．８ｐｈｅ　　　　　　　　　
　　　（１０）ＬＶＳ　　　　　　　　　　　　１（１
５Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　　３．０Ｔｒｐ　　
　　　　　　　　　１．６ Ａｒ　　　　　　　　　　　　　　２・９（６）　アミ
ノ酸配列 上記フラクション１及び２の各々１５０μＱを、アプラ
イドバイオシステムズ社製プロテインシークエンサー（
モデル４７０Ａ＞にて分析した。生じたＰＴＨ−アミノ
酸を、３３％アセトニトリル水溶液１００〜５０μＱに
て適宜希釈し、その５μＱをウォータースフ１０Ｂ型オ
ートサンプラーにて注入した。クロマトグラフィーのシ
ステムは、′ペックマン１１２型ポンプ２台を４２１型
コントローラーで作動させた。カラムはウルトラスフェ
ア−０ＤＳ−５μｍの充填された２ｍｍＸ　２５０ｍｍ
を用い、カラムヒーターにて５５℃に保った。流速は０
．３ｍ２／分とし、２０ｍＭ１酸ナトリウムとアセトニ
トリルとの混合液を用い、グラジェント溶出法で分離し
、２６９　ｎｍでモニターした。分析は４５分とした。

４′０サイクルの分析の結果、両者のアミノ酸配列は、
第３６番目のアミノ酸を除いて同一であり、各々以下の
通りであった。

３ｅｒ　−Ａ　Ｉａ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　−３ｅｒ　
−Ｐｈｅ　−Ｌ　ｅｕ　−３ｅｒ−Ａｓｎ　−Ｖａｌ　
−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ　−Ｐｈｅ　−Ｍｅｔ−Ａ　
ｒｇ−１１ｅ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｇ
　Ｉｕ　−Ｐｈｅ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｌ　ｅｕ−Ａｓｎ−
Ａｓｐ−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａｓｎ−ＧＩｎ−３
ｅｒ　−Ｉ　Ｉｅ　−１１ｅ−Ａｒｇ−Ａ　Ｉａ　−Ｘ
−ＡＳＩ）−Ｇｌｎ−Ｔ’／ｒ−１−ｅｕフラクション
１の第３６番目のアミノ酸（上記Ｘ）は、遺伝子の配列
から予想されるアミノ酸、即ちＡｓｎであり、フラクシ
ョン２のそれはＡＳｐであった。

以上のことより、フラクション１は、前記式（Ａ＞で表
わされるポリペプチド、即ちＩ［−１αであり、一方フ
ラクション２は、該ＩＬ−１αの第３６番目のアミノ酸
がＡＳＤに置換された本発明のポリペプチドであること
が確認された。以下この本発明ポリペプチドを「ポリペ
プチド■」という。

尚、上記ＩＬ−１αは、物質的に安定性に欠け、例えば
トリスＨ（ｄ！　＠耐液（ｐ　Ｈ８，０＞中においても
、一部より安定なポリペプチド■に変化することが認め
られた。

実施例２ （１）　本発明ポリペプチド■の製造 参考例１で得たプラスミドｐｔｒｌ）ＩＬ−’ｌα−１
１３を利用して、サイト−スペシフィック　ミュータジ
エネシス（Ｓｉｔｅ　−３ｐｅｃｉｆｉｃＭｕｔａｇｅ
ｎｅＳｉＳ）　　（ＰｒＯＣ，Ｎａｔ、　ＡＣａｄ、３
Ｃｉ、、３ユ。

５６６２−５６６６　（１９８４））の方法に従い、ポ
リベプチドエ発現用プラスミドを得、これよりポリペプ
チドエを以下の通り製造した。

即ち、Ｍ１３ｍｌ）１１フアージベクターを、−重鎖（
ｓｓ＞ＤＮＡ鋳型として用いた。まず、プラスミドｐ　
ｔｒｐ　ＩＬ−１ａ−１１３より、Ｅ　ＣＯＲＩ　／Ｂ
ａｍＨＩ　　ＤＮＡフラグメントを切り出し、Ｍ１３ｍ
ｌ）１１７７−ジ（ＲＦ＞のＥＣ０ＲＩと１３ａｍｌ−
１■の制限酵素サイトにクローニングし、これから−重
鎖（ｓｓ＞　ＤＮＡ　（Ｍ　１３−　Ｉ　Ｌ−１α−１
１３）を得、これをミュータジエネシスの鋳型とした。

合成オリゴヌクレオチド（５’　　ＡＣＴＧＧＧＴＧＡ
ＧＣＴＴＧＧＣＡＧ−３’　　（プライマー）〕を、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、これを５５
Ｍ１３−ＩＬ−１α−１１３ＤＮＡとハイブリダイズし
、アニーリング後、ｄ　ＮＴＰｓの存在下、ＤＮＡポリ
メラーゼエ（クレノーフラグメント）及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで各々処理し、１５℃で１８時間インキュベート
した。

得られたＤＮＡ＠ＪＭ１０５コンピテント細胞にトラン
スフオームし、生じたコロニーを、寒天プレート上に５
０コロニー植菌し、３７℃で１８時間培養した。生育し
たコロニーを含むフィルターを通常の方法によりアルカ
リ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベーキング処理を行
なった。このフィルターをプレハイブリダイズした後、
このものと、上記プライマーの５′末端を３２ｐ−γ−
ＡＴＰでラベルした３２ｐ−プローベとを、室温でハイ
ブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフィルターを
、６　ｘ　ｓｓｃバッファーで、室温で１０分間、次い
で５４℃で５分間各々洗浄し、乾燥後、−７０℃で１８
時間オートラジオグラフィーを行なった。

変異した５クローンの内から代表としてＭ１３−ＩＬ−
１α−３６Ｄを選び、これをＪＭＩ０５に感染ざぜて培
養し、５ＳＤＮＡ及びＲＦ　　ＤＮＡを調製した。

上記で得たｓｓＤ　Ｎ　ＡのＭ１３ジデオキシチェイン
　ターミネーション　シーフェンシングにより目的の遺
伝子の変異の確認を行なった。

ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ　　ＤＮＡより、ＥＣＯＲ
］：／３ａｍＨＩフラグメントを調製し、これを前記参
考例と同様にして発現プラスミドに組込み、所望のポリ
ペプチド■発現プラスミド（１，Ｌ−１α−３６Ｄ）を
）ｑだ。

このプラスミドを用いて、実施例１と同様にして、ポリ
ペプチド■を発現させ、これを精製（ＤＥＡＥ−ＨＰＬ
Ｃの結果は単一のＧＩＦ活性ピークを与えた）すること
により、前記物性を示す目的のポリペプチド■を得た。

その比活性は約１ｘ１０７ＧＩＦ単位／ｍｇ蛋白であっ
た。

実施例３ （１）　本発明ポリペプチド■及び■の製造実施例２に
おいてプライマーとして５’　−ＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧ
ＣＴＴＧＧＣＡＧ−３’を用いて、同様にして、ＩＬ−
１αの第１４１番目のアミノ酸（Ｃｙｓ）が３ｅｒに置
換された本発明ポリペプチドの発現用プラスミドである
ｐｔｒｏＩＬ−１α−１４１Ｓを得た。

該プラスミドを用いて、実施例１と同様にして、発現及
び精製を行なった結果、同様にＤＥＡＥ−ＨＰＬＣでＧ
ＩＦ活性の２つのピークが得られた。

之等につき、同様に解析を行なった結果、リテンション
タイムの早い方のピークフラクションは、遺伝子配列か
ら予想されるポリペプチド、即ちＩＬ−１αの第１４１
番目のアミノ酸（Ｃｙｓ）が３ｅｒに置換された本発明
ポリペプチド（ポリペプチド■）でおることが確認され
た。

また、他方のピークフラクションは、同様の解析の結果
、ＩＬ−１αの第３６番目のアミノ酸（Ａｓｎ）及び第
１４１番目のアミノ酸（Ｃｙｓ＞が、それぞれＡＳＩ）
及び３ｅｒに置換された本発明ポリペプチドであると同
定された。以下このポリペプチドを「ポリペプチド■」
という。

実施例４ （１）　本発明ポリペプチド■の製造 実施例３と同様にして、該実施例３で調製したプラスミ
ドｐｔｒｐ　ＩＬ−１ａ−１４１Ｓを利用して、プライ
マーとして５’　−ＡＴＴＣＧＡＧＣＣＧＡＴＧＡＴＣ
ＡＧ−３’　を用いることにより、目的のポリペプチド
■発現用プラスミドｐ　ｔｒｐＩＬ−１α−３６Ｄ・１
４１Ｓを得た。

上記プラスミドｐ　ｔｒｐ　ＩＬ−１α−３６Ｄ−１４
’ｌＳを、Ｈ８１０１株に保有させ、これを微工研に［
エツシエリヒア　コリＨＢ１０１／ｌ−１α−３６Ｄ・
１４１ＳＪなる名称で微工研条奇第１２９５号（ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ１２９５）として寄託した。

該プラスミドを用いて、実施例１と同様にして、発現及
び精製して、本発明の目的ポリペプチド■を得た。

このものの分子量は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、約１８
ｋｄであることが確認された。またこのもののＩＥＦに
よる等電点（１）Ｉ＞は、約５．０であった。ポリペプ
チド■及び■の比活性（ＧＩＦ活性）は、ポリペプチド
■と同等であった。

薬理試験例１ ■　ＧＩＦ活性及びＬＡＦ活性 本発明ポリペプチドのＧＩＦ活性については、既に記載
した通りであり、また、ポリペプチドエ、■及び■のい
ずれもそのＧＩＦ活性とほぼ同等のＬＡＦ活性を示した
。

更に本発明ポリペプチドにつき、以下の試験を行なった
。

■　抗腫瘍作用 腫瘍細胞メスＡ　（Ｍｅｔｈ　Ａ）の２０００００細胞
を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮肉接種（ｉ、ｄ、）Ｌ。

た（第Ｏ日日）。次いで、第７８目と第８８目に、ポリ
ペプチド■の０．３．１又は３μｇ／マウスを、各１回
実験動物の腫瘍内に投与した。

実験動物各７匹を１試験群とした。対照（コントロール
）群には、溶媒（１％マウス血清）のみを同様に投与し
た。

試験結果を第３図に示す。該図において横軸は腫瘍細胞
接種後日数（日）を、縦軸は腫瘍重量（ｍｇ）を示し、
曲線（１）は対照群を、曲線（２）はポリペプチドＩの
０．３μ９投与群を、曲線（３）はポリペプチド■の１
μＱ投与群を、また曲線（４）はポリペプチド■の３μ
Ｑ投与群をそれぞれ示す。また腫瘍重量は、平均（ｍｅ
ａｎ　）士標準偏差（ＳＤ）で示されており、＊はスチ
ュウデンツＴ−テストにおけるＰｒｏ、０５を、＊＊は
同Ｐ＜０．０１を示す。

■　Ｃ３Ｆ産生促進効果試験 ■−１細胞株ＬＪ−３７３ＭＧ（ＡＴＣＣＨＴＢｌ　７
、　Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍ
ａ、　ｌ−（ｕｍａｎ）を用いて以下の試験を行なった
。

即ち、まず、上記細胞を２Ｘ’ＩＯ”’個７／脱の細胞
濃度となるように、１０％ウシ胎児血清（ＧＩ　ＢＣＯ
社）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｆｌｏｗ社）及びＭＥＭ
ピルビン酸ナトリウム（ＦＩＯＷ社）を添加したイーグ
ルスＭＥＭ培地（日水社）に浮遊させた。

上記細胞浮遊液中に、種々の濃度となるようにポリペプ
チド■を加え、炭酸ガス培養器内で３７°Ｃで２４時間
培養し、各培養上清を集め、之等培養上清中に産生蓄積
されたＣ３Ｆ量を、マウス骨髄腫細胞を使用して測定し
た（１−ｅｗｉｓ、　　１．　Ｃ。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２８．
１６８（１９８２））。

得られた結果を第４図に示す。該図において、横軸はポ
リペプチド■の濃度（ｎｇ／ｌＴｌｌ２）を、縦軸はＣ
３Ｆ活性（単位／戒、Ｘ１０−”）を各々示す。

■−２ポリベプチドエを生体内に投与した場合、生体内
でのＣ３Ｆ産生六進作用が発現されることを以下の実験
により試験した。

即ち、正常マウス（ＢＡＬＢ／ｃ系マウス、静岡系実験
動物協同組合より購入）に、種々の開のポリペプチド■
を皮下投与した。上記投与後、８時間目に各実験動物よ
り採血し、血清中のＣ３Ｆ活性を上記■−１と同様にし
て、マウス骨髄腫細胞を用いて測定した。尚、対照とし
て、ヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ＞投与群を作成し、同
一試験に供した。

結果を第５図に示す。該図において、横軸はポリペプチ
ドエ投与量又はＨ３Ａ投与量（いずれもμＱ／マウス）
を、縦軸はＣ３Ｆ活性（単位／ｍｌ血清、Ｘ１０−”）
を各々示す。

■　抗炎症試験 ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ　）らの方法（Ｐ　ｒｏｃ、
　３　ｏｃ。

［：’ｘｐｔ１．１３ｉｏ１．Ｍｅｄ、、　１１１　、
５４４−５４７（１９６２））に準じて、この試験を行
なった。

即ち、６〜８週齢の雄ラット（Ｓ　ｐｒａｑｕｅＤａＷ
Ｉｅｙ系、日本チャールスリバー社）を、実験前日に体
重に基づいて１群６〜８匹の各群に分けて用いた。起炎
剤としてカラゲニン（ＭａｒｉｎｅＣＯＩ　１ｏｉｄ社
製）を、生理食塩水に１％となるように懸濁させたもの
を使用し、ラットの石後肢足た皮下に０．１鵬注射して
足浮腫を惹起させた。足浮腫を評価するため、起炎側注
射の前後の一定時間に、右後肢足随容積を、プレシモメ
ーター（ｐ＋ｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ、　ＬＪ（１１
０−ＶａＳｉｌｅ社製）を用いて測定した。前値に対す
る起炎剤注射後の容積増加率を浮腫率（ｓｗｅｌ　Ｉ　
ｉｎｋ％）として表わした。

被検物質は、ダルベツコのリン酸塩緩衝食塩水（Ｄｕｌ
ｂｅｃｏ　ｓ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ
　５ａｌｉｎｅ）に溶解希釈し、ラットの背部陵内に０
．１ｍ１Ｊ宛、起炎側注射の１時間前に注射した。尚、
対照群として、溶媒投与群を作成し、同一実験に供した
。

結果を第６図に示す。該図において、横軸は起炎剤投与
後時間（ｈｒ）を、縦軸は浮腫率（％）を示す。図中、
曲線（１）は対照群を、曲線（２）はポリペプチドエの
０．１μｇ投与群を、曲線（３）はポリベプチドエの１
μｇ投与群を、また曲線（４）はポリペプチド■の１０
μｇ投与群をそれぞれ示す。

■　放射線障害防止作用試験 ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（９週齢）に致死量のＸ線を照射
する２０時間前に、ポリペプチド■の１μｇ／マウス又
は０．３μｇ／マウスを腹腔内注射した。

Ｘ線照射装置（ＭＢＲ−１５０５Ｒ，日立メティコ社）
を使用し、８５０レントゲンのＸ線を、上記マウスに全
身照射し、以後、毎日その生存を確認した。尚、コント
ロールとして、ＰＢＳ投与群をおいた。

結果を第７図に示す。図において横軸はＸ線照射後の日
数（日）を、縦軸は供試動物の生存率（％）を示し、曲
線（１）はポリペプチドエの１μｇ投与群を、曲線（２
）はポリペプチド■の０．３μＱ投与群を、また曲線（
３）はコントロール群をそれぞれ示す。

第７図より、コントロール群では、Ｘ線照射後１８日日
に金側死亡したのに対し、ポリペプチド■投与群では、
その投与量に依存して、放射線障害の防止作用が認めら
れ、特に１μｇ投与群では、約８割が放射線障害による
死亡から回避され、生存することが確認された。

■　日和見感染防御効果試験 易感染モデルマウスを用いて、以下の試験を実施した。

（１）ＩＣＲ系雄性マウス（６週齢）を供試動物（１群
７匹）とし、第１８目に、５−フルオロウラシル（５−
Ｆｕ　、協和醗酵社製＞１００ｍＭｋｇを静脈内投与し
た。第２日間、第４８目及び第６日日に、ポリペプチド
エの１μｇ／マウスを皮下投与し、第７８目に、緑膿菌
（ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　Ｅ
　−２＞の所定量を腹腔内投与して感染させた。第１０
日日に供試動物の生存数を計数して、生存率（％）を求
めた。

結果を第８図（１）〜（３）に示す。

第８図（１）は上記実験群の結果を、同（２）はポリペ
プチドエを投与しなかった（５−Ｆ［ｊのみを投与した
）対照群の結果を、また同（３）は５−ＦＬＩ及びポリ
ペプチド■のいずれも投与しなかった対照群の結果をそ
れぞれ示す。

第８図中、縦軸は生存率（％）を、横軸は下記各緑膿菌
投与量を採用した群Ａ−Ｅを各々示す。

Ａ群・・・１９０００菌数／マウス投与群Ｂ群・・・　
３８００菌数／マウス投与群Ｃ群・・・　　７５０菌数
／マウス投与群り群・・・　　１５０菌数／マウス投与
群Ｅ群・・・　　　３０菌数／マウス投与群Ｆ群・・・
　　　　６菌数／マウス投与群■　ＩＬ−１αのＣ８Ｆ
産生促進効果試験Ｃ３Ｆ産生株として、じト肺細胞由来
株ＨＦＬ−１（Ｈｕｍａｎ　　ＥｍｂｒｙＯｎｉＣＬｕ
ｎｇＦｉｂｒＯｂｌａＳｔＳ。

ＡＴＣＣ登録細胞株Ｎｏ、ＣＣＬ−１５３＞を用い、以
下の試験を行なった。

まず、上記ＨＦＬ−１細胞を２Ｘ１０”個／噌の細胞濃
度となるように、１０％ウシ胎児血清加ハムスター１２
に＠養液［Ｈａｍ、　Ｒ，Ｇ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、５３．２８８　（１９
６５）　］に浮遊させた。次いで上記細胞懸濁液中に、
種々の濃度に調製した前記実施例１で得たＩＬ−１αを
加え、炭酸ガス培養器内で３７℃で２４時間、４８時間
及び７２時間各々培養し、各培養上清を集め、之等培養
上清中に産生蓄積されたＣ３Ｆ量を、マウス骨髄細胞を
使用して測定した［Ｌｅｗｓ。

１、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１
２８．１６８（１９Ｂ２）］。

結果を第３表に示す。

第３表 培養　　ＩＬ−１αの濃度（ＧＩＦ単位／鵬）上記各結
果により、ＩＬ−１αの添加によれば、１−ＩＦＬ−’
Ｉ細胞株のＣ３Ｆ産生量は、その無添加に比べて先進さ
れることが明らかでおる。

■　動物細胞からのサイト力インの製造方法様々の濃度
のポリペプチド■及び０．０１％ＰＨＡ−Ｐ存在下に、
ＨＢＳ−２０５Ｂ２細胞［Ｊ。

Ｊｍｍｕｎｏｌ、、１３１，１６８２−１６８９　（１
９８５）］を、２　Ｘ　”ｌ　Ｑ５ｃｅｌｌｓ　／ｖｙ
ｅｌｌにて培養した。

培養２４時間後の上清を採取し、そのＩＬ−２活性を、
スミス（Ｋ、　Ａ、　Ｓｍ１ｔｈ）らの方法に従い、Ｉ
Ｌ−２依存性マウスＴ細胞（ＣＴＬＬ２＞を用いて測定
した［Ｊ、　　■ｍｍｕｎｏ１．，１２０．２０２７（
１９７８）］。

結果を下記第４表に示す。

第４表 ポリペプチドｎ　　　　ＩＬ−２活性（ｃｐｍ　ｘの濃
度（ｎＭｍ１２）　　　１０−３＞平均（ｎ＝５）０　
　　　　　　　　　０、４ ０．０００５　　　　　０．４ ０．００５　　　　　　　　　０．６ ０．０５　　　　　　　　　２．１ ０、　５　　　　　　　　　　　３．　２５　　　　　
　　　　　　　３．５ ５０　　　　　　　　　　　　　　３．９５００　　　
　　　　　　　　　３．８以上に示す結果より、本発明
ポリペプチドを用いることにより、動物細胞からの天然
サイト力イン類の生産が効率よく行い得ることが判る。

また、本発明のボリペチドの、かかる方法への適用に際
しては、極めて微量、通常１０ｎｉｌｌ／１Ｔｌ１２程
度の使用で十分であり、誘導されたサイト力イン類の精
製過程をも容易にする。

■　動物細胞よりサイト力インを生産する場合、産生誘
引に使用する本発明ポリペプチドがその条件下において
構造的に安定であり、細胞表面上のＩＬ−１受容体に結
合することが必須である。すなわち、本発明ポリペプチ
ドがＩＬ−１受容体に結合し、サイトカイン産生に必要
なシグナルを細胞内に伝えｔことが重要である。

そこで、線維芽細胞上のＩＬ−１受容体への結合に関し
て、以下の試験を行なった。

６−ウェルプレート上で、−面にほぼ均一にまで増殖し
たＢａ１ｂ　／３Ｔ３細胞（クローンＡ３１：ＡＴＣＣ
，ＣＣＬ−１６３，１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ　／ｗｅｌｌ
）に、　　■で標識したＩＬ−１β［生化学５８，８号
、ｐ８４０　（１９８６）：ＥＰＯ１８７９９１号］の
５００００ｃｐｍ　／ｗｅｌｌ及び事前に１０％ＦＣ３
加Ｄ−ＭＥＭ中で３７°Ｃ下に２４時間インキュベート
した２０ｎＭｍＧのＩＬ−１β又はポリペプチド■を加
え、４°Ｃで反応させた。

反応液をパスツールピペットで除き、１０％ＦＣ３７１
０Ｄ　−Ｍ　Ｅ　Ｍの１ｍ１２を加えて静かに洗い上清
をすてた。この洗浄操作を２回繰返した後、１１ｍ１ｉ
２の１％ＳＤＳ、０．２Ｎ　　ＮａＯＨで細胞を可溶化
し、可溶化液及びざらにウェルを洗浄した可溶化液中の
放射能（結合放射能）をγ−カウンターにて測定した。

なお、上記１２５■標識ＩＬ−１βは、ポルトンとハン
ター（１３ｏ１ｔｏｎ　　ａｎｄ　ＨＬ！ｎｔｅｒ　＞
の方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、１３３，５２９　（１
９７３）に従い製造、精製した（比活性；２５０μＣｉ
／μｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ以上）。

得られた結果を下記第５表に示す。

第５表 （ｈｒ）　　　　　　　　阻止能（％）ポリペプチドＩ
Ｉ　　　　　　　１００ＩＬ−１β　　　　　　　　　
　　　約　　４なお、表において阻止能（％）は、下式
により求めた。

−Ｃ 結合能力（％）　＝　−Ｘ　１００ −Ｂ 式中Ａは未標識ポリペプチド■が存在しない時の結合し
た放射能、Ｂはプレートに非特異的に吸着した放射能、
Ｃは結合した放射能の実測値かかる指標は、共存させた
ＩＬ−１β又はポリペプチド■のＩＬ−１受容体への結
合力を表わす。

尚、ＩＬ−１β受容体は、ＩＬ−１α及びＩＬ−βに共
通であることが知られている。

上記第５表よりポリペプチド■は、サイト力イン誘導産
生条件下においても、ＩＬ−１受容体への結合力が低下
することなく、かかる適用に際して極めて好ましいこと
が判る。

製剤例１ ＧＩＦ活性として１Ｘ１０７単位／鵬のポリペプチド■
の生理食塩水溶液に、ヒ！・血清アルブミン（Ｈ３Ａ＞
を０．５％とな葛ように添加して、瀘過（０，２２μｍ
メンブランフィルタ−）後、これを無菌的に１　ｍＱず
つバイアル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用製剤を調製
した。

かくして得られた製剤は、これを用時注射用蒸留水１　
ｍＱに溶解して利用される。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐｃＤ−Ｇ　Ｉ　Ｆ−１６及びプラ
スミドｐｃＤ−ＧＦ−２０７のＣＤＮＡの制限酵素地図
を示す。 第２図はプラスミドｐｃＤ−ＧＩ　Ｆ−２０７とプラス
ミドｌ）ＴＭＩとからプラスミドｐｔｒｐＩＬ−１α−
１１３を、構築する概略図を示す。 第３図は抗腫瘍作用試験の結果を示す。 第４図及び第５図はＣ３Ｆ産生促進効果試験の結果を示
す。 第６図は抗炎症試論の結果を示す。 第７図は放射線障害防止作用試験の結果を示す。 第８図は日和見感染防御効果試験の結果を示す。 （以　上） 第４図 ホ゛リベブチド■の；崖　ｌ　　（ｎｇ／ｍｌ）第　５
　図 （Ｈ５Ａ）　　　　　　　ポリペプチド↑￥茸ｉ　（ｐ
ｇ　／マウス） 第６図 第７図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 【アミノ酸配列があります】 で表わされるインターロイキン−１αのアミノ酸配列に
   於て、３６位Ａｓｎ及び１４１位Ｃｙｓの少なくとも１
   つのアミノ酸が欠失されているか又は他のアミノ酸で置
   換されていることにより特徴付けられる改変されたアミ
   ノ酸配列を有するインターロイキン−１α誘導体。