JPH02223597A - インターロイキン―１β誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はインターロイキン−１β（Ｉ　Ｌ−１β）の誘
導体、より詳しくはＩＬ−１βの阻害活性を有し、ＩＬ
−１β拮抗剤乃至抑制剤として有用な新しいＩＬ−１β
誘導体に関する。

従来の技術 第２回国際リンホカインワークショップにおいて、かっ
てリンパ球活性化因子（ＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＡｃｔｉ
ｖａｔｉ、ｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　；　　Ｌ　Ａ　Ｆ　）
　、マイトジェニックプロティン（Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ
　Ｐｒｏｔｅｉｎ　）　、ヘルパーピー）ｙ−１（Ｈｅ
ｌｐｅｒ　ｐｅａｋ　−１）　、Ｔ　ＩＪ　：／ハ球代
替因子［Ｔ−ｃｅｌｌ　ｒｅｐｌａｃｉｎｇ　ｆａｃｔ
ｏｒ　ＩＩＩ（ＴＲＦ−ＩＩＩ）。

Ｔ−ｃｅｌｌ　ｒｅｐｌａｃｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　Ｍ
φ（ＴＲＦＭ）］　、Ｂセ／Ｌ。

アクチベーティング　ファクター（Ｂ−ｃｅｌｌａｃｔ
ｉｖａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　）　、ｆ３リンパ球分
化因子（Ｂ−ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏ
ｎ　ｆａｃｔｏｒ　）等の呼称で報告されてきた生理活
性物質は、いずれもインターロイキン１　（ＩＬ−１）
なる呼称に統一されることが決定された〔Ｃｅ１ｌｕｌ
ａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　４８．４３３−４３６　（
１９７９）　）。この決定は、上記各生理活性物質は物
質として区別できず、生理活性を異なる角度から把えて
表現しているにすぎないとの理由に基づいている。

上記Ｉ　Ｌ　−１は、例えば感染や炎症に対する全身的
な生体反応を誘起、伝達する重要な生体物質として知ら
れており、またそれ自体強い抗腫瘍活性を有するもノテ
ある［：Ｈｉｒａｉ　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、”Ｇａｎｎ
Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ　ｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ”、　ＪｅｆｐａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏ
ｃｉｅｔｉｅｓ　Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｋｙｏ　（１９８Ｂ
）　）が、同時に発熱、白血球数の増加、リンパ球の活
性化、肝臓での急性期蛋白質の生合成誘導等、炎症時の
生体に見られる反応を誘起することが認められている（
Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ　Ｃ，Ａ、＋　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋ
ｉｎ−１；　Ｒｅｖ。

Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　、６．５１−９５　（１９
８４）、　Ｋｌｕｇｅｒ、　Ｍ、Ｊ、。

Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、　Ｊ、　Ｊ、　＆　Ｐｏｗａｎｄ
ａ、　Ｍ、　Ｃ，ＴｈｅＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ、　Ｍ
ｅｔａｂｏｌｉｃ　ａｎｄ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃＡ
ｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　１ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１，Ａ
ｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８５）　）　。

また、ＩＬ−１の生物作用は多様であり、生体の恒常性
維持に重要な生体物質と考えられるが、ＩＬ−１の産生
調節機能に異常が発生し、ＩＬ−１の産生が冗進し、過
剰に生産される状態になった場合、種々の疾患の原因と
なることが考えられる。例えば、慢性関節リウマチでは
、関節滑脱の炎症度、骨破壊度及び滑脱組織のＨＬＡ−
ＤＲ抗原の発現度合の間に強い相関性が認められると報
告されテイル［Ｍｉｙａｓａｋａ、　Ｎ、、　５ａｔｏ
、　Ｋ、、　Ｇｏｔｏ。

Ｍ、、　５ａｓａｎｏ、　Ｍ、、　Ｎａｔｓｕｙａｍａ
、　Ｍ、、　Ｉｎｏｕｅ、　Ｋ、　ａｎｄＮｉｓｈｉｏ
ｋａ、　Ｋ、、　Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ　１ｎｔｅｒｌｅ
ｕｋｉｎ−１ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＨＬＡ−
ＤＲｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅｓｙｎｏｖｉ
ｕｍ　ｏｆ　ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｊｔｉ
ｓ　ｐａｔｉｅｎｔＡｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、
　３１．　（４）、　４８０−４８６　（１９８Ｂ））
。

また、抗腫瘍剤としてＩＬ−１を投与した場合、生体の
ＩＬ−１産生のバランスが崩れ、上記と同様の副作用が
発生される懸念もある。

ところで、ＩＩ、１の生理活性作用は、細胞表面上に存
在するＩＬ−１受容体を介して発現されると考えられて
おり、該ＩＩ、−１受容体レベルで、ＩＬ−１と拮抗す
る物質が発見されれば、過剰に産生されたＩＬ−１と受
容体部位で拮抗して、ＩＬ−１の種々の生理作用をブロ
ックするものと考えられる。

現在、慢性炎症性疾患の治療剤として、グルココルチコ
イドホルモンが用いられているが、その作用の一部はＩ
Ｌ−１の産生抑制にあることが知られテイル（Ｌｅｗ、
　Ｔｒｉ、、　Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、　Ｊ、　Ｊ、　＆
Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ、　Ｋ、、　Ａｎａｌｙｓｉｓ　
ｏｆ　ｔｈｅ　５ｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ。

ｔ”　ＩＬ−１αａｎｄ　ＩＬ−１βｐｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏ
ｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｃ
ｅｌｌｓｂｙ　ａ　ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ　ｈ
ｏｒｍｏｎｅ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４０（６
）、　１８９５−１９０２　（１９８Ｂ）　）が、該グ
ルココルチコイドは、その多様な生理作用より、種々の
危篤な副作用を惹起する不利がある。

従って、当業界では、ＩＬ−１受容体レベルでＩＬ−１
の作用に拮抗し、グルココルチコイドに見られる如き副
作用はなく、他の毒性や副作用の面でも安全性に優れ、
しかも選択性の高い新しい物質が、殊に慢性炎症疾患の
治療分野で望まれている。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記当業界の要望に合致するＩ　Ｌ−
１作用に拮抗し、ＩＬ−１β抑制剤乃至ＩＬ−１β拮抗
阻害剤として有用な新しい物質をを提供することにある
。

本発明の他の目的は、上記物質を含有する医薬及び上記
物質の遺伝子工学的手法による製造技術を提供すること
にある。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、次式（１）で表わされるＩＬ−１β又
はその誘導体のアミノ酸配列において、１４５位Ａｓｐ
及び１４６位Ｐｈｅの少なくとも一方が欠失されるか又
は他のアミノ酸残基で置換されて改変されたアミノ酸配
列を有することを特徴とするＩＬ−１β誘導体が提供さ
れる。

式（１）： ％式％ 〔式中、〈ｘ〉及び〈Ｙ〉は人体を構成するα−アミノ
酸残基を示す。〕 上記及び以下の本明細書におけるアミノ酸及びポリペプ
チドの表示はＩＵＰＡＣ及びＩＵＰＡＣＩＵＢによる命
名法又は規則における略号乃至当該分野で慣用されてい
る略号によるアミノ酸残基の表示法に従うものとし、塩
基配列における核酸の表示も同様とする。

本発明のＩＬ−１β誘導体は、ＬＡＦ活性で代表される
ＩＬ−１βの生物活性を実質的に有さないが、ＩＬ−１
受容体との結合能は有しており、このことから、ＩＬ−
１βと拮抗する作用、即ちＩＬ−１β抑制作用乃至阻害
作用を有する。従って該誘導体は、ＩＬ−１βの過剰産
生に基因する各種の病理状態乃至疾患に対してその治療
及び予防効果を奏し、医薬品として有用である。また本
発明誘導体は低毒性であり、上記医薬品として安全性が
優れており好適である。

上記式（１）で表わされる本発明ＩＬ−１β誘導体にお
いて、８位の〈Ｘ〉及び７１位の〈Ｙ〉は人体蛋白質を
構成するα−アミノ酸の残基であればいずれでもよいが
、特にＡｌａが好ましい。１４５位Ａｓｐ及び１４６位
Ｐｈｅに置換され得る他のアミノ酸残基も人体蛋白質を
構成するα−アミノ酸であればいずれでもよく、その例
としては例えばＬｅｕ　　Ｍｅｔ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ
　　Ｌｙｓ等を例示できる。

本発明誘導体中、特に好ましいものとしては、以下のも
のを例示できる。

ｏ　［Ｌｅｕ　　　　　コ　　ＩＬ−１β天然型ＩＬ−
１β（前記式（１）中８位及び７１位が共にＣｙｓであ
るもの）の１４６位ＰｈｅをＬｅｕに置換した誘導体 ｏ［Ｍｅｔ　　　　　コ　　ＩＬ−１β天然型ＩＬ−１
βの１４６位ＰｈｅをＭｅｔニ置換した誘導体 ｏ［Ｔｙｒ　　　：］ＩＬ−１β 天然型ＩＬ−１βの１４６位ＰｈｅをＴｙｒニ置換した
誘導体 ｏ［Ｌｙｓ　　　　　コ　　ＩＬ−１β天然型ＩＩ、−
１βの１４５位ＡｓｐをＬｙｓに置換した誘導体 ｏ　［Ｄｅｓ−Ａｓｐ　　　］　　Ｉ　Ｌ−１β天然型
ＩＩ、−１βの１４５位Ａｓｐを欠失した誘導体 ８、　　　　７１　　　　１４６ ｏ［Ａｌａ　　Ａｌａ　　　Ｌｅｕ　　　］　　Ｉ　Ｌ
−１βＩＬ−１β誘導体（前記式（１）中〈ｘ〉及び＜
Ｙ〉が共ニＡｌａテあるも（７））の１４６位Ｐｈｅを
Ｌｅｕに置換した誘導体 ８、　　　　７１　　　１４６ ｏ［Ａｌａ　　Ａｌａ　　　Ｍｅｔ　　　］　　Ｉ　Ｌ
−１βＩＬ−１β誘導体（前記式（１）中＜ｘ〉及び〈
Ｙ〉が共ニＡ１ａテあるもの）の１４６位ＰｈｅをＭｅ
ｔに置換した誘導体 本発明誘導体は、例えば遺伝子工学的手法により製造で
きる。即ち、前記式（１）で表わされる特定のポリペプ
チドをコードする遺伝子を利用し、これを微生物のベク
ターに組込んで該微生物細胞内で複製、転写、翻訳させ
ることにより製造できる。この方法は特に大量生産が可
能である点より有利である。

上記方法において用いられる遺伝子は、通常の方法、例
えばホスファイト　トリエステル法〔ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）、　３１０．１０５　（１９８４）　〕等の
常法に従い核酸の化学合成により全合成することもでき
るが、ＩＩＩ、１βもしくはその前駆体をコードする遺
伝子を利用するのが簡便であり、該遺伝子より上記化学
合成手段を含む常法に従い、前記特定のアミノ酸配列を
コードする核酸配列に改変することにより容易に製造で
きる。尚、上記ＩＬ−１β又はその前駆体をコードする
遺伝子は、公知（例えば特開昭６２−１７４０２２号公
報参照）である。また、上記遺伝子の改変操作は、目的
とするポリペプチドのアミノ酸配列に応じて、公知方法
に従い実施され得る（遺伝子工学的手法としては例えば
、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１
９８２）等参照）。例えば、ＤＮＡの切断、結合、リン
酸化等には、各種制限１１゜ 酵素、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ等の酵素を用いた常套手段が採用でき
、それらの酵素は市販品として容易に入手できる。之等
各操作における遺伝子乃至核酸の単離、精製も常法、例
えばアガロース電気泳動法等に従えばよい。得られる遺
伝子の複製は、一部後述するように通常のベクターを利
用する方法に従い得る。所望アミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ断片や合成リンカ−は、上記化学合成により容易
に製造できる。尚、上記において所望のアミノ酸に対応
するコドン自体は公知であり、その選択も任意でよく、
例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮した常法
に従い得る（ＮｕｃｌＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　９．４
３−７４　（１９８１）　Ｅ　。またこれらの核酸配列
のコドンの一部改変操作には、例えば常法通り１５〜３
０マ一程度の所望の改変をコードする合成ヌクレオチド
からなるプライマーを用いたサイト−スペシフィック　
ミュタジエネシス従来公知の一般的な遺伝子組換え技術
に従い製造できる。より詳細には、本発明遺伝子が宿主
細胞中で発現できるような組換えＤＮＡを作成し、これ
を宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養
すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいず
れをも用い得る。該真核生物の細胞には、を推動物、酵
母等の細胞が含まれ、を推動物細胞としては、例えばサ
ルの細胞であるＣＯ８細胞（Ｙ、　Ｇｌｕｚｍａｎ、　
Ｃｅ１ｌ、　２３．１７５−１８２　（１９８１））や
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダ
クターゼ欠損株［Ｇ、　Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄ　Ｌ、　
Ａ。

Ｃｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７７．４２１６−４２
２０　（１９８０）　：］等がよく用いられるが、之等
に限定はされない。を推動物細胞の発現ベクターとして
は、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロ
モーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部
位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これ
は更に必要により複製起源を有していてもよい。該発現
ベクターの具体例としてはＳＶ４０の初期プロモーター
を保有するｐ　３　■２ｄｈｆｒ　［Ｓ、　Ｓｕｂｒａ
ｍａｎｉ、　Ｒ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄＰ、　Ｂｅ
ｒｇ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１　（
９）、　８５４−８６４（１９８１）　）等を例示でき
るがこれに限定されない。

真核微生物としては酵母が一般によく用いられ、その中
でもサツカロミセス属酵母が有利に利用できる。該酵母
等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸性ホ
スファターゼ遺伝子に対するプロモーターを持ツｐ　Ａ
Ｍ　８２　［ＡｏＭｉｙａｎｏｈａｒａｅｔ　ａｌ、、
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｕ
、Ｓ、Ａ、、　８０．１５　（１９８３）　：１等を好
ましく利用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく
用いられ、之等の利用の場合は該宿主菌中で複製可能な
プラスミドベクター中に、本発明遺伝子が発現できるよ
うに該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シャイン
・アンド・ダルガー））塩基配列、更に蛋白合成開始に
必要なＡＴＧを付与した発現プラスミドを用い得る。上
記宿主菌としての大腸菌としてはエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２株等がよく
用いられ、ベクターとしては通常ｐＢＲ３２２がよく用
いられるが、これに限定されず、公知の各種の菌株及び
ベクターをいずれも利用できる。プロモーターとしては
例えばトリプトファン・プロモーターＰＬプロモーター
　１ａｃプロモーター　１ｐｐプロモーター等を使用で
き、いずれの場合も本発明遺伝子を発現させ得る。

トリプトファン・プロモーターを用いる場合につき詳述
すれば、発現ベクターとしてトリプトファン・プロモー
ター及びＳＤ配列を有するベクターｐＴＭ１（今本文男
２代謝、　Ｖｏｌ、２２．２８９（１９８５））を使用
し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ１ａ■部位に
、必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポリペプチドを
コードする遺伝子を連結させればよい。尚、本発明遺伝
子の発現は上記の如き直接発現系に限らず、例えばβ−
ガラクトンダーゼやβ−ラクタマーゼ等を利用して融合
蛋白質発現系とすることもできる。

かくして得られる発現ベクターの宿主細胞への導入及び
これによる形質転換法は、一般的方法、例えば主として
対数増殖期にある細胞を集め、ＣａＣＡ’２処理して自
然にＤＮＡを取り込みゃすい状態にして、ベクターを取
込ませる方法等によることができる。上記方法では、通
常知られているように形質転換の効率を一層向上させる
ためにＭｇＣｌ１２やＲｂＣ１を更に共存させ得る。ま
た宿主細胞をスフェロプラスト又はプロトプラスト化し
てから形質転換させる方法も採用できる。

上記で得られる所望の形質転換株を常法に従い培養する
ことにより、所望のポリペプチドが生産、蓄積される。

該培養に用いられる培地は、通常の細胞培養に慣用され
る各種の培地のいずれでもよい。その具体例としては、
例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地等及び之等に通常知ら
れている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類等
を添加した培地等を例示できる。尚、上記トリプトファ
ン・プロモーターを用いる場合は、一般に該プロモータ
ーが働くためのカザミノ酸を添加した、例えばＭ９最小
培地を用いて培養するのがよく、該培地には培養の適当
な時期にインドールアクリル酸等のトリプトファン・プ
ロモーターの働きを強めるための薬剤を添加することも
できる。

上記培養により得られる培養物からの目的ポリペプチド
、即ち本発明誘導体の精製、単離は常法に従い実施でき
、特に本発明誘導体を宿主から抽出する場合は、例えば
浸透圧ショック法等の温和な条件を採用するのが、その
高次構造保持の面からより好ましい。上記精製、単離は
、例えば当該ポリペプチドの物理、化学的性質を利用し
た各種の処理操作に従い実施できる〔例えば［生化学デ
ーターブックｎＪｐｐＨ７５〜１２５９、第１−版第１
．刷、１９８０年６月２３日、株式会社東京化学同人発
行参照〕。該方法としては、具体的には例えば通常の蛋
白沈澱剤による処理、限外が過、分子篩クロマトグラフ
ィー（ゲルが過）、液体クロマトグラフィー、遠心分離
、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、透析法
、之等の組合せ等を採用できる。上記操作の好ましい一
実施態様は次の通りである。

即ちまず培養上清より目的ポリペプチドを部分精製する
。この部分精製は、例えばアセトン、メタノール、エタ
ノール、プロパツール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ
）等の有機溶媒や酢酸、過塩素酸（ＰＣＡ）、トリクロ
ロ酢酸（Ｔ　ＣＡ）等の酸を蛋白沈澱剤として用いる処
理、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリ
ウム等の塩析剤を用いる処理及び／又は透析膜、平板膜
、中空繊維膜等を用いる限外濾過処理等により行なわれ
る。之等の各処理の操作及び条件は、通常のこの種方法
のそれらと同様のものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、ゲルが過に付すこと
により目的物質の活性が認められる両分を収得する。こ
こで用いられるゲル濾過剤としては特に限定はなく、例
えばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、アガ
ロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロースゲル、セ
ルロース等を素材とするものをいずれも利用できる。之
等の具体例としては、セファデックスＧタイプ、同Ｌ　
Ｈタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ（
以上、ファルマシア社）、セルロファイン（チッソ■）
、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオ−ラド社）
、ウルトロゲル（ＬＫＢ社）、ＴＳＫ−Ｇタイプ（東ソ
ー■）等を例示できる。

目的ポリペプチドは、上記ゲルが過により得られる活性
画分を、例えばハイドロキシアパタイトカラムを用いた
アフィニティークロマトグラフィ、ＤＥＡＥ法、０Ｍ法
、ＳＰ法等のイオン交換カラムクロマトグラフィー、ク
ロマトフオーカシング法、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー等に付すことにより、又は之等各操作の組合せによ
り更に精製でき、均質な物質として単離できる。

かくして本発明誘導体を単離、収得できる。

本発明誘導体は、これを有効成分として各種医薬用途に
有用な医薬製剤とすることができる。該医薬製剤は通常
本発明誘導体と共に適当な医薬製剤担体を配合して製剤
組成物の形態に調製される。

該製剤担体としては使用形態に応じた製剤を調製するの
に通常慣用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩
壊剤、表面活性剤等の賦形剤乃至は希釈剤をいずれも使
用できる。製剤組成物形態は、これが本発明誘導体を効
果的に含有する状態であれば特に限定はなく、例えば錠
剤、粉末剤、顆粒剤、乳剤等の固剤であってもよいが、
通常液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態とするのが好適
である。またこれは使用前に適当な担体の添加によって
液状となし得る乾燥品とすることもできる。之等はいず
れも常法に従い調製できる。

得られる医薬製剤は、その形態に応じた適当な投与経路
、例えば注射剤形態の医薬製剤は静脈内、筋肉内、皮下
、皮内、腹腔的投与等により、固剤形態の医薬製剤は、
経口乃至は経腸投与により投与される。医薬製剤中の有
効成分の量及び該製剤の投与量は、該製剤の投与方法、
投与形態、使用目的、これを適用される患者の症状等に
応じて適宜選択され一定ではないが、通常有効成分を約
１〜８０重量％程度含有する製剤形態に調製して、この
製剤をその有効成分量が１日成人１人当り約０．１μｇ
〜１０ｍｇ程度となる範囲で投与するのが望ましい。該
投与は、１日１回である必要はなく１日３〜４回に分け
ることもできる。

実　　　施　　　例 以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。尚
、以下の例における各種活性は、それぞれ以下の方法に
従い測定した。

（１）ＬＡＦ活性 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系マウス胸腺細胞を利用して、
オッペンハイムらの方法［Ｊ、　Ｊ、　Ｏｐｐｅｎｈｅ
ｉｍ　ｅｔａｌ、、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１１６
．１４６６　（１９７６）コによる。

（２）ＧＩＦ活性 ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５　Ｓ　ｌ　［Ｓ、　Ｎａｋ
ａｉｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、。

見４．１１８９　（１９８Ｂ）　）を用い、特開昭６２
＝１７４０２２号公報記載の方法による。

（３）　　ｐ　Ｇ　Ｅ　２産生活性 ９６ウエルーマイクロプレートにｌＸ１０４個／ウェル
でＡ３７５Ｓ１細胞を加え、１２時間後に種々の濃度に
希釈した試料を加えて培養し、２４時間後に回収した培
養上清中のプロスタグランデインＥ　２　　（Ｐ　Ｇ　
Ｅ　２　）を、ＰＧＥ２［Ｉ］−ＲＩＡキット（ＮＥＮ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ）　ニより測定す
る。

（４）ＩＩ、−１受容体結合活性 １２ウェル−プレートにほぼ均一に増殖させたＢａ１ｂ
／３Ｔ３細胞（約ｌＸ１０６細胞／ウエル）に、種々の
濃度に希釈した試料或は標準品（ｒＩＬ−１β、特開昭
６２ １７４０２２号記載のもの）と　　Ｉ　−Ｔ　Ｌｌ　α
（Ｔ、Ｋａｍｏｇａｓｈｉｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

胆４．７３０　（１９８８）　、５００００〜１１００
０００ｃｐ　）とを添加し、４℃で２時間培養する。上
澄液を除去した後、Ｄ　−Ｐ　Ｂ　Ｓ　（−）液で各ウ
ェルを洗浄し、洗浄液を除去後、各ウェルに１％５ＤＳ
−０，２Ｎ　　ＮａＯＨ１ｚＡ？を加え、細胞を可溶化
し、可溶化液中のカウントをγ−カウンター（アロカ社
製）にて測定する。受容体結合活性阻害率（％）は、　
　　Ｉ−ＩＬ−１αの結合を５０％阻害する標準品ｒＩ
Ｌ−１βの濃度を、同５０％阻害する試料Ｉ　Ｌ−１β
誘導体の濃度で除した値の百分率で表わす。

また、本発明ＩＬ−１β誘導体の酵素イムノアッセイを
、田中らの方法（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｉｍ・Ａｃｔａ、　
１６６、２３７　（１９８７）　）　ニ従い、Ａｆｆｉ
ｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　
ＩＬ−１βＦａｂ　’　−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅを用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により定量した
。

実施例　１ ［Ｌｅｕ　　　］ＩＬ−１βの製造 ■　本発明誘導体発現プラスミドの調製まずＩＬ−１β
のサイトスペシフィックーミュータジェネシス（Ｓｉｔ
ｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）用の
ベクターｆ１．ＩＬ−１βｌｐｐ　Ｔ　　［Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１５０．１１０６−１１
１４　（１９８Ｂ）、　］　ｊ、：１、ルバーファージ
Ｍ１３ＫＯ７，（宝酒造）を感染させることにより、−
本鎖ＤＮＡ　（ＳＳＤＮＡ）を得、これをミュータジェ
ネシスの鋳型とした。

５′−リン酸化合成オリゴヌクレオチド［５′−ＴＡＡ
ＣＴＧＡＣＴＴＧＡＣＣＡＴＧＣ−３’　　］をプライ
マーとし、オリゴヌクレオチドダイレフテッド　インビ
トロ　ミュータジエネシス　システム（Ｏｌｉｇｏｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒ
。

ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ、　Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ　ＵＫ社、コードＲＰＮ、２３２２）を用いて、
サイトスペシフイックーミュータジエネシスを行なった
（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８１．５６６２
１−５６６６（１９８４）参照〕。

エシエ’Ｊ　ヒフ　・：Ｉ　’）　（Ｅ、ｃｏｌｉ）　
ＭＶＩ　１８４（宝酒造）においてトランスフオームさ
れたクローンから５ＳＤＮＡを得、ジデオキシチェイン
ターミネイション法によりＤＮＡシークエンシングを行
ない、目的の遺伝子の変異した組換え体（形質転換体）
　　ｆｌ、ＩＩ、−１β−１４６Ｌ　／　Ｅ、ｃｏｌｉ
　ＭＶ１１８４　ヲ得た。

このプラスミドは、前記式（１）のアミノ酸配列の８位
〈Ｘ〉及び７１位〈Ｙ〉が共にＣｙｓであり且つ１４６
位アミノ酸残基（Ｐｈｅ）がＬｅｕに置換されたアミノ
酸配列を有する本発明ポリペプチド発現プラスミドであ
る。

上記形質転換体は、工業技術院微生物工業技術研究所（
微工研）　ニ［Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＶ　１１８４／　ｆｌ
、ＩＬ−１β−１４６Ｌ　Ｊなる表示で、微工研菌寄第
１０３５３号（ＦＥＲＭＰ−１０３５３）として寄託さ
れている。

■　形質転換体の培養 上記■テ得り形質転換体（ＭＶ１１８４　／　ｆｌ、Ｉ
Ｌ−１β−１４６Ｌ　）をアンピシリン１００μｇ　／
　ｙｔｌｌを含む下記組成のＬＢ培地１０１１に接種し
、３７℃で一晩振盪培養して前培養液を得た。

（ＬＢ培地組成〉 バクト・トリプトン（デイフコ社）　　Ｌｏｇ／Ａ’バ
クト・イースト抽出物（同上社）　　　５ｇ／Ａ’Ｎａ
ＣＡ’　（和光純薬社）　　　　　　　　１０ｇ／／上
記前培養液１０１１を、下記組成の生産培地（Ｍ９ＣＡ
培地）５０Ｃ）ｒＡ’に接種し、３７℃で１４時間振盪
培養した。

＜Ｍ９ＣＡ９ＣＡ培地 Ｎａ２　ＨＰＯ４・１２Ｈ２０６ｇ／／ＫＨ２ＰＯ４３
ｇ／Ａ’ ＮａＣ／　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ／Ａ’Ｎ
Ｈ４ＣＡ’　　　　　　　　　　　　　１　　ｇ／Ａ’
バクトーカザミノ酸　　　　　　　　Ｌｏｇ／Ａ’Ｌ−
システィン−ＨＣ１７５■／ｌ Ｌ−プロリン　　　　　　　　　　　　７５■／ｌＬ−
ロイシン　　　　　　　　　　　７５■／ｌｐＨを７．
４に調整後、１２１°Ｃで３０分間オートクレーブ処理
し、次いで下記組成の別滅菌液を接種時に無菌的に培地
に添加する。

〈別滅菌液組成〉 Ｉ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・４４Ｈ２Ｏ１ＣａＣｌ２
・２Ｈ２０ ７，５■／ｌチアミン・ＨＣｌ ４０％　グルコース ２　　ｉｌｌ／ＩＩ Ｏ，１ｘＡ’／ｌ１ １１１／ｌ ’Ｊ−８．７５ｘｌ！／ＩＩ 上記培養液の菌体内における所望ポリペプチドの生産状
態を以下の通り調べた。

即ち、まず培養液１　ｘｌｌより遠心分離により菌体を
集め、この菌体につき１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥをレムリ
の方法［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ
、　２２７゜６８０　（１９７０）］に従い実施し、ま
たＩＬ−１βモノクロ一ナル抗体を用いたタウリンらの
ウェスタンブロッティング法［Ｈ，Ｔｏｗｒｉｎ、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７６、４３５
０　（１９７９））　ニヨリ、１７．５ｋｄの位置に所
望ポリペプチドを確認した。

また別に、上記培養液１　ｙｔｌｌより遠心分離により
菌体を集め、これを２５％シュークロース−５０ｍＭ）
リス塩酸（ｐ　Ｈ８，０）溶液４５０１１１に懸濁させ
、１０ｍｇ／ｚ／リゾチーム（シグマ社製）［２５ｍＭ
トリス塩酸（ｐ　Ｈ８，０）で溶解した溶液］１５０μ
ｌを加え、４℃で１０分間放置した。次いで０．２５ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）５０μｌを加え、更に
０．３％トリトンＸ１００５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８
，０）　−２５ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）の溶液４
５０μｌを加え、室温で１０分間放置後、更によく懸濁
させ、遠心分離により菌体から所望のポリペプチドを含
む上清を得た。

得られた上清につき、前記諸活性を調べた。結果を以下
に示す。

（１）　Ｌ　Ａ　Ｆ活性：なし く２）ＧＩＦ活性：ｌ、２Ｘ１０３単位／　ｙｔｌｌ（
５１，１βｇ／ｙｔｌｌ） 比活性−２，３Ｘ１０４単位／■ （Ｉ　Ｌ−１βに対して０．０５８％）（３）　ｐ　Ｇ
Ｅ　２産生活性：なし く４）　Ｉ　Ｌ　−１受容体結合活性：ＩＬ−１−βに
対して５８．７％ また、上記上清につき、以下のＩＬ−１β抑制作用試験
を行なった。

（５）　Ｉ　Ｌ−１β抑制作用： １０′２倍又は１０″３倍希釈した菌体抽出上清を、Ｌ
ＡＦ活性及びＰＧＥ２産生活性の測定系に、所定量のＩ
Ｌ−１βと同時に添加し、各測定を同様にして行なった
。

ＬＡＦ活性につき得られた結果を第１表に、またＰ　Ｇ
　Ｅ　２産生活性の測定結果を第２表にそれぞれ示す。

第　　　１　　　表 第　　　２　　　表 以上の結果、本発明の［Ｌｅｕ　　　］ＩＬ−１βはＩ
　Ｌ−１受容体には結合するが、生物活性は実質的に示
さず、従ってＩＬ−１βの拮抗剤として有用であること
が判った。

■　本発明誘導体の精製 上記■で培養した培養液５１から集菌した菌体を、ＬＭ
　　Ｎａ２ＨＰＯ４６０ｙｔｌｌに懸濁させ、夜４℃に
放置した後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）
に対して２日間透析した。

得られた透析液を遠心分離（１００００ｒｐｍ２０分間
）し、上清と沈澱物とに分け、上清を２．０Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５，２５）にてｐＨ調製後、−夜４℃に放置し
、生じた沈澱を遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間
）ニテ除いた後、以下の条件でイオン交換高速液体クロ
マトグラフィーにより精製した。

カラム＋ＴＳＫゲル５Ｐ−５ＰＷ　（２１，５ｍｍＩ　
Ｄ　Ｘ　１５０　ｍｉｎ、　　Ｆ−ソー社製）溶離液Ａ
：５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）溶離液Ｂ：１．０
Ｍ　　ＮａＣＡ’を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，
５） 流速：３ＺＡ’／分 フラクション容積：６ｙｔｌｌ／チユ一ブ／２分濃度勾
配二　　　時間（分）　　　％Ｂ上記５Ｐ−ＨＰＬＣに
おいて、活性画分はＩＬ１βに対するモノクローナル抗
体を用いたウェスタンブロッティングにより確認した。

その結果、［Ｌｅｕ　　　］ＩＬ−１βはフラクション
Ｎ０９２８〜３０に検出され、このフラクションを集め
た。

次いで上記フラクションを限外が過にて濃縮し、更に４
０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）にて交換した後、
硫安を加えて４０％硫安溶液とし、これを以下の条件に
てＴＳＫゲルフェニル−５ＰＷ疎水性高速液体クロマト
グラフィーにかけた。

カラム：　ＴＳＫゲルフェニル−５ＰＷ　（７，５ｍｍ
ＩＤＸ７５ｍｍ、トーソー社製） 溶離液Ａ：４０％硫安を含む４０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ
　Ｈ８，０） 溶離液Ｂ　：　４０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）流
速：ｌ、ｘｌｌ１分 フラクション容積：ＩＪＡ’／チューブ／分濃度勾配二
　　　時間（分）　　　％Ｂ上記の結果、［Ｌｅｕ　　
　］　　Ｉ　Ｌ７１βはフラクションＮＯ，２４〜２５
に溶出された。また、これは５ＤＳ−ＰＡＧＥにより高
純度に精製されていることが確認された。

この精製試料につき、前記諸活性を調べた。結果を以下
に示す。

（１）　Ｌ　Ａ　Ｆ活性：なし く２）ＧＩＦ活性： 比活性−１，８６Ｘ１０４単位／■ （Ｉ　Ｌ−１βに対して０．０４７％）（３）　ｐ　ａ
　Ｅ　２産生活性：なしく４）　Ｉ　Ｌ　−１受容体結
合活性：ＩＬ−１βに対して４１％ 以上の結果、本発明の［Ｌｅｕ　　　］ＩＬ−１βはＩ
Ｌ−１受容体には結合するが、生物活性は実質的に示さ
ず、従ってＴＬ−１βの拮抗剤として有用であることが
判った。

実施例　２ ［Ｍｅｔ１４６］　　Ｉ　Ｌ　−１βの製造■　本発明
誘導体発現用プラスミドの調製実施例］−と同様にして
、発現ベクターｆ１・ＩＬ−１βｌｐｐ　Ｔに、ヘルパ
ーファージＭ１３ＫＯ７を感染させて、ＳＳＤ　Ｎ　Ａ
を得、これをミュータジエネシスの鋳型とし、５′−リ
ン酸化合成オリゴヌクレオチド［５’−ＡＣＴＧＡＣＡ
ＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’　）をプライマーとし、オリゴ
ヌクレオチドーダイレクテッドインビトロミュータジエ
ネシスを用いて、サイトスペシフイックーミュータンエ
ネシスを行なった。エシェリヒア・コリ（Ｅ・ｃｏｌｉ
）　Ｔ　Ｇ　１　（宝酒造）においてトランスフオーム
されたクローンから５ＳＤＮＡを得、ジデオキシチェイ
ンターミネイション法によりＤＮＡシークエンシングを
行ない、目的の遺伝子の変異した組換え体（形質転換体
）　　ｆｌ、ＩＬ−１β−１４６Ｍ　／　Ｅ、ｃｏｌｉ
ＴＧＩを得た。

このプラスミドは前記式（１）のアミノ酸配列の８位＜
Ｘ〉及び７１位＜Ｙ〉が共にＣｙｓであり且つ１４６位
アミノ酸残基（Ｐｈｅ）力（Ｍｅｔに置換されたアミノ
酸配列を有する本発明ポリペプチド発現プラスミドであ
る。

上記形質転換体は、微工研に［Ｅ、ｃｏｌｉ　ＴＧＩ／
ｆｌエト１β−１４６Ｍ　Ｊなる表示で、微工研菌寄第
１０３５４号（Ｆ　ＥＲＭＰ−１０３５４）として寄託
されている。

■　形質転換体の培養 上記■で得た形質転換体を、実施例１と同様の条件で培
養して本発明誘導体の発現を行ない、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
及びウェスタンブロッティングで所望のバンドを確認し
た。また菌体粗抽出液の活性を調べた結果は次の通りで
あった。

（１）　Ｌ　Ａ　Ｆ活性：なし く２）ＧＩＦ活性：５．３５Ｘ１０２単位／　ｚｌｌ（
１２，６μｇ／ｙｔ！り 比活性−５Ｘ１０４単位／■ （ＩＬ−１βに対して０．１２５％） （３）ＰＧＥ２産生活性：なし く４）　Ｉ　Ｌ　−１受容体結合活性：ＩＬ−１βに対
して２２．５％ 以上の結果、本発明の［Ｍｅｔ　　　］ＩＬ−１βはＩ
Ｉ、−１受容体には結合するが、生物活性は実質的に示
さず、従って■Ｌ−１βの拮抗剤として有用であること
が判った。

実施例　３ ［Ｔｙｒ　　　］ＴＬ−１βの製造 ■　本発明誘導体発現用プラスミドの調製実施例１と同
様にして、発現ベクターｆ１．ＩＬ−１βｌｐｐ　Ｔに
、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を感染させて、５ＳＤ
ＮＡを得、これをミュータジェネシスの鋳型とし、５′
−リン酸化合成オリゴヌクレオチド（５’　−ＴＡＡＣ
ＴＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＣ−３’　：ｌをプライマ
ーとし、オリゴヌクレオチドーダイレクテッドインビト
ロミュータジェネシスを用いて、サイトスペシフィック
ーミュータジェネシスを行なった。エシェリヒア・コリ
（Ｅ、ｃｏｌｉ）　”ｌ’　Ｇ　ｌにおいてトランスフ
オームされたクローンから５ＳＤＮＡを得、ジデオキシ
チェインターミネイション法によりＤＮＡシークエンシ
ングを行ない、目的の遺伝子の変異した組換え体（形質
転換体）　　ｆｌ、ＩＬ−１β−１４６Ｙ　／　Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　ＴＧＩを得た。

このプラスミドは前記式（１）のアミノ酸配列の８位＜
７．＞及び７１位〈Ｙ〉が共にＣｙｓであり且つ］−４
６位アミノ酸残基（Ｐｈｅ　）がＴｙｒに置換されたア
ミノ酸配列を有する本発明ポリペプチド発現プラスミド
である。

上記形質転換体は、微工研に［Ｅ、ｃｏｌｉ　ＴＧＩ　
／　ｆ］ＩＬ−１β−１４６Ｙ　Ｊなる表示で、微工研
菌寄第１０３５６号（ＦＥＲＭＰ−１，０３５６）とし
て寄託されている。

■　形質転換体の培養 上記■で得た形質転換体を、実施例１と同様の条件で培
養して本発明誘導体の発現を行ない、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
及びウェスタンブロッティングで所望のバンドを確認し
た。また菌体粗抽出液の活性を調べた結果は次の通りで
あった。

（１）　Ｌ　Ａ　Ｆ活性：なし く２）ＧＩＦ活性：６，５Ｘ１０３単位／　ｙｔｌｌ（
２７，１βｇ／ｘｉり 比活性−２，４Ｘ１０５単位／■ （Ｉ　Ｌ−１βに対して０．６％） （３）　ｐ　ＧＥ　２産生活性：なし く４）　Ｉ　Ｌ　−１受容体結合活性：ＩＩ、−１βに
対して３０．２％ 以上の結果、本発明の［Ｔｙｒ　　　］ＩＬ−１βはＴ
　Ｉ、−１受容体には結合するが、生物活性は実質的に
示さず、従ってＩＬ−１βの拮抗剤として有用であるこ
とが判った。

実施例　４ ８、　　　　７１　　　　　１４６ ［Ａｌａ　　Ａｌａ　　、Ｌｅｕ　　　］　　ＩＬ−１
βの製造■　分泌ベクターｆ１・Ｏｍｐ　ＡＡＭＳの構
築ｆ１ファージのインタージェニック領域を有するプラ
スミドｆｌ　、　ＩＬ−１βｌｐｐ　Ｔ　　［Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１５
０．１１０６−１１１４　（１９８Ｂ）］を、制限酵素
ＥＣ０ＲＩ（宝酒造社）で切断後、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉクレノーフラグメント（ベーリンガーマンハイム社）
を用いてセルフライゲーション（クレノー処理）を行な
い、ＥＣＯＲ■制限サイトを削除した。次にこのプラス
ミドを制限酵素Ｃ１ａ■（宝酒造社）で切断後、クレノ
ー処理し、更に制限酵素５ａｌｌ（宝酒造社）で切断し
て４．７ｋｂフラグメントを得た。

別個に、ブー７スミドｐ　ＩＮＩＩＩＯｍｐ　Ａ３　（
Ｇｈｒａｙｅｂｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯ，Ｊ、、　３
．２４３７　（１９８４））を、制限酵素Ｘｂａ工（宝
酒造社）で切断し、クレノー処理後、更に制限酵素Ｓａ
１■で切断して、ｌｋｂフラグメントを得た。

上記で得た両フラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造社）を用いてライゲーションして、Ｏｍｐ　Ａシグ
ナルペプチドを含む５．７ｋｂの融合ベクターを調製し
た。

プライマーとして５’　−ＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡ
ＣＧＴＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡ−３’（２８ｍｅｒ）
を用いて、サイトスペシフィックミュータジェネシス（
削除）により、上記融合ベクターから余分な領域を削る
と共にその有するｔｒｐプロモーターの下流にＸｂａ制
限サイトを設けた、ｆｌ・Ｏｍｐ　Ａ分泌ベクターを構
築した。このベクターは、リポプロティン（ｌｐｐ　）
のＳＤ配列に続いてシグナルペプチドの配列を有し、そ
の後にＥＣ０ＲＩ、）（ｉｎｄ■、ＢａｍＨＩのクロー
ニングサイトを有している。

上記ベクターを、更に制限酵素ＭＩＬＩＩ（宝酒造社）
及びＳａｌ■を用いて切断し、クレノー処理し、セルフ
ライゲーションを行なって、該ベクターより約７００ｂ
ｐのＭ１ｕ■−８ａｌ■フラグメントを除いたｆｌ、Ｏ
ｍｐＡΔＭＳ分泌ベクター（５，０ｋｂ）を最終的に得
た。

■　ｆｌ　、　Ｏｍｐ　Ａ融合ＩＬ−１βの構築プラス
ミドｐ　ＩＬ−１βのｃＤ　Ｎ　Ａ　［Ｔ、　Ｎ１５ｈ
ｉｄａｅｔ　ａｌ、、　Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，、１４３，３
４５（１９８７）　）を、制限酵素Ｈｇ１ＡＩ及びＡＣ
ＣＩで切断した後、マングビーンＳ１ヌクレアーゼ（Ｍ
ｕｎｇ　ｂｅａｎ　Ｓｌ　ｎｕｃｌｅａｓｅ　。

全酒造社製）で処理して、５８１ｂｐのフラグメントを
得た。

一方、Ｍ１３ｍｐｌＯファージベクター〔アマジャム社
製〕を制限酵素３　ｍａ　Ｉを用いて切断し、この切断
サイトに上記フラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
てクローニングして、Ｍ１３ｍｐｌＯＩＬ−１βを得た
。

このものを、次に制限酵素ＥＣ０ＲＩ及びＢａｍ）（Ｉ
で切断して、５９２ｂｐのＩＬ−１βをコードする遺伝
子を含むフラグメントを得た。

該フラグメントを同様にして、上記■で得たｆｌ、Ｏｍ
ｐＡΔＭＳ分泌ベクターのＥＣＯＲＩ　−ＢａｍＨＩ制
限サイトにクローニングして、約５．５ｋｂのｆｌ・Ｏ
ｍｐ　Ａ融合ＩＬ−１βを作成した。

■　ｆｌ　、　Ｏｍｐ　Ａ　ｈＩＬ−１β分泌ベクター
の構築上記■で得たベクターの一本鎖ＤＮＡをテンプレ
ートとし、その融合Ｎ末端の２１ｂｐを合成プライマー
［５’　−ＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡ
ＣＣＴＧＴＡＣＧＡＴＣＡＣＴ−３’３４ｍｅｒ）を用
いて、サイトスペシフィックミュ−タジェネシスにより
削除して、Ｏｍｐ　Ａシグナルペプチドの直後に成熟Ｉ
Ｌ−１βのＮ末端配列を持つｆｌ　、　Ｏｍｐ　Ａ−ｈ
ｌＬ−１β（５，６ｋｂ）を得た。

このものをエシェリヒア・コリＭＶ１１８４にトランス
フオームして、Ｉ　Ｌ−１β組換え形質転換体［ｆｌ　
、　Ｏｍｐ　Ａ　ｈＩＬ−１β／エシエリヒア、コリＭ
Ｖ１１８４］を得た。

■　分泌ベクターｆｌ　、　Ｏｍｐ　Ａ　ｈ　ＩＬ−１
β−８Ａ−７１Ａ１４６Ｌの構築 上記■で得た分泌ベクターｆ１・Ｏｍｐ　Ａ　ｈＩＬ−
１βのＳＳＤ　Ｎ　Ａを鋳型とし、合成オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして、実施例１と同様にサイトスペ
シフィックーミュータジェネシスを行ない、目的の遺伝
子の変異した組換え体（形質転換体）を得た。

このプラスミドは前記式（１）のアミノ酸配列の８位＜
ｘ〉及び７１位＜Ｙ〉が共にＡｌａであり且つ１４６位
アミノ酸残基（Ｐｈｅ）がＬｅｕに置換されたアミノ酸
配列を有する本発明ポリペプチド発現プラスミドである
。

■　形質転換体の培養 上記■で得た形質転換体を、実施例１と同様の条件で培
養して本発明誘導体の発現を行ない、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
及びウェスタンブロッティングで所望のバンドを確認し
た。また菌体粗抽出液の活性を調べた結果は次の通りで
あった。

（１）　Ｌ　Ａ　Ｆ活性：なし く２）ＧＩＦ活性：３，４６Ｘ１０２単位／　ｙｔｌｌ
（６，８μｇ／ｚｌ） 比活性−５，ｌＸｌＯ４単位／■ （ＩＬ−１βに対して０．１３％） （３）　Ｐ　Ｇ　Ｅ　２産生活性：なしく４）　Ｉ　Ｌ
　−１受容体結合活性：Ｉ　Ｉ、−１βに対して５１．
２％ ８、　　　　７１　　　　　１４６ 以上の結果、本発明（７）［Ａｌａ　　Ａｌａ　　＋Ｌ
ｅｕ　　　］ＩＬ−１βはＩＬ−１受容体には結合する
が、生物活性は実質的に示さず、従ってＩＩ、−１βの
拮抗剤として有用であることが判った。

実施例　５ ８、　　　　７１　　　　　１４６ ［Ａｌａ　　Ａｌａ　　−Ｍｅｔ　　　］　　ＩＬ−１
βの製造■　本発明誘導体発現用プラスミドの調製実施
例４と同様にして、分泌ベクターｆ　１　、０ｍｐＡ　
ｈＩＬ−１βのＳＳＤ　Ｎ　Ａから、目的の遺伝子の変
位した組換え体（形質転換体）を得た。

このプラスミドは前記式（１）のアミノ酸配列の８位〈
Ｘ〉及び７１位＜Ｙ〉が共にＡｌａであり且つ１４６位
アミノ酸残基（Ｐｈｅ）力＜Ｍｅｔに置換されたアミノ
酸配列を有する本発明ポリペプチド発現プラスミドであ
る。

上記形質転換体ハ、微工研ニ［Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＶ１１
８４／　ｆｌ、ｏｍｐ　Ａ　ｈｌＬ−１β−８Ａ−７１
Ａ−１４６ＭＪなる表示で、微工研菌寄第１０３５５号
（ＦＥＲＭＰ−１０３５５）として寄託されている。

■　形質転換体の培養 上記■で得た形質転換体を、実施例１と同様の条件で培
養して本発明誘導体の発現を行ない、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
及びウェスタンブロッティングで所望のバンドを確認し
た。また菌体粗抽出液の活性を調べた結果は次の通りで
あった。

（１）　Ｌ　Ａ　Ｆ活性：なし く２）ＧＩＦ活性：６．８９Ｘ１０２単位／ｙｔｌｌ（
１０μｇ／ｙｔｌｌ） 比活性＝６．８９Ｘ１０４単位／■ （Ｉ　Ｌ−１βに対して０．１７％） （３）　Ｐ　Ｇ　Ｅ　２産生活性：なしく４）　Ｉ　Ｌ
−１受容体結合活性： ＩＬ−１βに対して１７．０％ ８、　　　　７１　　　　　　１４６ 以上の結果、本発明（ｙ）［Ａｌａ　　Ａ’ｌａ　　０
Ｍｅｔ　　　］ＩＬ−１βはＩＬ−１受容体には結合す
るが、生物活性は実質的に示さず、従ってＩＩ、−１β
の拮抗剤として有用であることが判った。

実施例　６ ［Ｌｙｓ　　　］ＩＬ−１βの製造 ■　本発明誘導体発現用プラスミドの調製実施例１と同
様にして、発現ベクターｆ１・ＩＬ−１βｌｐｐ　Ｔに
、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を感染させて５ＳＤＮ
Ａを得、これをミュータジェネシスの鋳型とし、５′−
リン酸化合成オリゴヌクレオチド（５’　−ＧＡＴＡＴ
ＡＡＣＴＡＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧ−３’　）をプライ
マーとし、オリゴヌクレオチドーダイレクテッドインビ
トロミュータジェネシスを用いて、サイトスペシフィッ
クーミュータジェネシスを行なった。エシェリヒア・コ
リ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｔ　Ｇ　１においてトランスフオ
ームされたクローンから５ＳＤＮＡを得、ジデオキシチ
ェインターミネイション法によりＤＮＡシークエンシン
グを行ない、目的の遺伝子の変異した組換え体（形質転
換体）　　ｆｌ、ＩＬ−１β−１４５Ｋ　／　Ｅ、ｃｏ
ｌｉＴＧＩを得た。

このプラスミドは前記式（１）のアミノ酸配列の８位〈
Ｘ〉及び７１位〈Ｙ〉が共にＣｙｓであり且つ１４５位
アミノ酸残基（Ａｓｐ）がＬｙｓに置換されたアミノ酸
配列を有する本発明ポリペプチド発現プラスミドである
。

■　形質転換体の培養 上記■で得た形質転換体を、実施例１と同様の条件で培
養して本発明誘導体の発現を行ない、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
及びウェスタンブロッティングで所望のバンドを確認し
た。また菌体粗抽出液の活性を調べた結果は次の通りで
あった。

（１）　Ｌ　Ａ　Ｆ活性：なし く２）ＧＩＦ活性：１．０７Ｘ１０４単位／　７Ａ’（
１５，３μｇ　／ｙｔｌｌ　） 比活性−７，０Ｘ１０５単位／■ （Ｉ　Ｌ−１βに対して１．８％） （３）　Ｐ　Ｇ　Ｅ　２産生活性：なしく４）　Ｉ　Ｌ
　−１受容体結合活性：ＩＬ−１βに対して２９％ 以上の結果、本発明の［Ｌｙｓ　　　］ＩＬ−１βはＩ
　Ｌ−１受容体には結合するが、生物活性は実質的に示
さず、従ってＩＬ−１βの拮抗剤として有用であること
が判った。

実施例　７ ［Ｄｅｓ−Ａｓｐ　　　］　　Ｉ　Ｌ−１βの製造■　
本発明誘導体発現用プラスミドの調製実施例１と同様に
して、発現ベクターｆ１．Ｉト１βｌｐｐ　Ｔに、ヘル
パーファージＭ１３ＫＯ７を感染させて５ＳＤＮＡを得
、これをミュータジェネシスの鋳型とし、５′−リン酸
化合成オリゴヌクレオチド［５’　−ＡＧＧＡＴＡＴＡ
ＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣ−３’　Ｅをプライマーと
し、オリゴヌクレオチドーダイレクテッドインビトロミ
ュータジェネシスを用いて、サイトスペシフィックーミ
ュータジェネシスを行なった。エシェリヒア・コリ（Ｅ
、ｃｏｌｉ）　Ｔ　Ｇ　１においてトランスフオームさ
れたクローンから５ＳＤＮＡを得、ジデオキシチェイン
ターミネイション法によりＤＮＡシークエンシングを行
ない、目的の遺伝子の変異した組換え体（形質転換体）
　　ｆｌ、ＩＬ−１β−ｄｅｓ−１４５Ｄ／　Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＴＧＩを得た。

このプラスミドは前記式（１）のアミノ酸配列の８位〈
Ｘ〉及び７１位〈Ｙ〉が共にＣｙｓであり且つ１４５位
アミノ酸残基（Ａｓｐ）が欠失したアミノ酸配列を有す
る本発明ポリペプチド発現プラスミドである。

■　形質転換体の培養 上記■で得た形質転換体を、実施例１と同様の条件で培
養して本発明誘導体の発現を行ない、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
及びウェスタンブロッティングで所望のバンドを確認し
た。また菌体粗抽出液の活性を調べた結果は次の通りで
あった。

（１，）　Ｌ　Ａ　Ｆ活性：なし く２）ＧＩＦ活性：ｌ、５３Ｘ１０３単位／１１（７，
８μｇ／〃） 比活性＝１．９６Ｘ１０５単位／■ （Ｉ　Ｌ−１βに対して０．５％） （３）　Ｐ　Ｇ　Ｅ　２産生活性：なしく４）　Ｉ　Ｌ
−１受容体結合活性： ＩＬ−１βに対して３２％ 以上の結果、本発明の［Ｄｅｓ−Ａｓｐ　　　］　　Ｉ
　Ｌ−１βはＩＬ−１受容体には結合するが、生物活性
は実質的に示さず、従ってＩＬ−１βの拮抗剤として有
用であることが判った。

製剤例　１ 実施例１で得た本発明誘導体の生理活性食塩水に、ヒト
血清アルブミン（Ｈ８Ａ）を０．　５％となるように添
加して、濾過（０，２２μｍメンブランフィルタ−）後
、これを無菌的に１　ｘｌｌずつバイアル瓶に分注して
凍結乾燥し、注射用製剤を調製した。

かくして得られた製剤は、これを用時注射用蒸留水１７
１に溶解して利用される。

（以 上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 【遺伝子配列があります】 〔式中、〈Ｘ〉及び〈Ｙ〉は人体を構成するα−アミノ
   酸残基を示す。〕 で表わされるインターロイキン−１β又はその誘導体の
   アミノ酸配列において、１４５位＾Ａ＾ｓ＾ｐ及び１４
   ６位＾Ｐ＾ｈ＾ｅの少なくとも一方が欠失されるか又は
   他のアミノ酸残基で置換されて改変されたアミノ酸配列
   を有することを特徴とするインターロイキン−１β誘導
   体。