JPH02138224A - 血小板減少症治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は血小板減少症治療剤に関する。

従来の技術 近年、ガンの治療技術は長足の進歩を示し、従来の外科
的手術に加えて、化学療法、放射線療法、免疫療法等の
進歩には著しいものがあるが、特に化学療法、放射線療
法はそれらの有効性に相俟って強い副作用を伴いがちで
ある。

即ち、化学療法剤に用いられる化学療法剤は、制ガン作
用を有するが正常組織等への悪影響はないか極少ないも
のであるのが理想的であるが、現在知られている化学療
法剤はいずれも強い骨髄抑制を惹起し、白血球や血小板
の減少を伴い、長期に亘る連続投与は不可能であり、こ
の副作用のために治療の中断を余儀なくされる弊害があ
る。また、放射線療法のためのＸ線やγ線の照射も、上
記化学療法剤と同様に骨髄等の造血組織に対する副作用
、殊に白血球や血小板等の減少が著しく、同様に治療の
中断が必要となる。

上記の如き癌化学療法や放射線療法の継続制限因子の一
つとなる血小板等の減少に対する対策としては、血小板
輸血（ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　）や骨髄移植（ｂｏｎ
ｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）
が知られティる。

しかし、上記輸血では血小板、白血球の寿命が短く、頻
繁に新鮮な血球を移入せねばならない不利がある。上記
骨髄移植とは、骨髄中の造血前駆細胞にある特定の造血
因子が働くことにより白血球、赤血球、血小板等の血球
細胞の産生が調節されることを利用して、骨髄細胞を体
外より補充して血球細胞の回復や減少を軽減させる方法
であり、これはある種の腫瘍の治療に画期的成果をもた
らし、根治的治療法の一つとして確立された。しかし、
この骨髄移植を行なう場合、患者に適合する骨髄の提供
者を見つけること自体が非常に困難で、うまく骨髄が入
手できてもその移植にも困難が伴われ、しかも移植され
た骨髄が生着し、造血を開始して白血球や血小板等を末
梢血中に産生ずるには通常数週間の時間がかかり、その
間患者は極めて厳しい生死の境界状態に置かれる不利が
ある。

以上の通り、ガンの化学療法や放射線療法時等に見られ
る血小板減少等の症状を改善するために行われる輸血、
骨髄移植には、各種の欠点があり、これらの問題を克服
するためには、患者自身の造血機能を高める必要があり
、造血促進作用を有する薬剤の研究開発が当業界で切望
されている現状にあるが、現在特に血小板産生を促進さ
せ得る薬剤は全（知られていない。

発明が解決しようとする問題点 上記現状に鑑み、本発明者らも斯界の要望に合致する血
小板減少等の症状改善のための薬剤の提供を目的として
鋭意研究を重ねてきた。その過程で、従来よりリンパ球
を活性化し、インターロイキン−２（ＩＬ−２）等の産
生や抗体の産生等を亢進させる作用を始めとして多様な
生物活性を示すことが明らかにされ、之等の生物活性よ
り医薬品としての応用研究が種々行なわれつつあるイン
ターロイキン−１（ＩＬ−１）及びその誘導体、並びに
本願人らが新たに開発したＩＬ−１の誘導体が、実に驚
くべきことに血小板の減少を顕著に抑制する作用（血小
板増加作用）を有し、上記目的に合致する血小板減少症
治療剤として非常に有効であることを見出し、本発明を
完成した。

問題点を解決するための手段 即ち、本発明はＩＬ−１及びその誘導体から選ばれる少
なくとも１種を有効成分として含有する血小板減少症治
療剤に係わる。

本発明の血小板減少症治療剤は、上記の通り、ＩＬ−１
及びその誘導体を有効成分とすることを必須の要件とし
、これに基づいて、顕著な血小板増加作用を発揮し、か
くして血小板減少症の治療に非常に有効である。

本発明治療剤の有効成分とするＩ　Ｌ−１には、Ｌ　Ａ
　Ｆ　（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ
　Ｆａｃｔｏｒ）活性を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子の塩基配列から同定された１５９個のアミノ酸
配列を有するＩＬ−１α及び１５３個のアミノ配列を有
するＩＬ−１β［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　８１゜７９０７−７９１１　
（１９８４）　−Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、３１５．６
４１（１９８５）　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、１３．　（１６）５８６９　
（１９８５）等参照〕の両者が含まれる。之等はその産
生細胞から通常の方法により抽出、単離される天然型で
あってもよく、また遺伝子工学的手法により得られる組
換え型であってもよい。

また上記ＩＬ−１の誘導体には、各種のものが含まれ、
その代表例としては本願人らの先の出願に係わる各種の
アミノ酸配列を有するｒＬ−１α誘導体及びＩＬ−１β
誘導体が包含される〔特願昭６０−２８４６９９号（ヨ
ーロッパ特許公開１８７９９１号）、特願昭６２−５２
７８１号（ヨーロッパ特許公開第２３７９６７号）及び
特願昭６２−５７５６８号（ヨーロッパ特許公開第２３
７０７３号）等参照〕。

上記ＩＬ−１α誘導体は、以下のものである。

式（Ａ）： Ｓｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｂｅ−Ｌ
ｅｕ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓ
ｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｉ　１ｅ−Ｉ　１ｅ−Ｌ
ｙｓ−ＴｙｒＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＧｉｎＳｅｒ−
Ｉ　１ｅ−Ｉ　１ｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ
−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−ＬｅｕＴｈｒ−Ａ１ａ７Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｌｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ
−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−９ｅｒ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｔ
ｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−５ｅ
ｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ
−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ
−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−Ｈｌｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ
−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−１１ｅ−Ｔ
ｈｒＡｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ
−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａで表わされるＩＬ−１αのア
ミノ酸配列の３６位Ａｓｎ及び１４１位Ｃｙｓの少なく
とも一つのアミノ酸残基が欠失されているか又は他のア
ミノ酸残基で置換されている改変されたアミノ酸配列を
有する誘導体。

また、本発明者らは新たにＩＬ−１α誘導体の合成に成
功しており、該誘導体は以下の特徴を有している。

即ち、下式（α）： Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−３ｅｒ−Ａｓｎ−ＶａＩＬｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ
−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−１
１ｅ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘ　−Ａｓｐ−Ｇｌｎ
−Ｔｙｒ−ＬｅｕＴｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ
−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｖ
ａＩＩ　ｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉ　ｌｅ−５ｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＴｙｒＶａｌ−Ｔｈｒ
−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−
Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍ
ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈ
ｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−
Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｎＹ　　−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−１１ｅ−
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｒｐ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−１１ｅ−ＴｈｒＡｓｐ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇ
ｉｎ−Ａｌａ〔上記においてＸ及びＹは人体を構成する
α−アミノ酸残基を示す。〕 で表わされるＩＬ−１α誘導体のアミノ酸配列において
、１６位Ａｒｇが欠失されていること、該１６位Ａｒｇ
が他のアミノ酸残基で置換されていること、１位Ｓｅｔ
から１４位Ｐｈｅに至るアミノ酸配列が一欠失されてい
ること及び１位Ｓｅｒから１５位Ｍｅｔに至るアミノ酸
配列が欠失されていることから選ばれる条件の少なくと
も１つを充足する改変されたアミノ酸配列を有する。

上記ＩＬ−１β誘導体としては、以下のものを例示でき
る。

式（Ｂ）： Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ＬｅｕＡｒｇ−Ａｓｐ−５ｅｒ
−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａ
　１−Ｍｅｔ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｍ
ｅｔ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−１１ｅ
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＬｅｕＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−５ｅｒＣｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｎ−ＴｙｒＰｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＶａｌＰｈ
ｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ａ
ｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＬｅｕＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ
−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−
ＴｒｐＴｙｒ−Ｉ　１ｅ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｇ
ｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−ＭｅｔＰｒｏ−Ｖａｌ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉ　１ｅ−Ｔｈｒ−
Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖ
ａｌ−５ｅｒ−５ｅｒ で表わされる■Ｌ−１βのアミノ酸配列において、下記
ａ）〜ｄ）の条件の少なくとも１つを充足する改変され
たアミノ酸配列を有するＩＬ−１β誘導体。

ａ）１位Ａｌａ、３位Ｖａｌ　　４位Ａｒｇ、５位５ｅ
ｒ８位Ｃｙｓ　、　１１位Ａｒｇ　、　３０位Ｈ１ｓ７
１位Ｃｙｓ　　９３位Ｌｙｓ　、　９７位Ｌｙｓ　　９
８位Ａｒｇ　。

９９位ｐｈｅ、１０３位Ｌｙｓ　　１２０位Ｔｒｐ、１
２１位Ｔｙｒ及び１５３位Ｓｅｒカラ選ハレタ少なくと
も１つのアミノ酸残基が欠失されているか又は他のアミ
ノ酸残基で置換されていること、ｂ）１位Ａｌａから９
位Ｔｈｒに至るアミノ酸配列又はその中の少なくとも１
つのアミノ酸残基が欠失されていること（但し上記ａに
記載の１位Ａｌａ、３位Ｖａｌ　　４位Ａｒｇ、５位Ｓ
ｅｒ及び８位Ｃｙｓからなる群から選ばれたアミノ酸残
基の少なくとも１つが欠失されている場合を除く）、Ｃ
）１０３位Ｌｙｓから１５３位Ｓｅｔ　ニ至ルアミノ酸
配列又はその中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失
されていること（但し上記ａに記載の１０３位ＬｙＳ１
１２０位Ｔｒｐ、１２１位Ｔｙｒ及び１５３位Ｓｅｒか
らなる群から選ばれたアミノ酸残基の少なくとも１つが
欠失されている場合を除く）、 ｄ）上式（β）のＮ末端にアミノ酸残基又は下記式（Ｂ
′）で示される１′位Ｎｅｔから１１６′位Ａｓｐに至
るアミノ酸配列もしくはそのＣ末端側の一部のアミノ酸
配列が付加されていること、式（Ｂ′） Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−５ｅｒ−ＧｌｕＭｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｌａ
−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅ
ｔ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ
−Ｌｅｕ−ＡｓｐＬｅｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｎ−ＬｅｕＡｒ
ｇ−１１ｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ
−９ｅｒ−Ｌｙｓ−ＧｌｙＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌ
ａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−
Ａｓｐ−ＬｅｕＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−ＧｌｕＧｌｕ−
Ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−
Ｔｒｐ−Ａｓｐ−ＡｓｎＧｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｖａ
ｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ上記各式及び以下の本明細書におけ
るアミノ酸及びポリペプチドの表示は、ＩＵＰＡＣ及び
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる命名法又は規則における略号
乃至当該分野で慣用されている略号による表示法に従う
ものとする。

またアミノ酸残基の数及び位置は、欠落及び付加がある
場合であっても、全て前記式（Ａ）［ＩＬ−１αの場合
］及び前記式（Ｂ）［ＩＬ−１βの場合］のアミノ酸配
列に従って表示するものとする。但しＩＬ−１β誘導体
におけるアミノ酸残基の位置を示す数値の内ダッシュ（
′）を付したものは式（Ｂ′）のアミノ酸配列に従う。

上記ＩＬ−１の各誘導体は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１β
の各アミノ酸配列の特定位置の特定アミノ酸残基を他の
アミノ酸残基で置換したアミノ酸配列及び特定位置にア
ミノ酸残基を付加したアミノ酸配列のポリペプチドを包
含し、この置換及び付加を行ない得るアミノ酸残基は人
体蛋白質を構成するα−アミノ酸の残基であればいずれ
でもよく、特に中性アミノ酸残基が好適である。但しＣ
ｙｓはそのＳＨ基に基づき分子内又は分子間ジスルフィ
ド結合を形成することがあり、これを考慮すれば該アミ
ノ酸残基はＣｙｓ以外の上記アミノ酸残基であるのが好
ましい。

ＩＬ−１α誘導体の場合、特に好ましい上記人体蛋白質
を構成するα−アミノ酸残基としては、例えば１６位Ａ
ｒｇの場合はＧｌｙを、３６位Ａｓｎ　（７）場合はＡ
ｓｐを、１４１位置Ｃｙｓ　（ｙ）場合はＳｅｔをそれ
ぞれ例示できる。

またＴＬ−１β誘導体の場合、同様の特に好ましいもの
としては、例えば４位Ａｒｇの場合はＧｕｙ　。

Ｌｙｓ　、　Ｇｉｎ又はＡｓｐを、８位Ｃｙｓの場合は
Ｓｅｔ又ハＡ１ａを、１１位Ａｒｇ　（７）場合ハＧ１
ｎを、３０位Ｈｉｓ　（７）場合はＴｙｒを、７１位Ｃ
ｙｓ　（ｙ）場合は５ｅｒＡｌａ又はＶａｌを、９３位
Ｌｙｓ　（ｙ）場合はＬｅｕ又はＡｓｐを、９８位Ａｒ
ｇ　（ｙ）場合はＬｅｕを、１０３位Ｌｙｓ　（ｙ）場
合はＧｉｎを、１２０位Ｔｒｐ　（７）場合ハＡｒｇを
、１２１位Ｔｙｒの場合はＧｌｎを、またＮ末端への付
加の場合は、Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ又はＡｓｐを
それぞれ例示できる。

従来、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及び之等の誘導体はＬＡ
Ｆ活性、腫瘍細胞増殖抑制活性（Ｇ　Ｉ　Ｆ活性）、コ
ロニー刺激因子（Ｃ８Ｆ）、インターフェロン（ＩＦＮ
）、インターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン
３　（ＩＬ−３）等の種々のサイト力イン（ｃｙｔｏｋ
ｉｎｅ）類の産生促進活性、抗炎症活性、放射線障害防
止作用等を有し、例えば抗体産生促進やワクチンの効果
増強等の免疫系刺激剤、抗腫瘍剤、例えばＣ８Ｆ、ＩＬ
−２、ＩＬ−３等のサイトカイン産生促進剤、抗炎症剤
、放射線障害防止剤等の医薬品として有用であることが
知られているが、該ＩＬ−１が血小板増加作用（造血効
果）を有することは全く知られておらず、勿論この血小
板増加作用と上記公知の各種薬理効果との関連性につい
ても何ら報告はなく、該ＩＬ−１が血小板減少症治療剤
として利用できることは本発明者らにより初めて見出さ
れた事実である。

本発明治療剤において有効成分とする上記各種のＩＬ−
１α誘導体及びＩ　Ｌ−１β誘導体は、公知であるか又
は公知の遺伝子工学的手法により製造できる。即ち、前
記特定のポリペプチドをコードする遺伝子を利用して、
これを微生物のベクターに組込み該微生物細胞内で複製
、転写、翻訳させることにより所望の誘導体を製造でき
る。この方法は、特に大量生産が可能である点より有利
である。

上記方法において用いられる遺伝子は、通常の方法、例
えばホスファイト　トリエステル法（Ｎａｔｕｒｅ、　
３１０．１０５　（１９８４）　）等の常法に従い、核
酸の化学合成により全合成することもできるが、ＩＬ−
１もしくはその前駆体をコードする遺伝子を利用して合
成するのが簡便であり、例えば該遺伝子より上記化学合
成手段を含む常法に従い、前記特定のアミノ酸配列をコ
ードする核酸配列に改変すること等により容易に製造で
きる。

ＩＬ−１又はその前駆体をコードする遺伝子としては公
知のものをいずれも利用できる〔例えば特開昭６２−１
７４０２２号公報参照〕。

上記核酸（塩基）配列の改変操作も公知方法に従えばよ
（、目的とするポリペプチドのアミノ酸配列に応じて実
施される〔遺伝子工学的手法としテハ、例えばＭｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）参
照〕。

例えば、ＤＮＡの切断、結合、リン酸化等を目的とする
制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ
、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種の酵素処理等の常套手段
等が採用でき、それら酵素は市販品として容易に入手で
きる。之等各操作における遺伝子乃至核酸の単離、精製
も常法、例えばアガロース電気泳動法等に従えばよい。

また得られる遺伝子の複製は、一部後述するように通常
のベクターを利用する方法に従えばよい。また、所望の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片や合成リンカ−は
上記した化学合成により容易に製造できる。尚、上記に
おいて所望のアミノ酸に対応するコドンは自体公知であ
りまたその選択は任意でよく、例えば利用する宿主のコ
ドン使用頻度等を考慮した常法に従えばよい（Ｎｕｃｌ
、　Ａｃ１ｄｓ。

Ｒｅｓ、、　９．４３−７４　（１９８１）参照〕。ま
タコれラノ核酸配列のコドンの一部改変には、例えば常
法通り、１５〜３０マ一程度の、所望の改変をコードす
る合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いた
サイト−スペシフィック　ミュータジェネシス（Ｓｉｔ
ｅ−８ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　［
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８１．５６６２−５６６６　
（１９８４））等の方法を採用できる。

上記方法により得られる所望の遺伝子は、例えばマキサ
ム−ギルバートの化学修飾法［Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅ
ｒｔ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、、　６５．４９９−
５６０　（１９８０１やＭ１３ファージを用いるジデオ
キシヌクレオチド鎖終結法［Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　
ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ　、Ｊ、、　Ｇｅｎｅ。

（Ｙ、　Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１ｌ、　２３．１７５
−１８２　（１９８１）］やチャイニーズ・ハムスター
卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｇ、　Ｕ
ｒｌａｕｂ　ａｎｄ　Ｌ、　Ａ。

Ｃｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７７゜４２１６−４２
２０　（１９８０）］等がよく用いられるがこれらに限
定はされない。を推動物細胞の発現ベクターとしては、
通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモー
ター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及
び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更
に必要により複製起源を保有していてもよい。該発現ベ
クターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを保
有するｐ　３　Ｖ　２ｄｈｆｒ　［Ｓ、　Ｓｕｂｒａｍ
ａｎｉ、　Ｒ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄＰ、　Ｂｅｒ
ｇ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１．　（
９）、　８５４−８６４（１９８１）］等を例示できる
がこれに限定されない。

真核微生物としては酵母が一般によく用いられ、その中
でもサツカロミセス属酵母を有利に利用できる。該酵母
等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸性ホ
スファターゼ遺伝子に対するプロモーターを持ツｐ　Ａ
Ｍ　８２（Ａ、　Ｍｉｙａｎｏｈａｒａｅｔ　ａｌ、、
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　
Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８０゜１−５　（１９８３））等を好
ましく利用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく
用いられ、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベ
クターを用い、このベクター中に目的遺伝子が発現でき
るように、該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シ
ャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成
開始に必要なＡＴＧを付与した発現プラスミドが使用で
きる。

上記宿主菌としての大腸菌としてはエシェリヒア、コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　Ｋ　１２株
等がよく用いられ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２
２がよく用いられるが、これらに限定されず、公知の各
種の菌株及びベクターをいずれも利用できる。

プロモーターとしては、例えばトリプトファン・プロモ
ーター　Ｐｔプロモーター　１ａｃプロモーター　１ｐ
ｐプロモーター等を使用でき、いずれの場合にも目的遺
伝子を発現させ得る。

トリプトファン・プロモーターを用いる場合を例にとり
詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトファン・プロ
モーター及びＳＤ配列を持つベクターｐＴＭ１〔今本文
男、代謝、Ｖｏｌ、　２２．２８９（１９８５）］を使
用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ１ａＩ部位
に、必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポリペプチド
をコードする遺伝子を連結させればよい。尚、直接発現
系に限らず、例えばβ−ガラクトシダーゼやβ−ラクタ
マーゼ等を利用する融合蛋白質発現系によることもでき
る。

かくして得られる発現ベクターの宿主細胞への導入及び
これによる形質転換の方法としては、般に用いられてい
る方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集め、
ＣａＣＡ’２処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状
態にして、ベクターを取込ませる方法等を採用できる。

上記方法においては、通常知られているように形質転換
の効率を一層向上させるためにＭｇＣｌ２やＲｂＣ／を
培地に更に共存させることもできる。また、宿主細胞を
スフェロプラスト又はプロトプラスト化後に形質転換さ
せる方法も採用できる。

かくして得られる所望の形質転換株は、常法に従い培養
でき、該培養により、所望のポリペプチドが生産、蓄積
される。該培養に用いられる培地は、通常の細胞培養に
慣用される各種の培地のいずれでもよく、その具体例と
しては、例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地等及び之等に
通常知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタ
ミン類等を添加した培地を例示できる。尚、上記トリプ
トファン・プロモーターを用いた場合には、一般に該プ
ロモーターが働くようにするためにカザミノ酸を添加し
た、例えばＭ９最小培地を用いて培養することができ、
該培地中には培養の適当な時期にインドールアクリル酸
等のトリプトファン・プロモーターの働きを強めるため
の薬剤を添加することもできる。

かくして得られる活性物を含有する培養物からの目的ポ
リペプチド、即ち前記特定のＩＬ−１誘導体の精製、単
離は常法に従い行ない得る。尚、該ポリペプチドを宿主
から抽出するに当っては、例えば浸透圧ショック法等の
温和な条件を採用するのがその高次構造保持の面からよ
り好ましい。

上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチドの物理、化
学的性質を利用した各種の処理操作に従い実施できる〔
例えば「生化学データーブック■」ｐｐＨ７５−１２５
９、第１版第１刷、１９８０年６月２３日、株式会社東
京化学同人発行参照〕。該方法としては具体的には例え
ば通常の蛋白沈澱剤による処理、限外が過、分子ふるい
クロマトグラフィー（ゲルが過）、液体クロマトグラフ
ィー、遠心分離、電気泳動、アフィニティクロマトグラ
フィー、透析法、之等の組合等を採用できる。

より具体的には、上記操作は、例えば以下のごとくして
実施できる。即ち、まず培養上清より予め目的とするポ
リペプチドを部分精製する。この部分精製は、例えばア
セトン、メタノール、エタノール、プロパツール、ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒や酢酸、過塩
素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢酸（Ｔ　ＣＡ）等の酸を
蛋白沈澱剤として用いる処理、硫酸アンモニウム、硫酸
ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理
及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外
濾過処理等により行なわれる。

之等の各処理の操作及び条件は、通常のこの種方法のそ
れらと同様のものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、ゲルが過に付すこと
により目的物質の活性が認められる両分を収得する。こ
こで用いられるゲル濾過剤としては、特に限定はなく、
例えばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、ア
ガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロースゲル、
セルロース等を素材とするものをいずれも利用できる。

之等の具体例としては、セファデックスＧタイプ、同Ｌ
Ｈタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ（
以上、ファルマシア社）、セルロファイン（チッソ■）
、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオ−ラド社）
、ウルトロゲル（ＬＫＢ社）、ＴＳＫ−Ｇタイプ（トー
ソー社）等の市販品を例示できる。

目的とするポリペプチドは、上記ゲルが過により得られ
る活性画分を、例えばハイドロキシアパタイトカラムを
用いたアフィニティークロマトグラフィー、ＤＥＡＥ法
、０Ｍ法、ＳＰ法等のイオン交換カラムクロマトグラフ
ィー、クロマトフオーカシング法、逆相高速液体クロマ
トグラフィー等に付すことにより又は之等各操作の組合
せにより更に精製でき、かくして均質な物質としてのＩ
Ｌ−１α誘導体及びＩＬ−１β誘導体である前記特定の
ポリペプチドを単離、収得できる。

本発明の血小板減少症治療剤は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１
β及び之等の誘導体を有効成分として含有させることを
必須要件として、他は通常の医薬組成物と同様のものと
することができ、他に薬理的有効成分や製剤上の慣用成
分等を任意に配合して、常法に従いその適用に適した薬
理組成物形態に調製される。

上記薬理組成物に配合できる他の成分としては、特にＩ
Ｌ−１活性物の安定化の面より、例えばヒト血清アルブ
ミン（Ｉ　Ｓ　Ａ）等のアルブミン類や通常のし一型ア
ミノ酸、好ましくはシスティン、グリシン等が好ましい
。之等の添加量は、特に制限されるものではないが、Ｉ
Ｌ−１活性物１μｇ当たりアルブミン類では約０．０１
〜ｉｏｍｇ程度、アミノ酸は約０．００１〜１０ｍｇ程
度（２種以上のアミノ酸を併用する場合はそれらの合計
量）とするのが適当である。また上記薬理組成物には、
更に必要に応じて、糖類例えばグルコース、マンノース
、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノ
シトール、キシリトール等の糖アルコール類、ショ糖、
マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキ
シプロピルスターチ等の多糖等、好ましくはショ糖、マ
ルトース、マンニトール、イノシトール、デキストラン
等や、イオン性及び非イオン性界面活性剤、就中ポリオ
キシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系
、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタン
モノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等の界面活
性剤を配合することもできる。上記糖類はｔＬ−１活性
物１μｇ当たり約０．１■程度以上、好ましくは約１〜
１００ｍｇ程度の範囲、界面活性剤はＩＬ−１活性物１
μｇ当たり約０．０００１■程度以上、好ましくは約０
．００１〜０．１■程度の範囲で添加されるのが適当で
ある。

本発明治療剤の調製方法につき詳述すれば、該治療剤は
、一般に薬理有効量のＩＬ−１活性物（ＩＬ−１α、Ｉ
Ｌ−１β及び之等の誘導体）及び必要に応じて配合され
得る上記成分と共に、適当な医薬製剤担体を配合して、
製剤組成物の形態に調製される。該製剤担体としては使
用形態に応じた製剤を調製するのに通常慣用される充填
剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤等の賦形剤乃至は
希釈剤をいずれも使用できる。製剤組成物の形態は、こ
れが有効成分であるＩＬ−１活性物を効果的に含有する
状態であれば特に限定はなく、例えば錠剤、粉末剤、顆
粒剤、火剤等の固剤であってもよく、また液剤、懸濁剤
、乳剤等の注射剤形態であってもよい。またこれは使用
前に適当な担体の添加により液状となし得る乾燥品とす
ることもできる。之等の製剤組成物はいずれも常法に従
い調製され得る。

尚、上記において担体として採用し得る緩衝液としては
、特に限定されるものではないが、例えばクエン酸−リ
ン酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、酢酸
−酢酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム−リン酸−ナト
リウム、クエン酸−ホウ砂等のｐＨ４〜８、より好まし
くはｐ　Ｈ５〜６の各緩衝液を好ましく例示することが
できる。

得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態に応じた適当
な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、
筋肉内、皮下、皮肉、腹腔内投与等により投与され、固
剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与され得る。医
薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与量は、該製剤
の投与方法、投与形態、使用目的、之を適用される患者
の症状等に応じて適宜選択され、一定ではないが、通常
有効成分を約０．００００１〜８０重量％程度含有する
製剤形態に調製して、この製剤をこれに含有される有効
成分量が一日成人一人当り約０．０１μｇ〜１０■程度
となる範囲で投与するのが望ましい。該投与は、−日１
回である必要はなく一日３〜４回に分けることもできる
。

実　　　　施　　　　例 以下、参考例及び実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明する。尚、各側において生理活性は次の方法により測
定した。

〈活性の測定〉 （１）ＩＬ−１活性の測定 オッペンハイム（Ｊ、　Ｊ、　Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ　ｅ
ｔ　ａｌ　）　（７）方法（Ｊ、　Ｉｎｎｍｕｎｏｌ、
、　１１６．１４６６　（１９７６）　）に従い、Ｃ３
Ｈ／ＨｅＪ系マウスの胸腺細胞を利用して測定したＬＡ
Ｆ活性により表示した。

（２）ＧＩＦ活性の測定 ９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した供試液０．ｌｘ／を入れ、次に各ウェル
にヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を２×１０４個／　ＮＡ
’の濃度で含有する１０％ＦＣ３を含むイーグルスＭＥ
Ｍ浮遊液０．１ｙ／を加え、炭酸ガス培養器（ナフコ社
製）内で４日間培養する。

培養終了後、０．０５％ニュウトラルレッド（和光紬薬
社製）０．０５ｙＡ！を各ウェルに加え、３７℃で２時
間培養する。上澄液を除去した後、リン酸緩衝生理食塩
水０．３１１１を各ウェルに静かに加えてウェルを洗浄
する。洗浄液を除去した後、各ウェルにリン酸１ナトリ
ウム−エタノール等量混合液０．ｌｙＩを加え、マイク
ロミキサーで数分間振盪し、細胞内に取込まれた色素量
を、９６ウ工ルーマイクロタイトレーシヨンプレート用
光度計（タイターチエツクマルチスキャン、フロララボ
ラトリーズ社製）を用いて、吸光度５４０ｍμにて測定
し、増殖抑制活性を求める。対照群（コントロール群）
の細胞増殖の５０％抑制を示す試験群、即ち対照群の吸
光度測定値の１／２の吸光度測定値を示す試験群、の希
釈率の逆数をとり、これをＧＩＦ活性単位とする。従っ
て例えばこのＧＩＦ活性が１０単位の場合、この供試液
は１０倍希釈してもなお細胞増殖を５０％抑制する活性
を有する。

参考例　Ｉ ＩＬ−１α誘導体［１６Ｇ・３６Ｄ・１４１Ｓコの製造 ■　ＩＬ−４α誘導体発現用プラスミドの調製この例に
用いたプラスミドｐｔｒｐｒｒ、−ｉα１４１Ｓは、ヨ
ーロッパ特許公開第２３７０７３号公報に記載される通
り、ＩＬ−１α前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡを有
するプラスミドｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７〔エッシェリヒ
アコリχ１７７６／ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７（微工研条
寄第１２９４号）の保有するプラスミド）〕と、ｐＴＭ
１　〔今本文男、代謝　Ｖｏｌ、２２．２８９　（１９
８５））とから得られるプラスミドＩ）ｔｒｐ　ＩＬ−
１α−１１３を利用して、サイトスペシフィックミュー
タジェネシス［５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８
１．５６６２−５６６６　（１９８４））に従い得られ
たものであり、前記式（Ａ）で表わされるＩＬ−１αの
アミノ酸配列の第１４１番目のＣｙｓをＳｅｔに置換さ
せたアミノ酸配列のＩＬ−１α誘導体をコードする遺伝
子を有している。

上記プラスミドｐ　ｔｒｐ　Ｉ　Ｌ　−１ａ　−１４１
Ｓより、Ｃ１ａＩ−ＢａｍＨＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ　フ：）グ
、ｆｚ）（５２７ｂｐ）を切出し、これをＩＬ−１βサ
イトスペシフイツクーミユータジエネシス用ベクターｆ
１・ＩＬ１β　１ｐｐＴ［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、。

１５０、１１０６−１１１４　（１９８８）　：ｌ　ノ
ｃ１ａＩ−ＢａｍＨＩ長鎖フラグメントとライゲーショ
ンして、ｆｌ・ＩＬ１α−１４１Ｓを得た。これからヘ
ルパーファージＭ１３ＫＯ７（宝酒造）を感染させるこ
とにより、−本鎖ＤＮＡ　（ＳＳＤＮＡ）を得、これを
ミュータジェネシスの鋳型とした。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化された５′−
リン酸化合成オリゴヌクレオチド〔５′ＡＣＴＴＴＡＴ
ＧＧＧＧＡＴＣＡＴＣＡ−３’　］をプライマーとし、
オリゴヌクレオチドーダイレクテッドインビトロミュー
タジエネシス［０１１ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒ。

ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　、　７７　ジャム（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ　ＵＫ）社製、コードＲＰＮ・２３２２］を用
いてサイトスペシフィックーミュータジエネシスを行な
った。

エシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＭＶ　１３０４
（宝酒造）にトランスフオームされたクローンから５Ｓ
ＤＮＡを得、ジデオキシチェインターミネイション法に
よりＤＮＡシークエンシングを行ない、目的の遺伝子の
変異した組換え体（形質転換体）ｆｌ・Ｉ　Ｌ−１α−
１６Ｇ・１４１　Ｓ　／Ｅ、ｃｏｌｉＭＶ１３０４を得
た。

このプラスミドは前記式（α）のアミノ酸配列の１６位
ＡｒｇがＧｌｙに置換され、且つ３６位ＸがＡｓｎ　テ
、１４１位ＣｙｓがＳｅｒニ置換されたポリペプチド発
現プラスミドである。

上記形質転換体は、工業技術院微生物工業技術研究所（
微工研）に［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ
　１３０４／ｆ１．ＩＬ−１α・１６Ｇ、１４１ＳＪな
る表示で寄託されており、その寄託番号は微工研条寄第
２４３４号（ＦＥＲＭＢＰ−２４３４）である。

■　形質転換体の培養 上記■で得た形質転換体（ＭＶ　１３０４／ｆ　１゜Ｉ
Ｌ−１α・１６Ｇ・１４１　Ｓ）をアンピシリン１００
μｇ　／　ｚｌを含む下記組成のＬＢ培地６００１１に
接種し、３７℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。

＜ＬＢ培地組成〉 バクト・トリプトン（デイフコ社）　　１０ｇ／Ｉバク
ト・イースト抽出物（同上社）　　　５　ｇ　／　１Ｎ
ａＣ１（和光純薬社）　　　　　　　　Ｌｏｇ／ｌ上記
前培養液６００１１を、下記組成の生産培地３０１に接
種し、５０１容ジャーファーメンタ−（日立製作所）で
３６．５℃にて１４時間、通気量（０，５ＶＶＭ）　、
攪拌数（１２Ｏｒｐｍ）の条件で培養した。

〈生産培地組成〉 Ｎａ２　ＨＰＯ４・１２Ｈ２０６ｇ／ｌｌＫＨ２ＰＯ４
３ｇ／Ｉ ＮａＣ／　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ／／ＮＨ
４Ｃｌ　　　　　　　　　　　　　１　　ｇ／ｌバクト
ーカザミノ酸　　　　　　　　Ｌｏｇ／Ａ’バクトーイ
ースト抽出物　　　　　０．５ｇ／Ｉ！Ｌ−システィン
・ＨＣＩ　　　　　　　７５■／ｌＬ−プロリン　　　
　　　　　　　　　７５■／ｌＬ−ロイシン　　　　　
　　　　　　７５■／１４Ｎ　　ＮａＯＨにてｐ）（を
７．４に調整後、１２１℃で３０分間オートクレーブ処
理又は１２３°Ｃで２０分間蒸気加熱処理し、次いで下
記各成分の別滅菌液を接種時に無菌的に培地に添加する
。

〈別滅菌液組成〉 Ｉ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・４Ｈ２０２ｚ（１／ｌＬ
Ｍ　　ＣａＣＡ’２　　’　２Ｈ２００、１ｉｌｌ　／
　１２７．５■／ｌチアミン・ＨＣ／　　　　１　　ｙ
ｌｌ／ｌＩ４０％　グルコース　　　　　１８．７５ｙ
ｌｌ／ＩＩ培養終了後、大腸菌をＩ　Ｍ　　Ｎ　ａ　２
　ＨＰ　Ｏ４３００ｚＩ！に懸濁させ、−夜冷室に放置
し、その後同冷室にて１０ｍＭ）リスＨＣＩ緩衝液（ｐ
ＩＩ８．０）に対して２日間透析し、得られた透析液を
遠心分離（１６０００ｘｇ）して、上清と沈澱物とに分
離した。

■　ＩＬ−１α誘導体の精製 上記■で得た上清を、２Ｍ酢酸でｐＨ３に調整した後、
５Ｐ−ＨＰＬＣ［）−ソー社製、ＴＳＫゲル５Ｐ−５Ｐ
Ｗカラム（５，５Ｘ２０ｃｍ）使用］を用いて、以下の
条件で精製した。

カラム：　ＴＳＫゲル５Ｐ−５ＰＷ　（５，５Ｘ２０口
、トーソー社製） 溶離液Ａ　：　５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）
溶離液Ｂ　：　５０ｍＭ酢酸ナトリウム（１）Ｈ５，５
）濃度勾配二　　時間（分）　　　％Ｂ 流速：３ＣＪｔｌｌ／分 上記５Ｐ−ＨＰＬＣの結果、ＧＩＦ活性画分は、リテン
ションタイム１１４〜１３１分に認められた。

次いで上記で得られた活性画分につき、同条件下に再度
５Ｐ−ＨＰＬＣを行なってＧｔＦ活性画分を得た。

更に上記で得られた活性画分を集め、これを以下のイオ
ン交換クロマトグラフィー（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−ＨＰ　
Ｌ　Ｃ）に付して精製した。

カラム：　ＴＳＫゲルゲルＡＥ−５ＰＷ　（５，５Ｘ２
０ｃｍ、）−ソー社製） 溶離液Ａ：２０ｍＭトリスＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０） 溶離液Ｂ：０．５Ｍ　　ＮａＣＡ’含有２０ｍＭ）リス
ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０） 濃度勾配二　　時間（分）　　　％Ｂ 流速：３０ｚＡ＋／分 上記Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−ＨＰ　Ｌ　Ｃの結果、ＧＩＦ活
性画分は、リテンションタイム９８．８〜１０２．８分
に認められた。

上記で得られた活性画分を集め、これを園外濾過（ＹＭ
−５メンプラン、アミコン社製使用）によって、２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）の溶液組成と
なるように緩衝液を交換しつつ濃縮して、濃縮精製品を
得た。

尚、このものの等電点は５．０であった。

■　ＩＬ−１α誘導体の確認 （１）アミノ酸組成 上記■で得られた濃縮精製品３０μｌを、６ｍｍＸ５０
ｍｍの肉厚硬質試験管の底部に注意深く入れ、該試験管
を反応バイアルに入れ、ピコタグワークステーション（
ウォーターズ社製）にて減圧乾燥した。上記試験管に、
６Ｎ塩酸２００μｌ　（１％フェノールを含む）を加え
、注意深く脱気後、封管し、１３０°Ｃで４時間加水分
解を行なった。

次いで加水分解物に０．０２Ｎ塩酸４００μｌを加え、
これをアミノ酸分析用試料とした。

アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー（日立製作新製
、日立８３５型分析計）を用い、上記試料溶液２５０μ
ｌを注入して行なった。分離されたアミノ酸は、オルト
フタルアルデヒド法で検出した。また定量は、試料の前
後に分析した標準アミノ酸で作成した検量線によって行
なった。

その結果を、Ｐｈｅを基準（１０モル）として、各アミ
ノ酸の含有モル比で下記第１表に示す。尚、上記分析条
件下においては、Ｐｒｏ　、Ｃｙｓ及びＴｒｐは測定で
きない。

第　　１　　表 （２）　　アミノ酸配列 上記■で得られた濃縮精製品５０μ１（２９Ｓｐ　ｍｏ
ｌ相当）を、アプライドバイオシステムズ社製プロテイ
ンシークエンサー（モデル４７０Ａ）にて分析した。生
じたＰＴＨ−アミノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液
１００〜５００μｌにて適宜希釈し、その５μｌをウォ
ーターズ７１０Ｂ型オートサンプラーにて注入した。ク
ロマトグラフィーのシステムは、ペックマン１１２型ポ
ンプ２台を４２１型コントローラーで作動させた。カラ
ムはウルトラスフェア−０Ｄ１５μｍの充填された２ｍ
ｍＸ２５０ｍｍを用い、カラムヒーターにて５５°Ｃに
保った。流速は０．３／／分とし、２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウムとアセトニトリルとの混合液を用いてグラジェント
溶出法で分離し、２６９ｎ”でモニターした。分析は４
５分とした。

その結果、Ｎ末端酸３６個のアミノ酸配列は以下の通り
であった。

Ｓｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−３ｅｒ−Ａｓｎ−ＶａｌＬｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ
−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−
１１ｅ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ以上のことよ
り、得られた精製品は、前記式（α）で表わされるＩＬ
−１α誘導体の１６位アミノ酸（Ａｒｇ　）がＧｌｙに
置換されたポリペプチドであることが確認された。

また、遺伝子では３６位アミノ酸はＡｓｎであったが、
得られた精製品のそれはＡｓｐであった。このことは既
に天然型のＩＬ−１αでも観察されているように３６位
アミノ酸がＡｓｐである誘導体が安定な誘導体であり、
この例におけるＩＬ−１α誘導体においても同様の変異
が起っていることを意味している。

参考例　２ ＩＬ−１α誘導体［Δ（１−１４）　　・３６Ｄ・１４
１　Ｓ］の製造 ■　ＩＬ−１α誘導体発現用プラスミドの調製この例は
プラスミドｐｔｒｐＩＬ−１α−３６Ｄ・１４１Ｓ〔ヨ
ーロッパ特許公開第２３７０７３号公報記載、これを保
有する大腸菌Ｈ８１０１株は、微工研ニ「Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ／　ＩＬ　１α−３
６Ｄ　１４１ＳＪなる名称で微工研条寄第１２９５号（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ１２９５）として寄託されている〕を
利用して、サイトスペシフィックミュータジェネシスに
従い、以下の通り実施された。

即ち、上記プラスミドｐｔｒｐ　ＩＬ−４ａ−３６Ｄ−
１４１Ｓより、ＣＩａＩ−ＢａｍＨＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ７　
ラグメント（５２７ｂｐ）を切出し、参考例１と同じｆ
ｌ−ＩＬ−１βｌｐｐ　Ｔ　（７）　Ｃ１ａｌ　−Ｂａ
ｍＨＩ長鎖フラグメントとライゲーションして、ｆｌ・
ＩＬ−１α３６Ｄ・１４１Ｓを得た。これからヘルパー
ファージＭ１３ＫＯ７（宝酒造）を感染させることによ
り、−本鎖ＤＮＡを得、これをミュータジエネシスの鋳
型とした。

プライマーとして、合成オリゴヌクレオチド（５’　−
ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣ
ＡＴ（、−３’　）を用い、参考例１と同様にオリゴヌ
クレオチドーダイレクテッドインビトロミュータジエネ
シスを用いて、サイトスペシフィックーミュータジェネ
シスを行なった。

エシェリヒア・コリ　（Ｅ・ｃｏｌｉ）　ＭＶ　１１　
ｓ　４（宝酒造）にトランスフオームされたクローンか
ら５ＳＤＮＡを得、ジデオキシチェインターミネイショ
ン法によりＤＮＡシークエンシングを行ない、目的の遺
伝子の変異した組換え体（形質転換体）ｆｌ・ＩＬ−１
α−Δ（１−１４）　　・３６Ｄ・１４１　Ｓ／Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　　ＭＶ　１１８４を得た。

このプラスミドは前記式（α）のアミノ酸配列の１−１
４位アミノ酸配列を欠落しており、且つ３６位ＸがＡｓ
ｐテ、１４１位ＹがＳｅｔであるポリペプチド発現プラ
スミドである。

上記形質転換体は、工業技術院微生物工業技術研究所（
微工研）　ニ「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｍ
Ｖ　１１８４／ｆ１．ＩＬ−１ａ、Δ（１−，１４）　
３６Ｄ、　１４１ＳＪなる表示で寄託されており、微工
研条寄第２４３３号（ＦＥＲＭＢＰ−２４３３）として
寄託されている。

上記プラスミドを用いて、参考例１と略々同様にして、
目的とするＩＬ−１α誘導体の発現及び精製を行なった
。

かくして、目的の誘導体［ＩＬ−１α−Δ（１−１４）
・３６Ｄ・１４１　Ｓ］を得た。

その比活性は１．０Ｘ１０６ＧＩＦ単位／■蛋白であっ
た。

■　ＩＬ−１α誘導体の確認 （１）アミノ酸組成 参考例１の■（１）と同様にして、上記■で得たＩＬ−
１α誘導体のアミノ酸組成を分析した。

Ｐｈｅを７として得られた結果は下記第２表に示す通り
である。

第２表 （２）　　アミノ酸配列 参考例１の■（２）と同様にして、上記■で得たＩＬ−
１α誘導体のＮ末端域アミノ酸組成を分析した。

その結果、Ｎ末端域１５個のアミノ酸配列は以下の通り
であった。

Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｉ　１ｅ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ以上のことより、得られた誘
導体には確かに前記式（α）で表わされるＩＬ〜１αの
アミノ酸配列の１−１４位アミノ酸配列が欠失されてい
ることが確認された。

参考例　３ ＩＬ−１α誘導体［Δ（，１−１５）］の製造■　ＩＬ
−１α誘導体発現用プラスミドの調製この例は、ＩＬ−
１βサイトスペシフイツクーミユータジエネシス用ベク
ターｆ１・ＩＬ−１β１ｐｐＴ　［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１５
０゜１１０６−１１１４　（１９８Ｂ））を利用し、ま
ず該ベクターｆ１・ＩＬ−１β１　ｐｐＴをＥＣ０ＲＩ
で切断し、ＤＮＡポリメラーゼ■（クレノー断片）で処
理し、セルフライゲーションすることによってＥｃｏＲ
Ｉサイトを欠落させたｆｌ・Ｉ　Ｌ−１βｌ　ｐｐＴΔ
ＲＩを作成し、このプラスミドからＨｐａＩ　−Ｂａｍ
）ＩＩ長鎖フラグメントを切りだした。

別ニ、プラスミドｐｔｒｐ　ｔｔ、−１α−１１３〔ヨ
ーロッパ特許公開第２３７０７３号公報記載〕からＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ短鎖フラグメントを切りだし、これ
と上記ＨｐａＩ　−ＢａｍＨＩ長鎖フラグメントとを、
合成リンカ−［５’　−ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧ
ＴＴＣＡＣＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴ
ＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＧ−３′及び５’　
−ＡＡＴＴＣＧＴＡＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＣＴＣＡＴＡ
ＡＴＡＴＴＡＡＡＣＣＴＣＣＴＴＡＣＧＴＧＡＡＣＴＴ
ＧＣＧＴＡＣＴＡＧＴＴ−３’　］を介して接続させて
、目的の遺伝子を変異した組換え体（形質転換体）ｆｌ
・ＩＬ−１ａ、Δ（１１５）　／Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＶ１
１８４を得た。

このプラスミドは、前記式（１）のアミノ酸配列の１−
１５位アミノ酸配列を欠落しており、且つ３６位ＸがＡ
３Ｂテ、１４１位ＹがＣｙｓ　（ｙ）本発明ＩＬ−１α
誘導体発現プラスミドである。

■　ＩＬ−１α誘導体の製造 上記プラスミドを用いて、製造例１と略々同様にして、
目的とするＩＬ−１α誘導体の発現及び精製を行なった
。

即ち、上記プラスミドｆ１・ＩＬ−１α・Δ（１−１５
）を含む大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　）を、
実施例１と同じ条件で培養（６０１）後、遠心分離（１
６０００ｘｇ）により集菌した。得られた菌体を１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）に懸濁させ、−夜冷室に放
置した後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に対
して２日間透析した。得られた透析液を遠心分離（１６
０００ｘｇ）して上清と沈渣を分離した。

更に得られた沈渣につき上記と同一操作を２回繰り返し
それぞれ上清を得た。得られた上清を合わせ、以下の精
製操作に供した。

■　ＩＬ−１α誘導体の精製 まず上記■で得た上清を、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−ＨＰ　Ｌ
　Ｃ［トーソー社製、ＴＳＫゲルゲルＡＥ−５ＰＷカラ
ム（５，５Ｘ２０ｃｍ）使用］を用いて、以下の条件で
精製した。

カラム：ＴＳＫゲルゲルＡＥ−５ＰＷ　（５，５Ｘ２０
ｃｍ、）−ソー社製） 溶離液Ａ：２０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）溶離液Ｂ
：２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）　十０．５Ｍ　　
ＮａＣＡ’ 濃度勾配：　　時間（分）　　　％Ｂ 流速：３０ｚ／／分 上記において、リテンションタイム８８〜９３分（これ
をフラクションＡとよぶ）及び９９〜１０３分（これを
フラクションＢとよぶ）をそれぞれ集め、別々に限外濾
過（ＹＭ−５メンプラン使用）して濃縮した後、ゲルが
過ＨＰＬＣ［トーソー社製、ＴＳＫゲルゲル２０００Ｓ
ｗＧカラム（２１，５Ｘ６００ｍｍ）使用、溶離液ＰＢ
Ｓ−］で精製した。

上記で精製したフラクションＡを更に２Ｍ酢酸でｐＨ４
とした後、５Ｐ−ＨＰＬＣ［）−ソー社製、ＴＳＫゲル
５Ｐ−５ＰＷ（２１，５Ｘ１５０順）カラム］に付し、
下記条件で溶出させた。

カラム：　ＴＳＫゲル５Ｐ−５ＰＷ（２１，５Ｘ１５０
ｃｍ、トーソー社製） 溶離液Ａ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）溶離
液Ｂ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ　Ｈ５，０）＋０．
５Ｍ　　ＮａＣ１ 濃度勾配：　　時間（分）　　　％Ｂ 流速：３ｚＩ／分 リテンションタイム８７〜９３分の分画を集め、限外が
過（ＹＭ−５メンプラン使用）によって２０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）の溶液組成となるよう
に緩衝液を交換しつつ濃縮して、濃縮精製品を得た。

■　ＩＬ−１α誘導体の確認 （１）上記■で得た精製品のアミノ酸分析を、製造例１
の■（１）と同様にして実施した。

Ｐｈｅを７として得られた結果は下記第３表に示す通り
である。

第３表 （２）　　参考例１の■（２）と同様にして、上記■で
得たＩＬ−１α誘導体のＮ末端域アミノ酸配列を分析し
た。その結果、Ｎ末端域２３個のアミノ酸配列は以下の
通りであった。

Ｍｅｔ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉ　１ｅ−ＬｅｕＡｓｎ−Ａｓｐ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−１１ｅ−１１
ｅ−ＡｒｇＡｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ 以上のことより、得られた誘導体は前記式（α）で表わ
されるＩＬ−１α誘導体のアミノ酸配列の１−１５位ア
ミノ酸配列が欠失されており且つＸがＡｓｎであること
が確認された。

（３）また上記■で得たフラクションＢについて、フラ
クションＡと同様にして精製し、精製品のアミノ酸分析
を同様に実施した。Ｐｈｅを７として得られた結果は下
記第４表に示す通りである。

第４表 （４）また上記フラクションＢの精製品につき、参考例
１の■（２）と同様にしてＮ末端域アミノ酸配列を分析
した結果、Ｎ末端域２３個のアミノ酸配列は以下の通り
であった。

Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｉ　１ｅ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｉ　１ｅ−
Ｉ　１ｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ− 以上のことより、得られた誘導体は前記式（α）で表わ
されるＩＬ−１α誘導体のアミノ酸配列の１−１５位ア
ミノ酸配列が欠失されており且つＸがＡｓｐであること
が確認された。

参考例　４ ＩＬ−１α誘導体［Δ（１−１５）・３６Ｄ・１４１　
Ｓ］の製造 ■　ＩＬ−１α誘導体発現用プラスミドの調製この例は
プラスミドｐｔｒｐＩＬ−１α・３６Ｄ・１４１Ｓを利
用して、サイトスペシフィックーミュータジェネシスに
従い、以下の通り実施された。即ち、プラスミドｐｔｒ
ｐ　ｒｔ、−１１α・３６Ｄ−１４１８より、Ｃ１ａＩ
−ＢａｍＨＩ　［）　Ｎ　Ａ７ラグメン）（５２７ｂｐ
）を切出し、実施例１と同じｆｌ・ＩＬ−１βｌｐｐ　
７（ｙ）Ｃ１ａＩ−ＢａｍＨＩ長鎖フラグメントとライ
ゲーションしてｆｌ・ＩＬ−１α・３６Ｄ・１４１Ｓを
得た。これからヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（宝酒造
）を感染させて、−本鎖ＤＮＡ　（ＳＳＤＮＡ）を得、
これをミュータジエネシスの鋳型とした。

プライマーとして、合成オリゴヌクレオチド［５’　−
ＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣ−３’　
）を用い、実施例１と同様にオリゴヌクレオチドーダイ
レクテッドインビトロミュータジエネシスキット（アマ
ジャム社アを用いて、サイトスペシフィックーミュータ
ジエネシスを行なった。

エシェリヒア・コリＭＶ１１８４にトランスフオームさ
れたクローンからＳ；ＤＮＡを得、ジデオキシチェイン
ターミネイション法によりＤＮＡシークエンシングを行
ない、目的の遺伝子の変異した組換え体（形質転換体）
ｆｌ・ＩＬ−１αΔ（１−１５）　　・３６Ｄ・１４１
　Ｓ／Ｅ、　ｃｏｌｉＭｖ１１８４を得た。

更に、大量培養用の発現ベクターを次のように作製した
。即ち、まず前記ｆ１・ＩＬ−１β１ｐｐＴをＭｌｕｌ
及び５ａｌｌテ切断し、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー
フラグメント）で処理し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲ
ートし、ｆｌ・ＩＬ−１β１ｐｐＴΔＭＳを得た。これ
を更にＥＣＯＲ工、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフラ
グメント）、セルフライゲージ−ｓンを行ない、次にＡ
ａｔＩＩ　、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｇｌＩｆリン
カ−（ｐＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣ）処理し、ＡａｔＩＩサ
イトをＢｇＩＩＩサイトニ変換した。同様に、５ａｌＩ
ＸＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼ（クレノーフラグメント）　
、ＸｂａＩリンカ−（ｐＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣ）処理し
、５ａｉｌサイトをＸｂａ　Ｉサイトに変えた。これか
らＣ１ａ、Ｉ−ＢａｍＨＩ　［）　Ｎ　Ａ長鎖フラグメ
ント（５，５ｋｂ）を切出し、先のｆｌ・ＩＬ−１αΔ
（１−１５）　　・３６Ｄ・１４１Ｓから（ｙ）Ｃ１ａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ　Ｉ）　Ｎ　Ａ７ラグメント（４８２ｂ
ｐ）とライゲーションして、ｆｌ・ＩＬ−１αΔ（１−
１５）　　・３６Ｄ−１４１ＳＡ　（ＡａｔＩＩ。

Ｂｇｌｌｌ、　５ａｌｌ−＞Ｘｂａりを得た。これから
１１０９ｂｐ　ＢｇｌＩＩ−Ｘｂａｌ　　Ｉ）　Ｎ　Ａ
　７ラグメントを切出した。

別に、ｐ　ＡＴ　ｌ　５３ノＣ１ａＩサイトをＢｇｌＩ
Ｉサイトに、またＤｒａＩサイトをＸｂａＩサイトに置
き換え、ＢｇｌＩＩ及びＸｂａ　Ｉ　テ切断して得た２
５１４ｂｐのＢｇｌｌＩ　　Ｘｂａｌ長鎖フラグメント
と、先の１１０９ｌ１０９ｂｐ（ｙ）Ｂ　−Ｘｂａｌフ
ラグメントをライゲートシ、目的の組換え体ｐＡＴ・Ｉ
Ｌ−１αΔ（１−１５）・３６Ｄ・１４１Ｓを得た。

このプラスミドは、前記式（１）のアミノ酸配列の１−
１５位アミノ酸配列を欠落しており（但し、この組換え
体を培養して蛋白質を作らせて、翻訳開始コドンに由来
するＭｅｔが付加した蛋白質ができる場合は、実際上１
−１４位アミノ酸配列が欠落したポリペプチドができる
）、且つ３６位ＸがＡｓｐで、１４１位ＹがＳｅｒの本
発明ＩＬ−１α誘導体発現プラスミドである。

上記形質転換体は、工業技術院微生物工業研究所（微工
研）に、ｌ’−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｈ
ＢＩＯＩ　／ｐＡＴ　ＩＬ−１αΔ（１−１５）３６０
１４１５　Ｊなる表示で、微工研条寄第２４８３号（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２４８３）として寄託されている。

■　形質転換体の培養 上記形質転換体をテトラサイクリン１０μｇ／ｌｌを含
む下記組成のＬＢ培地６００７／に摂取し、３７℃で一
晩振盪培養して前培養液を得た。

（ＬＢ培地組成〉 バクト・トリプトン（デイフコ社）　　　１０ｇ／Ａ’
バクト・イースト抽出物（同上社）　　　５　ｇ　／　
Ａ’ＮａＣ／　（和光純薬社）　　　　　　　　１０ｇ
／ｌ上記前培養液６００ｚＡ’を、下記組成の生産培地
３０／に接種し、５０Ｉ！容ジャーファーメンタ−（日
立製作所）で３６．５°Ｃにて１６時間、通気量（ＩＶ
ｖＭ）、攪拌数（３００ｒｐｍ）の条件で培養した。

〈生産培地組成〉 Ｎａ２ＨＰＯ４’　１２Ｈ２０６ｇ／　１ＫＨ２ＰＯ４
３ｇ／ｌ ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　０．５ｇ／Ａ’Ｎ８
４　ＣＡ’　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　
　ｇ／ｌカゼイン酸加水分解物（シグマ社）１０　ｇ／
ｌバクトーイースト抽出物　　　　　０．５ｇ／Ａ’Ｍ
ｎＣｌ２−４Ｈ２０２，５ｍｇ／１ｌｌＬ−システィン
・ＨＣＩ　　　　　　７５　　■／　ＺＡ’Ｌ−プロリ
ン　　　　　　　　　　　７５　■／　ｘｌｌＬ−ロイ
シン　　　　　　　　　　７５　■／ＩＩ！４Ｎ　　Ｎ
ａＯＨにてｐＨを７．４に調整後、１２１℃で３０分間
オートクレーブ処理し、次いで下記各成分の別滅菌液を
接種時に無菌的に培地に添加する。

〈別滅菌液組成〉 Ｉ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・４Ｈ２０２ｙｌ／ｌＩＭ
　ＣａＣｌ２・２Ｉ］２０　　０．１１１１／１７．５
■／ｌチアミン・ＨＣＡ’　　　　１　　ｘｌｌ／ｌＩ
４０％　グルコース　　　　　１８．　７５３ＦＡ’／
　Ａ’培養後、遠心分離（１６０００ｘｇ）により集菌
し、得られた菌体を１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に
懸濁させ、−夜冷室に放置した後、１０ｍＭ）リス塩酸
緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）に対して２日間透析した。得ら
れた透析液を遠心分離（１６０００Ｘｇ）して上清と沈
渣を分離し、更に得られた沈渣に上記と同一操作を繰り
返して、上清を得た。得られた各上清を合わせ、以下の
精製操作に供した。

■　ＩＬ−１α誘導体の精製 まず上記■で得た上清を、２Ｍ酢酸を用いてｐＨ３に調
節した後、５Ｐ−ＨＰＬＣ［）−ソー社製、ＴＳＫゲル
５Ｐ−５ＰＷカラム（５，５Ｘ２０ｃｍ）使用］を用い
て、以下の条件で精製した。

カラム：　ＴＳＫゲル５Ｐ−５ＰＷ　（５，５Ｘ２０−
、トーソー社製） 溶離液Ａ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）溶離
液Ｂ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）＋０．５
Ｍ　　ＮａＣ１ 濃度勾配二　　時間（分）　　　％Ｂ 流速：３０ＦＡ’／分 上記において、リテンションタイム７０〜７５分の分画
を集め、これを１Ｍトリス塩酸緩衝液でｐＨ８，１に調
整した後、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−ＨＰ　Ｌ　Ｃ［トーソー
社製、ＴＳＫゲルゲルＡＥ−５ＰＷカラム（５，５Ｘ２
０ａｎ）に付し、下記条件で溶出させた。

カラム：ＴＳＫゲルゲルＡＥ−５ＰＷ　（５，５Ｘ２０
ｃｍ、　　トーソー社製） 溶離液Ａ：２０ｍＭ）リス塩酸（ｐ　Ｈ８，０）溶離液
Ｂ：２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）＋０、　５Ｍ　
　Ｎａ（、／ 濃度勾配二　　時間（分）　　　％Ｂ 流速：３０１１１／分 リテンションタイム９２〜９６分の分画を集め、限外が
過（ＹＭ−５メンプラン使用）″によって濃縮した後、
ゲルが過ＨＰＬＣ［トーソー社製、ＴＳＫゲルゲル２０
００ＳＷＧカラム（２１，５Ｘ６００１”）使用、溶離
液ＰＢＳ−，１１で精製シタ。

上記で精製したものを、更に２Ｍ酢酸でｐＨ４とした後
、５Ｐ−ＨＰＬＣ［トーソー社製、ＴＳＫゲル５Ｐ−５
ＰＷ（２１，５ｘ１５０ｍｍ）カラム］に付し、下記条
件で溶出させた。

カラム：　ＴＳＫゲル５Ｐ−５ＰＷ（２１，５Ｘ１５０
ｃｍ、トーソー社製） 溶離液Ａ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＩ（５，０）溶
離液Ｂ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）＋０．
５Ｍ　　ＮａＣＡ！ 濃度勾配：　　時間（分）　　　％Ｂ 流速：３１１１１／分 リテンションタイム８７〜９０分の分画を集め、限外が
過（ＹＭ−５メンプラン使用）によって２０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）の溶液組成となるよう
に緩衝液を交換しつつ濃縮して、精製品を得た。

■　ＩＬ−１α誘導体の確認 （１）上記■で得た精製品のアミノ酸分析を、実施例１
の■（１）と同様にして実施した。

Ｐｈｅを７として得られた結果は下記第５表に示す通り
である。

第５表 （２）　　参考例１の■（２）と同様にして、上記■で
得たＩＬ−１α誘導体のＮ末端域アミノ酸分析を分析し
た。

その結果、Ｎ末端域１５個のアミノ酸配列は以下の通り
であった。

Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｉ　１ｅ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ
−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ以上のことより、得られた誘
導体は前記式（α）で表わされるＩＬ−１αのアミノ酸
配列の１−１５位アミノ酸配列が欠失されていることが
確認された。

参考例　５ ｒＬ−１β誘導体［２４−１５３コの製造■　発現プラ
スミドの作製 ヒトｒＬ−１βをコードする遺伝子を保有するプラスミ
ドｐｔｒｐＧ　Ｉ　Ｆ−α　〔ヨーロッパ特許公開：　
ＥＰＯ１８７９９１号参照、これで形質転換サレタ大腸
菌ハ「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ｚ　１７
７６／ｐ　ｔｒｐ　Ｇ　Ｉ　Ｆ−ａ」なる名称で、１９
８５年１２月１２日に工業技術院微生物工業研究所に、
微工研条寄第９４９号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−９４９）と
して寄託されている〕を利用し、以下に示す方法に従い
、所望のポリペプチド発現プラスミドを構築した。

即ち、ｐｔｒｐＧＩＦ−ａを制限酵素ＮｄｅＩ及び５ａ
ｌＩで切断後、ＩＬ−１βの２４番目以降のアミノ酸配
列をコードしている領域を含む７８１ｂｐのＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動により単離した。このＤＮＡ
断片をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いて
、制限酵素ＮｄｅＩ及び５ａｌＩ切断部位を平滑末端と
した。

一方、５’−ＣＧＡＴＡＡＴＧ−３’及び５′−ＣＡＴ
ＴＡＴ−３’の５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼによりリン酸化し、これを先の平滑末端にしたＤＮＡ
断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、制限酵素Ｃ
１ａＩ及びＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳
動を行ない５１０ｂｐのＤＮＡ断片を単離精製した。

また、プラスミドｐＴＭ１を制限酵素Ｃ１ａＩ及びＢａ
ｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動を行なって、
ｔｒｐプロモーターを含む約４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片
を単離精製した。このＤＮＡ断片と、先で得られた５　
１　Ｑｂｐ（７）Ｃ１ａＩ　　ＢａｍＨＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ
断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、エシェ
リヒア・コリＨＢ１０１にトランスフオームさせ、目的
のトランスフォーマントを、ボイリング法（ｂｏｉｌｉ
ｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）　ニより得られるプラスミドＤＮ
Ａの制限酵素分析により選択した（Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ａｎｄ　
　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　　ｐｐ　３６
６、　　（１９Ｂ２）　　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　。

■　形質転換体の培養 上記形質転換体（Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１／ｐ　
ｔｒｐＧＩ）；”α−２４−４５３）を、アンピシリン
５０μｇ／　ｙｔｌｌ及びＬ−１リプ外ファン２０μｇ
／ｌ／を含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母
エキス及び０．５％ＮａＣＡ’）１０ｚＡ’中で、３７
°Ｃで一晩振盪培養し、この１７Ａ’をアンピシリン５
０μｇ／ｌｌ及び１％カザミノ酸を含むＭ９最小培地［
０，６％Ｎａ２Ｈ［’Ｏｔ　）　Ｏ−３％ＫｔｈＰＯｔ
、０．０５％ＮａＣ１，０，１％Ｎ１１ｔ　ＣＩ　、　
２　ｍ　Ｍ　Ｍｇ５Ｏ＋、０．２％グルコース及び０．
１ｍＭ　ＣａＣｈｌ　５０ｙ／に植菌し、３７°Ｃで振
盪培養し、５５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）が１．０とな
った時点で菌体を集め、１５％シュークロース−５０ｍ
Ｍ）リスＨＣＩ（ｐＨ８，０）−５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ
　（ｐＨ８，０）の溶液５７Ａ’に懸濁させ、１０　ｍ
ｇ／　ｙｌｌ　ＩＪゾチーム［１０ｍＭ）リスＨＣＩ　
（ｐＨ８）で溶解した溶液］　５００μｌを加え、更に
０．３％トリトンＸ１００−１８７．５ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ　（ｐＨ８，０）−１５０ｍＭトリスＨＣＡ’　　（
ｐＨ８，０）の溶液５　ｚｌｌを加え、室温で１５分間
放置後、更によく懸濁させ、遠心分離によってＧＩＦ活
性を有する菌体抽出物上清を得た。

■　ＩＬ−１β誘導体の精製及び同定 参考例１の■及び■と同様にして、クロマトグラフィー
操作を行なって精製し、得られる濃縮精製品につき等電
点、アミノ酸組成及びアミノ酸配列を求め、これが前記
式（Ｂ）で表わされるＩＬ−１βのアミノ酸配列の２４
番目から１５３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドであることを確認した。

参考例　６ ！Ｌ−１β誘導体［１−８２］の製造 ■　発現プラスミドの作製 参考例５に示したｐｔｒｐＧ　Ｉ　Ｆ−αを、制限酵素
ＰｖｕｌＩで切断後、ＩＬ−１βの１番目から８２番目
までのアミノ酸配列をコードしている領域を含む約２．
ｇｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により
単離精製した。

一方、Ｘｂａ　Ｉリンカ−［５’　　−ＣＴＣＴＡＧＡ
Ｇ−３′］の５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
によりリン酸化し、これを上記で得られたＤＮＡ断片に
Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを用いて連結後、制限
酵素Ｃ１ａＩ及びＸｂａ　Ｉで切断し、アガロースゲル
電気泳動を行ない２５０ｂｐのＤＮＡ断片を単離精製し
た。

また、プラスミドｐＴＭ１を制限酵素ＢａｍＨＩで切断
後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ断片）を用いて、
制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を平滑末端とした。続いて
このＤＮＡ断片にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより
リン酸化したＸｂａ　Ｉリンカ［５’　　−ＣＴＣＴＡ
ＧＡＧ−３’　　コ　をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結後、制限酵素Ｃ１ａＩ及びＸｂａＩで切断し、ｔｒｐ
プロモーター等を含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気
泳動により単離精製した。

このＤＮＡ断片と、先で得られた２５０ｂｐのＤＮＡ断
片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、エシェリ
ヒア・コリＨＢ　１０１にトランスフオームさせ、目的
のトランスフォーマントを、ボイリング法により得られ
るプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択した。

■　形質転換体の培養 上記形質転換体を参考例５と同様にして培養、処理して
、ＧＩＦ活性を有する菌体抽出物上清を得た。

■　ＩＬ−１β誘導体の精製及び同定 参考例５の■と同様にして精製し、得られる濃縮精製品
につき等電点、アミノ酸組成及びアミノ酸配列を求め、
これが前記式（Ｂ）で表わされるＩＬ−１βのアミノ酸
配列の１番目から８２番目のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドであることを確認した。

実施例　１　　血小板減少症治療剤の調製参考例２で得
られたポリペプチド［Ｉ　Ｌ−１α・Δ（１−１４）　
・３６Ｄ・１４１　Ｓ］の生理活性食塩水（ＧＩＦ活性
としてｌＸ１０６単位／１１１りに、ヒト血清アルブミ
ン（ＨＳ　Ａ）を０．５％となるように添加して、濾過
（０，２２μｍメンブランフィルタ−使用）後、これを
無菌的に１１１Ｉずつバイアル瓶に分注して、凍結乾燥
し、注射用製剤を調整した。

かくして得られた製剤は、これを用時注射用蒸留水１　
ｚｌに溶解して利用される。

実施例　２　　薬理効果試験Ｉ（増血作用試験）この例
は、本発明血小板減少症治療剤有効成分化合物の薬理効
果を試験したものである。

この試験に用いたポリペプチドは以下の通りである。

０１Ｌ−１α［３６Ｄ・１４１Ｓ］ （ヨーロッパ特許公開第２３７０７３号参照）０１Ｌ−
１ａ　［Δ（１−１４）　・３６Ｄ・１４１Ｓ］ＩＬ−
１αの１−１４位アミノ酸配列を欠失させ、３６位Ａｓ
ｎをＡｓｐに、１４１位ＣｙｓをＳｅｐにそれぞれ置換
したＩＬ−１α誘導体〔参考例２で得たもの〕 、　ＩＬ−１α［１６Ｇ・３６Ｄ・＋４１３］ＩＬ−１
αの１６位ＡｒｇをＧｌｙニ、３６位ＡｓｎをＡｓｐニ
、１４１位ＣｙｓをＳｅｒ　ニそれぞれ置換したＩＬ−
１α誘導体〔参考例１で得たもの〕０■Ｌ−１β［天然
型ＩＬ−１β］ （Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ
ｏｍｍｕｎ、、１４７　（１）。

３１５−３２１　（１９８７）参照） また、この試験には静岡系実験動物農業協同組合より購
入した９週齢の雄性Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを用
いた。

上記有効成分としてのポリペプチドは、之等をそれぞれ
マウス血清アルブミン１００μｇ　／　Ｉｌｌ含有注射
用生理食塩水［大板製薬工場社製］にて所定濃度に希釈
して用いた。

試験開始日（０日）に、実験用小動物Ｘ線照射装置（日
立ＭＢＲ−１５０５Ｒ）を用いて、マウスに４　Ｑ　Ｑ
　ＲａｄのＸ線を全身照射して放射線による血小板減少
症を誘発させた。

その翌日より各供試試薬を連日１３回皮下投与した。１
４日目に、マウスをエーテル麻酔し、開腹後に工大静脈
より採血し、マイクロティナ＝［ベクトンディッキンソ
ン（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）社製］に血液
を採取した。血球は自動血球分析装置（オルソＥＬＴ−
８）により分析した。

尚、実験は１群５匹のマウスを用いて行なった。

上記試験において、各供試試薬の各種投与量における１
４日目の血小板数（平均値上ＳＥ。

１０３７ｍｍ３　）の結果を下記第６表に示す。

第　　６　　表 尚、有意差検定は、溶媒投与群の値を対照としてスチュ
ーデンツＴテストにより行なった。※はｐ≦０．００１
を示す。

上記第６表より、無処置正常群の血小板数は１１６４±
１０であるのに対し、溶媒投与群では４４７±５２まで
血小板数が減少しているが、本発明有効成分（ＩＬ−１
及びそれらの誘導体）の投与群では、０，１μｇ／ｋｇ
の投与量から用量に依存して明白な血小板数の増加が認
められ、従って之等が血小板減少症の治療に有効である
ことが判る。

実施例　３　　薬理効果試験（造血作用試験）下記ＩＬ
−１の誘導体を用いて実施例２と同一の薬理試験を実施
した。

０１Ｌ−１α　［天然型コ ｏＩＬ−１α［３６Ｄ・１４１Ｓ］ ｏ１１．−１７＋　［Δ（１−１５）］（参考例３で得
たｒＬ−１α誘導体） ０ＩＬ−１ａ［Δ（１−１５）　・３６Ｄ］（参考例３
で得たＩＬ−１α誘導体） ０１Ｌ−１α［Δ（１−１５）・３６Ｄ・１４１Ｓ］（
参考例４で得たＩＬ−１α誘導体） ０、ＩＬ−１ａ［Δ（１−１４）　・３６Ｄ・＋４１Ｓ
］（参考例２で得たＩＬ−１α誘導体） 上記試験において、各供試試薬の各種投与量における１
４日目の血小板数（平均値±ＳＥ。

×ｌ　Ｑ　３７ｍｍ３　）の結果を下記第７表に、また
好中球数（平均値±ＳＥ、×１０３／ｍｍ３）の結果を
下記第８表にそれぞれ示す。

第 表 実施例　４　　生物活性試験 ＩＬ−１の誘導体のＧＩＦ活性を求めた結果を下記第９
表に示す。

第　　９　　表 尚、 表中ＳＡは比活性をＲＡは相対活性を示す。

実施例　５　　発熱性抑制試験 ＩＬ−１の誘導体の発熱性を試験するため、ラットを用
いた以下の実験を行なった。

実験に用いたラットは６〜１０週齢の雄性ＳＤクラット
体重１６０〜２５０ｇ）（日本チャールスリバー社）で
ある。

ＩＬ−１誘導体は、それぞれ１００μｇ　／　ｙｔｌｌ
のラット血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水に
て適当濃度に希釈して供試液とした。また、対照として
はヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）を使用した。

上記供試液及び対照液の所定量を、予め体重測定したラ
ットに皮下投与し、投与直前並びに２．４及び６時間後
にそれぞれラットの直腸体温を、サーミスター温度集録
装置に９２３（宝工業株式会社製）により測定した。

供試物質として、各参考例で得られた本発明誘導体並び
に比較のためのＩＬ−１β〔天然型、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１４７　　
（１）、３１５−３２１　（１９Ｂ？）　）及びＩＬ−
１α誘導体（Ｉ　Ｌ−１α［３６Ｄ・１４１Ｓコ、前記
式（Ａ）の３６番目のアミノ酸（Ａｓｎ　）をＡｓｐに
、１４１４１番目ミノ酸（Ｃｙｓ　）をＳｅｔに置換し
たもの、ヨーロッパ公開特許第２３７０７３号〕のぞれ
ぞれを用いて得られた結果（直腸温度が最も上昇する供
試物質投与４時間後の結果）を第１図に示す。

第１図において、横軸は供試物質の投与量（μｇ／ｋｇ
）を、縦軸は供試液投与直前の直腸温度を基準（０）と
した該温度変化値（６℃）を示し、また図中（１）は参
考例１で得た本発明誘導体［ＩＬ−１α・１６Ｇ・１４
１　Ｓ］を、（２）は参考例２で得た本発明誘導体［Ｉ
Ｌ−１α・Δ（１−１４）　　・３６Ｄ・１４１　Ｓ］
を、（３）は天然型ＩＬ−１βを、（４）は上記ヨーロ
ッパ公開特許記載のＩＬ−１α誘導体［Ｉ　Ｌ−１α・
３６Ｄ・１４１Ｓコを、また（５）は対照とするＨ　Ｓ
　Ａをそれぞれ示す。

上記第１図より、ＩＬ−１α誘導体は、試験したいずれ
の投与量においても発熱は実質的に起こらず、発熱性が
顕著に低減されているとか明らかである。これに対して
ＩＬ−１βは、０．１μｇ／ｋｇの投与量において既に
発熱が認められ、投与量増加に従い高い発熱性が観察さ
れる。またＩＬ−１α・３６Ｄ・１４１Ｓは、０．１μ
ｇ／ｋｇ。

１μｇ／ｋｇ及び１０μｇ／ｋｇの投与量では発熱は認
められないが、１００μｇ／ｋｇの投与では発熱性がみ
られる。

また参考例２で得たＩＬ−１α誘導体（ＩＬ１α　［Δ
（１−１４）　　・３６Ｄ・１４１Ｓ〕　と共に、参考
例３で得たＩＬ−１α誘導体（ＩＬ−１α［Δ（１−１
５）］及びＩＬ−１α［Δ（１−１５）・３６Ｄ］並び
に参考例４で得たＩＬ−１α誘導体［ＩＬ−１α［Δ（
１−１５）　　・３６Ｄ・１４１Ｓ〕のそれぞれを用い
て、上記と同一試験を行なった結果を第２図に示す。

図中、（１）はＩＬ−１α［Δ（１−１５）］を、（２
）はＩＬ−１α［Δ（１−１５）　　・３６Ｄ］を、（
３）はＩＬ−１α［Δ（１−１５）３６Ｄ・１４１　Ｓ
］を、（４）はＩＬ−１α［Δ（１−１４）・３６Ｄ・
１４１　Ｓ］を（５）はＩＬ−１αを、（６）はＩＬ−
１α［３６Ｄ］を、（７）はＩＬ−１α［３６Ｄ・１４
１３１を、また（８）は［Ｓｅｒ］　■Ｌ−１β〔ヨー
ロッパ公開特許第１８７９９１号参照〕をそれぞれ示す
。

実施例　６　　ヘモボイエチンー１活性試験へモボイエ
チ：７−１　（ＨｅｍＯｐＯｌｅｔｉｎ−１）活性を、
スタンレーら（Ｓｔａｎｌｅｙ、　Ｅ、　Ｒ，ｅｔ　ａ
ｌ、）（７）方法［Ｃｅ１ｌ、　４５．６６７−６７４
　（１９８６）］に準じて行なった。

即ち、静動脈協より購入した雄性Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　
ｃマウスへ５−フルオロウラシル１５０ｍｇ／ｋｇを静
脈内投与し、３日後に大腿骨骨髄細胞（５−ＦＵ処置骨
髄細胞）を採取した。上記５−ＦＵ処置骨髄細胞１゜５
×１０５個に、一定濃度（２００Ｕ／１１）のマウスＭ
−Ｃ８Ｆと、種々の濃度のＴＬ−１α又はＩＬ−１α誘
導体を添加し、軟寒天培地中にて培養し、７日目に培地
中に形成されたコロニーを計数した。尚、マウスＭ−Ｃ
３ＦはＬｃｅｌｌ培養上清より調製した。

得られた結果を第１０表に示す。

第　　１０　表 実施例　７　　臨床試験例 胃癌で肝、頚部リンパ節転移の認められるステージ２、
ＰＳ３の４１才の女性にＩＬ−１β誘導体［前記式（Ｂ
）の７１位ＣｙｓをにＳｅｒに置換したちの］のｌＸ１
０４単位（ＧＩＦ単位）を、毎日１回、皮下投与し、そ
の血液像を調べた。

その結果を下記第１１表に示す。

第１１表 第１１表に示す通り、投与１週間後より血小板数は増加
し、投与３週間後には投与前値の１．７倍にまで増加し
た。また白血球数も投与前値より１．８倍に増加した。

かくして、血小板数及び白血球数減少の改善効果が認め
られた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、ＩＬ−１誘導体の発熱性を調べた
結果を示すグラフである。 （以　上） 投与量（、ｕｇ／ｋｇ） 第 図 投与量（、ｕｇ／ｋｇ　）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）インターロイキン−１及びその誘導体から選ばれ
   る少なくとも１種を有効成分として含有する血小板減少
   症治療剤。