JP2572220B2 - インターロイキンー１α誘導体遺伝子 - Google Patents

インターロイキンー１α誘導体遺伝子

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新しいポリペプチド、更に詳しくはインタ
ーロイキン１α（IL−１α）の新しい誘導体をコードす
る遺伝に関する。
従来の技術 第２回国際リンホカインワークシヨツプにおいて、か
ってリンパ球活性化因子（Lymphocyte Activating Fact
or;LAF）、マイトジエニツク プロテイン（Mitogenic
Protein）、ヘルパーピーク−１（Helper peak−１）、
Ｔリンパ球代替因子〔Ｔ−cell replacing factor III
（TRF−III）、Ｔ−cell replacing factor Mφ（TR
FM）〕、Ｂセルアクチベーテイング フアクター（Ｂ−
cell activating factor）、Ｂリンパ球文化因子（Ｂ−
cell differentiation factor）などの呼称で報告され
てきた生理活性物質は、いずれもインターロイキン−１
（IL−１）なる呼称に統一されることが決定された〔Ce
llular Immunol.,48,433−436（1979）〕。この決定
は、上記各生理活性物質は物質として区別できず生理活
性を異なる角度から把えて表現しているにすぎないとの
理由に基づいている。
上記IL−１は、更に例えばＴリンパ球やＢリンパ球を
活性化し、インターロイキン２の産生亢進作用や抗体産
生を亢進させる作用を有し、また肝細胞に作用して蛋白
質合成を亢進させる作用、プロスタグランデイン産生を
亢進させる作用等を有することも報告されている〔Revi
ews of Infectious Disease,Vol.6,No.1,51−59（198
4）、NewEngland J.of Med.,311,1413（1984）等参
照〕。
しかして、物質としてのIL−１の本体に関しては現在
尚不明ではあるが、最近になってLAF活性を有するポリ
ペプチドもしくはその前駆体をコードする遺伝子の存在
がようやく報告された〔Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.81,7
907−7911（1984）、Nature,Vol.315,641（1985）、Nuc
leic Acid Research,Vol.13,（16）,5869（1985）〕。
上記によれば、遺伝子組換え技術に従って得られた培
養上清のLAF活性の確認より、下式（Ａ）で表わされる
ポリペプチドをLAF活性を有するポリペプチドであると
推定し、これを「IL−１α」と称している。
しかしながら、上記活性物質は勿論のこと、従来より
所謂IL−１として報告されている生理活性物質について
も、之等が均質な物質として製造単離された報告例はな
く、勿論かかる均質な物質の有する生理活性についての
報告も皆無である。
発明が解決しようとする問題点 本発明者らは、従来より、均質な物質としてのIL−１
αについ鋭意研究を重ねた結果、既にその製造技術を確
立すると共にその物質としての特性、その有する生理活
性等をも明らかにした。この研究結果に伴い、本発明者
らはまた上記式（Ａ）で表わされるポリペプチドがLAF
活性を有する事実をも確認した。
しかしながら、該ポリペプチドは、前記報告の通り、
生体の遺伝子に対応するものであるにも拘わらず、驚く
べきことに、物質としては不安定であることを見出し
た。
本発明の目的は、従って、上記式（Ａ）で表わされる
ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列を異にし、物質と
してより安定で、しかも医薬用途に好適な特性を有する
新しいポリペプチド（IL−１α誘導体）、これをコード
する遺伝子及びこれを用いて遺伝子工学的手法で上記IL
−１α誘導体であるポリペプチドを製造する方法を提供
することにある。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、式（Ａ） で表わされるIL−１αのアミノ酸配列において、36位As
n及び141位Cysの少なくとも１つのアミノ酸が欠失され
ているか又は他のアミノ酸で置換されていることにより
特徴付けられる改変されたアミノ酸配列をコードするIL
−１α誘導体（ポリペプチド）をコードする遺伝子が提
供される。
上記及び以下の本明細書におけるアミノ酸及びポリペ
プチドの表示は、IUPAC及びIUPAC−IUBによる命名法又
は規則における略号乃至当該分野で慣用されている略号
によるアミノ酸残基の表示法に従うものとし、塩基配列
における核酸の表示も同様とする。
上記ポリペプチド（以下、「本発明ポリペプチド」と
いう）は、例えばLAF活性、腫瘍細胞増殖抑制活性、即
ち腫瘍細胞に対して特異的にその増殖を抑制する活性、
CSF（Colony stimulating factor;コロニー刺激因
子）、インターフエロン（IFN）、インターロイキン−
２（IL−２）、インターロイキン−３（IL−３）等の種
々のサイトカイン類産生促進活性、即ち例えばヒト細胞
に作用してそれらサイトカイン類の産生を著しく促進さ
せる活性、抗炎症活性、特に例えば関節炎モデル動物に
投与することによって関節炎の進行を効果的に抑制する
活性、放射線障害防止作用、即ち骨髄移植時の放射線全
身照射、癌治療等における放射線照射、放射線事故時等
における生体障害乃至は重篤な副作用等を予防する作用
乃至防止する作用等を有する。従ってこれは例えば抗体
産生促進やワクチンの効果増強等の等の免疫系刺激剤、
抗腫瘍剤、CSF、IL−２、IL−３等のサイトカイン産生
促進剤、抗炎症剤、放射線障害防止剤等の医薬品として
有用である。殊に本発明のポリペプチドは、物質として
極めて安定である特徴を有し、しかも毒性も低く、之等
の点でも上記医薬品として好適である。又、IL−１は、
発熱性を有することが知られているが、本発明ポリペプ
チドは、かかる副作用がより少ない点においても優れて
いる。
本発明ポリペプチドは、例えばこれをCSF産生促進剤
として、ヒトに投与するときには、ウイルス感染や抗原
抗体反応等の危険性を生じることなく、癌化学療法や放
射線療法後の骨髄引形成による顆粒球減少を有効に回復
できる（顆粒減少治療薬）。また上記本発明ポリペプチ
ドを利用したCSF産生促進剤は、その本来のCSF産生促進
作用により、CSFの作用に基づく各種疾病の予防及び治
療剤としても有効に利用できる。例えば、CSFは顆粒球
やマクロフアージの機能を促進させる作用がある〔ロペ
ツツら（Lopez,A.F.el al.）,J.Immunol.,131,2983（19
83）、ハンダムら（Handam,E.et al.），同122,1134（1
979）及びバダスら（Vadas,M.Y.et al.），同130,795
（1983）〕ので、種々の感染症の予防及び治療薬として
臨床応用が期待されており、上記CSF産生促進剤も同様
に臨床応用が期待できる。
殊に、近年生体防御能が定価乃至障害された個体（co
mpromised host）に、それまで無害であった病原体が病
原性を発揮して惹起される、いわゆる日和見感染症（op
portunistic infection或いはterminal infection）
は、臨床的に問題となる病原体（起炎菌）が、シュード
モナス（Pseudomonas）、セラティア（Serratia）等の
グラム陰性桿菌、ヘルペス（Herpes simplex,HSV）、バ
リセラ−ゾースタ（Varicellazoster,VZV）、サイトメ
ガロウイルス（Cytomegalovirus,CMV）等のウイルス、
キャンディダ（Candida aldicans）、アスペルギルス
（Aspergillus fumigatus）、ノカルディア（Nocardia
asteroidea）等の真菌、カリニ原虫（Pneumocystis car
inii）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）等の原
虫等であり、現用の抗生物質は、之等の病原菌に対して
充分な効果を奏し難く、該日和見感染症に対する新しい
薬剤の研究開発が切望されている。本発明ポリペプチド
は、かかる日和見感染症の予防及び治療剤としても有効
であり、特にかかる日和見感染症が高頻度に見られる抗
癌剤投与時、即ち急性白血病の化学療法や骨髄多植時等
における各種の感染症、例えばガンジダ症、クリプトコ
ックス症、アスペルギルス症、接合菌症、黒色真菌感染
症、ウイルス感染症、サイトメガロウイルス肺炎、之等
の合併症等の予防及び治療剤として有用なものである。
また本発明ポリペプチドを有効成分とする抗炎症剤
は、関節炎等の予防及び治療剤として有効である。
更に、本発明ポリペプチドは、後記実施例に記載した
方法により測定される腫瘍細胞増殖抑制活性（以下これ
を「GIF活性」という）を有しており、種々の腫瘍細胞
に対して特異的にこれらの増殖を抑制する作用を発揮す
る。従って、これを有効成分とする抗腫瘍剤は、癌の化
学療法剤として、特に各種抗悪性腫瘍剤との併用による
寛解強化療法、寛解維持療法に有利に用いられる。
更に本発明ポリペプチドは、上記医薬用途以外に、そ
のサイトカイン産生促進活性に基づいて、例えば細胞株
からの各種有用サイトカインのインビトロ（in vitro）
製造に際して極めて有効に使用し得る。かかる細胞株か
らの天然型サイトカインの製造は、ことに糖蛋白質であ
るサイトカインにおいて着目されており、効率的にかつ
大量に有用サイトカンインを収得することができる。
また本発明者の研究によれば、IL−１α自身の新しい
生理活性が見い出された。
即ち、IL−１αは、GIF活性及びCSF産生促進活性を有
し、かかる生理活性に基づく上記の各種医薬用途に用い
ることができる。
本発明のIL−１α誘導体においては、前記式（Ａ）で
表わされるIL−１αの36位Asnが少なくとも欠失もしく
は他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドがより好ましい。置換を行い得る他のアミノ酸
としては、人体蛋白質を構成するα−アミノ酸であれば
いずれでもよいが、Cysは、そのSH基に基づいて分子間
結合を形成することがあり、これを考慮すれば、該アミ
ノ酸はCys以外の上記アミノ酸であるのが好ましい。特
に好ましいものとしては、例えば、36位Asnの場合はAsp
を、141位Cysの場合は、Serをそれぞれ例示することが
できる。
本発明ポリペプチドは、例えば遺伝子工学的手法によ
り製造することができる。即ち、前記本発明に係る特定
のポリペプチドをコードする遺伝子を利用し、これを微
生物のベクターに組込んで該微生物細胞内で複製、転
写、翻訳させることによって製造することができる。こ
の方法は、特に大量生産が可能である点より有利であ
る。
上記方法において用いられる遺伝子は、通常の方法、
例えばホスファイト トリエステル法（ネイチャー（Na
ture），310,105（1984）〕等の常法に従って、核酸の
化学合成により全合成することもできるが、IL−１αも
しくはその前駆体をコードする遺伝子を利用するのが簡
便であり、該遺伝子より、上記化学合成手段を含む常法
に従って、前記特性のアミノ酸配列をコードする核酸配
列に改変することにより容易に製造できる。
IL−１α又はその前駆体をコードする遺伝子は、公知
（記述）であり、我々も該遺伝子を得、これを用いて遺
伝子工学的手法でIL−１αを収得した。之等の一連の方
法は後記参考例において明らかにする。
上記遺伝子の改変操作は目的とするポリペプチドのア
ミノ酸配列に応じて公知方法に従い実施され得る（遺伝
子工学的手法としては、例えば、Molecular Cloning,Co
ld Spring Harbor Laboratory（1982）が参照され
る）。例えば、DNAの切断、結合、リン酸化等を目的と
する、制限酵素、DNAリガーゼ、ポリヌクレオチドキナ
ーゼ、DNAポリメラーゼ等の各種酵素処理等の常套手段
が採用でき、それらの酵素は市販品として容易に入手で
きる。之等各操作における遺伝子乃至核酸の単離、精製
も常法、例えばアガロース電気泳動法等に従えばよい。
また得られる遺伝子の複製は、一部後述するように通常
のベクターを利用する方法に従えばよい。また所望のア
ミノ酸配列をコードするDNA断片や合成リンカーは、上
記した化学合成により容易に製造できる。
尚、上記において所望のアミノ酸に対応するコドン自
体は公知であり、またその選択は任意でよく、例えば利
用する宿主のコドン使用頻度等を考慮した常法に従えば
よい〔Nucl.Acids,Res.,9、43−74（1981）〕。またこ
れらの核酸配列のコドンを一部改変する操作には、例え
ば常法どおり、15〜30マー程度の所望の改変をコードす
る合成ヌクレオチドからなるプライマーを用いたサイト
−スペシフイツク ミユータジエネシス（Site−Specif
ic Mutagenesis）〔Proc.Natl.Acad.Sci.,81,5662−566
6（1984）〕等の方法を採用することができる。
上記した方法により得られる所望の遺伝子は、例えば
マキサム−ギルバートの化学修飾法〔Maxam−Gilbert,M
eth.Enzym.,65,499−560（1980）〕やM13フアージを用
いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法〔Messing,J.and
Vieira,J.,Gene,19,269−276（1982）〕等により、その
塩基配列の決定及び確認を行なうことができる。
上記操作及び方法の具体例は、後記参照例及び実施例
に記述するが、該方法は特に限定されず、当業界におい
て周知の各種方法のいずれを採用してもよい。
かくして、本発明によれば前記した特定のアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードする新規な遺伝子も提
供される。
本発明のポリペプチドは、上記特定の遺伝子（本発明
遺伝子）を利用し、従来公知の一般的な遺伝子組換え技
術に従い製造できる。より詳細には、上記本発明遺伝子
が宿主細胞中で発現できるような組換えDNAを作成し、
これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を
培養すればよい。
ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のい
ずれをも用いることができる。該真核生物の細胞には、
脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞として
は、例えばサルの細胞であるCos細胞〔Y.Gluzman,Cell,
23,175−182（1981）〕やチャイニーズ・ハムスター卵
巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔G.Urlaub a
nd L.A.Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,77,4216−422
0（1980）〕等がよく用いられているが、之等に限定さ
れる訳ではない。脊椎動物細胞の発現ベクターとして
は、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロ
モーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部及
び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更
に必要により複製起源を保有していてもよい。該発現ベ
クターの例としてはSV40の初期プロモーターを保有する
p SV2dhfr〔S.Subramani,R.Mulligan and P.Berg.Mol.C
ell.Biol.,１（９）,854−864〕等を例示できるが、こ
れに限定されない。
また真核微生物としては酵母が一般によく用いられて
おり、その中でもサツカロミセス属酵母が有利に利用で
きる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、
例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーター
を持つp AM82〔A.Miyanohara et al,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA,80,1−５（1983）〕等を好ましく利用できる。
原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によ
く用いられている。本発明では例えば該宿主菌中で複製
可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に本
発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモ
ーター及びSD（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配
列、更に蛋白合成開始に必要なATGを付与した発現プラ
スミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸菌として
は、エシエリヒア・コリ（Escherichia cali）K12株等
がよく用いられ、ベクターとしては一般にp BR322がよ
く用いられるが、これに限定されず、公知の各種の菌側
及びベクターがいずれも利用できる。プロモーターとし
ては、例えばトリプトフアン・プロモーター、PLプロモ
ーター、lacプロモーター、lppプロモーター等を使用す
ることができ、いずれの場合にも本発明遺伝子を発現さ
せることができる。
トリプトフアン・プロモーターを用いる場合を例にと
り詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトフアン・プ
ロモーター及びSD配列を持つベクターpTM1〔今本文男、
代謝、Vol.22,289（1985）〕を使用し、SD配列の下流に
存在する制限酵素Cla I部位に、必要に応じてATGを付与
した所望のポリペプチドをコードする遺伝子を連結させ
ればよい。
尚、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラクトンダー
ゼやβ−ラクタマーゼ等を利用する融合蛋白質発現系に
よることもできる。
かくして得られる発現ベクターの宿主細胞への導入及
びこれによる形質転換の方法としては、一般に用いられ
ている方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集
め、CaCl2処理して自然にDNAを取り込みやすい状態にし
て、ベクターを取込ませる方法等を採用できる。上記方
法においては、通常知られているように形質転換の効率
を一層向上させるためにMgCl2やRbClを更に共存させる
こともできる。また、宿主細胞をスフエロプラスト又は
プロトプラスト化してから形質転換させる方法も採用す
ることができる。
かくして得られる所望の形質転換株は、常法に従い培
養することができ、該培養により、所望のポリペプチド
が生産、蓄積される。該培養に用いられる培地として
は、通常の細胞培養に慣用される各種の培地のいずれで
もよく、その具体例としては、例えばＬ培地、Ｅ培地、
M9培地等及び之等に通常知られている各種の炭素源、窒
素源、無機塩、ビタミン類等を添加した培地を例示でき
る。尚、上記トリプトフアン・プロモーターを用いた場
合には、一般にプロモーターが働くようにするためにカ
ザミノ酸を添加した、例えばM9最小培地を用いて培養す
ることができ、該培地中には培養の適当な時期にインド
ールアクリル酸等のトリプトフアン・プロモーターの働
きを強めるための薬剤を添加することもできる。
このようにして得られる活性物質を含有する培養物か
らの目的ポリペプチド、即ち本発明ポリペプチドの精
製、単離は常法に従って行なうことができる。尚、本発
明ポリペプチドを宿主から抽出するに当っては、例えば
浸透圧シヨツク法等の温和な条件を採用するのが、その
高次構造保持の面からより好ましい。
上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチドの物理、
化学的性質を利用した各種の処理操作に従い実施するこ
とができる〔例えば「生化学データーブツクII」pp1175
〜1259、第１版第１印刷、1980年６月23日、株式会社東
京化学同人発行参照〕。該方法としては、具体的には例
えば通常の蛋白沈澱剤による処理、限外過、分子ふる
いクロマトグラフイー（ゲル過）、液体クロマトグラ
フイー、遠心分離、電気泳動、アフイニテイクロマトグ
ラフイー、透析法、之等の組合せ等を採用できる。
より具体的には、上記操作は、例えば以下のごとくし
て実施できる。即ち、まず培養上清より予め目的とする
ポリペプチドを部分精製する。この部分精製は、例えば
アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ジ
メチルホルムアミド（DMF）等の有利溶媒や酢酸、過塩
素酸（PCA）、トリクロロ酢酸（TCA）等の酸を蛋白沈澱
剤として用いる処理、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウ
ム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理及び／又
は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外過処理
により行なわれる。之等の各処理の操作及び条件は、通
常のこの種方法のそれらと同様のものとすればよい。
次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル過に付すこ
とにより目的物質の活性が認められる画分を収得する。
ここで用いられるゲル過剤としては、特に限定はな
く、例えばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲ
ル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロース
ゲル、セルロース等を素材とするものをいずれも利用で
きる。之等の具体例としては、セフアデツクスＧタイ
プ、同LHタイプ、セフアロースタイプ、セフアクリルタ
イプ（以上、フアルマシア社）、セルロフアイン（チツ
ソ（株））、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオ
−ラド社）、ウルトロゲル（KLB社）、TSK−Ｇタイプ
（東洋曹達（株））等の市販品を例示できる。
目的とするポリペプチドは、上記ゲル過により得ら
れる活性画分を、例えばハイドロキシアパタイトカラム
を用いたアフイニテイークロマトグラフイー、DEAE法、
CM法、FP法等のイオン交換カラムクロマトグラフイー、
クロマトフオーカシング法、逆相高速液体クロマトグラ
フイー等に付すことにより、又は之等各操作の組合せに
より更に精製でき、均質な物質として単離できる。
上記クロマトフオーカシング法は、公知の各種方法に
より実施できる。カラムとしては、例えばPBE94（フア
ルマシア社製）等を、開始緩衝液としては、例えばイミ
ダゾール−塩酸等を、また溶出液としては、例えばポリ
バツフアー74（フアルマシア社製）−塩酸pH4.0）等を
使用できる。
上記逆相高速液体クロマトグラフイーは、例えばC4ハ
イポアー逆相HPLCカラム（バイオ−ラド社（Bio−Rad L
aboratories））等を用いて、移動剤としてアセトニト
リル、トリフルオロ酢酸（TFA）、水等及び之等の混合
溶媒を用いて実施できる。かくして本発明のポリペプチ
ドを単離、収得できる。
又、IL−１αをコードする遺伝子から上記と同様にし
てIL−１αを収得できる。
得られる本発明ポリペプチド又はIL−１αは、これを
有効成分として、前述した各種の医薬用途に有用な医薬
製剤とすることができる。該医薬製剤は、通常本発明ポ
リペプチド又はIL−１αと共に適当な医薬製剤担体を配
合して製剤組成物の形態に調製される。該製剤担体とし
ては使用形態に応じた製剤を調製するのに通常慣用され
る充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性
剤等の賦形剤乃至は希釈剤をいずれも使用できる。製剤
組成物の形態は、これが本発明ポリペプチド又はIL−１
αを効果的に含有する状態であれば、特に限定はなく、
例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤であつても
よいが、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態とする
のが好適である。またこれは使用前に適当な担体の添加
によって液状となし得る乾燥品とすることもできる。之
等製剤組成物はいずれも常法に従い調製され得る。
得られる医薬製剤は、該製剤組成の形態に応じた適当
な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、
筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により投与され、固
剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与され得る。医
薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与量は、該製剤
の投与方法、投与形態、使用目的、之を適用される患者
の症状等に応じて適宜選択され、一定ではないが、通常
有効成分を約１〜80重量％程度含有する製剤形態に調製
して、この製剤をこれに含有される有効成分量が一日成
人一人当り約0.1μｇ〜10mg程度となる範囲で投与する
のが望ましい。該投与は、一日１回である必要はなく一
日３〜４回に分けることもできる。
以下、参照例及び実施例を挙げて本発明を更に詳しく
説明する。
尚、以下の例において各種生理活性は、次の方法によ
り測定した。
〈活性の測定〉 （１）IL−１活性の測定 オツペンハインら（J.J.Oppenhein et al）の方法
〔J.Immunol.,116,1466（1976）〕に従い、C3H/HeJ系マ
ウスの胸腺細胞を利用して測定したLAF活性により表示
した。
（２）GIF活性の測定 96ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した供試液0.1mlを入れ、次に各ウエルにヒ
トメラノーマ細胞A375を２×10+個/mlの濃度で含有する
10％FCSを含むイーグルスMEM浮遊液0.1mlを加え、炭酸
ガス培養器（ナフコ社製）内で４日培養する。培養終了
後、0.05％ニユウトラルレツド（和光純薬社製）0.05ml
を各ウエルに加え、37℃で２時間培養する。上澄液を除
去した後、リン酸緩衝生理食塩水0.3mlを各ウエルに静
かに加えてウエルを洗浄する。洗浄液を除去した後、各
ウエルにリン酸１ナトリウム−エタノール等量混合液0.
1mlを加え、マイクロミキサーで数分間振盪し、細胞内
に取込まれた色素量を、96ウエル−マイクロタイトレー
シヨンプレート用光度計（タイターチエツクマルチスキ
ヤン、フロウラボラトリーズ社製）を用いて、吸光度54
0nmにて測定し、増殖抑制活性を求める。対照群（コン
トロール群）の細胞増殖の50％抑制を示す試験群、即ち
対照群の吸光度測定値の1/2の吸光度測定値を示す試験
群、の希釈率の逆数をとり、これをGIF活性単位とす
る。従つて例えばこのGIF活性が10単位の場合、この供
試液は10倍希釈してもなお細胞増殖を50％抑制する活性
を有する。
参考例１ U937細胞の培養 ヒトリンパ組織球腫U937細胞（Ascenso,J.L.et al.,B
lood,Vol.57,p170（1981）〕1.4×109個を、12−Ｏ−テ
トラデカノイルホルボール−13−アセテート（TPA）
（フアルマシア社製）25ng/ml、コンカナバリンＡ（Con
A）（シグマ社製）10μg/ml及び10％牛胎児血清（FCS）
を含むRPM1−1640培地に入れて、４×105個/mlの濃度の
細胞浮遊液を調製した。
この細胞浮遊液10mlずつを、直径9cのシヤーレ（フア
ルコン3003）に分注し、５％炭酸ガス中、37℃で３日間
培養後、培養上清をアスピレーターにて除去し、10％FC
S、細菌リポポリサツカライド（LPS）（デイフコ社製）
10μg/ml、ムラミルジペプチド（MDP）（和光純薬社
製）１μg/ml及びTPA1ng/mlを含むRPM1−1640培地10ml
を、各シヤーレに分注した。この培地にて５％炭酸ガス
中、37℃で18時間培養し、シヤーレ底部に付着したU937
細胞をmRNA調製用の材料として利用した。
mRNAの調製 RNAの抽出は、グアニジニウム／熱フエノール（guani
dium/hot phenol）法〔Feramisco,J.R,et al.,J.Biol.C
hem.,Vol.257,p11024（1982）〕とグアニジニウム／セ
シウムクロライド（guanidinium/cesium chloride）法
〔Vlisin,V.et al.,Biochemistry,Vol.13,p2633（197
4）〕との組合せにより行なった。
上記で培養したU937細胞を洗浄するために、培養上
清を除去した後、各シヤーレを5mlのPBS（−）溶液にて
すすぎ、その後、各シヤーレに1mlの4M−グラニジン・
イソチオシアネート混合液〔4M−グアニジンイソチオシ
アネート（Fluka社製）、50mMトリスHCl（pH7.6）、10m
M EDTA、２％ラウロイリルザルコシン酸ナトリウム〕を
添加し、細胞を溶解させた。溶解液をラバーポリスマン
とパスツールピペツトにて回収して、細胞溶解液を420m
lを得た。この溶解液を60℃に保ち、18G注射針に通過さ
せることにより、染色体DNAをせん断し、その後60℃に
保温したフエノールを等量加え、18G注射針にて更に溶
液を混合し、せん断した。次いでこの混合液に0.1M酢酸
ナトリウム−10mMトリスHCl（pH7.4）−1mM EDTA液210m
lとクロロホルム−イソアミルアルコール（24:1容積
比）混液420mlとを加え、60℃に保温しながら、15分間
激しく攪拌した。混合液を氷冷後、3000rpm、４℃で20
分間遠心し、水層を回収した。水層に２容のエタノール
を加え、−70℃にて一夜放置後、粗RNA沈澱を得た。該
粗RNAを、6Mグアニジン・イソチオシアナート−5mMクエ
ン酸ナトリウム（pH7.0）−0.1Mβ−メルカプトエタノ
ール−0.5％ラウロイリルザルコシン酸ナトリウム液48m
lに溶解させ、塩化セシウム19.2gを添加して溶解させ
た。次にこの混合液7mlずつを、5.7M塩化セシウム−0.1
M EDTA（pH7.5）の4mlに重層し、ベツクマンSW40Tiロー
ターにて、25℃、31500rpmで20時間遠心して、RNAを分
取した。
かくして得られたRNA量は9.7mgであつた。
次に上記で得られたRNAからmRNAを取得するために、
オリゴ（dT）−セルロース（コラボレイテイブ リサー
チ（Collaborative Research,Inc.社製）を用いて、カ
ラムクロマトグラフイーを行なった。吸着は10mMトリス
HCl（pH7.5）−0.5M NaCl−1mM EDTAにて行ない、溶出
は10mMトリスHCl（pH7.5）−1mM EDTAにて行なった。
この結果、得られたmRNAは、400μｇであつた。
cDNAライブラリーの調製 cDNAライブラリーの調製は、以下の通り、cDNAが動物
細胞において発限可能なオカヤマ−バーグ（Okayama−B
erg）法により行なった。即ち、cDNAクローニングに用
いるdT鎖の付加したベクター・プライマーは、プラスミ
ドpCDV1より、またdG鎖の付加したリンカーDNAは、プラ
スミドpL1より、各々オカヤマらの方法〔Okayama,H.and
P.Berg.,Molecular and Cellular Biology,Vol.3,p280
（1983）〕に従って調製した。
次に上記で得たmRNA15μｇを、5mMトリスHCl（pH7.
5）−0.5mM EDTA（pH7.5）水溶液20μに溶解し、65℃
で５分間、次いで37℃で５分間インキユベートした後、
反応液（全量40μ）を、50mMトリスHCl（pH8.3）、8m
M MgCl2、30mM KCl、0.3mMジチオスレイトール、2mMの
各dATP、dGTP、dCTP及びdTTP、ベクター・プライマーDN
A2.8μｇ、RNaseインヒビター（Promega Biotch社製）6
0ユニツト、逆転写酵素（バイオーラド社製）40ユニツ
トになるように調製して、37℃で１時間インキユベート
し、0.5M EDTA（pH7.5）２μ及び10％SDS2μを加え
て反応を停止させた。その後、フエノール・クロロホル
ム抽出及びクロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱と
してベクター・プライマーcDNA:mRNAを回収した。
回収されたベクター・プライマーcDNA:mRNAを、140mM
カコジル酸ナトリウム、30mMトリスHCl（pH6.8）、1mM
CaCl2、0.1mMジオチスレイトール、0.3μｇポリ
（Ａ）、66μM dCTP及び38ユニツトのターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフエラーゼ（フアルマシア社
製）からなる反応液30μ中で37℃、５分間インキユベ
ートした後、0.5M EDTA（pH7.5）1.5μ及び10％SDS1.
5μを加えて反応を停止させ、フエノール・クロロホ
ルム抽出及びクロロホルム抽出を行って、エタノール沈
澱としてオリゴdC鎖付加cDNA:mRNA−ベクター・プライ
マーを回収した。
この回収された核酸を、7mM入トリスHCl（pH7.5）、7
mM MgCl2、60mM NaCl、100μg/ml牛血清アルブミン及び
12ユニツトの制限酵素Hind III（日本ジーン社製）から
なる反応液20μ中で、37℃で90分間インキユベート
し、次いで0.5MEDTA（pH7.5）１μ及び10％SDS1μ
を加えて反応を停止させた。その後、フエノール・クロ
ロホルム抽出及びクロロホルム抽出を行い、エタノール
沈澱として、Hind III分解されたオリゴdC鎖付加cDNA:m
RNA−ベクター・プライマーを回収した。これを10mMト
リスHCl（pH7.5）−1mM EDTA（pH7.5）（TE（pH7.5））
10μに溶解させた。このうちの１μを用いて、上記
TE（pH7.5）、0.1M NaCl及びオリゴdC鎖の付加されたリ
ンカーDNA14ngからなる反応液10μ中で、65℃で２分
間インキユベートし、次いで42℃で30分間インキユベー
トした後、０℃に冷却した。
上記反応液を、更に20mMトリスHCl（pH7.5）、4mM Mg
Cl2、10mM（NH4）2SO4、0.1M KCl、50μg/ml牛血清アル
ブミン、0.1mM β−NAD（ニコチンアミド・アデニン・
ジヌクレオチド、フアルマシア社製）及び0.6μｇのエ
シエリヒア・コリDNAリガーゼ（フアルマシア社製）を
含む反応液100μとなるように調整し、12℃で一夜イ
ンキユベートした。この反応液に、dATP、dGTP、dCTP及
びdTTPの各々を40μＭになるように、またβ−NADを0.1
5mMになるようにそれぞれ加え、更にエシエリヒア・コ
リDNAリガーゼの0.4μｇ、エシエリヒア・コリDNAポリ
メラーゼＩ（ベーリンガー・マンハイム社製）の4.6ユ
ニツト及びエシエリヒア・コリRNaseH（フアルマシア社
製）の１ユニツトを加え、12℃で１時間、次いで25℃で
１時間インキユベートした。
上記で得られた反応液を用いて、エシエリヒア・コリ
HB101株を形質転換させた。エシエリヒア・コリHB101株
のコンピテント・セルとしては、ベテスダ リサーチ
ラボラトリーズ社（Bethesda Research Laboratories:B
RL）の製品を使用し、該BRL社のマニユアルに従って、
上記形質転換を行った。
かくして、約21000個からなるcDNAライブラリーが得
られた。
サルCOS−１細胞へのトランスフエクシヨン 上記で得られたcDNAライブラリーを、１グループ当
り平均70クローンのグループに分け、各グループからプ
ラスミドDNAを調整した。
プラスミドDNAは、アルカリ溶菌法（Molecular Cloni
ng−Ａ、Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labor
atory,1982,p368）に従い調製した。
かくして各グループから調製されたプラスミドDNA
を、それぞれサル培養細胞のCOS−１細胞〔Gluzman,Y.,
Cell,Vol.23,p175（1981）〕にトランフエクシヨンし
た。該トランスフエクシヨンは、DEAE−デキストラン法
によつた〔Yokota,T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,
Vol.81,p1070（1984）〕。即ち、COS−１細胞をトリプ
シン処理により、10％FCSを含むRPMI−1640培地に懸濁
させ、細胞数を１×106個/mlに調整後、10％FCSを含むR
PMI−1640培地を2ml/ウエル加えた６ウエルプレート
に、各々500μずつ分注した。一晩37℃で培養後、上
清を除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄し、10μg/
mlプラスミドDNA、0.4mg/ml DEAE−デキストラン（フア
ルマシア社製）、50mMトリスHCl（pH7.4）及び10％FCS
を含むRPMI−1640培地を1ml/ウエル加えて、4.5時間37
℃で培養した。その後、上清を除き、血清を含まない培
地で細胞を洗浄し、150μＭクロロキン（シグマ社製）
及び10％FCSを含むRPMI−1640培地を2ml/ウエル加え
て、更に37℃で３時間培養した。上清を除き、血清を含
まない培地で細胞を洗浄後、10％FCSを含むRPMI−1640
培地を3ml/ウエル加えて、37℃で72時間培養した。上清
を回収した後、10％FCSを含むRPMI−1640培地を2ml/ウ
エル加え、凍結融解を２回繰返し、細胞抽出液を回収し
た。この培養上清及び細胞抽出液について、GIF活性を
測定した。
GIF活性を示したグループを10クローン／グループの2
4グループに分け、上記と同様の操作を行ない、GIF活性
を測定し、活性を示したグループについて、更にグルー
プ内の各クローンにつき、上記と同様の操作を行なっ
て、GIF活性を示すクローンを同定した。
かくして、pcD−GIF−16及びpcD−GIF−207の２種類
のクローンを得た。
之等のクローンのGIF活性（GIF単位/ml）を第１表に
示す。
クローンの解析 プラスミドpcD−GIF−16及びpcD−GIF−207のcDNAの
制限酵素地図を第１図に示す。
また之等のcDNAの塩基配列を塩基特異的化学修飾法
〔Methods in Enzymology,Vol.65,p499（1980）〕及び
フアージM13ベクター〔Gene,Vol.19,p269（1982）〕を
使用したジデオキシ・チエーン・ターミネーシヨン〔Pr
oc.Natl.Acad.Sci.,USA,Vol.74,p5463（1977）〕により
決定した。
その結果、pcD−GIF−207の有するcDNAは、マーチら
の報告するIL−１α〔Carl J.March et al.,Nature,Vo
l.315,p641（1985）〕の翻訳領域cDNA配列と同一である
ことが確認された。
上記IL−１α前駆体蛋白質をコードするcDNAを有する
プラスミドpcD−GIF−207をエッシェリヒアコリχ1776
株に保有させた株を工業技術院微生物工業研究所に「エ
ッシェリヒア コリχ1776/pcD−GIF−207」なる名称で
微工研条寄第1294号（FERM BP1294）として寄託した。
ポリペプチドの発現及び製造 上記プラスミドpcD−GIF−207を、制限酵素Hind III
及びHinc IIにより切断した後、約0.66kbのHind III−H
inc II DNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動法に
より単離、精製した。このDNAフラグメントを更に制限
酵素Aluv Iで切断して、約0.5kbのAlu I−Hinc II DNA
フラグメントを同様にして単離した。
次に、合成オリゴヌクレオチド〔５′ CGATAATGTCAGC
ACCTTTTAG 3′及び５′ CTAAAAGGTGCTGACATTAT 3′〕の
各５′末端を、T4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン
酸化し、上記で得たAlu I−Hinc II DNAフラグメント
に、T4DNAリガーゼを用いて連結後、制限酵素Cla Iで切
断し、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付し
て、約0.54kbのCla I−Cla I DNAフラグメントを単離精
製した。
他方、プラスミドpTMI〔今本文男，代謝,Vol.22,289
（1985）〕を、制限酵素Cla Iで切断し、子牛腸アルカ
リホスホターゼ（CIAP;calf intestine alkaline phosp
hatase）で反応させた後、先に調製した約0.54kbのCla
I−Cla I DNAフラグメントと、T4DNAリガーゼで連結し
て目的のポリペプチド発現用プラスミドp trp IL−１α
−113を得た。
該プラスミドを、エシエリヒア・コリ−HB101にトラ
ンスフオームさせ、目的のトランスフオーマントを、ボ
イリング法により得られるプラスミドDNAの制限酵素に
よる切断フラグメントの大きさを解析することにより選
択した。
以上の概略を第２図に示す。
上記で得たトランスフオーマントより、プラスミドp
trp IL−１α−113を抽出し、これをエシエリヒア・コ
リW3110にトランスホームして、エシエリヒア・コリ（E
scherichia.coli）W3110/p trp IL−１α−113を得た。
実施例１ （１） 形質転換体の培養 参考例１ので得た形質転換体（エシエリヒア・コリ
W3110/p trp IL−１α−113）を、アンピシリン50μg/m
l及びＬ−トリプトフアン20μg/mlを含むLB培地（１％
トリプトン、0.5％酵母エキス及び0.5％NaCl）10ml中
で、37℃で一晩振盪培養し、この8mlを50μg/mlアンピ
シリン及び１％カザミノ酸を含むM9最小培地（0.6％Na2
HPO4、0.3％KH2PO4、0.05％NaCl、0.1％NH4Cl、2mM MgS
O4、0.2％グルコース及び0.1mM CaCl2）400ml中に植菌
し、37℃で振盪培養した。９時間後に大腸菌を1M Na2HP
O410mlに懸濁させ、一夜冷室に放置した後、10mMトリス
HCl緩衝液（pH8.0）に対して２日間透析した。
得られた透析液を遠心分離し、上清と沈澱物とに分離
した。得られた上清は28mlであり、GIF活性として7.3×
107ユニツトであった。
（２） ポリペプチドの精製 上記（１）で得た上清の2mlを、GTiウルトロクロム
ハイパフオーマンス リキツド クロマトグラフイー
システム（LKB社製）を用いたイオン交換クロマトグラ
フイー（DEAE−HPLC）により、以下の条件で精製した。
カラム:TSKゲルDEAE−5PW（7.5×75mm、東洋曹達社製） 溶離液A:20mMトリスHCl緩衝液（pH8.0） 溶離液B:0.5M NaCl含有20mMトリスHCl緩衝液（pH8.0） 流速:1ml/分 フラクシヨン容積:1ml/分／チユーブ 濃度勾配：時間（分） ％Ｂ 0 0 5 0 65 60 70 100 80 100 85 0 100 0 上記DEAE−HPLCの結果、GIF活性画分は、リテンシヨ
ンタイム26〜28分及び32.5〜34.5分の２カ所に認められ
た。以下この26〜28分の活性画分を「フラクシヨン１」
とし、32.5〜34.5分のものを「フラクシヨン２」とす
る。
上記各フラクシヨンについて、再度DEAE−HPLC及び高
速ゲルクロマトグラフイーを行なって、純粋なフラクシ
ヨン１及びフラクシヨン２のそれぞれを得た。
上記の通りGIF活性フラクシヨンが分かれて得られた
為、之等につき以下の確認試験を行った。
（３） SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 （SDS−PAGE） Laemmli,U.K.の方法〔Nature,277,680（1970）〕に従
い、上記フラクシヨン１及び２のSDS−PAGEを行なつ
た。その条件は次の通りである。
試料：上記フラクシヨン１又は２を乾固した後、ラエメ
リーのサンプルバツフアー〔1/20体積の２−メルカプト
エタノールを含む（2ME+）〕に溶解し、100℃で４分間
処理した。
ゲル：厚さ1.5mmの15％ポリアクリルアミドゲルを使用
した。
電気泳動装置：バイオ−ラド（Bio−Rad）社製プロテア
ンを用いた。
泳動条件:40mAの定電流で２時間泳動させた。
泳動後のゲルをバイオ−ラド社製シルバーステインキ
ツト（Silver stain kit）を用いて染色した。その結
果、フラクシヨン１及び２の両方とも、約18.3KDに単一
のバンドとして泳動され、いずれも遺伝子から予測され
る分子量18KDにほぼ一致した。
（４） 等電点電気泳動法（IEF） 上記フラクシヨン１及び２の等電点電気泳動を、pH範
囲3.5〜9.5のアンオフラインPAGプレート（LKB社製）及
びモデル1415（バイオ−ラド社製）を用いて行なつた。
その条件は次の通りである。
試料：上記で得たフラクシヨン１のPBS溶液で２日間放
置したもの、同２週間放置したもの、上記で得たフラク
シヨン２のPBS溶液で２週間放置したもの、対照のPBS溶
液及び以下のマーカープロテイン（pIマーカープロテイ
ン）の計５レーンを使用した。
〈マーカープロテイン〉 アミログルコシダーゼ（3.50）、 大豆トリプシンインヒビター（4.55）、 β−ラクトグロブリンＡ（5.20）、 ウシ カルボニツク アンヒドラーゼ（bovine carbo
nic anhydrase）Ｂ（5.85）、 ヒト カルボニツク アンヒドラーゼ（human carbon
ic anhydrase）Ｂ（6.55）、 ウマ ミオグロビン−アシデイツクバンド（horse my
oglobin−acidic band）（6.85）、 ウマ ミオグロビン−ベイシツクバンド（horse myog
lobin−basic band）（7.35）、 レンチル レクチン−アシデイツクバンド（lentil l
ectin−acidic band）（8.15）、 レンチル レクチン−ミドルバンド（lentil lectin
−middle band）（8.45）、 レンチル レクチン−ベイシツクバンド（lentil lec
tin−basic band）（8.65） 及び トリプシノーゲン（9.30）。
電極液：陽極液＝1M H3PO4 陰極液＝1M NaOH 泳動条件：定電力1W/cmゲル幅で90分間冷却下（10℃）
に泳動させた。
染色：染色は、シルバー ステイン キツトで行なつ
た。
上記泳動後、ゲルを1cm間隔でスライスし、蒸留水1ml
にて振盪抽出（２日）し、pHを測定し、等電点を算出し
た。
その結果、フラクシヨン２の等電点（pI）は約5.0で
あり、この位置に単一のバンドとして泳動された、フラ
クシヨン１においては等電点が約5.2及び約5.0に２つの
バンドとして泳動された。
（５） アミノ酸組成 上記フラクシヨン１及び２の各々30μを、12mm×12
0mmのパイレツクス製肉厚硬質試験管の底部に注意深く
入れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケーターにて減
圧乾燥した。乾燥試料の入つた試験管に4N−メタンスル
ホン酸〔0.2％の３−（２−アミノエチル）インドール
含有、ピアース（Pierce）社製〕50μを加え、0.1〜
0.2mmHgで１分間脱気後、減圧封管した。加水分解は118
℃のヒーター中で24時間を要して行なつた。開管後、4N
−水酸化ナトリウム46μで中和し、希釈用クエン酸緩
衝液で450μとした。
アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー（日立製作所
製、日立835型分析計）を用い、上記試料溶液250μを
注入して行なつた。分離されたアミノ酸は、オルトフタ
ルアルデヒド法で検出した。また定量は、試料の前後に
分析した標準アミノ酸で作成した検量線によつて行なつ
た。
その結果を、Pheを基準（10モル）として、各アミノ
酸の含有モル比で下記第２表に示す。尚、上記分析条件
下においては、Pro及びCysは測定できない。
第 ２ 表 アミノ酸 フラクシヨン２（モル比） Asp及び／又はAsn酸 20.6 Thr 11.4 Ser 10.1 Glu及び／又はGln酸 16.8 Gly 6.6 Ala 14.4 Val 5.8 Met 2.3 Ile 9.3 Leu 15.0 Tyr 6.8 Phe （10） Lys 10.5 His 3.0 Trp 1.6 Arg 2.9 （６） アミノ酸配列 上記フラクシヨン１及び２の各々150μを、アプラ
イドバイオシステムズ社製プロテインシークエンサー
（モデル470A）にて分析した。生じたPTH−アミノ酸
を、33％アセトニトリル水溶液100〜50μにて適宜希
釈し、その５μをウオーターズ710B型オートサンプラ
ーにて注入した。クロマトグラフイーのシステムは、ベ
ツクマン112型ポンプ２台を421型コントローラーで作動
させた。カラムはウルトラスフエアーODS−５μｍの充
填された2mm×250mmを用い、カラムヒーターにて55℃に
保つた。流速は0.3ml/分とし、20mM酢酸ナトリウムとア
セトニトリルとの混合液を用い、グラジエント溶出法で
分離し、269nmでモニターした。分析は45分とした。
40サイクルの分析の結果、両者のアミノ酸配列は、第
36番目のアミノ酸を除いて同一であり、各々以下の通り
であった。
Ser−Ala−Pro−Phe−Ser−Phe−Leu−Ser−Asn−Val−
Lys−Tyr−Asn−Phe−Met−Arg−Ile−Ile−Lys−Tyr−
Glu−Phe−Ile−Leu−Asn−Asp−Ala−Leu−Asn−Gln−
Ser−Ile−Ile−Arg−Ala−Ｘ−Asp−Gln−Tyr−Leu フラクシヨン１の第36番目のアミノ酸（上記Ｘ）は、
遺伝子の配列から予想されるアミノ酸、即ちAsnであ
り、フラクシヨン２のそれはAspであった。
以上のことにより、フラクシヨン１は、前記式（Ａ）
で表わされるポリペプチド、即ちIL−１αであり、一方
フラクシヨン２は、該IL−１αの第36番目のアミノ酸が
Aspに置換された本発明のポリペプチドであることが確
認された。以下この本発明ポリペプチドを「ポリペプチ
ドＩ」という。
尚、上記IL−１αは、物質的に安定性に欠け、例えば
トリスHCl緩衝液（pH8.0）中においても、一部より安定
なポリペプチドＩに変化することが認めらた。
実施例２ （１） 本発明ポリペプチドＩの製造 参考例１で得たプラスミドp trp IL−１α−113を利
用して、サイト−スペシフイツク ミユータジエネシス
（Site−Specific Mutagenesis）〔Proc.Nat.Acad.Sc
i.,81,5662−5666（1984）〕の方法に従い、ポリペプチ
ドＩ発現用プラスミドを得、これよりポリペプチドＩを
以下の通り製造した。
即ち、M13mp11フアージベクターを、一本鎖（ss）DNA
鋳型として用いた。まず、プラスミドp trp IL−１α−
113より、EcoR I/BamH I DNAフラグメントを切り出し、
M13mp11フアージ（RF）のEcoR IとBamH Iの制限酵素サ
イトにクローニングし、これから一本鎖（ss）DNA（M13
−IL−１α−113）を得、これをミユータジエネシスの
鋳型とした。
合成オリゴヌクレオチド（５′−ACTGGGTGAGCTTGGCAG
−３′（プライマー）〕を、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼでリン酸化し、これをssM13−IL−１α−113DNAとハ
イブリダイズし、アニーリング後、dNTPsの存在下、DNA
ポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）及びT4DNAリ
ガーゼで各々処理し、15℃で18時間インキユベートし
た。
得られたDNAをJM105コンピテント細胞にトランスフオ
ームし、生じたコロニーを、寒天プレート上に50コロニ
ー植菌し、37℃で18時間培養した。生育したコロニーを
含むフイルターを通常の方法によりアルカリ変性し、乾
燥後、80℃で２時間ベーキング処理を行なった。このフ
イルターをプレハイブリダイズした後、このものと、上
記プライマーの５′末端を32P−γ−ATPでラベルした32
P−プローベとを、室温でハイブリダイズさせた。ハイ
ブリダイズさせたフイルターを、６×sscバッフアー
で、室温で10分間、次いで54℃で５分間各々洗浄し、乾
燥後、−70℃で18時間オートラジオグラフイーを行なっ
た。
変異した５クローンの内から代表としてM13−IL−１
α−36Dを選び、これをJM105に幹線させて培養し、ssDN
A及びRF DNAを調製した。
上記で得たssDNAのM13ジデオキシチエイン ターミネ
ーシヨン シークエンシングにより目的の遺伝子の変異
の確認を行なった。
JM105で増殖させたRF DNAより、EcoR I/BamH Iフラグ
メントを調製し、これを前記参考例と同様にして発現プ
ラスミドに組込み、所望のポリペプチドＩ発現プラスミ
ド（IL−１α−36D）を得た。
このプラスミドを用いて、実施例１と同様にして、ポ
リペプチドＩを発現させ、これを精製（DEAE−HPLCの結
果は単一のGIF活性ピークを与えた）することにより、
前記物性を示す目的のポリペプチドＩを得た。この比活
性は約１×107GIF単位/mg蛋白であった。
実施例３ （１） 本発明ポリペプチドII及びIIIの製造 実施例２においてプライマーとして５′−ACTGGGTGAG
CTTGGCAG−３′を用いて、同様にして、IL−１αの第14
1番目のアミノ酸（Cys）がSerに置換された本発明ポリ
ペプチドの発現用プラスミドであるp trp IL−１α−14
1Sを得た。
該プラスミドを用いて、実施例１と同様にして、発現
及び精製を行なった結果、同様にDEAE−HPLCでGIF活性
の２つのピークが得られた。
之等につき、同様に解析を行なった結果、リテンシヨ
ンタイムの早い方のピークフラクシヨンは、遺伝子配列
から予想されるポリペプチド、即ちIL−１αの第141番
目のアミノ酸（Cys）がSerに置換された本発明ポリペプ
チド（ポリペプチドIII）であることが確認された。
また、他方のピークフラクシヨンは、同様の解析の結
果、IL−１αの第36番目のアミノ酸（Asn）及び第141番
目のアミノ酸（Cys）が、それぞれAsp及びSerに置換さ
れた本発明ポリペプチドであると同定された。以下この
ポリペプチドを「ポリペプチドII」という。
実施例４ （１） 本発明ポリペプチドIIの製造 実施例３と同様にして、該実施例３で調製したプラス
ミドp trp IL−１α−141Sを利用して、プライマーとし
て５′−ATTCGAGCCGATGATCAG−３′を用いることによ
り、目的のポリペプチドII発現用プラスミドp trp IL−
１α−36D・141Sを得た。
上記プラスミドp trp IL−１α−36D・141Sを、HB101
株に保有させ、これを微工研に「エツシエリヒア コリ
HB101/IL−１α−36D・141S」なる名称で微工研条寄第1
295号（FERM BP1295）として寄託した。
該プラスミドを用いて、実施例１と同様にして、発現
及び精製して、本発明の目的ポリペプチドIIを得た。
このものの分子量は、SDS−PAGEにより、約18KDであ
ることが確認された。またこのもののIEFによる等電点
（pI）は、約5.0であった。ポリペプチドII及びIIIの比
活性（GIF活性）は、ポリペプチドＩと同等であった。
薬理試験例１ GIF活性及びLAF活性 本発明ポリペプチドのGIF活性については、既に記載
した通りであり、また、ポリペプチドＩ、II及びIIIの
いずれもそのGIF活性とほぼ同等のLAF活性を示した。
更に本発明ポリペプチドにつき、以下の試験を行なっ
た。
抗腫瘍作用 腫瘍細胞メスＡ（Meth A）の200000細胞を、BALB/cマ
ウスに皮内接種（i.d.）した（第０日目）。次いで、第
７日目と第８日目に、ポリペプチドＩの0.3、１又は３
μg/マウスを、各１回実験動物の腫瘍内に投与した。
実験動物各７匹を１試験群とした。対照（コントロー
ル）群には、溶媒（１％マウス血清）のみを同様に投与
した。
試験結果を第３図に示す。該図において横軸は腫瘍細
胞接種後日数（日）を、縦軸は腫瘍重量（mg）を示し、
曲線（１）は対照群を、曲線（２）はポリペプチドＩの
0.3μｇ投与群を、曲線（３）はポリペプチドＩの１μ
ｇ投与群を、また曲線（４）はポリペプチドＩの３μｇ
投与群をそれぞれ示す。また腫瘍重量は、平均（mean）
±標準偏差（SD）で示されており、＊はスチュウデンツ
Ｔ−テストにおけるＰ＜0.05を、＊＊は同Ｐ＜0.01を示
す。
CSF産生促進効果試験 −１ 細胞株Ｕ−373MG〔ATCC HTB17,Glioblastoma,A
strocytoma,Human〕を用いて以下の試験を行なった。
即ち、まず、上記細胞を２×105個/mlの細胞濃度とな
るように、10％ウシ胎児血清（GIBCO社）、MEM非必須ア
ミノ酸（Flow社）及びMEMピルビン酸ナトリウム（Flow
社）を添加したイーグルスMEM培地（日水社）に浮遊さ
せた。
上記細胞浮遊液中に、種々の濃度となるようにポリペ
プチドＩを加え、炭酸ガス培養器内で37℃で24時間培養
し、各培養上清を集め、之等培養上清中に産生蓄積され
たCSF量を、マウス骨髄腫細胞を使用して測定した〔Lew
is,I.C.et al.,J.Immunol.,128,168（1982）〕。
得られた結果を第４図に示す。該図において、横軸は
ポリペプチドＩの濃度（ng/ml）を、縦軸はCSF活性（単
位/ml,×10-2）を各々示す。
−２ ポリペプチドＩを生体内に投与した場合、生体
内でのCSF産生亢進作用が発現されることを以下の実験
により試験した。
即ち、正常マウス（BALB/c系マウス、静岡県実験動物
協同組合より購入）に、種々の量のポリペプチドＩを皮
下投与した。上記投与後、８時間目に各実験動物より採
血し、血清中のCSF活性を上記−１と同様にして、マ
ウス骨髄腫細胞を用いて測定した。尚、対照として、ヒ
ト血清アルブミン（HSA）投与群を作成し、同一試験に
供した。
結果を第５図に示す。該図において、横軸はポリペプ
チドＩ投与量又はHSA投与量（いずれもμg/マウス）
を、縦軸はCSF活性（単位/ml血清，×10-2）を各々示
す。
抗炎症試験 ウインター（Winter）らの方法〔Proc.Soc.Exptl.Bio
l.Med.,111,544−547（1962）〕に準じて、この試験を
行なった。
即ち、６〜８週齢の雄ラツト（Spraque Dawley系、日
本チャールスリバー社）を、実験前日に体重に基づいて
１群６〜８匹の各群に分けて用いた。起炎剤としてカラ
ゲニン（Marine Colloid社性）を、生理食塩水に１％と
なるように懸濁させたものを使用し、ラツトの右後肢足
蹠皮下に0.1ml注射して足浮腫を惹起させた。足浮腫を
評価するため、起炎剤注射の前後の一定時間に、右後肢
足蹠容積を、プレシモメーター（plethysmometer,Ugo−
Vysile社製）を用いて測定した。前値に対する起炎剤注
射後の容積増加率を浮腫率（swelling％）として表わし
た。
被検物質は、ダルベッコのリン塩酸緩衝食塩水（Dulb
eco s phosphate buffered saline）に溶解希釈し、ラ
ツトの背部皮内に0.1ml宛、起炎剤注射の１時間前に注
射した。尚、対照群として、溶媒投与群を作成し、同一
実験に供した。
結果を第６図に示す。該図において、横軸は起炎剤投
与後時間（hr）を、縦軸は浮腫率（％）を示す。図中、
曲線（１）は対照群を、曲線（２）はポリペプチドＩの
0.1μｇ投与群を、曲線（３）はポリペプチドＩの１μ
ｇ投与群を、また曲線（４）はポリペプチドＩの10μｇ
投与群をそれぞれ示す。
放射線障害防止作用試験 BALB/c系マウス（９週齢）に致死量のＸ線を照射する
20時間前に、ポリペプチドＩの１μg/マウス又は0.3μg
/マウスを腹腔内注射した。
Ｘ線照射装置（MBR−1505R、日立メディコ社）を使用
し、850レントゲンのＸ線を、上記マウスに全身照射
し、以後、毎日その生存を確認した。尚、コントロール
として、PBS投与群をおいた。
結果を第７図に示す。図において横軸はＸ線照射後の
日数（日）を、縦軸は供試動物の生存率（％）を示し、
曲線（１）はポリペプチドＩの１μｇ投与群を、曲線
（２はポリペプチドＩの0.3μｇ投与群を、また曲線
（３）はコントロール群をそれぞれ示す。
第７図より、コントロール群では、Ｘ線照射後18日目
に全例死亡したのに対し、ポリペプチドＩ投与群では、
その投与量に依存して、放射線障害の防止作用が認めら
れ、特に１μｇ投与群では、約８割が放射線障害による
死亡から回避され、生存することが確認された。
日和見感染防御効果試験 易感染モデルマウスを用いて、以下の試験を実施し
た。
（１）ICR系雄性マウス（６週齢）を供試動物（１群７
匹）とし、第１日目に、５−フルオロウラシル（５−F
u、協和醗酵社製）100mg/kgを静脈内投与した。第２日
目、第４日目及び第６日目に、ポリペプチドＩの１μg/
マウスを皮下投与し、第７日目に、緑膿菌（Pseudomona
s aeruginosa E−２）の所定量を腹腔内投与して感染さ
せた。第10日目に供試動物の生存数を計数して、生存率
（％）を求めた。
結果を第８図（１）〜（３）に示す。
第８図（１）は上記実験群の結果を、同（２）はポリ
ペプチドＩを投与しなかった（５−Fuのみを投与した）
対照群の結果を、また同（３）は５−Fu及びポリペプチ
ドＩのいずれも投与しなかった対照群の結果をそれぞれ
示す。
第８図中、縦軸は生存率（％）を、横軸は下記各緑膿
菌投与量を採用した群Ａ〜Ｅを各々示す。
Ａ群…19000菌数／マウス投与群 Ｂ群… 3800菌数／マウス投与群 Ｃ群… 750菌数／マウス投与群 Ｄ群… 150菌数／マウス投与群 Ｅ群… 30菌数／マウス投与群 Ｆ群… 6菌数／マウス投与群 IL−１αのCSF産生促進効果試験 CSF産生株として、ヒト肺細胞由来株HFL−１（Human
Embryonic Lung Fibroblasts,ATCC登録細胞株No.CCL−1
53）を用い、以下の試験を行なった。
まず、上記HFL−１細胞を２×105個/mlの細胞濃度と
なるように、10％ウシ胎児血清加ハムスター12K培養液
［Ham,R.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.,53,288（1965）］に
浮遊させた。次いで上記細胞懸濁液中に、種々の濃度に
調製した前記実施例１で得たIL−１αを加え、炭酸ガス
溶媒器内で37℃で24時間、48時間及び72時間各々培養
し、各培養上清を集め、之等用倍上清中に産生蓄積され
たCSF量を、マウス骨髄細胞を使用して測定した［Lews,
I.C.et al.,J.Immunol,128,168（1982）］。
結果を第３表に示す。
上記各結果により、IL−１αの添加によれば、HFL−
１細胞株のCSF産生量は、その無添加に比べて亢進され
ることが明らかである。
動物細胞からのサイトカインの製造方法 種々の濃度のポリペプチドII及び0.01％PHA−Ｐ存在
下に、HBS−2C5B2細胞［J.Immunol.,131,1682−1689（1
985）］を、２×105cells/wellにて培養した。培養24時
間後の上清を採取し、そのIL−２活性を、スミス（K.A.
Smith）らの方法に従い、IL−２依存性マウスＴ細胞（C
TLL2）を用いて測定した［J.Immunol.,120,2027（197
8）］。
結果を下記第４表に示す。
以上に示す結果より、本発明ポリペプチドを用いるこ
とにより、動物細胞からの天然サイトカイン類の生産が
効率よく行い得ることが判る。
また、本発明のポリペプチドの、かかる方法への適用
に際しては、極めて微量、通常10ng/ml程度の使用で十
分であり、誘導されたサイトカイン類の精製過程をも容
易にする。
動物細胞よりサイトカインを生産する場合、産生誘
引に使用する本発明ポリペプチドがその条件下において
構造的に安定であり、細胞表面上のIL−１受容体に結合
することが必須である。すなわち、本発明ポリペプチド
がIL−１受容体に結合し、サイトカイン産生に必要なシ
グナルを細胞内に伝えることが重要である。
そこで、線維芽細胞上のIL−１受容体への結合に関し
て、以下の試験を行なった。
６−ウエルプレート上で、一面にほぼ均一にまで増殖
したBalb/3T3細胞（クローンA31:ATCC,CCL−163,1×106
cells/well）に、125Iで標識したIL−１β［生化学58,8
号、p840（1986）;EPO187991号］の50000cpm/well及び
事前に10％FCS加Ｄ−MEM中で37℃下に24時間インキユベ
ートした20ng/mlのIL−１β又はポリペプチドIIを加
え、４℃で反応させた。反応液をパスツールピペツトで
除き、10％FCS加Ｄ−MEMの1mlを加えて静かに洗い上清
をすてた。この洗浄操作を２回繰返した後、1mlの１％S
DS、0.2N NaOHで細胞を可溶化し、可溶化液及びさらに
ウエルを洗浄した可溶化液中の放射能（結合放射能）を
γ−カウンターにて測定した。
なお、上記125I標識IL−１βは、ボルトンとハンター
（Bolton and Hunter）の方法［Biochem.J.,133,529（1
973）に従い製造、精製した（比活性;250μCi/μg prot
ein以上）。
得られた結果を下記第５表に示す。
第 ５ 表 （hr） 阻止能（％） ポリペプチドII 100 IL−１β 約４ なお、表において阻止能（％）は、下式により求め
た。
式中Ａは未標識ポリペプチドＩが存在しない時の結合
した放射能、Ｂはプレートに非特異的に吸着した放射
能、Ｃは結合した放射能の実測値 かかる指標は、共存させたIL−１β又はポリペプチド
IIのIL−１受容体への結合力を表わす。尚、IL−１β受
容体は、IL−１α及びIL−１βに共通であることが知ら
れている。
上記第５表よりポリペプチドIIは、サイトカイン誘導
産生条件下においても、IL−１受容体への結合力が低下
することなく、かかる適用に際して極めて好ましいこと
が判る。
製剤例１ GIF活性として１×107単位/mlのポリペプチドＩの生
理食塩水溶液に、ヒト血清アルブミン（HSA）を0.5％と
なるように添加して、過（0.22μｍメンブランフイル
ター）後、これを無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し
て凍結乾燥し、注射用製剤を調製した。
かくして得られた製剤は、これを用時注射用蒸留水1m
lに溶解して利用される。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドpcD−GIF−16及びプラスミドpcD−G
F−207のcDNAの制限酵素地図を示す。 第２図はプラスミドpcD−GIF−207とプラスミドpTM1と
からプラスミドp trp IL−１α−113を構築する概略図
を示す。 第３図は抗腫瘍作用試験の結果を示す。 第４図及び第５図はCSF産生促進効果試験の結果を示
す。 第６図は抗炎症試験の結果を示す。 第７図は放射線障害防止作用試験の結果を示す。 第８図は日和見感染防御効果試験の結果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１２９４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１２９５ (72)発明者 河合 一吉 徳島県板野郡松茂町満穂字満穂開拓130 −２ ソレイユ503号 (72)発明者 嶽肩 世津子 徳島市川内町加賀須野1090−18 (72)発明者 石井 清士 徳島県板野郡藍住町住吉字逆藤39−46 (72)発明者 柳原 康夫 徳島市川内町大松891−６ (72)発明者 平井 嘉勝 徳島県板野郡北島町新喜来字江古川５− 49 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，315（20）Ｐ．641− 647（1985) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，81，Ｐ．7907−7911 （1984) Ｊ．Ｉｍｍｕｒｏｌ．135，Ｐ．314 （1985) Ｊ．Ｉｍｍｕｒｏｌ．135，Ｐ．3962 −3968（1985) Ｊ．Ｉｍｍｕｒｏｌ．129，Ｐ．2504 （1982)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式 で表わされるインターロイキン−１αのアミノ酸配列に
    於て、36位Asnを他のアミノ酸に置換した改変されたア
    ミノ酸配列をコードすること、及び36位Asn及び141位Cy
    sをそれぞれ他のアミノ酸に置換した改変されたアミノ
    酸配列をコードすることから選ばれる特徴を有するイン
    ターロイキン−１α誘導体遺伝子。
  2. 【請求項２】36位Asnを置換する他のアミノ酸がAspであ
    る請求の範囲第１項に記載の遺伝子。
  3. 【請求項３】36位AsnがAspに、141位CysがSerにそれぞ
    れ置換された改変されたアミノ酸配列をコードする請求
    の範囲第１項に記載の遺伝子。
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