JPH0649656B2

JPH0649656B2 - 血小板減少症治療剤

Info

Publication number: JPH0649656B2
Application number: JP1201870A
Authority: JP
Inventors: 哲中井; 公徳相原; 嘉勝平井
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-08-04
Filing date: 1989-08-03
Publication date: 1994-06-29
Anticipated expiration: 2009-06-29
Also published as: JPH02138224A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は血小板減少症治療剤に関する。

従来の技術近年、ガンの治療技術は長足の進歩を示し、従来の外科
的手術に加えて、化学療法、放射線療法、免疫療法等の
進歩には著しいものがあるが、特に化学療法、放射線療
法はそれらの有効性に相俟って強い副作用を伴いがちで
ある。

即ち、化学療法に用いられる化学療法剤は、制ガン作用
を有するが正常組織等への悪影響はないか極少ないもの
であるのが理想的であるが、現在知られている化学療法
剤はいずれも強い骨髄抑制を惹起し、白血球や血小板の
減少を伴い、長期に亘る連続投与は不可能であり、この
副作用のために治療の中断を余儀なくされる弊害があ
る。また、放射線治療のためのＸ線やγ線の照射も、上
記化学療法剤と同様に骨髄等の造血組織に対する副作
用、殊に白血球や血小板等の減少が著しく、同様に治療
の中断が必要となる。

上記の如き癌化学療法や放射線療法の継続制限因子の一
つとなる血小板等の減少に対する対策としては、血小板
輸血（transfusion）や骨髄移植（bone marrow transpl
antation）が知られている。しかし、上記輸血では血小
板、白血球の寿命が短く、頻繁に新鮮な血球を移入せね
ばならない不利がある。上記骨髄移植とは、骨髄中の造
血前駆細胞にある特定の造血因子が働くことにより白血
球、赤血球、血小板等の血球細胞の産生が調節されるこ
とを利用して、骨髄細胞を体外より補充して血球細胞の
回復や減少を軽減させる方法であり、これはある種の腫
瘍の治療に画期的成果をもたらし、根治的治療法の一つ
として確立された。しかし、この骨髄移植を行なう場
合、患者に適合する骨髄の提供者を見つけること自体が
非常に困難で、うまく骨髄が入手できてもその移植にも
困難が伴われ、しかも移植された骨髄が生着し、造血を
開始して白血球や血小板等を末梢血中に産生するには通
常数週間の時間がかかり、その間患者は極めて厳しい生
死の境界状態に置かれる不利がある。

以上の通り、ガンの化学療法や放射線療法時等に見られ
る血小板減少等の症状を改善するために行われる輸血、
骨髄移植には、各種の欠点があり、これらの問題を克服
するためには、患者自身の造血機能を高める必要があ
り、造血促進作用を有する薬剤の研究開発が当業界で切
望されている現状にあるが、現在特に血小板産生を促進
させ得る薬剤は全く知られていない。

発明が解決しようとする問題点上記現状に鑑み、本発明者らも斯界の要望に合致する血
小板減少等の症状改善のための薬剤の提供を目的として
鋭意研究を重ねてきた。その過程で、従来よりリンパ球
を活性化し、インターロイキン−２（ＩＬ−２）等の産
生や抗体の産生等を亢進させる作用を始めとして多様な
生物活性を示すことが明らかにされ、之等の生物活性よ
り医薬品としての応用研究が種々行なわれつつあるイン
ターロイキン−１（ＩＬ−１）及びその誘導体、並びに
本願人らが新たに開発したＩＬ−１の誘導体が、実に驚
くべきことに血小板の減少を顕著に抑制する作用（血小
板増加作用）を有し、上記目的に合致する血小板減少症
治療剤として非常に有効であることを見出し、本発明を
完成した。

問題点を解決するための手段即ち、本発明はＩＬ−１及びその誘導体から選ばれる少
なくとも１種を有効成分として含有する血小板減少症治
療剤に係わる。

本発明の血小板減少症治療剤は、上記の通り、ＩＬ−１
及びその誘導体を有効成分とすることを必須の要件と
し、これに基づいて、顕著な血小板増加作用を発揮し、
かくして血小板減少症の治療に非常に有効である。

本発明治療剤の有効成分とするＩＬ−１には、ＬＡＦ
（Lymphocyte Activating Factor）活性を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子の塩基配列から同定された１
５９個のアミノ酸配列を有するＩＬ−１α及び１５３個
のアミノ配列を有するＩＬ−１β〔Proc.Natl.Acad.Sc
i.,Vol.81,7907-7911(1984)；Nature,Vol.315,641 (198
5)；Nucleic Acid Research,Vol.13,(16)5869 (1985)等
参照〕の両者が含まれる。之等はその産生細胞から通常
の方法により抽出、単離される天然型であってもよく、
また遺伝子工学的手法により得られる組換え型であって
もよい。

また上記ＩＬ−１の誘導体には、各種のものが含まれ、
その代表例としては本願人らの先の出願に係わる各種の
アミノ酸配列を有するＩＬ−１α誘導体及びＩＬ−１β
誘導体が包含される。〔特願昭６０−２８４６９９号
（ヨーロッパ特許公開１８７９９１号）、特願昭６２−
５２７８１号（ヨーロッパ特許公開第２３７９６７号）
及び特願昭６２−５７５６８号（ヨーロッパ特許公開第
２３７０７３号）等参照〕。

上記ＩＬ−１α誘導体は、以下のものである。

式（Ａ）： Ser-Ala-Pro-Phe-Ser-Phe-Leu-Ser-Asn-Val-Lys-Tyr-As
n-Phe-Met-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-Asn-
Asp-Ala-Leu-Asn-Gln-Ser-Ile-Ile-Arg-Ala-Asn-Asp-Gl
n-Tyr-Leu-Thr-Ala-Ala-Ala-Leu-His-Asn-Leu-Asp-Glu-
Ala-Val-Lys-Phe-Asp-Met-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Ser-Ly
s-Asp-Asp-Ala-Lys-Ile-Thr-Val-Ile-Leu-Arg-Ile-Ser-
Lys-Thr-Gln-Leu-Tyr-Val-Thr-Ala-Gln-Asp-Glu-Asp-Gl
n-Pro-Val-Leu-Leu-Lys-Glu-Met-Pro-Glu-Ile-Pro-Lys-
Thr-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-Thr-Asn-Leu-Leu-Phe-Phe-Tr
p-Glu-Thr-His-Gly-Thr-Lys-Asn-Tyr-Phe-Thr-Ser-Val-
Ala-His-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Thr-Lys-Gln-Asp-Ty
r-Trp-Val-Cys-Leu-Ala-Gly-Gly-Pro-Pro-Ser-Ile-Thr-
Asp-Phe-Gln-Ile-Leu-Glu-Asn-Gln-Ala で表わされるＩＬ−１αのアミノ酸配列の３６位Asn及
び１４１位Cysの少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失
されているか又は他のアミノ酸残基で置換されている改
変されたアミノ酸配列を有する誘導体。

また、本発明者らは新たにＩＬ−１αの誘導体の合成に
成功しており、該誘導体は以下の特徴を有している。

即ち、下式（α）： Ser-Ala-Pro-Phe-Ser-Phe-Leu-Ser-Asn-Val-Lys-Tyr-As
n-Phe-Met-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-Asn-
Asp-Ala-Leu-Asn-Gln-Ser-Ile-Ile-Arg-Ala-X-Asp-Gln-
Tyr-Leu-Thr-Ala-Ala-Ala-Leu-His-Asn-Leu-Asp-Glu-Al
a-Val-Lys-Phe-Asp-Met-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Ser-Lys-
Asp-Asp-Ala-Lys-Ile-Thr-Val-Ile-Leu-Arg-Ile-Ser-Ly
s-Thr-Gln-Leu-Tyr-Val-Thr-Ala-Gln-Asp-Glu-Asp-Gln-
Pro-Val-Leu-Leu-Lys-Glu-Met-Pro-Glu-Ile-Pro-Lys-Th
r-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-Thr-Asn-Leu-Leu-Phe-Phe-Trp-
Glu-Thr-His-Gly-Thr-Lys-Asn-Tyr-Phe-Thr-Ser-Val-Al
a-His-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Thr-Lys-Gln-Asp-Tyr-
Trp-Val-Y-Leu-Ala-Gly-Gly-Pro-Pro-Ser-Ile-Thr-Asp-
Phe-Gln-Ile-Leu-Glu-Asn-Gln-Ala 〔上記においてＸ及びＹは人体を構成するαアミノ酸残
基を示す。〕で表されるＩＬ−１α誘導体のアミノ酸配列において、
１６位^Argが欠失されていること、該１６位^Argが他のア
ミノ酸残基で置換されていること、１位^Serから１４位
^Pheに至るアミノ酸配列が欠失されていること及び１位S
erから１５位Metに至るアミノ酸配列が欠失されている
ことから選ばれる条件の少なくとも１つを充足する改変
されたアミノ酸配列を有する。

上記ＩＬ−１β誘導体としては、以下のものを例示でき
る。

式（Ｂ）： Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg-Asp-Se
r-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu-Val-Met-Ser-Gly-Pro-Tyr-Glu-
Leu-Lys-Ala-Leu-His-Leu-Gln-Gly-Gln-Asp-Met-Glu-Gl
n-Gln-Val-Val-Phe-Ser-Met-Ser-Phe-Val-Gln-Gly-Glu-
Glu-Ser-Asn-Asp-Lys-Ile-Pro-Val-Ala-Leu-Gly-Leu-Ly
s-Glu-Lys-Asn-Leu-Tyr-Leu-Ser-Cys-Val-Leu-Lys-Asp-
Asp-Lys-Pro-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Ser-Val-Asp-Pro-Ly
s-Asn-Tyr-Pro-Lys-Lys-Lys-Met-Glu-Lys-Arg-Phe-Val-
Phe-Asn-Lys-Ile-Glu-Ile-Asn-Asn-Lys-Leu-Glu-Phe-Gl
u-Ser-Ala-Gln-Phe-Pro-Asn-Trp-Tyr-Ile-Ser-Thr-Ser-
Gln-Ala-Glu-Asn-Met-Pro-Val-Phe-Leu-Gly-Gly-Thr-Ly
s-Gly-Gly-Gln-Asp-Ile-Thr-Asp-PheThr-Met-Gln-Phe-V
al-Ser-Ser で表わされるＩＬ−１βのアミノ酸配列において、下記
ａ）〜ｄ）の条件の少なくとも１つを充足する改変され
たアミノ酸配列を有するＩＬ−１β誘導体。

ａ）１位Ala、３位Val、４位Arg、５位Ser、８位Cys、
１１位Arg３０位His、７１位Cys、９３位Lys、９７位Ly
s、９８位Arg、９９位Phe、１０３位Lys、１２０位Tr
p、１２１位Tyr及び１５３位Serから選ばれた少なくと
も１つのアミノ酸残基が欠失されているか又は他のアミ
ノ酸残基で置換されていること、ｂ）１位Alaから９位Thrに至るアミノ酸配列又はその中
の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失されていること
（但し上記ａに記載の１位Ala、３位VaL、４位Arg、５
位Ser及び８位Cysからなる群から選ばれたアミノ酸残基
の少なくとも１つが欠失されている場合を除く）、ｃ）１０３位Lysから１５３位Serに至るアミノ酸配列又
はその中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失されて
いること（但し上記ａに記載の１０３位Lys、１２０位T
rp、１２１位Tyr及び１５３位Serからなる群から選ばれ
たアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失されている場合
を除く）、ｄ）上式（Ｂ）のＮ末端にアミノ酸残基又は下記式
（Ｂ′）で示される１′位Metから１１６′位Aspに至る
アミノ酸配列もしくはそのＣ末端側の一部のアミノ酸配
列が付加されていること、式（Ｂ′）Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｌ
ａ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ
−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍ
ｅｔ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｔ
ｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ
−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ
−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ上記各式及び以下の本明細書におけるアミノ酸及びポリ
ペプチドの表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
による命名法又は規則における略号乃至当該分野で慣用
されている略号による表示方法に従うものとする。

またアミノ酸残基の数及び位置は、欠落及び付加がある
場合であっても、全て前記式（Ａ）［ＩＬ−１αの場合］及び前記式（Ｂ）［ＩＬ−１βの
場合］のアミノ酸配列に従って表示するものとする。但
しＩＬ−１β誘導体におけるアミノ酸残基の位置を示す
数値の内ダッシュ（′）を付したものは式（Ｂ′）のア
ミノ酸配列に従う。

上記ＩＬ−１の各誘導体は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１β
の各アミノ酸配列の特定位置の特定アミノ酸残基を他の
アミノ酸残基で置換したアミノ酸配列及び特定位置にア
ミノ酸残基を付加したアミノ酸配列のポリペプチドを包
含し、この置換及び付加を行ない得るアミノ酸残基は人
体蛋白質を構成するα−アミノ酸の残基であればいずれ
でもよく、特に中性アミノ酸残基が好適である。但しCy
sはそのＳＨ基に基づき分子内又は分子間ジスルフイド
結合を形成することがあり、これを考慮すれば該アミノ
酸残基はCys以外の上記アミノ酸残基であるのが好まし
い。

ＩＬ−１α誘導体の場合、特に好ましい上記人体蛋白質
を構成するα−アミノ酸残基としては、例えば１６位Ar
gの場合はGlyを、３６位Asnの場合はAspを、１４１位置
Cysの場合はSerをそれぞれ例示できる。

またＩＬ−１β誘導体の場合、同様の特に好ましいもの
としては、例えば４位Argの場合はGly、Lys、Gln又はAsp
を、８位Cysの場合はSer又はAlaを、１１位Argの場合は
Glnを、３０位Hisの場合はTyrを、７１位Cysの場合はSe
r、Ala又はValを、９３位Lysの場合はLeu又はAspを、９
８位Argの場合はLeuを、１０３位Lysの場合Glnを、１２
０位Trpの場合はArgを、１２１位Tyrの場合はGlnを、ま
たＮ末端への付加の場合は、Met、Leu、Arg又はAspをそれ
ぞれ例示できる。

従来、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及び之等の誘導体はＬＡ
Ｆ活性、腫瘍細胞増殖抑制活性（ＧＩＦ活性）、コロニ
ー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、
インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３
（ＩＬ−３）等の種々のサイトカイン（cytokine）類の
産生促進活性、抗炎症活性、放射線障害防止作用等を有
し、例えば抗体産生促進やワクチンの効果増強等の免疫
系刺激剤、抗腫瘍剤、例えばＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−
３等のサイトカイン産生促進剤、抗炎症剤、放射線障害
防止剤等の医薬品として有用であることが知られている
が、該ＩＬ−１が血小板増加作用（造血効果）を有する
ことは全く知られておらず、勿論この血小板増加作用と
上記公知の各種薬理効果との関連性についても何ら報告
はなく、該ＩＬ−１が血小板減少症治療剤として利用で
きるとは本発明者らにより初めて見出された事実であ
る。

本発明治療剤において有効成分とする上記各種のＩＬ−
１α誘導体及びＩＬ−１β誘導体は、公知であるか又は
公知の遺伝子工学的手法により製造できる。即ち、前記
特定のポリペプチドをコードする遺伝子を利用して、こ
れを微生物のベクターに組込み該微生物細胞内で複製、
転写、翻訳させることにより所望の誘導体を製造でき
る。この方法は、特に大量生産が可能である点より有利
である。

上記方法において用いられる遺伝子は、通常の方法、例
えばホスファイトトリエステル法〔Nature,310,105(1
984)〕等の常法に従い、核酸の化学合成により全合成す
ることもできるが、ＩＬ−１もしくはその前駆体をコー
ドする遺伝子を利用して合成するのが簡便であり、例え
ば該遺伝子より上記化学合成手段を含む常法に従い、前
記特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列に改変する
こと等により容易に製造できる。

ＩＬ−１又はその前駆体をコードする遺伝子としては公
知のものをいずれも利用できる〔例えば特開昭６２−１
７４０２２号公報参照〕。

上記核酸（塩基）配列の改変操作も公知方法に従えばよ
く、目的とするポリペプチドのアミノ酸配列に応じて実
施される〔遺伝子工学的手法としては、例えばMolecula
r Cloning Cold Spring Harbor Laboratory(1983)参
照〕。

例えば、ＤＮＡの切断、結合、リン酸化等を目的とする
制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌクレオチドキナー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種の酵素処理等の常套手
段等が採用でき、それら酵素は市販品として容易に入手
できる。之等各操作における遺伝子乃至核酸の単離、精
製も常法、例えばアガロース電気泳動法等に従えばよ
い。また得られる遺伝子の複製は、一部後述するように
通常のベクターを利用する方法に従えばよい。また、所
望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片や合成リンカ
ーは上記した化学合成により容易に製造できる。尚、上
記において所望のアミノ酸に対応するコドンは自体公知
でありまたその選択は任意でよく、例えば利用する宿主
のコドン使用頻度等を考慮した常法に従えばよい〔Nuc
l.Acids.Res.,9,43-74(1981)参照〕。またこれらの核酸
配列のコドンの一部改変には、例えば常法通り、１５〜
３０マー程度の、所望の改変をコードする合成オリゴヌ
クレオチドからなるプライマーを用いたサイト−スペシ
フィックミュータジェネシス（Site-Specific Mutage
nesis）〔Proc.Natl.Acad.Sci.,81,5662-5666(1984)〕
等の方法を採用できる。

上記の方法により得られる所望の遺伝子は、例えばマキ
サム−ギルバードの化学修飾法〔Maxam-Gilbert,Meth.E
nzym.,65,499-560(1980〕やＭ１３フアージを用いるジ
デオキシヌクレオチド鎖終結法〔Messing,J.and Vieira
,J.,Gene,19,269-276(1982)〕等により、その塩基配列
の決定及び確認を行ない得る。

上記操作及び方法の具体例を一部後記参考例に示すが、
該方法は特に限定されず、当業界において周知の各種方
法のいずれを採用してもよい。

かくして、前記した特定のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子が提供される（以下この遺伝
子を「目的遺伝子」という）。

前記特定のポリペプチドは、上記目的遺伝子を利用して
公知の一般的な遺伝子組換え技術に従い製造できる。よ
り詳細には、上記目的遺伝子が宿主細胞中で発現できる
ような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入し
て形質転換し、該形質転換体を培養すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいず
れをも利用でき、該真核生物の細胞には脊椎動物、酵母
等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサル
の細胞であるＣＯＳ細胞〔Y.Gluzman,Cell,23,175-182
〔1981)〕やチヤイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔G.Urlaub and L.A.Chasi
n,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,77,4216-4220(1980)〕
等がよく用いられるがこれらに限定はされない。脊椎動
物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする
遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプラ
イス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保
有するものを使用でき、これは更に必要により複製起源
を保有していてもよい。該発現ベクターの例としては、
ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr
〔S.Subramani,R.Mulligan and P.Berg,Mol.Cell.Bio
l.,1,(9),854-864(1981)〕等を例示できるがこれに限定されない。

真核微生物としては酵母が一般によく用いられ、その中
でもサッカロミセス属酵母を有利に利用できる。該酵母
等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸性ホ
スフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを持つｐＡＭ
８２〔A.Miyanoharaet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.
A.,80,1-5(1983)〕等を好ましく利用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく
用いられ、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベ
クターを用い、このベクター中に目的遺伝子が発現でき
るように、該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シ
ヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成
開始に必要なＡＴＧを付与した発現プラスミドが使用で
きる。上記宿主菌としての大腸菌としてはエシエリヒア
・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株等がよく用いら
れ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２がよく用いら
れるが、これらに限定されず、公知の各種の菌株及びベ
クターをいずれも利用できる。プロモーターとしては、
例えばトリプトファン・プロモーター、Ｐ_Ｌプロモータ
ー、lacプロモーター、lppプロモーター等を使用でき、
いずれの場合にも目的遺伝子を発現させ得る。

トリプトファン・プロモーターを用いる場合を例にとり
詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトファン・プロ
モーター及びＳＤ配列を持つベクターｐＴＭ１〔今本文
男、代謝、Vol.22,289(1985)〕を使用し、ＳＤ配列の下
流に存在する制限酵母ClaI部位に、必要に応じてＡＴＧ
を付与した所望のポリペプチドをコードする遺伝子を連
結させればよい。尚、直接発現系に限らず、例えばβ−
ガラクトシダーゼやβ−ラクタマーゼ等を利用する融合
蛋白質発現系によることもできる。

かくして得られる発現ベクターの宿主細胞への導入及び
これによる形質転換の方法としては、一般に用いられて
いる方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集
め、ＣａＣｌ_２処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい
状態にして、ベクターを取込ませる方法等を採用でき
る。上記方法においては、通常知られているように形質
転換の効率を一層向上させるためにＭｇＣｌ_２やＲｂＣ
ｌを培地に更に共存させることもできる。また、宿主細
胞をスフエロプラスト又はプロトプラスト化後に形質転
換させる方法も採用できる。

かくして得られる所望の形質転換株は、常法に従い培養
でき、該培養により、所望のポリペプチドが生産、蓄積
される。該培養に用いられる培地は、通常の細胞培養に
貫用される各種の培地のいずれでもよく、その具体例と
しては、例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地等及び之等に
通常知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタ
ミン類等を添加した培地を例示できる。尚、上記トリプ
トファン・プロモーターを用いた場合には、一般に該プ
ロモーターが働くようにするためにカザミノ酸を添加し
た、例えばＭ９最小培地を用いて培養することができ、
該培地中には培養の適当な時期にインドールアクリル酸
等のトリプトファン・プロモーターの働きを強めるため
の薬剤を添加することもできる。

かくして得られる活性物を含有する培養物からの目的ポ
リペプチド、即ち前記特定のＩＬ−１誘導体の精製、単
離は通常に従い行ない得る。尚、該ポリペプチドを宿主
から抽出するに当っては、例えば浸透圧ショック法等の
温和な条件を採用するのがその高次構造保持の面からよ
り好ましい。

上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチドの物理、化
学的性質を利用した各種の処理操作に従い実施できる
〔例えば「生化学データーブックII」pp1175-1259、第
１版第１刷、1980年６月23日、株式会社東京化学同人発
行参照〕。該方法としては具体的には例えば通常の蛋白
沈澱剤による処理、限外過、分子ふるいクロマトブラ
フィー（ゲイ過）、液体クロマトブラフィー、遠心分
離、電気泳動、アフィニティクロマトブラフィー、透析
法、之等の組合等を採用できる。

より具体的には、上記操作は、例えば以下のごとくして
実施できる。即ち、まず培養上清より予め目的とするポ
リペプチドを部分精製する。この部分精製は、例えばア
セトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒や酢酸、過塩素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）等の酸を蛋白沈
澱剤として用いる処理、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理及び／
又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外過処
理等により行なわれる。之等の各処理の操作及び条件
は、通常のこの種方法のそれらと同様のものとすればよ
い。

次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル過に付すこと
により目的物質の活性が認められる画分を収得する。こ
こで用いられるゲル過剤としては、特に限定はなく、
例えばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、ア
ガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロースゲル、
セルロース等を素材とするものをいずれも利用できる。
之等の具体例としては、セファデックスＧタイプ、同Ｌ
Ｈタイプ、セファロースタイプ、セファクリルタイプ
（以上、ファルマシア社）、セルロファイン（チッソ
（株））、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオ−
ラド社）ウルトロゲル（ＬＫＢ社）、ＴＳＫ−Ｇタイプ
（トーソー社）等の市販品を例示できる。

目的とするポリペプチドは、上記ゲル過により得られ
る活性画分を、例えばハイドロキシアパタイトカラムを
用いたアフィニティークロマトグラフィー、ＤＥＡＥ
法、ＣＭ法、ＳＰ法等のイオン交換カラムクロマトグラ
フィー、クロマトフオーカシング法、逆相高速液体クロ
マトグラフィー等に付すことにより又は之等各操作の組
合せにより更に精製でき、かくして均質な物質としての
ＩＬ−１α誘導体及びＩＬ−１β誘導体である前記特定
のポリペプチドを単離、収得できる。

本発明の血小板減少症治療剤は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１
β及び之等の誘導体を有効成分として含有させることを
必須要件として、他は通常の医薬組成物と同様のものと
することができ、他に薬理的有効成分や薬剤上の慣用成
分等を任意に配合して、常法に従いその適用に適した薬
理組成物形態に調製される。

上記薬理組成物に配合できる他の成分としては、特にＩ
Ｌ−１活性物の安定化の面より、例えばヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）等のアルブミン類や通常のＬ−型アミノ
酸、好ましくはシステイン、グリシン等が好ましい。之
等の添加量は、特に制限されるものではないが、ＩＬ−
１活性物１μｇ当たりアルブミン類では約０．０１〜１
０mg程度、アミノ酸は約０．００１〜１０mg程度（２種
以上のアミノ酸を併用する場合はそれらの合計量）とす
るのが適当である。また上記薬理組成物には、更に必要
に応じて、糖類例えばグリコース、マンノース、ガラク
トース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトー
ル、キシリトール等の糖アルコール類、ショ糖、マルト
ース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロ
ピルスターチ等の多糖等、好ましくはショ糖、マルトー
ス、マンニトール、イノシトール、デキストラン等や、
イオン性及び非イオン性海面活性剤、就中ポリオキシエ
チレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノア
シルエステル系、脂肪酸グリセリド系等の界面活性剤を
配合することもできる。上記糖類はＩＬ−１活性物１μ
ｇ当たり約０．１mg程度以上、好ましくは約１〜１００
mg程度の範囲、界面活性剤はＩＬ−１活性物１μｇ当た
り約０．０００１mg程度以上、好ましくは約０．００１〜０．１mg程度の範囲で添加されるのが適当
である。

本発明治療剤の調製方法につき詳述すれば、該治癒剤
は、一般に薬理有効量のＩＬ−１活性物（ＩＬ−１α、
ＩＬ−１β及び之等の誘導体）及び必要に応じて配合さ
れ得る上記成分と共に、適当な医薬製剤担体を配合し
て、製剤組成物の形態に調製される。該製剤担体として
は使用形態に応じた製剤を調製するのに通常慣用される
充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤等の賦形剤乃
至は希釈剤をいずれも使用できる。製剤組成物の形態
は、これが有効であるＩＬ−１活性物を効果的に含有す
る状態であれば特に限定はなく、例えば錠剤、粉末剤、
顆粒剤、丸剤等の固剤であってもよく、また液剤、懸濁
剤、乳剤等の注射剤形態であってもよい。またこれは使
用前に適当な担体の添加により液体となし得る乾燥品と
することもできる。之等の製剤組成物はいずれも常法に
従い調製され得る。

尚、上記において担体として採用し得る緩衝液として
は、特に限定されるものではないが、例えばクエン酸−
リン酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、酢
酸−酢酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム−リン酸ーナ
トリウム、クエン酸−ホウ砂等のpH４〜８、より好まし
くはpH５〜６の各緩衝液を好ましく例示することができ
る。

得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態に応じた適当
な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤は、静脈脈
内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により投与さ
れ、固剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与され得
る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与量は、
該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適用され
る患者の症状等に応じて適宜選択され、一定ではない
が、通常有効成分を０．００００１〜８０重量％程度含
有する製剤形態に調製して、この薬剤をこれに含有され
る有効成分量が一日成人一人当り約０．０１μｇ〜１０mg程度となる範囲で投与するのが望
ましい。該投与は、一日１回である必要はなく一日３〜
４回に分けることもできる。

実施例以下、参考例及び実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明する。尚、各例において生理活性は次の方法により測
定した。

＜活性の測定＞（１）ＩＬ−１活性の測定オッペンハイム（J.J.Oppenheim et al）の方法〔J.Imm
unol.,116,1466(1976)〕に従い、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ系マウ
ス胸腺細胞を利用して測定したＬＡＦ活性により表示し
た。

（２）ＧＩＦ活性の測定９６ウェルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した共試液０．１mlを入れ、次に各ウェルに
ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を２×１０⁴個／mlの濃度
で含有する１０％ＦＣＳを含むイーグルスＭＥＭ浮遊液
０．１mlを加え、炭酸ガス培養器（ナフコ社製）内で４
日間培養する。培養終了後、０．０５％ニュウトラルレ
ッド（和光純薬社製）０．０５mlを各ウェルに加え、３
７℃で２時間培養する。上澄液を除去した後、リン酸緩
衝生理食塩水０．３mlを各ウェルに静かに加えてウェル
を洗浄する。洗浄液を除去した後、各ウェルにリン酸１
ナトリウム−エタノール等量混合液０．１mlを加え、マ
イクロミキサーで数分間振盪し、細胞内に取込まれた色
素量を、９６ウェル−マイクロタイトレーションプレー
ト用光度計（タイターチェックマルチスキャン、フロウ
ラボラトリーズ社製）を用いて、吸光度５４０ｍμにて
測定し、増殖抑制活性を求める。対照群（コントロール
群）の細胞増殖の５０％抑制を示す試験群、即ち対照群
の吸光度測定値1/2の吸光度測定値を示す試験群、の希
釈率の逆数をとり、これをＧＩＦ活性単位とする。従つ
て例えばこのＧＩＦ活性が１０単位の場合、この共試液
は１０倍希釈してもなお細胞増殖を５０％抑制する活性
を有する。

参考例１ＩＬ−１α誘導体［１６Ｇ・３６Ｄ・１４１Ｓ］の製造ＩＬ−１α誘導体発現用プラスミドの調製この例に用いたプラスミドp trpＩＬ−１α−１４１Ｓ
は、ヨーロッパ特許公開第２３７０７３号公報に記載さ
れる通り、ＩＬ−１α−前駆体蛋白質をコードするｃＤ
ＮＡを有するプラスミドｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７〔エ
ッシェリヒアコリχ１７７６／ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７
（微工研条寄第１２９４号）の保有するプラスミド）〕
と、ｐＴＭ１〔今本文男、代謝，vol.22,289(1985)〕と
から得られるプラスミドp trpIL-1α-113を利用して、
サイトスペシフィックミュータジェネシス〔Site-speci
fic Mutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci.,81,5662-5666(1
984)〕に従い得られたものであり、前記式（Ａ）で表さ
れるＩＬ−１αのアミノ酸配列の第１４１番目のCysをS
erに置換させたアミノ酸配列のＩＬ−１α誘導体をコー
ドする遺伝子を有している。

上記プラスミドp trpＩＬ−１α−１４１Ｓより、ClaI-
BamHIＤＮＡフラグメント（５２７bp）を切出し、これ
をＩＬ−１βサイトスペシフィック−ミュータジェネシ
ス用ベクターｆ１・ＩＬ−１β IppＴ〔Biochem.Bioph
ys.Res.Commun.,150,1106-1114(1988)〕のClaI-BamHI長
鎖フラグメントとライゲーションとして、ｆ１・ＩＬ−
１α−１４１Ｓを得た。これからヘルパーファージＭ１
３ＫＯ７（宝酒造）を感染させることにより、一本鎖Ｄ
ＮＡ（ssＤＮＡ）を得、これをミュータジェネシスの鋳
型とした。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化された５′−
リン酸化合成オリゴヌクレオチド〔５′−ＡＣＴＴＴＡ
ＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＣＡ−３′〕をプライマーとし、
オリゴヌクレオチド−ダイレクテッドインビトロミュー
タジェネシス〔Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis、
アマシャム（Amersham UK）社製、コードRPN．２３２
２］を用いたサイトスペシフィック−ミュータジェネシ
スを行なった。

エシェリヒア・コリ（E.coli）ＭＶ１３０４（宝酒造）
にトランスフオームされたクローンからssＤＮＡを得、
ジデオキシチェインターミネィション法によりＤＮＡシ
ークエンシングを行ない、目的の遺伝子の変異した組換
え体（形質転換条）ｆ１・ＩＬ−１α−１６Ｇ・１４１
Ｓ／E.coliＭＶ１３０４を得た。

このプラスミドは前記式（ｄ）のアミノ酸配列の１６位
ArgがGlyに置換され、且つ３６位ＸがAsnで、１４１位C
ysがSerに置換されたポリペプチド発現プラスミドであ
る。

上記形質転換体は、工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に「Escherichia coli MV 1304／fl.IL-1α・
16G.141S」なる表示で寄託されており、その寄託番号は
微工研条寄第２４３４号（ＦＥＲＭＢＰ−２４３４）である。

形質転換体の培養上記で得た形質転換体（ＭＶ１３０４／ｆ１．ＩＬ−
１α・１６Ｇ・１４１Ｓ）をアンピシリン１００μｇ／
mlを含む下記組成のＬＢ培地６００mlに接種し、３７℃
で一晩振盪培養して、前培養液を得た。

＜ＬＢ培地組成＞バクト・トリプトン（ディフコ社）１０ｇ／ｌバクト・イースト抽出物（同上社）５ｇ／ｌＮａＣｌ（和光純薬社）１０ｇ／ｌ上記前培養液６００mlを下記組成の生産培地３０ｌに接
種し、５０ｌ容ジャーファーメンター（日立製作所）で
３６．５℃にて１４時間、通気量（０．５ＶＶＭ）、攪
拌数（１２０rpm）の条件で培養した。

＜生産培地組成＞Ｎａ_２ＨＰ０_４・１２Ｈ_２０６ｇ／ｌＫＨ_２ＰＯ_４３ｇ／ｌＮａＣｌ０．５ｇ
／ｌＮＨ_４Ｃｌ１ｇ／ｌバクトーカザミノ酸１０ｇ
／ｌバクト−イースト抽出物０．５ｇ
／ｌＬ−システィン・ＨＣｌ７５mg
／ｌＬ−プロリン７５mg
／ｌＬ−ロイシン７５mg
／ｌ４ＮＮａＯＨにてpHを７．４に調整後、１２１℃で３
０分間オートクレーブ処理又は１２３℃で２０分間蒸気
加熱処理し、次いで下記各成分の別滅菌液を接種時に無
菌的に培地に添加する。

＜別滅菌液組成＞１ＭＭｇＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ２ ml／ｌ１ＭＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．１ml／ｌ７．５mg／ｌチアミン・ＨＣｌ１ ml／ｌ４０％グルコース１８．７５ml
／ｌ培養終了後、大腸菌を１ＭＮａ_２ＨＰＯ_４３００ml
に懸濁させ、一夜冷室に放置し、その後同冷室にて１０
ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（pH８．０）に対して２日間透
析し、得られた透析液を遠心分離（１６０００×ｇ）し
て、上清と沈澱物とに分離した。

ＩＬ−１α誘導体の精製上記で得た上清を、２Ｍ酢酸でpH３に調整した後、Ｓ
Ｐ−ＨＰＬＣ［トーソー社製、ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ
カラム（５．５×２０cm）使用］を用いて、以下の条件
で精製した。

カラム：ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ（５．５×２０cm、ト
ーソー社製）溶離液Ａ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（pH４．５）溶離液Ｂ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（pH５．５）濃度勾配：時間（分）％Ｂ００３００１３０１００１６０１００１６５０１９５０流速：３０ml／分上記ＳＰ−ＨＰＬＣの結果、ＧＩＦ活性画分は、リテン
ションタイム１１４〜１３１分に認められた。

次いで上記で得られた活性画分につき、同条件下に再度
ＳＰ−ＨＰＬＣを行なってＧＩ活性画分を得た。

更に上記で得られた活性画分を集め、これを以下のイオ
ン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣ）に付
して精製した。

カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ（５．５×２０c
m、トーソー社製）溶離液Ａ：２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（pH８．０）溶離液Ｂ：０．５ＭＮａＣｌ含有２０ｍＭトリスＨＣ
ｌ緩衝液（pH８．０）濃度勾配：時間（分）％Ｂ００３００１５０６０１５５１００１８５１００１９００流速：３０ml／分上記ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣの結果、ＧＩＦ活性画分は、リ
テンションタイム９８．８〜１０２．８分に認められ
た。

上記で得られた活性画分を集め、これを限外過（ＹＭ
−５メンブラン、アミコン社製使用）によって、２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）の溶液組成とな
るように緩衝液を交換しつつ濃縮して、濃縮精製品を得
た。

尚、このものの等電点は５．０であった。

ＩＬ−１α誘導体の確認 (1)アミノ酸組成上記で得られた濃縮精製品３０μｌを、６mm×５０mm
の肉厚硬質試験管の底部に注意深く入れ、該試験管を反
応バイアルに入れ、ピコタグワークステーション（ウォ
ーターズ社製）にて減圧乾燥した。上記試験管に、６Ｎ
塩酸２００μｌ（１％フェノールを含む）を加え、注意
深く脱気後、封管し、１３０℃で４時間加水分解を行な
った。

次いで加水分解物に０．０２Ｎ塩酸４００μｌを加え、
これをアミノ酸分析用試料とした。

アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー（日立製作所
製、日立８３５型分析計）を用い、上記試料溶液２５０
μｌを注入して行なった。分離されたアミノ酸は、オル
トフタルアルデヒド法で検出した。また定量は、試料の
前後に分析した標準アミノ酸で作成した検量線によって
行なった。

その結果を、Pheを基準（１０モル）として、各アミノ
酸の含有モル比で下記第１表に示す。尚、上記分析条件
下においては、Pro、Cys及びTrpは測定できない。

(2) アミノ酸配列上記で得られた濃縮精製品５０μｌ（２９８ｐｍｏ
ｌ相当）を、アプライドバイオシステムズ社製プロテイ
ンシークエンサー（モデル４７０Ａ）にて分析した。生
じたＰＴＨ−アミノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液
１００〜５００μｌにて適宜希釈し、その５μｌをウォ
ーターズ７１０Ｂ型オートサンプラーにて注入した。ク
ロマトグラフィーのシステムは、ベックマン１１２型ポ
ンプ２台を４２１型コントローラーで作働させた。カラ
ムはウルトラフェアーＯＤＳ−５μｍの充填された２mm
×２５０mmを用い、カラムヒーターにて５５℃に保っ
た。流速は０．３ml／分とし、２０ｍＭ酢酸ナトリウム
とアセトニトリルとの混合液を用いてグラジェント溶出
法で分離し、２６９^nmでモニターした。分析は４５分とした。

その結果、Ｎ末端域３６個のアミノ酸配列は以下の通り
であった。

Ser-Ala-Pro-Phe-Ser-Phe-Leu-Ser-Asn-Val-Lys-Tyr-As
n-Phe-Met-Gly-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-Asn-
Asp-Ala-Leu-Asn-Gln-Ser-Ile-Ile-Arg-Ala-Asp 以上のことより、得られた精製品は、前記式（ａ）で表
わされるＩＬ−１α誘導体の１６位アミノ酸（Arg）がG
lyに置換されたポリペプチドであることが確認された。

また、遺伝子では３６位アミノ酸はAsnであったが、得
られた精製品のそれはAspであった。このことは既に天
然型のＩＬ−１αでも観察されているように３６位アミ
ノ酸がAspである誘導体が安定な誘導体であり、この例
におけるＩＬ−１α誘導体においても同様の変異が起っ
ていることを意味している。

参考例２ＩＬ−１α誘導体［Δ（１−１４）・３６Ｄ・１４１
Ｓ］の製造ＩＬ−１α誘導体発現用プラスミドの調製この例はプラスミドp trpＩＬ−１α−３６Ｄ・１４１
Ｓ〔ヨーロッパ特許公開第２３７０７３号公報記載、こ
れを保有する大腸菌ＨＢ１０１株は、微工研に「Escher
ichia coli HB101／IL-1α-36D 141S」なる名称で微工
研条寄第１２９５号（ＦＥＲＭＢＰ１２９５）として
寄託さている〕を利用して、サイトスペシフィックミュ
ータジェネシスに従い、以下の通り実施された。

即ち、上記プラスミドp trpＩＬ−１α−３６Ｄ・１４
１Ｓより、C1aI-BamHIＤＮＡフラグメント（５２７bp）
を切出し、参考例１と同じｆ１・ＩＬ−１β1ppＴのC1a
I-BamHI長鎖フラグメントとライゲーションして、ｆ１
・ＩＬ−１α−３６Ｄ・１４１Ｓを得た。これからヘル
パーファージＭ１３ＫＯ７（宝酒造）を感染させること
により、一本鎖ＤＮＡを得、これをミュータジェネシス
の鋳型とした。

プライマーとして、合成オリゴヌクレオチド〔５′−Ａ
ＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣＡ
ＴＣ−３′〕を用い、参考例１と同様にオリゴヌクレオ
チド−ダイレクテッドインビトロミュータジェネシスを
用いて、サイトスペシフィック−ミュータジェネシスを
行なった。

エシェリヒア・コリ（E.coli）ＭＶ１１８４（宝酒造）
にトランスフオームされたクローンからssＤＮＡを得、
ジデオキシチェインターミネィション法によりＤＮＡシ
ークエンシングを行ない、目的の遺伝子の変異した組換
え体（形質転換体）ｆ１・ＩＬ−１α−Δ（１−１４）
・３６Ｄ・１４１Ｓ／E.coli ＭＶ１１８４を得た。

このプラスミドは前記式（α）のアミノ酸配列の１−１
４位アミノ酸配列を欠落しており、且つ３６位ＸがAsp
で、１４１位ＹがSerであるポリペプチド発現プラスミ
ドである。

上記形質転換体は、工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に「Escherichia coli MV 1184／fl.IL-1α
・Δ（1-14)36D.141S」なる表示で寄託されており、微
工研条寄第２４３３号（ＦＥＲＭＢＰ−２４３３）とし
て寄託されている。

上記プラスミドを用いて、参考例１と略々同様にして、
目的とするＩＬ−１α誘導体の発現及び精製を行なっ
た。

かくして、目的の誘導体［ＩＬ−１α−Δ（１−１４）
・３６Ｄ・１４１Ｓ］を得た。

その比活性は１．０×１０^６ＧＩＦ単位／mg蛋白であっ
た。

ＩＬ−１α誘導体の確認 (1)アミノ酸組成参考例１の(1)と同様にして、上記で得たＩＬ−１
α誘導体のアミノ酸組成を分析した。

Pheを７として得られた結果は下記第２表に示す通りで
ある。

(2) アミノ酸配列参考例１の(2)と同様にして、上記で得たＩＬ−１
α誘導体のＮ末端域アミノ酸配列を分析した。

その結果、Ｎ末端域１５個のアミノ酸配列は以下の通り
であった。

Met-Met-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-Asn-As
p-Ala-Leu 以上のことより、得られた誘導体には確かに前記式
（α）で表わされるＩＬ−１αのアミノ酸配列の１−１
４位アミノ酸配列が欠失されていることが確認された。

参考例３ＩＬ−１α誘導体［Δ（１−１５）］の製造ＩＬ−１α誘導体発現用プラスミドの調製この例は、ＩＬ−１βサイトスペシフィック−ミュータ
ジェネシス用ベクターｆ１・ＩＬ−１β1ppT〔Biochem.
Biophys.Res.Commun.,150,1106-1114(1988)〕を利用
し、まず該ベクターｆ１・ＩＬ−１β1ppTをEcoRIで切
断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）で処理
し、セルフライゲーションすることによってEcoRIサイ
トを欠落させたｆ１・ＩＬ−１βlppTΔＲＩを作成し、
このプラスミドからHpaI-BamHI長鎖フラグメントを切り
だした。

別に、プラスミドp trpＩＬ−１α−１１３〔ヨーロッ
パ特許公開第２３７０７３号公報記載〕からEcoRI-BamH
I短鎖フラグメントを切りだし、これと上記HpaI-BamHI
長鎖フラグメントとを、合成リンカー［５′−ＡＡＣＴ
ＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴ
ＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡ
ＣＧ−３′及び５′−ＡＡＴＴＣＧＴＡＴＴＴＧＡＴＧ
ＡＴＴＣＴＣＡＴＡＡＴＡＴＴＡＡＡＣＣＴＣＣＴＴＡ
ＣＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣＧＴＡＣＴＡＧＴＴ−３′］を
介して接続させて、目的の遺伝子を変異した組換え体
（形質転換体）ｆ１・ＩＬ−１α・Δ（１−１５）／E.
coli MV1184を得た。

このプラスミドは、前記式（１）のアミノ酸配列の１−
１５位アミノ酸配列を欠落しており、且つ３６位ＸがAs
nで、１４１位ＹがCysの本発明ＩＬ−１α誘導体発現プ
ラスミドである。

ＩＬ−１α誘導体の製造上記プラスミドを用いて、製造例１と略々同様にして、
目的とするＩＬ−１α誘導体の発現及び精製を行なっ
た。

即ち、上記プラストミドｆ１・ＩＬ−１α・Δ（１−１
５）を含む大腸菌（E.coli HB101）を実施例１と同じ条
件で培養（６０ｌ）後、遠心分離（１６０００×ｇ）に
より集菌した。得られた菌体を１Ｍリン酸緩衝液（pH
６．０）に懸濁させ、一夜冷室に放置した後、０．０１
Ｍリン酸緩衝液（pH６．０）に対して２日間透析した。
得られた透析液を遠心分離（１６０００×ｇ）して上清
と沈渣を分離した。

更に得られた沈渣につき上記と同一操作を２回繰り返し
それぞれ上清を得た。得られた上清を合わせ、以下の清
掃操作に供した。

１Ｌ−１α誘導体の精製まず上記で得た上清を、ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣ［トーソ
ー社製、ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（５．５×
２０cm）使用］を用いて、以下の条件で精製した。

カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ（５．５×２０c
m、トーソー社製）溶離液Ａ：２０ｍＭトリス塩酸（pH８．０）溶離液Ｂ：２０ｍＭトリス塩酸（pH８．０）＋０．５Ｍ
ＮａＣｌ濃度勾配：時間（分）％Ｂ００３００１５０６０１５５１００１８５１００１９００流速：３０ml／分上記において、リテンションタイム８８〜９３分（これ
をフラクションＡとよぶ）及び９９〜１０３分（これを
フラクションＢとよぶ）をそれぞれ集め、別々に限外
過（ＹＭ−５メンブラン使用）して濃縮した後、ゲル
過ＨＰＬＣ［トーソー社製、ＴＳＫゲルＧ−２０００Ｓ
ＷＧカラム（２１．５×６００mm）使用、溶離液ＰＢＳ
⁻］で精製した。

上記で精製したフラクションＡを更に２Ｍ酢酸でpH４と
した後、ＳＰ−ＨＰＬＣ［トーソー社製、ＴＳＫゲルＳ
Ｐ−５ＰＷ（２１．５×１５０mmカラム］に付し、下記
条件で溶出させた。

カラム：ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ（２１．５×１５０m
m、トーソー社製）溶離液Ａ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（pH５．０）溶離液Ｂ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（pH５．０）＋０．
５ＭＮａＣｌ濃度勾配：時間（分）％Ｂ００２００１１０４５１１５１００１３０１００１３５０流速：３ml／分リテンションタイム８７〜９３分の分画を集め、限外
過（ＹＭ−５メンブラン使用）によって２０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（pH６．０）の溶液組成となるように
緩衝液を交換しつつ濃縮して、濃縮精製品を得た。

ＩＬ−１α誘導体の確認 (1)上記で得た精製品のアミノ酸分析を、製造例１の
(1)と同様にして実施した。

pheを７として得られた結果は下記第３表に示す通りで
ある。

(2)参考例１の(2)と同様にして、上記で得たＩＬ−
１α誘導体のＮ末端域アミノ酸配列を分析した。その結
果、Ｎ末端域２３個のアミノ酸配列は以下の通りであっ
た。

Met-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-Asn-Asp-Al
a-Leu-Asn-Gln-Ser-Ile-Ile-Arg-Ala-Asn-Asp- 以上のことより、得られた誘導体は前記式（α）で表わ
されるＩＬ−１α誘導体のアミノ酸配列の１−１５位ア
ミノ酸配列が欠失されており且つＸがAsnであることが
確認された。

(3)また上記で得たフラクションＢについて、フラク
ションＡと同様にして精製し、精製品のアミノ酸分析を
同様に実施した。Pheを７として得られた結果は下記第
４表に示す通りである。

(4)また上記フラクションＢの精製品につき、参考例１
の(2)と同様にしてＮ末端域アミノ酸配列を分析した
結果、Ｎ末端域２３個にアミノ酸配列は以下の通りであ
った。

Met-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-Asn-Asp-Al
a-Leu-Asn-Gln-Ser-Ile-Ile-Arg-Ala-Asp-Asp- 以上のことより、得られた誘導体は前記式(α)で表わさ
れるＩＬ−１α誘導体のアミノ酸配列の１−１５位アミ
ノ酸配列が欠失されており且つＸがAspであることが確
認された。

参考例４ＩＬ−１α誘導体［Δ（１−１５）・３６Ｄ・１４１
Ｓ］の製造ＩＬ−１α誘導体発現用プラスミドの調製この例はプラスミドp trpＩＬ−１α・３６Ｄ・１４１
Ｓを利用して、サイトスペシフィック−ミュータジェネ
シスに従い、以下の通り実施された。即ち、プラスミド
p trpＩＬ−１α・３６Ｄ・１４１Ｓより、ClaI-BamHI
ＤＮＡフラグメント（５２７bp）を切出し、実施例１と
同じｆ１・ＩＬ−１βlppＴのClaI-BamHI長鎖フラグメ
ントとライゲーションしてｆ１・ＩＬ−１α・３６Ｄ・
１４１Ｓを得た。これからヘルパーファージＭ１３ＫＯ
７（宝酒造）を感染させて、一本鎖ＤＮＡ（ssＤＮＡ）
を得、これをミュータジェネシスの鋳型とした。

プライマーとして、合成オリゴヌクレオチド〔５′−ＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣ
−３′〕を用い、実施例１と同様にオリゴヌクレオチド
−ダイレクテッドインビトロミュータジェネシスキット
（アマシャム社）を用いて、サイトスペシフィック−ミ
ュータジェネシスを行なった。

エシェリヒア・コリＭＶ１１８４にトランスフォームさ
れたクローンからSSＤＮＡを得、ジデオキシチェインタ
ーミネィション法によりＤＮＡシークエンシングを行な
い、目的の遺伝子の変異した組換え体（形質転換体）ｆ
１・ＩＬ−１αΔ（１−１５）・３６Ｄ・１４１Ｓ／
Ｅ．coliＭＶ１１８４を得た。

更に、大量培養用の発現ベクターを次のように作成し
た。即ち、まず前記ｆ１・ＩＬ−１βlppＴをMluI及びS
alIで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフラグメ
ント）で処理し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲートし、
ｆ１・ＩＬ−１βlppＴΔＭＳを得た。これを更にEcoR
I、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフラグメント）、セ
ルフライゲーションを行ない、次にAatII、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ、BglIIリンカー（ｐＧＡＡＧＡＴＣＴＴ
Ｃ）処理し、AatIIサイトをBgIIIサイトに変換した。同
様に、SalI、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフラグメン
ト）、XbaIリンカー（ｐＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣ）処理
し、SalIサイトをXbaIサイトに変えた。これからClaI-B
amHIＤＮＡ長鎖フラグメント（５．５kb）を切出し、先
のｆ１・ＩＬ−１αΔ（１−１５）・３６Ｄ・１４１Ｓ
からのClaI-BamHIＤＮＡフラグメント（４８２bp）とラ
イゲーションして、ｆ１・ＩＬ−１αΔ（１−１５）・
３６Ｄ・１４１ＳＡ（AatII→BglII,SalI→XbaI）を得
た。これから１１０９bp BglII-XbaIＤＮＡフラグメン
トを切出した。

別に、ｐＡＴ１５３のClaIサイトをBglIIサイトに、ま
たDraIサイトをXbaIサイトに置き換え、BglII及びXbaI
で切断して得た２５１４bpのBglII-XbaI長鎖フラグメン
トと、先の１１０９bpのBglII-XbaIフラグメントをライ
ゲートし、目的の組換え体ｐＡＴ・ＩＬ−１αΔ（１−
１５）・３６Ｄ・１４１Ｓを得た。

このプラスミドは、前記式（１）のアミノ酸配列の１−
１５位アミノ酸配列を欠落しており（但し、この組換え
体を培養して蛋白質を作らせて、翻訳開始コドンに由来
するMetが付加した蛋白質ができる場合は、実際上１−
１４位アミノ酸配列が欠落したポリペプチドができ
る）、且つ３６位ＸがAspで、１４１位ＹがSerの本発明
ＩＬ−１α誘導体発現プラスミドである。

上記形質転換体は、工業技術院微生物工業研究所（微工
研）に、「Escherichia coli HB101／pAT IL-1αΔ(1-1
5)36D141S」なる表示で、微工研条寄第２４８３号（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２４８３）として寄託されている。

形質転換体の培養上記形質転換体をテトラサイクリン１０μｇ／mlを含む
下記組成のＬＢ培地６００mlに摂取し、３７℃で一晩振
盪培養して前培養液を得た。

＜ＬＢ培地組成＞バクト・トリプトン（ディフコ社）１０ｇ／ｌバクト・イースト抽出物（同上社）５ｇ／ｌＮａＣｌ（和光純薬社）１０ｇ／ｌ上記前培養液６００mlを、下記組成の生産培地３０ｌに
接種し、５０ｌ容ジャーファーメンター（日立製作所）
で３６．５℃にて１６時間、通気量（１ＶＶＭ）、攪拌
数（３００rpm）の条件で培養した。

＜生産培地組成＞Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ６ｇ／ｌＫＨ_２ＰＯ_４３ｇ／ｌＮａＣｌ０．５ｇ
／ｌＮＨ_４Ｃｌ１ｇ／ｌカゼイン酸加水分解物（シグマ社）１０ｇ
／ｌバクト−イースト抽出物０．５ｇ
／ｌＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ２．５mg／ml Ｌ−システィン・ＨＣｌ７５ mg
／ml Ｌ−プロリン７５ mg
／ml Ｌ−ロイシン７５ mg
／ml ４ＮＮａＯＨにてpHを７．４に調整後、１２１℃で３
０分間オートクレーブ処理し、次いで下記各成分の別滅
菌液を接種時に無菌的に培地に添加する。

＜別滅菌液組成＞１ＭＭｇＳＯ_４・４Ｈ_２０２ ml／ｌ１ＭＣａＣｌ_２・２Ｈ_２００．１ml／ｌ７．５mg／ｌチアミン・ＨＣｌ１ ml／ｌ４０％グルコース１８．７５ml
／ｌ培養後、遠心分離（１６０００×ｇ）により集菌し、得
られた菌体を１Ｍリン酸緩衝液（pH６．０）に懸濁さ
せ、一夜冷室に放置した後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（pH８．０）に対して２日間透析した。得られた透析液
を遠心分離（１６０００×ｇ）して上清と沈渣を分離
し、更に得られた沈渣に上記と同一操作を繰り返して、
上清を得た。得られた各上清を合わせ、以下の精製操作
所に供した。

ＩＬ−１α誘導体の精製まず上記で得た上清を、２Ｍ酢酸を用いてpH３に調節
した後、ＳＰ−ＨＰＬＣ［トーソー社製、ＴＳＫゲルＳ
Ｐ−５ＰＷ（５．５×２０cm）使用］を用いて、以下の
条件で精製した。

カラム：ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ（５．５×２０cm、ト
ーソー社製）溶離液Ａ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（pH５．０）溶離液Ｂ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（pH５．０）＋０．
５ＭＮａＣｌ濃度勾配：時間（分）％Ｂ００３００９０３０９５１００１２５１００１３００流速：３０ml／分上記において、リテンションタイム７０〜７５分の分画
を集め、これを１Ｍトリス塩酸緩衝液でpH８．１に調整
した後、ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣ［トーソー社製、ＴＳＫゲ
ルＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（５．５×２０cm）に付し、
下記条件で溶出させた。

カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ（５．５×２０c
m、トーソー社製）溶離液Ａ：２０ｍＭトリス塩酸（pH８．０）溶離液Ｂ：２０ｍＭトリス塩酸（pH８．０）＋０．５Ｍ
ＮａＣｌ濃度勾配：時間（分）％Ｂ００２００１４０６０１４５１００１６５１００１７００流速：３０ml／分リテンションタイム９２〜９６分の分画を集め、限外
過（ＹＭ−５メンブラン使用）によって濃縮した後、ゲ
ル過ＨＰＬＣ［トーソー社製、ＴＳＫゲルＧ−２００
０ＳＷＧカラム（２１．５×６００mm）使用、溶離液Ｐ
ＢＳ⁻］で精製した。

上記で精製したものを、更に２Ｍ酢酸でpH４とした後、
ＳＰ−ＨＰＬＣ［トーソー社製、ＴＳＫゲルＳＰ−５Ｐ
Ｗ（２１．５×１５０mm）カラム］に付し、下記条件で
溶出させた。

カラム：ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ（２１．５×１５０m
m、トーソー社製）溶離液Ａ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（pH５．０）溶離液Ｂ：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（pH５．０）＋０．
５ＭＮａＣｌ濃度勾配：時間（分）％Ｂ００２００１１０４５１１５１００１３０１００１３５０流速：３０ml／分リテンションタイム８７〜９０分の分画を集め、限外
過（ＹＭ−５メンブラン使用）によって２０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（pH７．０）の溶液組成となるように
緩衝液を交換しつつ濃縮して、精製品を得た。

ＩＬ−１α誘導体の確認 (1)上記で得た精製品のアミノ酸分析を、実施例１の
(1)と同様にして実施した。

Pheを７として得られた結果は下記第５表に示す通りで
ある。

(2)参考例１の(2)と同様にして、上記で得たＩＬ−
１α誘導体のＮ末端域アミノ酸配列を分析した。

Met-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-Asn-Asp-Al
a-Leu-Asn- 以上のことより、得られた誘導体は前記式（α）で表わ
されるＩＬ−１αのアミノ酸配列の１−１５位アミノ酸
配列が欠失されていることが確認された。

参考例５ＩＬ−１β誘導体［２４−１５３］の製造発現プラスミドの作製ヒトＩＬ−１βをコードする遺伝子を保有するプラスミ
ドp trpＧＩＦ−α〔ヨーロッパ特許公開：ＥＰＯ１８
７９９１号参照、これで形質転換された大腸菌は「Esch
erichia coli χ1776／p trpＧＩＦ−α」なる名称で、
１９８５年１２月１２日に工業技術院微生物工業研究所
に、微工研条寄第９４９号（ＦＥＲＭＢＰ−９４９）
として寄託されている〕を利用し、以下に示す方法に従
い、所望のポリペプチド発現プラスミドを構築した。

即ち、p trpＧＩＦ−αを制限酵素NdeI及びSaIIで切断
後、ＩＬ−１βの２４番目以降のアミノ酸配列をコード
している領域を含む７８１bpのＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動により単離した。このＤＮＡ断片をＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いて、制限酵素Nd
eI及びSalI切断部位を平滑末端とした。

一方、５′−ＣＧＡＴＡＡＴＧ−３′及び５′−ＣＡＴ
ＴＡＴ−３′の５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼによりリン酸化し、これを先の平滑末端にしたＤＮＡ
断片に４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、制限酵素ClaI
及びBamHIで切断し、アガローズゲル電気泳動を行ない
５１０bpのＤＮＡ断片を単離精製した。

また、プラスミドｐＴＭ１を制限酵素ClaI及びBamHIで
切断後、アガロースゲル電気泳動を行なって、trpプロ
モーターを含む約４．４kbpのＤＮＡ断片を単離精製し
た。このＤＮＡ断片と、先で得られた５１０bpのClaI−
BamHIＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
させ、エシェリヒア・コリＨＢ１０１にトランスフォー
ムさせ、目的のトランスフォーマントを、ボイリング法
（boiling method）により得られるプラスミドＤＮＡの
制限酵素分析により選択した〔T.Maniatis,E.F.Fritsch
and J.Sambrook,Molecular Cloning,pp 366,(1982)Col
d Spring Harbor Laboratory〕。

形質転換体の培養上記形質転換体（E.coli HB 101／p trpGIF−α−２４
−１５３）を、アンピシリン５０μｇ／ml及びＬ−トリ
プトファン２０μｇ/mIを含むＬＢ培地（１％トリプト
ン、０．５％酵母エキス及び０．５％ＮａＣｌ）１０ml
中で、３７℃で一晩浸盪培養し、この１mlをアンピシリ
ン５０μｇ／ml及び１％カザミノ酸を含むＭ９最小培地［０．６％Na₂HPO₄、０．３％KH₂PO₄、０．０５％Ｎａ
Ｃｌ、０．１％ＮＨ_４Ｃｌ、２ｍＭＭｇＳＯ_４、０．
２％グルコース及び０．１ｍＭＣａＣｌ_２］５０mlに
植菌し、３７℃で振盪培養し、５５０nmでの吸光度（Ｏ
Ｄ）が１．０となった時点で菌体を集め、１５％シュー
クロース−５０ｍＭトリスＨＣｌ（pH８．０）−５０ｍ
ＭＥＤＴＡ（pH８．０）の溶液５mlに懸濁させ、１０
mg／mlリゾチーム［１０ｍＭトリスＨＣｌ（pH８）で溶
解した溶液］５００μｌを加え、更に０．３％トリトン
Ｘ１００−１８７．５ｍＭＥＤＴＡ（pH８．０）−１
５０ｍＭトリスＨＣｌ（pH８．０）の溶液５mlを加え、
室温で１５分間放置後、更によく懸濁させ、遠心分離に
よつてＧＩＦ活性を有する菌体抽出物上清を得た。

ＩＬ−１β誘導体の精製及び同定参考例１の及びと同様にして、クロマトグラフィー
操作を行なって精製し、得られる濃縮精製品につき等電
点、アミノ酸組成及びアミノ酸配列を求め、これが前記
式（Ｂ）で表わされるＩＬ−１βのアミノ酸配列の２４
番目から１５３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドであることを確認した。

参考例６ＩＬ−１β誘導体［１−８２］の製造発現プラスミドの作製参考例５に示したp trpＧＩＦ−αを、制限酵素PvuIIで
切断後、ＩＬ−１βの１番目から８２番目までのアミノ
酸配列をコードしている領域を含む約２．９kbpのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動により単離精製した。

一方、XbaIリンカー［５′−ＣＴＣＴＡＧＡＧ−３′］
の５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン
酸化し、これを上記で得られたＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結後、制限酵素ClaI及びXbaIで切断
し、アガロースゲル電気泳動を行ない２５０bpのＤＮＡ
断片を単離精製した。

また、プラスミドｐＴＭ１を制限酵素BamHIで切断後、
ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を用いて、制限
酵素BamHI切断部位を平滑末端とした。続いてこのＤＮ
Ａ断片にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化
したXbaIリンカー［５′−ＣＴＣＴＡＧＡＧー３′］を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、制限酵素ClaI及び
XbaIで切断し、trpプロモーター等を含むＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動により単離精製した。

このＤＮＡ断片と、先で得られた２５０bpのＤＮＡ断片
とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、エシェリヒ
ア・コリＨＢ１０１にトランスフォームさせ、目的のト
ランスフォーマントを、ボイリング法により得られるプ
ラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択した。

形質転換体の培養上記形質転換体を参考例５と同様にして培養、処理し
て、ＧＩＦ活性を有する菌体抽出物上清を得た。

ＩＬ−１β誘導体の精製及び同定参考例５のと同様にして精製し、得られる濃縮精製品
につき等電点、アミノ酸組成及びアミノ酸配列を求め、
これが前記式（Ｂ）で表わされるＩＬ−１βのアミノ酸
配列の１番目から８２番目のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドであることを確認した。

実施例１血小板減少症治療剤の調製参考例２で得られたポリペプチド［ＩＬ−１α・Δ（１
−１４）・３６Ｄ・１４１Ｓ］の生理活性食塩水（ＧＩ
Ｆ活性として１×１０^６単位／ml）に、ヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）を０．５％となるように添加して、過
（０．２２μｍメンブランフィルター使用）後、これを
無菌的に１mlずつバイアル瓶に分注して、凍結乾燥し、
注射用製剤を調整した。

かくして得られた製剤は、これを用時注射用蒸留水１ml
に溶解して利用される。

実施例２薬理効果試験Ｉ（造血作用試験）この例は、本発明血小板減少症治療剤有効成分化合物の
薬理効果を試験したものである。

この試験に用いたポリペプチドは以下の通りである。

ＩＬ−１α［３６Ｄ・１４１Ｓ］（ヨーロッパ特許公開第２３７０７３号参照）ＩＬ−１α・［Δ（１−１４）・３６Ｄ・１４１Ｓ］ＩＬ−１αの１−１４位アミノ酸配列を欠失させ、３６
位AsnをAspに、１４１位CysをSerにそれぞれ置換したＩ
Ｌ−１α誘導体〔参考例２で得たもの〕ＩＬ−１α・［１６Ｇ・３６Ｄ・１４１Ｓ］ＩＬ−１αの１６位ArgをGlyに、３６位AsnをAspに、１
４１位CysをSerにそれぞれ置換したＩＬ−１α誘導体
〔参照例１で得たもの〕ＩＬ−１β［天然型ＩＬ−１β］（Biochem.Biophys.Res.Commun.,147(1),315-321(1987)
参照）また、この試験には静岡県実験動物農業協同組合より購
入した９周齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。

上記有効成分としてのポリペプチドは、之等をそれぞれ
マウス血清アルブミン１００μｇ／ml含有注射用生理食
塩水「大塚製薬工場社製］にて所定の濃度に希釈して用
いた。

試験開始日（０日）に実験用小動物Ｘ線照射装置（日立
ＭＢＲ−１５０５Ｒ）を用いて、マウスに４００RadＸ
線を全身照射して放射線による血小板減少症を誘発させ
た。

その翌日より各供試試薬を連日１３回皮下投与した。１
４日目に、マウスをエーテル麻酔し、開腹後に下大静脈
より採血し、マイクロティナー［ベクトンディッキンソ
ン(BECTON DICKINSON)社製］に血液を採取した。血球は
自動血球分析装置（オルソＥＬＴ−８）により分析し
た。

尚、実験は１群５匹のマウスを用いて行なった。

上記試験において、各供試試薬の各種投与量における１
４日目の血小板数（平均値±ＳＥ，１０^３／mm³）の結
果を下記第６表に示す。

尚、有意差検定は、溶媒投与群の値を対照としてスチュ
ーデンツＴテストにより行なった。^※はｐ≦０．００１
を示す。

上記第６表より、無処置正常群の血小板数は１１６４±
１０であるのに対し、溶媒投与群では４４７±５２まで
血小板数が減少しているが、本発明有効成分（ＩＬ−１
及びそれらの誘導体）の投与群では、０．１μｇ／kgの
投与量から用量に依存して明白な血小板数の増加が認め
られ、従って之等が血小板減少症の治療に有効であるこ
とが判る。

実施例３薬理効果試験（造血作用試験）下記ＩＬ−１の誘導体を用いて実施例２と同一の薬理試
験を実施した。

ＩＬ−１α［天然型］ＩＬ−１α［３６Ｄ・１４１Ｓ］ＩＬ−１α［Δ（１−１５）］（参考例３で得たＩＬ−１α誘導体）ＩＬ−１α［Δ（１−１５）・３６Ｄ］（参考例３で得たＩＬ−１α誘導体）ＩＬ−１α［Δ（１−１５）・３６Ｄ・１４１Ｓ］（参考例４で得たＩＬ−１α誘導体）ＩＬ−１α［Δ（１−１４）・３６Ｄ・１４１Ｓ］（参考例２で得たＩＬ−１α誘導体）上記試験において、各供試試薬の各種投与量における１
４日目の血小板数（平均値±ＳＥ，×１０^３／mm³）の
結果を下記第７表に、また好中球数（平均値±ＳＥ，×
１０^３／mm³）の結果を下記第８表にそれぞれ示す。

実施例４生物活性試験ＩＬ−１の誘導体のＧＩＦ活性を求めた結果を下記第９
表に示す。

尚表中ＳＡは比活性をＲＡは相対活性を示す。

実施例５発熱性試験ＩＬ−１の誘導体の発熱性を試験するため、ラットを用
いた以下の実験を行なった。

実験に用いたラットは６〜１０週齢の雄性ＢＤラット
（体重１６０〜２５０ｇ）（日本チャールスリバー社）
である。

ＩＬ−１誘導体は、それぞれ１００μｇ／mlのラット血
清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水にて適当濃度
に希釈して供試液とした。また、対照としてはヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）を使用した。

上記供試液及び対照液の所定量を、予め体重測定したラ
ットに皮下投与し、投与直前並びに２、４及び６時間後
にそれぞれラットの直腸体温を、サーミスター温度集録
装置Ｋ９２３（宝工業株式会社製）により測定した。

供試物質として、各参考例で得られた本発明誘導体並び
に比較のためのＩＬ−１β〔天然型、Biochem.Biophys.
Res.Commun.,147(1)，315-321(1987)〕及びＩＬ−１α
誘導体〔ＩＬ−１α［３Ｄ・１４１Ｓ］、前記式（Ａ）
の３６番目のアミノ酸（Asn）をAspに、１４１番目のア
ミノ酸（Cys）をSerに置換したもの、ヨーロッパ公開特
許第２３７０７３号〕のそれぞれを用いて得られた結果
（直腸温度が最も上昇する供試物質投与４時間の結果）
を第１図に示す。

第１図において、横軸は供試物質の投与量（μｇ／kg）
を、縦軸は供試液投与直前の直腸温度を基準（０）とし
た該温度変化値（Δ℃）を示し、また図中（１）は参考
例１で得た発明誘導体［ＩＬ−１α・１６Ｇ・１４１
Ｓ］を、（２）参考例２で得た本発明誘導体［ＩＬ−１
α・Δ（１−１４）・３６Ｄ・１４１Ｓ］を、（３）は
天然型ＩＬ−１βを、（４）は上記ヨーロッパ公開特許
記載のＩＬ−１α誘導体［ＩＬ−１α・３６Ｄ・１４１
Ｓ］を、また（５）は対照とするＨＳＡをそれぞれ示
す。

上記第１図より、ＩＬ−１α誘導体は、試験したいずれ
の投与量においても発熱は実質的に起こらず、発熱性が
顕著に低減されているとが明らかである。これに対して
ＩＬ−１βは、０．１μｇ／kgの投与量において既に発
熱が認められ、投与量増加に従い高い発熱性が観察され
る。またＩＬ−１α・３６Ｄ・１４１Ｓは、０．１μｇ
／kg、１μｇ／kg及び１０μｇ／kgの投与量では発熱は
認められないが、１００μｇ／kgの投与では発熱性がみ
られる。

また参考例２で得たＩＬ−１α誘導体［ＩＬ−１α［Δ
（１−１４）・３６Ｄ・１４１Ｓ〕と共に、参考例３で
得たＩＬ−１α誘導体〔ＩＬ−１α［Δ（１−１５）］
及びＩＬ−１α［Δ（１−１５）・３６Ｄ〕並びに参考
例４で得たＩＬ−１α誘導体〔ＩＬ−１α［Δ（１−１
５）・３６Ｄ・１４１Ｓ〕のそれぞれを用いて、上記と
同一試験を行なった結果を第２図に示す。

図示中、（１）はＩＬ−１α［Δ（１−１５）］を、
（２）はＩＬ−１α［Δ（１−１５）・３６Ｄ］を、
（３）はＩＬ−１α［Δ（１−１５）・３６Ｄ・１４１
Ｓを、（４）はＩＬ−１α［Δ（１−１４）・３６Ｄ・
１４１Ｓ］を（５）はＩＬ−１αを、（６）はＩＬ−１
α［３６Ｄ］を、（７）はＩＬ−１α［３６Ｄ・１４１
Ｓ］を、また（８）は［⁷¹Ser］ＩＬ−１β〔ヨーロッ
パ公開特許第１８７９９１号参照〕をそれぞれ示す。

実施例６ヘモポイエチン−１活性試験ヘモポイエチン−１（Hemopoietin-1）活性を、スタン
レーら（Stanley,E.R.etal.）の方法〔Cell,45,667-674
(1986)〕に準じて行なった。

即ち、静動協より購入した雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスへ５
−フルオロウラシル１５０mg／kgを静脈内投与し、３日
後に大腿骨骨髄細胞（５−ＦＵ処置骨髄細胞）採取し
た。上記５一ＦＵ処置骨髄細胞１．５×１０^５個に、一
定濃度（200U/ml）のマウスＭ−ＣＳＦと、種々の濃度
のＩＬ−１α又はＩＬ−１α誘導体を添加し、軟寒点培
地中にて培養し、７日目に培地中に形成されたコロニー
を計数した。尚、マウスＭ−ＣＳＦはＬcell培養上清よ
り調製した。

得られ結果を第１０表に示す。

実施例７臨床試験例胃癌で肝、頚部リンパ節移転の認められるステージ２、
ＰＳ３の４１才の女性にＩＬ−１β誘導体［前記式
（Ｂ）の７１位CysをにSerに置換したもの］の１×１０
^４単位（ＧＩＦ単位）を、毎日１回、皮下投与し、その
血液像を調べた。

その結果を下記第１１表に示す。

第１１表に示す通り、投与１週間後より血小板数は増加
し、投与３週間後には投与前値の１．７倍にまで増加し
た。また白血球数も投与前値より１．８倍に増加した。

かくして、血小板数及び白血球数減少の改善効果が認め
られた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、ＩＬ−１誘導体の発熱性を調べた
結果を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インターロイキン１及びその誘導体から選
ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する血小板
減少症治療剤。
【請求項２】有効成分がＩＬ−１α［３６Ｄ・１４１
Ｓ］である請求項１に記載の血小板減少症治療剤。
【請求項３】有効成分がＩＬ−１α［Δ（１−１４）・
３６Ｄ・１４１Ｓ］である請求項１に記載の血小板減少
症治療剤。
【請求項４】有効成分がＩＬ−１β［７１Ｓ］である請
求項１に記載の血小板減少症治療剤。