JPH02138222A - インターロイキン‐１βの安定化組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）活性物
の新しい安定化された組成物に関する。

従来の技術 ＩＬ−１βは、マクロファージ・単球のみならす多くの
細胞から産生され、多様な生物活性を示すことか知られ
ている（代謝、Ｖｏｌ、２３．臨時増刊号、免疫　８６
．Ｄ９７−１０４　（１９８６）：Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　”Ｉ　２　、Ｎｏ、
　６．　Ｄ　７５３７６０　（１９８６）等参照〕。

上記活性より該ＩＬ−１βは医薬品としての応用か期待
されており、本出願人もまた先にＩＬ１β及びその誘導
体が種々の医薬用途に有効でおることを明らかにした（
ヨーロッパ特許公開番号：ＥＰ０２３７９６７Ａ２参照
〕。

一方、医薬品としての応用に際しては、その有効成分が
通常の医薬形態及び保存条件下において、経時変化する
ことなく安定であることが要求されることは勿論で必り
、上記ＩＬ−１βの場合も当然に上記性能が要求される
。殊に、臨床応用を可能とするまでに高度に精製された
均質標品においては、安定性上その扱いにより充分な配
慮か要求され、その活性を保持するには通常種々の制限
を受ける。しかして、凍結処理や凍結乾燥処理また温度
、時間等の種々の保存条件下において、より安定に保つ
ことのできるＩＬ−１βの安定化された製剤組成物の開
発、改良が斯界で望まれている。

発明が解決しようとする課題 ＩＬ−１β活性物は薬理活性が強く極めて微量で使用さ
れる一方、容器壁への吸着性を有しており、有効成分と
しての含量が低下すればするほどこの吸着性が問題とな
り、その防止が必要となる。

またＩＬ−１β活性物は不安定で、この不安定さは有効
成分の含量が低下すればするほど増加する傾向かある。

本発明は、上記問題点を解決して、医薬品としての応用
面で特に好適なＩＬ−１β活性物の安定な組成物を提供
し、また等張付を有する上記ＩＬ１β活性物の安定化さ
れた組成物を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段 本発明者らは上記目的より鋭意研究を重ねた結果、ＩＬ
−１β活性物に人血清アルブミン及び／又は糖類と界面
活性剤とを配合する時には、之等が吸着防止効果及び安
定化効果を奏し、ＩＬ−１β活性物の活性か著しく安定
化されることを見出し、ここに本発明を完成するに至っ
た。

本発明によればＩＬ−１β活性物と共に人血清アルブミ
ン及び／又は゛糖類と界面活性剤とを配合してなるＩＬ
−１βの安定化組成物が提供される。

本発明組成物において、有効成分として利用する■Ｌ−
１β活性物にはＩＬ−１β及びその誘導体が包含される
。２等有効成分としては、より具体的には、本出願人の
先のヨーロッパ特許公開公報（ＥＰＯ２３７９６７Ａ２
＞に記載のポリペプチド及びその均等物を例示できる。

該ポリペプチドは、下式（Ａ＞ Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−３ｅ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｎｅｔ−３ｅｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ｔｌｉｓ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−）１ｅｔ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ＶａｌＶａ　ｌ　−Ｐｈｅ−３ｅｒ−
Ｎｅｔ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｖａ　！　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ
　ｌ　ｙ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ　−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｖａｌ
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｎｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−１ｌ
　ｅ−Ｇ　ｌ　ｕ　−１ｌ　ｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙ
ｓ−ＬｅｕＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−
Ｇｌ　ｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−
１１ｅ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｎ−）１ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ａｓｐ−１ｌ　ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ
ｌ−３ｅｒ−３ｅｒ で表わされるＩＬ−１βのアミノ酸配列において、ａ）
１位Ａ１ａ、３位Ｖａｌ、４位Ａｒ（１，５位３ｅｒ、
８位Ｃｙｓ、１１位Ａｒｇ、３０位ＨｉＳ、７１位Ｃｙ
ｓ、９３位ＬＪＳ、９７位ＬＶＳ、９８位Ａｒｇ、９９
位Ｐｈｅ、１０３位Ｌｙｓ、１２０位丁ｆｆ）、１２１
位丁ｙｒ及び１５３位Ｓｅｐから選ばれた少なくとも１
つのアミノ酸残塁が欠失されているが又は他のアミノ酸
残塁で置換されていること、ｂ）１位のＡｌａから９位
のＴｈｒに至るアミノ酸配列又はその中の少なくとも１
つのアミノ酸残塁が欠失されていること（但し上記ａ）
に記載の１位Ａｌａ、３位Ｖａｔ、４位Ａｒｇ、５位３
ｅｒ及び８位ＣｙＳからなる群から選ばれたアミノ酸残
塁の少なくとも１つか欠失されている場合を除く）、Ｃ
）１０３位のＬＪＳから１５３位の３ｅｒに至るアミノ
酸配列又はその中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠
失されていること（但し上記ａ）に記載の１０３位ＩＶ
Ｓ、１２０位Ｔｒｐ、１２１位丁ｙｒ及び１５３位３ｅ
ｒからなる群から選ばれたアミノ酸残塁の少なくとも１
つが欠失されてぃる場合を除く）、 ｄ）上記式（Ａ＞のＮ末端にアミノ酸残塁又は下式（Ｂ
）で示される１′位Ｍｅｔから１１６′位ＡＳＤに至る
アミノ酸配列もしくはそのＣ末端側の一部アミノ酸配列
が付加されていること、式（Ｂ） １（ｅｔ−八ｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−
Ｌｅｕ−Ａｌａ−３ｅｒ−ＧｌｕＭｅｔ−Ｎｅｔ−Ａｌ
ａ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ
−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−１
−１ｅｔ−ＬｙＳ−ＣｙＳ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
ＡＳｐ−ＬｅＬＩ−ＡＳＩ）Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｅｕＡｒｇ−Ｉｌｅ−３ｅｒ−Ａｓｐ−旧５−ｔｌｉｓ
−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−八ｒｇ−
Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＡＳｐ−ＬｙＳ−ＬｅＬｌ−Ａ
ｒ（１−ＬｙＳ−Ｈｅｔ−ＬｅｌＪ−Ｖａ　ｌ　−Ｐｒ
ｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌ
　ｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−１ｌ　ｅ−Ｐｈ
ｅ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｐｒｏ−Ｉ　
ｌ　ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−丁ｈｒ−丁ｒｐ−Ａ
Ｓｐ−ＡＳｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−王ｙｒ−ｖａｌ−旧５
−ＡＳｐというａ）〜ｄ）の条件の少なくとも１つを充
足することのあるアミノ酸配列を有することにより特徴
例けられる。

上記及び以下の本明細書におけるアミノ酸及びポリペプ
チドの表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＡＣＩＵＢによる命
名法又は規則における略号乃至当該分野で慣用されてい
る略号による表示法に従うものとする。また塩基配列に
おける核酸の表示も同様とする。アミノ酸の数又は位置
は、欠落及び付加がある場合でおっても、全てＩＬ−１
βのアミノ酸配列即ち前記式（Ａ）の配列に従い表示す
る。但しアミノ酸の位置を示す数値の内ダッシュを付し
たものは式（Ｂ）のアミノ酸配列に従う。

以下、上記ポリペプチド（ＩＬ−１β及びその誘導体）
につき詳述する。

上記ＩＬ−１β誘導体は、ＩＬ−１βの前記式（Ａ＞に
示されるアミノ酸配列において、上記ａ）〜ｄ）の要件
の１つ又は２つ以上を組み合わせて充足するアミノ酸配
列を含有するポリペプチドである。好ましい誘導体は前
記要ｎａ＞〜Ｃ）の少なくとも１つを充足するアミノ酸
配列を有するもの及びａ）〜Ｃ）の少なくとも１つの要
件とｄ）の要件とを同時に満足するアミノ酸配列を有す
るものでおる。

ＩＬ−１βａ１体であるポリペプチドの好ましい具体例
を挙げると次の通りでおる。

１）少なくとも１位Ａｌａが欠失されているが又は他の
アミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

？）少なくとも３位Ｖａｌが欠失されているか又は仙の
アミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

３）少なくとも４位Ａｒ（Ｉか欠失されているか又は他
のアミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

４）少なくとも５位３ｅｒが欠失されているか又は他の
アミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

５）少なくとも８位ＣｙＳが欠失されているか又は他の
アミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

６）少なくとも１１位Ａｒｇが欠失されているか又は他
のアミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

７）少なくとも３０位）−１ｉｓが欠失されているが又
は他のアミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

８）少なくとも７１位Ｃｙｓが欠失されているが又は他
のアミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

９）少なくとも９３位ＬＶＳか欠失されているが又は他
のアミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

１０〉少なくとも９７位Ｌｙｓが欠失されているが又は
他のアミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

１１）少なくとも９８位Ａｒｇが欠失されているが又は
他のアミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

１２）少なくとも９９位Ｐｈｅか欠失されているか又は
他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド。

１３）少なくとも１０３位Ｌｙｓが欠失されているが又
は他のアミノ酸残塁で買換されているポリペプチド。

１４）少’：くとも１２０位Ｔｒｐか欠失されているが
又は１１！２のアミノ酸残塁で置換されているポリペプ
チド。

１５）少なくとも１２１位Ｔｙｒが欠失されているか又
は伯のアミノ酸残塁で置換されているポリペプチド。

１６）少なくとも１５３位Ｓｅｒか欠失されているが又
は他のアミノ酸残基で置換されているポリペプチド。

１７）１位のＡ１８から３位のＶａｌに至るアミノ酸配
列、１位のＡｌａから６位のｌｅｕに至るアミノ酸配列
又は１位のＡｌａから９位のＴｈｒに至るアミノ酸配列
が少なくとも欠失されているポリペプチド。

１Ｂ＞１５１位Ｖａｌから１５３位３ｅｒに至るアミノ
酸配列、１４９位ＧＩｎから１５３位３ｅｒに至るアミ
ノ酸配列、１４５位Ａｓｐから１５３位３ｅｒに至るア
ミノ酸配列、１４１位ＧＩｎから１５３位３ｅｒに至る
アミノ酸配列、１２１位Ｔｙｒから］５３位３ｅｒに至
るアミノ酸配列又は１０３位ｉ　ｙｓから１５３位３ｅ
ｒに至るアミノ酸配列か少なくとも欠失されているポリ
ペプチド。

１９）式（Ａ＞のＮ末端に、アミノ酸残塁を少なくとも
有するポリペプチド。

２０）式（Ａ）のＮ末端に、式（Ｂ）で表わされるアミ
ノ酸配列１１２′位Ａ１ａから１１６′位ＡＳｔ）に至
るアミノ酸配列、７７′位Ｍｅｔから１１６′位ＡＳｐ
に至るアミノ酸配列、７１′位Ｍｅｔから１１６′位Ａ
ＳＩ）に至るアミノ酸配列、３２′　位Ｍｅｔから１１
６′位Ｓｅｐに至るアミノ酸配列又は１′位Ｍｅｔから
１１６′位ＡＳｐに至るアミノ酸配列を少なくとも有す
るポリペプチド。

上記ＩＬ−１β誘導体は、ＩＬ−１βのアミノ酸配列の
特定位置の特定アミノ酸残塁が伯のアミノ酸残塁で置換
されたアミノ酸配列及び特定位置にアミノ酸残基の付加
されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが
、この買換及びイ」加を行ないｊｑるアミノ酸残塁（よ
、人体蛋白質を構成するα−アミノ酸の残基であればい
ずれでもよく、中性アミノ酸残基であるのが好適でおる
。但し、ＣｙｓはそのＳＨ基に基づいて分子内又１よ分
子間ジスルフィド結合を形成することかあり、これを考
慮すれば該アミノ酸残塁はＣｙｓ以外の上記アミノ酸残
塁であるのが好ましい。特に好ましいものとして例えば
４位Ａｒ（］の場合はＧＩＶ、　Ｌｙｓ、　Ｇｌｎ又は
ＡＳＩ）を、８位Ｃｙｓの場合は３ｅｒ又はＡｌａを、
１１位Ａｒ（］の場合はＧｌｎを、３０位ヒトｉｓの場
合はＴｙｒを、７１位Ｃｙｓの場合は３ｅｒ、Ａｌａ又
はＶａを、９３位ＬＶＳの場合はｌｅｕ又はＡＳＩ）を
、９８位Ａｒｇの場合はｌｅｕを、１０３位ＬＶＳの場
合はＱｌｒｌを、１２０位Ｔｒｐの場合はＡｒｇを、１
２１位下ｙｒの場合はＧｌｎを、またＮ末端への付加の
場合は、Ｍｅｔ、１−ｅｕ、Ａｒ（］又はＡＳＩ）をそ
れぞれ例示できる。

かかるＩＬＩβ誘導体及びＩＬ−１βは、例えばＬＡＦ
活性、腫瘍細胞増殖抑制活性（Ｇ　Ｉ　Ｆ活性）、即ち
腫瘍細胞に対して特異的にその増殖を抑制する活性、コ
ロニー刺激因子（Ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ
　ｆａｃｔｏｒ　：　Ｃ３Ｆ）　、インターロイキン（
＋ｎｔｅｒ４ｅｒｏｎ　：　Ｉ　Ｆ　Ｎ　）　、インタ
ーロイキン２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　−２：　Ｉ　
Ｌ　−２）　、インターロイキン３　（＋ｎｔｅｒｌｅ
ｕｋｉｎ　−３：　Ｉ　Ｌ−３）等の種々のサイト力イ
ン（ｃｙｔｏｋ　ｉ　ｎｅ　）類の産生促進活性、即ち
例えばヒト細胞に作用してそれらサイトカイン類の産生
を著しく促進させる活性、抗炎症活性、特に例えば関節
炎モデル動物に投与することによって関節炎の退行を効
果的に抑制する活性、放射線障害防止作用、即ち骨髄移
植時の敢ｑ４線全身照射、癌治療等における放射線照射
、放射線事故時における生体障害乃至は車篤なｎ１作用
等を予防する作用乃至防止する作用等を４１している。

前記し゛た１ｍ−１β誘導体は上記各活性のいずれか少
なくとも一つの点で優れているか、或いは（及び）より
毒性か低く副作用か少ない点で優れている。

従って−［記ＩＬ−１β誘導体並びにＩＬ−１βは、例
えば抗体産生促）川やワクチンの効果増強等の免疫系刺
激剤、抗腫瘍剤、例えばＣ３Ｆ、ＩＬ−２、Ｉ　Ｌ−３
等のサイトカイン産生促進剤、抗炎症剤、放射線障害防
止剤等の医薬品として有用である。

殊に上記ＩＬ−１β及びその誘導体か関節炎等の炎症に
活動を示すという新たな１１１児は、ＩＬｌが炎症をメ
デイエートしその惹起に関与するとされてきた事実によ
れば、驚くべきことである。

また上記１１−１β誘導体は上記各活性のいずれか少な
くとも一つの点で優れているか又は（及び）より毒性か
低く副作用が少ない点て優れている。

とりわけ、上記ＩＬ−１β及びその誘導体は、Ｃ３Ｆ産
牛促准剤として有効でおり、これをヒトに投与するとき
には、ウィルス感染や抗原抗体反応等の危険性を生じる
ことなく、癌化学療法や放射線療法後の骨髄低形成によ
る顆粒球減少を有効に回復できる（顆粒球減少治療剤）
。上記Ｃ３Ｆ産生促進剤はまたその本来のＣ３Ｆ産生促
進作用により、Ｃ３Ｆの作用に基づく各種疾゛病の予防
及び治療剤としても有効に利用できる。例えば、Ｃ３Ｆ
は顆粒球ヤマクロファーシの機能を促進さ°ぜる作用か
ある〔ロペツッら（Ｌｏｐｅｚ、　Ａ、　Ｆ、　ｅｔａ
ｔ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３１　、２９８３
　（１９８３）、ハンダムら（！ｌａｎｄａｍ、　Ｅ、
ｅｔ　ａｌ、、同１２２゜１１３４　（１９７９）及び
パタ′スら（ＶａｄａＳ、　Ｍ、八。

ｅｔ　ａｌ、、同１３０．７９５　（１９８３））ので
、種々の感染症の予防及び治療剤として臨床応用か期待
されており、上記Ｃ３Ｆ産生促進剤も同様に臨床応用が
期待される。

殊に、近年生体防御能が低下乃至障害された個体（ＣＯ
ｍｌ）ｒｏｍｉｓｅｄ　ｈｏｓｔ）に、それまで無害で
あった病原体か病原性を発揮して惹起される、所謂日和
見感染症（ｏｐｔ）ｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ　１ｎｆｅｃ
ｔｉｏｎ或いはｔｅｒｍｉｎａｌ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ
）は、臨床的に問題となる病原体（起炎菌）がシュード
モナス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）セラティア（３
０ｒｒａｔ　ｉａ）等のダラム陰性桿菌、ヘルペス（Ｈ
ｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ、ト１ｓＶ）、バリセラゾ
ースタ（Ｖ　ａｒｉｃｅｌ　ｌａ　ｚｏｓｔｅｒ、　Ｖ
　Ｚ　Ｖ　）　、＋ナイトメカロウイルス（Ｃｙｔｏｍ
ｅｑａｌｏｖｉｒｕｓ、　ＣＭＶ）等のウィルス、キャ
ンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　）アス
ペルキルス（ＡＳｔ）ｅｒｇｉｌｌＵｓ　ｆｕｍｉｇａ
ｔｕｓ＞　、ノカルデイア（Ｎ　ｏｃａｒｄｉａ　ａｓ
ｔｅｒｏｉｄｅａ）等の真菌、カリニ昆虫（Ｐｔ＞ｅｕ
ｔｎｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ）、トキソブラズ
？　（Ｔ　ｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉ　ｉ　）　
等の原虫等て市り、現用の抗生物質は、之等の病原菌に
対して充分な効果を秦しテ１く、該日和見感染症に対す
る新しい薬剤の研究開光か切望されている。ＩＬ−１β
β誘導は、かがる日和見感染°症、の予防及び治療剤と
しても有用であり、特にかかる日和見感染症か高頻度に
見られる抗癌剤投与時、即ち急性白面病の化学療法や骨
ｆｌｆｉ移桶時における各種の感染症、例えばカンジダ
症、クリプトコックス症、アスペルギルス症、接合菌属
、黒色真菌感染症、ウィルス感染症、サイトメカロウィ
ルス肺炎、之等の合（ｊｆ症等の予防及び治療剤として
有用なものである。

更にＩＬ−１β及びその誘導体は、上記医薬用途以外に
、そのサイトカイン産生促進活性に基づき、例えば細胞
株からの各種有用サイト力インのインビトロ（ｉｎ　Ｖ
ｉｔｒＯ）製造に際して極めて有効に使用し得る。かか
る細胞株からの天然型サイトカインの製造は、殊に１１
！ｉ蛋白質て゛あるサイト力インにおいて着目されてお
り、効率的に且つ人里に有用リーイトカインを収）号で
きる。

上記したＩＬ＝１β誘導体中、少なくとも７１位Ｃｙｓ
を置換乃至は欠失させたもの、特に上記Ｃｙｓ＠仙のア
ミノ酸残基、例えば３ｅｒ、　Ａｌａ、Ｖａｔ等で置換
したものは高活性を示す。

また、少なくとも４位Ａｒ９．９３位ＬＶＳ、８位Ｃｙ
ｓを置換乃至は欠失させたＩＬ−１β誘導体、及び少な
くとも１０３位以降の少なくとも一つのアミノ酸残基を
欠失させた誘導体は、いずれもプロスタグランジンＥ（
ＰＧＥ）産生促進作用が弱く、従って発熱作用等の１１
作用並びに毒性かより少ない特徴を有し、更に少なくと
も４位Ａｒｇ又は９３位ＩＪｓを置換乃至ｔよ欠失させ
た誘導体は、ＧＩＦ並びにＬＡＦ活性に比し、Ｃ３Ｆ産
生促進活性及び抗炎症活性がより強い特徴を有している
。

更に、上記誘導体中、式（Ａ）のＮ末端に少なくとも特
定のアミノ酸残基もしくはポリペプチドが付加したもの
は、ＧＩＦ活性及びＬＡＦ活性に比してＣ３Ｆ産生促進
作用及び抗炎症作用かより高い特徴を有し、しかも毒性
が低く且つ作用の持続性の点で医薬品として、殊に経口
剤乃至は全開として利用する場合により有効である。

更に上記誘導体、殊に少なくとも８位Ｃｙｓ及び／又は
７１位ＣｙＳを置換乃至欠失させたもの、特に上記Ｃｙ
ｓを仙のアミノ酸残基例えば３ｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ等
で置換したものは、種々の条件下におけるＩＬ−１受容
体への結合性において優れている。

尚、上記誘導体の内でＩＬ−１βに比しその分子中にＣ
ｙＳをより少なく含むか又は含まないものは、Ｃｙｓの
ＳＨ基に基づく分子内もしくは分子間結合の不要な形成
を考慮すればより好ましい。

上記した特定のポリペプチド、即らＩＬｉβ及びその誘
導体は、例えば遺伝子工学的手法により製造することか
できる。即ち、前記特定のポリペプチドをコードする環
１云子を利用し、これを微生物のベクターに組込んで該
微生物細胞内で、複製、転写、Ｉ！１１訳させることに
よって製造することかできる。この方法は、特に大量生
産か可能である点より有利でおる。

上記方法において用いられる遺伝子は、通常の方法、例
えばボスファイト　トリエステル法〔ネイチャ＝（Ｎａ
ｔｕｒｅ　）　、　３１０．１０５（１９８４））等の
常法に従い、核酸の化学合成により全合成することもて
きるか、ＩＬ−１βもしくはその前駆体をコートする遺
伝子を利用して合成するのか簡便て必り、例えば該遺伝
子より上記化学合成手段を含む常法に従い、前記特定の
アミノ酸配列をコードする核酸配列に改変すること等に
より容易に製造できる。

ＩＬ−１β又はその前駆体を］−ドする遺伝子は公知で
あり、我々も先の出願（特願昭６０１３８２８１号、特
開昭６２−１７４０２２号公報）に記載したように、Ｉ
Ｌ−１βをコードする遺伝子を得、これを用いて遺伝子
工学的手法でＩ「−］βを収得するに成功している。

上記核酸（塩基）配列の改変操作も公知方法に従えばよ
く、目的とするポリペプチドのアミノ酸配列に応じて実
施される（遺伝子工学的手法としては、例えば、Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ　１−ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　（コ９８
２〉か参照される〕。

例えば、ＤＮＡの切断、結合、リン酸化等を目的とする
制限配索、ＤＮＡリカーピ、ポリスクレオヂドキナーゼ
、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種の酔索迅理等の常套手段
等か採用でき、それら酵素は市販品として容易に入手で
きる。之等各操作にあけるｊ頁伝子乃至核酸の単離、精
製も常法、例えばアカロース電気泳動法等に従えばよい
。また得られる遺伝子の復製（よ、一部後述するように
通常のベクターを利用する方法に従えばよい。また、所
望のアミノ酸配列をコートするＤＮＡ断片や合成リンカ
−は上記した化学合成により容易に）４］聞できる。尚
、上記において所望のアミノ酸に対応するフトンは自体
公λ１」でおりまたその選択は任意でよく、例えば利用
する宿主の］トン使用頻度等を考慮した常法に従え（ま
よい（Ｎｕｃ　ｌ　、　Ａｃ　ｉ　ｄｓ、　Ｒｅｓ。

旦、４３−７４　（１９８１））。またこれらの核酸配
列のコドンの一部改変には、例えば常法通り、１５〜３
０マ一程度の、所望の改変をコードする合成オリゴヌク
レオチドからなるプライマーを用いたサイト−スペシフ
ィック　ミュークジエネシス（Ｓｉｔｅ−３ｐｅｃｉｆ
ｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　ＣＰｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ　＋、　、　８ユ、５６６２−５６６
６（１９８４））等の方法を採用できる。

上記方法により得られる所望の遺伝子は、例えばマキサ
ム−キルハートの化学修飾法（）Ｉａｘａｍ−Ｇ＋１ｂ
ｅｒｔ、　ｔｌｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、　　６５．４９
９−５６０（１９８０））やＭ１３ファージを用いるジ
デオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、
ａｎｄＶ＋ｅ＋ｒａ　、Ｊ、、　Ｇｅｎｅ、　　１９．
２６９−２７６（１９８２））等により、その塩基配列
の決定及び確認を行ない得るが、之等に限定されず当業
界において周知の各種方法のいずれをも採用できる。

かくして、前記した特定のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子が提供される（以下この遺伝
子を１目的遺伝子」という）。

前記特定のポリペプチドは、上記目的遺伝子を利用して
公知の一般的な遺伝子組換え技術に従い製造できる。よ
り詳細には、上記目的遺伝子が宿主細胞中で発現できる
ような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入し
て形質転換し、該形質転換体を培養すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいず
れをも用い得る。該真核生物の細胞には、を推動物、酵
母等の細胞が含まれ、を推動物細胞として（よ、例えば
号ルの細）泡で必るＣＯ３細胞（Ｙ。

Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１ｌ、２３．１７５−１８２（
１９８１））やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジ
じドロ葉酸レダクターゼ欠損株ＣＧ。

Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄ　Ｌ、Ａ、Ｃｈａｓｉｎ　　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７７．４２１６−４２２０　（１９８０））等
かよく用いられるか之等に限定されない。を推動物細胞
の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子
の上流に位置するプロモーターＲＮ△のスプライス部位
、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するも
のを使用でき、これは更に必要により複製起源を保有し
ていてもよい。該発現ベクターの例としてはＳＶ４０の
初期プロモーターを保有するｐｓＶ２ｄｈｆｒ　（Ｓ、
　ＳｕｂｒａｍａｎＲ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｐ
、Ｂｅｒｇ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　　１
（９）、８５４−８６４）等を例示できるが、これに限
定されない。

また真核微生物としては酵母が一般によく用いられ、そ
の中でもサツカロミセス属酵母が有利に利用できる。該
酵ｆ′ｆ１等の真核微生物の発現ベクターとしては、例
えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーターを
持ツｐＡＮ８２　　（Ａ、Ｈｉｙａｎｏｈａｒａｅｔ　
ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ口、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ
ＳＡ、　　８０．　１５　（１９８３））等を好ましく
利用できる。

原核生物の宿主としては大腸菌や枯草菌か一般によく用
いられ、例えば該宿主菌中て複製可能なプラスミドベク
ターを用い、このベクター中に目的遺伝子か発現できる
ように、該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シャ
イン・アンド・クルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開
始に必要なＡＴＧを付与した発現プラスミドか使用でき
る。上記宿主菌としての大腸菌としては、ニジエリじア
−Ｊす（Ｆｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ　
１２株等かよく用いられ、ベクターとしては一般にｐＢ
Ｒ３２２かよく用いられるか、これに限定されず、公知
の各種の菌株及びベクターかいずれも利用できる。

プロモーターとしては、例えばトリプトファンプロモー
ター、ＰＬプロモーター、ｌａｃプロモータ、ｌｐｐプ
ロモーター等を使用することがてき、いずれの場合にも
目的遺伝子を発現させ得る。

トリプトファンプロモーターを用いる場合を例にとり詳
述すれば、発現ベクターとしてトリプトファンプロモー
ター及びＳＤ配列を持つベクターｐ丁Ｍ１　（今本文男
、代謝、Ｖｏｌ、２２．２８９（１９８５））を使用し
、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ１ａＩ部位に、
必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポリペプチドをコ
ートする遺伝子を連結させればよい。

尚、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラクトシダーゼ
やβ−ラクタマーレ等を利用する融合蛋白質発現系によ
ることもできる。

かくしてｊｑられる発現ベクターの宿主細胞への導入及
びこれによる形質転換の方法としては、般に用いられて
いる方法、例えば主として対数増殖１■にある細胞を集
め、ＣａＣＱ２逃理して自然にＤＮＡを取り込みやすい
状態にして、ベクターを取込ませる方法等を採用できる
。上記方法においては、通常知られているように形質転
換の効率を一層向上させるためにＭ　Ｃｌ　ＣＱ　２や
ＲｂＣ（１！を培地に更に共存させることも可能である
。また、宿主細胞をスフェロプラスト又はプロトプラス
ト化してから形質転換させる方法をも採用できる。

かくして１ｑられる所望の形質転換株は、常法に従い培
養でき、該培養により、所望のボ１ノペプヂドが生産、
蓄積される。該培養に用いられる培地としては、通常の
細胞培養に・開用される各種の培地のいずれでもよく、
その具体例としては、例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地
等及び之等に通常）、ｌられている各種の炭素源、窒素
源、無は塩、ビタミン類等を添加した培地を例示できる
。尚、上記トリプトファンプロモーターを用いた場合に
（ｊｌ、一般にプロモーターか動くようにするためにカ
ナミノ酸を添加した、例え（まＭ９最小培地を用いて培
養することかでき、該培地中には培養の適当な時開にイ
ンドールアクリル酸等のトリプトファンプロモーターの
働きを強めるための薬剤を添加することもできる。

かくして得られる活性物を含イ１する培養物からの目的
ポリペプチド、即ち前記特定のポリペプチドの゛）１＾
製、単離は常法に従い行ない得る。尚、該ポリペプチド
を宿主から抽出するに当っては、例えば浸透圧ショック
法等の温和な条件を採用するのかその高次構造保持の面
からより好ましい。

上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチドの物Ｊ！Ｐ
、化学的性質を利用した各種の処理操作に従い実施する
ことかできる（例えば［生化学デークーブックＩＩｊｐ
ｐ１１７５〜１２５９、第１版第１刷、１９８０年６月
２３０、株式会社東京化学同人発行参照）。該方法とし
ては、具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤による処理、
限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（グル濾過）
、液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、アフ
イニテイクロマトグラフイー、透析法、之等の組合せ等
を採用できる。

より具体的には、上記操作【よ例えば以下の如くして実
施できる。即ちまず培ｆ３上清より予め目的とするポリ
ペプチドを部分精製する。この部分精製１よ、例えばア
セトン、メタノール、エタノール、プロパツール、ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ＞等の有機溶媒や酢酸、過塩
素醗（ＰＣＡ）　、トリクロロ酢酸（工ＣＡ）等の閣を
蛋白沈澱剤として用いる処理、怪１酸アンモニウム、硫
酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処
理及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限
外濾過処理等により行ない得る。之等の各処理の操作及
び条件は、通常のそれらと同様とすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル濾過に付すこと
により目的物質の活性が認められる両分を収得する。こ
こで用いられるゲル濾過剤としては、特に限定はなく例
えばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、アガ
ロースゲル、ポリアクリルアミド−アノフロースグル、
セルロース等を素材とするものをいずれも利用できる。

之等の具体例としては、セファデックスＧタイプ、Ｉｍ
ＬＨタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ
（以上、ファルマシア社）、セルロファイン（チッソ■
）、バイオゲルＰタイプ、同へタイプ（ハイオーラド社
）、ウルトロゲル（ＬＫＢ社）、Ｔ　Ｓ　Ｋ−’Ｇタイ
プ（トーソー社）等を例示できる。

目的とするポリペプチドは、上記ゲル濾過により得られ
る活性画分を、例えばハイドロキシアパタイトカラムを
用いたアフィニティークロマトグラフィー、ＤＥＡＥ法
、ＣＭ法、ＳＰ法等のイオン交換カラムクロマトグラフ
ィー、クロマトフオーカシング法、逆相高速液体クロマ
トグラフィー等に付すことにより、又は之等各操作の組
合せにより更に精製でき、均質な物質として単離できる
。

上記クロマトフオーカシング法は、公知の各種方法によ
り実施できる。カラムとしては例えばＰＢＥ９４　（フ
ァルマシア社製）等を、開始緩衝液としては例えばイミ
ダゾール−塩酸等を、溶出液としては例えばポリバッフ
ァー７４（ファルマシア社製）−塩酸（ｐＨ４，０＞等
を使用できる。

上記逆相高速液体クロマトグラフィーは、例えばＣ４ハ
イボア一逆相ＨＰＬＣカラム（バイオ−ラド社（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）等を用いて
、移動剤としてアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）　、水等及び之等の混合溶媒を用いて実施できる
。

かくしてＩＬ−１β及びその誘導体としての前記特定の
ポリペプチドを単離、収得てきる。

以下、本発明組成物につき詳）ボする。

本発明組成物は、例えば上記したｌｌ−１β及びその誘
導体等を包含するＩＬ−１β活性物と共に、人血清アル
ブミン及び／又は゛糖類と界面活性剤とを含有すること
を必須の要件と覆る。

上記において糖としては特に限定はなく、例えばグルコ
ース、マンノース、カラクトース、果糖等の単糖類、マ
ンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコ
ール類、ショ糖、マルｉ〜−ス、乳糖等の三糖類、デキ
ストラン、ヒドロキシプロピルスターチ等の多糖類等を
使用でき、之等は一種単独でも二種以上混合しても用い
得る。之等の中で特にショ糖、マルトース、マンニトー
ル、イノシトール、デキストラン等は好ましい。

界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性及び非イ
オン性界面活性剤のいずれも使用でき、就中、ボリオギ
シエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、
ポリオギシエヂレンアルキルエーテル系、ソルビタン七
ノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等の界面活性
剤を好ましく利用できる。

上記糖類の添加量は、ｌｌ−１β活性物１μｑ当たり約
０．１ｍｏ程度以上、好ましくは約１〜１００ｍｇ程度
の範囲とするのが適当てあり、界面活性剤の添加量は、
ｌ−１β活性物１μｑ当たり約０．ＯＯｏｌｍ（］程度
以上、好ましくは約０１００１〜０．１ｍｇ程度の範囲
とするのが適当である。また人血清アルブミンの添加量
はＩＬ１β活性物１μｑ当たり約０．００１ｍｏ程度以
上、好ましくは約０．０１〜１０ｍＣｌ程度の範囲とす
るのが適当である。

本発明組成物は、上記特定の成分の配合を必須要件とし
て、他は通常のこの種医薬組成物と同様のものとするこ
とかでき、他の桑埋的有効成分や製剤上の慣用成分等を
任意に配合してもよく、かくして得られる組成物は、前
）ホした各種の医薬用途、例えば抗体産生やワクチン効
果の増強並びに免疫不全症の治療等の免疫刺激剤、抗腫
瘍剤、り一イト力イン類の産生促進剤、抗炎症剤、放射
線障害防止剤、日和見感染症治療剤等に有効に適用する
ことかできる。

特に、本発明組成物に配合できる他の成分としては、Ｉ
Ｌ−１β活性物の安定化を更に増加させる而より、通常
の含硫還元剤か好ましい。該含硫還元剤としては、具体
的にはシスティン、Ｎ−アセチルホモシスティン、チオ
クト酸、チオグリコール酸及び之等の塩類、チオエタノ
ールアミン、チオグリセロール、チオ硫酸ナトリウム、
チオ乳酸、ジチオスレイトール、グルタチオン等の比較
的温和な還元剤等を好ましく例示でき、之等は一種単独
でも利用でき、２種以上併用することもてきる。之等の
添加量は特に制限されないが、ＩＬ−１β活性物１μｑ
当たり約０．００１ｍｇ程度以上、好ましくは０．０１
〜１０１１１ｇ程度（２種以上を併用する場合はそれら
の合計量）とするのが適当で市る。

本発明組成物は、また緩衝液で等張化して安定な等仮止
製剤とされるのが適当である。ここで用いられる緩衝液
としては、例えば代表的には、クエン酸−クエン酸ナト
リウム、クエン酸−リン酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナト
リウム、クエン酸ホウ砂等のｐＨ４〜８程度、好ましく
はｐＨ５〜６の各種ｔｌ液を例示できる。

本発明組成物は、例えば通常薬理有効量のＩＬ１β活性
物及び前記特定の配合成分と共に、適当な医薬製剤担体
を配合して製剤組成物の形態に調製される。該製剤担体
としては使用形態に応じた製剤の調製に通常慣用される
充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤等の賦形剤乃
至希釈剤をいずれも使用できる。製剤組成物の形態は、
これが有効成分であるＩｌｌβ活性物を効果的に含有す
る状態であれば特に限定はなく、錠剤、粉末剤、顆粒剤
、乳剤等の固剤であってもよく、液剤、懸濁剤、乳剤等
の注射剤形態であってもよい。またこれは使用前に適当
な担体の添加により液状となし得る乾燥品とすることも
てきる。之等の製剤組成物はいずれも常法に従い調製さ
れ得る。

得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態に応じた適当
な投与経路、例えば注射剤形態の医￥製剤は、静脈内、
筋肉内、皮下、皮内、腹腔的投与等により投与され、固
剤形態の医薬製剤（，１１、経口乃至は経腸投与され得
る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与量は、
該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適用され
る患者の症状等に応じて適宜選択され、一定ではないが
、通常有効成分を約０．００００００１〜８０重量％程
度含有する製剤形態に調製して、この製剤をこれに含有
される有効成分量か一日成人一人当り約０．００１μｇ
〜１００μＱ程度となる範囲で投与するのか望ましい。

該投与は、−日１回である必要はなく３〜４回に分ける
こともできる。

発明の効果 本発明によれば、医薬品として注目され、期待されてい
るＩＬ−１β活性物の安定化された組成物が提供される
。

本発明組成物は、構成成分のＩＬ−１β活性物の安定性
の面で優れた特性を有し、例えば凍結処理や凍結乾燥処
理等の通常の医薬形態としての所望の調製及びそれら医
薬品の通常の保存条件下においても長期間安定であり、
かかる分野において穫めて有用である。

実　　　　施　　　　例 以下実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明する。

各実施例において有効成分として用いられるＩＬＩβ活
性物（ＩＬ−１β誘導体〉の表示は、下記第１表に示す
略号にて行なうものとし、このうちポリペプチドエ〜ｘ
ｘｘｘ■は待聞昭６３１５２３９８号公報記載のもので
あり、ポリペプチドＸＸＸＸＩＸ〜ＸＸＸＸＸｖｌは上
Ｍａ　ニＱ　シＴ以下の製造参考例により得られるもの
である。また之等のＩＬ−１活性及びＧＩＦ活性の測定
は、同公開公報記載の方法に従う。

たＩＬ １β） 製造参考例　１ ■　特開昭６３−１５２３９８号公報記載の製造例１−
■に準じて、プラスミドＤ　ｔｒｙ　Ｇ　Ｉ　Ｆ−αを
利用したサイトースペシフィックミュータジ■ネシスに
より、下記２表に示す各ポリペプチド（ＩＬ−１β誘導
体）を得た。

尚、各ポリペプチドの発現、ＧＩＦ活性の測定及び精製
は、上記公開公報記載の方法に従うものであり、５ＤＳ
−ＰＡＧＥも同様にその参考例２−（４）に示す方法に
準じた。以下の各例でも特筆しない限り同様でおる。

第　　　２　　　表 製造参考例　２ この例は、ＩＬ−１βのＮ末端に種々のアミノ酸残塁を
付加したＩＬＩβ誘導体（ポリペプチドＸＸＸＸＸ■〜
ＸＸＸＸＸｖＩ〉を製造した例である。

上記Ｎ末端領域付近には、蛋白質合成の開始コドンＡＴ
Ｇの５塩塁上流にＣｌａＩ部位か存在するか、それより
下流には１１番目のＡｒｇのところにＭＳｔ）Ｉ部位か
存在するだ（プであり、この２つの部位間にリンカ−Ｄ
ＮＡを挿入しようとすると、該リンカ−か長くなりすぎ
るため、まず之等の制限酵素部位間のもつとＮ末端に近
いアミノ酸のところで適当な制限酵素部位の作成を検討
し、その結果、４番目のＡｒｇのコドンをＣＧＴから△
ＧＡに代えて、次のＳｅｐとの間にＡＧＡＴＣＴのＢＣ
ＩＩＩＩｆｌｉ１１限酵素部位を作成し、この作成され
たＢ（ＩＩＩＩと上記ＣｌａＩ部位間に、予め合成され
た変異領域を含む各種合成リンカ−を入替えて所望の遺
伝子を構築し、これを大腸菌で発現させて、目的のポリ
ペプチドを得た。以下、その方法を詳述する。

（１）制限酵素ＢｇＩＩＩ部位を持つ１「−１β発現プ
ラスミドの作成 ｔｒｐプ０−Ｅ−ターを用いたＩ）ｔｒｌ）ＧＩＦ−α
：４９２１　ｂｏ）を、制限酵素Ｃ１ａＩ及びｊ３ａ制
」■で消化して、５７９ｂｐと４３４２ｂｐの２つのフ
ラグメントＤＮＡを得た。

上記５７９ｂｐフラグメントＤＮＡを更にＭＳｆ）Ｉで
消化して、５′末端にＭｓｐＩ部位を、３′末端にＢａ
ｍＨＩ部位を持つ５４３　ｂｐのフラグメントＤＮＡを
得た。

次に、以下の配列のリンカ−ＤＮＡを合成し、Ｔ４ポリ
ヌクレオチトキナーセを用いてその５′末端をリン酸化
した。

ｓｐＩ このリン酸化リンカ−と、上記５４３ｂｌ）のフラグメ
ントとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結して、５′
末端にＣＩａＩ部位、中間にＢｇＩＩＩ、ＭｓｐＩ部位
及び３′末端にＢａｍＨＩ部位を持つＤＮＡフラグメン
ト（５７９ｔ）Ｄ）を得た。

最後に、上記で得た５７９ｂｐのフラグメントと、先の
４３４２ｂｐのフラグメントとを、Ｔ！ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結することにより、新たにＢｇ１１１部位を
持つＩＬ−１β発現プラスミド（ｐｔｒｐｌＬ−１β、
ヒ１２：４９２１ｂｐ）を冑た。

得られたプラスミドをニジエリじア・コリトｌＢ１０１
にトランスフオームし、得られるクローンをＤＮＡシー
クエンスした結果、目的通りＢｇ１１１部位を有するＩ
Ｌ−１β発現遺伝子で必ることか確認された。

（２）合成りＮＡリンカ−によるｌｍ−１βのＮ末端付
加変異蛋白質の製造 上記（１）で得たプラスミドｐｔｒｐＨ−１β。

Ｈ２のＣｌａＩ　−Ｂ（Ｉｆ　ＩＩ制限酵素部位間で、
合成りＮＡリンカ−とベクターＤＮＡとを置換させるこ
とにより、ＩＬ−１βのＮ末端に所望のアミノ酸を付加
した変異蛋白質を作成した。

上記付加するアミノ酸としてはＩＬ−１β前駆体由来の
５アミノ配置列（Ａ　ｌａ−Ｔｙｒ−ＶａＨａｓ−ＡＳ
Ｄ：　ＡＹＶＩ−ＩＤ＞　、酸性アミ、〕酸（ＡＳＩ）
＋Ｄ）、中性アミノＭ（Ｌｅｕ；Ｌ）及び塩基性アミノ
酸（Ａｒ（］；Ｒ）のそれぞれ１つずつを選んだ。

之等の変位蛋白質をそれぞれＩＡＹＶ日Ｄ］Ｉり−コβ
、　［Ｄ］−Ｉｍ−１β、　［Ｌ］−１Ｌ１β及び［Ｒ
］−ＩＬ−１βと略記する。

各合成リンカ−ＤＮＡ配列は次の通りて必る。

■ＡＹＶＨＤを付加するためのリンカ−Ｃｌａ工 Ｎｄｅ工 Ａｓｐ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｔ　　　ＢＩＩＩ
ＧＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＡＡ、−−−一。

ＣＴＡＣＧＡＧＧＡＣＡＴＴＣＴＡＧ ■Ｄをイ」加するためのリンカ− １ａＩ Ｂ（ＩＩＩＩ Ａ）−３ ＴＣＴＡＧ、　　−５゜ ■Ｌを付加するためのリンカ− ｌａＩ ＢｇＩＩＩ Ａ１　　　　　−３゜ ＴＣＴＡＧ、　　−５’ ■Ｒをイ」加するためのリンカ− Ｃ１ａｌ Ｂ！；ＩＩＩＩ ますＩＬ−β発現プラスミドＤ　ｔｒｌ）　Ｉ　Ｌ〜１
β。

Ｈ２をＣ１ａＩ及びＢｇｌＩＩて消化して、４．９ｋｂ
ｐのフラグメントＤＮＡを得た。

次いで上記■〜■の各リンカ−を合成し、Ｔ４ポリヌク
レオチトキナーセを用いてそれらの５′末端をリン酸化
した。

１■られた５′末端をリン酸化した合成リンカ−のそれ
ぞれと、上記４．９ｋｂｐのフラグメントＤＮＡとをＴ
４ＤＮＡリカーゼを用いて連結させ、４種類の１１−１
βＮ末端付加変異蛋白質発ｊηプラスミドを構築した。

２等プラスミドのそれぞれをニジ■リヒア・コリＨＢＩ
ＯＩにトランスフオームし、得られるクローンをＤＮＡ
シークエンスして、目的ＤＮＡシークエンスを確認した
。

（３）ＩＬＩβＮ末端付加変異蛋白質の発現及び精製 上記（２〉で得た各発現プラスミドでトランスフオーム
された１１８１０１株（Ｋ１２株）をＭ９培地中、３７
°Ｃて振盪培養した。

遠心分離して集めた菌体を１Ｍリン酸水水素ナトリウム
で４°Ｃにて処理した後、５ｍＭトリスＪｎ酸緩衝液（
ｐＨ８，０＞に対して透析し、浸透圧ショックにて破壊
した。

透析液を酢酸にてＤＨ約４に調整した後、生じた沈澱を
遠心分離により除去し、上清液を陽イオン交換高速液体
クロマトグラフィー（ＨＦ’ＬＣ、トーソー社製、５Ｐ
−５ＰＷカラム使用）にがけ、メインピークを再クロマ
トグラフィーにか［プて更に精製した。上記陽イオン交
換ＨＰＬＣを２度行なうことにより冑られる各ＩＬ−１
β変異蛋白質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動てほぼ単一
のハンドに精製された。

史に、アミコンＹＭ−５メンプランによる限外濾過を行
ない、溶媒を酢酸緩衝液（ｐＨ５，５＞から水におぎか
えた。

１ｑられた各変異蛋白て１の諸性質を下記第３表にまと
めて示す。

第３表 ＩＬ−１β（ポリペプチド■）及びその誘導１本につき
、以下の活性試験を行なった。

尚、前記したポリペプチド■に対する抗血清を用いて、
ＲＩＡ法により測定したポリペプチド■換停蛋白吊（ｍ
ｇ＞当りのＬＡＦ活性（Ｕ）（は、下記第４表に示す通
りでおる。

第４表 薬理試験例１：ポリペプチド■のＣ３Ｆ産生促進効果試
験 ■ヒト肺細胞のＣ３Ｆ産生に対する促進効果試験Ｃ３Ｆ
産生株として、ヒト肺細胞由来株ＨＦＬ１（ｔ−１ｕ＋
ｕａｎ　Ｅｔｔ＋ｂｒｙｏｎｉｃ　ｌｕｎｇＦ＋ｂｒｏ
ｂｌａｓｔｓＡＴＣＣ登録細胞株Ｎｏ、ＣＣＬ−１５３
＞を用い、以下の試験を行なった。

ます、上記ＨＦＬ−１細胞を２Ｘ１０”個／ｎ＋Ｑの細
胞濃度となるように、］Ｏ％ウシ胎児血清加ハムスター
１２に培養液（Ｈａｍ、　Ｒ，Ｇ、　、　Ｐｒｏｃ、　
ＮａｔＡｃＤ＞Ｓｃｉ、、　　５３．２８８　（１９６
５）　）に浮遊させた。次いで上記細胞懸濁液中に、種
々のｙＡ度に調製した前記参考例で得たポリペプチド■
を加え、炭酸ガス培養器内で３７°Ｃて２４時間、４８
時間及び７２時間各々培養し、各培養上清を集め、之等
培養土清中に産生蓄積されたＣ３Ｆ＠を、マ「クス骨髄
細胞を使用して測定した（Ｌｅｗｉｓ、１．Ｃ，ｅｔａ
ｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　”Ｉ　２８．１６８
　（１９８２）　）。

ポリペプチド■を用いて得られた各培養時間（ｈｒ）で
の結果を第１図に示す。図において、＠軸はポリペプチ
ド■の濃度（Ｇ　Ｉ　Ｆ単位／ｍ１２）を、縦軸はＣ３
Ｆ活性（単位／ｍＱ）を示す。

上記結果より、ポリペプチドエの添加によれば、トＩＦ
Ｌ−１細胞株のＣ３Ｆ産生量は、該ポリペプチドの無添
加に比べて実に数百倍にも亢進されることが明らかであ
る。

ヒト正常皮膚由来細胞株としてＣＲＬ１４４５　（ＡＴ
ＣＣ，Ｎｏ、＞を用いて以下の試験を行なった。即ち、
上記細胞を２Ｘ１０”個、／　ｍＱの細胞濃度となるよ
うに１０％ウシ胎児血清加ダルヘッＤＭＥＭ培養液（Ｄ
ｕｌｂｅｃｏ、Ｒ，ａｎｄ　Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｇ、。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、旦、３９６　（１９５９））に浮遊
させた。上記細胞浮遊液に、種々の濃度の参考例で得た
ポリペプチド■を加え、炭酸カス培養器内で３７°Ｃで
２４．４８及び７２時間培養した後、培養上清を集め、
産生されたＣ３　Ｆｆｆｉをマウス骨ｔｔＩ細胞を使用
して上記試験■と同様にして測定した。

得られた結果を第１図と同様にして、第２図にボす。

第２図より、ＧＩＦ活性として１単位、／　ｍｌ：ｌ以
下のポリペプチドエをヒト正常皮膚由来の原線維芽細胞
に加えることにより、該細胞のＣ３Ｆ産生能は著しく促
進されることか明らかて必る。

■生体内でのＣ３Ｆ産生に対する促進効果試験ポリペプ
チド■を生体内に投与した場合、生体内でのＣ３Ｆ産生
六進作用が発現されることを以下の動物実験により試験
した。

即ち、正常マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス、静岡県実鋏
動物協同組合より購入）に、種々の量の参考例で得たポ
リペプチドＩ（ＧＩＦ活性として１０３〜１０”単位／
個体）を静脈内投与した。

上記投与後２．４．８．１２及び２４時間目に各実験動
物より採血し、血清中のＣ８Ｆ濃度をマウス骨髄細胞を
用いて測定した。

結果を第３図に示す。図において横軸は各種濃度（Ｇ　
Ｉ　Ｆ単位７／個体）のポリペプチド■の投与後時間（
ｈｒ）を、縦軸はＣ３Ｆ活性（単位／ＩＩＩＱ血清〉を
各々示す。また図中（１）はポリペプチド■の１０万０
ＩＦ単位７／個体投与群を、（２）は同１万ＧＩＦ単位
／個体投与群を、（３）は同１０００ＧＩ　Ｆ単位／個
体投与群を、また（４〉は対照群（Ｈ３Ａ’ｌＯμｇ／
個体投与群）を示す。

第３図より、ポリペプチド■を動物に与えた場合、動物
血清中のｃｓＦｌ＝ｉは著しく高くなっていることか判
明した。即ち、ポリペプチドエは注射された量に比例し
て生体内でのＣ３Ｆ産生を著しく亢進させる作用のある
ことが認められた。

薬理試験例２：ポリペプチトエの抗関節炎試験■　パー
スン（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃ，）１．、　Ｐｒｏｃ、Ｓｏ
ｃ、ＥｘｐＢｉｏｌ、Ｍｅｄ、、９１．９５　（１９５
６）　）及びワードとジョーンズ（Ｗａｒｄ、　Ｊ、　
Ｒ，、Ｊｏｎｅｓ、　Ｒ，Ｓ。

Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、５．　
５５７　　＜　１９６２　）　　）の方法に準じて、ア
ジュバント関節炎ラッ［〜を作製した。即ら、雌性Ｓ、
Ｄ、系ラッ１うの尾根部皮肉にミコバクテリウム・ブヂ
リカム （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）
死菌を流動パラフィンに懸濁させたアジュバントを０．
０５ｍＱ注則した。１４日目に足腫服に基づいて群分け
しくｎ−６）、その翌日より５日間に亘って、ポリペプ
チドエ又はその溶媒（生理食塩水；対照群）を、皮内投
与した。経口的に足容積を測定することにより、関節炎
に対７−る影響を評価した。

結果を第４図に示す。図において横軸はアジュバント投
与後日教（日）を、縦軸は定体積（Ｘｏ、０１＋ｎＱ）
を各々示す。また図中（］〉（よボポリペプチドの１０
万ＧＩＦ単位／個体投与酊を、（２）は同１万ＧＩＦ単
位２７個体投与群を、（３）は同１０００ＧＩ　Ｆ単位
／個体投与群を、（４）は同１００Ｇ　Ｉ　Ｆ単位／個
体投与群を、（５）は対照群（生理食塩水投与群）を、
また（６）は正常ラット群を示す。

第４図より、対照群（グラフ（５））の足腫服は２３日
目まで増悪したのに対し、ポリペプチドエの投与群（グ
ラフ（１）〜（４））においては、その投与の４日目（
アジュバント投与１変１８日目）より、足腫服の抑制作
用か８温められ、最終投与４日’＋’Ａ　（アジュバン
ト投与１変２３日目〉においても関節炎の進行を阻止で
きることかＩｆｆ化された。

薬即試験例３：ＩＬ−１β誘導体のＣ３Ｆ産生促進効果
試験 細胞株Ｕ−３７３ＭＧ　（ＡＴＣＣＨ丁Ｂ１７、Ｇｌｉ
ｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ、　Ｈｕ
ｍａｎ）を用いて、以下の試験を行なった。

上記細胞を、２Ｘ１０５個／ｍＱの細胞濃度となるよう
に、１０％Ｆ　ＣＳ　（ＧＩＢＣＯ社製）、ＭＥＭ非必
須アミノ酸（Ｆｌｏｗ社製）及びＭＥＭピルビン酸ナト
リウム（Ｆｌｏｗ社製）を添加したイーグルＭＥＭ培地
（日水社’！ｊ　）に浮遊させ、種々の濃度となるよう
に被験物質を加えて、炭酸ガス培谷器内で３７°Ｃ−Ｃ
′２４時間培養した。

各培養上清を集め、之等培養土清中に産生蓄積されたＣ
３Ｆ量を、マウス骨髄細胞を使用して測定した［Ｌｅｗ
ｉｓ、１．Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
、　１２８゜］６８　（］９８２））。

結果を第５図に示す。図において横軸は被験物質の濃度
（ｎｇ、／ｍＱ）を、縦軸はＣ３Ｆ活性（Ｕ／＋ｎＱ）
を示す。また図中曲線（１）〜（７〉は以下のポリペプ
チドを被験物質とした時の結果を示す。

曲線　１　・・・ポリペプチドＶ１ 曲線　２　・・・ポリペプチド■ 曲線　３　・・・ポリペプチド■ 曲線　４　・・・ポリペプチドＶ 曲線　５　・・・ポリペプチドＩＶ 曲線　６　・・・ポリペプチド■ 曲線　７　・・・ポリペプチドＸＸＸ 薬理試験例４：ｌ−’！β誘導体の抗炎症試験ウィンタ
ー（Ｗｉｎｔｅｒ　）らの方法（ｐｒｏｃ、　５ｏｃＥ
ｘｐｔ１．Ｂｉｏｌ、）ｌｅｄ、、　１１１　、　５４
４−５４７（１９６２））に準じてこの試験を行なった
。

即ち、６〜８週齢の雄ラット（Ｓ　ｐｒａｑｕｅ［）ａ
Ｗｌｅｌ／系、日本チャールスリハー社）を、実験前日
に体重に基づいて１群６〜８匹の各群に分けて用いた。

起炎剤としてカラゲニン（ＭａｒｌｎｅＣｏｔ　１ｏｉ
ｄ社製）を、生理食塩水に１％となるように懸濁さＵた
ものを使用し、ラツ１〜の右後肢足跣皮下に０．１ｍＱ
注射して足浮腫を惹起させた。足浮腫を評価するため、
起炎剤注躬の前後の一定時間に、右後肢足た容積を、プ
レシモメーター（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ、　Ｕ
（］０−Ｖａｓｉｌｅ礼製〉を用いて測定した。前値に
対する起炎削性ｑ４後の容積増加率を浮腫率（ｓｗｅｌ
ｌｉｎｏ％）として表わした。

被験物質は、ダルベツコのリン酸ｊｆｆｌ緩衝食塩水（
−［）ｕｌｂｅｃｏ’ｓ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆ
ｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）に溶解希釈し、ラットの背
部皮内にＯｙ１ｍＱ宛、起炎削性射の１時間前に注射し
た。尚、対照群として、溶媒投与群を１作成し、同一実
験に供した。

結果を第６図に示す。

図において横軸は、起炎剤投与後時間（ｈｒ）を、縦軸
は浮腫率（％）を示す。また、図中、曲線（１〉は対照
群を、曲線（２）はポリペプチドＶｌの０．１μＱ投与
群を、曲線（３）はポリペプチドＶｌの１μ９投与群を
、曲線（４）はポリペプチドＶｌの１０μｑ投与群をそ
れぞれ示す。

桑浬試験例５：ＩＬ−１β誘導体の放射線障害防止作用
試験 ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（９週齢）に致死量のＸ線を照ｑ
」す６２０時間前に、ポリペプチドＶｌの１μＣｌ／マ
ウス又１は０．３μｑ／マウスを１１す貯内注剣した。

Ｘ線照射装置（ＭＢＲ−１５０５Ｒ１日立メディコ社）
を使用し、８５０レントゲンのＸ線を、上記マウスに全
身照射し、以後、毎日その生存を確８２シた。尚、コン
トロールとしてＰＢＳ投与群をおいた。

結果を第７図に示す。図において横軸（よＸ線照射後の
日数（日）を、縦軸は供試動物の生存率（％）を示し、
曲線（１）はポリペプチドｖ１の１μｑ投与群を、曲線
（２）はポリペプチドＶｌの０．３μｑ投与群を、また
曲線（３）はコントロール群をぞれぞれ示す。

第７図より、コントロール群ではＸ線照射後１８日日に
全例死亡したのに対し、ポリペブチ１〜Ｖｌ投与群では
、その投与量に依存して、放射線障害の防止作用が認め
られ、１μｑ投与群では、約８割か放射線障害による死
亡から回避され、生存することかＴＮ認された。

薬理試験例６：ＩＬ−１Ｂ誘導体の日和見感染防御効果
試験 易感染モデルマウスを用いて、以下の試験を実施した。

ＩＣＲ系雄性マウス（６週齢〉を供試動物（１群７匹）
とし、第１日月に５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ、協
和醗酵社製＞　１００ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した。第
２日日、第４日日及び第６日日にポリペプチドｖＩの１
μｇ２／マウスを皮下投与し、第７日月に、緑１殿菌（
ｐｓｅＵｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＥ〜２
）の所定惜を腹腔内投与して感染させた。

第１０日月に供試動物の生存数を計数して、生存率（％
）を求めた。

結果を第８図（１）〜（３）に示す。

第８図（１）は上記実験群の結果を、同（２）はポリペ
プチドｖ１を投与しなかった（５−ＦＵのみを投与した
）対照群の結果を、また同（３）は５−Ｆｕ及びポリペ
プチドＶｌのいずれも投与しなかった対照群の結果をそ
れぞれ示す。

第８図中、縦軸は生存率（％）を、横軸は下記各緑廂菌
投与量を採用した群Ａ〜Ｆを各々示す。

Ａ群・・・１９０００菌数／マウス投与群Ｂ群・・・　
３８００菌数／マウス投与群Ｃ群・・・　　７５０菌数
／マウス投与群り群・・・　　１５０菌数／マウス投与
群Ｅ群・・・　　　３０菌数／マウス投与群Ｆ群・・・
　　　　６菌数、／マウス投与群〈動物細胞からのサイ
ト力インの製造方法〉■　種々のａ度のポリペプチドＸ
ＸＸＶＩ！及び０．０１％ＰＨＡ−Ｐ存在下に、トｌＢ
５−２０５Ｂ２細胞（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　１３
１　、１６８２１６８９　（１９８５））を、２Ｘ１０
”細胞／ウェルにて培養した。培養２４時間後の上清を
採取し、そのＩＬ−２活性を、スミス（Ｋ、　Ａ、　Ｓ
…１［ｈ）らの方法に従い、ＩＬ−２依存ｉ生マウスＴ
細胞（ＣＴＬＬ２＞を用いて測定した（　Ｊ、　ｌｍｍ
１ＪｎＯ１。

１２０．２０２７　（１９７８））。

結果を下記第５表に示す。

第５表 ■　Ｕ−３７３ＭＧ細胞を、１０％Ｆ　ＣＳ　７１０Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地で集密的まて培養し、更に２０ｎ
ＭｍＱのポリペプチドＸ　Ｘ　Ｘ　Ｖｌを含む又は含ま
ない（コントロール）上記培地中で１８時間インキュベ
ー１〜した。

培地を除去した後、グアニジニウム／セシウムクロライ
ド法により　ＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）−セルロ
ース　りロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ＞”　ＲＮ
Ａ　（ｍＲＮＡ＞を収１ｑシた。ノザン・プロッティン
グ法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ＞に従い、
上記ポリ（Ａ＞”　ＲＮＡ１０μｑをアガロースゲル（
１，２％）電気泳動にイ」シ分画後、ニトロセルロース
・フィルターに転写した。減圧下８０’Ｃてベーキング
し、２０ｍＭ　トリスＨＣ２（１：）Ｈ８，０＞中で１
００’Ｃ下に、５分間処理後、５０％フォルムアミド、
５ＸＳＳＣ１５０ｒｎＭソシウムフオスフエート（ｐＨ
６，５＞、４ｘデンハード液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　
５ｏｌｕｔｉｏｎ）及び２００μＱ／ｍＱの変性サルモ
ン　スペラムＤＮＡ中で４２°Ｃ下にプリハイブリダイ
ゼーションを行なった。５時間後、ニックトランスレー
ションで放射能標識したＧＭ−Ｃ３ＦｃＤＮＡ　［５ｃ
ｉｅｎｃｅ２２８．８１０　（１９８５）］のＰｓｔＩ
−ＮｃｏＩＤＮＡ断片又はＢ　Ｓ　Ｆ　−２ＣＤ　Ｎ　
Ａ　［Ｎａｔｕｒｅ３２４．７３　（１９８６）］のＫ
ｐｎニー　ＢａｍＨｌＤＮＡ断片と、４２°Ｃ下に２０
時間ハイブリダイゼーションを行なった。フィルターを
０．１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　７Ｊ［］　２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃて
至温下に１５分間、更に０．１％ＳＤＳ加Ｑ、　１Ｘｓ
ｓｃで５０’Ｃ下に１時間洗浄した。Δ−トラジオグラ
ムは、増感紙を用いて、−７０’Ｃ下に一夜行なった。

その結果、ＧＭ−Ｃ３ＦのＤＮＡ断片を用いた場合も、
ＢＳＦ−２のＤＮＡ断片を用いた場合も、１［−１β誘
導体の利用により、動物細胞からの天然ナイト力イン類
の生産が効率よく行ない得ることか判った。

また、ＩＬ−１β誘導体の、かかる方法への適用に際し
ては、極めて微量、通常１０ｎＭ＋ｎＱ程度の使用で十
分でおり、誘導されたザイトカイン類の精製過程をも容
易にする。

■　動物細胞よりサイト力インを生産する場合、産生誘
引に使用するＩＬ−１８活性物がその条件下において構
造的に安定て必り、細胞表面上のＩＬ−１受容体に結合
することが必須である。即ち、ＩＬ−１β活性物がＩＬ
−１受容体に結合し、サイトカイン産生に必要なシグナ
ルを細胞内に１云えることか手要である。そこで、線維
芽細胞上のＩＬＩ受容体への結合に関して、以下の試験
を行なった。即ち、６−ウ■ルプレート上で、−面にほ
ぼ均一にまで増殖したＢａ１ｂ、／３Ｔ３細胞（クロー
ンＡ３１：Ａ丁ＣＣ，ＣＧ１〜１６３、１Ｘ１０”細胞
／ウェルに、　　Ｉて標識したポリペプチドＩ（１ｍ−
１β）の５００００ｃｐｍ／つ■ル及び事前に１０％Ｆ
Ｃ３７ＪＯＤ−ＭＥＭ中で３７°Ｃ下にインキュベ−１
〜した２０１ｇ、／ｍ２のポリペプチド■を加え、４°
Ｃで反応させた。反応液をパスツールピペットで除き、
１０％Ｆ　ＣＳ　７ＪＯＤ　−ＭＥＭの１　ｍＱを加え
て静かに洗い上清を捨てた。

この洗浄操作を２回線ｊヌした後、１　ｍＱの１％ＳＤ
Ｓ、０．２Ｎ　　Ｎａ０日で細胞を可溶化し、可溶化液
及び更にウェルを洗浄した可溶化液中の放射能（結合放
射能）をＴ−カウンターにて測定した。

尚、上記１２５Ｉ標識ポリペプチド■は、小ルトンとハ
ンター（Ｂｏｌｔｏｎ　Ｈａｎｔｅｒ）の方法（ＢＩＯ
ＣｈｅｍＪ、、１３３，５２９　（１９７３））に従い
製造精製した（比活性；２５０μＣｉ／μｑ蛋白以上）
。

ｊｑられた結果を下記第６表に示す。

第６表 尚、表中阻止能は次式により求めた。

かかる指標は、共存させたポリペプチド■の１１１受容
体への結合力を表わす。

上記第６表より、ポリペプチド■、即ちＩＬ１β自体は
、サイト力イン誘導条件下において、時間の経過と共に
、ｌ−１受容体への結合力か低下してしまうことか明ら
かとなった。

そこで、上記において、２４時間の事前のインキュベー
ションを行ったポリペプチドエ、ポリペプチドＶｌ又は
ポリペプチドｘ　ｘ　ｘ　ｖｍを用いた同試験を行なっ
た。

結果を第６表と同様にして第７表に示す。

第７表 Ａ：未標識ポリペプチド■か存在しない時の結合した放
射能 Ｂニブレートに非特異的に吸着した放射能Ｃ：結合した
放射能の実測値 上記結果より、動物細胞からのサイト力イン類の製造に
際しては、ＩＬ−１β誘導体の採用かより好ましいこと
か判る。

実施例　］ ■　ＧＩＦ活性［前記した方法において、ヒトメラノー
マ細胞として△３７５３１株（微工研菌奇第９６７０号
）を用いて測定した］として４５０００単位、／ｍＱ（
約１μｃＩ蛋白ｔ／ｍ（２）のポリペプチドＶｌ、ツウ
ィーン８０（ポリソルベート８０：日本サーファクタン
ト社製＞０．０１ｍＭｍＱ及びマルトース１５ｍｇ／＋
ｎＱとなる量の各成分を、０．０１Ｍクエン酸−クエン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０＞に加えて混合し、混
合物をか過（０，２２μｍメンブラーフィルター使用＞
　１４１２、炉液を無菌的に１１′ＩＩＱずつバイアル
瓶に分注し、凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明組
成物を調製した。該製剤は、これを開時、生理食塩水１
　ｍＱに溶解して利用される。

■　上記■と同様にして、ポリペプチド■又はポリペプ
チドＸＸｖを有効成分として含有する注射用製剤形態の
本発明組成物を調製した。

他のＩ＋−１β活性物も略同様にして、注射用製剤形態
に調製できる。

■　安定ＩＩ試験 上記■で得られた製剤を用いて、その安定性を下記方法
により試験した。

（Ｉ＞方法Ｔ： 凍結乾燥した上記製剤を、カラス瓶（気密、遮光）容器
中、４°Ｃ又は全部下にそれぞれ保存した。

安定性の判定は、下記刊定塁準に塁づいて１．２．３及
び６ケ月間それぞれ保存後に評価した。

く判定基準〉 性　状：（外Ｅ）試験開始時と同じく、白色の１先であ
る時「変化なし」と判定した。

（溶状）生理食塩水１　ｒｎＱに溶かした溶液が、無色
透明である時に１変化なし」と判定した。

水素イオン濃度二開始時のｐｌ−１値（５，６５）の±
０．２の範囲を「変化なし」と判定した。

浸透圧比：開始時の値を１００％とした時、９５〜１０
５％の範囲内に必る時を「変化なし」と判定した。

尚、上記判定は、１サンプルにっき３バイアルの結果の
平均をもって評価した。

（ｎ）結　果： 全ての保存温度及び全ての保存期間において、本発明の
製剤はいずれも上記阜ギ、により「変化なし」と判定さ
れた。上記試験における６ケ月の保存後の測定データー
（平均値）を第８表に示す。

第８表 （ＩＩＩ）方法■： 凍結乾燥した上記製剤を、生理食塩水１　ｒｎＱに溶か
した後、３日間、４°Ｃ又は室温下に保存し、その溶状
及び水素イオン濃度を、上記方法工に準じて測定評価し
た。

（１ｖ）結果： 上記試験■の結果を第８表と同様にして第９表に示す。

第９表 上記試験の結果（第８表及び第９表）より、本発明組成
物は、極めて安定であることが判る。

（Ｖ）方法■： 凍結乾燥した上記製剤を、カラス瓶（気密、遮光）容器
中、４°Ｃ又は室温下にそれぞれ保存した。

安定性の判定は、下記判定基準に基づいて、１．２及び
４週間保存後に評価した。

く判定基準〉 含量（％）：試験開始後の１１−１β活性物の含量を１
００％とした時、９５〜１０５％の範囲内にある時を「
変化なし」と判定した。

尚、ＩＬ−１β活性物の含量は、下記条件の高速液体ク
ロマトグラフィー（トＩＰＬＣニドーソー社製ＨＰＬＣ
システム）によって測定した。

カラム：ＴＳＫ　　０ＤＳ−１２０Ｔ（４，６φｘ１５
０ｍｍニドーソー社製） 溶　媒：Ａ液−０，１％ＴＦＡ−水 Ｂ液−０．１％ＴＦＡ−アセトニトリルグラジェントプ
ログラム 時間（分）　　　Ｂ　％ ３５　　　　　３Ｂ 倹　出：紫外線吸収（２２０％ｍ） （ｖｌ）結果： 全ての保存温度及び期間において、いずれも「変化なし
」と判定された。尚、４週間保存後の測定データー（平
均）を下記第１０表に示す。

第　　１０　表 実施例　２ ■　実施例１の■において、その配合成分を下記イ〜ホ
とする以外は同様にして、それぞれ法則用製剤形態の本
発明組成物を調製した。

イ、ポリペプチドＶｌ　　　　　１０μＣＩ／ｍＱツウ
ィーン８０　　　　　０．０１ｍ（］／ｍＱデキストラ
ン４０ システィン ＳＡ （同一緩衝液使用） 口、ポリペプチドＶｌ ツウイーン８０ ショ糖 システィン （同一緩衝液使用） ハ、ポリペプチドＶｌ ツウィーン８０ マンニトール システィン ＳＡ （同一緩衝液使用） 二、ポリペプチドｖ１ ツウイーン８０ イノシトール １５ｍＭ＋ｎＱ Ｑ、　　１ｍｇ、／ｍＱ １ｍ（１，／ｍ（１！ １０μｇ、／　ｍＱ ０、　０１　ｍｇ、／ｍＱ １５ｍＭｎ＋Ｑ ０、　１ｍＭＩＩＩＱ ］Ｏμｑ／ｍＱ Ｏ，０１１１１Ｍｍ１２ ５ｍＭｍＱ Ｏ，１ｍ（１／ｍ（７ ｍＭｍＱ １０μｇ／ｍＱ ０、　０１　ｍＭｍ（Ｉｔ ５ｍＭｍＱ システィン　　　　　　　０．　”１ｍ（］／ｍＱＨ３
Ａ　　　　　　　　　　１ｍＭｍＱ（同一緩衝液使用） ホ、ポリペプチドＶｌ　　　　　１０１．ｌＣＩ／ｍ２
ツウィーン８０　　　　　０．０１…す、／　ｒｒ＋Ｑ
マルトース　　　　　　１５ｍＭｍＱ システィン　　　　　　　０．１ｍＭｍＱ（０，０１Ｍ
クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ＩＨ５，０＞使用
〉 ■　上記■で調製した各製剤の安定性を下記方法により
試験した。

（Ｉ＞方法： 上記製剤を、ガラス瓶（気密、遮光）容器中、４°Ｃ又
は２５°Ｃ下にそれぞれ保存し、１．２及び４週間保存
後に、前記■安定性試験に示した判定基準に従い、各製
剤の性状（外観及び溶状）並びに含量（％〉を評価し安
定性を調へた。

（ｎ）結果： 全ての製剤（上記イ〜ホ）において、全ての保存条件下
で「変化なし」と判定された。尚、４週間保存後の測定
データー（平均）を下記第１１表にボす。

第１１表 以上の各試験結果より、本発明組成物は、ＩＬ−１β活
性物の安定化に）かめて優れたものであることが判る。

実施例　３ ■　ＩＬ−１β活性物［ポリペプチドＶＩ］０．１μＣ
）／ｍＱ又はＯ，Ｏ］Ｌ［１，／ｍＱを含む下記組成の
本発明組成物をカラスバイアル瓶、シリコンコートガラ
スバイアル瓶、ポリプロピレン容器及びポリスチレン容
器の各々に入れて本発明組成物を調製した。

〈配合組成〉 ＩＬ−１β活性物　０．１又は０．０１　ｔＪＱ、／ｍ
ＱＯ，０１Ｍクエン酸緩性ｉ液（ｐＨ６，０）ショ糖　
　　　　　　　　　５ｍ。

システィン　　　　　　　　０．１ｍｇ人血清アルブミ
ン　　０．０１〜１０ｍｇ／ｍＱ■　上記■て調製した
本発明組成物のそれぞれにつき、以下の吸着防止試験を
行なった。即ち、各組成物試料を、２日間及び４日間そ
れぞれ４°Ｃに放置後、ＩＬｉ活性物の残存量を以下の
エンザイムイムノアッセイにより測定した。

くエンザイムイムノアツセイ〉 ９６穴マイクロプレートにマウス抗ＩＬ−１β活性物モ
ノクローナル抗体１００μＱ／ウェルを加え、４°Ｃて
一佼放首する。洗浄後、１％ウシ血清アルブミン４００
１１９を加え、室温で３０分間放置し、プロラギングを
行なわける。洗浄後、試料の段階希釈液１００μＱを加
え、４°Ｃて一夜敢首後、洗浄１−る。ウサキ抗ＩＬ−
１β抗体（Ｃ１ｉｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ
、　ｖｏｌ、　１６６．　ｐ２３７２４６（１９８７）
及びＥｕｒｏｐ、　Ｊ、　１＋ｎｍｕｎｏｌｏｇ。

ｖｏｌ、１７．１５２７−１５３０（１９８７）参照〕
の１００μＱを加え、３７°Ｃで２時間放置する。

洗浄した後、パーオキシダーゼ標識抗体ウサギグロブリ
ン（バイオラット社製）溶液１００μＱを加えて３７°
Ｃて２時間放置する。洗浄後、基質溶液１００μＱを加
えて室温で２〜１５分間放首する。２Ｎ硫酸で反応を停
止させ、４９２ｎｍの吸光度を測定する。別に、ＩＬ−
１β活性物の既知）農度の溶液で検量線を作成し、この
検量線より試１１’ＥｌのＩＬ−１β活性物の温度を求
める。

１ワられた結果を第１２表に示す。

但し第１２表中、容器の種類′の項にあける１はカラス
バイアル瓶を、２はシリコンコートノコラスバイアル瓶
を、３はポリプロピレン容器を、また４はポリスチレン
容器をそれぞれ示す。

この第１２表より、本発明組成物試料はいずれも容器へ
のＩＬ−１βの吸着か認められないことが明らかである
。

実施例　４ ■　ＩＬ−１β活性物（ポリペプチドＶｌ）１μｑに人
血清アルブミン０．１ｍｇ、０．０１Ｍクエン酸〜クエ
ン酸ナト１ノウム緩衝液（ｆ）Ｈ６，Ｏ＞及び下記第１
３表に示す各成分を加えて混合し、混合物８濾過（０，
２２μｍメンブランフィルタ−使用〉後、炉液を無菌的
に１　ｍＱずつカラスバイアル瓶に分注し、凍結乾燥し
て、注射用製剤形態の本発明組成物を調製した。

■　上記■で調製した各本発明試γ」の安定性を以下の
試験により調べた。即ら、凍結乾燥した各試料をカラス
バイアル瓶（気密、遮光）中、２５°Ｃ１５０’Ｃ又は
７０’Ｃ下に各々１．２又は４週間保存したく但し７０
’Ｃ下では１週間のみ保存した）。

ＩＬＩβ活性物の残存量は、下記クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣニド−ソー社製日ＰＬＣシステム）により測定
した。

カラム：丁ＳＫ　　Ｃｌ８−ＮＰＲ（４，６φＸ３５ｍ
ｍトーソー社製） 溶媒：△液−０，１％丁ＦＡ−水 Ｂ液−０．１％ＴＦＡ−アセトニトリルグフジエントプ
ロクラム 時間（分）　　Ｂ％ 検出：紫外線吸収（２１０ｎｍ） 第 表 得られた結果を第１４表に示す。

上記第１４表に示す通り、４週間、２５°Ｃの保存では
全ての本発明組成物試料【こおいて変化か見られず、４
週間、５０°Ｃの保存では本発明組成物試料ＮＯ，チ及
びワにおいて変化は認められず、１週間、７０’Ｃの保
存では本発明組成物試料Ｎ。

ワのみ変化か認められなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第３図（よポリペプチド■のＣ３Ｆ産牛に対
する促進効果試験結果を示すグラフである。 第４図はポリペプチド■の抗関節炎試験結果を小すグラ
フでめる。 第５図は■Ｌ−１β誘導体のＣ３Ｆ産生促進試験結果を
示すグラフでおる。 第６図はＩＬ−１β誘導体の抗炎症試験結果をボすグラ
フである。 第７図はＩＬ−１β誘導体の１５Ｉｉ則線障害防止作用
試験の結果を示すグラフである。 第８図はｌｍ−１β誘導体の日和見感染症防止作用試験
の結果を示すグラフである。 （以 上） ２４ｈ「 ４８ｈ「 ７２ｈ「 第 図 ２４ｈ「 ４８ｈ「 ７２ｈ「 ポリペプチド　Ｉ　ｏＣｊＡ　度（ＧＩＦ　阜（ｉ／ｍ
ｌ）第 図 ネ支オうミ岸め貰。う紫１支（ｒｉｇ／ｍｌ）第 図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）インターロイキン−１β活性物と共に、人血清ア
   ルブミン及び／又は糖類と界面活性剤とを含有すること
   を特徴とするインターロイキン−１βの安定化組成物。
2. （２）インターロイキン−１β活性物と共に、人血清ア
   ルブミン及び糖類を含有する請求項（１）記載の組成物
   。
3. （３）更に含硫還元剤を含有する請求項（１）記載の組
   成物。
4. （４）緩衝液で等張化した請求項（１）記載の組成物。