KR100468553B1

KR100468553B1 - 고친화성 인터루킨-4 뮤테인

Info

Publication number: KR100468553B1
Application number: KR10-1999-7000371A
Authority: KR
Inventors: 제프리 그리브; 아르멘 비. 샤나펠트; 스티븐 록즈니악
Original assignee: 바이엘 코포레이션
Priority date: 1996-07-19
Filing date: 1997-07-09
Publication date: 2005-01-29
Also published as: HUP0000248A2; ATE310821T1; DE69734723T2; MY124565A; BR9710733A; HUP0000248A3; IL182509A0; ID17491A; BR9710733B1; PL188738B1; CA2259940C; NZ505238A; AR060630A2; CA2259940A1; TR199900100T2; KR20000067914A; JP2000515016A; DE69734723D1; EP0939817A2; DK0939817T3

Abstract

본 발명은 야생형 IL-4의 A-알파 나선 또는 C-알파 나선 중 어느 하나의 결합 표면에 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하여서, IL-4Rα 수용체에 적어도 천연 IL-4 보다 큰 친화도로 결합되는 뮤테인인, 야생형 IL-4에 따라 번호매김된 재조합 사람 IL-4 뮤테인에 관한 것이다. 치환은 보다 바람직하게는 A-나선형에서는 위치 13 및 16, 그리고 C-나선형에서는 위치 81 및 89로 구성된 위치 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시양태는 위치 13에서의 치환이 Thr을 Asp로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인이다. 또한, 약제 조성물, 뮤테인을 코딩하는 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열, 형질전환된 숙주 세포, 뮤테인에 대한 항체, 및 치료 방법도 기재되어 있다.

Description

고친화성 인터루킨-4 뮤테인{High-Affinity Interleukin-4 Muteins}

인터루킨-4는 조혈 세포 및 비조혈 세포에서 광범위한 스펙트럼의 세포 기능을 조절하는, 활성화된 T 세포(Howard 등, J. Exp. Med. 155: 914 (1982)), 마스트 세포 (Brown 등, Cell 50: 809(1987)) 및 호염기구(Seder 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2835(1991))에 의해 분비되는 15 kDa 당단백질이다. IL-4의 서열은 미국 특허 제5017691호에 개시되어 있다. 인터루킨 4(IL-4)는 면역계의 세포, 내피 세포 및 섬유아 세포 특성을 갖는 것들에 대해서 활성을 갖는 다형질발현성 시토킨이다. IL-4의 시험관 내에서의 보고된 효과에는 T 및 B 세포의 증식, B 세포에 의한 면역글로불린 부류간의 변환, 내피 세포에서 세포 표면 결합 분자 생성의 자극, 및 IL-6 방출의 자극이 포함된다. T 세포에서는, IL-4는 미토겐에 의해 예비활성화된 후, T 세포 증식을 자극하고, IFN-γ 생산을 저하시킨다. 단핵구에서는, IL-4는 클래스 II MHC 분자 발현, 리포폴리사카라이드-유도성 tPA의 방출, 및 CD23 발현을 유도한다. 내피세포(EC)에서는, IL-4는 VCAM-1의 발현 및 IL-6의 방출을 유도한다. IL-4는 ICAM-1 발현을 감소시킨다(Maher, DW 등, Human Interleukin-4: An Immunomodulator with Potential Therapeutic Applications, Progress in Growth Factor Research, 3: 43-56(1991)).

IL-4는 IL-2에 노출되어 활성화된 T 세포의 증식을 자극할 수 있기 때문에, IL-4 치료법이 추구되고 있다. 예를 들어, 신장암의 동물 모델에서는 IL-4의 항신생물 활성이 입증되었고, 마우스에서는 종양 퇴화를 유도하였다 (Bosco, M. 등, Low Doses of IL-4 Injected Perilymphatically in Tumor-bearing Mice Inhibit the Growth of Poorly and Apparently Nonimmunogenic Tumors and Induce a Tumor Specific Immune Memory, J. Immunol. 145: 3136-43(1990)). 그러나, 그의 독성으로 인하여 사람에서의 투여는 제한된다 (Margolin, K. 등, Phase II studies of Human Recombinant Interleukin-4 in Advanced Renal Cancer and Malignant Melanoma, J. Immunotherapy 15: 147-153(1994)).

IL-4의 일반적인 구조 및 기능 및 4개의 역평행 a-나선형 도메인(A-D)를 포함하는 관련 단량체 리간드는 현재 공지되어 있다. IL-4의 3차원 구조도 밝혀졌다 (Powers 등, Science 256:1673 (1992)). 단백질은 4개의 왼손 방향 a-나선 및 2개의 b-시이트를 함유한다.

IL-4 수용체는 2개 이상의 쇄로 구성된다. 제1 IL-4R 쇄인, IL-4Rα는 IL-2R의 b 쇄 및 성장 인자 수용체 수퍼패밀리의 다른 구성원과 상당히 상동성을 공유한다 (Ldzerda 등, J. Exp. Med. 171:861(1990)). 제2 IL-4R 쇄인, "공통 쇄", γc로도 알려져 있는 IL-2R의 쇄도 확인되었다 (Russell 등, Science 262:1877(1993). 이 2개의 결합 부위는 순차적인 두번의 결합에 관여하는 듯하며, 이는 1:1:1의 3원 복합체를 형성하게 한다. IL-4Rα와 결합하는 것으로 추측되는 IL-4의 영역은 나선 A 및 C의 어느 하나 또는 모두에 위치하는 것으로 생각되며, gc와의 작용 영역은 나선 D 상에 위치하는 것으로 생각된다. 현재의 이론으로는 제1 결합은 제1 결합 성분인 IL-4Rα와 리간드가 접촉하는 것이라는 입장이다. 이 결합에는 어떠한 세포의 신호 전달 활성과도 연관되지 않는다. 제2 결합은 IL-4/IL-4Rα 복합체가 제2 쇄, gc를 보강하는 경우에 일어난다. 상기 제2 결합이 일어난 후에야, 신호전달이 일어나고 세포 활성이 얻어진다. 야생형 IL-4의 길항작용은 IL-4Rα에 대한 결합은 보유한 채로, 세포 활성에 필수적인 제2 영역에 의해 매개되는 결합 작용을 감소시키거나 또는 제거하는 경우에 나타난다. 효능 작용은, 후보 리간드가 구조적으로 제1 및 제2 영역을 통하여 두가지 수용체 성분 모두에 작용하는 경우에 일어난다.

IL-4의 길항제는 문헌에 보고되어 있다. 길항제로서 기능하는 IL-4의 돌연변이체에는 IL-4 길항제 뮤테인 IL-4/Y124D (Kruse, N., Tony, H.P., Sebald, W., Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement, Embo J. 11: 3237-44, 1992) 및 이중 뮤테인 IL-4 [R121D/Y124D] (Tony, H. 등, Design of Human Interleukin-4 Antagonists in Inhibiting Interleukin-4-dependent and Interleukin-13-dependent responses in T-cells and B-cells with high efficiency, Eur. J. Biochem. 225: 659-664(1994))이 있다. 단일 뮤테인이란 D-나선 중 위치 124의 티로신이 아스파라긴산에 의해 치환된 것이다. 이중 뮤테인이란 D-나선 중 위치 121의 아르기닌이 아스파라긴산에 의해 치환되고, 위치 124의 티로신이 아스파라긴산에 의해 치환된 것이다. D-나선의 상기 영역에서의 변이는 제2 결합 부위에서의 작용 변화와 분명히 관계가 있다.

야생형 IL-4의 효능작용 또는 길항작용을 나타내는 IL-4의 돌연변이 변이체는 IL-4의 다형질발현성 효과 중 하나와 관련된 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, IL-4의 길항제는 IL-4 생산에 의해 악화되는 질환, 예를 들어 천식, 알레르기, 또는 다른 염증성 반응과 관련된 질환을 치료하는데 유용할 것이다. IL-4의 효능제는 IL-4의 존재가 예를 들어, 자가면역 질병, 예를 들면, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 당뇨병 등과 같은 질병의 완화 또는 약화와 관련되어 있는 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 자가면역 질병은 T 헬퍼 세포군, 유형 1 및 2(Th1, Th2)의 생산에서의 분극화에 의해 특징지워진다. 천연 CD4+ T 세포는 자극시 존재하는 시토킨에 따라, Th1 또는 Th2 하위 세트로 분화된다. IL-4 효능제는 이상적으로는 목적하는 T-헬퍼 세포를 생산하도록 즉, Th2를 향하여 갈 것이고, 이로 인해 치료 효과를 갖게된다.

제PCT/US93/03613호는 알파 나선형 도메인에서 Phe-Leu 또는 Tyr-Leu 서열, 및 Phe-Leu 또는 Tyr-Leu 서열로부터 바로 업스트림 또는 다운스트림에 위치하는 2개의 아미노산 내에 음으로 하전된 아미노산을 갖는, IL-4 변이체를 개시하고 있는데, 이 변이체는 음으로 하전된 아미노산을 중성 아미노산으로 치환하면 IL-4 수용체에 대한 친화성이 증가된다. 또한, 음으로 하전된 잔기 중 2개의 잔기 내에, IL-4의 a-나선 내의 Tyr-Leu 또는 Phe-Leu의 특이적 치환이 친화성을 향상시키는 것으로 개시되어 있다. 상기 변이체는 (디프테리아 독소와의) IL-4 융합 단백질이다.

<발명의 요약>

본 발명은 야생형 IL-4의 A-알파 나선 또는 C-알파 나선 중 어느 하나의 결합 표면에서 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하여서, IL-4Rα 수용체에 적어도 천연 IL-4 보다 큰 친화도로 결합되는 뮤테인인, 야생형 IL-4에 따라 번호매김된 재조합 사람 IL-4 뮤테인에 관한 것이다. 치환은 바람직하게는 A-나선형에서는 위치 13 및 16, 그리고 C-나선형에서는 위치 81 및 89로 구성된 위치 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시양태는 위치 13에서의 치환이 Thr를 Asp로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인이다. 또한, 약제 조성물, 뮤테인을 코딩하는 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열, 형질전환된 숙주 세포, 뮤테인에 대한 항체, 및 치료 방법도 기재되어 있다.

또한, 본 발명은 우선 스트렙타비딘이 결합할 수 있는 펩티드 태그를 갖는 수용체 쇄의 결합 부위를 스트렙타비딘으로 코팅된 플래쉬플레이트(Flash Plate)로 도입하는 단계, 두번째로 수용체 쇄의 결합 부위에 대한 친화성을 갖는 방사성 표지된 천연 리간드를 플래쉬플레이트로 도입하는 단계, 세번째로 수용체 쇄의 결합 부위에 대해 친화성을 갖는 뮤테인 리간드를 플래쉬플레이트로 도입하는 단계, 평형상태로 만든 후 플래쉬플레이트에 의해 생성된 신호량을 측정하는 단계, 및 마지막으로 천연 리간드에 대한 뮤테인 리간드의 상대적 친화도를 산출하는 단계를 포함하는, 수용체에 대한 뮤테인의 결합능 측정 방법에 관한 것이다. 바람직한 유형에서, 상기 방법은 수용체 쇄 IL-4Rα를 사용한다.

또한, 본 발명은 (a) 야생형 IL-4의 D-나선 중 R121D 및 Y124D 치환, 및 (b) 야생형 IL-4의 A- 또는 C-알파 나선중 어느 하나의 결합 표면에서의 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 이로써 뮤테인이 IL-4Rα 수용체에 적어도 천연 IL-4 보다 큰 친화도로 결합하는, 야생형 IL-4에 따라 번호매김된 재조합 사람 IL-4 길항제 뮤테인에 관한 것이다. 치환은 바람직하게는 A-나선형에서는 위치 13 및 16에서, C-나선형에서는 위치 81 및 89로 구성된 위치의 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시양태는 위치 13에서의 치환이 Thr를 Asp로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 길항제 뮤테인이다. 또한, 약제 조성물, 뮤테인을 코딩하는 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열, 형질전환된 숙주 세포, 뮤테인에 대한 항체, 및 치료 방법도 기재되어 있다.

본 발명은 일반적으로 약리학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 시토킨 패밀리의 신규한 변이체, 특히 사람 인터루킨 4(IL-4)에 관한 것이다.

도 1은 IL-4의 리간드/수용체 구조의 개략도이다. IL-4는 4개의 나선 집합체 단백질이고, 본원에서는 4개의 나선을 정면도로 도시하고 있다 (A, B, C 및 D, 각각 N-말단에서 C-말단으로). IL-4 수용체의 제1 결합 성분은 IL-4Rα이고, 이는 IL-4의 A-나선 및 C-나선을 통해 IL-4 리간드와 작용한다. 3원 복합체, IL-4/IL-4Rα/IL-4Rγ의 형성은 표적 세포에서 신호전달을 유도한다.

도 2는 T13D-IL-4[R121D/Y124D]의 경쟁적 결합의 X-Y 플롯이다. 고체상 결합 분석에서 125I-IL-4에 대한 T13D-IL-4[R121D/Y124D]의 경쟁력()을 IL-4[R121D/Y124D]의 경쟁력()에 대해 상대적으로 나타내고 있다. T13D-IL-4[R121D/Y124D]에 대한 상기 분석을 사용하여 측정한 Kd는 0.28 nM였고, IL-4[R121D/Y124D]에 대해서는 5.0 nM였다.

도 3은 T13D-IL-4[R121D/Y124D]에 의한 IL-4의 길항작용()을 나타내는 유사한 X-Y 플롯이다. PHA 아세포의 IL-4 유도성 증식에 대한 T13D-IL-4[R121D/Y124D]의 경쟁력은 IL-4[R121D/Y124D]()에 대해 상대적으로 나타내고 있다. T13D-IL-4[R121D/Y124D]에 대해 상기 분석을 사용하여 측정한 IC₅₀은 2 nM였고, IL-4[R121D/Y124D]에 대해서는 13 nM였다.

도 4는 sIL-4Rα-STX의 아미노산 서열 목록이다.

도 5는 T13D-IL-4 뮤테인의 복합 서열 목록이다.

도 6은 T13D-IL-4[R121D/Y124D] 뮤테인의 복합 서열 목록이다.

신규한 뮤테인, 및 wtIL-4 수용체에 대해 보다 높은 친화성을 갖는 신규한 IL-4 뮤테인을 유도하는 메카니즘이 본원에 기재되어 있다.

본원에 사용된 "야생형(wild) IL-4" 또는 "wtIL-4"는, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,017,691호에 개시된 바와 같이, 야생형이든 또는 재조합형이든 천연형 사람 IL-4의 129개의 정상적으로 생기는 아미노산 서열을 갖는 사람 인터루킨-4를 의미한다.

본원에 사용된 "IL-4 뮤테인"은, 사람의 성숙한 인터루킨-4 단백질에 대한특정 아미노산 치환이, 특히 A-나선 또는 C-나선에 대해, 보다 바람직하게는 그의 결합 표면을 구성하는 아미노산에 대해 일어난 폴리펩티드를 의미한다. A 나선의 결합 표면은 일반적으로 아미노산의 약 5 내지 약 16 위치, 그리고 나선 C에서는 약 77 내지 약 89 위치에 있다. 어느 한 나선에서의 이와 같은 변화는 얻어진 뮤테인의 IL-4Rα에 대한 친화성을 증가시키고, 이와 같은 뮤테인은, 그 분자에 대한 추가 치환의 최종 특성에 따라, wt IL-4의 효능제 또는 길항제일 수 있다.

본원에 사용된 "IL-4 길항제 뮤테인"은 사람의 성숙한 인터루킨-4 단백질에 대해 특정 아미노산 치환이 일어난 폴리펩티드를 의미한다. 상세하게는, 본원에서 제안된 길항제 뮤테인은 3개 이상의 별개의 치환을 포함한다. 본원에 포함되는 모든 길항제 뮤테인에 한쌍의 "IL-4[R121D/Y124D]" 치환이 존재하고, 이는 D-나선의 골격 중 한쌍의 치환, R121D(Arg를 Asp로) 및 Y124D(Tyr를 Asp로) 의미한다. 또한, 세번째 치환은 수용체 알파 쇄에 대한 뮤테인의 결합 친화성을 증가시키는 위치에서 A-나선 또는 C-나선 중 어느 하나의 결합 표면에서 일어난다. 이와 같은 변화를 제외하고는, 가장 바람직한 IL-4 길항제 뮤테인은 다른 비치환 잔기에서는 야생형 IL-4과 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 IL-4 뮤테인은 또한 천연 IL-폴리펩티드 쇄의 다른 잔기의 1 이상의 부위에서 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 수식에 의해 특성화될 수 있다. 본 발명에 따라, 임의의 이러한 삽입, 결실, 치환 및 수식은 IL-4와 관련된 활성을 보유하는 IL-4 뮤테인을 제공해야 한다.

본 발명자들은 IL-4의 다른 위치에서의 보존적 수식 및 치환(즉, 뮤테인의 2차 또는 3차 구조에 최소한의 영향을 미치는 것)을 선호한다. 이와 같은 보존적 치환은 데이호프(Dayhoff)의 문헌[The Atlas of Protein Sequence and Structure 5(1978)] 및 아르고스(Argos)의 문헌[EMBO J., 8;779-785(1989)]에 기재된 것을 포함한다. 예를 들면, 하기 군 중 하나에 속하는 아미노산은 보존적 변화를 나타낸다:

- ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr;

- cys, ser, tyr, thr;

- val, ile, leu, met, ala, phe;

- lys, arg, his;

- phe, tyr, trp, his; 및

- asp, glu, tyr.

본 출원인은 또한 분자내 가교 형성 또는 부정확한 디술피드 결합 형성 부위를 제거하는, 수식 또는 치환을 선호한다. 예를 들면, IL-4는 야생형 위치 3, 24, 46, 65, 99 및 127에서 6개의 cys 잔기를 갖고, 이중 1개 이상이 가교 형성 상호작용에 관여할 수 있는 것으로 알려져 있다. 야생형 단백질 3차 구조가 보존되도록 가능한 한 원거리에서 치환이 선택되어야 한다.

"야생형 IL-4에 따른 번호매김"이란 용어는, 선택된 아미노산을 야생형 IL-4에 보통 아미노산이 존재하는 위치에 따라 식별한다는 것을 의미한다. IL-4 길항제 뮤테인에 삽입 또는 결실이 가해지는 경우, 당업계 숙련자는 예를 들면 야생형 IL-4에 따라 번호매김될 때 보통 125 위치에 존재하는 Ser(S)가 뮤테인 내에서 위치가 전좌될 수 있다. 그러나, 전좌된 Ser(S) 위치는 그의 옆에 접한 아미노산과 야생형 IL-4 중의 Ser의 옆에 접해있는 아미노산에 대한 조사 및 상관성에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명의 IL-4 뮤테인은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다. 이와 같은 방법은, 본 발명의 IL-4 뮤테인을 코딩하고 적절하게 형질전환된 숙주에서 서열을 발현하는 DNA 서열을 작제하는 것을 포함한다. 본 방법에 의해 본 발명의 재조합 뮤테인이 생산된다. 그러나, 보다 덜 바람직하지만 본 발명의 뮤테인은 화학 합성법 또는 화학 합성과 재조합 DNA 기술의 조합법에 의해 생산될 수 있다.

본 발명의 뮤테인을 생산하는 재조합 방법의 하나의 실시양태로, 야생형 IL-4를 코딩하는 DNA 서열을 단리 또는 합성한 후, 부위 특이적 돌연변이 유발법에 의해 트레오닌-13에 대한 코돈을 아스파라긴산에 대한 코돈으로 변화시킴으로써 DNA 서열을 작제한다. 이 기술은 공지되어 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌[Mark et al, Site-specific Mutagenesis Of The Human Fibroblast Interferon Gene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-66(1984)], 및 미국 특허 제4,588,585호를 참조한다.

본 발명의 IL-4 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열을 작제하는 다른 방법은 화학 합성법일 것이다. 예를 들면, 바람직한 IL-뮤테인을 코딩하는 유전자는, 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적 방법에 의해 합성할 수 있다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는, 목적하는 IL-4 뮤테인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 그리고 바람직하게는 재조합 뮤테인이 생산되는 숙주 세포에서 바람직한 코돈을 선택함으로써 만들어진다. 이와 관련해서, 유전자 코드가 축퇴됨(degenerate)을 즉, 아미노산이 1개 이상의 코돈에 의해 코딩될 수 있음은 익히 알려져 있다. 예를 들면, Phe(F)는 2개의 코돈, TTC 또는 TTT에 의해 코딩되고, Tyr(Y)는 TAC 또는 TAT에 의해 코딩되고, His (H)는 CAC 또는 CAT에 의해 코딩된다. Trp(W)는 단일 코돈 TGG에 의해 코딩된다. 따라서, 특정 IL-4 뮤테인을 코딩하는 주어진 DNA 서열에 대해서, 이 IL-4 뮤테인을 코딩하는 다수의 축퇴성 DNA 서열이 존재할 것으로 생각된다. 예를 들면, SEQ ID NO: 9에 나타나는 뮤테인 T13D-IL4[R121D/Y124D]에 대한 바람직한 DNA 서열 외에도, IL-4 뮤테인을 코딩하는 다수의 축퇴성 DNA 서열이 존재할 것이다. 이와 같은 축퇴성 DNA 서열은 본 발명이 범위에 속하는 것으로 간주된다. 즉, 본 발명에 있어서 "그의 축퇴성 변이체"는 특정 뮤테인을 코딩하는 모든 DNA 서열을 의미한다.

본 발명의 IL-4 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열은, 부위 특이적 돌연변이 유발법, 화학 합성법 또는 기타 방법 중 어느 방법에 의해 생산되든지, 신호 서열을 코딩하는 DNA 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 이와 같은 신호 서열은, 존재하는 경우, IL-4 뮤테인의 발현을 위해 선택된 세포가 인식할 수 있는 것이어야 한다. 이는 또한 원핵세포 또는 진핵세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. 이는 또한 천연 IL-4의 신호 서열일 수 있다. 신호 서열의 포함 여부는, IL-4 뮤테인을 생산하는 재조합 세포로부터 IL-4 뮤테인을 분비시키는 것이 바람직한지에 따라 결정될 수 있다. 선택된 세포가 원핵세포인 경우, 일반적으로 DNA 서열이 신호 서열을 코딩하는 것이 아니라 직접 발현을 위해 N-말단 메티오닌을 포함하는 것이 바람직하다. 선택된 세포가 진핵세포인 경우, 일반적으로는 신호 서열이 코딩되는 것이 바람직하고, 야생형 IL-4 신호 서열이 사용되는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 따라 IL-4 뮤테인을 코딩하는 유전자의 합성에 표준법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 작제할 수 있다. IL-4 뮤테인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오티드를 합성한 후 라이게이션한다. 각 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 상보적인 어셈블리를 위해 5' 또는 3' 오버행(overhang)을 포함한다.

(합성법, 부위 특이적 돌연변이 유발법, 또는 다른 방법에 의해) 일단 어셈블리되면, 본 발명의 IL-뮤테인을 코딩하는 DNA 서열이 발현 벡터 내로 삽입되고 목적하는 형질전환된 숙주에서의 IL-4 뮤테인의 발현에 적합한 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결될 것이다. 적합한 어셈블리는 뉴클레오티드 서열 결정, 제한지도 작성, 및 적합한 숙주에서 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 숙주에서 트랜스펙트된 유전자를 높은 수준으로 발현시키기 위해, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능하는 전사 및 번역 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결되어야 한다.

발현 조절 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 따라 좌우될 것이다. 광범위한 각종 발현 숙주/벡터 조합이 사용될 수 있다. 진핵세포 숙주에 대해 유용한 발현 벡터로는, 예를 들면 SV40, 소의 파필로마 바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스로부터의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 들 수 있다. 세균 숙주에 대해 유용한 발현 벡터로는 공지된 세균성 플라스미드(예: col E1, pCR1, pER32z, pMB9 및 그의 유도체를 포함하는E.coli로부터의 플라스미드), 보다 넓은 범위의 숙주의 플라스미드(예: RP₄), 파아지 DNA(예: 파아지 람다의 다수의 유도체(예: NM989)), 및 기타 DNA 파아지(예: M13 및 필라멘트성 단일 가닥 DNA 파아지)를 들 수 있다. 효모 세포에 대해 유용한 발현 벡터로는 2m 플라스미드 및 그의 유도체를 들 수 있다. 곤충 세포에 대해 유용한 벡터로는 pVL 941을 들 수 있다. 본 발명자들은 pFastBac' 1(메릴랜드주 게이더버그 소재의 Gibco BRL)을 선호한다 (문헌[Cate et al, Isolation Of The Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells, Cell,45: 685-98(1986)]을 참조한다).

또한, 임의의 광범위한 발현 조절 서열이 상기 벡터에 사용될 수 있다. 이와 같이 유용한 발현 조절 서열로는, 전술한 발현 벡터의 구조 유전자와 관련된 발현 조절 서열을 들 수 있다. 유용한 발현 조절 서열의 예로는, 예를 들면 SV40 또는 아데노바이러스의 조기(early) 및 후기(late) 프로모터, lac 계, trp 계, TAC 및 TRC 계, 파아지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역(예: PL), fd 코트 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해성 효소에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터(예를 들면 PhoA), 효모 a-메이팅 계의 프로모터, 바큘로바이러스의 폴리헤드론(polyhedron) 프로모터, 및 원핵세포 또는 진핵세포 또는 그의 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 서열, 및 그의 조합을 들 수 있다.

세균, 진균(효모를 포함함), 식물, 곤충, 포유류 또는 기타 적합한 동물 세포 또는 세포주뿐만 아니라, 트랜스제닉 동물 또는 식물을 비롯한 임의의 적합한 숙주를 사용하여 본 발명의 IL-뮤테인을 생산할 수 있다. 보다 상세하게는, 이들 숙주로는 E. Coli, 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 진균, 효모, 곤충 세포, 예를 들면, Spodoptera frugiperda(SF9), 동물 세포, 예를 들면 차이니스 햄스터 난소(CHO) 및 NS/O와 같은 마우스 세포, 아프리칸 그린 원숭이 세포(예: COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BNT 10), 및 사람 세포 뿐만 아니라, 조직 배양 중의 식물 세포와 같은 공지된 진핵세포 및 원핵세포 숙주를 들 수 있다. 동물 세포 발현에 있어서, 본 발명자들은 배양된 CHO 세포 및 COS 7 세포, 특히 CHO 세포주 CHO(DHFR-)를 선호한다.

물론, 모든 벡터 및 발현 조절 서열이 본원에 기재된 DNA 서열을 발현시키는데 있어서 동일하게 잘 기능하는 것은 아님을 이해해야 한다. 또한, 모든 숙주가 동일한 발현계에서 동일하게 잘 기능하지는 않을 것이다. 그러나, 당업계 숙련자는, 과도하게 실험하지 않고도 이들 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주를 선택할 수 있다. 예를 들면, 벡터의 선택에 있어서, 벡터가 숙주내에서 복제되어야 하므로 숙주가 고려되어야 한다. 벡터의 카피수, 카피수의 조절능, 및 벡터에 의해 코딩되는 임의의 기타 단백질의 발현(예: 항생제 마커)가 또한 고려되어야 한다. 예를 들면, 본 발명에서 사용되는 바람직한 벡터로는, IL-4 뮤테인을 코딩하는 DNA가 카피수로 증폭되도록 하는 것을 들 수 있다. 이와 같은 증폭성 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 이들 벡터로는, 예를 들면 DHFR 증폭법(예: Kaufman의 미국 특허 제4,470,461호 및 문헌[Kaufman and Sharp, Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression, Mol. Cell. Biol., 2: 1304-19(1982)]참조) 또는 글루타민 신테타제("GS") 증폭법(예를 들면 미국 특허 제5,122,464호 유럽 출원 공개 제EPO338841호 참조)에 의해 증폭 가능한 벡터를 들 수 있다.

발현 조절 서열을 선택하는데 있어서, 또한 다양한 요소가 고려되어야 한다. 이들 요소로는, 예를 들면 서열의 상대적 세기, 그의 조절능, 및 특히 가능한 2차 구조를 고려하여 본 발명의 IL-뮤테인을 코딩하는 실제적인 DNA 서열과의 상용성을 들 수 있다. 숙주는, 선택된 벡터와의 상용성, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 생성물의 독성, 그의 분비 특성, 그의 정확한 폴리펩티드 폴딩능, 그의 발효 또는 배양 요건, 및 DNA 서열에 의해 코딩되는 생성물 정제 용이성을 고려하여 선택되어야 한다.

상기 매개변수 내에서, 당업자는 예를 들면 CHO 세포 또는 COS 7 세포를 사용하여 대규모의 발효 또는 동물 배양에 있어서 목적하는 DNA 서열을 발현시키는 각종의 벡터/발현 조절 서열/숙주의 조합을 선택할 수 있다.

본 발명에 따라 얻어진 IL-4 뮤테인은 뮤테인 생산에 사용된 숙주 생물체에 따라 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 세균이 숙주로서 선택되면, 생산된 IL-4 뮤테인이 글리코실화되지 않을 것이다. 한편, 진핵세포의 경우에, 천연 IL-4가 글리코실화되는 것과 동일한 방법은 아닐지라도, IL-4 뮤테인을 글리코실화시킬 것이다.

형질전환된 숙주에 의해 생산된 IL-뮤테인은 임의의 적합한 방법에 의해 정제될 수 있다. IL-4를 정제하는 다양한 방법이 알려져 있다. 예를 들면 미국 특허 제5,013,824호 및 동 5,017,691호, 및 제WO 9604306-A2호를 참조한다. 본 발명자들은 면역 친화성 정제법을 선호한다. 예를 들면, 문헌[Okamura et al,. Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatography And N-Terminal Amino Acid Sequence,Biochem.,19: 3831-35(1980)]을 참조한다.

본 발명의 IL-뮤테인의 생물학적 활성은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 분석될 수 있다. 이와 같은 분석법으로는 제EP-B1-41313호에 기재된 바와 같이 항바이러스 활성의 항체 중화법, 단백질 키나제 유도법, 올리고아데닐레이트 2,5-A 신테타제 또는 포스포디에스테라제 활성법을 들 수 있다. 이들 분석법으로는 또한 면역조절 분석법(예를 들면 미국 특허 제4,753,795호 참조), 성장 억제 분석법, T 세포 증식법, 내피 세포에서의 IL-6 유도 및 MCP-1 유도법, 및 인터루킨-4 수용체를 발현시키는 세포에 대한 결합 측정법을 들 수 있다. 또한 문헌[Spits H, Yssel H, Takebe Y, et al., Recombinant Interleukin-4 Promotes the Growth of Human T Cells, J. Immunol. 139: 1142-47(1987)]을 참조한다.

본 발명의 IL-4 뮤테인이 야생형 천연 IL-4 또는 재조합 IL-4에 의한 치료에 사용되는 양과 거의 동일하거나 그를 초과하는 투여량으로 투여될 것이다. IL-4 뮤테인 유효량이 바람직하게 투여된다. "유효량"이란 치료될 증상 또는 징후의 심화 또는 확산을 방지하거나 경감시킬 수 있는 양을 의미한다. 당업계 숙련자에게IL-4 뮤테인 유효량은, 특히 질병, 투여량, IL-4 뮤테인의 투여 스케쥴 (IL-4 뮤테인이 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여되는지의 여부에 따라), 조성물의 혈청 반감기, 및 환자의 일반적인 건강 상태에 따라 좌우된다는 것은 명백한 사실이다.

IL-4 뮤테인은 바람직하게는 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물 형태로 투여된다. "제약상 허용 가능한 담체"란 투여되는 환자에 대해 임의의 바람직하지 않은 효과를 유발시키지 않는 담체를 의미한다. 이와 같은 제약상 허용 가능한 담체는 당업계에 공지되어 있다. 본 발명자들은 pH 7.0에서의 2% HSA/PBS를 선호한다.

본 발명의 IL-4 뮤테인은 공지된 방법에 의해 약제 조성물로 제형화될 수 있다. 예를 들면 본원에 참고로 인용된, 적합한 제형이 기재된 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, E. W. Martin]을 참조한다. IL-4 뮤테인의 약제 조성물은 액상형, 겔형, 동결건조형, 또는 임의의 다른 적합한 형태를 비롯한, 각종의 형태로 제형화될 수 있다. 바람직한 형태는 처리될 특정 징후에 따라 좌우되고, 당업계 숙련자에게 명백할 것이다.

IL-4 뮤테인 약제 조성물은 경구적, 에어로졸, 정맥내, 근육내, 복막내, 내피 또는 피하, 또는 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 바람직한 투여 형태는 치료될 특정 징후에 따라 좌우되고, 이 형태는 당업계 숙련자에게 명백할 것이다. IL-4 뮤테인의 약제 조성물은 기타 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이들 약제가 동일한 약제 조성물의 일부로서 혼입되거나, 또는 IL-4 뮤테인과 별도로, 동시에 또는 임의의 적합한 치료 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 또한, IL-4 뮤테인 약제 조성물은 다른 치료의 첨가물로서 사용될 수 있다.

즉, 본 발명은 임의의 적합한 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 사람에서 면역 질환, 암 또는 종양, 비정상적 세포 성장의 치료, 또는 면역 조절을 위한, 조성물 또는 방법을 제공한다. 배경기술 란에서 전술한 바와 같이, IL-4는 많은 효과를 갖는다. 이중 일부는 T 세포 증식의 자극, T-헬퍼 세포의 분화, 사람 B-세포 활성 및 증식의 유도, 및 면역글로불린의 림포킨 특이적 면역글로불린 클래스간의 변환이다. 임파 계에 미치는 효과로는 MHC 클래스 II 항원의 발현 증진(문헌[Noelle, R., et al, Increased Expression of Ia Antigens on resting B cells; a New Role for B Cell Growth Factor, PNAS USA, 81:6149-53(1984)] 참조), 및 B 세포 상의 CD 23의 발현 증진([Kikutani, H, et al., Molecular Structure of Human Lymphocyte Receptor for Immunoglobulin, Cell 47: 657-61(1986)] 참조)를 들 수 있다. 즉, IL-4에 관한 생물학은, 천식을 포함하는, 알레르기 및 알레르기 염증성 질병의 발병에 IL-4가 중요한 역할을 담당함을 제안하고 있다. T-헬퍼 세포 유형 1(Th1) 및 세포 유형 2(Th2)는 면역 반응에 관여한다. 자극을 받은 Th2 세포는 IL-4를 분비시키고, Th1 진행을 차단한다. 임의의 Th2-관련성 질병은 IL-4 길항제에 의한 치료법에 따르고, 유사하게 임의의 Th1-관련성 질병은 IL-4 효능제에 의한 치료법에 따른다.

또한, 유전자 치료법에서 본 발명의 IL-4 뮤테인을 코딩하는 DNA 서열의 용도가 고안되었다. IL-4 길항제에 대해 고안된 유전자 치료법으로는, IL-4가 기존의 임상적 질환, 예를 들면 염증 관련성 질환(천식) 또는 알레르기를 유발하거나 악화시킬것으로 예상되는 질병의 치료를 들 수 있다. 효능제 용도로는 류마티스성 관절염, 다발성 경화증 및 인슐린 의존성 당뇨병과 같은 자가면역성 질병을 들 수 있다. 이들 자가 면역성 질병은 T 헬퍼 유형 1(Th1)에 대한 T 헬퍼 세포군 생산의 분극화에 의해 특성화된다.

유전자 치료법을 사용한, 효능제 및 길항제 모두에 해당하는, IL-4 뮤테인의 국부적 수송은, 효능제의 비특이적 투여과 관련된 잠재적 독성 문제를 방지하면서, 표적 영역에 치료제를 제공할 수 있다. 생체외 및 생체내 유전자 치료법이 모두 고려된다. 한정된 세포군에 잠재적인 치료 유전자를 전달하는 몇몇 방법이 알려져 있다. 문헌[Mulligan, The Basic Science Of Gene Therapy,Science, 260: 926-31(1993)]을 참조한다. 이 방법은 하기를 포함한다:

1) 직접적인 유전자 전달 (예를 들면 문헌[Wolff et al., Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In Vivo,Science, 247: 1465-68(1990)] 참조),

2) 리포좀 매개성 DNA 전달 (예를 들면 문헌[Caplen et al., Liposome-mediated CFTR Gene Transfer To The Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis,Nature Med. 3: 39-46(1995);Crystal, The Gene As A Drug,Nature Med.1:15-17(1995);Gao and Huang, A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection Of Mammalian Cells,Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 280-85(1991)] 참조),

3) 레트로바이러스 매개성 DNA 전달 (예를 들면 문헌[Kay et al., In VivoGene Therapy Of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs,Science, 262: 117-19(1993);Anderson, Human Gene Therapy,Science256: 808-13(1992)]참조),

4) DNA 바이러스 매개성 DNA 전달 (이와 같은 DNA 바이러스로는 아데노바이러스(바람직하게는 Ad-2 또는 Ad-5 기재의 벡터), 허피스 바이러스(바람직하게는 허피스 심플랙스 바이러스 기재의 벡터), 및 파르보바이러스(바람직하게는 "결핍성" 또는 비자발성 파르보바이러스 기재의 벡터, 보다 바람직하게는 아데노 관련 바이러스 기재의 벡터, 가장 바람직하게는 AAV-2 기재의 벡터)를 들 수 있다. 예를 들면, 문헌[Ali et al., The Use Of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy,Gene Therapy, 1:367-84(1994)], 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제4,797,368 및 동 제5,139,941호를 참조한다.

목적하는 유전자의 전달을 위한 특정 벡터 계의 선택은 다양한 인자에 의해 좌우될 것이다. 하나의 중요한 인자는 표적 세포군의 특성이다. 레트로바이러스 벡터가 광범위하게 연구되고 다수의 유전자 치료 적용법에 사용되어 왔으나, 이 벡터들은 감염성 비분할 세포에 대해서는 일반적으로 적합하지 않다. 또한, 레트로바이러스는 종양 유발 가능성을 갖는다.

아데노바이러스는 넓은 범위의 숙주를 갖고, 뉴우런 또는 간세포와 같은 정지상태의 또는 말단 분화된 세포를 감염시킬 수 있고, 본질적으로 종양 유발성이 아닌 것으로 나타나는 이점을 갖는다(문헌[Ali et al, 상기 문헌, p. 367] 참조). 아데노바이러스는 숙주 게놈으로 통합되는 것 같지 않다. 이들은 염색체 외부에 존재하므로, 삽입을 통한 돌연변이 유발의 위험이 크게 감소된다(문헌[Ali et al, 상기 문헌, p. 373] 참조).

아데노-관련 바이러스는 아데노바이러스 기재의 벡터에서와 유사한 이점을 나타낸다. 그러나, AAV는 사람 염색체 19 상에서의 부위 특이적 통합을 나타낸다(문헌[Ali et al, 상기 문헌, p. 377] 참조).

본 실시양태에 따라, 본 발명의 IL-4 뮤테인을 코딩하는 DNA를 사용한 유전자 치료는 이를 필요로하는 환자에게, 진단과 동시에 또는 직후에 제공된다.

당업계 숙련자는, IL-뮤테인 DNA를 포함하는 임의의 적합한 유전자 치료 벡터가 본 실시양태에 따라 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 이와 같은 벡터의 작제 기술은 알려져 있다 (예를 들면, 문헌[Ohno et al., 상기 문헌, p. 784;Chang et al, 상기 문헌, p. 522] 참조). IL-4 뮤테인 DNA 함유 벡터를 표적 부위에 도입하는 것은 문헌[Ohno et al, 상기 문헌, p 784]에 기재된 공지 기술을 사용하여 달성될 수 있다.

본 발명이 보다 잘 이해되도록, 하기 실시예를 수록한다. 본 실시예는 단지 설명을 위한 것으로, 어떠한 식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨져서는 않된다.

일반적으로, 알라닌 치환을 IL-4의 A-나선 및 C 나선 표면 상의 예견된 잔기의 상응하는 위치에 부위 특이적 돌연변이 유발법에 의해 야생형 IL-4 서열에 도입시켰다(문헌 [Smith LJ; Redfield C; Boyd J; Lawrence GM; Edwards RG; Smith RA 및 Dobson CM, Human interleukin 4. The solution structure of a four-helix bundle protein, J.Mol. Biol., 224(4): 899-904 (1992)] 참조). 이들 잔기는 대부분 IL-4와 IL-4Rα와의 상호작용을 매개하며 (도 1); IL-4Rα에 대한 알라닌 치환 IL-4 뮤테인의 결합 친화성에 대한 효과는 치환 잔기가 결합 작용에 관여할 수 있음을 나타낸다. 알라닌으로 치환되는 경우에 친화성에 대해 중간 효과를 제공하는 잔기를 광범위하게 치환하면 친화성을 향상시키는 변화가 일어남을 확인하였다. 친화성을 향상시키는 돌연변이가 조합되는 경우에 IL-4Rα에 대한 IL-4 (또는 IL-4 관련 펩티드) 친화성의 조합적 증가를 달성할 수 있다. 친화성의 증가는 효능성의 증가와 연관될 것이다.

뮤테인을 부위 특이적 돌연변이 유발법에 의해 발생시키고, 바큘로바이러스계에서 발현시키고, 균일하게 정제하고, 아미노산 분석법으로 정량화하고, 수용체 결합 분석법으로 측정하였다. 본 연구에 사용된 사람의 성숙 IL-4의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 1)을 하기에 나타낸다; 위치 1의 His는 성숙된 폴리펩티드의 N-말단을 나타낸다. A 나선, C 나선 및 D 나선을 개별적인 출발점 상에 제시하였고, 밑줄로 나타내었다. 적절하게 치환되어 보다 높은 친화성 변이체를 제공하는 아미노산은 진하게 나타내었다.

(SEQ ID NO:1)

D 나선에서 두 개의 치환 R121D 및 Y124D를 함유하는 사람 IL-4의 공지된 길항 변이체에 본 연구에서 조사한 돌연변이를 도입시켰다 [Tony HP 등, Design of human interleukin-4 antagonists inhibiting interleukin-4-dependent and interleukin-13-dependent responses in T-cells and B-cells with high efficiency,Eur. J. Biochem, 225(2): 659-65 (1994); 이 뮤테인은 "IL-4[R121D/Y124D"로 표시됨]. 뮤테인을 바큘로바이러스계에 발현시키고, 균일하게 정제하고, 고체상 IL-4Rα 수용체 결합 분석법으로 측정하였다. IL-4Rα에 대한 향상된 친화성의 생물학적 중요성을 T 세포 증식 분석법으로 측정하였다. IL-4[R121D/Y124D] 뮤테인이 IL-4의 길항제이기 때문에, IL-4Rα에 대한 향상된 친화성은 보다 높은 친화성의 길항제 뮤테인의 IC₅₀를 감소시킨다 (IC₅₀은 정의된 효능제 반응을 50 % 억제하는데 필요한 길항제 농도로서 정의됨).

<실시예 1>

뮤테인의 생산

뮤테인을 문헌 [Kunkel TA, Roberts JD, 및 Zakour RA, "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection", Methods Enzymol, 154: 367-382 (1987)]에 기재된 바와 같이 목적하는 돌연변이에 상응하는 코돈을 함유하는 프라이머를 사용하여 부위 특이적 돌연변이 유발법에 의해 발생시켰다. 간단하게는, 제한 효소 부위 Bam HI 및 Xba I를 함유하는 사람 IL-4 cDNA를 동일한 부위를 사용하여 M13 파아지 벡터 M13 mp 19 (New England Biolabs, 매사추세츠주 비버리 소재)내로 서브클로닝하였다. 야생형 IL-4 cDNA는, 포르볼 (phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트 10 ng/㎖로 24시간 유도된 사람 말초 혈액 림프구로부터 mRNA를 단리하여 이로부터 발생된 cDNA 집합체로부터 폴리머라제 연쇄 반응법("PCR")을 사용하여 얻었다. 사용된 PCR 프라이머는 IL-4 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 대해서는,(SEQ ID NO:2)이고, IL-4 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에 대한 것은(SEQ ID NO:3)이다.

제한 효소 부위 Bam HI (5' 말단) 및 Xba I (3' 말단)을 각각의 올리고뉴클레오티드로 삽입하고 이탤릭체로 표시하였다. 사용된 PCR 조건은 25 사이클에 대하여 94 ℃에서 1분, 58.7 ℃에서 1분 및 72 ℃에서 1분이었다. 이에 따라 얻어진 정확한 IL-4 cDNA 서열을 제조자에 의해 기재된 바와 같이 시쿼나아제 (Sequenase(등록상표)) 서열결정 키트 (Amersham Life Sciences, 일리노이주 아링톤 하이츠 소재)를 사용하여 서열결정함으로써 확인하였다. 우라실 함유 단일 가닥 DNA (U-DNA)는, IL-4 cDNA를 함유하는 M13mp19를 사용하여 E-coli 균주 CJ236 (Bio-Rad Laboratories, 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)을 형질전환시킴으로써 얻었다. 부위 특이적 돌연변이 유발법은 일반적으로 돌연변이 유발을 위한 코돈에 대한 주형 U-DNA 5'와 상동성 뉴클레오티드 15개, 목적하는 변화를 포함하는 뉴클레오티드, 및 최종 변형된 뉴클레오티드의 주형 U-DNA 3'와 상동성인 추가의 뉴클레오티드 10개를 함유하는 프라이머를 사용하였다. Asp에 대한 D 나선 돌연변이 Arg-121 및 Asp에 대한 D-나선 돌연변이 Tyr-124를 야생형 IL-4 서열에 도입시켰다. IL-4[R121D/Y124D]로 칭해지는 이 변이체에 대한 우라실 DNA를 상기 기재된 바와 같이 생성시켰다. 본 연구에서 생성된 모든 돌연변이는 IL-4[R121D/Y124D] 주형을 사용하여 생성되었다.

프라이머를 제조자의 프로토콜을 사용하여 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (New England Biolabs, 매사추세츠주 비버리 소재)를 사용하여 인산화하였다. 이어서 인산화된 프라이머를 U-DNA 주형에 어닐링시킨 후, 제조자 (Bio-Rad Laboratories, 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)에 의해 기재된 바와 같이 T7 DNA 폴리머라제 (Bio-Rad Laboratories, 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)로 연장시켰다. E.coli 균주 DH5a(등록상표) 세포 (Gibco BRL, 매릴랜드주 게이더버그 소재)를 반응 혼합물 5 ㎕로 형질전환시키고, 0.7 % 한천을 함유하는 "LB 배지"중에 플레이팅시켰다. 37 ℃에서 인큐베이션한 후, 각 돌연변이 유발 반응으로부터 생성되는 3개의 각각의 플라크를 선택하고, "LB 배지" 2 ㎖로 옮겨서 37 ℃에서 밤새 증식시켰다. 단일 가닥 DNA를 제조자의 프로토콜에 따라 M13 정제 키트 (Qiagen, Inc., 캘리포니아주 채츠워드 소재)를 사용하여 단리시키고, 목적하는 돌연변이를 함유하는 클론을 제조자의 프로토콜에 따라 시쿼나아제(등록상표) 서열결정 키트 (Amersham Life Sciences, 일리노이주 아링톤 하이츠 소재)를 사용하여 단일 가닥 DNA를 서열결정함으로써 확인하였다. IL-4의 정확한 돌연변이 서열을 함유하는 플라크에 상응하는 복제 형태 DNA (M13 파아지의 이중 가닥 형태)를 퀴아겐 플라스미드 미니프랩 키트 (Quiagen, Inc., 캘리포니아주 채츠워드 소재)를 사용하여 단리시켰다. IL-4 뮤테인 cDNA 형태를 Bam HI 및 Xba I를 사용하여 정제된 복제 형태 DNA로부터 단리시키고, 플라스미드 벡터 pFastBac(등록상표) 1 (Gibco BRL, 매릴랜드주 게이더버그 소재)에 서브클로닝하였다. 서브클로닝된 후, 제조자에 의해 기재된 바와 같이 재조합 바큘로바이러스 DNA (하기에는 박크미드 (Bacmid)로 칭함)를 뮤테인 cDNA를 함유하는 pFastBac(등록상표) 1을 E.coli 균주 DH10Bac(등록상표) (GibcoBRL, 매릴랜드주 게이더버그 소재)로 형질전환시킴으로써 생성하였다. 뮤테인을 백 투 백 ‰ (Bac-to-Bac) (GibcoBRL, 매릴랜드주 게이더버그 소재) 바큘로바이러스 발현계를 사용하여 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda, Sf) 9 세포에서 발현시켰다. 모든 곤충 세포는 28 ℃에서 인큐베이션하였다. 간단하게는, Sf 9 세포 2 ㎖ 배양액을 셀펙틴 (CellFECTIN(등록상표)) (GibcoBRL, 매릴랜드주 게이더버그 소재)을 사용하여 재조합 박크미드 5 ㎕로 트랜스펙트시켰다. 상등액을 트랜스펙트된지 60시간 후에 회수하고, 그레이스 (Grace) 배지 (GibcoBRL, 매릴랜드주 게이더버그 소재)에서 1 x 10⁶Sf 9 세포/㎖의 100 내지 200 ㎖ 배양액을 감염시키는데 사용하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 상등액을 GSA 로터 (Dupont Instrument Co., 델라웨어주 윌밍톤 소재)를 사용하여 소르발 (Sorvall(등록상표)) RC-5B 원심분리기에서 10분 동안 5000 rpm으로 원심분리하여 감염된지 48 내지 60 시간 후에 회수하고, 바이러스 역가를 분석하였다 (통상적으로 > 1 x 10⁸플라크 형성 단위/㎖를 얻었음). 단백질 생산을 위하여 SF900 II 배지 (GibcoBRL, 매릴랜드주 게이더버그 소재) 500 ㎖에서 1 ㎖ 당 2-3 x 10⁶Sf 9 세포를 4 내지 10의 감염 다중도로 감염시키고, 상등액을 GSA 로터 (Dupont Instrument Co., 델라웨어주 윌밍톤 소재)를 사용하여 소르발 (Sorvall(등록상표)) RC-5B 원심분리기에서 10분 동안 5000 rpm으로 원심분리하여 감염된지 60 내지 72 시간 후에 회수하고, 멸균 0.2 μM 필터 기구를 통해 여과시켰다.

<실시예 2>

뮤테인의 정제

제조자의 프로토콜에 따라 항사람 IL-4 단클론 항체 C400.1 및 C400.17을 면역원으로서 재조합 사람 IL-4 (Genzyme Diagnostics, 마이애미주 캠브릿지 소재)를 사용하여 마우스로부터 표준 프로토콜을 사용하여 생산하고, 복수액으로 생성하고, 정제하고, CNBr 활성화 세파로즈 (Pharmacia, 스웨덴 업살라 소재)에 커플링시켰다. 각각의 IL-4 뮤테인을 함유하는 재조합 바큘로바이러스에 의해 Sf 9 세포 감염으로부터 발생된 Sf 9 세포 상등액을 항 IL-4 MAb-커플링된 세파로즈 1 ㎖ 칼럼 상에 로딩하고, 100 mM NaHCO₃, 500 mM NaCl, pH 8.3으로 세척하고, 물로 세척하여 염을 제거하고, 100 mM 글리신, pH 3.0의 8 칼럼 부피로 용출시켰다. 분획물을 0.1 부피의 1M 트리스, pH 8.0을 함유하는 실리케이트화 바이알에 회수하였다. 뮤테인 단백질을 완충액 A 내지 B (완충액 A, 물; 완충액 B, 아세토니트릴, 0.1 % 트리플루오로아세트산)의 0 내지 100 % 구배를 사용하여 다이나맥스 (Dynamax(등록상표)) 300Å C₁₈칼럼 (Rainin Instrument Co., 매사추세츠주 오번 소재)에서 역상 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 분획물을 SDS-PAGE에 의해 측정하고, 뮤테인 함유 분획물을 저장을 위해 동결건조시키고, 분석을 위해 멸균 인산 완충 염수 (PBS; 10 mM NaPO₄, 137 mM NaCl, pH 7.6)에서 재현탁시켰다. 이렇게 정제된 뮤테인은 통상적으로 SDS-PAGE (은 염색)에 의해 관찰시 단일 밴드이고, 아미노산 분석 (통상적으로 정확도는 90 %를 초과함)에 의해 정량화되었다.

<실시예 3>

수용체 결합 분석법

IL-4Rα에 대한 IL-4 뮤테인의 결합능에 대한 치환 효과를 측정하기 위하여 [Ldzerda, R.L 등, Human interleukin 4 receptor confers biological responsiveness and defines a novel receptor superfamily, J. Exp. Med. 171: 861-873 (1990)], 고체상 수용체 결합 분석법을 수행하였다. 간단하게는, 뮤테인의 친화성을 고체 표면에 결합된 IL-4Rα로부터 방사성 표지된 IL-4를 변위시키는 성능에 의해 측정하였다. 도 2는 IL-4[R121D/Y124D]에 관한 고체상 결합 분석법으로 125I-IL-4에 대한 T13D-IL-4[R121D/Y124D]의 경쟁능을 나타낸다. 분석법은 스트렙타비딘으로 코팅된 96 웰 플레쉬플레이트(등록상표) (Dupont NEN (등록상표), 매사추세츠주 보스톤 소재)를 사용하여 설정하고, IL-4Rα의 세포외 도메인을 스트렙타비딘이 결합된 IL-4Rα의 세포외 도메인에 엔지니어링된 펩티드 태그에 의해 상기 플레이트에 결합시켰다. 플래쉬플레이트는 플레이트 표면에 인접한 방사선 표지된 화합물만이 섬광을 일으킬 수 있는 특성을 갖는, 플레이트 플라스틱으로 함침된 섬광물을 함유한다. 방사선 표지된 IL-4 및 IL-4 길항제 뮤테인을 함유하는 시료를 각각의 웰에 첨가하고, 평형에 도달할 때까지 인큐베이션시켰다. 비결합 방사선 표지된 화합물은 섬광 신호를 유도하지 않기 때문에, 각각의 웰에 결합된 방사능을 측정하기 전에 세척 단계는 요구되지 않는다. 이와 같이 측정된 방사능은 IL-4Rα에 결합된 방사선 표지된 IL-4 양을 나타내고, 첨가된 비표지 IL-4 길항제 뮤테인 양을 고려하여 IL-4Rα에 대한 비표지 IL-4 길항제 뮤테인의 친화성을 계산한다. 내부 표준을, 각 뮤테인과 병행하여 IL-4[R121D/Y124D]의 친화성을 측정함으로써 각각의 분석법에서 생성하였다. 따라서, 친화성의 특정 상대적 측정값을 얻을 수 있으며, IL-4Rα에 대한 친화성에 대한 개별적 치환 효과를 측정하였다.

IL-4Rα의 세포외 도메인을 유카르트 세포 (Jurkat cell) lgt11 라이브러리 (Stratagene Cloning Systems, 캘리포니아주 라졸라 소재)로부터 PCR을 사용하여 회수하였다. IL-4Rα의 세포외 도메인을 단리시키는데 사용된 PCR 프라이머는 IL-4Rα 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 대하여,(SEQ ID NO:4)이고, IL-4Rα의 세포외 도메인의 3' 말단에 대하여(SEQ ID NO:5)이다.

사용된 PCR 조건은 30 사이클에 대하여 94 ℃에서 1분, 65.8 ℃에서 1분 및 72 ℃에서 1분이었다. 얻어진 PCR 생성물을 제한 효소 BamHI 및 Eco47III으로 절단시키고, 동일한 효소로 절단된 서열 Ser-Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO: 6)에 상응하는 코돈을 지닌 DNA를 함유하는 pBluescript(등록상표)) 벡터 (Stratagene Cloning Systems, 캘리포니아주 라졸라 소재)에 서브클로닝하였다. 이 서열은 스트렙타비딘에 결합하는 것으로 보고되어 있다 [Schmidt TG and Skerra, A., The random peptide library-assisted engineering of a C-terminal affinity peptide, useful for the detection and purification of a functional Ig Fv fragment, Protein Eng, 6(1):109-122 (1992)]. 이에 따라 생성된 IL-4Rα의 세포외 영역은 세포외 영역의 C 말단에서의 펩티드 서열 Ser-Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO: 6)를 코딩하고, sIL-4Rα-STX (위치 1에서 Met는 성숙한 IL-4Rα의 N-말단임)로 칭해지며, SEQ ID NO:7이다.

sIL-4Rα-STX 단백질은 IL-4 길항제 뮤테인에 대해 사용된 것과 동일한 방식으로 바큘로바이러스계를 사용하여 생산되었고, 기재된 바와 같이 [Kruse N 등 "Two distinct functional sites of human interleukin 4 are identified by variants impaired in either receptor binding or receptor activation", EMBO J. 12(13) p5121-9(1993)], IL-4 커플링된 매트릭스로 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, PBS에 저장하였다. IL-4 매트릭스는 제조자 (Pharmacia, 스웨덴 업살라 소재)에 의해 기재된 바와 같이 E. coli 내에서 생산된 IL-4를 CNBr 세파로즈 4B에 커플링시킴으로써 생성되었다. 스트렙타비딘 코팅된 플래쉬플레이트(등록상표) (Dupont NEN(등록상표), 매사추세츠주 보스톤 소재)를 2시간 동안 20 ℃에서 100 mM 트리스, 0.1 % BSA, pH 7.0에서 2 ㎍/㎖ sIL-4Rα-STX 100 ㎕로 코팅하고, PBS, 0.1 % BSA, pH 7.6으로 세척하고, 1.5시간 동안 20 ℃에서 100 ㎕ PBS, 0.1 % BSA, pH 7.6 중에서 200 pM 125I-IL-4 (Dupont NEN(등록상표), 매사추세츠주 보스톤 소재) 및 다양한 농도의 IL-4 길항 뮤테인과 함께 4배수로 인큐베이션시켰다. 분석법을 2회 이상 반복하였다. 내부 표준으로서의 IL-4[R121D/Y124D]를 동일한 플래쉬플레이트 상에서 각각의 뮤테인과 병행하여 적정하였다. 결합된 방사능을 탑카운트(TopCount) 섬광 측정기 (Packard Instrument Co., 코네티커트주 메리덴 소재)로 측정하고, K_d값을 리간드 프로그램 [Munson, P.J 및 Rodbard, D., "Computerized Analysis of Ligand Binding Data", Meth. Enzymol., 92 543-576면 (1983)]을 사용하여 계산하였고, % CV로 표현되는 K_d값의 오차는 2 내지 20 %이었다. 결과를 각각의 분석 플레이트로부터 얻어진 데이터를 사용하여 K_d뮤테인/K_dIL-4[R121D/Y124D]의 비로서 나타내었다. 측정된 Kd 값간의 차이는 IL-4Rα (즉, Kd 뮤테인/Kd IL-4[R121D/Y124D] < 1)에 대한 각각의 뮤테인의 친화성의 상대적 증가, 또는 IL-4Rα에 대한 각각의 뮤테인의 친화성의 상대적 감소를 나타낸다 (즉, Kd 뮤테인/Kd IL-4[R121D/Y124D] > 1).

<실시예 4>

T 세포 증식 분석법

1차 T 세포를 정상적인 공여체로부터의 신선한 혈액으로부터 얻었고, 문헌 [Kruse, N., Tony, H.P. 및 Sebald, W., Conversion of human interleukin-4-into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement, Embo J. 11: 3237-44 (1992)]에 본질적으로 기재된 바와 같이 피콜파크 플러스 (FicollPaque(등록상표) Plus) (Pharmacia, 스웨덴 업술라 소재)를 사용하여 원심분리에 의해 정제하였다. 정제된 말초 혈액 단핵 세포를 7일 동안 10 ㎍/㎖ 식물의 응집소와 함께 인큐베이션하고 (Sigma Chemical Co., St. 미주리주 루이스 소재), 원심분리에 의해 회수하고, RPMI 1640 배지 (Gibco BRL, 매릴랜드주 게이더버그 소재)에서 세척하였다. 5 x 10⁴활성화 T 세포/웰 (PHA 아세포)을 96 웰 플레이트에서 10 % 우태아 혈청, 10 mM HEPES, pH 7.5, 2 mM L-글루타민, 100 유닛/㎖ 페니실린 G, 및 100 ㎍/㎖ 황산스트렙토마이신을 함유하는 PRMI 1640 배지에서 가변량의 IL-4 또는 뮤테인과 함께 48시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하고, 웰 당 1 μCi³H-티미딘 (Dupont NEN(등록상표), 매사추세츠주 보스톤 소재)로 6시간 동안 펄스시키고, 회수하고, 방사능을 탑카운트 섬광 측정기 (Packard Instrument Co., 코네티커트주 메리덴 소재)로 측정하였다.

<실시예 5>

IL-4Rα에 대한 IL-4의 친화성에 대한 알라닌 치환 효과

나선 A 및 C의 표면 노출된 잔기의 알라닌 치환이 IL-4Rα에 대한 IL-4 친화성에 대해 미치는 효과를 하기 표 I에 나타내었다.

IL-4의 A 나선 및 C 나선의 표면이 노출된 잔기의 알라닌 스캔의 결과^*

돌연변이	K_d뮤테인/K_dIL-4[R121D/Y124D]
A 나선Ile-5에서 Ala	71
Gln-8에서 Ala	1.1
Gln-9에서 Ala	125
Ile-11에서 Ala	3.3
Lys-12에서 Ala	1.0
Thr-13에서 Ala	6.4
Asn-15에서 Ala	1.8
Ser-16에서 Ala	0.43
C 나선His-74에서 Ala	1.9
Lys-77에서 Ala	3.7
Gln-78에서 Ala	4.7
Arg-81에서 Ala	8.9
Phe-82에서 Ala	2.3
Lys-84에서 Ala	11
Arg-85에서 Ala	4.2
Arg-88에서 Ala	150
Asn-89에서 Ala	51
Trp-91에서 Ala	2.3
^*모든 돌연변이를 IL-4[R121D/Y124D] 골격 상에 위치시켰다.

일반적으로 알라닌 치환은 단백질 폴딩에 구조적 변화를 유발하지 않기 때문에, 활성에 미치는 영향, 이 경우에는 친화성에 미치는 영향은 치환된 측쇄의 손실에 기인 할 수 있다 [Cunningham, B.C., Wells, J.A., High-resolution epitope mapping of hGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis, Science 244 (4908) 1081-5 (1989)]. 알라닌 치환의 결과로서 나타나는 친화성의 명목상 변화(예: 약 2배)는 치환된 잔기/위치가 상호작용에 관련되지 않음을 제시하며, 큰 효과(예, 100배 초과)는 잔기 치환된 위치가 상호작용에 중요하다는 것을 제시한다 [Lowman HB 등, "Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phagedisplay", Biochemistry 30 (45) 10832-8면 (1991)]. 로우만 등 (상기문헌)은 가장 민감한 잔기 뿐만 아니라, 알라닌 치환의 결과로서 결합에서의 중간 효과를 나타내는 잔기가 연구하고자 하는 상호작용과 관련된다는 것을 알게 되었다.

상기 결과를 IL-4의 A 나선 및 C 나선의 알라닌 스캔 결과에 적용하는 경우에, IL-4와 IL-4Rα간의 상호작용을 위해 가장 중요한 잔기는 Glu-9 및 Arg-88이며, 중간 잔기는 Ile-5>Asn-89>Lys-84∼Arg-81>Thr-13∼Gln-78∼Arg-85∼Lys-77을 포함할 것이며, 상호작용에 포함될 것 같지 않은 잔기는 Gln-8, Ile-11, Lys-12, Asn-15, His-74, Phe-82 및 Trp-91을 포함한다. 알라닌으로 치환되는 경우에 관찰된 친화성의 증가에 의해 Ser 16은 IL-4와 IL-4Rα 간에 형성된 경계면 상에 또는 내에 존재한다. 이 결과는 IL-4Rα에 대한 IL-4의 가능한 결합 표면이, IL-4 의 구조 [Smith LJ 등, Human interleukin 4., The solution structure of a four-helix bundle protein, J. Mol. Biol., 224 (4): 899-904 (1992)]내에 위치되는 경우에, IL-4의 A 나선 및 C 나선의 인접 부분으로 구성되고, 각각의 나선 상에 약 3개의 나선 전환점(turn), 즉 A 나선 상에 5-16 위치, 및 C 나선 상에 77-89 위치에 대해 확장된다. IL-4 수용체 알파와 가장 많이 접촉할 것 같은 잔기는 A 나선에서는 Ile-5, Glu-9, Thr-13 및 Ser-16 이며, C 나선에서는 Lys-77, Gln-78, Arg-81, Lys-84, Arg-85, Arg-88 및 Asn-89이다. 구조적으로, 상호작용에서 가장 중요한 중심은 잔기 Glu-9, Arg-88 및 Asn-89를 포함하는 것으로 여겨지고, 일반적으로 관찰된 알라닌 효과는 분자의 상기 부분으로부터 멀어질수록 감소된다. 따라서, 이 분석법은 IL-4Rα에 대한 IL-4의 결합 표면에 대해 설명된다.

<실시예 6>

선택된 위치에서의 치환 뮤테인

성장 호르몬의 상기 분석법에서, 알라닌으로 치환되는 경우에 친화성에 대한 중간 효과를 갖는 잔기 치환은 이의 수용체에 대한 성장 호르몬의 친화성을 개선시킨다는 것이 밝혀졌다 [Lowman HB 등, "Selecting high affinity binding proteins by monovalent phage display"., Biochemistry, 30(45) 10832-8면(1991)]. 친화성이 개선된 소정 잔기의 치환 특성을 예측할 수 없다. 따라서, 본원에 제시된 분석법에서, 고유의 구조적 효과를 갖지 않거나 (즉, Cys, Gly, Pro단독) 또는 간편한 산화 반응 (즉, Met 단독)이 일어나는 모든 치환을 목적하는 위치에 도입시켰다.

목적하는 잔기 및 이의 치환^*

잔기	Ala-효과	치환
Ile-5	71	D,E,F,H,K,L,N,Q,R,S,T,V,W,Y
Thr-13	6.4	D,E,F,H,I,K,L,N,Q,R,S,V,W,Y
Ser-16	0.43	D,E,F,H,I,K,L,N,Q,R,T,V,W,Y
Arg-81	8.9	D,E,F,H,I,K,L,N,Q,S,T,V,W,Y
Asn-89	51	D,E,F,H,I,K,L,Q,R,S,T,V,W,Y
^*모든 돌연변이를 IL-4[R121D/Y124D] 골격 상에 위치시켰다.

따라서, 시스테인, 글리신, 메티오닌 및 프롤린을 추가의 치환 분석법으로부터 제외시켰다. 알라닌 치환시, 5 내지 80 배의 친화성의 감소 또는 임의의 증가가 있는 경우에 추가의 분석을 위해 잔기를 선택하였다. 이 범위는 로우맨 등 (상기문헌)에 의해 얻어진 결과를 기초로 하여 선택하였다. 또한, 알라닌 치환으로부터 얻어진 친화성의 관찰된 증가로 인해, Ser-16을 추가의 분석을 위해 선택하였으며, 또한 이 위치에서 기타 치환은 친화성을 증가시킬 수 있음을 암시하였다.

<실시예 7>

IL-4Rα에 대한 개선된 친화성을 제공하는 치환

A 및 C 나선에서 개별적인 위치에서의 치환을 함유하는 뮤테인은 IL-4[R121D/Y124D] 골격과 함께 생성되었으며, 경쟁 결합 분석법을 수행하여 각각의 뮤테인을 IL-4[R121D/Y124D]와 동등하게 비교하였다. 이는 직접적인 비교를 가능하게 하였고, IL-4Rα에 대한 특정 뮤테인의 친화성에 대한 각각의 치환 효과에 대한 결론을 얻었다.

친화성이 개선된 모든 치환을 하기 표 III에 나타내었다. "K_dIL-4[R121D/Y124D]/K_d뮤테인" 비는 각각의 치환의 결과로서 관찰된 친화성에서의 상대적 증가를 의미한다.

치환	K_dIL-4[R121D/Y124D]/K_d뮤테인
T13D-IL-4[R121D/Y124D]	18
S16A-IL-4[R121D/Y124D]	2.5
S16D-IL-4[R121D/Y124D]	3.1
S16H-IL-4[R121D/Y124D]	1.5
S16I-IL-4[R121D/Y124D]	1.8
S16L-IL-4[R121D/Y124D]	2.9
S16Q-IL-4[R121D/Y124D]	2.3
S16R-IL-4[R121D/Y124D]	1.8
S16T-IL-4[R121D/Y124D]	2.4
S16V-IL-4[R121D/Y124D]	2.0
S16Y-IL-4[R121D/Y124D]	1.8
R81K-IL-4[R121D/Y124D]	1.8
N89I-IL-4[R121D/Y124D]	2.0

대부분의 치환은 유해하거나 또는 IL-4Rα에 대한 친화성에 효과를 갖지 않는다 (데이터를 나타내지 않음). 그러나, 몇몇 치환은 친화성을 개선시켰고, 가장 현저한 것은 Thr-13에서 Asp 치환으로, IL-4Rα에 대한 친화성을 놀랍게도 18배 증가시킨다 (도 2). 이 분석법에서 아미노산 Ser-16은 유일하게, 대부분의 치환이 친화성을 온화하게 증가시켰다. 유사한 경쟁 결합 프로파일을 이의 상대적인 친화성와 관련된 기타 뮤테인에 대해 얻었다 (데이터를 나타내지 않음).

친화성 증가는 IL-4[R121D/Y124D]의 모단백질과 관련된다. 하나의 단백질에서 상기 치환들을 조합하여 친화성의 조합적 증가를 기대할 수 있으며, 예를 들면, [T13D/N89I]-IL-4[R121D/Y124D]는 IL-4[R121D/Y124D]보다 친화성이 36배 큰 뮤테인을 생산할 수 있다.

잔기 Thr-13 및 Ser-16은, 적절히 치환되는 경우에, 친화성은 최적으로 증가되었다. 이는 알라닌과 치환되는 경우에 뮤테인 T13A 또는 S16A와 유사한 효과(각각 6.4배 감소 및 2.5배 증가)를 제공하는 기타 잔기는 또한 적절히 치환된 경우에 보다 높은 친화성 IL-4 변이체를 생성할 것이라는 것을 암시한다. 알라닌 치환 잔기의 최근 유형에 대해서는 Ile-11, Lys-77, Gln-78, Lys-84 및 Arg-85가 포함될 것이다.

광범위하게 연구된 성장 호르몬에 대하여 친화성이 증가된 단일 치환은 1.5 내지 5배였다 [Lowman HB; Wells JA, "Affinity maturation of human growth hormone by monovalent phage display", J. Mol. Biol. 234(3) 564-78면 (1983)]. 그러나, 최근에는 활성 [사람 IL-3 (Olins PO 등, Saturation mutagenesis of human interleukin-3, J. Biol. Chem. 270 (40): 23754-60 (1995)] 또는 친화성 [사람 모양체 신경영양성 인자 (CNTF) (Saggio I 등, CNTF variants with increased biological potency and receptor selectivity define a functional site ofreceptor interaction, EMBO J. 14 (13): 3045-54 (1995)]가 크게 개선된 치환이 확인되었다. IL-3에 대해서는 1회 돌연변이가 시험관내 생물학적 활성을 약 26배 증가시켰으며, CNTF에 대해서는 단일 치환이 친화성을 약 32배 증가시켰다. 문헌에 있는 기타 시토킨에 있어서는 대부분의 치환이 일반적으로 친화성/활성의 효과 또는 손실을 유발하지 않았다. 따라서, 친화성 및 (또는) 활성에 대한 소정 치환의 절대 효과는 예측할 수 없다.

<실시예 8>

생물학적 활성에 대한 T13D 치환의 효과

IL-4 길항제 뮤테인 IL-4[R121D/Y124D]는 IL-4의 길항제이고 (Tony HP, Shen BJ, Reusch P 및 Sebald W, "Design of human interleukin-4 antagonists inhibiting interleukin-4-dependent and interleukin-13-dependent responses in T-cells and B-cells with high efficiency", Eur. J. Biochem., 225(2) p 659-65 (1994)], 이는 IL-4 활성을 자극할 수 없기 때문에 이 연구에서는 "기준" 펩티드로서 사용되었다. 이 길항제 뮤테인은 IL-4 Rα에 결합하나, 신호전달이 가능하도록 gc와 결합하지는 않는 능력으로 인해 길항제로 여겨지며, 따라서 IL-4가 대응(cognate) 수용체 복합체에 결합하는 것을 차단한다. 따라서, 친화성에 의해 측정되는 IL-4Rα와의 상호작용에 대해 IL-4[R121D/Y124D]의 생물학적 효과 (IL-4 길항 작용)과 별개이다.

수용체 친화성이 생물학적 효능과 관련된다는 것을 입증하기 위하여, 뮤테인 T13D-IL-4[R121D/Y124D]이 PHA 아세포의 IL-4 유도성 증식을 억제하는 능력에 대하여 측정하였다 (도 3). IL-4[R121D/Y124D]에 대하여 관찰된 IC₅₀(50 % 억제가 나타나는 농도)은 관찰된 수용체 친화성의 상대적인 변화에 대략적으로 비례한다는 것을 알게 되었다.

결과적으로, 높은 친화도로 IL-4Rα에 결합하지만, T13D-IL-4[R121D/Y124D]는 IL-4 길항제로 남는다. T13D-IL-4[R121D/Y124D] 대 IL-4[R121D/Y124D]에 대한 IC₅₀은 상기 두 개의 단백질에 대하여 얻어진 상대적 K_d값 (고체상 결합 분석법으로 측정된 바와 같음)에 대략적으로 비례하고, T13D-IL-4[R121D/Y124D]의 K_d는 IL-4[R121D/Y124D]의 K_d보다 약 18배 낮으며 (각각 0.28 nM vs. 5.0 nM), T13D-IL-4[R121D/Y124D]의 IC₅₀은 IL-4[R121D/Y124D]의 IC₅₀보다 약 5 내지 10배 낮다 (각각 2 nM vs. 13 nM). 상대 효과에서 특정적인 숫자상의 차이는 각각 분석법의 특정 조건의 결과일 수 있다: 20 ℃에서 고체상 결합 분석법을 위한 1.5시간 인큐베이션 대 증식 분석법을 위한 37 ℃에서의 48시간 인큐베이션. 생물학적 분석법에서 IL-4와 경쟁하는 것에 대한 이 연구에서 평가된 기타 뮤테인의 성능은 또한 IL-4[R121D/Y124D]에 대한 상대적인 K_d에 비례하였다 (데이터를 나타내지 않음). 이 결과는 IL-4Rα와의 결합은 IL-4 수용체의 활성화와는 다르다는 것을 나타내며, 이 활성화는 IL-4Rα 및 하나 이상의 기타 서브유닛 (예, g_c)의 이형 이량체화를 필요로한다. 따라서, A 및 C 나선에서 IL-4에 대한 변형은 IL-4Rα에 대한 IL-4의 친화성을 조절하고, 생물학적 영역에서 IL-4를 길항시키는 상기 뮤테인의 능력에 대하여 비례적으로 행해진다. 또한, IL-4와 그의 수용체와의 상호작용 기작으로 인하여, 이 친화성 효과는 IL-4 유래의 효능제 펩티드의 효능을 증가시키는 것으로 해석되어야 한다.

또한, 본 발명의 이론은 다른 시토킨에 적용될 수 있다. 가장 명백한 표적물은 IL-13이고, 이는 IL-13 수용체 복합체가 또한 IL-4Rα를 이용한다는 사실에 기인한다 [Zurawski S.M 등, The Primary binding subunit of the human interleukin-4 receptor is also a component of the interleukin-13 receptor, J. Biol. Chem., 270: 13869-78 (1995)]. 따라서, IL-13의 A 및 C 나선을 IL-4와 더욱 유사하게 돌연변이화하는 것은 IL-4Rα에 대한 결합 친화성을 증가시키게 된다.

2개의 인터루킨 배열은 표적 돌연변이 부위, 예를 들면 IL-4 상의 Thr 13과 유사한 위치를 확인할 수 있게 한다. 2개의 인터루킨의 결합 표면을 하기 표 IV에서 비교하였다.

알라닌 스캔으로부터 확인되는 IL-4Rα와의 상호작용을 매개하는 IL-4의 가장 중요한 잔기, Glu-9 및 Arg-88을 서열 배열을 기초로 하여 IL-13 에서 상응하는 잔기와 같이 진하게 나타내었다. 상기 기재한 바와 같이 IL-13은 수용체 복합체에서 IL-4Rα 쇄를 사용한다 (Zurawski S.M 등, 상기 문헌). 따라서, IL-13의 A 나선 및 C-나선이 IL-4의 A 나선 및 C-나선과 보다 유사하게 변화되는 것은 IL-4Rα에 대한 결합 친화성을 증가시킨다. 또한, 위치적으로 동일한 IL-13 잔기의 IL-4Rα에 대한 IL-4의 친화성을 증가시키는 것으로 알려진 잔기로의 치환 (IL-4 및 IL-13에 대하여 이중선으로 나타난 위치)은 또한 이의 수용체 복합체에 대한 IL-13의 친화성을 증가시키고 이에 따라 효능을 증가시키게 된다.

서열. 하기 생물학적 서열이 포함된다.

SEQ ID NO 1: 아미노산 서열, 성숙한 사람의 IL-4,

SEQ ID NO 2: 뉴클레오티드 서열, PCR 프라이머,

SEQ ID NO 3: 뉴클레오티드 서열, PCR 프라이머,

SEQ ID NO 4: 뉴클레오티드 서열, PCR 프라이머,

SEQ ID NO 5: 뉴클레오티드 서열, PCR 프라이머,

SEQ ID NO 6: 스트렙타비딘에 대한 펩티드 태그의 아미노산 서열,

SEQ ID NO 7: sIL-4Rα-STX의 아미노산 서열,

SEQ ID NO 8: T13D-IL4의 아미노산, 뉴클레오티드, 및

SEQ ID NO 9: T13D-IL4[R121D/Y124D]의 아미노산, 뉴클레오티드 서열

본 발명의 기타 실시양태는 당업자들에게 명백할 것이다. 여기에 기재된 개념 및 실험상 접근법은 이형성 다량체 수용체계를 사용하는 다른 시토킨, 특히 IL-2 및 관련 시토킨 (예, IL-7, IL-9, IL-10, IL-13 및 IL-15), 인터페론 알파 및 인터페론 감마에 적용될 수 있을 것이다.

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Claims

야생형 IL-4의 위치 13, 16, 81 및 89에서의 치환으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하여서, IL-4Rα 수용체에 적어도 야생형 IL-4 보다 큰 친화도로 결합되는 뮤테인인, 야생형 IL-4에 따라 번호매김된 정제 및 단리된 사람 IL-4 뮤테인.
삭제
제1항에 있어서, 위치 13에서의 상기 치환이 Thr를 Asp로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항의 재조합 사람 IL-4 뮤테인을 제약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는, 면역 질환, 암 또는 종양, 비정상적 세포 성장의 치료, 또는 면역 조절을 위한 약제 조성물.
삭제
제1항에 있어서, SEQ ID NO:8의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
야생형 IL-4의 위치 13, 16, 81 및 89에서의 치환으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하여서, IL-4Rα 수용체에 적어도 야생형 IL-4 보다 큰 친화도로 결합되는 뮤테인인, 야생형 IL-4에 따라 번호매김된 재조합 사람 IL-4 뮤테인을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 서열.
제7항의 정제되고 단리된 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포.
제3항에 있어서, SEQ ID NO:8의 DNA 서열 또는 그의 안정하게 혼성화 가능한 변이체에 의해 코딩되는, 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제9항의 재조합 사람 IL-4 뮤테인을 발현시킬 수 있는, 형질전환된 숙주 세포.
삭제
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삭제
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삭제
(a) 야생형 IL-4의 D-나선에서의 R121D 및 Y124D 치환, 및

(b) 상기 야생형 IL-4의 위치 13, 16, 81 및 89에서의 치환으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 치환

을 포함하고, 이로써 뮤테인이 적어도 야생형 IL-4 보다 큰 친화도로 IL-4Rα 수용체에 결합하는, 야생형 IL-4에 따라 번호매김된 정제 및 단리된 사람 IL-4 길항제 뮤테인.
삭제
제17항에 있어서, 위치 13에서의 상기 치환이 Thr를 Asp로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 길항제 뮤테인.
제17항의 재조합 사람 IL-4 길항제 뮤테인을 제약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 면역 질환, 암 또는 종양, 비정상적 세포 성장의 치료, 또는 면역 조절을 위한 약제 조성물.
삭제
제17항에 있어서, SEQ ID NO:9의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 재조합 사람 IL-4 길항제 뮤테인.
제17항의 재조합 사람 IL-4 길항제 뮤테인을 코딩하는, 정제되고 단리된 폴리뉴클레오티드 서열.
제23항의 정제되고 단리된 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포.
제19항에 있어서, SEQ ID NO:9의 DNA 서열 또는 그의 안정하게 혼성화 가능한 변이체에 의해 코딩되는, 재조합 사람 IL-4 길항제 뮤테인.
제25항의 재조합 사람 IL-4 뮤테인을 발현시킬 수 있는, 형질전환된 숙주 세포.
삭제
제1항에 있어서, 상기 위치 16의 치환이 세린을 알라닌으로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항에 있어서, 상기 위치 16에서의 치환이 세린을 아스파테이트로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항에 있어서, 상기 위치 16에서의 치환이 세린을 히스티딘으로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항에 있어서, 상기 위치 16에서의 치환이 세린을 이소루이신으로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항에 있어서, 상기 위치 16에서의 치환이 세린을 루이신으로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항에 있어서, 상기 위치 16에서의 치환이 세린을 글루타민으로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항에 있어서, 상기 위치 16에서의 치환이 세린을 아르기닌으로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항에 있어서, 상기 위치 16에서의 치환이 세린을 트레오닌으로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항에 있어서, 상기 위치 16에서의 치환이 세린을 발린으로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항에 있어서, 상기 위치 16에서의 치환이 세린을 티로신으로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항에 있어서, 상기 위치 81에서의 치환이 아르기닌을 라이신으로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.
제1항에 있어서, 상기 위치 89에서의 치환이 아스파라긴을 이소루이신으로 치환하는 것인 재조합 사람 IL-4 뮤테인.