EA000852B1

EA000852B1 - Мутантный il-6 человека и его внутренний фрагмент, кодирующие их последовательности днк, способы их получения, содержащие их фармацевтические композиции, содержащие их векторы, линии клеток-хозяев и способ лечения il-6 опосредованных заболеваний

Info

Publication number: EA000852B1
Application number: EA199800914A
Authority: EA
Inventors: Марк Элерс; Штефан Розе-Йон; Йоахим Гротзингер
Original assignee: Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В.
Priority date: 1996-04-09
Filing date: 1996-04-09
Publication date: 2000-06-26
Also published as: CN1216063A; PT907737E; EA199800914A1; EP0907737A1; DE69634497D1; FI982198A0; CA2251355C; CN1131309C; BR9708648A; DE69634497T2; DK0907737T3; NO984697D0; UA72426C2; AU728267B2; WO1997038103A1; ATE291087T1; HK1019770A1; IL126484A0; JP4189866B2; FI982198A

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому мутантному IL-6, кодирующей его последовательности ДНК и его применению в терапии, в том числе и в составе композиций.

Предпосылки изобретения

Интерлейкин-6 выделяется в плазму при повреждении или инфекции различными типами клеток. Он вовлечен в ряд процессов, таких как иммунная защита, гемопоэз, созревание мегакариоцитов, образование тромбоцитов и реакции острой фазы (Akira, S. et al., Adv. Immunol. 54:1,

1993).

Играя ключевую роль в защите организмахозяина, IL-6 вовлечен в патогенез многих заболеваний, таких как плазмоцитома/миелома, остеопороз, неопластические и аутоиммунные заболевания (Akira, S. et al., Adv. Immunol. 54:1, 1993).

Рецепторный комплекс IL-6 на клеткахмишенях состоит из двух различных субъединиц: специфической лиганд связывающей субъединицы массой 80 кДа (IL-6Ra) и передающего сигнал белка массой 130 кДа 130) (Yamasaki К. et al., Science 241:825, 1988; Таgа T.et al., Cell 58:573, 1989; Hibi, M. et al., Cell 63:1149, 1990). IL-6 связывается с IL-6Ra, и комплекс IL-6/IL6Ra ассоциируется с димером gp 130, инициируя сигнал IL-6. Сам по себе IL-6 не обнаруживает доступного измерению сродства к gp130 (Zohlnhofer, D. et al., FEBS Lett. 306:219, 1992; Murakami, M et al., Science 260:1808, 1993).

Интерлейкин 6 является белком, характеризующимся вариабельностью N-концевого участка. Ранее было показано (Hirano, Т. et al. Nature 324:73, 1986), что он состоит из 184 аминокислот. (Эта нумерация аминокислот далее будет применена в заявке). Предсказания вторичной структуры и моделирование белка показали, что IL-6 является членом семейства гемопоэтических цитокинов, характеризующимся четырьмя антипараллельными α-спиралями (A, В, С и D) (Bazan, J.F., Immunol. Today 11:350, 1990; Ehlers, M., J.Immunol. 153:1744, 1994). LIF фактор ингибирования лейкоза, CNTF (цилиарный нейротрофный фактор), IL-11, СТ-1 (кардиотропин-1) и OSM (онкостатин M) также принадлежат к этому семейству. Все они используют белок gp130 в своем рецепторном комплексе, что объясняет их перекрывающиеся биологические активности (Akira, S. et al., Adv. Immunol. 54:1, 1993; Pennica, D. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 92:1141, 1995; Pennica, D. et al., J.Biol. Chem. 270:10915, 1995).

Делеционным анализом IL-6 было показано, что 28 N-концевых аминокислотных остатков являются несущественными для биологической активности данной молекулы. Удаление более чем 28 аминокислот инактивирует белок (Brakenhoff, J.P.J. et al., J. Immunol. 143:1175,

1989). Дальнейшие исследования позволяют предсказать, что С-конец и конец А-В петли/начало В-спирали (участок 2с, остатки G77E95) вовлечены во взаимодействие с IL-6Ra (Ehlers, M., J.Immunol. 153:1744, 1994; Kruttgen, A. et al., FEBS Lett. 262:323, 1990; Kruttgen, A. et al., FEBS Lett. 273:95, 1990; Lutticken, С. et al., FEBS Lett. 282:265, 1991; Leebeck, F.W.G. et al., J.Biol. Chem. 267:14832, 1992). Данный результат был подтвержден недавней публикацией модели IL-6 человека (Ehlers, M.,J. Immunol. 153:1744, 1994), где данные два участка располагались вблизи друг друга.

К настоящему времени идентифицированы два сайта взаимодействия IL-6 с gp130.

. Эпитопным картированием белка IL-6 с помощью нейтрализующих MAT предоставлены доказательства, что остатки Q152-Т162 (начало D-спирали) вовлечены во взаимодействие с gp130 (Brakenhoff, J.P.J., Serono Symр. Pub.Raven Press. 88:33, 1992; Brakenhoff, J.P.J., J.Biol. Chem. 269:86, 1994). Анализом химерных человеческих/мышиных белков IL-6 показано наличие эпитопа в пределах начала А-B петли IL-6, вовлеченной в контактирование и активацию gp130 (Ehlers, M.,J. Immunol. 153:1744, 1994; Ehlers, M. et al., J.Biol.Chem. 270:8158, 1995). Недавно этот результат был подтвержден посредством демонстрации того, что лейцин 57 вовлечен в это взаимодействие (De Hon, F.D. et al., FEBS Lett. 369:187, 1995). Этот район находится в непосредственной близости к началу Dспирали, что позволяет предположить, что эти два участка вместе формируют один общий сайт взаимодействия с одним gp130 (Ehlers, M.,J. Immunol. 153:1744, 1994; Ehlers, M. et al., J.Biol.Chem. 270:8158, 1995; De Hon, F.D. et al., J.Exp.Med. 180:2395, 1994).

2. Второй сайт взаимодействия с gp130 был определен по аналогии с комплексом GH (гормоном роста)/GHR₂, структура которого была определена с использованием рентгеноструктурного анализа. (De Vos, A.M. et al., Science 255:306, 1992). Было высказано предположение, что части GH, важные для взаимодействия со вторым GHR (рецептором) являются аналогичными таковым IL-6 для взаимодействия с одним из gp130 (Savino, R. et ак, ЕМВО J. 13:281, 1994; Savino, R. et al., EMBO J. 13:5863, 1994). В действительности замена двух аминокислот в Аспирали (Y31D/G35F) и двух аминокислот в Сспирали (S118R/V121D) также приводит к образованию мутантного белка IL-6 с почти нормальным связыванием IL-6Ra, но не обладающего биологической активностью. Эти четыре аминокислоты вероятно важны для взаимодействия со вторым белком gp130 (Savino, R. et al., ЕМВО J. 13:5863, 1994; Paonessa, G. et al., EMBO J. 14:1942, 1995).

3. Принимая во внимание обсуждавшееся ранее участие IL-6 в патогенезе некоторых за3 болеваний, разработка ингибиторов активности IL-6 является объектом активного изучения. Для достижения этой цели были применимы различные подходы, включая применение антител против IL-6, gp130, или др80; применение растворимого gjo130; или мутеинов IL-6 или рецептора IL-6.

Заявитель исследовал возможность синтеза новых мутантных IL-6, которые способны действовать как антагонисты рецептора IL-6. С этой целью одним из научных подходов являлся синтез мутантных белков, сохраняющих способность связывания с IL-6Ra, но утерявших способность взаимодействовать с gp130. Таким образом оптимальной молекулой является такая, которая не проявляет активности IL-6, но имеет более высокое сродство к рецептору IL-6Ra, чем IL-6, и содержит как можно меньше мутаций по сравнению с IL-6 в целях уменьшения риска антигенности.

Подробное описание изобретения

Заявителем было обнаружено, что, сочетая точечные мутации в положении 54 с двумя мутациями F170L/S176R, увеличивающими сродство к IL-6Ra, и двумя мутациями Q159E/T162P, уменьшающими IL-6Raзависимое взаимодействие с gp130, можно было получить мутантные белки человеческого IL-6, сохраняющие сродство к рецепторам, но не способные активировать gp130. В частности, основным объектом данного изобретения является мутантный IL-6 человека, имеющий аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2 и обозначенную SEQ ID NO: 1, так же, как его фрагменты.

Полученный белок проявляет себя как эффективный антагонист IL-6 в эксперименте на человеческой IL-6Ra-зависимой миеломной клеточной линии XG-1 и обладает всеми преимуществами, описанными выше.

Другим объектом изобретения является молекула ДНК, включающая последовательность ДНК, кодирующую полипептид SEQ ID NO:1 , так же как и ее варианты, имеющие место в результате вырожденности генетического кода, или в результате точечных мутаций, кодирующая полипептид, имеющий одинаковую активность с полипептидом SEQ ID NO:1.

Следующим объектом настоящего изобретения является плазмидный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению.

Следующим аспектом настоящего изобретения является применение данного белка в качестве лекарственного средства. В частности, оно относится к применению заявленного белка в производстве лекарственного средства для лечения заболеваний, при которых IL-6 является звеном патогенеза, таких как, например, плазмоцитома/миелома, остеопороз и неопластические и аутоиммунные заболевания.

Лекарственное средство предпочтительно находится в форме фармацевтической композиции, содержащей белок по настоящему изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или наполнителями. Такие фармацевтические композиции являются еще одним аспектом настоящего изобретения.

Одним из способов получения заявленного мутантного белка является применение технологии ПЦР и синтетических олигонуклеотидов, содержащих несовпадение по основанию, подлежащих мутированию, в качестве праймеров.

Экспрессия любых рекомбинантных белков по изобретению, описанных здесь, может происходить в эукариотических клетках (таких как клетки дрожжей, насекомых или млекопитающих) или в прокариотических клетках при применении соответствующих экспрессирующих векторов. Может быть использован любой из известных в данной области методов.

Например, молекула ДНК, кодирующая полипептид по настоящему изобретению вставляется в сконструированные надлежащим образом экспрессирующие векторы в соответствии с методиками, хорошо известными из предшествующего уровня техники (см. Sambrook et al, 1989). Двухцепочечная кДНК присоединяется к плазмидным векторам гомополимерным наращиванием или рестрикционной сшивкой, включающей использование синтетических ДНКлинкеров, или в соответствии с методикой лигирования по тупым концам: для лигирования молекул ДНК применяют ДНК-лигазы, а нежелательное объединение избегается обработкой щелочной фосфатазой.

Для того чтобы быть способным экспрессировать желаемый белок, экспрессирующий вектор должен включать также особые нуклеотидные последовательности, содержащие транскрипционную и трансляционную регуляторную информацию, связанные с ДНК, кодирующей желаемый белок, таким образом, чтобы обеспечить возможность экспрессии гена и продукции белка. В первую очередь, для того, чтобы ген транскрибировался, ему должен предшествовать промотор, узнаваемый РНК-полимеразой, с которым полимераза связывается и таким образом инициирует процесс транскрипции. Применяется множество таких промоторов, которые работают с различной эффективностью (сильные и слабые промоторы).

В случае эукариотических хозяев могут быть применены различные транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности в зависимости от природы хозяина. Они могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирус, вирус папиломы крупного рогатого скота, вакуолизирующий обезьяний вирус или сходные вирусы, где регуляторные сигналы ассоциированы с определенным геном, имеющим высокий уровень экс5 прессии. Примерами являются ТК-промотор вируса герпеса, ранний промотор SV40, дрожжевой промотор гена g;-i14 и т.д. Регуляторные сигналы инициации транскрипции, которые обеспечивают возможность репрессии и активации, могут быть подобраны так, что может быть изменена экспрессия генов.

Молекулу ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по изобретению, встраивают в вектор(ы), содержащие оперативно связанные регуляторные сигналы транскрипции и трансляции, способные к интеграции желаемых генных последовательностей в клетки-хозяева. Клетки, которые были стабильно трансформированы введенной ДНК, могут отбираться введением также одного или более маркеров, которые позволяют проводить селекцию клеток-хозяев, содержащих экспрессирующий вектор. Маркер может также сообщать фототрофность ауксотрофному хозяину, толерантность к токсичным агентам, например к антибиотикам или тяжелым металлам, таким как медь, и т.п. Селективный маркерный ген может быть либо напрямую связан с последовательностью ДНК гена, подлежащего экспрессии, или введен в ту же клетку котрансфицированием. Дополнительные элементы могут также быть нужны для оптимального синтеза белков по настоящему изобретению.

Факторы, имеющие значение при выборе конкретной плазмиды или вирусного вектора, включают: легкость, с которой реципиентные клетки, которые содержат вектор, могут быть распознаны и отобраны среди тех реципиентных клеток, которые не содержат вектор; количество копий вектора, которое желательно в конкретном хозяине; и желательна ли способность вектора трансформировать клетки-хозяева различных видов.

По получении вектор(ы) или последовательность ДНК, содержащие конструкцию(и), пригодные для экспрессии, могут быть введены в подходящую клетку-хозяин различными методами: трансформацией, трансфекцией, конъюгацией, слиянием протопластов, электропорацией, осаждением с помощью фосфата кальция, прямой микроинъекцией и так далее.

Клетки-хозяева могут быть как прокариотическими, так и эукариотическими. Предпочтительными являются эукариотические хозяева, например клетки млекопитающих, таких как человек, обезьяна, мышь, клетки яичников китайского хомячка (СНО), поскольку они обеспечивают посттрансляционную модификацию белковых молекул, включая правильное свертывание или гликозилирование в нужных сайтах. Дрожжевые клетки также могут обеспечивать посттрансляционную модификацию пептидов, включая гликозилирование. Существует ряд методик рекомбинантных ДНК с использованием сильных промоторных последовательностей и многокопийных векторов, которые могут быть использованы для получения желаемого белка в дрожжах. Дрожжи узнают лидерные последовательности клонируемых генных продуктов млекопитающих и секретируют пептид вместе с лидерной последовательностью (т.е. препептид).

После введения вектора(ов) клетки-хозяева выращивают на селективной среде, на которой отбираются только векторсодержащие клетки. Экспрессия клонируемых генных последовательностей приводит к продукции желаемого белка.

Очистка рекомбинантных белков проводится любым из известных для этой цели методов, т.е. в соответствии с любой традиционной методикой, включая экстракцию, осаждение, хроматографию, электрофорез и т.д. Преимущественным методом очистки заявленного белка является аффинная хроматография с использованием иммобилизованных на гелевой матрице колонки моноклональных антител, связывающихся с белком-мишенью. Неочищенные препараты, содержащие рекомбинантный белок пропускают через колонку. Белок задерживается на колонке, специфически связываясь с антителами, в то время как примеси проходят сквозь нее. После отмывки белок элюируют с колонки при контролировании рН или ионной силы.

Изобретение далее будет проиллюстрировано нижеследующими примерами, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема притязаний. В примерах даны ссылки на описанные ниже фигуры.

Краткое описание

Фиг. 1 - точечные мутанты белка IL-6 человека. (А) - белок IL-6 человека с четырьмя предсказанными α-спиралями показано заштрихованными прямоугольниками. Цифрами показаны первые и последние остатки α-спирали. Представлена аминокислотная последовательность участков 2с и 2α с его подразделением на 2α1 и 2α2 для человеческого (наверху) и мышиного (внизу) IL-6. Присутствуют полученные точечные мутации в участке 2α. (В) - представлено сравнение выровненных участков 2α молекул IL-6. (С) - ленточная модель человеческого IL-6. Изображение F78 (внизу) важно для понимания связывания с рецептором IL-6Ra, a K54 (наверху) важно для понимания IL-6Raзависимого взаимодействия с gp130. N-конец соответствует остатку 1 7 человеческого IL-6 (Ehlers et al. 1994);

фиг. 2 - нуклеотидная последовательность мутантного человеческого IL-6 по настоящему изобретению. Она содержит пять точечных мутаций по сравнению с человеческим IL-6 в положениях 54, 159, 162, 170, 176. Эти положения выделены жирным шрифтом;

фиг. 3 - связывание и биологическая активность точечных мутантов K54 человеческого

IL-6. (А) - связывание мутеинов IL-6 (мутантного интерлейкина 6) с растворимым человеческим IL-6Ra. Представлены средние значения из двух экспериментов. (В) - пролиферация клеток мыши линии В 9 и (С) - человеческих клеток линии XG-1 как реакция на мутанты IL-6. Представлен один из трех экспериментов. (D) - индукция экспрессии гаптоглобина мутантным IL6 в клетках гепатомы человека. Количество требуемого для 50% экспрессии гаптоглобина человеческого IL-6 принято за 100%. Представлены средние значения из двух экспериментов;

фиг. 4 - связывание и биологическая активность точечных мутантов K54 в комбинации с EP-LR. (А) - связывание мутантных IL-6 с растворимым человеческим IL-6Ra. Представлены средние значения из двух экспериментов. (В) пролиферация клеток мыши линии В 9 и (С) человеческой линии XG-1 как реакция на мутанты IL-6. Представлен один из трех экспериментов. (D) - индукция экспрессии гаптоглобина мутантными 1L-6 в клетках гепатомы человека. Показан уровень экспрессии гаптоглобина в присутствии 1 мкг/мл мутантного белка. Представлены средние значения из двух экспериментов;

фиг. 5 - эффект антагонизма точечной мутации К54 в комбинации с EP-LR на индуцированную IL-6 человека пролиферацию клеток линии XG-1. Указанные концентрации мутантов IL-6 добавляли к клеткам XG-1 в присутствии 1 00 пг/мл человеческого IL-6 и оценивали клеточную пролиферацию. Представлены средние значения из двух экспериментов.

Примеры

Материалы и методы Реактивы

Рестриктазы AccI, EcoNI, HindIII, NcoI, NheI и XbaI были получены от компании AGS (Heidelberg, Germany), полинуклеотидкиназа, щелочная фосфатаза кишечника теленка и Т4 ДНК-лигаза получены от компании Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany). Рестриктаза BspEI и Vent ДНК-полимераза поставлены компанией NEN Biolabs (Schwalbach, Germany) и среды для культур клеток получены от Gibco (Eggenstein, Germany). Реагент Болтона-Хантера (74ТБк/ммоль) и метка tran[S³⁵] получены от фирмы Amersham International (Amersham, United Kingdom).

Олигонуклеотиды были получены от фирмы Pharmacia (Freiburg, Germany).

Козьи и кроличьи поликлональные антитела против человеческого гаптоглобина были предоставлены компанией Sigma (Deisenhofen, Germany), а конъюгированные с щелочной фосфатазой ослиные поликлональные антитела против кроличьего IgG - компанией Pierce (Rockford, U.S.A.).

кДНК человеческого IL-6 была любезно предоставлена докторами T.Hirano и T.Kishimoto (Osaka, Japan).

Бактериальная экспрессирующая плазмида pRSET 5d и бактерия хозяин BL21 (DB3) были описаны Shopfer et al. (Schoepfer, R. et al., Neuron 5:393, 1990). После замены сигнальных последовательностей на кодон начала трансляции кДНК, кодирующую IL-6 человека, клонировали в вектор pRSET 5d по сайтам рестрикции NcoI и HindIII (Van Dam, M. et al., J. Biol. Chem. 268:15285, 1992).

Человеческая миеломная клеточная линия XG-1 была предоставлена доктором Б.Клейном (Nantes, France).

Растворимый белок IL-6Ra был экспрессирован в E.coli, ренатурирован и очищен (Stoyan, Т., Eur. J. Biochem. 216:239, 1993).

Поликлональные моноспецифические антитела против IL-6Ra были получены введением части внеклеточного домена растворимого белка IL-6Ra кроликам (Stoyan, Т., Eur. J. Biochem. 216:239, 1993).

Конструкция экспрессирующих векторов

Для введения точечных мутаций по аминокислоте 54 в IL-6 человека (pRSET 5d-huIL-6K54X), четыре олигонуклеотида были сшиты и лигированы в EcoNI-NheI-рестрикт pRSET5dмутанта 2α (Ehlers, M.,J. Immunol. 153:1744,

1994). Олигонуклеотиды представляли собой:

5' AAC ATG TGT GAA AGC AGC GAT GAG GCG 3' смыслов.(К54О) (SEQ ID NO: 2)

5' СТА GCG ССТ CAT CGC TGC TTT CAC AC 3\ттисмгсховая (K54D) (SEQ ID NO: 3) 5' AAC ATG TGT GAA AGC AGC GAA GAG GCG 3' смыслов.(К54Е) (SEQ ID NO: 4)

5' СТА GCG CCT CTTCGC TGC TTT CAC AC 3' антисмысловая(К54Е) (SEQ ID NO: 5) 5' AAC ATG TGT GAA AGC AGC TTT GAG GCG 3' cmhctob(K54F) (SEQ ID NO: 6)

5* СТА GCG CCT CAAAGC TGC TTT CAC AC 3’ антисмысловая(К54Р) (SEQ ID NO: 7) 5' AAC ATG TGT GAA AGC AGC AAT GAG GCG 3’ смыслов.(К54Я) (SEQ ID NO: 8)

5' СТА GCG CCT CAT TGC TGC TTT CAC AC 3* антисмысловаяфС54Ъ1) (SEQ ID NO: 9) 5' AAC ATG TGT GAA AGC AGC CCC GAG GCG 3’ с№слов,(К54Р) (SEQ ID NO: 10)

5' СТА GCG CCT CGG GGC TGC TTT CAC AC 3^,антисмысловая(К54Р) (SEQ ID NO: 11) 5' GAA AGG AGA CAT GTA АСА AGA GT 3' смыслов.(5Е0 ID NO: 12)

S' ATG TTA CTC TTG TTA CAT GTC TCC ITT 3'^антисмысловая(5ЕО ID NO: 13)

Чтобы объединить точечные мутации по аминокислоте 54 с двумя точечными мутациями F1 70L/S1 76R (кратко обозначаемыми LR) и двумя точечными мутациями Q159E/T162P (кратко обозначаемыми ВР), были сконструированы векторы pRSET 6d-huIL-6-EP-K54X-LR лигированием фрагментов NcoI-XbaI кДНК из pRSET-5d-huIL-6-K54X в NcoI-XbaIрасщепленный вектор pRSET 6d-huIL-6Q159E/T162P-2a2-F170L/S176R (кратко обозначаемый pRSET 6d-huIL-6-EP-2a2-LR) ( Ehlers, M. et al., J.Biol.Chem. 270:8158, 1995). Целостность всех конструкций была подтверждена анализом фрагментов рестрикции и секвенированием ДНК (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463, 1977).

Получение белков

Бактерии BL21 (DE3) были трансформированы вектором экспрессии pRSET. Генная экспрессия и ренатурация белков, переведенных в растворенное состояние из телец включения, были произведены, как описано (Van Dam, M. et al., J. Biol. Chem. 268:15285, 1992; Studier, F.W. et al., Meth. Enzymol. 185:60, 1990; Arcone, R, et al., Eur.J.Biochem. 198:541, 1991). Ренатурированные белки были очищены до >90% гомогенности. Чистота рекомбинантных белков была проверена 12,5% SDS-PAGE и окрашиванием серебром.

Связывание IL-6 с растворимым IL-6Ra человека

Очищенные мутантные белки IL-6 были последовательно разведены в PBS, содержащим 0,02% TWEEN 20/0,2% BSA и добавлены к 1 нг человеческого ¹²⁵I-IL-6 (60.000-90.000 имп/мин-нг) и 1,7 нг растворимого человеческого IL-6Ra, экспрессированного в E.coli (Stoyan, Т., Eur. J. Biochem. 216:239, 1993), до конечного объема 500 мкл. После инкубации в течение ночи при 4°С IL-6/sIL-6Ra комплексы были иммунопреципитированны с использованием IL-6Ra (рецептор-6Ra) антисыворотки и протеин А-Сефарозы, радиоактивность была подсчитана счетчиком Гейгера.

Биологические анализы

Для анализа пролиферации мышиных клеток В 9 и человеческих клеток XG-1, мутантные белки IL-6 последовательно разводили до концентраций, указанных на фигурах. Анализы выполнялись, как описано (Aarden, L.A et al., Eur. J. Immunol. 17:1411, 1987; Zhang, X.-G. et al., Blood. 76:2599, 1990). Одна единица В9, соответствующая приблизительно 1 пг человеческого IL-6 на мл, приводила к половине от максимальной пролиферации клеток В9. С человеческими клетками XG-1 половина максимальной пролиферации была получена после стимуляции с 50 пг/мл человеческого IL-6. Для анализа секреции белка острой фазы, клетки гепатомы человека (Нер3В) культивировали на модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 10% околоплодной сыворотки теленка, распределяли в 96-луночные культуральные планшеты и оставляли до образования монослоя. Клетки отмывали PBS, выдерживали в течение 1 ч в DMEM без околоплодной сыворотки теленка и потом обрабатывали в течение 20 ч в 1 00 мл несодержащей сыворотки DMEM с возрастающими количествами мутантных белков IL-6. Количество гаптоглобина, секретированного в культуральную среду, определяли ферментсвязывающим иммуносорбентным анализом (Salvati, A.L. et al., J. Biol. Chem. 270:12242, 1995).

Результаты

Аминокислота К 54 IL-6 вовлечена в IL-6Raзависимое взаимодействие с gp130 Исследования с человеческими/мышиными химерными белками IL-6 показали, что область 2a2 (остатки 50-55) белка IL-6 необходима для IL-6Ra-зависимого взаимодействия с gp130 (Ehlers, M. et al., J.Biol.Chem. 270:8158,

1995) (фиг. 1А). Замена этих остатков по соответствующим аминокислотам в мышином белке приводила к уменьшению связывания с gp130 и 30-кратному снижению биоактивности человеческих XG-1 клеток. Сравнение с десятью молекулами IL-6 показало, что внутри области 2а2 положительно заряженная К54 сохраняется в 8 молекулах, но меняется на отрицательно заряженную аспарагиновую кислоту в мышиной и крысиной аминокислотной последовательности (Van Snick, J. et al., Eur.J.Immunol. 18:193, 1988; Northemann, W. et al., J. Biol. Chem. 264:16072, 1 989) (фиг. 1В). Поэтому произведена замена К54 (фиг. 1С) на аминокислоты, показанные на фиг. 1А. Процедура клонирования привела также к трем двухточечным мутациям IL-6: C44F/K54E, C50F/K54N и S52R/K54N, которые были также проанализированы (фиг. 1А).

Для исследования влияния точечных мутаций К54 на IL-6Rα-зависимое взаимодействие с gp130 проводили в первую очередь измерение связывания IL-6Ra путем замещения связывания человеческого ¹²⁵I-IL-6 с растворимой формой белка IL-6Ra путем использования точечных мутантов. Как показано на фиг. 3А, немеченный человеческий вариант IL-6 дикого типа замещает связывание человеческого ¹²⁵I-IL-6 на 50% при использовании в 1 0-20-кратном молярном избытке. Точечный мутант К54Р и двойной мутант S52R/K54N проявлял в 10 раз большее сродство, чем человеческий IL-6, тогда как мутант К54Е имел в три раза меньшее сродство, чем huIL-6, к IL-6Ra. Другие исследованные мутанты показали сходное сродство с человеческим IL-6. Кроме того, мутанты стимулировали пролиферацию IL-6-зависимых В9 клеток в той же мере, что и человеческий IL-6, что демонстрирует интактность их структуры (фиг. 3В).

В клетках миеломы XG-1 и клетках человеческой гепатомы характер биологической активности IL-6 мутеина был следующим: К54Р> S52R/K54N > huIL-6 = K54F > K54D > К54Е > C50F/K54N > C44F/K54E. Так, мутанты К54Р и S52R/K54N, имевшие наивысшее сродство к IL6Ra, также проявляли наивысшую биологическую активность на человеческих клетках. Замена положительно заряженного лизина 54 на отрицательно заряженную аспарагиновую кислоту имела результатом только слегка ослабленную биологическую активность в человеческих клетках, тогда как замена на Glu имела результатом существенное снижение (10кратное) биологической активности.

Разработка новых антагонистов рецепторов человеческого IL-6

Недавно было показано на мышах, что введение остатков 50-55 (область 2a2) и двух точечных мутаций F170L/S176R (обозначение LR), которые повышают сродство к IL-6Ra, в двойной мутант Q159E/T162P (обозначение IL11

6-EP), который обнаруживает пониженное взаимодействие с gp130, приводит в результате к получению мутантного IL-6 с отсутствием биологической активности в человеческих клетках (Ehlers, M. et al., J.Biol.Chem. 270:8158, 1995). Сродство этого IL-6 мутанта (IL-6-EP2a2-LR) к человеческому IL-6Ra было схожим с таковым к человеческому IL-6. Этот IL-6 мутант был эффективным антагонистом рецептора IL-6 в высоко чувствительных человеческих IL6-зависимых клетках линии миеломы человека XG-1.

Мутации К54 были введены в мутантные белки IL-6-EP-LR. Полученные в результате мутантные белки IL-6 были названы IL-6-EPK54X-LR, где Х обозначает все мутации, введенные в позицию 54 (фиг. 1А). Мутант IL-6EP-C44F/K54E-LR и мутант IL-6-EP-K54E-LR обнаруживали пониженное сродство к человеческому IL-6Ra, тогда как все другие мутанты вели себя как человеческий IL-6 (фиг. 4А). Пролиферация мышиных клеток В 9 была сильно снижена для мутантов IL-6-EP-2a2-LR и IL-6EP-S52R/K54N-LR. Все другие мутанты были приблизительно в 5-10 раз менее активны, чем человеческий IL-6 (фиг. 4В). В противоположность этому, величина пролиферации клеток человеческой миеломы XG-1 снижается на три порядка в случае мутантов IL-6-EP-LR, IL-6-EPK54F-LR и IL-6-EP-S52R/K54N-LR (фиг. 4С). Все другие мутанты не обнаруживали регистрируемой биологической активности. В человеческих Нер3В клетках только мутанты IL-6-EP-LR и IL-6-EP-K54F-LR обнаруживали остаточную активность (фиг. 4D).

Когда мутанты без биологической активности были добавлены в возрастающих количествах к человеческим клеткам миеломы (XG-1 ), стимулированным 1 00 пг/мл человеческого IL-6, было обнаружено ингибирование пролиферации. Фиг. 5 показывает, что прибавление мутантов IL-6-EP-2a2-LR и IL-6-EP-K54P-LR приводит к 50% ингибированию пролиферации при приблизительно 1 00 нг/мл, тогда как все другие мутанты были приблизительно в 5-10 раз менее эффективны.

Обсуждение

Аминокислота К54 является частью gp130связывающего эпитопа

Все мутантные IL-6 с К54, замененной различными аминокислотными остатками, эффективно связывались с человеческим IL-6Ra. Интересно, что введение Р54 и двойной мутации S52R/R54N приводило к образованию IL-6 с более высоким сродством к человеческому IL6Ra. Поскольку область 2a2, которая включает остаток 54, была идентифицирована как участвующая во взаимодействии с gp130 (Ehlers, M. et al., J.Biol.Chem. 270:8158, 1995), это указывает скорее всего на непрямой эффект. Сделано предположение, что присутствие Р54 или заряженной аминокислоты аргинина в положении 52 приводит к перемещению петли между спиралью А и спиралью В, посредством изменения местоположения области 2С, которая напрямую вовлечена во взаимодействие IL-6Ra. Замена консервативного для восьми видов лизина 54 на аспарагиновую кислоту, являющуюся консервативной для мыши и крысы, ведет к слабому снижению активности, тогда как замена на глутаминовую кислоту приводит к существенному снижению (в 10 раз) биологической активности. Хотя глутаминовая кислота несет боковую цепь на одну метильную группу длиннее, чем аспарагиновая кислота, похоже, что расстояние между заряженной группой и человеческим IL6Ra существенно. Исходя из этих данных, возможно предсказать, что мутация по положению К54 взаимодействует с отрицательно заряженными остатками в положении 54 человеческого IL-6, приводя к восстановлению узнавания между gp1 30 и IL-6/IL-6Ra комплексом. Мутация в цистеиновых остатках положения 44 или 50 в мутантном IL-6 приводит к слабой потере биологической активности, что подтверждается недавними результатами Rock с соавторами (Salvati, A.L. et al., J.Biol.Chem. 270:12242, 1995), сумевшим продемонстрировать, что замена цистеиновых (остатков) в положениях 44 и 50 не приводит к инактивации мутантного IL-6.

Взаимодействие лиганда с рецептором Структура комплекса гормона роста человека с его рецептором (GH/GHR2) была показана в работе (De Vos, A.M. et al., Science 255:306, 1992). Сайт взаимодействия гормона роста с его рецептором многократно подвергался мутагенезу (Cunningham, В. С. et al., Science 244:1081, 1989; Cunningham, B.C. et al., J. Mol. Biol. 234:554, 1993; Bass, S. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:4498, 1991) и оценен вклад каждого аминокислотного остатка в энергию связывания (Clackson Т., et al., Science 267:383, 1995). Поскольку комплекс гормон роста/его рецептор являются единственной парой из семейства гемопоэтических цитокинов, чья структура известна на атомном уровне, она является парадигмой для других членов семейства. Для комплекса гормон роста/рецептор известно, что эпитоп взаимодействия для обоих состоит примерно из 30 аминокислотных остатков (Clackson Т., et al., Science 267:383, 1995). Однако вклад этих аминокислотных остатков не одинаков. Основной вклад в энергию связывания производят два гидрофобных взаимодействия. Это ядро связывания окружено менее важными для контакта остатками, которые в основном гидрофильны и частично гидратированы, они дают примерно треть вклада в энергию связывания. Существует теория, что такое определение сайтов связывания применимо и к другим взаимодействиям типа лиганд/рецептор (Clackson Т., et al., Science 267:383, 1995).

Однако, как считается, К54 является одним из остатков окружения центрального района взаимодействия IL-6/gp130, имеющего слабый вклад в энергию взаимодействия. Относительно сильный эффект замены К54Р в мутантном антагонисте IL-6 является следствием структурных изменений в петле АВ.

Антагонисты рецептора IL-6

Как известно, были идентифицированы два района, вероятно контактирующие с gp130, 1) участок 2α2 (остатки 50-55) и лейцин 57, комплементарные вершине спирали D IL-6 и 2) эпитоп, сформированный частями спиралей А и С (Ehlers, M.,J. Immunol. 153:1744, 1994; Brakenhoff, J.P.J., J.Biol. Chem. 269:86, 1994; Ehlers, M. et al., J.Biol.Chem. 270:8158, 1995; De Hon, F.D. et al., FEBS Lett. 369:187, 1995; De Hon, F.D. et al., J. Exp. Med 180:2395, 1994; Savino, R. et al., EMBO J. 13:281, 1994; Savino, R. et al., EMBO J. 13:5863, 1994). Для связывания IL-6 с IL-6Ra необходим конец А-В петли (остаток 78), так же как и С-конец белка (Ehlers, M.,J. Immunol. 153:1744, 1994; Kruttgen, A. et al., FEBS Lett. 262:323, 1990; Kruttgen, A. et al., FEBS Lett. 273:95, 1990; Lutticken, C. et al., FEBS Lett. 282:265, 1991; Leebeck, F.W.G. et al., J. Biol. Chem. 267:14832, 1992). Ясно, что две молекулы gp1 30 необходимы для инициации сигнала и весьма вероятно, что роль двух сайтов взаимодействия с gp1 30 на IL-6 заключается во взаимодействии с двумя белками gp130. Перестройки вблизи обоих сайтов взаимодействия с gp1 30 приводили к образованию молекул, способных связываться с рецептором, но не способных инициировать сигнал. Было показано, что такие молекулы могут быть использованы в качестве антагонистов рецептора для IL-6 (Ehlers, M. et al., J.Biol.Chem. 270:8158, 1995; De Hon, F.D. et al., J.Exp. Med. 180:2395, 1994; Savino, R. et al., EMBO J. 13:281, 1994; Savino, R. et al., EMBO J. 13:5863, 1994). Факт одновременного увеличения связывающей активности мутантного IL-6 по отношению к IL-6Ra привел к так называемым суперантагонистам (Ehlers, M. et al., J.Biol.Chem. 270:8158, 1995; De Hon, F.D. et al., J.Exp. Med. 180:2395, 1994; Savino, R. et al., EMBO J. 13:5863, 1994), что предполагает возможность изменения связывающих свойств различных субъединиц рецептора по какому-либо независимому варианту.

Новый антагонист рецептора IL-6, представленный в данной заявке на патент, содержит единственную замену К54Р в участке 2α2 и, тем не менее, является столь же эффективным, как и недавно сконструированный мутантный IL-6 с пятью аминокислотными заменами в участке 2α2 (Ehlers, M. et al., J.Biol.Chem. 270:8158, 1 995).

Интересно, что мутантный К54Р белок показал большее связывание с IL-6Ra, чем IL-6, в то время как комбинация мутантов ЕР и LR показала нормальное связывание.

Говоря о терапевтическом потенциале антагонистов цитокиновых рецепторов, понятно, что чем меньше аминокислот изменяется, тем меньше шанс, что антагонист будет антигеном. Исходя из этой точки зрения, мутантный IL-6 и IL-6-EP-K54P-LR являются улучшенными вариантами антагонистов рецептора IL-6, доступных ранее.

Перечень последовательностей (1 ) Ообщая информация:

(i) Заявитель:

(A) имя: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.

(B) улица: 14 JOHN GORSIRAWEG (c): город: CURACAO (E) государство: NETHERLANDS ANTILLES (F) индекс: NONE (ii) Название изобретения: Мутеин IL-6 (iii) Количество последовательностей: 1 3 (iv) Электронная форма:

(A) тип носителя: гибкий диск (B) компьютер: IBM.PC-совместимый (C) операционная система: PC-DOS/MSDOS (D) программное обеспечение: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (ЕРО) (2) Информация О SEQ ID NO: 1:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 21 2 аминокислот (B) тип: аминокислотная (C) количество цепей:

(D) топология: линейная (ii) Тип молекулы: пептид (iii) Гипотетическая: нет (iv) Антисмысловая: нет (v) Тип фрагмента: N-концевой (ix) Признаки:

(A) имя/ключ: белок (B) местонахождение 1...184 (xi) Описание последовательности: SEQ ID

NO:1

Met Asn ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro val Ala Phe Ser Leu -25 ' -20 -15

Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro -10 -5 1

Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gin Pro Leu Thr ⁵ 10 15 20

Ser Ser Glu Arg He Asp Lys Gin lie Arg Tyr lie Leu Asp Gly He

30 35

Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 40 45 50

Ser Pro Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 55 60 65

Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 70 75 80

Val Lys lie lie Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr as 90 95 100

Leu Gin Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gin Ala Arg Ala Val Gin 105 HO 115

Met Ser Thr Lys Val Leu lie Gin Phe Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn 120 125 130

Leu Asp Ala He Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 135 140 145

Thr Lys Leu Gin Ala Gin Asn Gin Trp Leu Glu Asp Met Pro Thr His 150 155 «О

Leu lie Leu Arg Ser Leu Lys Glu Phe Leu Gin Arg Ser Leu Arg Ala 165 170 175 180 (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 2:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 27 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (С )количество цепей: одна (D)топология: линейная (ii) Тип молекулы: геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 2:

AACATGTGTG AAAGCAGCGA TGAGGCG (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 3:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 26 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) количество цепей: одна (D) топология: линейная (ii) Тип молекулы: геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) Описание последовательности: SEQ ID NO: 3:

CTAGCGCCTC ATCGCTGCTT ТСАСАС (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 4:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 27 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) количество цепей: одна (D) топология: линейная (ii) Тип молекулы: геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) Описание последовательности SEQ ID NO: 4:

AACATGTGTG AAAGCAGCGA AGAGGCG (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 5:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 26 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) количество цепей: одна (D) топология: линейная (ii) Тип молекулы: геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) Описание последовательности SEQ ID NO: 5:

CTAGCGCCTC TTCGCTGCTT TCACAC (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 6:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 27 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) количество цепей: одна (D) топология: линейная (ii) Тип молекулы: геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) Описание последовательности SEQ ID NO: 6:

AACATGTGTG AAAGCAGCTT TGAGGCG (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 7:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 26 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) количество цепей: одна (D) топология: линейная (ii) Тип молекулы: геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) Описание последовательности SEQ ID NO:7:

CTAGCGCCTC AAAGCTGCTT TCACAC (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 8:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 27 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) количество цепей: одна (D) топология: линейная (ii) Тип молекулы: геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) Описание последовательности SEQ ID NO: 8:

AACATGTGTG AAAGCAGCAA TGAGGCG (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 9:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 26 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) количество цепей: одна (D) топология: линейная (ii) Тип молекулы: геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) Описание последовательности SEQ ID NO: 9:

CTAGCGCCTC ATTGCTGCTT TCACAC (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 10:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 27 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) количество цепей: одна (D) топология: линейная (ii) Тип молекулы: геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) Описание последовательности SEQ ID NO: 1 0:

AACATGTGTG AAAGCAGCCC CGAGGCG (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 11:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 26 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) количество цепей: одна (D) топология: линейная (ii) Тип молекулы: геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) описание последовательности SEQ ID NO: 11:

CTAGCGCCTC GGGGCTGCTT TCACAC (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 12:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 23 пары оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) количество цепей: одна (D) топология: линейная (ii) Тип молекулы: геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) Описание последовательности SEQ ID NO: 1 2:

GAAAGGAGAC ATGTAACAAG AGT (2) Информация для идентификации последовательности SEQ ID NO: 13:

(i) Характеристики последовательности:

(A) длина: 27 пар оснований (B) тип: нуклеиновая кислота (C) количество цепей: одна (D) топология: линейная (ii) Тип молекула геномная ДНК (iii) Гипотетическая: нет (xi) Описание последовательности SEQ ID NO: 13:

ATGTTACTCT TGTTACATGT СТССТТТ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ, 1. Мутантный интерлейкин-6 (IL-6) человека, имеющий аминокислотную последовательность Met Asn Ser Phe -25 Ser Thr Ser Ala Phe -20 Gly Pro Val Ala Phe -15 Ser Leu Gly Leu Leu -10 Leu Val Leu Pro Ala -5 Ala Phe Pro Ala Pro 1 Val Pro Pro Gly 5 Glu Asp Ser Lys Asp 10 Val Ala Ala Pro His 15 Arg Gin Pro Leu Thr 20 Ser Ser Glu Arg lie Asp Lys Gin lie Arg Tyr Ile Leu Asp Gly lie 25 30 35 Ser Ala Leu Arg 40 Lys Glu Thr Cys Asn 45 Lys Ser Asn Met Cys 50 Glu Ser Ser Pro Glu 55 Ala Leu Ala Glu Asn 60 Asn Leu Asn Leu Pro 65 Lys Met Ala Glu Lys 70 Asp Gly Cys Phe Gin 75 Ser Gly Phe Asn Glu 80 Glu Thr Cys Leu Val 85 Lys Ile Ile Thr Gly 90 Leu Leu Glu Phe Glu 95 Val Tyr Leu Glu Tyr 100 Leu Gin Asn Arg Phe 105 Glu Ser Ser Glu Glu 110 Gin Ala Arg Ala Val 115 Gin Met Ser Thr Lys 120 Val Leu Ile Gin Phe 125 Leu Gin Lys Lys Ala 130 Lys Asn Leu Asp Ala 135 Ile Thr Thr Pro Asp 140 Pro Thr Thr Asn Ala 145 Ser Leu Leu Thr Lys 150 Leu Gin Ala Gin Asn 155 Gin Trp Leu Glu Asp 160 Met Pro Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Leu Lys Glu Phe Leu Gin Arg Ser Leu Arg Ala 165 170 175 180 Leu Arg Gin Met содержащую следующие точечные мутации по сравнению с природным IL-6 человека: Pro 54, Glu 159, Pro 162, Leu 170 и А^ 176. 2. Внутренний фрагмент мутантного IL-6 человека по п.1 формулы, обладающий аналогичной биологической активностью. 3. Последовательность ДНК, кодирующая мутантный IL-6 человека по п.1 формулы. 4. Последовательность ДНК, кодирующая внутренний фрагмент мутантного IL-6 человека по п.2 формулы. 5. Вектор, используемый для экспрессии мутантного IL-6 по п.1 формулы или его внутреннего фрагмента по п.2 формулы, содержащий последовательность ДНК по любому из пп.3-4 формулы. 6. Линия клеток-хозяев, трансформированная вектором экспрессии по п.5 формулы или последовательностью ДНК по любому из пп.3-4 формулы. 7. Способ получения мутантного IL-6 по п.1 формулы, заключающийся в том, что культивируют линию клеток-хозяев по п.6 формулы в условиях, обеспечивающих экспрессию IL-6, и выделяют целевой продукт из культуральной среды. 8. Способ получения внутреннего фрагмента мутантного IL-6 по п.2 формулы, заключающийся в том, что культивируют линию клеток-хозяев по п.6 формулы в условиях, обеспечивающих экспрессию фрагмента, и выделяют целевой продукт из культуральной среды. 9. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента мутантный IL-6 по п.1 формулы или его внутренний фрагмент по п.2 формулы и один или более фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель. I 0. Применение мутантного IL-6 по п.1 формулы в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции по п.9 формулы. II . Применение внутреннего фрагмента мутантного IL-6 по п.1 формулы в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции по п.9 формулы.

1

2. Способ лечения заболеваний, опосредованных патогенным действием IL-6, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.9 формулы.