SK287984B6

SK287984B6 - Substantially pure or recombinant polypeptide, nucleic acid, host cell, method for the preparation of polypeptide, binding compound, kit, composition comprising an antibody and use thereof

Info

Publication number: SK287984B6
Application number: SK1574-2002A
Authority: SK
Inventors: Madaline Chirica; Robert A. Kastelein; Kevin W. Moore; Christi L. Parham
Original assignee: Schering Corporation
Priority date: 2000-05-10
Filing date: 2001-05-10
Publication date: 2012-08-06
Also published as: NO20025354D0; DK1287130T3; SI1287130T1; AU6135101A; US7411041B2; JP2012187111A; ZA200208795B; EP1287130A2; NO20025354L; HK1049862B; IL152414A0; US7749718B2; MXPA02011081A; CZ20023698A3; US6756481B2; CA2408571C; EP1287130B2; AU2001261351B2; JP2015110576A; US8110378B2

Abstract

Nucleic acids coding mammalian, e.g. primate receptors, purified receptor proteins and their fragments. Antibodies, both polyclonal and monoclonal, are provided. Described are methods of using the compositions for both diagnostic and therapeutic utilities.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka prostriedkov a spôsobov na ovplyvňovanie cicavčej fyziológie, vrátane funkcie imunitného systému. Poskytuje najmä spôsoby na regulovanie vývoja a/alebo imunitného systému. Opísané sú aj diagnostické a terapeutické použitia týchto materiálov.

Doterajší stav techniky

Rekomhinantná DNA technológia vo všeobecnosti označuje techniky integrovania genetickej informácie z donorového zdroja do vektorov na následné spracovanie, ako napríklad prostredníctvom zavedenia do hostiteľa, čím sa prenesená genetická informácia kopíruje a/alebo exprimuje v novom prostredí. Obvykle genetická informácia existuje vo forme komplementárnej DNA (cDNA) odvodenej od mediátorovej RNA (mRNA), ktorá kóduje požadovaný proteínový produkt. Nosičom je často plazmid, ktorý má schopnosť inkorporovať cDNA na neskoršiu replikáciu v hostiteľovi, a v niektorých prípadoch vlastne riadi expresiu cDNA, a tým riadi syntézu kódovaného produktu v hostiteľovi. Pozri napr. Sambrook a ďalší., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2. vyd.) zv. 1-3, CSH Press, NY.

Už určitý čas je známe, že cicavčia imunitná odpoveď je založená na sérii komplexných bunkových interakcií, nazývaných „imunitná sieť“. Súčasný výskum poskytol nové preniknutie do podstaty vnútornej prevádzky tejto siete. Zatiaľ čo ostáva zrejmé, že veľký podiel imunitnej odpovede sa v skutočnosti točí okolo sieťových interakcií lymfocytov, makrofágov, granulocytov a iných buniek, imunológovia sú teraz vo všeobecnosti toho názoru, že rozpustné proteiny, známe ako lymfokíny, cytokíny alebo monokíny, majú kritické úlohy pri riadení týchto bunkových interakcií. Takže je značný záujem o izoláciu, charakterizáciu a mechanizmy účinku bunkových modulačných faktorov, ktorých pochopenie bude viesť k významným pokrokom v diagnostike a liečbe rôznych medicínskych abnormalít, napr. porúch imunitného systému.

Zdá sa, že lymfokíny sprostredkúvajú bunkové aktivity rôznymi spôsobmi. Pozri napr. Paul (vyd. 1996) Lundamental Immunology 3. vyd., Raven Press, New York; a Thomson (vyd. 1994) The Cytokine Handbook 2. vyd., Academic Press, San Diego. Dokázali podporiť proliferáciu, rast a/alebo diferenciáciu pluripotentných hematopoetických kmeňových buniek na veľký počet progenitorov zahŕňajúcich rôzne bunkové rodiny, ktoré tvoria komplexný imunitný systém. Správne a vyvážené interakcie medzi bunkovými komponentmi sú nevyhnutné pre zdravú imunitnú odpoveď. Rozličné bunkové rodiny často odpovedajú rozličným spôsobom, keď sa podávajú lymfokíny spolu s inými činidlami.

Bunkové rodiny, ktoré sú výnimočne dôležité pre imunitnú odpoveď, zahŕňajú dve triedy lymfocytov: B-bunky, ktoré môžu produkovať a vylučovať imunoglobulíny (proteiny so schopnosťou rozoznávať a viazať sa na cudzí materiál, aby sa dosiahlo jeho odstránenie), a rôzne podtriedy T-buniek, ktoré vylučujú lymfokíny a indukujú alebo suprimujú B-bunky a rôzne iné bunky (vrátane iných T-buniek), čím vytvárajú imunitnú sieť. Tieto lymfocyty interagujú s mnohými inými typmi buniek.

Výskum na lepšie pochopenie a liečbu rôznych imunitných porúch bol brzdený všeobecnou neschopnosťou udržiavať bunky imunitného systému in vitro. Imunológovia objavili, že kultiváciu mnohých týchto buniek je možné dosiahnuť použitím T-bunkového supematantu a supematantov iných buniek, ktoré obsahujú rôzne rastové faktory, vrátane mnohých lymfokínov.

Existujú rôzne rastové a regulačné faktory, ktoré modulujú morfogenetický vývoj. Známe sú mnohé receptory pre cytokíny. Často existujú aspoň dve kritické podjednotky vo funkčnom receptore. Pozri napr. Heinrich, a ďalší (1998) Biochem. J. 334: 297-314; Gonda a D'Andrea (1997) Blood 89: 355-369; Presky, a ďalší (1996) Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 14002-14007; Drachman a Kaushansky (1995) Curr. Opin. Hematol. 2: 22-28; Theze (1994) Eur. Cytokine Netw. 5: 353-368; a Lemmon a Schlessinger (1994) Trends Biochem. Sci. 19: 459-463.

Z uvedeného je zrejmé, že objavenie a vývoj nových rozpustných proteínov a ich receptorov, vrátane proteínov podobných s lymfokínmi, by sa mali podieľať na nových terapiách širokého rozsahu degeneratívnych alebo abnormálnych stavov, ktoré priamo alebo nepriamo zahŕňajú vývoj, diferenciáciu alebo funkciu, napr. buniek imunitného systému a/alebo hematopoetických buniek. Veľmi výhodné by bolo najmä objavenie a pochopenie nových receptorov pre lymfokínom podobné molekuly, ktoré zosilňujú alebo zvyšujú potenciál užitočných aktivít iných lymfokínov. Predložený vynález poskytuje nové receptory pre ligandy mazujúce podobnosť s cytokínovými zmesami a príbuznými zlúčeninami a ich použitie.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka nových receptorov príbuzných s cytokínovými receptormi, napr. primátových molekulových štruktúr podobných s cytokínovým receptorom, označovaných ako DNAX cytokínové receptorové podjednotky (DCRS), a ich biologických aktivít. Poskytuje najmä opis jednej podjednotky, označenej ako DCRS5. Zahŕňa nukleové kyseliny kódujúce samotné polypeptidy a spôsoby ich produkcie a použitie. Nukleové kyseliny podľa vynálezu sa sčasti vyznačujú ich homológiou s tu zahrnutými klonovanými komplementárnymi DNA (cDNA) sekvenciami. Okrem toho vynález poskytuje p40/IL-B30 ligand zodpovedajúci receptorovým podjednotkám DCRS5 a ΙΕ-12β 1, ktorých párovanie poskytuje možnosť preniknutia do indikácií na použitie agonistov a antagonistov na základe reakčných činidiel nasmerovaných proti nim.

Podstatou vynálezu je v podstate čistý alebo rekombinantný polypeptid, ktorý obsahuje aspoň desať po sebe idúcich aminokyselín vnútrobunkovej časti sekv. č. 2. V určitých uskutočneniach polypeptid: obsahuje aspoň 25 za sebou idúcich aminokyselín vnútrobunkovej časti sekv. č. 2; je rekombinantný a obsahuje vnútrobunkovú časť sekv. č. 2; ďalej obsahuje aspoň desať po sebe idúcich aminokyselín nie z vnútrobunkovej časti sekv. č. 2; obsahuje aspoň 25 aminokyselín extracelulárnej časti sekv. č. 2; obsahuje zrelú sekv. č. 2; alebo je v podstate čistým prirodzeným polypeptidom. Inak, rekombinantný polypeptid: pozostáva zo zrelej sekvencie podľa tabuľky 1; je neglykozylovaným polypeptidom; je z človeka; obsahuje aspoň 40 po sebe idúcich aminokyselín sekv. č. 2; obsahuje aspoň tri neprekrývajúce sa segmenty obsahujúce aspoň pätnásť po sebe idúcich amino-kyselín zo sekv. č. 2; je prirodzeným polymorfným variantom sekv. č. 2; má dĺžku aspoň približne 30 aminokyselín; má aspoň dva neprekrývajúce sa epitopy, ktoré sú špecifické pre primátovú DCRS5; má molekulovú hmotnosť aspoň 30 kD s prirodzenou glykozyláciou; je syntetickým polypeptidom; je v sterilnej forme; je vo vodnom alebo tlmivom roztoku; je pripojený na tuhý substrát; je konjugovaný s inou chemickou skupinou; alebo je fyzikálne spojený s ΙΒ-12Ββ1 polypeptidom.

Iné uskutočnenia vynálezu poskytujú: v podstate čistý alebo rekombinantný polypeptid obsahujúci aspoň dva rozličné neprekrývajúce sa segmenty aspoň so šiestimi po sebe idúcimi aminokyselinami vnútrobunkovej časti sekv. č. 2; v podstate čistý alebo rekombinantný polypeptid obsahujúci aspoň dvanásť po sebe idúcich aminokyselín vnútrobunkovej časti sekv. č. 2; alebo v podstate čistý prirodzený sekvenčný polypeptid obsahujúci zrelú sekv. č. 2. V konkrétnych formách polypeptid obsahuje aspoň dva rozličné neprekrývajúce sa segmenty najmenej šiestich po sebe idúcich aminokyselín vnútrobunkovej časti sekv. č. 2, kde: rozličné neprekrývajúce sa segmenty: zahŕňajú jeden segment aspoň so dvanástimi amino-kyselinami; zahŕňajú jeden segment aspoň so siedmimi aminokyselinami a druhý segment aspoň so deviatimi aminokyselinami; zahŕňajú tretí segment aspoň so šiestimi aminokyselinami; alebo zahŕňajú jeden segment vybraný z R355-L373, P378-L405, V407-D426, K428-D439, P441-V452,1454-G460,1465-T587 alebo N592-606; alebo polypeptid ďalej obsahuje aspoň dva rozličné neprekrývajúce sa segmenty aspoň so šiestimi za sebou idúcimi aminokyselinami extracelulárnej časti sekv. č. 2. Alternatívne bude polypeptidom obsahujúcim aspoň dvanásť za sebou idúcich aminokyselín vnútrobunkovej časti sekv. č. 2 polypeptid, v ktorom: segment obsahujúci aspoň dvanásť za sebou idúcich aminokyselín zahŕňa jeden z R355-L373, P378-L405, V407-D426, K428-D439, P441-V452, I454-G460, I465-T587 alebo N592-606; alebo polypeptid ďalej obsahuje aspoň dva rozličné neprekrývajúce sa segmenty aspoň so šiestimi za sebou idúcimi aminokyselinami extracelulárnej časti sekv. č. 2. Alebo, čistý polypeptid s prirodzenou sekvenciou obsahujúcou zrelú sekv. č. 2 môže ďalej zahŕňať purifikáciu alebo detekciu epitopu. Takéto polypeptidy môžu: pozostávať zo zrelej sekvencie podľa tabuľky 1; byť neglykozylovaným polypeptidom; byť z človeka; obsahovať aspoň 40 aminokyselín zo sekv. č. 2; mať aspoň tri neprekrývajúce sa segmenty aspoň so pätnástimi po sebe idúcimi aminokyselinami sekv. č. 2; byť prirodzeným polymorfným variantom sekv. č. 2; mať dĺžku aspoň približne 30 aminokyselín; mať aspoň dva neprekrývajúce sa epitopy, ktoré sú špecifické pre primátovú DCRS5; mať molekulovú hmotnosť aspoň 30 kD s prirodzenou glykozyláciou; byť syntetickým polypeptidom; byť v sterilnej forme; byť vo vodnom alebo tlmivom roztoku; byť pripojené na tuhý substrát; byť konjugované s inou chemickou skupinou; alebo byť fyzikálne spojené s ΙΙ.-12Ηβ1 polypeptidom.

Poskytnuté sú rôzne iné prostriedky, napr. prostriedky obsahujúce: v podstate čistý polypeptid kombinovaný s IL- 12β 1 proteínom; alebo takýto polypeptid v nosiči, pričom nosičom je: vodná zlúčenina vrátane vody, fyziologický roztok a/alebo tlmivý roztok; a/alebo sú formulované na orálne, rektálne, nazálne, topické alebo parenterálne podanie.

Poskytnuté sú kity, ktoré obsahujú takýto polypeptid a: kompartment obsahujúci polypeptid; kompartment obsahujúci ΙΙ,-12Ηβ1 polypeptid; kompartment obsahujúci p40, IL -B30 alebo p40/IL-B30 polypeptid; alebo inštrukcie na použitie alebo odpadovú nádobu pre reakčné činidlá v kite.

Poskytnuté sú protilátky a iné viažuce zlúčeniny, napr. zlúčeniny obsahujúce antigén viažuce miesto z protilátky, ktoré sa špecificky viaže na vnútrobunkovú časť DCRS5, pričom: viažuca zlúčenina je v nádobe; polypeptid je z človeka; väzobnou zlúčeninou je Fv, Fab alebo Fab₂ fragment; viažuca zlúčenina je konjugovaná s inou chemickou skupinou; alebo protilátka: je vyvolaná proti peptidovej sekvencii zrelého polypeptidu podľa tabuľky 1; je vyvolaná proti zrelej DCRS5; je vyvolaná proti purifikovanej ľudskej DCRS5; je imunoselektívna; je polyklonálnou protilátkou; viaže sa na denaturovanú DCRS5; má Kd proti antigénu s veľkosťou aspoň 30 pm; je pripojená na tuhý substrát, vrátane guľôčky alebo plastickej membrány; je v sterilnom prostriedku; alebo je detegovateľne značená, zahŕňajúc rádioaktívnu alebo fluorescenčnú značku. Poskytnuté sú aj kity, ktoré obsahujú viažucu zlúčeninu a: kompartment obsahujúci viažucu zlúčeninu; kompartment obsahujúci: p40 polypeptid; IL-B30 polypeptid; DCRS5 polypeptid a/alebo IL-12Rpi polypeptid; kompartment obsahujúci protilátku, ktorá sa selektívne viaže na: p40 polypeptid; IL-B30 polypeptid; DCRS5 polypeptid a/alebo IL-12Κβ 1 polypeptid; alebo inštrukcie na použitie, alebo odpadovú nádobu pre reakčné činidlá v kite.

Poskytnuté sú aj spôsoby, napr. spôsob na produkciu antigénu: protilátkový komplex, zahŕňa uvedenie primátového DCRS5 polypeptidu do kontaktu s protilátkou v príslušných podmienkach, čím sa umožní vytvorenie komplexu. Takýto spôsob sa môže použiť ak: komplex je purifikovaný od iných cytokínových receptorov; komplex je purifikovaný od inej protilátky; uvádzanie do kontaktu sa uskutočňuje so vzorkou obsahujúcou interferón; kontaktovanie umožňuje kvantitatívnu detekciu antigénu; kontaktovanie sa uskutočňuje so vzorkou obsahujúcou protilátku; alebo kontaktovanie umožňuje kvantitatívnu detekciu protilátky. Poskytnuté sú aj iné prostriedky, napr. prostriedky, ktoré obsahujú: sterilnú viažucu zlúčeninu alebo viažucu zlúčeninu a nosič, pričom nosičom je: vodná zlúčenina vrátane vody, fyziologický roztok a/alebo tlmivý roztok; a/alebo sú formulované na orálne, rektálne, nazálne, topické alebo parenterálne podanie.

Vynález poskytuje aj izolovanú alebo rekombinantnú nukleovú kyselinu, ktorá kóduje DCRS5 polypeptid, pričom: DCRS5 je z človeka; alebo nukleová kyselina: kóduje antigénovú peptidovú sekvenciu podľa tabuľky 1; kóduje viaceré antigénové peptidové sekvencie podľa tabuľky 1; je zhodná aspoň s trinástimi nukleotidmi prirodzenej cDNA kódujúcej segment; je expresným vektorom; ďalej obsahuje počiatok replikácie; je z prirodzeného zdroja; obsahuje detegovateľnú značku; obsahuje syntetickú oligonukleotidovú sekvenciu; je menšia ako 6 kb, výhodne menšia ako 3 kb; je z primáta; obsahuje prirodzenú celú kódujúcu sekvenciu; je hybridizačnou sondou pre gén kódujúci DCRS5; alebo je PCR primárom, PCR produktom alebo mutagenizačným primérom. Poskytnuté sú bunky obsahujúce rekombinantnú nukleovú kyselinu, vrátane bunky, ktorou je: prokaryotická bunka; eukaryotická bunka; bakteriálna bunka; kvasinková bunka; hmyzia bunka; cicavčia bunka; myšacia bunka; bunka primáta alebo ľudská bunka.

Kitové uskutočnenia zahŕňajú kity, ktoré obsahujú nukleovú kyselinu a: kompartment obsahujúci nukleovú kyselinu; kompartment obsahujúci nukleovú kyselinu, ktorá kóduje: p40 polypeptid; IL-B30 polypeptid; DCRS5 polypeptid; a/alebo IL-12Rpi polypeptid; kompartment, ktorý obsahuje: p40 polypeptid; IL-B30 polypeptid; CDRS5 polypeptid; a/alebo IL-12RP1 polypeptid; kompartment, ktorý obsahuje protilátku, ktorá sa selektívne viaže na: p40 polypeptid; IL-B30 polypeptid; DCRS5 polypeptid; a/alebo IL12β1 polypeptid; alebo inštrukcie na použitie alebo odpadovú nádobu pre reakčné činidlá v kite.

Iné nukleokyselinové uskutočnenia zahŕňajú nukleové kyseliny, ktoré: hybridizujú s časťou sekv. č. 1, kódujúcou vnútrobunkovú časť, v premývacích podmienkach zahŕňajúcich 30 minút pri 30 °C a menej ako 2M soľ; alebo sú zhodné v sekvencií najmenej približne 30 nukleotidov s vnútrobunkovou časťou primátovej DCRS5. Výhodne bude takouto nukleovou kyselinou nukleová kyselina: pre ktorú sú premývacími podmienkami 45 °C a/alebo 500 mM soľ; alebo 55 °C a/alebo 150 mM soľ; alebo sekvencia aspoň s 55 alebo 75 nukleotidmi.

Terapeutické použitia zahŕňajú spôsoby modulácie fyziológie alebo vývoja bunky vrátane kontaktovania bunky s: antagonistom p40/IL-B30, ktorý je komplexom obsahujúcim: extracelulámu časť primátovej DCRS5 a/alebo extra-celulámu časť primátového IL-12Rβl; antagonistom p40/IL-B30, ktorým je protilátka viažuca sa na komplex obsahujúci: primátovú DCRS5 a/alebo primátový IL-12Rβl; antagonistom p40/IL-B30, ktorým je protilátka viažuca sa na DCRS5; antagonistom p40/IL-B30, ktorým je protilátka viažuca sa na IL12-RP1; antagonistom p40/IL-B30, ktorým je antisense nukleová kyselina proti DCRS5 alebo IL-12Rβl; alebo antagonistom p40/IL-B30, ktorým je protilátka viažuca sa na komplex, ktorý obsahuje primátovú DCRS5 a/alebo primátový IL-12Rβl. V jednom type spôsobu sa kontaktovanie uskutočňuje s antagonistom a v kombinácii s antagonistom proti IL-12, IL-18, TNF a/alebo IFNy; alebo je bunka z hostiteľa, ktorý: má známky alebo symptómy chronickej, TH1 sprostredkovanej choroby; má symptómy alebo známky sklerózy multiplex, reumatoidnej artritídy, osteoartritídy, zápalového črevného ochorenia, cukrovky, psoriázy alebo sepsy; alebo dostal alogénny transplantát. Naopak, spôsobom môže byť kontaktovanie s agonistom a: kontaktovanie v kombinácii s IL-12, IL-18, TNF alebo IFNy; alebo je bunka z hostiteľa, ktorý: má známky alebo symptómy chronickej Th2 reakcie; trpí nádorom, vírusovou alebo plesňovou infekciou; dostal vakcínu; alebo trpí alergickou reakciou.

Prehľad

I. Všeobecná časť

II. Aktivity

III. Nukleové kyseliny

A. - kódujúce fragmenty, sekvenciu, sondy

B. - mutácie, chiméry, fúzie

C. - výroba nukleových kyselín

D. - vektory, bunky, ktoré ich obsahujú

IV. Proteíny, peptidy

A. - fragmenty, sekvencia, imunogény, antigény

B. - muteíny

C. - agonisty/antagonisty, funkčné ekvivalenty

D. - výroba proteínov

V. Výroba nukleových kyselín, proteínov

A. - syntetických

B. - rekombinantných

C. - prirodzené zdroje

VI. Protilátky

A. - polyklonálne

B. - monoklonálne

C. - fragmenty; Kd

D. - anti-idiotypové protilátky

E. - hybridómové bunkové línie

VII. Kity, diagnostika a kvantifikácia

A. - ELISA

B. - testovanie kódujúcej mRNA

C. - kvalitatívna/kvantitatívna analýza

D. -kity

VIII. Terapeutické prostriedky, spôsoby

A. - kombinačné prostriedky

B. -jednotkovádávka

C. - podávanie

IX. Skríning

I. Všeobecná časť

Predložený vynález poskytuje aminokyselinovú sekvenciu a DNA sekvenciu cicavčích, tu primátových, molekúl podobných cytokínovej receptorovej pod-jednotke, ktoré sú tu označené ako DNAX cytokínová receptorová podjednotka 5 (CDRS5), ktorá má dobre definované vlastnosti, tak štrukturálne, ako aj biologické. Rôzne cDNAs kódujúce tieto molekuly sa získali z primátových, napr. ľudských, cDNA sekvenčných knižníc. Želateľné by boli aj iné primátové alebo iné cicavčie náprotivky.

Okrem toho vynález poskytuje zosúladenie p40/IL-B30 ligandu s receptorovými pojednotkami DCRS5 a IL-12Rpi, ktorých párovanie poskytuje pochopenie indikácií na použitie agonistov a antagonistov založené na reakčných činidlách nasmerovaných proti nim.

Niektoré štandardné aplikovateľné spôsoby sú opísané, alebo sa na nich odvoláva napr. v Maniatis, a ďalší (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, a ďalší (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2. vyd.), zv. 13, CSH Press, NY; Ausubel, a ďalší, Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; alebo Ausubel, a ďalší (1987 a periodické dodatky) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; pričom každá z uvedených publikácií je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie.

Nukleotidová (sekv. č. 1) a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia (sekv. č. 2) primátového, napr. ľudského, DCRS5 kódujúceho segmentu je uvedená v tabuľke 1. Označená je predpokladaná signálna sekvencia, ale môže byť závislá od typu bunky, alebo môže obsahovať niekoľko zvyškov v oboch smeroch. Potenciálnymi N-glykozylačnými miestami sú asparagínové zvyšky v polohách 6, 24, 58, 118, 157, 209 a 250. Disulfidové väzby sa pravdepodobne nachádzajú medzi cysteínovými zvyškami v polohách 29 a 78; a konzervatívny CCXW motív sa nachádza v polohách 110/121/123. Dôležitý je tryptofán v polohe 219; a WxxWS motív v polohe 281 - 285. Segment od približne 1 - 101 je Ig doména; od približne 102 - 195 je cytokín viažuca doména 1; od približne 196 - 297 je cytokín viažuca doména 2; od približne 298 - 330 je spojovník; od približne 329 - 354 je transmembránový segment; a od približne 356 - 606 je vnútrobunková doména. Vnútrobunkové znaky zhŕňajú pravdepodobné SH2 viažuce miesta v Y374-I377, Y461-Q464 a Y588-Q591; a potencionálne dôležité tyrozínové zvyšky v polohách 406, 427, 440 a 453. Tieto miesta a ohraničenia sú dôležité.

ORF obsahuje pravdepodobnú signálnu sekvenciu, o ktorej sa predpokladá, že je štiepená v ...CHG/GIT..., ako bolo ukázané. Predpokladaná extra-celuláma doména s 328 aminokyselinami je nasledovaná pravdepodobným trans-membránovým segmentom a nakoniec cytoplazmatickou doménou obsahujúcou približne 252 aminokyselín. Predpokladá sa, že za ligand viažuce funkcie je zodpovedná extraceluláma doména.

Reverzná translácia nukleokyselinovej sekvencie je uvedená v tabuľke 2.

Tabuľka 1

Nukleotidová a polypeptidová sekvencia uskutočnení podobných DNAX cytokínovej receptorovej podjednotke (DCRS5). Primátové, napr. ľudské uskutočnenie (pozri sekv. č. 1 a sekv. č. 2). Označená je predpokladaná signálna sekvencia, ale môže sa meniť o niekoľko polôh a závisí od bunkového typu.

gtggtacggg aattccattg tgttgggcag ccaacaaggg tggcagcctg gctctgaagt 60 ggaattatgt gcttcaaaca ggttgaaaga gggaaacagt cttttcctgc ttccagac 118

atg aat	cak	gtc	act	att	caa	tgg gat gca gta ata	gcc	ctt	tac ata 166
Met Asn	Xaa	Val	Thr	íle	Gin	Trp Asp Ala Val íle	Ala	Leu	Tyr íle
		-20			-15	-10
ctc ttc	agc	tgg	tgt	cat	gga	gga att aca aat ata	aac	tgc	tct ggc 214
Leu Phe	Ser	Trp	Cys	His	Gly	Gly íle Thr Asn íle	Asn	Cys	Ser Gly
	-5		-1	1		5
cac atc	tgg	gta	gaa	cca	gcc	aca att ttt aag atg	ggt	atg	aat atc 262
His íle	Trp	Val	Glu	Pro	Ala	Thr íle Phe Lys Met	Gly	Met	Asn íle
10		15		20		25
tct ata	tat	tgc	caa	gca	gca	att aag aac tgc caa	cca	agg	aaa ctt 310
Ser íle	Tyr	Cys	Gin	Ala	Ala	íle Lys Asn Cys Gin	Pro	Arg	Lys Leu
			30		35 40
cat ttt	tat	aaa	aat	ggc	atc	aaa gaa aga ttt caa	atc	aca	agg att 358
His Phe	Tyr	Lys	Asn	Gly	íle	Lys Glu Arg Phe Gin	íle	Thr	Arg íle
		45			50	55
aat aaa	aca	aca	get	cgg	ctt	tgg tat aaa aac ttt	ctg	gaa	cca cat 406
Asn Lys	Thr	Thr	Ala	Arg	Leu	Trp Tyr Lys Asn Phe	Leu	Glu	Pro His
	60			65		70
get tct	atg	tac	tgc	act	get	gaa tgt ccc aaa cat	ttt	caa	gag aca 454
Ala Ser	Met	Tyr	Cys	Thr	Ala	Glu Cys Pro Lys His	Phe	Gin	Glu Thr
75		80			85
ctg ata	tgt	gga	aaa	gac	att	tct tct gga tat ccg	cca	gat	att cct 502
Leu íle	Cys	Gly	Lys	Asp	íle	Ser Ser Gly Tyr Pro	Pro	Asp	íle Pro
90		95			100 105
gat gaa	gta	acc	tgt	gtc	att	tat gaa tat tca ggc	aac	atg	act tgc 550
Asp Glu	Val	Thr	Cys	Val	íle	Tyr Glu Tyr Ser Gly	Asn	Met	Thr Cys
			110		115 120
acc tgg	aat	get	rgg	aag	ctc	acc tac ata gac aca	aaa	tac	gtg gta 598
Thr Trp	Asn	Ala	Xaa	Lys	Leu	Thr Tyr íle Asp Thr	Lys	Tyr	Val Val
		125			130	135
cat gtg	aag	agt	tta	gag	aca	gaa gaa gag caa cag	tat	ctc	acc tca 646
His Val	Lys	Ser	Leu	Glu	Thr	Glu Glu Glu Gin Gin	Tyr	Leu	Thr Ser
	140			145		150
agc tat	att	aac	atc	tcc	act	gat tca tta caa ggt	ggc	aag	aag tac 694

Ser	Tyr 155	íle	Asn íle 160	Ser Thr Asp 165	Ser Leu	Gin	Gly Gly	Lys	Lys	Tyr
ttg	gtt	tgg	gtc caa	gca gca aac	gca cta	ggc	atg gaa	gag	tca	aaa 742
Leu	Val	Trp	Val Gin	Ala Ala Asn	Ala Leu	Gly	Met Glu	Glu	Ser	Lys
170			175	180	185
caa	ctg	caa	att cac	ctg gat gat	ata gtg	ata	cct tet	gca	gcc	gtc 790
Gin	Leu	Gin	íle His	Leu Asp Asp	íle Val	íle	Pro Ser	Ala	Ala	Val
	190		195	200
att	tcc	agg	get gag	act ata aat	get aca	gtg	ccc aag	acc	ata	att 838
íle	Ser	Arg	Ala Glu	Thr íle Asn	Ala Thr	Val	Pro Lys	Thr	íle	íle
			205	210	215
tat	tgg	gat	agt caa	aca aca att	gaa aag	gtt	toc tgt	gaa	atg	aga 886
Tyr	Trp	Asp	Ser Gin	Thr Thr íle	Glu Lys	Val	Ser Cys	Glu	Met	Arg
		220		225 230
tac	aag	get	aca aca	aac caa act	tgg aat	gtt	aaa gaa	ttt	gac	acc 934
Tyr	Lys	Ala	Thr Thr	Asn Gin Thr	Trp Asn	Val	Lys Glu	Phe	Asp	Thr
	235		240	245
aat	ttt	aca	tat gtg	caa cag tca	gaa ttc	tac	ttg gag	cca	aac	att 982
Asn	Phe	Thr	Tyr Val	Gin Gin Ser	Glu Phe	Tyr	Leu Glu	Pro	Asn	íle
250			255	260	265
aag	tac	gta	ttt caa	gtg aga tgt	caa gaa	aca	ggc aaa	agg	tac	tgg 1030
Lys	Tyr	Val	Phe Gin	Val Arg Cys	Gin Glu	Thr	Gly Lys	Arg	Tyr	Trp
			270	275	280
cag	cct	tgg	agt tca	ccg ttt ttt	cat aaa	aca	cct gaa	aca	gtt	ccc 1078
Gin	Pro	Trp	Ser Ser	Pro Phe Phe	His Lys	Thr	Pro Glu	Thr	Val	Pro
			285	290	295
cag	gtc	aca	tca aaa	gca ttc caa	cat gac	aca	tgg aat	tet	ggg	cta 1126
Gin	Val	Thr	Ser Lys	Ala Phe Gin	His Asp	Thr	Trp Asn	Ser	Gly	Leu
		300		305 310
aca	gtt	get	tcc atc	tet aca ggg	cac ctt	act	tet gac	aac	aga	gga 1174
Thr	Val	Ala	Ser íle	Ser Thr Gly	His Leu	Thr	Ser Asp	Asn	Arg	Gly
	315		320	325
gac	att	gga	ctt tta	ttg gga atg	atc gtc	ttt	get gtt	atg	ttg	tca 1222
Asp	íle	Gly	Leu Leu	Leu Gly Met	íle Val	Phe	Ala Val	Met	Leu	Ser
330			335	340	345
att	ctt	tet	ttg att	ggg ata ttt	aac aga	tca	ttc ega	act	ggg	att 1270
He Leu Ser Leu íle Gly íle Phe Asn Arg Ser Phe Arg Thr Gly íle
			350	355	360
aaa	aga	agg	atc tta	ttg tta ata	cca aag	tgg	ctt tat	gaa	gat	att 1318
Lys	Arg Arg	íle Leu	Leu Leu íle	Pro Lys	Trp	Leu Tyr	Glu Asp	íle
			365	370	375

cct	aat	atg aaa aac agc aat gtt	gtg aaa	atg	cta	cag	gaa aat	agt	1366
Pro	Asn	Met Lys Asn Ser Asn Val 380 385	Val Lys 390	Met	Leu	Gin	Glu Asn	Ser
gaa	ctt	atg aat aat aat tcc agt	gag cag	gtc	cta	tat	gtt gat	ccc	1414
Glu	Leu 395	Met Asn Asn Asn Ser Ser 400 405	Glu Gin	Val	Leu	Tyr	Val Asp	Pro
atg	att	aca gag ata aaa gaa atc	ttc atc	cca	gaa	cac	aag cct	aca	1462
Met 410	íle	Thr Glu íle Lys Glu íle 415 420	Phe íle 425	Pro	Glu	His	Lys Pro	Thr
gac	tac	aag aag gag aat aca gga	ccc ctg	gag	aca	aga	gac tac	ccg	1510
Asp	Tyr	Lys Lys Glu Asn Thr Gly 430 435	Pro Leu	Glu 440	Thr	Arg	Asp Tyr	Pro
caa	aac	tcg cta ttc gac aat act	aca gtt	gta	tat	att	cct gat	ctc	1558
Gin	Asn	Ser Leu Phe Asp Asn Thr 445 450	Thr Val 455	Val	Tyr	íle	Pro Asp	Leu
aac	act	gga tat aaa ccc caa att	tca aat	ttt	ctg	cct	gag gga	agc	1606
Asn	Thr	Gly Tyr Lys Pro Gin íle 460 465	Ser Asn 470	Phe	Leu	Pro	Glu Gly	Ser
cat	ctc	agc aat aat aat gaa att	act tcc	tta	aca	ctt	aaa cca	cca	1654
His	Leu 475	Ser Asn Asn Asn Glu íle 480 485	Thr Ser	Leu	Thr	Leu	Lys Pro	Pro
gtt	gat	tcc tta gac tca gga aat	aat ccc	agg	tta	caa	aag cat	cct	1702
Val 490	Asp	Ser Leu Asp Ser Gly Asn 495 500	Asn Pro 505	Arg	Leu	Gin	Lys His	Pro
aat	ttt	get ttt tct gtt tca agt	gtg aat	tca	cta	agc	aac aca	ata	1750
Asn	Phe	Ala Phe Ser Val Ser Ser 510 515	Val Asn	Ser 520	Leu 1	Ser	Asn Thr	íle
ttt	ctt	gga gaa tta agc ctc ata	tta aat	caa	gga	gaa	tgc agt	tct	1798
Phe	Leu	Gly Glu Leu Ser Leu íle 525 530	Leu Asn 535	Gin	Gly	Glu	Cys Ser	Ser
cct	gac	ata caa aac tca gta gag	gag gaa	acc	acc	atg	ctt ttg	gaa	1846
Pro	Asp	íle Gin Asn Ser Val Glu 540 545	Glu Glu 550	Thr	Thr	Met	Leu Leu	Glu
aat	gat	tca ccc agt gaa act att	cca gaa	cag	acc	ctg	ctt cct	gat	1894
Asn	Asp 555	Ser Pro Ser Glu Thr íle 560 565	Pro Glu	Gin	Thr	Leu	Leu Pro	Asp
gaa	ttt	gtc tcc tgt ttg ggg atc	gtg aat	gag	gag	ttg	cca tct	att	1942
Glu 570	Phe	Val Ser Cys Leu Gly íle 575 580	Val Asn 585	Glu	Glu	Leu	Pro Ser	íle
aat	act	tat ttt cca caa aat att	ttg gaa	agc	cac	ttc	aat agg	att	1990

Asn Thr Tyr Phe Pro Gin Asn íle Leu Glu Ser His Phe Asn Arg íle 590 595 600 tca ctc ttg gaa aag tagagctgtg tggtcaaaat caatatgaga aagctgcctt 2045

Ser Leu Leu Glu Lys

605

gcaatctgaa	cttgggtttt	ccctgcaata	gaaattgaat	tctgcctctt	tttgaaaaaa	2105
atgtattcac	atacaaatct	tcacatggac	acatgttttc	atttcccttg	gataaatacc	2165
taggtagggg	attgctgggc	catatgataa	gcatatgttt	cagttctacc	aatcttgttt	2225
ccagagtagt	gacatttctg	tgctcctacc	atcaccatgt	aagaattccc	gggagctcca	2285
tgccttttta	attttagcca	ttcttctgcc	tmatttctta	aaattagaga	attaaggtcc	2345
cgaaggtgga	acatgcttca	tggtcacaca	tacaggcaca	aaaacagcat	tatgtggacg	2405
cctcatgtat	tttttataga	gtcaactatt	tcctctttat	tttccctcat	tgaaagatgc	2465
aaaacagctc	tctattgtgt	acagaaaggg	taaataatgc	aaaatacctg	gtagtaaaat	2525
aaatgctgaa	aattttcctt	taaaatagaa	tcattaggcc	aggcgtggtg	gctcatgctt	2585
gtaatcccag	cactttggta	ggctgaggtr	ggtggatcac	ctgaggtcag	gagttcgagt	2645
ccagcctggc	caatatgctg	aaaccctgtc	tctactaaaa	ttacaaaaat	tagccggcca	2705
tggtggcagg	tgcttgtaat	cccagctact	tgggaggctg	aggcaggaga	atcacttgaa	2765
ccaggaaggc	agaggttgca	ctgagctgag	attgtgccac	tgcactccag	cctgggcaac	2825
aagagcaaaa	ctctgtctgg	aaaaaaaaaa aaaa	2859

MN(O/H)VTIOWDAVIALYILFSWCHGGITNINCSGHIWVEPATIFKMGMNISIYCQAAIKNCQPRKLHF YKNGIKERFQITRINKTTARLWYKNFLEPHASMYCTAECPKHFQETLICGKDISSGYPPDIPDEVTCVIY EYSGNMTCTWNA(G/R)KLTYIDTKYWHVKSLETEEEQQYLTSSYINISTDSLQGGKKYLVWVQAANAL GMEESKQLQIHLDDIVIPSAAVISRAETINATVPKTIIYWDSQTTIEKVSCEMRYKATTNQTWNVKEFDT NFTYVQQSEFYLEPNIKYVFQVRCQETGKRYWQPWSSPFFHKTPETVPQVTSKAFQHDTWNSGLTVASIS TGHLTSDNRGDIGLLLGMIVFÄVMLSILSLIGIFNRSFRTGIKRRILLLIPKWLYEDIPNMKNSNWKML QENSELMNNNS SEQVLYVDPMITEIKEIFIPEHKPTDYKKENTGPLETRDYPQNSLFDNTTWYIPDLNT GYKPQISNFLPEGSHLSNNNEITSLTLKPPVDSLDSGNNPRLQKHPNFAFSVSSVNSLSNTIFLGELSLI LNQGECSSPDIQNSVEEETTMLLENDSPSETIPEQTLLPDEFVSCLGIVNEELPSINTYFPQNILESHFN RISLLEK

Tabuľka 2

Reverzná translácia primátovej, napr. ľudskej, DCRS5 (sekv. č. 3):

ATGAAYCAYGTNACNATHCARTGGGAYGCNGTNATHGCNYTNTAYATHYTNTTYWSNTGGTGYCAYGGNGGNAT

HACNAAYATHAAYTGYWSNGGNCAYATHTGGGTNGARCCNGCNACNATHTTYAARATGGGNATGAAYATHWSNA

THTAYTGYCARGCNGCNÄTHAARAAYTGYCARCCNMGNAARYTNCAYTTYTAYAARAAYGGNATHAARGARMGN

TTYCARATHACNMGNATHAAYAARACNACNGCNMGNYTNTGGTAYAARAAYTTYYTNGARCCNCAYGCNWSNAT

GTAYTGYACNGCNGARTGYCCNAARCAYTTYCARGARACNYTNATHTGYGGNAARGAYATHWSNWSNGGNTAYC

CNCCNGAYATHCCNGAYGARGTNACNTGYGTNATHTAYGARTAYWSNGGNAAYATGACNTGYACNTGGAAYGCN

MGNAARYTNACNTAYATHGAYACNAARTAYGTNGTNCAYGTNAARWSNYTNGARACNGARGARGARCARCARTA

YYTNACNWSNWSNTAYATHAAYATHWSNACNGAYWSNYTNCARGGNGGNAARAARTAYYTNGTNTGGGTNCARG

CNGCNAAYGCNYTNGGNATGGARGARWSNAARCARYTNC7XRATHCAYYTNGAYGAYATHGTNATHCCNWSNGCN

GCNGTNATHWSNMGNGCNGARACNATHAAYGCNACNGTNCCNAARACNATHATHTAYTGGGAYWSNCARACNAC

NATHGARAARGTWSNTGYGARATGMGNTAYAARGCNACNACNAAYCARACNTGGAAYGTNAARGARTTYGAYA

CNAAYTTYACNTAYGTNCARCARWSNGARTTYTAYYTNGARCCNAAYATHAARTAYGTNTTYCARGTNMGNTGY

CARGARACNGGNAARMGNTAYTGGCARCCNTGGWSNWSNCCNTTYTTYCAYAARACNCCNGARACNGTNCCNCA

RGTNACNWSNAARGCNTTYCARCAYGAYACNTGGAAYWSNGGNYTNACNGTNGCNWSNATHWSNACNGGNCAYY

TNACNWSNGAYAAYMGNGGNGAYATHGGNYTNYTNYTNGGNATGATHGTNTTYGCNGTNATGYTNWSNATHYTN

WSNYTNATHGGNATHTTYAAYMGNWSNTTYMGNACNGGNATHAAKMGNMSNATHYTNYTNYTNATHCCNAARTG

GYTNTAYGARGÄYATHCCNAAYATGAARAAYWSNAAYGTNGTNAARATGYTNCARGÄRAAYWSNGARYTNATGA

AYAAYAAYWSNWSNGARCARGTNYTNTAYGTNGAYCCNATGATHACNGARATHAARGARATHTTYATHCCNGAR

CAYAARCCNACNGAYTAYAARAARGARAAYACNGGNCCNYTNGARACNMGNGAYTAYCCNCARAAYWSNYTNTT

YGAYAAYACNACNGTNGTNTAYATHCCNGAYYTNAAYACNGGNTAYAARCCNCARATHWSNAAYTTYYTNCCNG

ARGťaJWSNCAYYTNWSNAAYAAYAAYGARATHACNWSNYTNACNYTNAARCCNCCNGTNGAYWSNYTNGAYWSN

GGNAAYAAYCCNMGNYTNCARAARCAYCCNAAYTTYGCNTTYWSNGTNWSNWSNGTNAAYWSNYTNWSNAAYAC

NATHTTYYTNGGNGARYTNWSNYTNATHYTNAAYCARGGNGARTGYWSNWSNCCNGAYATHCARAAYWSNGTNG

ARGARGARACNACNATGYTNYTNGARAAYGAYWSNCCNWSNGARACNATHCCNGARCARACNYTNYTNCCNGAY

GARTTYGTNWSNTGYYTNGGNATHGTNAAYGARGARYTNCCNWSNATHAAYACNTAYTTYCCNCARAAYATHYT

NGARWSNCAYTTYAAYMGNATHWSNYTNYTNGARAAR

Tabuľka 3

Porovnanie rôznych cytokínových receptorových podjednotiek. Ľudský IL-6 receptorový proteín gpl30 je sekv. č. 4 (GenBank M57230); ľudská IL-12 receptorová beta2 podjednotka je sekv. č. 5 (GenBank U64198).

huIL-12R 2 1 MAHTFRGCSLAFMFIITWLLIKAKIDACKRGDVTVKPSHVILLGSTVN 48 hugpl301 MLTLQTWWQALFIFLTTESTGELLDPCG---YISPESPWQLHSNFT 45 huDCRS5 1MNHVTIQWDAVIALYILFSWCHGGITNINCS-GHIWVEPATIFKMGMNIS 49 * . * huIL-12R 2 49 ITCSLKPRQGCFHYSRRNKLILYKFDRRINFHHGHSLNSQVTGLPLG--- 95 hugpl30 46 AVCVLKEKCMDYFHVNANYIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIA 95 huDCRS550 IYCQAAIKN—CQP---RKLHFYKNGIKER-FQITRINKTTÄRLWYKNFL 93 * . . . . * . .

huIL-12R 2 96 —TTLFVCKLACINSD-EIQICGAEIFVGVAPEQPQNLSCIQKGEQGTVA 142 hugpl3096 SLNIQLTCNILTFGQL-EQNVYGITIISGLPPEKPKNLSCIVN-EGKKMR 143 huDCRS594 EPHASMYCTAECPKHFQETLICGKDISSGYPPDIPDEVTCVIYEYSGNMT 143 ★ ' * ******* * huIL-12R 2 143 CTWERGRDTHLYTEYTLQLSGPKNLTWQKQCKDIYCDYLDFGINLTPESP 192 hugpl30144 CEWDGGRETHLETNFTLKS—EWATHKFADCKAKRDTPTSCTVDYS-TVY 190 huDCRS5144 CTWNARKLTYIDTKYWHVKSLETEEEQQYLTSSYINISTDSLQGG---- 189 * * ******* huIL-12R 2 193 ESNFTAKVTAVNSLGSSSSLPSTFTFLDIVRPLPPWDIRIKFQKASVSRC 242 hugpl30191 FVNIEVWVEAENALGKVTSDHINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSIL 240 huDCRS5190 -KKYLVWVQAANALGMEESKQLQIHLDDIVIPSAAVISRAETINATVPKT 238 ****** * ** huIL-12R 2 243 TLYWRD----EGLVLLNRLRYRPSNSRLWNMVN---VTKAKGRHDLLDLK 285 hugpl30241 KLTWTNPSIKSVIILKYNlQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLK 290 huDCRS5239 IIYWDS—QTTIEKVSCEMRYKATTNQTWNVKEFD-TNFTYVQQSEFYLE 285 * * * * * huIL-12R 2 hugpl30291 huDCRS5286 ★

huIL-12R 2 hugpl30341 huDCRS5321 huIL-12R 2 hugpl30388 huDCRS5358 huIL-12R 2 hugpl30437 huDCRS5388 huIL-12R 2 hugpl30481 huDCRS5418 huIL-12R 2 hugpl30531 huDCRS5454 huIL-12R 2 hugpl30577 huDCRS5491 huIL-12R 2 hugpl30626 huDCRS5496 huIL-12R 2 hugpl30676 huDCRS5520 huIL-12R 2 hugpl30726 huDCRS5553 huIL-12R 2 hugpl30776 huDCRS5581 huIL-12R 2 hugpl30826 huDCRS5624 ★

286 PFTEYEFQISSKLHLYKGSWSDWSESLRAQTPEEEPTGMLDVWYMKRHID 335

PFTEYVFRIRCMKEDGKGYWSDWSEEASGITYEDRPSKAPSFWYKIDPSH 340

PNIKYVFQVRCQ-ETGKRYWQPWSSPFFHKTPETVP-------------- 320 * ★ **** * * *

336 YS-RQQISLFWKNLSVSEARGKILHYQVTLQELTGGKAMTQNITGHTSWT 384

TQGYRTVQLVWKTLPPFEANGKILDYEVT---LTRWKSHLQNYTVNATKL 387

-----QVTSKAFQHDTWNSGLTVASISTG------HLTSDN—RGDIGLL 357

385 TVIPRTGNWAVAVSAANSKGSSLPTRINIMNLCEAGLLAPRQVSANSEGM 434

TVNLTNDRYLATLTVRNLVGKSDAAVLTIP-ACDFQATHPVMDLKAFPKD 436

LGMIVFAVMLSILSLIGIFNRSFRTGIKRR-------------------- 387 ★

435 DNILVTWQPPRKDPSÄVQEYWEWRELHPG-GDTQVPLNWLRSRPYNVSA 483

NMLWVEWTTPRE---SVKKYILEWCVLS---DKAPCITDWQQEDGTVHRT 480

----------------ILLLIPKWLYEDIPNMKNSNWKMLQEN----SE 417 *

484 LISENIKSYICYEIRVYALSGDQ-GGCSSILGNSKHKAPLSGPHINAITE 532

YLRGNLAESKCYLITVTPVYADGPGSPESIKAYLKQAPPSKGPTVRTKKV 530

LMNNNSSE--------QVLYVDP-----MITEIKEIFIPEHKPTDYKKE- 453 ★ ★ * * *

533 EKGSILISWNSIPVQEQMGCLLHYRIYWKERDSNSQPQLCEIPYRVSQNS 582

GKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTIIGN----ETAVNVDSSHTE 576 —NTGPLETRDYP---QNSLFDNTTWYIPDLNTG------YKPQISN— 490 * ★ *

583 HPINSLQPRVTYVLWMTALTAAGESSHGNEREFCLQGKAN-WMAFVAPSI 631

YTLSSLTSDTLYMVRMAAYTDEG-GKDGPEFTFTTPKFAQGEIEAIWPV 625

------------------FLPEG--------------------------- 495 •k

632 CIAIIMVGIFSTHYFQQKVFVLLAALRP-----------QWCSREIPDPA 670

CLAFLLTTLLGVLFCFNKRDLIKKHIWPNVPDPSKSHIAQWSPHTPPRHN 675

-----------SHLSNNN-EITSLTLKP--------------PVDSLDSG 519 *

671 NSTCAKKYPIAEEKTQLPLDRLLID-WPTPEDPEPLVIS—EVLHQVTPV 717 FNSKDQMYSDGNFTDVSWEIEANDKKPFPEDLKSLDLFKKEKINTEGHS 725 NNPRLQKHPN-FAFSVSSVNSLSNT-------------1---FLGELSLI 552

718 FRHPPCSNWPQREKGIQGHQASEKDMMHSASSPPPPRALQAESRQLVDLY 767

SGIGGSSCMSSSRPSISSSDENESSQNTSSTVQYSTWHSGYRHQVPSVQ 775

LNQGECS S—PDIQNSVEEETTMLLENDSP----------------- 580 ★ ★ *

768 KVLESRGSDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSN---IDDLPSHEAP 814

VFSRSESTQPLLDSEERPEDLQLVDHVDGGDGILPRQQYFKQNCSQHESS 825 —SE TIPEQTLLPDEFVSCLGIVNEELPSINTYFPQN ILESHFNR— 623 *

815 LADSLEELEPQHISLS-----VFPSSSLHPLTFSCG--------------845

PDISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQSCGSGQMKMFQEVSAAD 875 —ISLLEK 629 ★

huIL-12R 2 846 ----------DKLTLDQLKMRCDSLML 862 hugpl30876 AFGPGTEGQVERFETVGMEAATDEGMPKSYLPQTVRQGGYMPQ 918 huDCRS5630 629

Najbližšími príbuznými extracelulámej domény „IL-30R“ sú IL-6 signálny prenášač gpl30 a IL-12RP2. O niečo menej blízkymi príbuznými sú GCSF receptor, leptínový receptor, receptor leukemického inhibičného faktora a CNTF receptor. „IL-30R“ je členom triedy I cytokínovej receptorovej superrodiny a je blízko príbuzný IL-6R/IL-12R rodiny.

Tabuľka 3 znázorňuje porovnanie dostupných sekvencií primátových receptorových podjednotiek s primátovou, napr. ľudskou DCRS5 (IL-30R). DCRS5 je podobná s IL-6 receptorovou podjednotkou gpl30 (napr. IL-6R podjednotkou) a IL-12RP2 podjednotkou. DCRS5 má štrukturálne znaky beta podjednotky, ale skutočné poradie proteínových interakcií a signalizácia ostávajú nerozriešené.

Tak ako sa používa tu, opisuje výraz DCRS5 proteín obsahujúci amino-kyselinovú sekvenciu uvedenú v tabuľke 1. V mnohých prípadoch bude funkčne alebo štrukturálne ekvivalentný jeho podstatný fragment, vrátane napr. ďalších extracelulámych segmentov. Vynález zahŕňa aj proteínové odchýlky príslušnej DCRS5 alely, ktorej sekvencia je poskytnutá, napr. muteín alebo iný konštrukt. Typicky budú takéto varianty mať menej ako približne 10 % sekvenčné rozdiely oproti cieľovej oblasti, a teda budú často mať 1 až 11 substitúcií, napr. 2, 3, 5 a 7 substitúcií a iné. Zahrnuté sú aj alelické a iné varianty, napr. prirodzené polymorfizmy, opísaného proteínu. Typicky sa bude viazať na jeho zodpovedajúci biologický ligand, možno v dimerizovanom stave s alfa receptorovou podjednotkou, s vysokou afinitou, napr. s afinitou aspoň približne 100 nM, zvyčajne s lepšou afinitou ako približne 30 nM, výhodne lepšou ako približne 10 nM, a najvýhodnejšie s lepšou ako približne 3 nM. Tento výraz by tu mal byť používaný aj na označenie príbuzných prirodzene sa vyskytujúcich foriem, napr. aliel, polymoríhých variantov a metabolických variantov cicavčieho proteínu. Výhodné formy receptorových komplexov sa budú viazať na príslušný ligand s afinitou a selektivitiou, ktorá postačuje na interakciu ligand-receptor.

Tento vynález zahŕňa aj kombinácie proteínov alebo peptidov, ktoré majú zhodnú aminokyselinovú sekvenciu s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v tabuľke 1. Bude zahŕňať sekvenčné varianty s relatívne malým počtom substitúcií, napr. výhodne menej ako približne 3 až 5 substitúciami.

Podstatný polypeptidový „fragment“ alebo „segment“ je sekvencia amino-kyselinových zvyškov obsahujúca aspoň približne 8 aminokyselín, vo všeobecnosti aspoň 10 aminokyselín, všeobecnejšie aspoň 12 aminokyselín, často aspoň 14 aminokyselín, častejšie aspoň 16 aminokyselín, typicky aspoň 18 aminokyselín, typickejšie aspoň 20 aminokyselín, zvyčajne aspoň 22 aminokyselín, obvyklejšie aspoň 24 aminokyselín, výhodne aspoň 26 aminokyselín, výhodnejšie aspoň 28 aminokyselín a vo výnimočne výhodných uskutočneniach aspoň približne 30 alebo viac aminokyselín. Sekvencie segmentov rôznych proteínov sa môžu navzájom porovnávať v príslušnej dĺžke reťazcov. V mnohých situáciách môžu fragmenty mať fúnkčné vlastnosti intaktných podjednotiek, napr. extraceluláma doména transmembránového receptora si môže zachovať ligand viažuce znaky a môže byť použitá na prípravu komplexu podobného rozpustnému receptora.

Aminokyselinová sekvenčná homológia alebo sekvenčná zhoda sa stanovujú optimalizáciou zhôd zvyškov. Pri niektorých porovnaniach sa môžu, ak je to potrebné, zaviesť medzery. Pozri napr. Needleham, a ďalší, (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; Sankoff, a ďalší, (1983) L kapitola v Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; a softvérové balíky od IntelliGenetics, Mountain View, CA; a the University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wl; pričom každá z týchto publikácií je tu zahrnutá jej citáciou. To sa mení, keď sa za zhody považujú konzervatívne substitúcie. Konzervatívne substitúcie typicky zahŕňajú substitúcie v rámci nasledujúcich skupín: glycin, alanín; valín, izoleucín, leucín; kyselina asparágová, kyselina glutámová; asparagín, glutamin; serín, treonín; lyzín, arginín; a fenylalanín, tyrozín. Za homologické aminokyselinové sekvencie sa považujú tie sekvencie, ktoré zahŕňajú prirodzené alelické alebo medzidruhové odchýlky v cytokínovej sekvencií. Typické homologické proteíny alebo peptidy budú na 50 až 100 % homologické (ak môžu byť zavedené medzery), na 60 až 100 % homologické (ak môžu byť zahrnuté konzervatívne substitúcie) s aminokyselinovým sekvenčným segmentom podľa tabuľky 1. Miera homológie bude aspoň približne 70 %, vo všeobecnosti aspoň 76 %, všeobecnejšie aspoň 81 %, často aspoň 85 %, častejšie aspoň 88 %, typicky aspoň 90 %, typickejšie aspoň 92 %, zvyčajne aspoň 94 %, zvyčajnejšie aspoň 95 %, výhodne aspoň 96 % a výhodnejšie aspoň 97 % a vo výnimočne výhodných uskutočneniach aspoň 98 % alebo viac. Stupeň homológie sa bude meniť s dĺžkou porovnávaných segmentov. Homologické proteíny alebo peptidy, ako napríklad alelické varianty, budú zdieľať väčšinu biologických aktivít s uskutočneniami opísanými v tabuľke 1, najmä s vnútrobunkovou časťou.

Tak ako sa používa tu, výraz „biologická aktivita“ sa používa na opis, bez obmedzenia, vplyvov na signalizáciu, zápalové reakcie, vrodenú imunitu a/alebo morfogenický vývoj prostredníctvom cytokínom podobných ligandov. Tieto receptory môžu napríklad sprostredkovávať fosfatázové alebo fosforylázové aktivity, ktoré je možné jednoducho merať štandardnými postupmi. Pozri napr. Hardie, a ďalší (vyd. 1995) The Prote12 in Kinase FactBook zv. I a II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, a ďalší (1991) Meth. Enzymol. 200: 38-62; Hunter, a ďalší (1992) Celí 70: 375-388; Lewin (1990) Celí 61: 743-752; Pines, a ďalší (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56: 449-463; a Parker, a ďalší (1993) Náture 363: 736-738. Receptory alebo ich časti môžu byť užitočné ako fosfátové značiace enzýmy na značenie všeobecných alebo špecifických substrátov. Podjednotky môžu byť aj funkčnými imunogénmi na vyvolanie rozoznávajúcich protilátok alebo antigénmi schopnými viazať protilátky.

Výrazy ligand, agonista, antagonista a analóg, napr. DCRS5, sa týkajú interakcií ligand-receptor, napr. toho, či je receptorom prirodzený receptor alebo protilátka. Bunkové odpovede sú pravdepodobne typicky sprostredkované receptorovými tyrozín kinázovými dráhami.

Ligandom je aj molekula, ktorá slúži buď ako prirodzený ligand, na ktorý sa viaže uvedený receptor alebo jeho analóg, alebo ako molekula, ktorá je funkčným analógom prirodzeného ligandu. Funkčným analógom môže byť ligand so štrukturálnymi modifikáciami, alebo to môže byť úplne nepríbuzná molekula, ktorá má molekulový tvar interagujúci s príslušnými ligandovými väzobnými determinantami. Ligandy môžu slúžiť ako agonisty alebo antagonisty, pozri napr. Goodman, a ďalší (vyd. 1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon Press, New York.

Racionálny dizajn liečiva môže byť založený aj na štrukturálnych štúdiách molekulových tvarov receptora alebo protilátky a iných efektorov alebo ligandov. Pozri napr. Herz, a ďalší (1997) J. Recept. Signál Transduct. Res. 17: 671-776; a Chaiken, a ďalší (1996) Trends Biotechnol. 14: 369-375. Efektormi môžu byť iné proteíny, ktoré sprostredkúvajú iné funkcie ako odpoveď na viazanie ligandu, alebo iné proteíny, ktoré normálne interagujú s receptorom. Jedným prostriedkom na stanovenie toho, ktoré miesta interagujú so špecifickými inými proteínmi, je fyzikálna štrukturálna determinácia, napr. rôntgenová kryštalografia alebo dvojrozmerné NMR techniky. Tieto poskytnú návod na to, ktoré aminokyselinové zvyšky tvoria molekulové kontaktné oblasti. Podrobný opis proteínovej štrukturálnej determinácie pozri napr. Blundell a Johnson (1976) Proteín Crystallography, Academic Press, New York, ktorá je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie.

II. Aktivity

Proteíny podobné cytokínovému receptoru budú mať množstvo rozličných biologických aktivít, napr. vnútrobunkovú signalizáciu, napr. prostredníctvom STAT4, modulovanie bunkovej proliferácie alebo vo fosfátovom metabolizme, pričom sa budú pridávať alebo odstraňovať zo špecifických substrátov, typicky proteínov. To bude vo všeobecnosti viesť k modulácii zápalovej funkcie, inej vrodenej imunitnej odpovede, alebo modulácii morfologického účinku. Podjednotka sa pravdepodobne bude viazať na ligand s nízkou špecifickou afinitou.

DCRS5 má charakteristické motívy receptorovej signalizácie prostredníctvom JAK dráhy. Pozri napr. Ihle, a ďalší (1997) Stem Cells 15 (dod. 1): 105-111; Silvennoinen, a ďalší (1997) APMIS 105: 497-509; Levy (1997) Cytokine Growth Factor Review 8: 81-90; Winston a Hunter (1996) Current Biol. 6: 668-671; Barrett (1996) Baillieres Clin. Gastroenterol. 10: 115; a Briscoe, a ďalší (1996) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 351: 167-171. Zaujímavé sú najmä opísané SH2 viažuce motívy.

Biologické aktivity cytokínových receptorových podjednotiek sa budú týkať pridávania alebo odstraňovania fosfatázových skupín ku substrátom, typicky špecifickým spôsobom, ale príležitostne nešpecifickým spôsobom. Substráty môžu byť identifikované štandardnými spôsobmi a aj podmienky enzymatickej aktivity môžu byť testované štandardnými spôsobmi, napr. ako je opísané v Hardie, a ďalší (vyd. 1995) The Proteín Kinase FactBook zv. I a II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, a ďalší (1991) Meth. Enzymol. 200: 38-62; Hunter, a ďalší (1992) Celí 70: 375-388; Lewin (1990) Celí 61: 743-752; Pines, a ďalší. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56:449-463; a Parker, a ďalší (1993) Náture 363: 736-738.

Receptorové podjednotky sa môžu kombinovať, aby sa vytvorili funkčné komplexy, napr. komplexy, ktoré môžu byť užitočné na viazanie ligandu alebo prípravu protilátok. Tieto komplexy budú mať veľké diagnostické využitie vrátane detekcie alebo kvantifikácie. Funkčné spojenie receptora s p40/IL-B30 ligandom poskytuje dôležitý prehľad o klinických indikáciách, na ktoré bude receptor užitočný. Takže antagonisty a agonisty budú mať predpokladateľné funkčné účinky.

III. Nukleové kyseliny

Tento vynález sa týka použitia izolovanej nukleovej kyseliny alebo fragmentov, ktoré kódujú napríklad tieto alebo blízko príbuzné proteíny, alebo ich fragmenty, ktoré napr. kódujú zodpovedajúci polypeptid, výhodne polypeptid, ktorý je biologicky aktívny. Okrem toho tento vynález zahŕňa izolované alebo rekombinantné DNAs, ktoré kódujú kombinácie takýchto proteínov alebo polypeptidov majúcich charakteristické sekvencie, napr. DCRS5s samostatne alebo v kombinácii s inými, ako napríklad s IL-12Rpi (pozri Showe, a ďalší (1996)) Ann. N. Y. Acad. Sci. 795: 413-425; Gately, a ďalší (1998) Ann. Rev. Immunol. 16: 495-521; GenBankU03187, NM005535) podjednotkou. Typicky je nukleová kyselina schopná hybridizovať, v príslušných podmienkach, s nukleokyselinovým sekvenčným segmentom uvedeným v tabuľke 1, ale výhodne nie so zodpovedajúcim segmentom iných receptorov opísaných v tabuľke 3. Uvedeným biologicky aktívnym prote13 inom alebo polypeptidom môže byť proteín s úplnou dĺžkou alebo fragment, a bude typicky obsahovať segment aminokyselinovej sekvencie, ktorá je vysoko homologická, napr. má významný podiel rovnakých sekvencií, so sekvenciou uvedenou v tabuľke 1. Okrem toho tento vynález zahŕňa použitie izolovanej alebo rekombinantnej nukleovej kyseliny alebo jej fragmentov, ktoré kódujú proteíny obsahujúce fragmenty, ktoré sú ekvivalentné s DCRS5 proteínmi, napr. vnútrobunkovými časťami. Izolované nukleové kyseliny môžu byť príslušné regulačné sekvencie na 5' a 3' ohraničeniach, napr. promótory, zosiľňovače, signály na pridávanie poly-A a iné regulačné sekvencie z prirodzeného génu. Poskytnuté sú aj kombinácie, ako je uvedené, napr. kombinácia DCRS5 s IL-12Rp 1, alebo s ich extracelulámymi časťami viažucimi ligand, ako ligandovými antagonistami. Aj diagnostické využitia napr. polymorfných alebo iných variantov sú zrejmým spôsobom dôležité.

„Izolovanou“ nukleovou kyselinou je napr. RNA, DNA alebo zmiešaný polymér, ktorý je v podstate čistý, napr. oddelený od iných komponentov, ktoré prirodzene sprevádzajú natívnu sekvenciu, ako napríklad ribozómov, polymeráz a ohraničujúcich genomických sekvencii z pôvodných druhov. Výraz zahŕňa nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá môže byť vyňatá z prirodzene sa vyskytujúceho prostredia a zahŕňa rekombinantné alebo klonované DNA izoláty, ktoré sa tým líšia od prirodzene sa vyskytujúcich kompozícií a chemicky syntetizovaných analógov alebo analógov biologicky syntetizovaných heterológnymi systémami. V podstate čistá molekula zahŕňa izolované formy molekuly, buď úplne, alebo v podstate čisté.

Izolovanou nukleovou kyselinou bude vo všeobecnosti homogénna kompozícia molekúl, ale, v niektorých uskutočneniach, bude obsahovať heterogenitu, výhodne minoritnú. Táto heterogenita sa typicky vyskytuje na koncoch polymérov alebo v častiach, ktoré nie sú kritické pre požadovanú biologickú funkciu alebo aktivitu.

„Rekombinantná“ nukleová kyselina je typicky definovaná buď spôsobom jej výroby, alebo jej štruktúrou. Čo sa týka spôsobu jej výroby, napr. produktu vyrobeného určitým spôsobom, využíva sa proces rekombinantných nukleokyselinových techník, napr. techník zahŕňajúcich zásah človeka do nukleotidovej sekvencie. Typicky tento zásah zahŕňa in vitro manipuláciu, hoci za určitých okolností môže zahŕňať klasickejšie techniky kríženia zvierat. Alternatívne to môže byť nukleová kyselina vyrobená generovaním sekvencie obsahujúcej fuziu dvoch fragmentov, ktoré sa prirodzene nevyskytujú kontinuálne za sebou, ale sú považované za výlučné produkty prírody, napr. prirodzene sa vyskytujúce mutanty, ako sa nachádzajú v ich prirodzenom stave. Takže produktmi môžu byť napr. bunky transformované s vektorom, ktorý sa prirodzene nevyskytuje, akým sú napríklad nukleové kyseliny obsahujúce sekvenciu odvodenú použitím akéhokoľvek syntetického oligonukleotidového procesu. Takýto proces sa často uskutočňuje na účely nahradenia, napr. kodónu, iným kodónom kódujúcim rovnakú alebo konzervatívnu aminokyselinu, pričom typicky sa zavádza alebo odstraňuje sekvenčné miesto rozoznávané reštrikčným enzýmom, alebo sa táto náhrada uskutočňuje kvôli štrukturálno-funkčnej analýze. Alternatívne sa proces uskutočňuje na spojenie nukleokyselinových segmentov s požadovanými funkciami, aby sa vygenerovala jediná genetická entita zahŕňajúca požadovanú kombináciu funkcií, ktorá sa nenachádza v bežne dostupných prirodzených formách, napr. kódujúca fúzovaný proteín. Miesta rozoznávané reštrikčnými enzýmami sú často cieľom takýchto umelých manipulácií, ale prostredníctvom konštruovania môžu byť zahrnuté aj iné miestne špecifické ciele, napr. promótory, DNA replikačne miesta, regulačné sekvencie, riadiace sekvencie alebo iné užitočné znaky. Podobný koncept je určený pre rekombinantný, t. j. fúzovaný, polypeptid. To bude zahŕňať diméme opakovania alebo fúziu DCRS5 s IL-12Rpl podjednotkou. Konkrétne sú zahrnuté syntetické nukleové kyseliny, ktoré, v dôsledku degenerácie genetického kódu, kódujú ekvivalentné DCRS5 polypeptidy alebo fragmenty a fúzie sekvencii z rôznych rozličných príbuzných molekúl, napr. iných členov cytokínovej receptorovej rodiny.

V kontexte nukleovej kyseliny je „fragmentom“ kontinuálny segment aspoň približne 17 nukleotidov, vo všeobecnosti aspoň 21 nukleotidov, všeobecnejšie aspoň 25 nukleotidov, obvykle aspoň 30 nukleotidov, obvyklej šie aspoň 35 nukleotidov, často aspoň 39 nukleotidov, častejšie aspoň 45 nukleotidov, typicky aspoň 50 nukleotidov, typickejšie aspoň 55 nukleotidov, zvyčajne aspoň 60 nukleotidov, zvyčajnejšie aspoň 66 nukleotidov, výhodne aspoň 72 nukleotidov, výhodnejšie aspoň 79 nukleotidov a vo výnimočne výhodných uskutočneniach to bude aspoň 85 alebo viac nukleotidov, vrátane 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200 atď. Typicky sa môžu navzájom porovnávať fragmenty s rozličnými genetickými sekvenciami s príslušnou dĺžkou reťazcov, najmä definované segmenty, ako napríklad opísané domény.

Nukleové kyseliny, ktoré kódujú DCRS5, budú výnimočne užitočné na identifikáciu génov, mRNA a cDNA druhov, ktoré kódujú samotné alebo blízko príbuzné proteíny, ako aj DNAs, ktoré kódujú polymorfné, alelické alebo iné genetické varianty, napr. z rôznych jedincov alebo príbuzných druhov. Výhodnými sondami pre takéto skríningy sú tie oblasti receptora, ktoré sú konzervované v rámci rozličných polymorfných variantov, alebo ktoré obsahujú nukleotidy, ktorým chýba špecifická, a výhodne budú mať kompletnú alebo takmer kompletnú dĺžku. V iných situáciách budú užitočnejšie polymorfné variantové špecifické sekvencie. Diagnostikované môžu byť aj kombinácie polymorfných variantov DCRS5 s variantmi lL-12Rpi.

Tento vynález ďalej zahŕňa rekombinantné nukleokyselinové molekuly a fragmenty s nukleokyselinovou sekvenciou, ktorá je rovnaká alebo vysoko homologická s tu uvedenou izolovanou DNA. Konkrétne, sekven14 cie budú často operatívne spojené s DNA segmentmi, ktoré riadia transkripciu, transláciu a DNA replikáciu. Tieto ďalšie segmenty typicky pomáhajú pri expresii požadovaného nukleokyselinového segmentu.

Homologické alebo vysoko zhodné nukleokyselinové sekvencie, keď sa vzájomne porovnávajú, napr. DCRS5 sekvencie, majú významnú podobnosť. Štandardy pre homológiu pri nukleových kyselinách sú buď mierami homológie všeobecne používanými v oblasti porovnávania sekvencií, alebo sú založené na hybridizačných podmienkach. Komparatívne hybridizačné podmienky sú podrobnejšie opísané neskôr.

Podstatná zhoda v kontexte porovnávania nukleokyselinových sekvencií znamená buď to, že segmenty alebo ich komplementárne vlákna, keď sa porovnávajú, sú identické, keď sa optimálne zoradia, s príslušnými nukletidovými inzerciami alebo deléciami, aspoň na približne 60 % nukleotidov, vo všeobecnosti aspoň na 66 %, obvykle aspoň na 71 %, často aspoň 76 %, častejšie aspoň 80 %, zvyčajne aspoň 84 %, zvyčajnejšie aspoň 88 %, typicky aspoň 91 %, typickejšie aspoň približne 93 %, výhodne aspoň približne 95 %, výhodnejšie aspoň približne 96 až 98 % alebo viac a vo výnimočne výhodných uskutočneniach približne 99 % alebo viac nukleotidov, vrátane, napr. segmentov kódujúcich štrukturálne domény alebo iné opísané segmenty. Alternatívne, podstatná zhoda bude existovať, keď budú segmenty hybridizovať v selektívnych hybridizačných podmienkach ku vláknu alebo jeho komplementu, typicky použitím sekvencie uvedenej v tabuľke 1. Typicky, selektívna hybridizácia nastane, keď je aspoň 55 % homológia pri vlákne dlhom aspoň približne 14 nukleotidov, typickejšie aspoň približne 65 %, výhodne aspoň približne 75 % a výhodnejšie aspoň približne 90 %. Pozri Kanehisa (1984) Nucl. Acids Res. 12: 203-213, pričom táto publikácia je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie. Dĺžka homologického porovnávania, ako je opísaná, môže zahŕňať dlhšie reťazce a, v určitých uskutočneniach, sa bude týkať vlákna obsahujúceho aspoň približne 17 nukleotidov, vo všeobecnosti aspoň približne 20 nukleotidov, obvykle aspoň približne 24 nukleotidov, zvyčajne aspoň približne 28 nukleotidov, typicky aspoň približne 32 nukleotidov, typickejšie aspoň približne 40 nukleotidov, výhodne aspoň približne 50 nukleotidov a výhodnejšie aspoň približne 75 až 100 alebo viac nukleotidov. To zahŕňa napr. 125,150,175, 200,225,250,275,300, 325, 350 atď. a iné dĺžky.

Prísnymi podmienkami, vo vzťahu k homológii v hybridizačnom kontexte, budú kombinované podmienky obsahu soli, teploty, organických rozpúšťadiel a iných parametrov, ktoré sa typicky kontrolujú v hybridizačných reakciách. Prísne teplotné podmienky budú zvyčajne zahŕňať teploty nad približne 30 °C, zvyčajnejšie nad približne 37 °C, typicky nad približne 45 °C, typickejšie nad približne 55 °C, výhodne nad približne 65 °C a výhodnejšie nad približne 70 °C. Prísne podmienky obsahu soli budú zvyčajne menej ako približne 500 mM, obvykle menej ako približne 400 mM, obvyklejšie menej ako približne 300 mM, typicky menej ako približne 200 mM, výhodne menej ako približne 100 mM a výhodnejšie menej ako približne 80 mM, aj nižšie ako približne 50 alebo 20 mM. Ale kombinácia parametrov je oveľa dôležitejšia ako hodnota ktoréhokoľvek jednotlivého parametra. Pozri napr. Wetmur a Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370, pričom táto publikácia je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie.

Izolovanú DNA je možné jednoducho modifikovať nukleotidovými substitúciami, nukleotidovými deléciami, nukleotidovými inzerciami a inverziami nukleotidových reťazcov. Výsledkom týchto modifikácií sú nové DNA sekvencie, ktoré kódujú tento proteín alebo jeho deriváty. Tieto modifikované sekvencie môžu byť používané na výrobu mutantných proteínov (muteínov) alebo na zosilnenie expresie variantových druhov. Zosilnená expresia môže zahŕňať génovú amplifikáciu, zvýšenú transkripciu, zvýšenú transláciu a iné mechanizmy. Takáto mutantná DCRS5 sa podobá opísanej DCRS5, ale má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa líši od sekvencie iných proteínov podobných cytokínovému receptoru, ako sa nachádzajú v prírode, či už deléciou, substitúciou alebo inzerciou. Najmä výraz „miestne špecificky mutantná DCRS5“ zahŕňa proteín, ktorý má v podstate rovnakú sekvenciu ako proteín uvedený v tabuľke 1, a typicky zdieľa väčšinu biologických aktivít alebo účinkov tu opísaných foriem. Identifikované budú aj rôzne prirodzené polymorfné variantné sekvencie.

Hoci sú miestne špecifické mutačné miesta predeterminované, mutanty nemusia byť miestne špecifické. Mutagenéza cicavčej DCRS5 sa môže dosiahnuť vytvorením aminokyselinových inzercií alebo delécií v géne, v spojení s expresiou. Aby sa získal konečný konštrukt, môžu sa generovať substitúcie, delécie, inzercie alebo mnohé kombinácie. Inzercie zahŕňajú amino- alebo karboxy- terminálne fúzie. Náhodná mutagenéza sa môže uskutočňovať v cieľovom kodóne a expresné cicavčie DCRS5 mutanty sa potom môžu skrínovať z hľadiska požadovanej aktivity, pričom sa predpokladá určitý aspekt vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou. Metódy výroby substitučných mutácií vo vopred určených miestach v DNA so známou sekvenciou sú v oblasti dobre známe, napr. prostredníctvom Ml3 primerovej mutagenézy. Pozri aj Sambrook, a ďalší (1989) a Ausubel a ďalší (1987 a periodické dodatky). Výnimočne užitočnými konštruktmi budú extraceluláme časti DCRS5 asociované s IL-12Rpi segmentmi.

Mutácie v DNA by normálne nemali posunúť kódujúce sekvencie mimo čítacích rámcov a výhodne netvoria komplementárne oblasti, ktoré by mohli hybridizovať a tak vytvárať sekundárnu mRNA štruktúru, ako napríklad slučky alebo vlásenky.

Fosforamidová metóda, opísaná v Beaucage a Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862, bude produkovať vhodné syntetické DNA fragmenty. Dvojvláknový fragment sa často bude získavať buď syntetizo15 vaním komplementárneho vlákna a vzájomným anelovaním vlákien v príslušných podmienkach, alebo pridaním komplementárneho vlákna použitím DNA polymerázy s vhodnou primérovou sekvenciou.

Pri mutagenéze sa často aplikujú techniky polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Alternatívne sú obvykle používanými metódami na generovanie definovaných mutácií vo vopred určených miestach mutagenizačné priméry. Pozri napr. Innis, a ďalší (vyd. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA; a Dieffenbach a Dveksler (1995; eds.) PCR Primér: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY.

Určité uskutočnenia vynálezu sa týkajú kombinácie prostriedkov, ktoré obsahujú opísané receptorové sekvencie. V iných uskutočneniach sa môžu spojiť fúnkčné časti sekvencii, aby kódovali fúzované proteíny. V iných formách môžu byť substituované varianty opísaných sekvencii.

IV. Proteíny, peptidy

Ako je opísané, predložený vynález zahŕňa primátovú DCRS5, napr. DCRS5, ktorej sekvencie sú uvedené v tabuľke 1 a opísané skôr. Zahrnuté sú aj alelické a iné varianty, vrátane napr. fúzovaných proteínov kombinujúcich časti takýchto sekvencii s inými, vrátane napr. IL-12Κβ 1, epitopových príveskov a funkčných domén.

Predložený vynález poskytuje aj rekombinantné proteíny, napr. heterológne fúzované proteíny použitím segmentov týchto primátových alebo hlodavčích proteínov. Heterológnym fúzovaným proteínom je fúzia proteínov alebo segmentov, ktoré prirodzene nie sú normálne fúzované rovnakým spôsobom. Takže fúzovaný produkt DCRS5 s iným cytokínovým receptorom je kontinuálnou proteínovou molekulou, ktorá má sekvencie fúzované v typickej peptidovej väzbe, typicky vyrobenou ako jeden translačný produkt a majúcou vlastnosti, akými sú napr. sekvencia alebo antigénnosť, odvodené od každého zdrojového peptidu. Podobný koncept sa aplikuje na heterológne nukleokyselinové sekvencie. Poskytnuté sú aj kombinácie rôznych určených proteínov.

Okrem toho môžu byť vyrobené nové konštrukty z kombinácie podobných funkčných alebo štrukturálnych domén z iných príbuzných proteínov, napr. cytokínových receptorov alebo zvončekovitých receptorov, vrátane druhových variantov. Napríklad, ligand viažuce alebo iné segmenty sa môžu vymieňať medzi rôznymi novými fúzovanými polypeptidmi alebo fragmentmi. Pozri napr. Cunningham, a ďalší (1989) Science 243: 1330-1336; a O'Dowd, a ďalší (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992, pričom obe publikácie sú tu zahrnuté prostredníctvom ich citácie. Takže výsledkom funkčného spojenia receptor-viažucich špecificít budú nové chiméme polypeptidy majúce nové kombinácie špecificít. Napríklad, ligand viažuce domény z iných príbuzných receptorových molekúl sa môžu pridať alebo substituovať inými doménami tohto alebo príbuzných proteínov. Výsledný protein bude mať často hybridnú funkciu a vlastnosti. Napríklad, fúzovaný protein môže zahŕňať zameriavaciu doménu, ktorá môže slúžiť na poskytnutie sekvestrovania fúzovaného proteínu na konkrétnu subcelulámu organelu.

Kandidátski fúzovací partneri a sekvencie sa môžu vybrať z rôznych sekvenčných databáz, napr. GenBank, c/o IntelliGenetics, Mountain View, CA; a BCG, University of Wisconsin Biotechnology Computing Group, Madison, WI, ktoré sú tu zahrnuté prostredníctvom ich citácie. Výnimočne výhodné sú najmä kombinácie polypeptidových sekvencii uvedených v tabuľkách 1 a 3. Variantové formy proteínov sa môžu substituovať v opísaných kombináciách.

Predložený vynález poskytuje najmä muteíny, ktoré viažu cytokínom podobné ligandy a/alebo ktoré sa podieľajú na prenose signálu. Štrukturálne porovnanie ľudskej DCRS5 s inými členmi cytokínovej receptorovej rodiny ukazuje konzervované znaky/zvyšky. Pozri tabuľku 3. Porovnanie ľudskej DCRS5 sekvencie s inými členmi cytokínovej receptorovej rodiny indikuje rôzne spoločne zdieľané štrukturálne a fúnkčné znaky. Pozri aj Bazan a ďalší (1996) Náture 379: 591; Lodi a ďalší (1994) Science 263: 1762-1766; Sayle a Milner-White (1995) TIBS 20: 374-376; a Gronenberg a ďalší (1991) Protein Engineering 4: 263-269.

Výnimočne výhodné sú substitúcie buď s myšacími sekvenciami, alebo s ľudskými sekvenciami. Naopak, konzervatívne substitúcie mimo ligand viažucich interakčných oblastí budú pravdepodobne zachovávať väčšinu signalizačných aktivít; a konzervatívne substitúcie mimo vnútrobunkových domén budú pravdepodobne zachovávať väčšinu ligand viažucich vlastností.

„Deriváty“ primátovej DCRS5 zahŕňajú aminokyselinové sekvenčné mutanty, glykozylačné varianty, metabolické deriváty a kovalentná alebo agregačné konjugáty s inými chemickými skupinami. Kovalentné deriváty sa môžu pripraviť pripojením funkčných skupín na skupiny, ktoré sa nachádzajú v DCRS5 aminokyselinových bočných reťazcoch alebo na N-konci, napr. prostriedkami, ktoré sú v oblasti dobre známe. Tieto deriváty môžu zahŕňať, bez obmedzenia, alifatické estery alebo amidy karboxylového konca alebo zvyškov obsahujúcich karboxylové vedľajšie reťazce, O-acylové deriváty zvyškov obsahujúcich hydroxylovú skupinu a N-acylové deriváty amino-koncovej aminokyseliny alebo zvyškov obsahujúcich amino skupinu, napr. lyzínu alebo arginínu. Acylové skupiny sú vybrané zo skupiny alkylových skupín, vrátane C3 až C18 normálneho alkylu, čím sa vytvárajú alkanol aroylové druhy.

Zahrnuté sú najmä glykozylačné zmeny, napr. vyrobené modifikáciou glykozylačných vzorov polypeptidu v priebehu jeho syntézy a spracovania, alebo v ďalších procesných krokoch. Výnimočne výhodnými prostriedkom na uskutočňovanie týchto glykozylačných zmien je vystavenie polypeptidu glykozylačným enzýmom izolovaným z buniek, ktoré normálne poskytujú takéto spracovávanie, napr. cicavčím glykozylačným enzýmom. Do úvahy prichádzajú aj deglykozylačné enzýmy. Zahrnuté sú aj verzie rovnakej primárnej aminokyselinovej sekvencie, ktorá má iné minoritné modifikácie vrátane fosforylovaných aminokyselinových zvyškov, napr. fosfotyrozínu, fosfoserínu alebo fosfotreonínu.

Hlavnou skupinou derivátov sú kovalentné konjugáty receptorov alebo ich fragmentov s inými proteínmi alebo polypeptidmi. Tieto deriváty je možné syntetizovať v rekombinantnej kultúre, ako N-koncové fúzie alebo použitím činidiel známych v oblasti, ktoré sú užitočné na prepájanie proteínov prostredníctvom reaktívnych bočných skupín. Výhodnými derivatizačnými miestami s prepájacími činidlami sú voľné aminoskupiny, uhľovodíkové skupiny a cysteínové zvyšky.

Poskytnuté sú aj fúzované polypeptidy medzi receptormi a inými homologickými alebo heterologickými proteínmi. Homologickými polypeptidmi môžu byť fúzie medzi rozličnými receptormi, čoho výsledkom je napríklad hybridný proteín majúci väzobnú špecificitu pre viaceré rozličné cytokínové ligandy, alebo receptor, ktorý môže mať širšiu alebo slabšiu špecificitu substrátového účinku. Podobne sa môžu skonštruovať hetero logne fúzie, ktoré by mali kombináciu vlastností alebo aktivít derivovaných proteínov. Typickými príkladmi sú fúzie reporterového polypeptidu, napr. luciferázy, so segmentom alebo doménou receptora, napr. ligand-viažucim segmentom, takže sa môže jednoducho určiť prítomnosť alebo lokalizácia požadovaného ligandu. Pozri napr. Duli a ďalší US patent č. 4859609, ktorý tuje zahrnutý prostredníctvom jeho citácie. Iní génoví fuzovací partneri zahŕňajú glutatión-S-transferázu (GST), bakteriálnu β-galaktozidázu, trpE, proteín A, β-laktamázu, alfa amylázu, alkohol dehydrogenázu a kvasinkový alfa párovací faktor. Pozri napr. Godowski a ďalší (1988) Science 241: 812-816. Značené proteíny budú často substituované v opísaných kombináciách proteínov. Asociácie DCRS5 s IL-12Rβl sú výnimočne významné, ako je opísané.

Fosforamidovým spôsobom, opísaným v Beaucage a Carruthers (1981) Tetra, Letts. 22: 1859-1862, sa budú produkovať vhodné syntetické DNA fragmenty. Dvojvláknový fragment sa bude často získavať buď syntetizovaním komplementárneho reťazca a anelovaním reťazcov v príslušných podmienkach, alebo pridaním komplementárneho reťazca použitím DNA polymerázy s príslušnou primérovou sekvenciou.

Takéto polypeptidy môžu mať aj aminokyselinové zvyšky, ktoré boli chemicky modifikované fosforyláciou, sulfonáciou, biotinyláciou alebo pridaním alebo odstránením iných skupín, najmä skupín, ktoré majú tvar podobný s fosfátovými skupinami. V niektorých uskutočneniach budú modifikácie užitočnými značkovacími činidlami alebo budú slúžiť ako purifikačné ciele, napr. afinitné ligandy.

Fúzované proteíny budú typicky vyrábané buď rekombinantnými nukleokyselinovými metódami, alebo syntetickými polypeptidovými metódami. Techniky na manipuláciu nukleových kyselín a expresiu sú vo všeobecnosti opísané napríklad v Sambrook a ďalší (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vyd.), zv. 13, Cold Spring Harbor Laboratory, a Ausubel a ďalší (vyd. 1987 a periodické dodatky) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York, ktoré sú tu zahrnuté prostredníctvom ich citácie. Techniky na syntézu polypeptidov sú opísané napríklad v Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 21492156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; a Atherton a ďalší (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; pričom každá z týchto publikácií je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie. Pozri aj Dawson a ďalší (1994) Science 266: 776-779, kde sú uvedené spôsoby na výrobu väčších polypeptidov.

Tento vynález zahŕňa aj použitie derivátov DCRS5, ktorými nie sú len odchýlky v aminokyselinovej sekvencii alebo glykozylácii. Takéto deriváty môžu zahŕňať kovalentné alebo agregačné spojenie s chemickými skupinami. Tieto deriváty vo všeobecnosti spadajú do troch tried: (1) soli, (2) kovalentné modifikácie bočných reťazcov a terminálnych zvyškov a (3) adsorpčné komplexy, napr. s bunkovými membránami. Takéto kovalentné alebo agregačné deriváty sú užitočné ako imunogény, ako reakčné činidlá v imunologických testoch, alebo pri purifikačných metódach, ako napríklad pri afinitnej purifikácii receptora alebo inej viažucej molekuly, napr. protilátky. Cytokínový ligand môže byť napríklad imobilizovaný kovalentným naviazaním na tuhý podklad, ako napríklad kyanogén bromidom aktivovanú Sepharose, spôsobmi, ktoré sú v oblasti dobre známe, alebo adsorbovaním na polyolefinové povrchy, s alebo bez glutaraldehydovým krížovým naviazaním, na použitie v testoch alebo purifikácii cytokínového receptora, protilátok alebo iných podobných molekúl. Ligand môže byť značený aj s detegovateľnou skupinou, napr. rádioiodinačnou alebo chloraminovou T procedúrou, kovalentne naviazaný na zriedkavé zemské cheláty alebo konjugovaný s inou fluorescenčnou skupinou na použitie v diagnostických testoch.

Kombinácia, napr. obsahujúca DCRS5, podľa tohto vynálezu sa môže používať ako imunogén na produkciu antiséra alebo protilátok špecifických, napr. schopných rozlíšiť medzi inými členmi cytokínovej receptorovej rodiny, pre opísané kombinácie. Komplexy sa môžu použiť na skrínovanie monoklonálnych protilátok alebo antigén-viažucich fragmentov pripravených imunizáciou s rôznymi formami nečistých prípravkov obsahujúcich proteín. Konkrétne, výraz „protilátky“ zahŕňa aj antigén viažuce fragmenty prirodzených proti17 látok, napr. Fab, Fab2, Fv atď. Purifikovaná DCRS5 sa môže použiť aj ako reakčné činidlo na detekciu protilátok generovaných pri odpovedi na prítomnosť zvýšených hladín expresie alebo pri imunologických poruchách, ktoré vedú k produkcii protilátok proti endogénnemu receptoru. Okrem toho, DCRS5 fragmenty môžu slúžiť aj ako imunogény na produkciu protilátok podľa predloženého vynálezu, ako je opísané hneď neskôr. Napríklad, tento vynález zahŕňa protilátky, ktoré majú väzobnú afinitu proti, alebo boli vyvolané proti aminokyselinovým sekvenciám uvedeným v tabuľke 1, ich fragmentom alebo rôznym homologickým peptidom. Tento vynález zahŕňa najmä protilátky, ktoré majú väzobnú afinitu proti, alebo boli vyvolané proti špecifickým fragmentom, o ktorých sa predpokladá, alebo ktoré v skutočnosti sú, vystavené na vonkajšom proteínovom povrchu prirodzenej DCSR5. Užitočné budú aj komplexy kombinácií proteínov a môžu sa proti nim vyrobiť protilátkové prípravky.

V určitých iných uskutočneniach rozpustné konštrukty, napr. extraceluláme Iigand viažuce segmenty DCRS5 s IL-12Rpi, môžu byť viažucimi kompozíciami pre Iigand a môžu byť užitočné buď ako ligandové antagonisty, alebo ako antigény na blokovanie ligandom sprostredkovanej signalizácie. Tak môžu byť užitočné buď na diagnostiku, napr. na histologické značenie ligandu, alebo terapeuticky, napr. ako antagonisty ligandu.

Blokovanie fyziologickej odpovede na receptorové ligandy môže byť výsledkom inhibície viazania ligandu na receptor, pravdepodobne prostredníctvom kompetitívnej inhibície. Takže in vitro testy podľa predloženého vynálezu budú často využívať protilátky alebo antigén viažuce segmenty týchto protilátok, rozpustné receptorové konštrukty alebo fragmenty pripojené na tuhé fázové substráty. Tieto testy umožnia aj diagnostickú determináciu buď účinkov mutácií a modifikácií v Iigand viažucej oblasti, alebo iných mutácií a modifikácií, napr. tých, ktoré ovplyvňujú signalizáciu alebo enzymatickú funkciu.

Tento vynález zahŕňa aj použitie kompetitívnych liekových skríningových testov, napr. testov, pri ktorých neutralizačné protilátky proti receptorovým komplexom alebo fragmentom súťažia s testovanou zlúčeninou pri viazaní sa na Iigand alebo inú protilátku. Týmto spôsobom sa neutralizačné protilátky alebo fragmenty môžu použiť na detegovanie prítomnosti polypeptidu, ktorý zdieľa jedno alebo viac viažucich miest pre receptor, a môžu byť použité aj na obsadenie väzobných miest na receptore, kde by sa inak mohol viazať ligand. Rozpustné receptorové konštrukty, v ktorých sú skombinované extraceluláme alebo Iigand viažuce domény DCRS5 s IL-12Rpi, môžu byť užitočnými antagonistami na kompetitívne viazanie p40/IL-B30 ligandu.

V. Vytváranie nukleových kyselín a proteínu

DNA, ktorá kóduje proteín alebo jeho fragmenty, sa môže získať chemickou syntézou, skríningom cDNA knižníc, alebo skríningom genomických knižníc pripravených zo širokého rozsahu bunkových línií alebo tkanivových vzoriek. Prirodzené sekvencie sa môžu izolovať použitím štandardných metód a tu poskytnutých sekvencii, napr. v tabuľke 1. Iné druhy náprotivkov sa môžu identifikovať hybridizačnými technikami alebo rôznymi PCR technikami v kombinácii s alebo prostredníctvom prehľadávania sekvenčných databáz, napr. GenBank.

Táto DNA sa môže exprimovať v širokom rozsahu hostiteľov, aby sa syntetizoval kompletný receptor alebo jeho fragmenty, ktoré naopak môžu byť použité napríklad na generovanie polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok; na väzobné štúdie; na konštrukciu a expresiu modifikovaných Iigand viažucich domén alebo kinázo/fosfatázových domén; a na štrukturálno-fúnkčné štúdie. Varianty fragmentov sa môžu exprimovať v hostiteľských bunkách, ktoré sú transformované alebo transfekované s príslušnými expresnými vektormi. Tieto molekuly môžu byť v podstate bez proteínových alebo bunkových kontaminantov, pričom to nie sú molekuly získané z rekombinantného hostiteľa, a preto sú výnimočne užitočné pre farmaceutické prostriedky, keď sa kombinujú s farmaceutický prijateľným nosičom a/alebo riedidlom. Proteín alebo jeho časti sa môžu exprimovať ako fúzie s inými proteínmi. Zaujímavé sú najmä kombinácie opísaných proteínov alebo nukleových kyselín, ktoré ich kódujú.

Expresné vektory sú typicky samostatne sa replikujúcimi DNA alebo RNA konštruktmi, ktoré obsahujú požadovaný receptorový gén, jeho fragmenty alebo kombinácie génov, zvyčajne operatívne pripojené na vhodné genetické riadiace elementy, ktoré sú rozoznávané vo vhodnej hostiteľskej bunke. Tieto riadiace elementy sú schopné ovplyvňovať expresiu vnútri vhodného hostiteľa. Viaceré gény sa môžu exprimovať koordinovane a môžu byť na polycistrónovej mediátorovej RNA. Špecifický typ riadiacich elementov nevyhnutných na uskutočnenie expresie bude závisieť od konkrétnej použitej hostiteľskej bunky. Vo všeobecnosti môžu genetické riadiace elementy zahŕňať prokaryotický promótorový systém alebo eukaryotický promótorový expresný riadiaci systém a typicky zahŕňajú transkripčný promótor, voliteľne operátor na riadenie nástupu transkripcie, transkripčné zosilňovače na zvýšenie úrovne mRNA expresie, sekvenciu, ktorá kódujú vhodné ribozóm viažuce miesto a sekvencie, ktoré ukončujú transkripciu a transláciu. Expresné vektory zvyčajne obsahujú aj počiatok replikácie, ktorý umožňuje, aby sa vektor replikoval nezávisle od hostiteľskej bunky.

Vektory podľa tohto vynálezu zahŕňajú vektory, ktoré obsahujú DNA kódujúcu kombináciu proteínov, ako bola opísaná, alebo biologicky aktívny ekvivalentný polypeptid. DNA môže byť riadená vírusovým promótorom a môže kódovať selekčný marker. Tento vynález ďalej zahŕňa použitie takýchto expresných vektorov, ktoré sú schopné exprimovať eukaryotické cDNAs kódujúce takéto proteíny v prokaryotickom alebo eukaryotickom hostiteľovi, pričom vektor je kompatibilný s hostiteľom a eukaryotické cDNAs sú začlenené do vektora takým spôsobom, aby sa pri pestovaní hostiteľa obsahujúceho vektor exprimovali dané cDNAs. Zvyčajne sú expresné vektory navrhnuté tak, aby sa stabilne replikovali v ich hostiteľských bunkách alebo aby sa značne amplifikoval celkový počet kópií požadovaného génu (génov) na bunku. Nieje vždy nevyhnutné požadovať, aby sa expresný vektor replikoval v hostiteľskej bunke, napr. je možné uskutočniť prechodnú expresiu proteínu alebo jeho fragmentov v rôznych hostiteľoch použitím vektorov, ktoré neobsahujú počiatok replikácie rozoznávaný hostiteľskou bunkou. Je možné použiť aj vektory, ktoré spôsobujú integráciu proteín kódujúcich častí do hostiteľskej DNA prostredníctvom rekombinácie.

Vektory, tak ako sa používajú tu, zahŕňajú plazmidy, vírusy, bakteriofágy, integrovateľné DNA fragmenty a iné vehikulá, ktoré umožňujú integráciu DNA fragmentov do genómu hostiteľa. Expresné vektory sú špecializované vektory, ktoré obsahujú genetické riadiace elementy, ktoré uskutočňujú expresiu operatívne pripojených génov. Plazmidy sú najbežnejšie používanou formou vektora, ale aj iné formy vektorov, ktoré majú ekvivalentnú funkciu, a ktoré sú, alebo sa stanú, známymi v oblasti, sú vhodné na použitie podľa tohto vynálezu. Pozri napr. Pouwels a ďalší (1985 a dodatky) Cloning Vectors; A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y., a Rodriguez a ďalší (vyd. 1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, pričom tieto publikácie sú tu zahrnuté prostredníctvom ich citácie.

Transformované bunky sú bunky, výhodne cicavčie, ktoré boli transformované alebo transfekované vektormi skonštruovanými použitím rekombinantných DNA techník. Transformované hostiteľské bunky zvyčajne exprimujú požadované proteíny, ale na účely klonovania, amplifikácie a manipulácie ich DNA nemusí exprimovať predmetné proteíny. Tento vynález ďalej zahŕňa kultiváciu transformovaných buniek vo vyživovacom médiu, čím sa umožňuje akumulácia proteínov. Tieto proteíny sa môžu izolovať buď z kultúry, alebo v niektorých prípadoch z kultivačného média.

Na účely tohto vynálezu sú nukleové sekvencie operatívne spojené, keď sú navzájom vo funkčnom vzťahu. Napríklad, DNA kódujúca presekvenciu alebo sekrečný vedúci peptid je operatívne spojená s polypeptidom, ak je exprimovaná ako preproteín alebo sa podieľa na smerovaní polypeptidu do bunkovej membrány, alebo na vylučovaní polypeptidu. Promótor je operatívne spojený s kódujúcou sekvenciou, ak riadi transkripciu polypeptidu. Ribozóm viažuce miesto je operatívne spojené s kódujúcou sekvenciou, ak je v polohe, ktorá umožňuje transláciu. Zvyčajne znamená operatívne spojený kontinuálny alebo v čítacom rámci, ale určité genetické elementy, ako napríklad represné gény, nie sú kontinuálne napojené, ale sa viažu na operátorové sekvencie, ktoré na druhej strane riadia expresiu.

Vhodné hostiteľské bunky zahŕňajú prokaryoty, nižšie eukaryoty a vyššie eukaryoty. Prokaryoty zahŕňajú gram negatívne a gram pozitívne organizmy, napr. E. coli a B. subtilis. Nižšie eukaryoty zahŕňajú kvasinky, napr. S. cerevisiae a Pichia a druhy rodu Dictyostelium. Vyššie eukaryoty zahŕňajú zavedené tkanivové bunkové línie zo živočíšnych druhov, tak necicavčieho pôvodu, napr. hmyzie bunky a vtáčie bunky, ako aj cicavčieho pôvodu, napr. ľudské, primátové a hlodavčie bunky.

Prokaryotické hostiteľské vektorové systémy zahŕňajú široký rozsah vektorov z mnohých rozličných druhov. Tak ako sa používa tu, E. coli a jej vektory budú používané genericky, aby boli zahrnuté ekvivalentné vektory používané v iných prokaryotoch. Reprezentatívnym vektorom na amplifikáciu DNA je pBR322 alebo mnohé jeho deriváty. Vektory, ktoré môžu byť používané na expresiu receptora alebo jeho fragmentov, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na vektory obsahujúce lac promótor (pUC série); trp promótor (pBR322 trp); Ipp promótor (pIN série); lambda pP alebo pR promótory (pOTS) alebo hybridné promótory, ako napríklad ptac (pDR540). Pozri Brosius a ďalší (1988) „Expression Vectors Employing Lambda, and Ipp derived Promoters“, vo Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, (vyd. Rodriguez and Denhardt), Buttersworth, Boston, Kapitola 10, str. 205-236, pričom tieto publikácie sú tu zahrnuté prostredníctvom ich citácie.

Nižšie eukaryoty, napr. kvasinky a Dictiostelium, môžu byť transformované s vektormi obsahujúcimi DCRS5 sekvenciu. Na účely tohto vynálezu je najbežnejším nižším eukaryotickým hostiteľom pekárenská kvasinka, Saccharomyces cerevisiae. Bude používaná ako všeobecný reprezentant nižších eukaryotov, hoci dostupných je aj množstvo iných kmeňov a druhov. Kvasinkové vektory typicky pozostávajú z počiatku replikácie (ak nejde o integratívny typ), selekčného génu, promótora, DNA kódujúcej receptor alebo jeho fragmenty a sekvencii na ukončenie translácie, polyadenyláciu a ukončenie transkripcie. Vhodné expresné vektory pre kvasinku zahŕňajú také konštitutívne promótory ako promótor 3 fosfoglycerát kinázového génu a promótory rôznych iných glykolytických enzýmových génov, alebo také inducibilné promótory, akými sú napríklad promótor alkohol dehydrogenázy 2 alebo metalotionínový promótor. Vhodné vektory zahŕňajú deriváty nasledujúcich typov: samostatne sa replikujúce s nízkym počtom kópií (ako napríklad YRp série), samostatne sa replikujúce s vysokým počtom kópií (ako napríklad YEp série); integratívne typy (ako napríklad YIp série) alebo mini chromozómy (ako napríklad YCp série).

Vyššie eukaryotické tkanivové kultivačné bunky sú normálne výhodnými hostiteľskými bunkami na expresiu funkčne aktívnych interleukínových alebo receptorových proteínov. V princípe sú použiteľné mnohé vyššie eukaryotické tkanivové kultúrne bunkové línie, napr. hmyzie bakulovírusové expresné systémy, či už z bezstavovcov alebo zo stavovcov. Výhodné sú však cicavčie bunky. Transformácia alebo transfekcia a šírenie takýchto buniek sa stali rutinným postupom. Príklady užitočných bunkových línií zahŕňajú HeLa bunky, vaječníkové bunkové línie z čínskeho škrečka (CHO), obličkové bunkové línie z mláďat potkanov (BRK), hmyzie bunkové línie, vtáčie bunkové línie a opičie (COS) bunkové línie. Expresné vektory pre takéto bunkové línie zvyčajne zahŕňajú počiatok replikácie, promótor, translačné iniciačné miesto, RNA zostrihové miesta (ak je použitá genomická DNA), polyadenylačné miesto a transkripčné terminačné miesto. Tieto vektory zvyčajne obsahujú aj selekčný gén alebo amplifikačný gén. Vhodnými expresnými vektormi môžu byť plazmidy, vírusy alebo retrovírusy nesúce promótory odvodené napr. z takých zdrojov, akými sú adenovírus, SV40, parvovírusy, vakcinia vírus alebo cytomegalovírus. Reprezentatívne príklady vhodných expresných vektorov zahŕňajú pCDNAl; pCD, pozri Okayama a ďalší (1985) Mol. Celí Biol. 5: 1136 1142; pMClneo PolyA, pozri Thomas a ďalší (1987) Celí 51: 503 512; a bakulovírusový vektor, ako napríklad pAC 373 alebo pAC 610.

Pre vylučované proteíny a niektoré membránové proteíny otvorený čítací rámec zvyčajne kóduje polypeptid, ktorý pozostáva zo zrelého alebo vylučovaného produktu kovalentne pripojeného na svojom N-konci na signálny peptid. Signálny peptid sa odštepuje pred vylúčením zrelého alebo aktívneho polypeptidu. Štiepne miesto je možné predpokladať s vysokým stupňom presnosti na základe empirických pravidiel, napr. vonHeijne (1986) Nucleic Acids Research 14: 4683-4690 a Nielsen a ďalší (1997) Protein Eng. 10: 1-12, a presné aminokyselinové zloženie signálneho peptidu sa často nejaví ako dôležité pre jeho funkciu, napr. Randall a ďalší (1989) Science 243: 1156-1159; Kaiser a ďalší (1987) Science 235: 312-317. Zrelé proteíny podľa vynálezu sa môžu jednoducho determinovať použitím štandardných metód.

Často bude potrebné exprimovať tieto polypeptidy v systéme, ktorý poskytuje špecifický alebo definovaný glykozylačný vzor. V tom prípade bude zvyčajným vzorom ten, ktorý je prirodzene poskytovaný expresným systémom. Ale vzor bude modifikovateľný vystavením polypeptidu, napr. neglykozylovanej formy, príslušným glykozylačným proteínom začleneným do heterologického expresného systému. Napríklad, receptorový gén môže byť ko-transformovaný s jedným alebo viacerými génmi kódujúcimi cicavčie alebo iné glykozylačné enzýmy. Použitím tohto prístupu budú cicavčie glykozylačné vzory dosiahnuteľné v prokaryotoch alebo v iných bunkách. Expresia v prokaryotických bunkách bude typicky viesť k neglykozylovaným formám proteínu.

Zdrojom DCRS5 môže byť eukaryotický alebo prokaryotický hostiteľ exprimujúci rekombinantnú DCRS5, ako je opísané. Zdrojom môže byť aj bunková línia, ale aj iné cicavčie bunkové línie sú zahrnuté týmto vynálezom, pričom výhodná bunková línia je humánna.

Keď sú už známe sekvencie, primátová DCRS5, jej fragmenty alebo deriváty môžu byť pripravené konvenčnými postupmi na syntézu peptidov. Tieto zahŕňajú procesy, ktoré sú opísané napríklad v Stewart a Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky a Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York; a Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York; pričom všetky tieto publikácie sú tu zahrnuté prostredníctvom ich citácie. Použitý môže byť napríklad azidový proces, proces s kyselinou chlorovodíkovou, proces s anhydridom kyseliny, zmiešaný anhydridový proces, proces s aktívnym esterom (napríklad p-nitrofenyl esterom, jV-hydroxysukcinimidovým esterom alebo kyanometyl esterom), karbodiimidazolový proces, oxidačno-redukčný proces alebo dicyklohexylkarbodiimid (DCCD) aditívny proces. Na uvedené procesy sú aplikovateľné tak syntéza na tuhej fáze, ako aj syntéza v roztoku. Podobné techniky môžu byť použité s čiastočnými DCRS5 sekvenciami.

DCRS5 proteíny, fragmenty alebo deriváty sa vhodne pripravujú v súlade s uvedenými procesmi, ktoré sa typicky využívajú na peptidovú syntézu, vo všeobecnosti buď prostredníctvom takzvaného postupného procesu, ktorý zahŕňa kondenzovanie aminokyseliny s koncovou aminokyselinou, jednu po druhej, ako nasledujú v sekvencii, alebo pripájaním peptidových fragmentov na terminálnu aminokyselinu. Aminokyseliny, ktoré sa nemajú použiť v pripájacej reakcii, musia byť typicky chránené, aby sa zabránilo pripojeniu v nesprávnej lokalite.

Ak sa používa syntéza na tuhej fáze, C-koncová aminokyselina sa naviaže na nerozpustný nosič alebo podklad prostredníctvom svojej karboxylovej skupiny. Nerozpustný nosič nie je nijako zvlášť limitovaný, pokiaľ má väzobnú schopnosť proti reaktívnej karboxylovej skupine. Príklady takýchto nerozpustných nosičov zahŕňajú halogénmetylové živice, fenolové živice, íerc-alkyloxykarbonyl-hydrazinované živice a podobne.

Aminoskupinou chránená aminokyselina sa naväzuje do sekvencie prostredníctvom kondenzácie aktivovanej karboxylovej skupiny a reaktívnej amino-skupiny predtým vytvoreného peptidu alebo reťazca, aby sa syntetizoval peptid krok za krokom. Po syntetizovaní kompletnej sekvencie sa peptid oddelí od nerozpustné20 ho nosiča, aby sa vyprodukoval peptid. Tento prístup na tuhej fáze je všeobecne opísaný v Merrifíeld a ďalší (1963) v J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 2156, pričom táto publikácia je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie.

Pripravený proteín a jeho fragmenty sa môžu izolovať a purifikovať z reakčnej zmesi prostredníctvom peptidovej separácie, napr. extrakciou, precipitáciou, elektroforézou, rôznymi formami chromatografie, prostredníctvom imunoafinity a podobne. Receptory podľa tohto vynálezu sa môžu získať v rôznych stupňoch čistoty v závislosti od požadovaných použití. Purifikácia sa môže uskutočňovať použitím tu opísaných proteínových purifikačných techník, pozri neskôr, alebo použitím tu opísaných protilátok v spôsoboch imunoabsorpčnej afinitnej chromatografie. Táto imunoabsorpčná afinitná chromatografia sa uskutočňuje tak, že sa najprv pripoja protilátky na tuhý podklad, a potom sa pripojené protilátky uvádzajú do kontaktu so solubilizovanými lyzátmi príslušných buniek, lyzátmi iných buniek exprimujúcich receptor alebo lyzátmi alebo supematantmi buniek produkujúcich proteín ako výsledok DNA techník, pozri neskôr.

Vo všeobecnosti bude purifikovaný proteín čistý aspoň na približne 40 %, obvykle bude čistý aspoň na približne 50 %, zvyčajne bude čistý aspoň na približne 60 %, typicky bude čistý aspoň na približne 70 %, typickejšie bude čistý aspoň na približne 80 %, výhodne bude čistý aspoň na približne 90 % a výhodnejšie bude čistý aspoň na približne 95 % a vo výhodných uskutočneniach bude čistý na 97 % až 99 % alebo viac. Čistota bude zvyčajne vzťahovaná na hmotnosť, ale môže byť vzťahovaná aj na molové množstvo. Aplikované budú rozličné testy, podľa toho, ako to bude vhodné. Purifikované môžu byť individuálne proteíny a potom sa môžu kombinovať.

VI. Protilátky

Protilátky môžu byť vyvolané proti rôznym cicavčím, napr, primátovým DCRS5 proteínom a ich fragmentom, tak v prirodzene sa vyskytujúcich natívnych formách, ako aj v ich rekombinantných formách, pričom rozdielom je, že protilátky proti aktívnemu receptoru s väčšou pravdepodobnosťou rozoznávajú epitopy, ktoré sú prítomné len v natívnych konformáciách. Zahrnuté sú aj protilátky, ktoré rozoznávajú epitopy prezentované kombináciou, napr. funkčnou, DCRS5 s 1L-12RP1. Detekcia denaturovaného antigénu môže byť užitočná napr. vo Western analýze. Zahrnuté môžu byť aj anti-idiotypové protilátky, ktoré by boli užitočné ako agonisty alebo antagonisty prirodzeného receptora alebo protilátky.

Protilátky, vrátane viažucich fragmentov a jednoreťazcových verzií, proti vopred určeným fragmentom proteínu sa môžu vyvolať imunizáciou zvierat konjugátmi fragmentov s imunogénnymi proteínmi. Monoklonálne protilátky sa pripravujú z buniek vylučujúcich požadovanú protilátku. Tieto protilátky môžu byť skrínované z hľadiska väzby na normálny alebo defektný proteín, alebo môžu byť skrinované z hľadiska agonistickej alebo antagonistickej aktivity. Tieto mono-klonálne protilátky sa zvyčajne budú viazať s hodnotou KD aspoň približne 1 mM, zvyčajnejšie aspoň približne 300 μΜ, typicky aspoň približne 100 μΜ, typickejšie aspoň približne 30 μΜ, výhodne aspoň približne 10 μΜ a výhodnejšie aspoň približne 3 μΜ alebo lepšou.

Protilátky, vrátane antigén viažucich fragmentov, podľa tohto vynálezu môžu mať významnú diagnostickú alebo terapeutickú hodnotu. Môžu byť účinnými antagonistami, ktoré sa viažu na receptor a inhibujú viazanie ligandu alebo inhibujú schopnosť receptora vyvolať biologickú odpoveď, napr. účinok na jeho substrát. Môžu byť užitočné aj ako nie neutralizačné protilátky a môžu byť spojené s toxínmi alebo rádionuklidmi, aby sa viazali na produkujúce bunky alebo bunky lokalizované v zdroji interleukínu. Okrem toho, tieto protilátky môžu byť konjugované s liekmi alebo inými terapeutickými činidlami, buď priamo, alebo nepriamo, prostredníctvom spojovníka.

Protilátky podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné aj na diagnostické aplikácie. Ako zachytávacie alebo nie neutralizačné protilátky by sa mohli viazať na receptor bez inhibovania viazania ligandu alebo substrátu. Ako neutralizačné protilátky môžu byť užitočné v kompetitívnych väzobných testoch. Budú užitočné aj na detegovanie alebo kvantifikáciu ligandu. Môžu byť použité ako reakčné činidlá pre Western blot analýzu alebo na imunoprecipitáciu alebo imunopurifikáciu zodpovedajúceho proteínu. Podobne, nukleové kyseliny a proteíny môžu byť imobilizované na tuhých substrátoch na afinitnú purifikáciu alebo detekčné metódy. Substrátmi môžu byť napr. tuhé živicové guľôčky alebo plastické fólie.

Proteínové fragmenty môžu byť pripojené na iné materiály, najmä polypeptidy, a to ako fúzované alebo ako kovalentne pripojené polypeptidy na použitie ako imunogény. Cicavčie cytokínové receptory a fragmenty môžu byť fúzované alebo kovalentne pripojené na rôzne imunogény, ako napríklad hemocyanín zo svätojánskej mušky, hovädzí sérový albumín, tetanus toxoid atď. Spôsoby na prípravu polyklonálnych antisér pozri Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper a Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; a Williams a ďalší (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, zv. 1, Academic Press, New York; pričom každá publikácia je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie. Typický spôsob zahŕňa hyperimunizáciu zvieraťa s antigénom. Krátko po opakovaných imunizáciách sa potom odoberie krv zo zvieraťa a izoluje sa gama globulín.

V niektorých prípadoch je želateľné pripraviť monoklonálne protilátky z rôznych cicavčích hostiteľov, ako napríklad myší, hlodavcov, primátov, ľudí atď. Opis techník na prípravu takýchto monoklonálnych protilátok je možné nájsť napr. v Stites a ďalší (vyd.) Basic and Clinical Immunology (4. vyd.), Lange Medical

Publications, Los Altos, CA, a tam citované referencie; Harlow a Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. vyd.) Academic Press, New York; a najmä v Kohler a Milstein (1975) v Náture 256: 495 497, kde sa diskutuje jeden spôsob generovania monoklonálnych protilátok. Každá z týchto publikácií je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie. Stručne zhrnuté, tento spôsob zahŕňa injekčné podanie imunogénu zvieraťu. Zviera sa potom usmrtí a odoberú sa bunky zo sleziny, ktoré sa potom fuzujú s myelómovými bunkami. Výsledkom je hybridná bunka alebo „hybridom“, ktorý je schopný reprodukovať sa in vitro. Populácia hybridómov sa potom skrínuje, aby sa izolovali jednotlivé klony, z ktorých každý vylučuje jediný druh protilátky proti imunogénu. Pri tomto spôsobe sú získané individuálne protilátkové druhy produktmi imortalizovaných a klonovaných jedných B buniek z imúnneho zvieraťa, ktoré sú generované ako odpoveď proti špecifickému miestu rozoznávanému na imunogénnej látke.

Iné vhodné techniky zahŕňajú in vitro vystavenie lymfocytov antigénnym polypeptidom alebo alternatívne, selekciu z knižníc protilátok vo fágových alebo podobných vektoroch. Pozri Huse a ďalší (1989) „Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda“, Science 246: 1275-1281; a Ward a ďalší (1989) Náture 341: 544-546, pričom každá z týchto publikácií je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie. Polypeptidy a protilátky podľa predloženého vynálezu môžu byť používané s alebo bez modifikácie, vrátane chimémych alebo humanizovaných protilátok. Často budú polypeptidy a protilátky značené prostredníctvom ich pripojenia, buď kovalentného, alebo nekovalentného, na látku, ktorá poskytuje detegovateľný signál. Známych je veľké množstvo značiek a konjugačných techník a sú zverejnené tak vo vedeckej, ako aj v patentovej literatúre. Vhodné značky zahŕňajú rádionuklidy, enzýmy, substráty, kofaktory, inhibítory, fluorescenčné skupiny, chemiluminiscentné skupiny, magnetické častice a podobne. Patenty opisujúce použitie takýchto značiek zahŕňajú US patenty č: 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 a 4366241. Produkované môžu byť aj rekombinantné a chiméme imunoglobulíny, pozri Cabilly, US patent č. 4816567; alebo môžu byť vytvárané v transgénnych myšiach, pozri Mendez a ďalší (1997) Náture Genetics 15: 146-156. Tieto publikácie sú tu zahrnuté prostredníctvom ich citácií.

Protilátky podľa tohto vynálezu môžu byť použité aj na afinitnú chromatografiu na izoláciu DCRS5 proteínov alebo peptidov. Môžu sa pripraviť kolóny, v ktorých budú protilátky pripojené na tuhý podklad, napr. častice, ako agaróza, Sephadex alebo podobne, pričom bunkový lyzát môže prechádzať cez kolónu, ktorá sa potom premyje, nasledujú zvyšujúce sa koncentrácie mierneho denaturačného činidla, čím sa uvoľní purifikovaný proteín. Alternatívne sa proteín môže použiť na purifikáciu protilátky. Aplikovať sa môžu príslušné krížové absorpcie alebo vyčerpania.

Protilátky môžu byť použité na skríning expresných knižníc na konkrétne expresné produkty. Zvyčajne, protilátky používané v takomto postupe budú značené so skupinou umožňujúcou jednoduchú detekciu prítomnosti antigénu prostredníctvom viazania protilátky.

Protilátky vyvolané proti cytokínovému receptoru budú použité aj na vyvolanie anti-idiotypových protilátok. Tieto budú užitočné na detegovanie alebo diagnostiku rôznych imunologických stavov súvisiacich s expresiou proteínu alebo buniek, ktoré exprimujú proteín. Budú užitočné aj ako agonisty alebo antagonisty ligandu, ktoré môžu byť kompetitívnymi receptorovými inhibítormi alebo môžu nahradiť prirodzene sa vyskytujúce ligandy. Určité protilátky proti receptorovým podjednotkám alebo kombinácie môžu slúžiť ako aktivačné protilátky, ktoré môžu ovplyvňovať signalizáciu, a tým slúžiť napr. ako agonisty ligandu.

Cytokínový receptorový proteín, ktorý sa špecificky viaže na, alebo ktorý špecificky imunologický reaguje s protilátkou generovanou proti definovanému imunogénu, ako napríklad imunogénu pozostávajúcemu z aminokyselinovej sekvencie označenej ako sekv. č. 2, sa typicky determinuje v imunoteste. Imunotest typicky využíva polyklonálne antisérum, ktoré bolo vyvolané napr. proti proteínu so sekv. č. 2. Toto antisérum je vybrané tak, aby malo nízku krížovú reaktivitu proti iným členov cytokínovej receptorovej rodiny, napr. IL-12Rp2 receptorovej pod-jednotke alebo IL-6 receptorovej podjednotke gpl30, výhodne z rovnakých druhov, a akákoľvek takáto krížová reaktivita je odstránená imunoabsorpciou pred použitím imunotestu.

Na to, aby sa produkovalo antisérum na použitie v imunoteste, sa proteín, napr. so sekv. č. 2, izoluje ako je tu opísané. Rekombinantný proteín sa napríklad môže produkovať v cicavčej bunkovej línii. Vhodný hostiteľ, napr. inbredný kmeň myší, ako napr. Balb/c, sa imunizuje s vybraným proteínom, typicky použitím štandardného adjuvans, ako napríklad Freundovho adjuvans, a podľa štandardného imunizačného protokolu pre myši (pozri Harlow a Lane, suprá). Alternatívne sa ako imunogén môže použiť syntetický peptid odvodený od tu opísaných sekvencii a konjugovaný s nosičovým proteínom. Polyklonálne séra sa izolujú a titrujú proti imunogénnemu proteínu v imunoteste, napr. imunoteste v tuhom skupenstve s imunogénom imobilizovaným na tuhom podklade. Polyklonálne antiséra s titrom 10⁴ alebo vyšším sa selektujú a testujú z hľadiska ich krížovej reaktivity proti iným členom cytokínovej receptorovej rodiny, napr. gpl30 alebo IL-12Rp 1 použitím kompetitívneho väzobného imunotestu, ako napríklad testu opísaného v Harlow a Lane, supra, na stranách 570-573. Na toto stanovovanie sa výhodne používajú aspoň dvaja členovia cytokínovej receptorovej rodiny. Títo členovia cytokínovej receptorovej rodiny sa môžu produkovať ako rekombinantné proteíny a môžu sa izolovať použitím štandardných techník molekulovej biológie alebo proteínovej chémie, ktoré sú tu opísané.

Na stanovenie krížovej reaktivity sa môžu použiť imunotesty vo forme kompetitívneho viazania. Napríklad, protein so sekv. č. 2 sa môže imobilizovať na tuhom podklade. Proteíny pridávané do testu konkurujú viazaniu antisér na imobilizovaný antigén. Schopnosť uvedených proteínov konkurovať viazaniu antisér na imobilizovaný protein sa porovnáva s proteínmi, napr. gpl30 alebo IL-12Κβ 1. Percento krížovej reaktivity pre uvedené proteíny sa vypočítava použitím štandardných výpočtov. Tie antiséra, ktoré majú menej ako 10 % krížovú reaktivitu s každým z uvedených proteínov, sa vyberú a spoja. Krížovo reagujúce protilátky sa potom odstránia zo spojených antisér imunoabsorpciou s uvedenými proteínmi.

Imunoabsorbované a spojené antiséra sa potom použijú v kompetičných väzobných imunotestoch, ako je opísané, aby sa porovnal druhý protein s imunogénnym proteínom (napr. proteínom podobným s DCRS5 so sekv. č. 2). Na uskutočnenie tohto porovnania sa každý z týchto dvoch proteínov testuje v širokom rozsahu koncentrácií a determinuje sa množstvo každého proteínu potrebné na 50 % inhibíciu viazania antisér na imobilizovaný protein. Ak je potrebné množstvo druhého proteínu menej ako dvojnásobkom množstva proteínu z vybraného proteínu alebo proteínov, ktoré sú potrebné, potom sa o druhom proteíne hovorí, že sa špecificky viaže na protilátku generovanú proti imunogénu.

Je pochopiteľné, že tieto cytokínové receptorové proteíny sú členmi rodiny homologických proteínov, ktoré obsahujú mnohé identifikované gény. Pre konkrétny génový produkt, ako napríklad DCRS5, výraz označuje nielen tu opísané aminokyselinové sekvencie, ale aj iné proteíny, ktoré sú alelické, nealelické alebo sú druhovými variantmi. Je tiež zrejmé, že výrazy zahŕňajú neprirodzené mutácie zavádzané zámerným mutovaním použitím obvyklej rekombinantnej technológie, ako napríklad jednomiestnej mutácie, alebo vystrihnutím krátkych sekcií DNA kódujúcej príslušné proteíny, alebo substitúciou nových aminokyselín, alebo pridaním nových aminokyselín. Pri takýchto minoritných zmenách sa typicky bude v podstate zachovávať imunoidentita pôvodnej molekuly a/alebo jej biologická aktivita. Takže tieto zmeny zahŕňajú proteíny, ktoré špecificky imunologický reagujú s určeným prirodzene sa vyskytujúcim DCRS5 proteínom. Biologické vlastnosti zmenených proteínov je možné determinovať prostredníctvom expresie proteínu vo vhodnej bunkovej línii a meraním príslušného účinku, napr. na transfekované lymfocyty. Konkrétne proteínové modifikácie, ktoré sú považované za minoritné, by zahŕňali konzervatívnu substitúciu aminokyselín s podobnými chemickými vlastnosťami, ako je opísané pre cytokínovú receptorovú rodinu ako celok. Optimálnym zosúladením proteínu s proteínom z cytokínových receptorov a použitím tu opísaných obvyklých imunotestov na determináciu imunoidentity je možné určiť proteínové zloženie podľa vynálezu.

Okrem toho, protilátky proti receptorovým podjednotkám môžu slúžiť na priestorové blokovanie viazania sa ligandu na funkčný receptor. Takéto protilátky môžu byť vyvolané buď proti samostatnej podjednotke, alebo proti kombinácii DCRS5 s ΙΕ-12Κβ1. Výsledkom by boli protilátkové antagonisty.

VII. Kity, diagnostika a kvantifikácia

Pre kity a testovacie metódy sú užitočné tak prirodzene sa vyskytujúce, ako aj rekombinantné formy molekúl podobných cytokínovým receptorom podľa vynálezu. Napríklad, tieto spôsoby by sa mohli aplikovať na skríning väzobnej aktivity napr. ligandov proti týmto proteínom. V súčasnosti bolo vyvinutých niekoľko automatizovaných testov, ktoré umožňujú skríning desiatok tisíc zlúčenín ročne. Pozri napr. B1OMEK automated workstation, Beckman Instruments, Palo Alto, Califomia, a Fodor a ďalší (1991) Science 251: 767-773, pričom tieto publikácie sú tu zahrnuté prostredníctvom ich citácie. Druhá publikácia opisuje prostriedok na testovania viazania sa rôznych definovaných polymérov syntetizovaných na tuhom substráte. Vývoj vhodných testov na skríning ligandových alebo agonistových/-antagonistových homologických proteínov môže byť značne uľahčený dostupnosťou veľkých množstiev purifikovaných, rozpustných cytokínových receptorov v aktívnom stave, ako napríklad takých, ktoré sú poskytnuté týmto vynálezom.

Purifikovaná DCRS5 sa môže naniesť priamo na platne na použitie v uvedených ligandových skríningových technikách. Ale, nie neutralizačné protilátky proti týmto proteínom môžu byť použité ako zachytávacie protilátky na imobilizáciu príslušného receptora na tuhej fáze, čo je užitočné napr. pri diagnostických použitiach.

Tento vynález zahŕňa použitie DCRS5, jej fragmentov, peptidov a ich fúzovaných produktov v rôznych diagnostických kitoch a spôsoboch na detekciu prítomnosti proteínu alebo jeho ligandu. Alternatívne alebo okrem toho, môžu byť v kitoch a spôsoboch zahrnuté protilátky proti molekulám. Typicky bude mať kit kompartment obsahujúci buď DCRS5 peptid, alebo génový segment, alebo reakčné činidlo, ktoré rozoznáva jedno alebo druhé. Typicky, rozoznávacími reakčnými činidlami by boli v prípade peptidu receptor alebo protilátka, alebo v prípade génového segmentu, by to zvyčajne bola hybridizačná sonda. Iné komponenty kitu môžu zahŕňať iné proteíny alebo reakčné činidlá príbuzné s p40, IL-B30 alebo ΙΕ-12Κβ1 polypeptidmi ligand/receptorového párovania.

Výhodný kit na determináciu koncentrácie DCRS5 vo vzorke by typicky obsahoval značenú zlúčeninu, napr. ligand alebo protilátku, so známou väzobnou afinitou proti DCRS5, zdroj DCRS5 (prirodzene sa vyskytujúci alebo rekombinantný), ako pozitívnu kontrolu, a prostriedok na separáciu naviazanej od voľnej značenej zlúčeniny, napríklad tuhú fázu na imobilizáciu DCRS5 v testovanej vzorke. Normálne budú poskyt23 nuté kompartmenty obsahujúce reakčné činidlá a inštrukcie. Poskytnuté sú aj kity obsahujúce príslušnú nukleovú kyselinu alebo proteín.

Protilátky, vrátane antigén viažucich fragmentov, špecifické pre cicavčiu DCRS5 alebo peptidový fragment, alebo receptorové fragmenty sú užitočné na diagnostické aplikácie na detegovanie prítomnosti zvýšených hladín ligandu a/alebo jeho fragmentov. Diagnostické testy môžu byť homogénne (bez separačného kroku medzi voľným reakčným činidlom a komplexom protilátka-antigén) alebo heterogénne (so separačným krokom). Existujú rôzne komerčné testy, ako napríklad rádioimunotest (RIA), s enzýmom spojený imunoabsorpčný test (ELISA), enzýmový imunotest (EIA), enzýmová multiplicitná imunotestovacia technika (EMIT), substrátový značený fluorescenčný imunotest (SLFIA) a podobne. Využiť sa môžu napríklad neznačené protilátky použitím sekundárnej protilátky, ktorá je značená a ktorá rozoznáva protilátku proti cytokínovému receptoru alebo proti konkrétnemu fragmentu. Tieto testy boli tiež do veľkej miery diskutované v literatúre. Pozri napr. Harlow a Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH., a Coligan (vyd. 1991 a periodické dodatky) Current Protocols In Immunology Greene/Wiley, New York.

Anti-idiotypové protilátky môžu mať podobné požitie a môžu slúžiť ako agonisty alebo antagonisty cytokínových receptorov. Mali by byť užitočné ako terapeutické reakčné činidlá za vhodných okolností.

Často sa reakčné činidlá pre diagnostické testy dodávajú v kitoch, aby bola optimalizovaná citlivosť testu. Na účely tohto vynálezu je poskytnutá značená alebo neznačená protilátka alebo značený ligand, v závislosti od povahy testu, protokolu a značky. To je zvyčajne v spojení s inými aditívami, ako napríklad tlmivými roztokmi, stabilizátormi, materiálmi nevyhnutnými na produkciu signálu, ako napríklad substrátmi pre enzýmy a podobne. Výhodne, kit bude obsahovať aj inštrukcie na správne použitie a odpadovú nádobu na použité obsahy. Typicky má kit kompartmenty pre každé užitočné reakčné činidlo a bude obsahovať inštrukcie na správne použitie a odpadovú nádobu pre reakčné činidlá. Želateľné je, aby reakčné činidlá boli poskytnuté vo forme suchého lyofilizovaného prášku, pričom reakčné činidlá môžu byť rekonštituované vo vodnom médiu, pričom majú príslušné koncentrácie na uskutočňovanie testu.

Uvedené zložky diagnostických testov môžu byť použité bez modifikácie alebo môžu byť modifikované rôznymi spôsobmi. Napríklad, značenie sa môže dosiahnuť kovalentným alebo nekovalentným pripojením skupiny, ktorá priamo alebo nepriamo poskytuje detegovateľný signál. V mnohých týchto testoch môže byť priamo alebo nepriamo značená testovaná zlúčenina, cytokínový receptor alebo protilátka proti nim. Možnosti na priame značenie zahŕňajú značkovacie skupiny: rádioaktívne značky, ako napríklad ¹²⁵I, enzýmy (US patent č. 3645090), ako napríklad peroxidázu a alkalickú fosfatázu, a fluorescenčné značky (US patent č. 3940475), ktoré sú schopné monitorovať zmenu v intenzite fluorescencie, posun vlnovej dĺžky alebo fluorescenčnú polarizáciu. Oba tieto patenty sú tu zahrnuté prostredníctvom ich citácie. Možnosti nepriameho značenia zahŕňajú biotinyláciu jednej zložky, po ktorej nasleduje viazanie na avidín pripojený na jednu z uvedených značkovacích skupín.

Existuje množstvo spôsobov na oddelenie naviazaného od voľného ligandu, alebo alternatívne, naviazanej od voľnej testovanej zlúčeniny. Cytokínový receptor sa môže imobilizovať na rôznych matriciach a potom nasleduje premývanie. Vhodné matrice zahŕňajú plastické matrice, ako napríklad ELISA platne, filtre a guľôčky. Spôsoby imobilizácie receptora na matrici zahŕňajú, bez obmedzenia, priamu adhéziu na plast, použitie zachytávacej protilátky, chemické párovanie a biotín avidín. Posledný krok v tomto postupe zahŕňa precipitáciu komplexu protilátka/-antigén ktoroukoľvek z niekoľkých metód vrátené spôsobov zahŕňajúcich napr. organické rozpúšťadlo, ako napríklad polyetylénglykol alebo soľ, ako napríklad síran amónny. Iné vhodné separačné techniky zahŕňajú, bez obmedzenia, spôsob fluoresceínových protilátkových magnetizovateľných častíc opísaný v Rattle a ďalší (1984) Clin. Chem. 30(9): 1457 1461, a dvojitú protilátkovú magnetickú časticovú separáciu, ako je opísaná v US patente č. 4659678, pričom každá z týchto publikácií je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie.

Spôsoby pripájania rôznych značiek na proteín alebo fragmenty boli do veľkej miery zverejnené v literatúre a nie je potrebné podrobnejšie ich tu diskutovať. Mnohé techniky zahŕňajú použitie karbodiimidu alebo aktívnych esterov na vytvorenie peptidových väzieb, formovanie tioéterov prostredníctvom reakcie merkaptoskupiny s aktivovaným halogénom, ako napríklad chlóracetylom, alebo aktivovaným olefínom, ako napríklad maleimidom, na vytvorenie spojenia alebo podobne. V týchto aplikáciách nájdu použitie aj fúzované proteíny.

Iný diagnostický aspekt tohto vynálezu zahŕňa použitie oligonukleotidovej alebo polynukleotidovej sekvencie vybranej zo sekvencie cytokínového receptora. Tieto sekvencie môžu byť použité ako sondy na detekciu hladín príslušného cytokínového receptora u pacientov, u ktorých je podozrenie, že majú imunologickú poruchu. Príprava tak RNA, ako aj DNA nukleotidových sekvencií, značenie sekvencií a výhodná veľkosť sekvencií sú dostatočne opísané a diskutované v literatúre. Normálne by mala mať oligonukleotidová sonda aspoň približne 14 nukleotidov, zvyčajne aspoň približne 18 nukleotidov a polynukleotidové sondy môžu mať až niekoľko kilobáz. Využité môžu byť rôzne značky, najobvyklejšie rádionuklidy, najmä ³²P. Ale využité môžu byť aj iné techniky, ako napríklad biotínom modifikované nukleotidy na začlenenie do polynukleotidu. Biotín potom slúži ako miesto na viazanie avidínu alebo protilátok, ktoré môžu byť značené širokou škálou značiek, ako napríklad rádionuklidmi, fluorescenčnými činidlami, enzýmami alebo podobne. Alternatívne, môžu byť využité protilátky, ktoré môžu rozoznávať špecifické duplexy, vrátane DNA duplexov, RAN duplexov, DNA RNA hybridných duplexov alebo DNA proteínových duplexov. Na druhej strane môžu byť protilátky značené, a môžu sa uskutočňovať testy, pri ktorom sa duplex naviaže na povrch, tak, aby sa pri vytvorení duplexu na povrchu mohla detegovať prítomnosť protilátky naviazanej na duplex. Použitie sond pre nové antisense RNA sa môže uskutočňovať obvyklými technikami, ako napríklad nukleokyselinovou hybridizáciou, plus a mínus skríningom, rekombinančným sondovaním, hybridnou uvoľňovacou transláciou (HRT) a hybridnou zastavenou transláciou (HART). To zahŕňa aj amplifíkačné techniky, ako napríklad polymerázovú reťazovú reakciu (PCR).

Zahrnuté sú aj diagnostické kity, ktoré testujú kvalitatívnu alebo kvantitatívnu prítomnosť iných markerov. Diagnostika alebo prognostika môžu závisieť od kombinácií viacerých indikácií použitých ako markerov. Takže, kity môžu testovať kombinácie markerov. Pozri napr. Viallet a ďalší (1989) Progress v Growth Factor Res. 1: 89-97. Detekcia polymorfných odchýlok, ktoré môžu reflektovať funkčné receptorové signalizačné rozdiely, môže byť užitočná pri určovaní terapeutickej stratégie. Odchýlky, ktoré odrážajú silnejšiu alebo slabšiu reakciu na ligand, môžu umožniť roztriedenie skupín pacientov na responzívne a neresponzívne podskupiny.

VIII. Terapeutická využiteľnosť

Tento vynález poskytuje reakčné činidlá s významnou terapeutickou hodnotou. Pozri napr. Levitzki (1996) Curr. Opin. Celí Biol. 8: 239-244. Cytokínové receptory (prirodzene sa vyskytujúce alebo rekombinantné), ich fragmenty, muteínové receptory a protilátky, spolu so zlúčeninami identifikovanými samými osebe, ktoré majú väzobnú afinitu proti receptorom alebo protilátkam, by mali byť užitočné na liečbu stavov vykazujúci abnormálnu expresiu receptorov alebo ich ligandov. Takéto abnormality sa typicky budú manifestovať prostredníctvom imunologických porúch. Pozri WO 01/18051, ktorý je tu zahrnutý prostredníctvom jeho citácie. Okrem toho, tento vynález by mal poskytnúť terapeutickú hodnotu pri rôznych ochoreniach alebo poruchách spojených s abnormálnou expresiou alebo abnormálnym spúšťaním reakcie na ligand. Napríklad, o p40/IL-B30 ligande sa predpokladá, že sa zúčastňuje na vývoji bunkami sprostredkovanej imunity, napr. protinádorovej aktivite, na zosúlaďovaní humorálnej a bunkovej imunity a na protivírusových účinkoch. Konkrétne sa zdá, že ligand aktivuje NK a T bunky. Terapia sa môže kombinovať s IL-18, IL-12, TNF, IFNy, rádio/chemoterapiou, adjuvans alebo protinádorovými, protivírusovými alebo protiplesňovými zlúčeninami.

Naopak, antagonisty, ktoré môžu byť kombinované s antagonistami TNF, IFNy, IL-18 alebo IL-12, alebo s IL-10 alebo steroidmi, môžu byť indikované pri chronických Thi sprostredkovaných ochoreniach, autoimunitných ochoreniach, a/alebo v situáciách odmietnutia transplatátu, pri skleróze multiplex, psoriáze, pri chronických zápalových stavoch, reumatoidnej artritíde, osteoartritíde alebo pri zápalových ochoreniach čriev. Antagonisty môžu byť vo forme protilátok proti receptorovým podjednotkám, vo forme rozpustných receptorových konštruktov alebo antisense nukleových kyselín proti jednej alebo viacerým receptorovým podjednotkám. Spojenie p40/IL-B30 ligandu s receptorovými podjednotkami DCRS5 a IL-12Rpi poskytuje pochopenie indikácií na použitie agonistu a antagonistu.

Teoreticky, na základe p40/IL-B30 opísaných aktivít, môžu byť antagonisty cytokínu ovplyvňované napr. rozpustnou DCRS5, s alebo bez rozpustnej IL-12RP1, alebo protilátkami proti každej z receptorových podjednotiek. Antagonisty môžu byť užitočné ako inhibítory nežiaducich imunitných alebo zápalových reakcií, na zameranie pamäťových T buniek, alebo v kombinácii s IL-12/IL-12R antagonistami alebo inými protizápalovými látkami alebo imunosupresívnymi látkami. Klinickými indikáciami môžu byť chronický zápal alebo situácie pri transplantáciách. Rôzne polymorfizmy môžu zosilňovať alebo zoslabovať receptorovú funkciu, a ak je dominantná, mohli by byť užitočné ako terapeutické látky. Identifikácia takýchto odchýlok môže umožniť roztriedenie skupín pacientov na responzívnych alebo neresponzívnych. Reakčné činidlá môžu byť užitočné ako detekčné alebo značkovacie reakčné činidlá alebo ablatívne reakčné činidlá pre pamäťové T bunky a/alebo NK bunky.

Génová terapia môže spôsobiť, že požadované bunkové populácie reagujú na p40/IL-B30 ligand, napr. ako adjuvans pre nádorovú imunoterapiu na uľahčenie aktivácie lymfocytov infiltrujúcich do nádoru, T buniek alebo NK buniek. Antisense stratégie sa môžu aplikovať napr. na zabránenie receptorovej responzívnosti.

Rôzne abnormálne stavy sú známe pri týchto typoch buniek, pri ktorých sa Northern blot analýzou ukázalo, že produkujú IL-12 p40 a/alebo IL-B30 mRNA. Pozri Berkow (vyd.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N. J.; Thom, a ďalší Harrison's Principles of Intemal Medicíne, McGraw-Hill, N. Y.; a Weatherall a ďalší (vyd.) Oxford Textbook of Medicíne, Oxford University Press, Oxford. Mnohé iné medicínske stavy a ochorenia budú reagovať na liečbu tu poskytnutým agonistom alebo antagonistom. Pozri napr. Stites a Terr (vyd.; 1991) Basic and Clinical Immunology Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut; a Samter a ďalší (vyd.) Immunological Diseases Little, Brown and Co. Iné pravdepodobné indikácie na liečbu zahŕňajú remodeling kostí, sexuálnu dysfúnkciu, prevenciu neurodegeneratívnych ochorení, demenciu, stres a iné. Tieto problémy by mali reagovať na prevenciu alebo liečbu použitím tu poskytnutých prostriedkov.

Rekombinantné cytokínové receptory, muteíny, agonistické alebo anta-gonistické protilátky proti nim alebo protilátky sa môžu purifikovať a potom podávať pacientovi. Tieto reakčné činidlá sa môžu kombinovať na terapeutické použitie s ďalšími aktívnymi zložkami, napr. v bežných farmaceutický prijateľných nosičoch alebo riedidlách, spolu s fyziologicky neškodnými stabilizátormi a excipientmi. Tieto kombinácie môžu byť sterilné, napr. prefiltrované, a umiestnené v dávkových formách, napríklad prostredníctvom lyofilizácie v dávkových liekovkách, alebo uskladnené v stabilizovaných vodných prípravkoch. Tento vynález zahŕňa aj použitie protilátok alebo ich väzobných fragmentov, ktoré nepredstavujú komplementárne viazanie.

Ligandový skríning použitím cytokínového receptora alebo jeho fragmentov sa môže uskutočňovať na identifikáciu molekúl, ktoré majú väzobnú afinitu proti receptorom. Následné biologické testy sa potom môžu využiť na stanovenie toho, či pravdepodobný ligand môže poskytnúť kompetitívne viazanie, ktoré môže blokovať vlastnú stimulačnú aktivitu. Receptorové fragmenty sa môžu použiť ako blokátor alebo antagonista na blokovanie aktivity ligandu. Podobne, zlúčenina, majúca vlastnú stimulačnú aktivitu, môže aktivovať receptor a je teda agonistom, pretože stimuluje aktivitu ligandu, napr. indukuje signalizáciu. Tento vynález ďalej zahŕňa terapeutické použitie protilátok proti cytokínovým receptorom ako antagonistov.

Množstvá reakčných činidiel budú závisieť od mnohých rozličných faktorov vrátane spôsobu podávania, cieľového miesta, fyziologickej životnosti reakčného činidla, farmakologickej životnosti, fyziologického stavu pacienta a iných podávaných liekov. Takže liečebné dávky by mali byť titrované tak, aby bola optimalizovaná bezpečnosť a účinnosť. Typicky, dávky používané in vitro môžu poskytnúť užitočný návod pri množstvách užitočných na in situ podávanie týchto reakčných činidiel. Testovanie účinných dávok na liečbu konkrétnych porúch na zvieratách poskytne ďalšiu predbežnú indikáciu humánnej dávky. Rôzne prístupy sú opísané napr. v Gilman a ďalší (vyd. 1990) Goodman a Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. vyd., Pergamon Press; a Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. vyd. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; pričom každá z týchto publikácií je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie. Spôsoby podávania sú diskutované tu a neskôr, napr. orálne, intravenózne, intraperitoneálne alebo intramuskuláme podanie, transdermálna difúzia a iné. Farmaceutický prijateľné nosiče budú zahŕňať vodu, fyziologický roztok, tlmivé roztoky a iné opísané zlúčeniny, napr. zlúčeniny uvedené v Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Kvôli pravdepodobnosti vysoko afinitného viazania alebo obratovým množstvám, medzi pravdepodobným ligandom a jeho receptormi, na začiatku by sa mala očakávať účinnosť nízkych dávok týchto reakčných činidiel. Takže obvykle by sa malo očakávať, že dávkové rozsahy budú v množstvách nižších ako lmM koncentrácie, typicky nižších ako približne 10μΜ koncentrácie, zvyčajne nižších ako približne 100 nM, výhodne nižších ako približne 10 pM (pikomolov) a najvýhodnejšie nižších ako približne 1 fM (femtomol), s príslušným nosičom. Na kontinuálne podávanie sa často budú využívať formulácie s pomalým uvoľňovaním alebo zariadenia s pomalým uvoľňovaním.

Cytokínové receptory, ich fragmenty, a protilátky alebo ich fragmenty, antagonisty a agonisty, môžu byť podávané priamo hostiteľovi, ktorý sa má liečiť alebo, v závislosti od veľkosti zlúčenín, môže byť želateľné konjugovať ich s nosičovými proteínmi, ako napríklad ovalbumínom alebo sérovým albumínom, pred ich podaním. Terapeutické formulácie sa môžu podávať v mnohých bežných dávkových formuláciách. Hoci je možné, aby sa aktívna zložka podávala samostatne, výhodné je, ak je vo forme farmaceutickej formulácie. Formulácie zahŕňajú aspoň jednu aktívnu zložku, ako je definovaná, spolu s jedným alebo viacerými prijateľnými nosičmi. Každý nosič musí byť tak farmaceutický, ako aj fyziologicky prijateľný v tom zmysle, že musí byť kompatibilný s inými zložkami a nesmie poškodzovať pacienta. Formulácie zahŕňajú tie, ktoré sú vhodné na orálne, rektálne, nazálne alebo parenterálne (vrátane subkutánneho, intramuskulámeho, intravenózneho a intradermálneho) podanie. Je vhodné, ak sú formulácie prezentované v jednotkovej dávkovej forme a môžu byť pripravené spôsobmi dobre známymi v oblasti farmácie. Pozri napr. Gilman a ďalší (vyd. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. vyd., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. vyd. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis a ďalší (vyd. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms : Parenteral Medications Dekker, N Y; Lieberman a ďalší (vyd. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, N Y; a Lieberman a ďalší (vyd. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, N Y. Terapia podľa tohto vynálezu môže byť kombinovaná s alebo použitá v spojení s inými terapeutickými činidlami, najmä agonistami alebo antagonistami iných členov cytokínovej receptorovej rodiny.

IX. Skríning

Skríning liečiv použitím DCRS5 alebo jej fragmentov sa môže uskutočňovať na identifikáciu zlúčenín, ktoré majú väzobnú afinitu proti receptorovej podjednotke, vrátane izolácie asociovaných zlúčenín. Následné biologické testy potom môžu byť využité na stanovenie toho, či má zlúčenina vlastnú stimulačnú aktivitu a či je teda blokátorom alebo antagonistom tým, že blokuje aktivitu ligandu. Okrem toho súlad medzi p40/IL-B30 ligandom a funkčným receptorom DCRS3 s IL-12Rpi, umožňuje skríning antagonistov a agonistov s pozitívnou kontrolou signálu. Môže sa uskutočňovať skríning malých molekúl alebo protilátok.

Jeden spôsob na skríning liečiv využíva eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky, ktoré sú stabilne transformované rekombinantnými DNA molekulami exprimujúcimi DCRS5 v kombinácii s inou cytokínovou receptorovou podjednotkou, napr. IL-12Rpi. Verí sa, že signalizácia využíva STAT4. Môžu sa izolovať bunky, ktoré exprimujú receptor izolovane od iných funkčných receptorov. Takéto bunky, buď živé, alebo vo fixovanej forme, sa môžu použiť na štandardné protilátka/antigén alebo ligand/receptor väzobné testy. Pozri aj Parce a ďalší (1989) Science 246: 243-247; a Owicki a ďalší, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4007-4011, ktoré opisujú citlivé metódy na detekciu bunkových odpovedí. Výnimočne užitočné sú kompetitívne testy, pri ktorých sa bunky kontaktujú a inkubujú so značeným receptorom alebo protilátkou, ktoré majú známu väzobnú afinitu proti ligandu, ako napríklad ¹²⁵l-protilátkou, a s testovanou vzorkou, ktorej väzobná afinita proti viažucej zlúčenine sa meria. Naviazané a voľné označené väzobné kompozície sa potom oddelia, aby sa zhodnotil stupeň viazania. Množstvo naviazanej testovanej zlúčeniny je nepriamo úmerné hodnote viazania značeného receptora na známy zdroj. Je možné použiť mnohé techniky na oddelenie naviazaného od voľného ligandu, aby sa určil stupeň viazania ligandu. Tento separačný krok by mohol typicky zahŕňať postup, ako napríklad adherovanie na filtre, po ktorom nasleduje premývanie, adherovanie na plast, po ktorom nasleduje premývanie, alebo centrifugácia bunkových membrán. Živé bunky by mohli byť použité aj na skríning účinkov liečiv na cytokínom sprostredkované funkcie, napr. STAT4 signalizáciu a iné. Niektoré detekčné metódy umožňujú elimináciu separačného kroku, napr. proximálny senzitívny detekčný systém.

Široký rozsah tohto vynálezu je najlepšie pochopiteľný prostredníctvom odvolania sa na nasledujúce príklady, ktoré nie sú mienené ako obmedzenie vynálezu na konkrétne uskutočnenia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

I. Všeobecné metódy

Niektoré štandardné metódy sú opísané alebo spomenuté napr. v Maniatis, a ďalší (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook a ďalší (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2. vyd.), zv. 1-3, CSH Press, NY; alebo Ausubel, a ďalší (1987 a dodatky) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Metódy na purifikáciu proteínu zahŕňajú také metódy ako precipitácia na sírane amónnom, kolónová chromatografia, elektroforéza, centrifugácia, kryštalizácia a iné. Pozri napr. Ausubel a ďalší (1987 a periodické dodatky); Coligan a ďalší (vyd. 1996) a periodické dodatky, Current Protocols In Protein Science Greene/Wiley, New York; Deutscher (1990) „Guide to Protein Purification“ v Methods in Enzymology, zv. 182, a iné zväzky v tejto sérií; a literatúra výrobcov o použití produktov na purifikáciu proteínov, napr. Pharmacia, Piscataway, N. J., alebo BioRad, Richmond, CA. Kombinácia s rekombinantnými technikami umožňuje fúziu s príslušnými segmentmi, napr. s FLAG sekvenciou alebo ekvivalentnou sekvenciu, ktoré môžu byť fúzované prostredníctvom sekvencie odstrániteľnej proteázou. Pozri napr. Hochuli (1990) „Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent“ v Setlow (vyd.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87- 98, Plénum Press, N. Y.; a Crowe a ďalší (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Počítačová sekvenčná analýza sa uskutočňuje napr. použitím dostupných softvérových programov, vrátene programom od GCG (U. Wisconsin) a GenBank zdrojov. Taktiež sa používali zverejnené sekvenčné databázy, napr. od GenBank a iných.

Mnohé techniky aplikovateľné na IL-10 receptory sa môžu aplikovať na DCRS5, ako je opísané napr. v US patente č. 5789192 (IL-10 receptor), ktorý je tu zahrnutý prostredníctvom jeho citácie.

II. Funkčné klonovanie

Pozorovalo sa, že anti-hIL-12Rpi protilátka blokuje odpovede ľudských T buniek na p40/IL-B30, a že p40/IL-B30 sa viaže na IL-12Rpi. Z toho vyplývalo, že IL-12RP1 je jednou podjednotkou receptorového komplexu pre p40/IL-B30.

Identifikovala sa populácia myšacích T buniek, ktorá odpovedala na p40/IL-B30, ale neodpovedala na IL-12, a iná populácia, ktorá odpovedala na IL-12, ale neodpovedala na p40/IL-B30. Okrem toho sa pozorovalo, že Ba/F3 bunky exprimujúce rekombinantnú mlL-12Rpi a mIL-12Rp2 odpovedajú na IL-12, ale nie na p40/IL-B30. Z týchto výsledkov spoločne vyplývalo, že receptorový komplex pre p40/IL-B30 obsahuje IL27

-12Κβ 1 a aspoň jednu inú podjednotku, ktorou nie je IL-12β2. V súlade s tým sa navrhla expresná klonovacia stratégia na izoláciu tohto druhého receptorového komonentu.

cDNA knižnica sa pripravila z mRNA izolovanej z Kit225 buniek, IL-2 dependentnej ľudskej T bunkovej línie, ktorá reaguje tak na IL-12, ako aj na p40/IL-B30. cDNA knižnica sa vyrobila použitím retrovírusového expresného vektora pMX. Ba/F3 bunky exprimujúce rekombinantnú hIL-12Rβl sa infikovali s touto cDNA knižnicou, nechali sa zotavovať 3 až 4 dni v IL-3, potom sa premyli a naniesli sa na 96-jamkové platne v množstve 15 000 buniek na jamku v médiu obsahujúcom 50 ng/ml hyper-hp40/hIL-B30. Pozri WO 01/18051. Do kultúr sa každých 5 dní pridával ďalší hyper-hp40/hIL-B30. Po približne dvoch týždňoch malo bunkový rast 5 až 10 % jamiek. Bunky sa izolovali z každej jamky, jednotlivo sa expandovali na väčšie kultúry v hyper-hp40/hIL-B30 a testovali sa z hľadiska závislosti rastu na hyper-hp40/hIL-B30.

Bunky, ktorých rast bol závislý od p40/IL-B30, sa analyzovali prostredníctvom PCR na retrovírusové cDNA inzerty. Z viac ako 40 analyzovaných izolátov všetky, okrem jedného, obsahovali cDNA kódujúce novú receptorovú DCRS5. Táto kandidátska humánna cDNA sa klonovala v expresnom vektore a transfekovala sa do Ba/F3 buniek exprimujúcich hIL-12Rβl. Tieto bunky sa stali responzívnymi na p40/IL-B30, na základe čoho sme urobili záver, že nová cDNA kóduje požadovanú DCRS5, funkčnú IL-B30 receptorovú podjednotku.

III. Znaky kompletnej DCRS5; chromozomálna lokalizácia

Cytoplazmatická doména DCRS5 nie je celkovo blízko príbuzná s inými cytoplazmatickými doménami cytokínových receptorov, spoločným znakom v tejto rodine molekúl. Cytoplazmatická doména obsahuje sedem tyr zvyškov, z ktorých aspoň tri sú časťou rozoznávaných SH2-väzobných motívov: YEDI, YKPQ a YFPQ. YEDI motív je podobný s identifikovanými väzobnými miestami pre tyrozín fosfatázu shp2. Druhé dva motívy sú veľmi podobné so sekvenciami, o ktorých je známe, že viažu Statl/Stat3, respektíve Stat3. YKPQ motív sa spolu s ohraničujúcimi sekvenciami podobá do určitého stupňa motívom v Stat4 a v IL-12Κβ1, o ktorých je známe, že viažu Statl-3. To je v súlade z predchádzajúcimi údajmi naznačujúcimi, že p40/IL-B30, podobne ako IL-12, aktivuje Stat4.

PCR priméry odvodené od DCRS5 sekvencie sa používajú na sondovanie ľudskej cDNA knižnice. Sekvencie môžu byť odvodené napr. z tabuľky 1, výhodne sú to sekvencie v blízkosti konca sekvencii. Kompletné cDNA pre primátovú, hlodavČiu a iné druhy DCRS5 sa klonujú napr. prostredníctvom DNA hybridizačného skríningu ZgtlO fága. PCR reakcie sa uskutočňujú použitím T. aquaticus 7a#plus DNA polymerázy (Stratagene) v príslušných podmienkach.

Pripravia sa chromozómové stery. Uskutoční sa in situ hybridizácia na chromozómových prípravkoch získaných z fytohemaglutinínom stimulovaných ľudských lymfocytov kultivovaných 72 hodín. Na posledných sedem hodín kultivácie sa pridá 5-brómdeoxyuridin (60 pg/ml média), aby sa zaistila posthybridizácia chromozomálnych pásov v dobrej kvalite.

PCR fragment, amplifikovaný pomocou primérov, sa klonuje do príslušného vektora. Vektor sa označí nick-transláciou s ³H. Rádioaktívne značená sonda sa hybridizuje s metafázovými stermi v konečnej koncentrácii 200 ng/ml hybridizačného roztoku, ako je opísané v Mattei a ďalší (1985) Hum. Genet. 69: 327-331.

Po porytí s nukleárnou track emulziou (KODAK NTB2) sa rezy exponujú. Aby sa zabránilo sklzavaniu strieborných zrniek v priebehu páskovania, chromozómové stery sa najprv farbia tlmeným Giemsovým roztokom a fotografujú sa v metafáze. R-páskovanie sa potom uskutočňuje metódou fluórchrómfotolýzy-Giemsa (FPG) a metafázy sa opäť fotografujú pred analýzou.

Podobné vhodné metódy sa používajú pre iné druhy.

IV. Lokalizácia DCRS5 mRNA

Ľudské multiplicitné tkanivo (kat. č. 1,2) a bloty rakovinovej bunkovej línie (kat. č. 7757-1), obsahujúce približne 2 pg poly(A)⁺RNA na dráhu, sa nakúpili od Clontech (Palo Alto, CA). Sondy sa rádioaktívne označili s [a-³²P] dATP napr. použitím Amersham Rediprime random primérového značkovacieho kitu (RPN1633). Uskutočnila sa predhybridizácia a hybridizácie napr. pri 65 °C v 0,5M Na₂HPO₄, 7 % SDS, 0,5M EDTA (pH 8,0). Uskutočňovali sa premývania za veľmi prísnych podmienok, napr. pri 65 °C s dvoma počiatočnými premývaniami v 2x SSC, 0,1 % SDS 40 minút, po ktorých nasledovalo premývanie v 0,lxSSC, 0,1 % SDS 20 min. Membrány sa potom exponovali pri -70 °C na rôntgenový film (Kodak) v prítomnosti intenzifikovaných tienidiel. Podrobnejšie štúdie prostredníctvom cDNA knižnicových Southern blotov sa uskutočnili s vybranými vhodnými humánnymi DCRS5 kionmi, aby sa skúmala ich expresia v hemopoetických alebo iných podtriedach buniek.

Alternatívne sa z tabuľky 1 vybrali dva vhodné priméry. RT-PCR sa použila na vhodnú mRNA vzorku selektovanú na prítomnosť kódu na produkciu cDNA, napr. vzorku, ktorá exprimuje gén.

Kompletné klony sa môžu izolovať hybridizáciou cDNA knižníc z príslušných tkanív vopred selektovaných prostredníctvom PCR signálu. Môžu sa uskutočniť Northern bloty.

Správa pre gény kódujúce DCRS5 sa bude testovať prostredníctvom vhodnej technológie, napr. prostredníctvom PCR, imunotestom, hybridizáciou alebo inak. Tkanivové a orgánové cDNA prípravy sú dostupné napr. od Clontech, Mountain View, CA. Ako bolo opísané, je užitočná identifikácia zdrojov prirodzenej expresie. A identifikácia funkčného receptorového podjednotkového párovania umožňuje predpovedať, aké bunky exprimujú kombináciu receptorových podjednotiek, ktorej výsledkom bude fyziologická responzívnosť na každý z cytokínových ligandov.

Na určenie myšacej distribúcie sa môže uskutočňovať napr. Southern analýza: DNA (5 pg) z primáme amplifikovanej cDNA knižnice sa poštiepila s príslušnými reštrikčnými enzýmami, aby sa uvoľnili inzerty, nechali sa zbehnúť na 1% agarózovom géli a preniesli sa na nylonovú membránu (Schleicher and Schuell, Keene, NY).

Vzorky na izoláciu myšacej mRNA môžu zahŕňať: myšaciu fibroblastovú L bunkovú líniu v pokojovom štádiu (C200); Braf:ER (Braf fúziu s estrogénovým receptorom) transfekované bunky, kontrolu (C201); T bunky, TH1 polarizované (Mell4 jasný, CD4+ bunky zo sleziny, polarizované 7 dní s IFN-γ a anti-IL-4; T200); T bunky, TH2 polarizované (Mell4 jasný, CD4+ bunky zo sleziny, polarizované 7 dní s IL-4 a anti-IFN-γ; T201); T bunky, vysoko TH1 polarizované (pozri Openshaw a ďalší (1995) J. Exp. Med. 182: 1357-1367); aktivované s anti-CD3 2, 6, 16 h, spojené; T202); T bunky, vysoko TH2 polarizované (pozri Openshaw a ďalší (1995) J. Exp. Med. 182; 1357-1367; aktivované s anti-CD3 2, 6,16 hodín, spojené; T203); CD44-CD25+ pre T bunky, prebrané z týmusu (T204); TH1 T bunkový kloň Dl.l, odpočívajúci 3 týždne po poslednej stimulácii s antigénom (T205); TH1 T bunkový kloň D 1.1, 10 pg/ml ConA stimulovaný 15 hodín (T206); TH2 T bunkový kloň CDC35, odpočívajúci 3 týždne po poslednej stimulácii s antigénom (T207); TH2 T bunkový kloň CDC35, 10 pg/ml ConA stimulovaný 15 hodín (T208); Mell4+ naivné T bunky zo sleziny, v pokojovom štádiu (T209); Mell4+ T bunky, polarizované na TH1 s IFN-Y/IL-12/anti-IL-4 6, 12, 24 hodín, spojené (T210); Mell4+ T bunky polarizované na Th2 s IL-4/anti-IFN-y 6, 13, 24 hodín, spojené (T211); nestimulované zrelé B bunky leukemickej bunkovej línie A20 (B200); nestimulovaná B bunková línia CH 12 (B201); nestimulované veľké B bunky zo sleziny (B202); B bunky z celkovej sleziny, LPS aktivované (B203); metrizamidom obohatené dentritické bunky zo sleziny, v pokojovom štádiu (D200); dentritické bunky z kostnej drene, v pokojovom štádiu (D201); monocytová bunková línia RAW 264.7 aktivovaná s LPS 4 hodiny (M200); makrofágy kostnej drene derivované s GM a M-CSF (M201); makrofágová bunková línia J774, v pokojovom štádiu (M202); makrofágová bunková línia J774 + LPS + anti-IL-10 izolovaná po 0,5, 1, 3, 6, 12 hodinách, spojená (M203); makrofágová bunková línia J774 + LPS + IL-10 izolovaná po 0,5, 1, 3, 5, 12 hodinách (M204); aerosólom iniciované myšacie pľúcne tkanivo, Th2 priméry, aerosól OVA iniciácia, spojené po 7, 14, 23 hodinách (pozri Garlis a ďalší (1995) Clinical Immunology and Immunopathology 75: 75-83; X206); pľúcne tkanivo infikované s Nippostrongulus (pozri Coffman a ďalší (1989) Science 245: 308-310; X200); celkové dospelé pľúca, normálne (0200); celkové pľúca, rag-1 (pozri Schwarz a ďalší (1993) Immunodeficiency 4: 249-252; 0205); IL-10 K.O. slezina (pozri Kuhn a ďalší (1991) Celí 75: 263-274; X201); celková dospelá slezina, normálna (0201); celková slezina, rag-1 (0207); IL-10 K.O. Peyerové plaky (0202); celkové Peyerové plaky, normálne (0210); IL-10 K.O. mezentrické lymfatické uzliny (X203); celkové mezentrické lymfatické uzliny, normálne (0211); IL-10 K.O. hrubé črevo (X203); celkové hrubé črevo, normálne (0212); NOD myšací pankreas (pozri Makino a ďalší (1980) Jikken Dobutsu 29: 1-13; X205); celkový týmus rag-1 (0208); celková oblička, rag-1 (0209); celkové srdce, rag-1 (0202); celkový mozog, rag-1 (0203); celkové semenníky, rag-1 (0204); celková pečeň, rag-1 (0206); normálne potkanie spojivové tkanivo, 0300); a potkanie artritické spojivové tkanivo (X300).

Vzorky na izoláciu humánnej mRNA môžu zahŕňať: periférne krvné mono-nukleáme bunky (monocyty, T bunky, NK bunky, granulocyty, B bunky), v pokojovom štádiu (T 100); periférne krvné mononukleáme bunky, aktivované s anti-CD3 a spojené po 2, 6, 12 hodinách (T 101); T bunky, THO kloň Mot 72, v pokojovom štádiu (T 102); T bunky, THO kloň Mot 72, aktivované s anti-CD28 a anti-CD3 3, 6, 12 hodín, spojené (T103); T bunky, THO kloň Mot 72, anergicky ošetrované so špecifickým peptidom 2, 7, 12 hodín, spojené (T104); T bunky, TH1 kloň HY06, v pokojovom štádiu (T107); T bunky, TH1 kloň HY06, aktivované s antiCD28 a anti-CD3 3, 6, 12 hodín, spojené (T108); T bunky, TH1 kloň HY06, anergicky ošetrované so špecifickým peptidom 2, 6, 12 hodín, spojené (T109); T bunky, TH2 kloň HY935, v pokojovom štádiu (TI 10); T bunky, TH2 kloň HY395, aktivované s anti-CD28 a anti-CD3 2, 7, 12 hodín, spojené (Till); T bunky CD4+CD45RO-T bunky polarizované 27 dní s anti-CD28, IL-4 a anti-IFN-γ, TH2 polarizované, aktivované s anti-CD3 a anti-CD28 4 hodiny (TI 16); T bunkové nádorové línie Jurkat a Hut78, v pokojovom štádiu (TI 17); T bunkové klony, spojené AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, v pokojovom štádiu (TI 18); T bunkové náhodné γδ T bunkové klony, v pokojovom štádiu (TI 19); splenocyty, v pokojovom štádiu (B100); splenocyty, aktivované s anti-CD40 a IL-4 (B101); B bunkové EBV línie, spojené WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY, v pokojovom štádiu (B102); B bunková línia JY, aktivovaná s PMA a ionomycínom 1, 6 hodín, spojené (B 103); NK 20 klony, spojené, v pokojovom štádiu (K100); NK 20 klony, spojené, aktivované s PMA a ionomycínom 6 hodín (K101); NKL kloň, získaný od pacientov s periférnou leukémiou LGL, ošetrené s IL-2 (K106); NK cytotoxický kloň 640-A30-1, v pokojovom štádiu (K107); he29 matopoetická prekurzorová línia TF1, aktivovaná s PMA a ionomycínom 1, 6 hodín, spojená (C100); U937 premonocytová línia, v pokojovom štádiu (Ml00); U937 premonocytová línia, aktivovaná s PMA ionomycínom 1, 6 hodín, spojená (M101); preprané monocyty, aktivované s LPS, IFN-γ, anti-IL-10 1, 2, 6, 12, 24 hodín, spojené (M102); preprané monocyty, aktivované s LPS, IFN-γ, IL-10 1, 2, 6, 12, 24 hodín, spojené (M103); preprané monocyty, aktivované s LPS, IFN-γ, anti-IL-10 4, 16 hodín, spojené (M106); preprané monocyty, aktivované s LPS, IFN-γ, IL-10 4, 16 hodín, spojené (M107); preprané monocyty, aktivované s LPS 1 hodinu (M108); preprané monocyty, aktivované s LPS 6 hodín (M109); DC 70% CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, v pokojovom štádiu (D101); DC 70% CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, aktivované s PMA a ionomycínom 1 hodinu (D 102); DC 70% CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, aktivované s PMA a ionomycínom 6 hodín (Dl03); DC 95% CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní FACS roztriedené, aktivované s PMA a ionomycínom 1, 6 hodín, spojené (D104); DC 95% CDla+, z CD34+ GMCSF, TNFa 12 dní FACS roztriedené, aktivované s PMA a ionomycínom 1, 6 hodín, spojené (D105); DC CDla+ CD86+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní FAC roztriedené, aktivované s PMA a ionomycínom 1, 6 hodín, spojené (K106); DC z monocytov GM-CSF, IL-4 5 dní, v pokojovom štádiu (D107); DC z monocytov GM-CSF, IL-4 5 dní, v pokojovom štádiu (D 108); DC z monocytov GM CSF, IL-4 5 dní aktivované s LPS 4, 16 hodín, spojené (D109); DC z monocytov GM-CSF, IL-4 5 dní, aktivované s TNFa, monocytový šupe 4, 16 hodín, spojené (Dl 10); leiomyómový LI 1 benígny nádor (X101); normálne myometrium M5 (0115); malígny leiomyosarkóm GS1 (X103); pľúcna fibroblastová sarkómová línia MRC5, aktivovaná s PMA a ionomycínom 1, 6 hodín, spojená (C 101); obličková epiteliálna karcinómová bunková línia CHA, aktivovaná s PMA a ionomycínom 1, 6 hodín, spojená (C 102); obličky 28 týždňového plodu (0100); pľúca 28 týždňového plodu (0101); pečeň 28 týždňového plodu (0102); srdce 28 týždňového plodu (0103); mozog 28 týždňového plodu (0104); žlčník 28 týždňového plodu (0106); tenké črevo 28 týždňového plodu (0107); tukové tkanivo 28 týždňového plodu (0108); vaječník 25 týždňového plodu (0109); maternica 25 týždňového plodu (OllO); semenník 28 týždňového plodu (Ol 11); slezina 28 týždňového plodu (Ol 12); dospelá placenta (Ol 13); zapálená mandľa od 12 ročného dieťaťa (X100).

Podobné vzorky môžu byť na hodnotenie izolované z iných druhov.

V. Klonovanie druhových náprotivkov DCRS5

Rôzne stratégie sa používajú na získanie druhových náprotivkov DCRS5, výhodne z primátov a hlodavcov. Jedným spôsobom je krížová hybridizácia použitím blízko príbuzných druhových DNA sond. Môže byť užitočný na prechod na evolučné podobné druhy, ako prechodný krok. Iný spôsob sa uskutočňuje prostredníctvom použitia špecifických PCR primérov aje založený na identifikácii blokov podobnosti alebo rozdielnosti medzi génmi, napr. oblastí vysoko konzervatívnej alebo nekonzervatívnej polypeptidovej alebo nukleotidovej sekvencie.

Prieskumy databáz môžu identifikovať podobné sekvencie a umožniť produkciu vhodných sond.

VI. Produkcia cicavčieho DCRS5 proteínu

Skonštruuje sa vhodný, napr. GST, fúzovaný konštrukt na expresiu napr. v E. coli. Napríklad sa skonštruuje myšací IGIF pGex plazmid a transformuje sa do E. coli. Čerstvo transformované bunky rastú napr. v LB médiu obsahujúcom 50 pg/ml ampicilínu a indukujú sa s IPTG (Sigma, St. Louis, MO). Po inkubovaní cez noc sa baktérie zozbierajú a pelety obsahujúce DCRS5 proteín sa izolujú. Pelety sa homogenizujú napr. v TE tlmivom roztoku (50 mM Tris-bázy pH 8,0, 10 mM EDTA and 2 mM pefabloc) v 2 litroch. Tento materiál sa trikrát pasážuje cez mikrofluidizér (Microfluidics, Newton, MA). Skvapalnený supematant sa centrifúguje na Sorvall GS-3 rotor 1 hodinu pri 13 000 ot./min. Výsledný supematant obsahujúci cytokínový receptorový proteín sa prefiltruje a pasážuje sa na glutatión-SEPHAROSE kolóne ekvilibrovanej v 50 mM Tris-bázy pH 8,0. Frakcie obsahujúce DCRS5-GST fúzovaný proteín sa spoja a poštiepia napr. s trombínom (Enzýme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN). Poštiepené spojené frakcie sa potom prepasážujú na Q-SEPHAROSE kolóne ekvilibrovanej v 50 mM Tris-bazy. Frakcie obsahujúce DCRS5 sa spoja a nariedia v studenej destilovanej H₂O, aby sa znížila vodivosť, a znova sa prepasážujú cez čerstvú Q-Sepharose kolónu, samostatne alebo aj cez imunoafinitnú protilátkovú kolónu. Frakcie obsahujúce DCRS5 proteín sa spoja, rozdelia sa na alikvóty a uskladnia sa pri -70 °C.

Porovnanie CD spektra s cytokínovým receptorovým proteínom môže naznačiť, že proteín je správne poskladaný. Pozri Hazuda a ďalší (1969) J. Biol. Chem. 264: 1689-1693.

VII. Príprava DCRS5 špecifických protilátok

Inbredné Balb/c myši sa imunizujú intraperitoneálne s rekombinantnými formami proteínu, napr. purifikovaným DCRS5 alebo stabilne transfekovanými NIH-3T3 bunkami. Zvieratá sa stimulujú v príslušných časových bodoch s proteínom, s alebo bez ďalšieho adjuvans, aby sa lepšie stimulovala produkcia protilátok. Izoluje sa sérum, alebo sa vyprodukujú hybridómy z izolovaných slezín.

Alternatívne, Balb/c myši sa imunizujú s bunkami transformovanými génom alebo jeho fragmentmi, buď endogénnymi, alebo exogénnymi bunkami, alebo s izolovanými membránami obohatenými z hľadiska expresie antigénu. V príslušnom čase sa izoluje sérum, typicky po mnohých ďalších podaniach. Užitočné môžu byť rôzne génové terapeutické techniky, napr. pri produkcii proteínu in situ na generovanie imunologickej odpovede. Sérové alebo protilátkové prípravky sa môžu krížovo absorbovať alebo imunoselektovať, aby sa pripravili v podstate purifikované protilátky s definovanou špecificitou a vysokou afinitou.

Môžu sa vyrobiť monoklonálne protilátky. Napríklad, splenocyty sa fuzujú s vhodným fúzovacím partnerom a hybridómy sa selektujú v rastovom médiu štandardnými postupmi. Hybridómové supematanty sa skrínujú na prítomnosť protilátok, ktoré sa viažu na DCRS5, napr. prostredníctvom ELISA alebo iným testom. Môžu sa selektovať alebo pripraviť protilátky, ktoré špecificky rozoznávajú DCRS5 uskutočnenia.

Pri inom spôsobe sa syntetické peptidy alebo purifikovaný proteín prezentujú imunitnému systému, aby sa generovali monoklonálne alebo polyklonálne protilátky. Pozri napr. Coligan (vyd. 1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; a Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. Vo vhodných situáciách sa väzobné reakčné činidlo buď označí, ako je opísané, napr. fluorescenčné alebo iným spôsobom, alebo sa imobilizuje na substrát, aby sa mohli uskutočňovať panning spôsoby. Nukleové kyseliny sa môžu začleniť do buniek vo zvierati, aby sa produkoval antigén, ktorý slúži na vyvolanie imunitnej odpovede. Pozri napr. Wang a ďalší (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 4156-4160; Barry a ďalší (1994) BioTechniques 16: 616-619; a Xiang a ďalší (1995) Immunity 2: 129-135.

VIII. Produkcia fúzovaných proteínov s DCRS5

Rôzne fúzované konštrukty sa vyrábajú s DCRS5, vrátane uskutočnení, v ktorých sa kombinuje s IL-12Rpi sekvenciou. Časť príslušného génu sa fúzuje s epitopovým príveskom, napr. FLAG príveskom, alebo s dvojhybridným systémovým konštruktom. Pozri napr. Fields a Song (1989) Náture 340: 245-246.

Epitopový prívesok sa môže použiť na expresný klonovací postup s detekciu prostredníctvom anti-FLAG protilátok, aby sa detegoval väzobný partner, napr. ligand pre príslušný cytokínový receptor. Dvojhybridný systém môže byť použitý aj na izoláciu proteínov, ktoré sa špecificky viažu na DCRS5.

IX. Vzťah štruktúry a aktivity

Informácia o nevyhnutnosti konkrétnych zvyškov sa determinuje použitím štandardných postupov a analýz. Uskutočňuje sa štandardná mutagenézová analýza, napr. prostredníctvom generovania mnohých rozličných variantov v daných polohách, napr. v uvedených polohách, a hodnotia sa biologické aktivity variantov. To sa môže uskutočňovať v rozsahu determinovania polôh, ktoré modifikujú aktivitu, alebo je možné zameranie na špecifické polohy, aby sa determinovali zvyšky, ktoré môžu byť substituované buď na účely zachovania, alebo blokovania, alebo modulácie biologickej aktivity.

Alternatívne môže z analýzy prirodzených variantov vyplynúť, ktoré polohy tolerujú prirodzené mutácie. To môže byť výsledkom populačnej analýzy odchýlok medzi jedincami alebo kmeňmi, alebo druhmi. Vzorky od vybraných jedincov sa analyzujú, napr. PCR analýzou, a sekvenujú. To umožňuje hodnotenie populačných polymorfizmov.

X. Koexpresia DCRS5 a IL-12RP1

Vektor alebo vektory, kódujúce príslušné gény, sa môžu transfekovať do bunky. Výhodne bude mať takýto vektor selekčné markery na identifikáciu buniek, ktoré boli úspešne transformované. Koexpresia dvoch génov umožní génovým produktom správne sa asociovať a vytvoriť aktívne receptorové komplexy.

Alternatívne je dostupné použitie metód spôsobujúcich asociáciu funkčných dimérov. Pozri napr. O'Shea a ďalší (1989) Science 245: 646-648; Kostelny a ďalší (1992) J. Immunol. 148: 1547-1553; a Patel a ďalší (1996) J. Biol. Chem. 271: 30386-30391. Expresia extracelulámych domén a fyzikálna asociácia, napr. sprostredkovaná afinitou Fos/Jun leucínového zipsu, bude viesť k ligandovým väzobným konštruktom, ktoré by mohli slúžiť ako väzobné zlúčeniny na diagnostické alebo terapeutické použitia.

Všetky tu uvedené citácie sú tu zahrnuté prostredníctvom ich referencie v rovnakom rozsahu, ako keby bola každá publikácia alebo prihláška vynálezu konkrétne a jednotlivo uvedená.

Je možné urobiť mnohé modifikácie a variácie tohto vynálezu bez toho, aby sa vybočilo z ducha a rozsahu vynálezu, ako bude zrejmé priemernému odborníkovi v oblasti. Tu opísané konkrétne uskutočnenia sú poskytnuté len ako príklad a vynález je obmedzený len pripojenými nárokmi spolu s celým rozsahom ekvivalentov, ktoré vyplývajú z nárokov. Vynález nie je obmedzený konkrétnymi uskutočneniami, ktoré sú tu prezentované len ako príklady.

Zoznam sekvencii <110> Schering Corporation < 120> Cicavčie receptorové proteíny, príbuzné reakčné činidlá a spôsoby <130> DX01074 <140> PCT/USO1/15057 <150> US 60/203426 <151> 2000-05-10 <160>5 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211>2859 <212> DNA <213> neznámy <220>

<223> Opis neznámeho organizmu: primát; predpokladá sa, že Homo sapiens <220>

<221>CDS <222> (119)..(2005) <220>

<221> mat peptid <222> (188)..(2005) <220>

<221> rôzne znaky <222> (1)..(2859) <223> Xaa translácie závisia od genetického kódu <400> 1 gtggtacggg aattccattg tgttgggcag ccaacaaggg tggcagcctg gctctgaagt 60 ggaattatgt gcttcaaaca ggttgaaaga gggaaacagt cttttcctgc ttccagac 118

40

atg Met ctc Leu

aat cak Asn Xaa

gtc act att caa

tgg gat gca gta

ata gcc íle Ala ata aac

ctt Leu -10 tgc Cys

tac ata

166 214

Val -20 tgg Trp

Thr tgt Cys

íle Gin cat gga

Trp gga Gly

Asp Ala Val -15

Tyr tct Ser

íle ggc Gly

ttc Phe

agc Ser

att íle

aca aat

His

Gly

Thr

Asn

íle

Asn

45

-5

-1

1

5

cac

atc

tgg

gta

gaa

cca

gcc

aca

att

ttt

aag

atg

ggt

atg

aat

atc

262

His

Xle

Trp

Val

Glu

Pro

Ala

Thr

íle

Phe

Lys

Met

Gly

Met

Asn

íle

10

15

20

25

tct

ata

tat

tgc

caa

gca

att

aag

aac

tgc

caa

cca

agg

aaa

ctt

310

50

Ser

íle

Tyr

Cys

Gin

Ala

íle

Lys

Asn

Cys

Gin

Pro

Arg

Lys

Leu

30

35

40

cat

ttt

tat

aaa

aat

ggc

atc

aaa

gaa

aga

ttt

caa

atc

aca

agg

att

358

His

Phe

Tyr

Lys

Asn

Gly

íle

Lys

Glu

Arg

Phe

Gin

íle

Thr

Arg

íle

45

50

55

aat

aaa

aca

get

cgg

ctt

tgg

tat

aaa

aac

ttt

ctg

gaa

cca

cat

406

Asn

Lys

Thr

Ala

Arg

Leu

Trp

Tyr

Lys

Asn

Phe

Leu

Glu

Pro

His

60

65

70

get

tct

atg

tac

tgc

act

get

gaa

tgt

ccc

aaa

cat

ttt

caa

gag

aca

454

Ala

Ser

Met

Tyr

Cys

Thr

Ala

Glu

Cys

Pro

Lys

His

Phe

Gin

Glu

Thr

60

75

80

85

ctg

ata

tgt

gga

aaa

gac

att

tct

gga

tat

ccg

cca

gat

att

cct

502

Leu 90

íle

Cys

Gly

Lys

Asp 95

íle

Ser

Gly

Tyr 100

Pro

Asp

íle

Pro 105

gat

gaa

gta

acc

tgt

gtc

att

tat

gaa

tat

tca

ggc

aac

atg

act

tgc

Asp

Glu

Val

Thr

Cys 110

Val

íle

Tyr

Glu

Tyr 115

Ser

Gly

Asn

Met

Thr 120

Cys

acc

tgg

aat

get

rgg

aag

ctc

acc

tac

ata

gac

aca

aaa

tac

gtg

gta

Thr

Trp

Asn

Ala 125

Xaa

Lys

Leu

Thr

Tyr 130

íle

Asp

Thr

Lys

Tyr 135

Val

cat

gtg

aag

agt

tta

gag

aca

gaa

gag

caa

cag

tat

ctc

acc

tca

His

Val

Lys 140

Ser

Leu

Glu

Thr

Glu 145

Glu

Gin

Tyr 150

Leu

Thr

Ser

agc

tat

att

aac

atc

tcc

act

gat

tca

tta

caa

ggt

ggc

aag

tac

Ser

Tyr 155

íle

Asn

íle

Ser

Thr 160

Asp

Ser

Leu

Gin

Gly 165

Gly

Lys

Tyr

ttg

gtt

tgg

gtc

caa

gca

aac

gca

cta

ggc

atg

gaa

gag

tca

aaa

Leu 170

Val

Trp

Val

Gin

Ala 175

Ala

Asn

Ala

Leu

Gly 180

Met

Glu

Ser

Lys 185

caa

ctg

caa

att

cac

ctg

gat

ata

gtg

ata

cct

tet

gca

gcc

gtc

Gin

Leu

Gin

íle

His 190

Leu

Asp

íle

Val 195

íle

Pro

Ser

Ala

Ala 200

Val

att

tcc

agg

get

gag

act

ata

aat

get

aca

gtg

ccc

aag

acc

ata

att

íle

Ser

Arg

Ala 205

Glu

Thr

íle

Asn

Ala 210

Thr

Val

Pro

Lys

Thr 215

íle

tat

tgg

gat

agt

caa

aca

att

gaa

aag

gtt

tcc

tgt

gaa

atg

aga

Tyr

Trp

Asp 220

Ser

Gin

Thr

íle 225

Glu

Lys

Val

Ser

Cys 230

Glu

Met

Arg

tac

aag

get

aca

aac

caa

act

tgg

aat

gtt

aaa

gaa

ttt

gac

acc

Tyr

Lys 235

Ala

Thr

Asn

Gin 240

Thr

Trp

Asn

Val

Lys 245

Glu

Phe

Asp

Thr

aat

ttt

aca

tat

gtg

caa

cag

tca

gaa

ttc

tac

ttg

gag

cca

aac

att

Asn 250

Phe

Thr

Tyr

Val

Gin 255

Gin

Ser

Glu

Phe

Tyr 260

Leu

Glu

Pro

Asn

íle 265

aag

tac

gta

ttt

caa

gtg

aga

tgt

caa

gaa

aca

ggc

aaa

agg

tac

tgg

Lys

Tyr

Val

Phe

Gin 270

Val

Arg

Cys

Gin

Glu 275

Thr

Gly

Lys

Arg

Tyr 280

Trp

cag

cct

tgg

agt

tca

ccg

ttt

cat

aaa

aca

cct

gaa

aca

gtt

ccc

Gin

Pro

Trp

Ser 285

Ser

Pro

Phe

His 290

Lys

Thr

Pro

Glu

Thr 295

Val

Pro

cag

gtc

aca

tca

aaa

gca

ttc

caa

cat

gac

aca

tgg

aat

tet

ggg

cta

Gin

Val

Thr 300

Ser

Lys

Ala

Phe

Gin 305

His

Asp

Thr

Trp

Asn 310

Ser

Gly

Leu

aca

gtt

get

tcc

atc

tet

aca

ggg

cac

ctt

act

tet

gac

aac

aga

gga

Thr

Val 315

Ala

Ser

íle

Ser

Thr 320

Gly

His

Leu

Thr

Ser 325

Asp

Asn

Arg

Gly

gac

att

gga

ctt

tta

ttg

gga

atg

atc

gtc

ttt

get

gtt

atg

ttg

tca

Asp 330

íle

Gly

Leu

Leu 335

Gly

Met

íle

Val

Phe 340

Ala

Val

Met

Leu

Ser 345

att

ctt

tet

ttg

att

ggg

ata

ttt

aac

aga

tca

ttc

ega

act

ggg

att

íle

Leu

Ser

Leu

íle 350

Gly

íle

Phe

Asn

Arg 355

Ser

Phe

Arg

Thr

Gly 360

íle

aaa

aga

agg

atc

tta

ttg

tta

ata

cca

aag

tgg

ctt

tat

gaa

gat

att

Lys

Arg

íle 365

Leu

íle

Pro 370

Lys

Trp

Leu

Tyr

Glu 375

Asp

íle

cct

aat

atg

aaa

aac

agc

aat

gtt

gtg

aaa

atg

cta

cag

gaa

aat

agt

Pro

Asn

Met 380

Lys

Asn

Ser

Asn

Val 385

Val

Lys

Met

Leu

Gin 390

Glu

Asn

Ser

gaa

ctt

atg

aat

tcc

agt

gag

cag

gtc

cta

tat

gtt

gat

ccc

Glu

Leu 395

Met

Asn

Ser 400

Ser

Glu

Gin

Val

Leu 405

Tyr

Val

Asp

Pro

atg

att

aca

gag

ata

aaa

gaa

atc

ttc

atc

cca

gaa

cac

aag

cct

aca

Met 410 gac Asp

íle tac Tyr

Thr aag Lys

Glu aag Lys

íle Lys 415

Glu aca Thr

íle gga Gly

Phe ccc Pro

íle ctg Leu

Pro 420 gag Glu

Glu His aca aga

Lys gac Asp

Pro tac Tyr

Thr 425

gag Glu

aat Asn

ccg Pro

1510

Thr

Arg

5

430

435

440

caa

aac

tcg

cta

ttc

gac

aat

act

aca

gtt

gta

tat

att

cct

gat

ctc

1558

Gin

Asn

Ser

Leu

Phe

Asp

Asn

Thr

Val

Tyr

íle

Pro

Asp

Leu

445

450

455

aac

act

gga

tat

aaa

ccc

caa

att

tca

aat

ttt

ctg

cct

gag

gga

age

1606

10

Asn

Thr

Gly

Tyr

Lys

Pro

Gin

íle

Ser

Asn

Phe

Leu

Pro

Glu

Gly

Ser

460

465

470

cat

ctc

age

aat

gaa

att

act

tcc

tta

aca

ctt

aaa

cca

1654

His

Leu

Ser

Asn

Glu

íle

Thr

Ser

Leu

Thr

Leu

Lys

Pro

475

480

485

15

gtt

gat

tcc

tta

gac

tca

gga

aat

ccc

agg

tta

caa

aag

cat

cct

1702

Val

Asp

Ser

Leu

Asp

Ser

Gly

Asn

Pro

Arg

Leu

Gin

Lys

His

Pro

490

4 95

500

505

aat

ttt

get

ttt

tet

gtt

tca

agt

gtg

aat

tca

cta

age

aac

aca

ata

1750

Asn

Phe

Ala

Phe

Ser

Val

Ser

Val

Asn

Ser

Leu

Ser

Asn

Thr

íle

20

510

515

520

ttt

ctt

gga

gaa

tta

age

ctc

ata

tta

aat

caa

gga

gaa

tgc

agt

tet

1798

Phe

Leu

Gly

Glu

Leu

Ser

Leu

íle

Leu

Asn

Gin

Gly

Glu

Cys

Ser

525

530

535

cct

gac

ata

caa

aac

tca

gta

gag

gaa

acc

atg

ctt

ttg

gaa

1846

25

Pro

Asp

íle

Gin

Asn

Ser

Val

Glu

Thr

Met

Leu

Glu

540

545

550

aat

gat

tca

ccc

agt

gaa

act

att

cca

gaa

cag

acc

ctg

ctt

cct

gat

1894

Asn

Asp

Ser

Pro

Ser

Glu

Thr

íle

Pro

Glu

Gin

Thr

Leu

Pro

Asp

555

560

565

30

gaa

ttt

gtc

tcc

tgt

ttg

ggg

atc

gtg

aat

gag

ttg

cca

tet

att

1942

Glu

Phe

Val

Ser

Cys

Leu

Gly

íle

Val

Asn

Glu

Leu

Pro

Ser

íle

570

575

580

585

aat

act

tat

ttt

cca

caa

aat

att

ttg

gaa

age

cac

ttc

aat

agg

att

1990

Asn

Thr

Tyr

Phe

Pro

Gin

Asn

íle

Leu

Glu

Ser

His

Phe

Asn

Arg

íle

35

590

595

600

tca ctc ttg gaa aag tagagctgtg tggtcaaaat caatatgaga aagctgcctt 2045 Ser Leu Leu Glu Lys

605 gcaatctgaa cttgggtttt ccctgcaata gaaattgaat tctgcctctt tttgaaaaaa 2105 atgtattcac atacaaatct tcacatggac acatgttttc atttcccttg gataaatacc 2165 taggtagggg attgctgggc catatgataa gcatatgttt cagttctacc aatcttgttt 2225 ccagagtagt gacatttctg tgctcctacc atcaccatgt aagaattccc gggagctcca 2285 tgccttttta attttagcca ttcttctgcc tmatttctta aaattagaga attaaggtcc 2345 cgaaggtgga acatgcttca tggtcacaca tacaggcaca aaaacagcat tatgtggacg 2405 cctcatgtat tttttataga gtcaactatt tcctctttat tttccctcat tgaaagatgc 2465 aaaacagctc tctattgtgt acagaaaggg taaataatgc aaaatacctg gtagtaaaat 2525 aaatgctgaa aattttcctt taaaatagaa tcattaggcc aggcgtggtg gctcatgctt 2585 gtaatcccag cactttggta ggctgaggtr ggtggatcac ctgaggtcag gagttcgagt 2645 ccagcctggc caatatgctg aaaccctgtc tctactaaaa ttacaaaaat tagccggcca 2705 tggtggcagg tgcttgtaat cccagctact tgggaggctg aggcaggaga atcacttgaa 2765 ccaggaaggc agaggttgca ctgagctgag attgtgccac tgcactccag cctgggcaac 2825 aagagcaaaa ctctgtctgg aaaaaaaaaa aaaa 2859 <210>2 <211> 629 <212> PRT <213> neznámy <400>2

Met

Asn

Xaa

Val -20

Thr

íle

Gin

Trp

Asp -15

Ala

Val

íle

Ala

Leu -10

Tyr

íle

Leu

Phe

Ser -5

Trp

Cys

His

Gly -1

Gly 1

íle

Thr

Asn

íle 5

Asn

Cys

Ser

Gly

His 10

íle

Trp

Val

Glu

Pro 15

Ala

Thr

íle

Phe

Lys 20

Met

Gly

Met

Asn

íle 25

Ser

íle

Tyr

Cys

Gin 30

Ala

íle

Lys

Asn 35

Cys

Gin

Pro

Arg

Lys 40

Leu

His

Phe

Tyr

Lys 45

Asn

Gly

íle

Lys

Glu 50

Arg

Phe

Gin

íle

Thr 55

Arg

íle

Asn

Lys

Thr 60

Thr

Ala

Arg

Leu

Trp 65

Tyr

Lys

Asn

Phe

Leu 70

Glu

Pro

His

Ala

Ser 75

Met

Tyr

Cys

Thr

Ala 80

Glu

Cys

Pro

Lys

His 85

Phe

Gin

Glu

Thr

Leu 90

íle

Cys

Gly

Lys

Asp 95

íle

Ser

Gly

Tyr 100

Pro

Asp

íle

Pro 105

Asp

Glu

Val

Thr

Cys 110

Val

íle

Tyr

Glu

Tyr 115

Ser

Gly

Asn

Met

Thr 120

Cys

Thr

Trp

Asn

Ala 125

Xaa

Lys

Leu

Thr

Tyr 130

íle

Asp

Thr

Lys

Tyr 135

Val

His

Val

Lys 140

Ser

Leu

Glu

Thr

Glu 145

Glu

Gin

Tyr 150

Leu

Thr

Ser

Tyr 155

íle

Asn

íle

Ser

Thr 160

Asp

Ser

Leu

Gin

Gly 165

Gly

Lys

Tyr

Leu 170

Val

Trp

Val

Gin

Ala 175

Ala

Asn

Ala

Leu

Gly 180

Met

Glu

Ser

Lys 185

Gin

Leu

Gin

íle

His 190

Leu

Asp

íle

Val 195

íle

Pro

Ser

Ala

Ala 200

Val

íle

Ser

Arg

Ala 205

Glu

Thr

íle

Asn

Ala 210

Thr

Val

Pro

Lys

Thr 215

íle

Tyr

Trp

Asp 220

Ser

Gin

Thr

íle 225

Glu

Lys

Val

Ser

Cys 230

Glu

Met

Arg

Tyr

Lys 235

Ala

Thr

Asn

Gin 240

Thr

Trp

Asn

Val

Lys 245

Glu

Phe

Asp

Thr

Asn 250

Phe

Thr

Tyr

Val

Gin 255

Gin

Ser

Glu

Phe

Tyr 260

Leu

Glu

Pro

Asn

íle 265

Lys

Tyr

Val

Phe

Gin 270

Val

Arg

Cys

Gin

Glu 275

Thr

Gly

Lys

Arg

Tyr 280

Trp

Gin

Pro

Trp

Ser 285

Ser

Pro

Phe

His 290

Lys

Thr

Pro

Glu

Thr 295

Val

Pro

Gin

Val

Thr 300

Ser

Lys

Ala

Phe

Gin 305

His

Asp

Thr

Trp

Asn 310

Ser

Gly

Leu

Thr

Val 315

Ala

Ser

íle

Ser

Thr 320

Gly

His

Leu

Thr

Ser 325

Asp

Asn

Arg

Gly

Asp 330

íle

Gly

Leu

Leu 335

Gly

Met

íle

Val

Phe 340

Ala

Val

Met

Leu

Ser 345

íle

Leu

Ser

Leu

íle 350

Gly

íle

Phe

Asn

Arg 355

Ser

Phe

Arg

Thr

Gly 360

íle

Lys

Arg

íle 365

Leu

íle

Pro 370

Lys

Trp

Leu

Tyr

Glu 375

Asp

íle

Pro

Asn

Met 380

Lys

Asn

Ser

Asn

Val 385

Val

Lys

Met

Leu

Gin 390

Glu

Asn

Ser

Glu

Leu 395

Met

Asn

Ser 400

Ser

Glu

Gin

Val

Leu 405

Tyr

Val

Asp

Pro

Met 410

íle

Thr

Glu

íle

Lys 415

Glu

íle

Phe

íle

Pro 420

Glu

His

Lys

Pro

Thr 425

Asp

Tyr

Lys

Glu 430

Asn

Thr

Gly

Pro

Leu 435

Glu

Thr

Arg

Asp

Tyr 440

Pro

Gin

Asn

Ser

Leu 445

Phe

Asp

Asn

Thr

Thr 450

Val

Tyr

íle

Pro 455

Asp

Leu

Asn

Thr Gly 460

Tyr Lys

Pro

Gin

íle 465

Ser Asn

Phe

Leu Pro Glu 470

Gly

Ser

His

Leu

Ser

Asn

Glu

íle

Thr

Ser

Leu

Thr

Leu

Lys

Pro

475

480

485

Val

Asp

Ser

Leu

Asp

Ser

Gly

Asn

Pro

Arg

Leu

Gin

Lys

His

Pro

490

495

500

505

Asn

Phe

Ala

Phe

Ser

Val

Ser

Val

Asn

Ser

Leu

Ser

Asn

Thr

íle

510

515

520

Phe

Leu

Gly

Glu

Leu

Ser

Leu

íle

Leu

Asn

Gin

Gly

Glu

Cys

Ser

525

530

535

Pro

Asp

íle

Gin

Asn

Ser

Val

Glu

Thr

Met

Leu

Glu

540

545

550

Asn

Asp

Ser

Pro

Ser

Glu

Thr

íle

Pro

Glu

Gin

Thr

Leu

Pro

Asp

555

560

565

Glu

Phe

Val

Ser

Cys

Leu

Gly

íle

Val

Asn

Glu

Leu

Pro

Ser

íle

570

575

580

585

Asn

Thr

Tyr

Phe

Pro

Gin

Asn

íle

Leu

Glu

Ser

His

Phe

Asn

Arg

íle

590

595

600

Ser

Leu

Glu

Lys

605

<210> 3 <211>1887 <212> DNA <213> reverzná translácia <220>

<221> rôzne znaky <222> (1)..(1887) <223> n môže byť a, c, g alebo t <400> 3 atgaaycayg tgycayggng athttyaara ccnmgnaary aayaaracna tgyacngcng wsnggntayc aayatgacnt caygtnaarw athwsnacng gcnytnggna wsngcngcng taytgggayw acnaaycara garttytayy aarmgntayt cargtnacnw athwsnacng athgtnttyg mgnacnggna ccnaayatga aayaaywsnw ttyathccng mgngaytayc aayacnggnt aayaaygara aayccnmgny wsnaayacna ccngayathc tnacnathca gnathacnaa tgggnatgaa tncayttyta cngcnmgnyt artgyccnaa cnccngayat gyacntggaa snytngarac aywsnytnca tggargarws tnathwsnmg sncaracnac cntggaaygt tngarccnaa ggcarccntg snaargcntt gncayytnac cngtnatgyt thaarmgnmg araaywsnaa sngarcargt arcayaarcc cncaraayws ayaarccnca thacnwsnyt tncaraarca thttyytngg araaywsngt rtgggaygcn yathaaytgy yathwsnath yaaraayggn ntggtayaar rcayttycar hccngaygar ygcnmgnaar ngargargar rggnggnaar naarcarytn ngcngaracn nathgaraar naargartty yathaartay gwsnwsnccn ycarcaygay nwsngayaay nwsnathytn nathytnytn ygtngtnaar nytntaygtn nacngaytay nytnttygay rathwsnaay nacnytnaar yccnaaytty ngarytnwsn ngargargar gtnathgcny wsnggncaya taytgycarg athaargarm aayttyytng garacnytna gtnacntgyg ytnacntaya carcartayy aartayytng carathcayy athaaygcna gtnwsntgyg gayacnaayt gtnttycarg ttyttycaya acntggaayw mgnggngaya wsnytnathg ytnathccna atgytncarg gayccnatga aaraargara aayacnacng ttyytnccng ccnccngtng gcnttywsng ytnathytna acnacnatgy tntayathyt thtgggtnga cngcnathaa gnttycarat arccncaygc thtgyggnaa tnathtayga thgayacnaa tnacnwsnws tntgggtnca tngaygayat cngtnccnaa aratgmgnta tyacntaygt tnmgntgyca aracnccnga snggnytnac thggnytnyt gnathttyaa artggytnta araaywsnga thacngarat ayacnggncc tngtntayat arggnwsnca aywsnytnga tnwsnwsngt aycarggnga tnytngaraa nttywsntgg rccngcnacn raaytgycar hacnmgnath nwsnatgtay rgayathwsn rtaywsnggn rtaygtngtn ntayathaay rgcngcnaay hgtnathccn racnathath yaargcnacn ncarcarwsn rgaracnggn racngtnccn ngtngcnwsn nytnggnatg ymgnwsntty ygargayath rytnatgaay haargarath nytngaracn hccngayytn yytnwsnaay ywsnggnaay naaywsnytn rtgywsnwsn ygaywsnccn wsngaracna thecngarca racnytnytn ccngaygart tygtnwsntg yytnggnath gtnaaygarg arytnccnws nathaayacn tayttyccnc araayathyt ngarwsncay ttyaaymgna thwsnytnyt ngaraar <210>4 <211> 918 <212> PRT <213> neznámy <220>

<223> Opis neznámeho organizmu: primát; pravdepodobne Homo sapiens <400> 4

1800

1860

1887

Met 1

Leu

Thr

Leu

Gin 5

Thr

Trp

Val

Gin 10

Ala

Leu

Phe

íle

Phe 15

Leu

Thr

Glu

Ser 20

Thr

Gly

Glu

Leu

Leu 25

Asp

Pro

Cys

Gly

Tyr 30

íle

Ser

Pro

Glu

Ser 35

Pro

Val

Gin

Leu 40

His

Ser

Asn

Phe

Thr 45

Ala

Val

Cys

Val

Leu 50

Lys

Glu

Lys

Cys

Met 55

Asp

Tyr

Phe

His

Val 60

Asn

Ala

Asn

Tyr

íle 65

Val

Trp

Lys

Thr

Asn 70

His

Phe

Thr

íle

Pro 75

Lys

Glu

Gin

Tyr

Thr 80

íle

Asn

Arg

Thr 85

Ala

Ser

Val

Thr 90

Phe

Thr

Asp

íle

Ala 95

Ser

Leu

Asn

íle

Gin 100

Leu

Thr

Cys

Asn

íle 105

Leu

Thr

Phe

Gly

Gin 110

Leu

Glu

Gin

Asn

Val 115

Tyr

Gly

íle

Thr

íle 120

íle

Ser

Gly

Leu

Pro 125

Pro

Glu

Lys

Pro

Lys 130

Asn

Leu

Ser

Cys

íle 135

Val

Asn

Glu

Gly

Lys 140

Lys

Met

Arg

Cys

Glu 145

Trp

Asp

Gly

Arg 150

Glu

Thr

His

Leu

Glu 155

Thr

Asn

Phe

Thr

Leu 160

Lys

Ser

Glu

Trp

Ala 165

Thr

His

Lys

Phe

Ala 170

Asp

Cys

Lys

Ala

Lys 175

Arg

Asp

Thr

Pro

Thr 180

Ser

Cys

Thr

Val

Asp 185

Tyr

Ser

Thr

Val

Tyr 190

Phe

Val

Asn

íle

Glu 195

Val

Trp

Val

Glu

Ala 200

Glu

Asn

Ala

Leu

Gly 205

Lys

Val

Thr

Ser

Asp 210

His

íle

Asn

Phe

Asp 215

Pro

Val

Tyr

Lys

Val 220

Lys

Pro

Asn

Pro

Pro 225

His

Asn

Leu

Ser

Val 230

íle

Asn

Ser

Glu

Glu 235

Leu

Ser

íle

Leu 240

Lys

Leu

Thr

Trp

Thr 245

Asn

Pro

Ser

íle

Lys 250

Ser

Val

íle

Leu 255

Lys

Tyr

Asn

íle

Gin 260

Tyr

Arg

Thr

Lys

Asp 265

Ala

Ser

Thr

Trp

Ser 270

Gin

íle

Pro

Glu 275

Asp

Thr

Ala

Ser

Thr 280

Arg

Ser

Phe

Thr 285

Val

Gin

Asp

Leu

Lys 290

Pro

Phe

Thr

Glu

Tyr 295

Val

Phe

Arg

íle

Arg 300

Cys

Met

Lys

Glu

Asp 305

Gly

Lys

Gly

Tyr

Trp 310

Ser

Asp

Trp

Ser

Glu 315

Glu

Ala

Ser

Gly

íle 320

Thr

Tyr

Glu

Asp

Arg 325

Pro

Ser

Lys

Ala

Pro 330

Ser

Phe

Trp

Tyr

Lys 335

íle

Asp

Pro

Ser

His 340

Thr

Gin

Gly

Tyr

Arg 345

Thr

Val

Gin

Leu

Val 350

Trp

Lys

Thr

Leu

Pro 355

Pro

Phe

Glu

Ala

Asn 360

Gly

Lys

íle

Leu

Asp 365

Tyr

Glu

Val

Thr

Leu 370

Thr

Arg

Trp

Lys

Ser 375

His

Leu

Gin

Asn

Tyr 380

Thr

Val

Asn

Ala

Thr 385

Lys

Leu

Thr

Val

Asn 390

Leu

Thr

Asn

Asp

Arg 395

Tyr

Leu

Ala

Thr

Leu 400

Thr

Val

Arg

Asn

Leu 405

Val

Gly

Lys

Ser

Asp 410

Ala

Val

Leu

Thr 415

íle

Pro

Ala

Cys

Asp 420

Phe

Gin

Ala

Thr

His 425

Pro

Val

Met

Asp

Leu 430

Lys

Ala

Phe

Pro

Lys 435

Asp

Asn

Met

Leu

Trp 440

Val

Glu

Trp

Thr

Thr 445

Pro

Arg

Glu

Ser

Val 450

Lys

Tyr

íle

Leu 455

Glu

Trp

Cys

Val

Leu 460

Ser

Asp

Lys

Ala

Pro 465

Cys

íle

Thr

Asp

Trp 470

Gin

Glu

Asp

Gly 475

Thr

Val

His

Arg

Thr 480

Tyr

Leu

Arg

Gly

Asn 485

Leu

Ala

Glu

Ser

Lys 490

Cys

Tyr

Leu

íle

Thr 495

Val

Thr

Pro

Val

Tyr 500

Ala

Asp

Gly

Pro

Gly 505

Ser

Pro

Glu

Ser

íle 510

Lys

Ala

Tyr

Leu

Lys 515

Gin

Ala

Pro

Ser 520

Lys

Gly

Pro

Thr

Val 525

Arg

Thr

Lys

Val 530

Gly

Lys

Asn

Glu

Ala 535

Val

Leu

Glu

Trp

Asp 540

Gin

Leu

Pro

Val

Asp 545

Val

Gin

Asn

Gly

Phe 550

íle

Arg

Asn

Tyr

Thr 555

íle

Phe

Tyr

Arg

Thr 560

íle

Gly

Asn

Glu 565

Thr

Ala

Val

Asn

Val 570

Asp

Ser

His

Thr 575

Glu

Tyr

Thr

Leu

Ser 580

Ser

Leu

Thr

Ser

Asp 585

Thr

Leu

Tyr

Met

Val 590

Arg

Met

Ala

Tyr 595

Thr

Asp

Glu

Gly

Gly 600

Lys

Asp

Gly

Pro

Glu 605

Phe

Thr

Phe

Thr

Thr 610

Pro

Lys

Phe

Ala

Gin 615

Gly

Glu

íle

Glu

Ala 620

íle

Val

Pro

Val 625

Cys

Leu

Ala

Phe

Leu 630

Leu

Thr

Leu

Leu 635

Gly

Val

Leu

Phe

Cys 640

Phe

Asn

Lys

Arg

Asp 645

Leu

íle

Lys

His 650

íle

Trp

Pro

Asn

Val 655

Pro

Asp

Pro

Ser

Lys 660

Ser

His

íle

Ala

Gin 665

Trp

Ser

Pro

His

Thr 670

Pro

Arg

His

Asn 675

Phe

Asn

Ser

Lys

Asp 680

Gin

Met

Tyr

Ser

Asp 685

Gly

Asn

Phe

Thr

Asp 690

Val

Ser

Val

Glu 695

íle

Glu

Ala

Asn

Asp 700

Lys

Pro

Phe

Pro 705

Glu

Asp

Leu

Lys

Ser 710

Leu

Asp

Leu

Phe

Lys 715

Lys

Glu

Lys

íle

Asn 720

Thr

Glu

Gly

His

Ser 725

Ser

Gly

íle

Gly

Gly 730

Ser

Cys

Met

Ser 735

Ser

Arg

Pro

Ser 740

íle

Ser

Asp 745

Glu

Asn

Glu

Ser

Ser 750

Gin

Asn

Thr

Ser

Ser 755

Thr

Val

Gin

Tyr

Ser 760

Thr

Val

His

Ser 765

Gly

Tyr

Arg

His

Gin 770

Val

Pro

Ser

Val

Gin 775

Val

Phe

Ser

Arg

Ser 780

Glu

Ser

Thr

Gin

Pro 785

Leu

Asp

Ser

Glu 790

Glu

Arg

Pro

Glu

Asp 795

Leu

Gin

Leu

Val

Asp 800

His

Val

Asp

Gly

Gly 805

Asp

Gly

íle

Leu

Pro 810

Arg

Gin

Tyr

Phe 815

Lys

Gin

Asn

Cys

Ser 820

Gin

His

Glu

Ser

Ser 825

Pro

Asp

íle

Ser

His 830

Phe

Glu

Arg

Ser

Lys 835

Gin

Val

Ser

Val 840

Asn

Glu

Asp

Phe 845

Val

Arg

Leu

Lys

Gin Gin 850

íle Ser

Asp His 855

íle

Ser Gin

Ser Cys 860

Gly

Ser

Gly

Gin

Met

Lys

Met

Phe

Gin

Glu

Val

Ser

Ala

Asp

Ala

Phe

Gly

Pro

Gly

865

870

875

880

Thr

Glu

Gly

Gin

Val

Glu

Arg

Phe

Glu

Thr

Val

Gly

Met

Glu

Ala

885

890

895

Thr

Asp

Glu

Gly

Met

Pro

Lys

Ser

Tyr

Leu

Pro

Gin

Thr

Val

Arg

Gin

900

905

910

Gly

Tyr

Met

Pro

Gin

915

<210>5 <211> 862 <212> PRT <213> neznámy <220 <223> Opis neznámeho organizmu: primát; pravdepodobne Homo sapiens <4005

Met 1

Ala

His

Thr

Phe 5

Arg

Gly

Cys

Ser

Leu 10

Ala

Phe

Met

Phe

íle 15

íle

Thr

Trp

Leu

Leu 20

íle

Lys

Ala

Lys

íle 25

Asp

Ala

Cys

Lys

Arg 30

Gly

Asp

Val

Thr

Val 35

Lys

Pro

Ser

His

Val 40

íle

Leu

Gly

Ser 45

Thr

Val

Asn

íle

Thr 50

Cys

Ser

Leu

Lys

Pro 55

Arg

Gin

Gly

Cys

Phe 60

His

Tyr

Ser

Arg

Arg 65

Asn

Lys

Leu

íle

Leu 70

Tyr

Lys

Phe

Asp

Arg 75

Arg

íle

Asn

Phe

His 80

His

Gly

His

Ser

Leu 85

Asn

Ser

Gin

Val

Thr 90

Gly

Leu

Pro

Leu

Gly 95

Thr

Leu

Phe

Val 100

Cys

Lys

Leu

Ala

Cys 105

íle

Asn

Ser

Asp

Glu 110

íle

Gin

íle

Cys

Gly 115

Ala

Glu

íle

Phe

Val 120

Gly

Val

Ala

Pro

Glu 125

Gin

Pro

Gin

Asn

Leu 130

Ser

Cys

íle

Gin

Lys 135

Gly

Glu

Gin

Gly

Thr 140

Val

Ala

Cys

Thr

Trp 145

Glu

Arg

Gly

Arg

Asp 150

Thr

His

Leu

Tyr

Thr 155

Glu

Tyr

Thr

Leu

Gin 160

Leu

Ser

Gly

Pro

Lys 165

Asn

Leu

Thr

Trp

Gin 170

Lys

Gin

Cys

Lys

Asp 175

íle

Tyr

Cys

Asp

Tyr 180

Leu

Asp

Phe

Gly

íle 185

Asn

Leu

Thr

Pro

Glu 190

Ser

Pro

Glu

Ser

Asn 195

Phe

Thr

Ala

Lys

Val 200

Thr

Ala

Val

Asn

Ser 205

Leu

Gly

Ser

Ser 210

Ser

Leu

Pro

Ser

Thr 215

Phe

Thr

Phe

Leu

Asp 220

íle

Val

Arg

Pro

Leu 225

Pro

Trp

Asp

íle 230

Arg

íle

Lys

Phe

Gin 235

Lys

Ala

Ser

Val

Ser 240

Arg

Cys

Thr

Leu

Tyr 245

Trp

Arg

Asp

Glu

Gly 250

Leu

Val

Leu

Asn 255

Arg

Leu

Arg

Tyr

Arg 260

Pro

Ser

Asn

Ser

Arg 265

Leu

Trp

Asn

Met

Val 270

Asn

Val

Thr

Lys

Ala 275

Lys

Gly

Arg

His

Asp 280

Leu

Asp

Leu

Lys 285

Pro

Phe

Thr

Glu

Tyr 290

Glu

Phe

Gin

íle

Ser 295

Ser

Lys

Leu

His

Leu 300

Tyr

Lys

Gly

Ser

Trp 305

Ser

Asp

Trp

Ser

Glu 310

Ser

Leu

Arg

Ala

Gin 315

Thr

Pro

Glu

Glu 320

Pro

Thr

Gly

Met

Leu 325

Asp

Val

Trp

Tyr

Met 330

Lys

Arg

His

íle

Asp 335

Tyr

Ser

Arg

Gin

Gin 340

íle

Ser

Leu

Phe

Trp 345

Lys

Asn

Leu

Ser

Val 350

Ser

Glu

Ala

Arg

Gly 355

Lys

íle

Leu

His

Tyr 360

Gin

Val

Thr

Leu

Gin 365

Glu

Leu

Thr

Gly

Gly 370

Lys

Ala

Met

Thr

Gin 375

Asn

íle

Thr

Gly

His 380

Thr

Ser

Trp

Thr

Thr 385

Val

íle

Pro

Arg

Thr 390

Gly

Asn

Trp

Ala

Val 395

Ala

Val

Ser

Ala

Ala 400

Asn

Ser

Lys

Gly

Ser 405

Ser

Leu

Pro

Thr

Arg 410

íle

Asn

íle

Met

Asn 415

Leu

Cys

Glu

Ala

Gly 420

Leu

Ala

Pro

Arg 425

Gin

Val

Ser

Ala

Asn 430

Ser

Glu

Gly

Met

Asp 435

Asn

íle

Leu

Val

Thr 440

Trp

Gin

Pro

Arg 445

Lys

Asp

Pro

Ser

Ala 450

Val

Gin

Glu

Tyr

Val 455

Val

Glu

Trp

Arg

Glu 460

Leu

His

Pro

Gly

Gly 465

Asp

Thr

Gin

Val

Pro 470

Leu

Asn

Trp

Leu

Arg 475

Ser

Arg

Pro

Tyr

Asn 480

Val

Ser

Ala

Leu

íle 485

Ser

Glu

Asn

íle

Lys 490

Ser

Tyr

íle

Cys

Tyr 495

Glu

íle

Arg

Val

Tyr 500

Ala

Leu

Ser

Gly

Asp 505

Gin

Gly

Cys

Ser 510

Ser

íle

Leu

Gly

Asn 515

Ser

Lys

His

Lys

Ala 520

Pro

Leu

Ser

Gly

Pro 525

His

íle

Asn

Ala

íle 530

Thr

Glu

Lys

Gly 535

Ser

íle

Leu

íle

Ser 540

Trp

Asn

Ser

íle

Pro 545

Val

Gin

Glu

Gin

Met 550

Gly

Cys

Leu

His 555

Tyr

Arg

íle

Tyr

Trp 560

Lys

Glu

Arg

Asp

Ser 565

Asn

Ser

Gin

Pro

Gin 570

Leu

Cys

Glu

íle

Pro 575

Tyr

Arg

Val

Ser

Gin 580

Asn

Ser

His

Pro

íle 585

Asn

Ser

Leu

Gin

Pro 590

Arg

Val

Thr

Tyr

Val 595

Leu

Trp

Met

Thr

Ala 600

Leu

Thr

Ala

Gly 605

Glu

Ser

His

Gly 610

Asn

Glu

Arg

Glu

Phe 615

Cys

Leu

Gin

Gly

Lys 620

Ala

Asn

Trp

Met

Ala 625

Phe

Val

Ala

Pro

Ser 630

íle

Cys

íle

Ala

íle 635

íle

Met

Val

Gly

íle 640

Phe

Ser

Thr

His

Tyr 645

Phe

Gin

Lys

Val 650

Phe

Val

Leu

Ala 655

Ala

Leu

Arg

Pro

Gin 660

Trp

Cys

Ser

Arg

Glu 665

íle

Pro

Asp

Pro

Ala 670

Asn

Ser

Thr

Cys

Ala 675

Lys

Tyr

Pro

íle 680

Ala

Glu

Lys

Thr 685

Gin

Leu

Pro

Leu

Asp 690

Arg

Leu

íle

Asp 695

Trp

Pro

Thr

Pro

Glu 700

Asp

Pro

Glu

Pro

Leu 705

Val

íle

Ser

Glu

Val 710

Leu

His

Gin

Val

Thr 715

Pro

Val

Phe

Arg

His 720

Pro

Cys

Ser

Asn 725

Trp

Pro

Gin

Arg

Glu 730

Lys

Gly

íle

Gin

Gly 735

His

Gin

Ala

Ser

Glu 740

Lys

Asp

Met

His 745

Ser

Ala

Ser

Pro 750

Pro

Arg

Ala 755

Leu

Gin

Ala

Glu

Ser 760

Arg

Gin

Leu

Val

Asp 765

Leu

Tyr

Lys

Val

Leu 770

Glu

Ser

Arg

Gly

Ser 775

Asp

Pro

Lys

Pro

Glu 780

Asn

Pro

Ala

Cys

Pro 785

Trp

Thr

Val

Leu

Pro 790

Ala

Gly

Asp

Leu

Pro 795

Thr

His

Asp

Gly

Tyr 800

Leu

Pro

Ser

Asn

íle Asp Asp 805

Leu

Pro

Ser 810

His

Glu

Ala

Pro

Leu Ala 815

Asp

Ser

Leu

Glu

Leu

Glu

Pro

Gin

His

íle

Ser

Leu

Ser

Val

Phe

820

825

830

Pro

Ser

Leu

His

Pro

Leu

Thr

Phe

Ser

Cys

Gly

Asp

Lys

Leu

835

840

845

Thr

Leu

Asp

Gin

Leu

Lys

Met

Arg

Cys

Asp

Ser

Leu

Met

Leu

850

855

860

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. V podstate čistý alebo rekombinantný polypeptid, ktorý obsahuje aspoň desať po sebe idúcich aminokyselín vnútrobunkovej časti sekv. č. 2.
2. V podstate čistý alebo rekombinantný antigénny polypeptid, ktorý obsahuje aminokyseliny 1 až 606 zo sekv. č. 2.
3. Izolovaná alebo rekombinantná nukleová kyselina, ktorá kóduje polypeptid podľa nároku 2.
4. Izolovaná alebo rekombinantná nukleová kyselina podľa nároku 3, ktorá obsahuje nukleotidy 188 až 2005 zo sekv. č. 1.
5. V podstate čistý alebo rekombinantný antigénny polypeptid podľa nároku 2, ktorý obsahuje aminokyseliny 23 až 606 zo sekv. č. 2.
6. Izolovaná alebo rekombinantná nukleová kyselina, ktorá kóduje polypeptid podľa nároku 5.
7. Izolovaná alebo rekombinantná nukleová kyselina podľa nároku 6, ktorá obsahuje nukleotidy 119 až 2005 zo sekv. č. 1.
8. Expresný vektor, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 3.
9. Hostiteľská bunka, ktorá obsahuje expresný vektor podľa nároku 8.
10. Hostiteľská bunka podľa nároku 9, ktorá je cicavčou bunkou.
11. Hostiteľská bunka podľa nároku 9, ktorá je hmyzou bunkou.
12. Hostiteľská bunka podľa nároku 9, ktorá je bakteriálnou bunkou.
13. Hostiteľská bunka podľa nároku 9, ktorá je kvasinkovou bunkou.
14. Spôsob produkcie polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

a) kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 9 v podmienkach vhodných na expresiu polypeptidu a

b) izoláciu alebo purifikáciu polypeptidu.
15. Väzobná zlúčenina obsahujúca protilátku alebo antigénové viažuce miesto z protilátky, ktorá sa špecificky viaže na polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu sekv. č. 2.
16. Väzobná zlúčenina podľa nároku 15, ktorá sa špecificky viaže na polypeptid obsahujúci zvyšky 1 až 606 zo sekv. č. 2.
17. Väzobná zlúčenina podľa nároku 16, ktorá sa špecificky viaže na polypeptid obsahujúci zvyšky 356 až 606 zo sekv. č. 2.
18. Väzobná zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15, 16 alebo 17, ktorou je monoklonálna protilátka alebo antigénové viažuce miesto protilátky.
19. Väzobná zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15, 16 alebo 17, ktorou je Fab, Fab2 alebo Fv fragment.
20. Kit, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:

a) väzobnú zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15,16 alebo 17;

b) inštrukcie na použitie.
21. Spôsob výroby antigénu, vyznačujúci sa tým, že komplex protilátky zahŕňa uvedenie väzobnej zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15, 16 alebo 17 do kontaktu s antigénnym polypeptidom zo sekv. č. 2, v príslušných podmienkach na umožnenie vytvorenia komplexu.
22. Heterodiméma zmes, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

a) polypeptid, obsahujúci aminokyseliny 1 až 606 zo sekv. č. 2; a

b) IL-12Rpl.
23. Zmes podľa nároku 22, vyznačujúca sa tým, že je schopná viazať IL-B30/p40.
24. Kit, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:

a) polypeptid, obsahujúci aminokyseliny 1 až 606 zo sekv. č. 2; a

b) inštrukcie na použitie.
25. Kit podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje:

a) ΙΙ_-12β1 polypeptid a

b) p40 alebo IL-B30 polypeptidy, alebo IL-B30/p40 komplex.
26. Zmes obsahujúca antagonistickú protilátku alebo antigénové viažuce miesto z protilátky, ktorá sa viaže na polypeptid obsahujúci aminokyseliny 1-328 zo sekv. č. 2, na použitie ako liek.
27. Zmes obsahujúca antagonistickú protilátku alebo antigénové viažuce miesto z protilátky, ktorá sa viaže na komplex obsahujúci

a) polypeptid, obsahujúci aminokyseliny 1 až 328 zo sekv. č. 2; a

b) extracelulámu časť IL-12Rp 1, na použitie ako liek.
28. Zmes obsahujúca komplex:

a) polypeptid, obsahujúci aminokyseliny 1 až 328 zo sekv. č. 2; a

b) extracelulámu časť IL-12RP1, na použitie ako liek.
29. Zmes obsahujúca antisense nukleovú kyselinu k polynukleotidu kódujúcemu polypeptid obsahujúci sekvenciu č. 2 na použitie ako liek.
30. Zmes obsahujúca agonistickú protilátku alebo antigénové viažuce miesto z protilátky, ktorá sa viaže na komplex obsahujúci

a) polypeptid, obsahujúci aminokyseliny 1 až 328 zo sekv. č. 2; a

b) extracelulámu časť IL-12RP1, na použitie ako liek.
31. Zmes podľa jedného z nárokov 26 až 29 v kombinácii s antagonistom:

a) IL-12;

b) IL-18;

c) TNF alebo

d) IFNy na použitie ako liečivo.
32. Zmes podľa nároku 30 v kombinácii s:

a) IL-12;

b) IL-18;

c) TNF alebo

d) IFNy na použitie ako liečivo.
33. Použitie zmesi definovanej v nárokoch 26 alebo 31 na výrobu lieku na liečenie pacientov majúcich:

a) chronické Thi sprostredkované ochorenie;

b) sklerózu multiplex;

c) reumatoidnú artritídu;

d) osteoartritídu;

e) zápalové ochorenie čriev;

f) cukrovku;

g) psoriázu;

h) sepsu alebo

i) alogénny transplantát.
34. Použitie zmesi definovanej v nárokoch 27, 28 alebo 29 na výrobu lieku na liečenie pacientov majúcich:

a) chronické Thi sprostredkované ochorenie;

b) sklerózu multiplex;

c) reumatoidnú artritídu;

d) osteoartritídu;

e) zápalové ochorenie čriev;

f) cukrovku;

g) psoriázu;

h) sepsu alebo

i) alogénny transplantát.
35. Použitie zmesi definovanej v nárokoch 30 alebo 32 na výrobu lieku na liečenie pacientov trpiacich na:

a) chronickú Th2 odpoveď;

b) nádor;

c) vírusovú infekciu;

d) rast plesní alebo

e) alergickú reakciu.
36. Použitie zmesi definovanej v nárokoch 30 alebo 32 na výrobu lieku na liečenie pacientov dostávajúcich vakcínu.