NO331408B1

NO331408B1 - Betydelig rent eller rekombinant antigenpolypeptid, isolert eller rekombinant nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertscelle, fremgangsmate for fremstilling av et polypeptid, bindingsforbindelse, sett, fremgangsmate for fremstilling av et antigen: antistoffkompleks, heterodimert preparat, preparat samt anvendelse av preparatet ved fremstilling av et medikament for behandling av en pasient

Info

Publication number: NO331408B1
Application number: NO20025354A
Authority: NO
Inventors: Kevin W Moore; Robert A Kastelein; Madaline Chirica; Christi L Parham
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 2000-05-10
Filing date: 2002-11-08
Publication date: 2011-12-19
Also published as: NO20025354D0; DK1287130T3; SI1287130T1; AU6135101A; US7411041B2; JP2012187111A; ZA200208795B; EP1287130A2; NO20025354L; HK1049862B; IL152414A0; US7749718B2; MXPA02011081A; CZ20023698A3; US6756481B2; CA2408571C; EP1287130B2; AU2001261351B2; JP2015110576A; US8110378B2

Abstract

Nukleinsyrer som koder for pattedyr (f eks. primat) reseptorer, rensede reseptorproteiner og fragmenter derav. Antistoffer, både polyklonale og monoklonale, er også tilveiebrakt. Fremgangsmåte for anvendelse av preparater for både diagnostisk og terapeutisk bruk er beskrevet.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører betydelig rent eller rekombinant antigenpolypeptid, isolert eller rekombinant nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, bindingsforbindelse, sett, fremgangsmåte for fremstilling av et antigen: antistoffkompleks, heterodimert preparat, preparat samt anvendelse av preparatet ved fremstilling av et medikament for behandling av en pasient.

Oppfinnelsens bakgrunn

Rekombinant DNA-teknologi henviser generelt til teknikker hvor genetisk informasjon fra en donorkilde integreres inn i en vektor for påfølgende prosessering, slik som gjennom innføring i en vert, hvorved den overførte genetiske informasjon kopieres og/eller uttrykkes i det nye miljøet. Vanligvis forekommer genetisk informasjon i form av komplementært DNA (cDNA) avledet fra budbringer-RNA (mRNA) som koder for et ønsket proteinprodukt. Bæreren er vanligvis et plasmid som har kapasi-tet til å innlemme cDNA for senere replikasjon i en vert, og i noen tilfeller faktisk å kontrollere ekspresjonen av cDNA-et og derved direkte syntese av produktet det kodes for i verten. Se f.eks. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. utg.), vol. 1-3, CSH Press, NY.

Det har i noen tid vært kjent at immunresponsen hos pattedyr er basert på en rekke komplekse cellulære interaksjoner, kalt "immunnettverket". Nyere forskning har gitt ny innsikt i de innerste virkningsmekanismer til dette nettverket. Mens det fortsatt er klart at mye av immunresponsen faktisk utvikles rundt nettverkslignende interaksjoner av lymfocytter, makrofager, granulocytter og andre celler, er immunologer nå generelt av den oppfatning at løselige proteiner, kjent som lymfokiner, cytokiner eller monokiner, spiller en viktig rolle i kontrollen av disse cellulære interaksjonene. Således er det vesentlig interesse for isolering, karakterisering og virknings-mekanismene til cellemodulerende faktorer, en forståelse som vil føre til vesentlige fremskritt i diagnose og behandling av en rekke medisinske abnormiteter, f.eks. immunsystemforstyrrelser.

Lymfokiner bevirker åpenbart cellulære aktiviteter på en rekke måter. Se f.eks. Paul (red. 1996), Fundamental Immunology, 3. utg., Raven Press, New York, og Thomson (red. 1994), The Cytokine Handbook, 2. utg., Academic Press, San Diego. De er blitt vist å understøtte proliferasjonen, veksten og/eller differensieringen av pluripotente hematopoetiske stamceller til et stort antall forløperceller omfattende diverse cellelinjer som utgjør et komplekst immunsystem. Korrekte og balanserte interaksjoner mellom de cellulære komponentene er nødvendig for en sunn immunrespons. De ulike cellelinjene responderer ofte på forskjellig måte når lymfokiner administreres sammen med andre midler.

Cellelinjer som er særlig viktige for immunresponsen, omfatter to klasser lymfocytter: B-celler, som kan fremstille og utskille immunglobuliner (proteiner med evne til å gjenkjenne og binde til fremmed materiale for å bevirke dets fjerning), og T-celler av ulike undergrupper som utskiller lymfokiner og som induserer eller undertrykker B-cellene og ulike andre celler (omfattende andre T-celler), utgjør det immune nettverk. Disse lymfocyttene interagerer med mange andre celletyper.

Forskning for bedre å forstå og behandle ulike immun-forstyrrelser har vært hemmet av den generelle manglende evne til å opprettholde celler fra immunsystemet in vitro. Immunologer har oppdaget at dyrkning av mange av disse cellene kan gjennomføres ved anvendelse av T-celle- og andre cellesuper-natanter, som inneholder ulike vekstfaktorer omfattende mange av lymfokinene.

Det eksisterer en rekke vekst- og regulatoriske faktorer som modulerer morfogenetisk utvikling. Mange reseptorer for cytokiner er kjent. Det er ofte minst to nødvendige subenheter i den funksjonelle reseptor. Se f.eks. Heinrich et al.

(1998), Biochem. J., 334:297-314, Gonda og D'Andrea (1997), Blood, 89:355-369, Presky et al. (1996), Proe. Nat'1 Acad. Sei. USA, 93:14002-14007, Drachman og Kaushansky (1995), Curr. Opin. Hematol., 2:22-28, Theze (1994), Eur. Cytokine Netw., 5:353-368, og Lemmon og Schlessinger (1994), Trends Biochem. Sei., 19:459-463.

Fra det foregående er det åpenbart at oppdagelsen og utviklingen av nye løselige proteiner og deres reseptorer, om fattende de som ligner lymfokiner, burde bidra til nye terapier for et vidt spekter av degenerative eller abnorme tilstander som direkte eller indirekte involverer utvikling, differensiering eller funksjon f.eks. av immunsystemet og/eller hematopoetiske celler. I særdeleshet vil oppdagelsen og forståelsen av nye reseptorer for lymfokinlignende molekyler som forsterker eller potenserer de fordelaktige aktivitetene til andre lymfokiner, være meget fordelaktig. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye reseptorer for ligander som utviser likhet med cytokinlignende preparater og beslektede forbindelser, og fremgangsmåter for deres anvendelse.

EMBL-database aksesjonsnr. AC026054 gjør kjent en DNA-sekvens som har 98 % identitiet med SEQ ID NO: 1 over et område på 1400 nukleotider (nt) fra nt 1300 til 2700.

Presky D. H. et al., "A functional interleukin 12 receptor complex is composed og two beta-type cytokine receptor subunits", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1996, Vol. 93, s. 14002-14007, ISSN 0027-8424, omhandler IL-12-reseptorkomplekset og beskriver kloning av subenheten IL-12R(32.

WU C-Y. et al., "Biological function and distribution of human interleukin-12 receptor beta chain", Eur. J. Immunol., 1996, Vol. 26, s. 345-350, ISSN 0014-2980, undersøker den biologiske funksjonen og fordelingen av IL-12R(31, og konkluderer med at IL-12R(31 er nødvendig, men ikke tilstrekkelig, for ekspresjon av en funksjonell IL-12R.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelsen omfatter et betydelig rent eller rekombinant antigenpolypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter aminosyrerestene 1 til 606 i SEQ ID NO: 2.

Også omfattet av oppfinnelsen er isolert eller rekombinant nukleinsyre, kjennetegnet ved at den koder for polypeptidet ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen en ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen .

Også omfattet av oppfinnelsen er en vertscelle, kjennetegnet ved at den omfatter ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, kjennetegnet ved at den omfatter: a) dyrkning av vertscellen ifølge oppfinnelsen under betingelser som er egnet for ekspresjon av polypeptidet,

og

b) isolering eller rensing av polypeptidet.

Også omfattet av oppfinnelsen er en bindingsforbindelse, kjennetegnet ved at den består av et antistoff eller antigenbindende fragment derav som spesifikt binder til et polypeptid som består av aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 2.

Videre omfatter oppfinnelsen et sett, kjennetegnet ved at det omfatter:

a) bindingsforbindelse ifølge oppfinnelsen, og

b) instruksjoner for anvendelse.

Også omfattet av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for

fremstilling av et antigen: antistoffkompleks, kjennetegnet ved at det omfatter at bindingsforbindelsen ifølge ethvert av kravene 14, 15 eller 16 bringes i kontakt med et antigenpolypeptid ifølge SEQ ID NO: 2 under betingelser som er egnet for dannelsen av komplekset.

Videre omfatter oppfinnelsen et heterodimert preparat, kjennetegnet ved at det omfatter: a) et polypeptid omfattende aminosyrerestene 1 til 606 i SEQ ID NO: 2, og

b) IL-12R(31.

Også omfattet av oppfinnelsen er et preparat, kjennetegnet ved at det består av et antagonistantistoff eller antigenbindende fragment derav som binder til et kompleks som består av: i) et polypeptid som består av aminosyrene 1-328 i SEQ ID

NO: 2, og

ii) den ekstracellulære del av IL-12R(31

for anvendelse som et medikament.

Også omfattet av oppfinnelsen er anvendelse av preparatet ifølge oppfinnelsen ved fremstilling av et medikament for behandling av en pasient som har:

a) en kronisk Thl-mediert sykdom,

b) multippel sklerose,

c) reumatoid artritt,

d) osteoartritt,

e) inflammatorisk tarmsykdom,

f) diabetes,

g) psoriasis,

h) sepsis, eller

i) et allogent transplantat.

Utfyllende informasjon

Foreliggende oppfinnelse er rettet på nye reseptorer beslektet med cytokinreseptorer, f.eks. primat, cytokinreseptorlignende molekylstrukturer benevnt DNAX-cytokinreseptor-subenheter (DCRS) og deres biologiske aktiviteter. Spesielt tilveiebringes beskrivelse av én subenhet gitt navnet DCRS5. Den omfatter nukleinsyrer som koder for selve polypeptidene og fremgangsmåter for deres fremstilling og anvendelse. Nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet delvis ved deres homologi til vedlagte, klonede komplementær-DNA(cDNA)-sekvenser. I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen sammenstilling av p40/IL-B30-liganden med reseptorsubenhetene DCRS5 og IL-12R|$1, hvis pardannelse gir innsikt i indikasjoner for anvendelse av agonistene og antagonistene, basert på reagenser rettet dertil.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et betydelig renset eller rekombinant polypeptid omfattende minst 10 sammenhengende aminosyrer i den intracellulære delen til SEQ ID NO: 2. I visse utførelsesformer gjelder det for peptidet at det: omfatter minst 25 sammenhengende aminosyrer i den intracellulære delen til SEQ ID NO: 2, er rekombinant, omfattende den intracellulære delen til SEQ ID NO: 2, videre omfatter minst 10 sammenhengende aminosyrer i den ikke-intracellulære delen til SEQ ID NO: 2, omfatter minst 25 aminosyrer i den ekstracellulære delen til SEQ ID NO: 2, omfatter fullengde-SEQ ID NO: 2 eller er et betydelig rent, naturlig peptid. I andre utførelsesformer gjelder det for det rekombinante polypeptidet at det: består av hele sekvensen i tabell 1, er et ikke-glykosylert polypeptid, er fra et menneske, omfatter minst 40 sammenhengende aminosyrer fra SEQ ID NO: 2, utviser minst 3 ikke-overlappende segmenter på minst 15 sammenhengende aminosyrer fra SEQ ID NO: 2, er en naturlig polymorf variant av SEQ ID NO: 2, har en lengde på minst 30 aminosyrer, utviser minst to ikke-overlappende epitoper som er spesifikke for en primat-DCRS5, har en molekylvekt på minst 30 kD med naturlig glykosylering, er et syntetisk peptid, forekommer i en steril form, er i en vandig eller bufret løsning, er forbundet til et fast substrat, er konjugert til en annen kjemisk del eller er fysisk forbundet med et IL-12RP1-polypeptid.

Andre utførelsesformer tilveiebringer et betydelig rent eller rekombinant polypeptid omfattende minst to forskjellige ikke-overlappende segmenter på minst 6 sammenhengende aminosyrer i den intracellulære delen til SEQ ID NO: 2, et betydelig renset eller rekombinant polypeptid omfattende minst 12 sammenhengende aminosyrer i den intracellulære delen til SEQ ID NO: 2 eller en betydelig renset, naturlig forekommende polypeptidsekvens omfattende hele SEQ ID NO: 2. I spesielle utførelsesformer vil polypeptidet som omfatter minst to forskjellige ikke-overlappende segmenter på minst 6 sammenhengende aminosyrer i den intracellulære delen til SEQ ID NO: 2 være et hvor: de forskjellige ikke-overlappende segmentene: inkluderer én av minst 12 aminosyrer, inkluderer én av minst 7 aminosyrer, og et annet på minst 9 aminosyrer, inkludert et tredje segment som er forskjellig i minst 6 aminosyrer, eller omfatter én av R355-L373, P378-L405, V407-D426, K428-D439, P441-V452, I454-G460, I465-T587 eller N592-606, eller at polypeptidet videre omfatter minst to forskjellige ikke-overlappende segmenter på minst 6 sammenhengende aminosyrer i den ekstracellulære delen til SEQ ID NO: 2. Alternativt vil polypeptidet som omfatter 12 sammenhengende aminosyrer i den intracellulære delen til SEQ ID NO: 2 være et hvor: segmentet med minst 12 sammenhengende aminosyrer omfatter én av R355-L373, P378-L405, V407-D426, K428-D439, P441-V452, I454-G460, I465-T587 eller N592-606 eller polypeptidet videre omfatter minst to forskjellige ikke-overlappende segmenter på minst 6 sammenhengende aminosyrer i den ekstracellulære delen til SEQ ID NO: 2. Eller det rene polypeptidet med naturlig sekvens omfattende hele SEQ ID NO: 2 kan videre omfatte en rensings- eller deteksjonsepitop. Slike polypeptider kan: bestå av fullengdesekvensen ifølge tabell 1, være et ikke-glykosylert polypeptid, være fra et menneske, omfatte minst 40 sammenhengende aminosyrer ifølge SEQ ID NO: 2, utvise minst tre ikke-overlappende segmenter på minst 15 sammenhengende aminosyrer ifølge SEQ ID NO: 2, være en naturlig polymorf variant av SEQ ID NO: 2, ha en lengde på minst ca. 30 aminosyrer, utvise minst to ikke-overlappende epitoper som er spesifikke for en primat-DCRS5, ha en molekylvekt på minst 30 kD med naturlig glykosylering, være et syntetisk polypeptid, være i en steril form, være i en vandig eller bufret løsning, være bundet til et fast underlag, være forbundet til en annen kjemisk gruppe eller være fysisk forbundet med et IL-12Rpi-polypeptid.

Ulike andre preparater er tilveiebrakt, f.eks. omfattende et betydelig rent polypeptid kombinert med IL-12Rpi-proteinet eller et slikt polypeptid i en bærer, hvori bæreren er: en vandig forbindelse omfattende vann, saltvann og/eller buffer, og/eller er formulert for oral, rektal, nasal, lokal eller parenteral administrasjon.

Sett som omfatter et slikt polypeptid og: en seksjon omfattende polypeptidet, en seksjon omfattende et IL-12RP1-polypeptid, en seksjon omfattende et p40-, IL-B30- eller p40/IL-B30-polypeptid, eller instruksjoner for anvendelse eller disponering av reagenser i settet, tilveiebringes.

Antistoffer og andre bindingsforbindelser tilveiebringes, f.eks. som omfatter et antigenbindende sete fra et antistoff som spesifikt binder til den intracellulære delen av DCRS5, hvori: den bindende forbindelse er i en container, polypeptidet er fra et menneske, den bindende forbindelse er et Fv-, Fab- eller Fab2~fragment, den bindende forbindelse er konjugert til en annen kjemisk gruppe, eller antistoffet: er laget mot en peptidsekvens fra et fullengdepolypeptid ifølge tabell 1, er laget mot en fullengde-DCRS5, er laget mot en renset human DCRS, er immunutvalgt, er et polyklonalt antistoff, binder til en denaturert DCRS5, utviser Kd mot antigen på minst 30 U.M, er bundet til et fast underlag, omfattende en kule- eller plastikk-membran, er i en steril sammensetning, eller er merket for deteksjon, omfattende en radioaktiv eller fluorescerende markør. Sett er også tilveiebrakt som omfatter den bindende forbindelse og: en seksjon omfattende den bindende forbindelse, en seksjon omfattende et p40-polypeptid, et IL-B30-polypeptid, et DCRS5-polypeptid og/eller et IL-12Rpi-polypeptid, en seksjon omfattende et antistoff som binder selektivt til: et p40-polypeptid, et IL-B30-polypeptid, et DCRS5-polypeptid og/eller et IL-12Rpi-poly peptid, eller instruksjoner for anvendelse eller destruksjon av reagenser i settet.

Det er også skaffet til veie fremgangsmåter f.eks. for fremstilling av et antigen-antistoffkompleks, omfattende at et primat-DCRS5-polypeptid under egnede betingelser bringes i kontakt med et antistoff, og derved tillater at komplekset dannes. En slik fremgangsmåte kan være en hvor komplekset er renset fra andre cytokinreseptorer, komplekset er renset fra andre antistoffer, kontakten er med en prøve inneholdende et interferon, kontakten tillater kvantitativ påvisning av antigenet, kontakten er med en prøve inneholdende antistoffet, eller kontakten tillater kvantitativ påvisning av antistoffet. Andre preparater er tilveiebrakt, f.eks. preparater som omfatter en steril bindingsforbindelse eller bindingsforbindelsen og en bærer, hvori bæreren er: en vandig forbindelse, omfattende vann, saltvann og/eller buffer, og/eller er formulert for oral, rektal, nasal, lokal eller parenteral administrasjon.

Det tilveiebringes også en isolert eller rekombinant nukleinsyre som koder for DCRS5-polypeptidet, hvori: DCRS5 er fra et menneske, eller nukleinsyren koder for en antigenisk peptidsekvens ifølge tabell 1, koder for et mangfold av anti-geniske peptidsekvenser ifølge tabell 1, utviser identitet over minst 13 nukleotider med et naturlig cDNA som koder for segmentet, er en ekspresjonsvektor, videre omfatter et replikasjonsorigo, er fra en naturlig kilde, omfatter en påvisningsmarkør, omfatter syntetisk nukleotidsekvens, er mindre enn 6 kb, fortrinnsvis mindre enn 3 kb, er fra en primat, omfatter en naturlig kodende sekvens i full lengde, er en hybridiserings-probe for et gen som koder for DCRS5, eller en PCR-primer, et PCR-produkt eller en mutageneseprimer. Celler som inneholder den rekombinante nukleinsyren tilveiebringes, inkludert hvor cellen er: en prokaryot celle, en eukaryot celle, en bakteriecelle, en gjærcelle, en insektcelle, en pattedyrcelle, en musecelle, en primatcelle eller en humancelle.

Utførelsesformer av settet inkluderer de som omfatter nukleinsyren og: en seksjon omfattende nukleinsyren, en seksjon omfattende en nukleinsyre som koder for: et p40-polypeptid, et IL-B30-polypeptid, et DCRS5-polypeptid og/eller et IL-12Rpi-polypeptid, en seksjon omfattende: et p40-polypeptid, et IL-B30- polypeptid, et DCRS5-polypeptid og/eller et IL-12Rpi-polypeptid, en seksjon omfattende et antistoff som selektivt binder til: et p40-polypeptid, et IL-B30-polypeptid, et DCRS5-polypeptid og/eller et IL-12Rpi-polypeptid, eller instruksjoner for anvendelse eller disponering av reagenser i settet.

Andre nukleinsyreutførelsesformer omfatter de som hybridiserer under vaskebetingelser på 30 minutter ved 30 °C og mindre enn 2 M salt til delen av SEQ ID NO: 1 som koder for den intracellulære delen, eller utviser identitet over en strekning på minst ca. 30 nukleotider med den intracellulære delen til en primat-DCRS5. Fortrinnsvis vil en slik nukleinsyre være en hvor: vaskebetingelsene er ved 45 °C og/eller 500 mM salt eller 55 °C og/eller 150 mM salt, eller strekningen er på minst 55 eller 75 nukleotider.

Terapeutisk anvendelse omfatter fremgangsmåter for modulering av fysiologi eller utvikling av en celle omfattende å bringe cellen i kontakt med: en antagonist av p40/IL-B30, som er et kompleks omfattende: den ekstracellulære delen til en primat-DCRS5 og/eller den ekstracellulære delen til en primat-IL-12Rpi, en antagonist av p40/IL-B30 som er et antistoff som binder et kompleks omfattende: primat-DCRS5 og/eller primat-IL-12Rpi, en antagonist av p40/IL-B30 som er et antistoff som binder til DCRS5, en antagonist av p40/IL-B30 som er et antistoff mot IL-12Rpi, en antagonist av p40/IL-B30 som er en antisensenukleinsyre mot DCRS5 eller IL-12RP1, eller en agonist av p40/IL-B30 som er et antistoff som binder et kompleks omfattende primat-DCRS5 og/eller primat-IL-12Rpi. I én type fremgangsmåte er kontakten med en antagonist, og kontakten utføres i kombinasjon med en antagonist for IL-12, IL-18, TNF og/eller IFNy, eller cellen er fra en vert som: utviser tegn eller symptomer på kronisk TH1-mediert sykdom, utviser symptomer eller tegn på multippel sklerose, reumatoid artritt, osteoartritt, "inflammatory bowel disease", diabetes, psoriasis eller sepsis, eller mottar et allogent transplantat. I motsatt fall kan fremgangsmåten være å bevirke kontakt med en agonist, og: kontakten skjer i kombinasjon med IL-12, IL-18, TNF eller IFNy, eller cellen er fra en vert som: utviser tegn eller symptomer på en kronisk Th2-respons, lider av en tumor, virus eller soppvekst, mottar en vaksine, eller lider av en allergisk respons.

Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer Disposisjon

I. Generelt

II. Aktiviteter

III. Nukleinsyrer

A. kodende fragmenter, sekvenser, prober

B. mutasjoner, kimærer, fusjoner

C. tillaging av nukleinsyrer

D. vektorer, celler omfattende

IV. Proteiner, peptider

A. fragmenter, sekvenser, immunogener, antigener B. muteiner C. agonister/antagonister, funksjonelle ekvivalenter

D. tillaging av proteiner

V. Tillaging av nukleinsyrer og proteiner

A. syntetiske

B. rekombinante

C. naturlige kilder

VI. Antistoffer

A. polyklonale

B. monoklonale

C. fragmenter, Kd

D. antiidiotypiske antistoffer

E. hybridomcellelinjer

VII. Sett, diagnoser og kvantitering

A. ELISA

B. mRNA-kodende analyse

C. kvalitative/kvantitative

D. sett

VIII. Terapeutiske preparater og fremgangsmåter

A. kombinasjonspreparater

B. enhetsdose

C. administrasjon

IX. Screening.

I. Generelt

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer aminosyresekvensen og DNA-sekvensen til pattedyr, inkludert primat, cytokinreseptorlignende subenhetsmolekyler, hvor den ene, som er blitt gitt navnet DNAX-cytokinreseptorsubenhet 5 (DCRS5), har bestemte definerte, både strukturelle og biologiske egenskaper. Ulike cDNA-er som koder for disse molekylene, ble skaffet til veie fra primat, f.eks. humane cDNA-sekvensbibliotek. Andre primat- eller andre pattedyrsmotsvarigheter kunne også være ønskelig.

I tillegg tilveiebringes sammenstilling av p40/IL-B30-ligand med reseptorsubenheter DCRS5 og IL-12R01, hvis pardannelse tilveiebringer innsikt i indikasjoner for anvendelse av agonister og antagonister basert på reagenser rettet dertil.

Noen av standardfremgangsmåtene som er anvendbare, er beskrevet eller referert, f.eks. i Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. utg.), vol. 1-3, CSH Press, NY, Ausubel et al., Biology, Greene Publishing Asso-ciates, Brooklyn, NY, eller Ausubel et al. (1987 og periodiske supplementer), Current Protocols in Molecular Biology, Greene/ Wiley, New York.

Nukleotid (SEQ ID NO: 1) som koder for DCRS5-segment fra en primat, f.eks. et menneske, og tilsvarende aminosyresekvens (SEQ ID NO: 2), vist i tabell 1. Den antatte signal-sekvensen er indikert, men kan avhenge av celletype eller kan være noen få residuer i begge retninger. Potensielle N-glyko-syleringsseter er ved asparaginresiduene 6, 24, 58, 118, 157, 209 og 250. Disulfidbindinger finnes sannsynligvis mellom cysteinresiduene ved posisjoner 29 og 78, og et konservert C CXW-motiv er funnet ved posisjonene 110/121/123. Tryptofan ved 219 og WxxWS-motivet fra 281-285 er betydningsfullt. Segmentet fra ca. 1-101 er et Ig-domene, fra ca. 102-195 er et cytokinbindende domene 1, fra ca. 196-297 er et cytokinbindende domene 2, fra ca. 298-330 er en linker, fra ca. 329-354 er et transmembransegment og fra ca. 356-606 er et intracellulært domene. Intracellulære trekk omfatter antatte SH2-bindingsseter ved Y374-I377, Y461-Q464 og Y588-Q591 og potensielt viktige tyrosinresiduer ved 406, 427, 440 og 453. Disse setene og deres tilstøtende områder er betydningsfulle.

ORF inneholder en antatt signalsekvens som er foreslått å bli spaltet ved ...CHG/GIT..., som vist ovenfor. Et antatt ekstracellulært domene på 328 aminosyrer er etterfulgt av et antatt transmembransegment, og endelig et cytoplasmatisk domene på ca. 252 aminosyrer. De ligandbindende funksjoner er antatt å ligge i det ekstracellulære domenet.

Den reverse translasjonsnukleinsyresekvensen er tilveiebrakt i tabell 2.

De nærmeste slektningene til det ekstracellulære domenet til "IL-30R" er IL-6-signaltransduser gpl30 og IL-12RP2. En noe fjernere slektning er GCSF-reseptor, leptinreseptor, leukemiinhibisjonsfaktorreseptor og CNTF-reseptor. Således er "IL-30R" et medlem av klasse I-grenen til cytokinreseptor-superfamilien og er nært beslektet med IL-6R/IL-12R-familien.

Tabell 3 viser sammenligning av de tilgjengelige sekvensene for primatreseptorsubenheter med primat, f.eks. human DCRS5 (IL-30R). DCRS5 har likhetstrekk med IL-6-reseptorsubenhet gpl30 (f.eks. IL-6R subenhet) og IL-12Rp2-subenheten. DCRS5 utviser strukturelle trekk for en beta-subenhet, men den faktiske sekvensen av proteininteraksjoner og signaliseringen forblir uløst.

Uttrykket DCRS5 brukes her for å beskrive et protein omfattende aminosyresekvensen vist i tabell 1. I mange tilfeller vil et vesentlig fragment derav være funksjonelt eller struk-turelt ekvivalent, omfattende f.eks. ytterligere ekstracellulære segmenter. Oppfinnelsen inkluderer også en proteinvariasjon av det respektive DCRS5-allel hvis sekvens er tilveiebrakt, f.eks. et mutein eller andre konstruksjoner. Slike varianter vil typisk utvise mindre enn ca. 10 % sekvensforskjeller med målregionen, og vil således ofte ha mellom 1 og 11 fold substitusjoner, f.eks. 2, 3, 5, 7 fold og andre. Det omfatter også allele og andre varianter, f.eks. naturlig polymorfisme, av proteinet som beskrives. Det vil typisk binde til dets tilsvarende biologiske ligand, muligens i en dimerisert tilstand med en alfa-reseptor-subenhet, med høy affinitet, f.eks. minst ca. 100 nM, vanligvis bedre enn ca. 30 nM, fortrinnsvis bedre enn ca. 10 nM, og mer foretrukket bedre enn ca. 3 nM. Uttrykket skal også anvendes her for å henvise til beslektede, naturlig forekommende former, f.eks. alleler, polymorfe varianter og metabolske varianter av pattedyrproteinet. Foretrukne former av reseptorkompleksene vil binde den egnede ligand med en affinitet og selektivitet som er passende for en ligand-reseptorinteraksjon.

Det beskrives også kombinasjoner av proteiner eller peptider som har vesentlig aminosyresekvensidentitet med aminosyresekvensen i tabell 1. Det vil omfatte sekvensvarianter med relativt få substitusjoner, f.eks. fortrinnsvis færre enn ca. 3-5.

Et betydelig polypeptid-"fragment" eller -"segment" er en rekke med aminosyreresiduer på minst ca. 8 aminosyrer, generelt minst 10 aminosyrer, mer generelt minst 12 aminosyrer, ofte minst 14 aminosyrer, enda oftere minst 16 aminosyrer, typisk minst 18 aminosyrer, mer typisk minst 20 aminosyrer, vanligvis minst 22 aminosyrer, mer vanlig minst 24 aminosyrer, fortrinnsvis minst 26 aminosyrer, mer foretrukket minst 28 aminosyrer og i særlig foretrukne utførelsesformer minst ca. 30 eller flere aminosyrer. Sekvensene til segmentene av ulike proteiner kan sammenlignes med hverandre over en passende distanse. I mange situasjoner kan fragmenter utvise de samme funksjonelle egenskaper som de intakte subenhetene, f.eks. kan det ekstracellulære domenet til den transmembrane reseptor bibeholde ligand-bindingstrekkene og kan anvendes til fremstilling av et løselig reseptorlignende kompleks.

Aminosyresekvenshomologi eller sekvensidentitet bestemmes ved optimalisering av residuesammenligning. I noen sammenligninger kan mellomrom introduseres hvis påkrevd. Se f.eks. Needleham et al. (1970), J. Mol. Biol., 48:443-453, Sankoff et al. (1983), kapittel 1 i Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA, og programvarepakken fra IntelliGenetics, Mountain View, CA, og the University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI. Dette endres når man vurderer konservative substitusjoner som matcher. Konservative substitusjoner inkluderer typisk substitusjoner innen følgende grupper: glysin, alanin, valin, isoleucin, leucin, asparaginsyre, glutaminsyre, asparagin, glutamin, serin, treonin, lysin, arginin, og fenylalanin, tyrosin. Homologe aminosyresekvenser har til hensikt å inkludere naturlige allele og interartsvariasjoner i cytokinsekvensen. Typiske homologe proteiner eller peptider vil ha fra 50 til 100 % homologi (dersom mellomrom kan introduseres), til 60-100 % homologi (dersom konservative substitusjoner er inkludert) med et aminosyresekvenssegment ifølge Tabell 1. Homologimålinger vil være på minst ca. 70 %, generelt minst 76 %, mer generelt minst 81 %, ofte minst 85 %, oftere minst 88 %, typisk minst 90 %, mer typisk minst 92 %, vanligvis minst 94 %, mer vanlig minst 95 %, fortrinnsvis minst 96 % og mer foretrukket minst 97 %, og i særlig foretrukne utførelsesformer minst 98 % eller mer. Graden av homologi vil variere med lengden av de sammenlignede segmentene. Homologe proteiner eller peptider, slik som de allele varianter, vil dele de fleste biologiske aktiviteter med den foretrukne utførelsesform beskrevet i tabell 1, særlig i den intracellulære delen.

Uttrykket "biologisk aktivitet" anvendes her for å beskrive, uten begrensning, effekter på signalisering, inflammatoriske responser, medfødt immunitet og/eller morfogen utvikling av cytokinlignende ligander. Disse reseptorene bør f.eks. bevirke fosfatase- eller fosforylaseaktiviteter, aktiviteter som er lett målbare ved standardfremgangsmåter. Se f.eks. Hardie et al. (red. 1995), The Protein Kinase FactBook, vol. I og II, Academic Press, San Diego, CA, Hanks et al. (1991), Meth. Enzymol., 200:38-62, Hunter et al. (1992), Cell, 70:375-388, Lewin (1990), Cell, 61:743-752, Pines et al. (1991), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 56:449-463, og Parker et al. (1993), Nature, 363:736-738. Reseptorene eller deler derav kan være nyttige som fosfatmarkørenzymer for merking av generelle eller spesifikke substrater. Subenhetene kan også være funksjonelle immunogener for å fremkalle gjenkjennende antistoffer eller antigener som er i stand til å binde antistoffer.

Uttrykkene ligand, agonist, antagonist og analog til, f.eks. et DCRS5-petisjonstrekk ved ligand-reseptor-interaksjoner, f.eks. hvor reseptoren er en naturlig reseptor eller et antistoff. De sannsynlige, cellulære responser er typisk bevirket gjennom reseptor-tyrosinkinasereaksjonspor.

En ligand er også et molekyl som fungerer enten som en naturlig ligand hvortil angitte reseptor eller en analog derav binder, eller et molekyl som er en funksjonell analog av den naturlige liganden. Den funksjonelle analogen kan være en ligand med strukturelle modifikasjoner, eller kan være et fullstendig ubeslektet molekyl som har en molekylær form som interagerer med de rette ligandbindingsdeterminantene. Ligandene kan fungere som agonister eller antagonister, se f.eks. Goodman et al. (red. 1990), Goodman&Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon Press, New York.

Rasjonell legemiddeldesign kan også være basert på strukturelle studier av de molekylære formene til en reseptor eller et antistoff og andre effektorer eller ligander. Se f.eks. Herz et al. (1997), J. Recept. Signal Transduct. Res., 17:671-776, og Chaiken et al. (1996), Trends Biotechnol., 14:369-375. Effektorer kan være andre proteiner som bevirker andre funksjoner som respons på ligandbindingen, eller andre proteiner som normalt interagerer med reseptoren. En fysisk struktur-bestemmelse, f.eks. røntgenkrystallografi eller todimensjonal NMR-teknikk er én måte å bestemme hvilke seter som interagerer spesifikt med andre proteiner. Disse vil tilveiebringe veiledning i forhold til hvilke aminosyreresiduer som danner molekylære kontaktregioner. For en detaljert beskrivelse av protein-strukturbestemmelse se f.eks. Blundell og Johnson (1976), Protein Crystallography, Academic Press, New York.

II. Aktiviteter

Cytokinreseptorlignende proteiner vil ha en rekke forskjellige biologiske aktiviteter, f.eks. intracellulær signalisering, f.eks. via STAT4, som modulerer celleproliferasjonen, eller i fosfatmetabolismen, ved å bli tilsatt til eller fjernet fra spesifikke substrater, typisk proteiner. Slike biologiske aktiviteter vil generelt resultere i modulering av en inflammatorisk funksjon, andre medfødte immunresponser eller en morfologisk effekt. Subenheten vil trolig ha en spesifikk lav bindingsaffinitet til liganden.

DCRS5 har de karakteristiske motivene til en reseptor som signaliserer gjennom JAK-reaksjonsveien. Se f.eks. Ihle et al. (1997), Stem Cells, 15(suppl. 1):105-111, Silvennoinen et al. (1997), APMIS, 105:497-509, Levy (1997), Cytokine Growth Faktor Review, 8:81-90, Winston og Hunter (1996), Current Biol., 6:668-671, Barrett (1996), Baillieres Clin. Gastroenterol., 10:1-15, og Briscoe et al. (1996), Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei., 351:167-171. SH2-bindingsmotivet beskrevet ovenfor er av særlig interesse.

De biologiske aktivitetene til cytokinreseptorsub-enhetene vil være relatert til innføring eller fjerning av fosfatgrupper på substrater, på en karakteristisk, spesifikk måte, men fra tid til annen på en uspesifikk måte. Substrater kan identifiseres, eller betingelser for enzymatisk aktivitet kan måles ved standardmetoder, f.eks. som beskrevet av Hardie et al. (red. 1995), The Protein Kinase FactBook, vol. I og II, Academic Press, San Diego, CA, Hanks et al. (1991), Meth. Enzymol., 200:38-62, Hunter et al. (1992), Cell, 70:375-388, Lewin (1990), Cell, 61:743-752, Pines et al. (1991), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 56:449-463, og Parker et al. (1993), Nature, 363:736-738.

Reseptorsubenhetene kan kombineres for å danne funksjonelle komplekser, f.eks. som kan være egnet for å binde ligand eller fremstille antistoffer. Disse vil ha viktig diagnostisk anvendelse, inkludert påvisning eller kvantitering. Den funksjonelle bindingen av reseptoren til p40/IL-B30-liganden tilveiebringer viktig innsikt inn i de kliniske indikasjoner som reseptoren vil være nyttig for. Antagonister og agonister vil således ha antatte funksjonelle effekter.

III. Nukleinsyrer

Denne oppfinnelsen er basert på anvendelse av isolerte nukleinsyrer eller fragmenter, f.eks. som koder for disse eller nært beslektede proteiner eller fragmenter derav, f.eks. for å kode for et tilsvarende polypeptid, fortrinnsvis et som er biologisk aktivt. I tillegg dekker denne oppfinnelsen isolerte eller rekombinante DNA-er som koder for kombinasjoner av slike proteiner eller polypeptider som har karakteristiske sekvenser, f.eks. av DCRS5-er alene eller i kombinasjon med andre, slik som en IL-12Rpi-subenhet (se Showe et al. (1996), Ann. N.Y. Acad. Sei., 795:413-425, Gately et al. (1998), Ann. Rev. Immunol., 16:495-521, GenBank U03187, NM_005535). Karakteristisk er nukleinsyren i stand til å hybridisere, under riktige betingelser, med et nukleinsyresekvenssegment som vist i tabell 1, men fortrinnsvis ikke med et tilsvarende segment fra en annen reseptor beskrevet i tabell 3. Angitte biologisk aktive protein eller polypeptid kan være et protein med full lengde eller et fragment, og vil karakteristisk ha et segment av en aminosyresekvens som er meget homolog, f.eks. har betydelige distanser som er identiske med en vist i tabell 1. Videre dekker denne oppfinnelsen anvendelsen av isolert eller rekombinant nukleinsyre, eller fragmenter derav, som koder for proteiner som har fragmenter som er ekvivalente med DCRS5-proteinene, f.eks. intracellulære deler. De isolerte nukleinsyrene kan ha de respektive regulatoriske sekvensene i 5'- og 3'-flanker, f.eks. promoterer, "enhancere", poly-A-addisjonssignaler og andre fra det naturlige genet. Kombinasjoner som beskrevet er også tilveiebrakt, f.eks. kombinasjonen av DCRS5 og IL-12RP1 eller deres ekstracellulære ligandbindingsdeler som ligandantagonister. Diagnostiske anvendelser, f.eks. på polymorfe eller andre varianter er også klart viktige.

En "isolert" nukleinsyre er en nukleinsyre, f.eks. en RNA-, DNA- eller blandet polymer, som er betydelig ren, f.eks. separert fra andre komponenter som naturlig medfølger en nativ sekvens, slik som ribosomer, polymeraser, og omkringliggende genomiske sekvenser fra opphavsarten. Uttrykket favner en nukleinsyresekvens som er blitt fjernet fra sitt naturlig forekommende miljø, og omfatter rekombinant eller klonede DNA-isolater, som derved skiller seg fra naturlig forekommende preparater og kjemisk syntetiserte analoger eller analoger som er biologisk syntetisert av heterologe systemer. Et betydelig rent molekyl omfatter isolerte former av molekylet, enten fullstendig eller betydelig rent.

En isolert nukleinsyre vil generelt være et homogent preparat av molekyler, men vil i noen utførelsesformer inneholde heterogenitet, fortrinnsvis i liten grad. Det er karakteristisk at denne heterogeniteten er funnet ved polymerens ender eller deler som ikke er kritiske for en ønsket biologisk funksjon eller aktivitet.

En "rekombinant" nukleinsyre er karakteristisk definert enten ved sin fremgangsmåte for fremstilling eller sin struktur. Med henvisning til fremgangsmåten for fremstilling, f.eks. et produkt laget ved en fremgangsmåte, er fremgangsmåten anvendelse av rekombinant nukleinsyreteknikk, f.eks. som omfatter menneske-lig inngripen i nukleotidsekvensen. Denne inngripen omfatter karakteristisk in vitro-manipulasjon, selv om det under visse omstendigheter kan omfatte mer klassiske dyreavlsteknikker. Alternativt kan det være en nukleinsyre som er laget ved å generere en sekvens bestående av fusjon av to fragmenter som ikke er naturlig sammenhengende med hverandre, men som er ment å ekskludere naturlige produkter, f.eks. naturlig forekommende mutanter som er funnet i deres naturlige tilstand. Således omfattes f.eks. produkter som er laget ved å transformere celler med en unaturlig forekommende vektor, så vel som nukleinsyrer omfattende sekvenser avledet ved å bruke syntetiske oligonukleo-tidfremgangsmåte. En slik fremgangsmåte er ofte utført for å erstatte, f.eks. et kodon, med et redundant kodon som koder for den samme eller en konservativ aminosyre, mens man karakteristisk innfører eller fjerner et restriksjonsenzymsekvens-gjenkjennelsessete, eller for å gjøre noen struktur-funksjons-analyser. Alternativt utføres prosessen for å forene nuklein-syresegmenter med ønskede funksjoner for å generere en enkelt genetisk enhet omfattende en ønsket kombinasjon av funksjoner som ikke finnes i de vanlig tilgjengelige, naturlige former, f.eks. som koder for et fusjonsprotein. Restriksjonsenzymgjenkjennelsesseter er ofte målet for slike kunstige manipuleringer, men andre setespesifikke mål, f.eks. promoterer, DNA-replikasjonsseter, reguleringssekvenser, kontrollsekvenser eller andre nyttige trekk kan tilsiktet inkorporeres. Et lignende konsept er tiltenkt et rekombinant polypeptid, f.eks. et fusjonspolypeptid. Dette vil omfatte en dimer gjentakelse eller fusjon av DCRS5 med IL-12Rpi-subenheten. Syntetiske nukleinsyrer som gjennom genetisk koderedundans koder for polypeptider som er ekvivalente med fragmenter av DCRS5 og fusjoner av sekvenser fra en rekke forskjellige beslektede molekyler, f.eks. andre cytokinreseptorfamiliemedlemmer, er spesifikt inkludert.

Et "fragment" i en nukleinsyresammenheng er et sammenhengende segment på minst ca. 17 nukleotider, generelt minst 21 nukleotider, mer generelt minst 25 nukleotider, vanligvis minst 30 nukleotider, mer vanlig minst 35 nukleotider, ofte minst 39 nukleotider, oftere minst 45 nukleotider, typisk minst 50 nukleotider, mer typisk minst 55 nukleotider, vanligvis minst 60 nukleotider, mer vanlig minst 66 nukleotider, fortrinnsvis minst 72 nukleotider, mer foretrukket minst 79 nukleotider, og i særlig foretrukne utførelsesformer minst 85 eller flere nukleotider, omfattende 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200 etc. Karakteristisk kan fragmenter med ulike genetiske sekvenser sammenlignes med hverandre over en passende distanse, særlig slike definerte segmenter som domenene beskrevet nedenfor.

En nukleinsyre som koder for DCRS5, vil være særlig nyttig til å identifisere gener, mRNA- og cDNA-typer som koder for det samme eller nært beslektede proteiner, så vel som DNA-er som koder for polymorfe, allele eller andre genetiske varianter, f.eks. fra forskjellige individer eller beslektede arter. Foretrukne prober for slike screeninger er de fra regionene til reseptoren som er konservert mellom ulike polymorfe varianter, eller som inneholder nukleotider som mangler spesifisitet, og vil fortrinnsvis være av full lengde eller nesten slik. I andre situasjoner vil polymorfe variantspesifikke sekvenser være mer egnet. Kombinasjoner av polymorfe varianter av DCRS5 med varianter av IL-12RP1 kan også diagnostiseres.

Denne oppfinnelsen dekker videre rekombinante nuklein-syremolekyler og fragmenter som har en nukleinsyresekvens iden-tisk med eller som er meget homolog med det isolerte DNA-et fremlagt her. Nærmere bestemt vil sekvensene ofte bli knyttet operabelt til DNA-segmenter som kontrollerer transkripsjon, translasjon og DNA-replikasjon. Disse tilleggssegmentene bistår typisk i ekspresjonen av det ønskede nukleinsyresegmentet.

Homologe eller meget identiske nukleinsyresekvenser som utviser vesentlig likhet når de sammenlignes med hverandre, f.eks. DCRS5-sekvenser. Standarder for homologi i nukleinsyrer er enten mål for homologi generelt anvendt innen teknikken ved sekvenssammenligninger eller basert på hybridiseringsbetingel ser. Sammenlignbare hybridiseringsbetingelser er beskrevet mer detaljert nedenfor.

Betydelig identitet i nukleinsyresekvenssammenlignings-sammenheng betyr enten at segmentene eller deres komplementære tråder, når de sammenlignes, er identiske når de er optimalt oppstilt på linje, med passende nukleotidinnskudd eller

-delesjoner i minst ca. 60 % av nukleotidene, generelt minst 66 %, vanligvis minst 71 %, ofte minst 76 %, oftere minst 80 %, vanligvis minst 84 %, mer vanlig minst 88 %, karakteristisk minst 91 %, mer karakteristisk minst ca. 93 %, fortrinnsvis minst ca. 95 %, mer foretrukket minst ca. 96-98 % eller mer, og i særlig foretrukne utførelsesformer så høyt som ca. 99 % eller mer av nukleotidene, omfattende f.eks. segmenter som koder for strukturelle domener eller andre beskrevne segmenter. Alternativt vil vesentlig identitet forekomme når segmentene vil hybridisere til en tråd eller dens komplementære tråd, under selektive hybridiseringsbetingelser, ved typisk å anvende en sekvens avledet fra tabell 1. Selektiv hybridisering vil karakteristisk forekomme når det er minst ca. 55 % homologi over en distanse på minst ca. 14 nukleotider, mer karakteristisk minst ca. 65 %, fortrinnsvis minst ca. 75 % og mer foretrukket minst ca. 90 %. Se Kanehisa (1984), Nucl. Acids Res., 12:203-213. Lengden til homologisammenligningen, som beskrevet, kan være over lengre distanser og vil i visse utførelsesformer være over en distanse på minst ca. 17 nukleotider, generelt minst ca. 20 nukleotider, ordinært minst ca. 24 nukleotider, vanligvis minst ca. 28 nukleotider, typisk minst ca. 32 nukleotider, mer typisk minst ca. 40 nukleotider, foretrukket minst ca. 50 nukleotider og mer foretrukket minst ca. 75-100 eller flere nukleotider. Dette inkluderer f.eks. 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 etc. og andre lengder.

Stringente betingelser når man refererer til homologi i hybridiseringssammenheng, vil være stringente kombinerte betingelser av salt, temperatur, organiske løsningsmidler og andre parametere som typisk er kontrollert i hybridiserings-reaksjoner. Stringente temperaturbetingelser vil vanligvis omfatte temperaturer over ca. 30 °C, mer vanlig over ca. 37 °C, typisk over ca. 45 °C og mer karakteristisk over ca. 55 °C, fortrinnsvis over ca. 65 °C og mer foretrukket over ca. 70 °C. Strenge saltbetingelser vil vanligvis være mindre enn ca. 500 mM, vanligvis mindre enn ca. 400 mM, mer vanlig mindre enn ca. 300 mM, karakteristisk mindre enn ca. 200 mM, fortrinnsvis mindre enn ca. 100 mM og mer foretrukket mindre enn ca. 80 mM, selv ned til mindre enn ca. 50 eller 20 mM. Kombinasjonen av parameterne er imidlertid mye viktigere enn målet for enhver enkelt parameter. Se f.eks. Wetmur og Davidson (1968), J. Mol.Biol., 31:349-370.

Isolert DNA kan lett modifiseres ved nukleotidsubsti-tusjoner, nukleotiddelesjoner, nukleotidinnskudd og inversjoner av nukleotidlengder. Disse modifikasjonene resulterer i nye DNA-sekvenser som koder for dette proteinet eller dets derivater. Disse modifiserte sekvensene kan anvendes til å fremstille mutantproteiner (muteiner) eller til å øke ekspresjonen av artsvarianter. Økt ekspresjon kan involvere genoppformering, økt transkripsjon, økt translasjon og andre mekanismer. Slik mutant-DCRS5-definisjon av DCRS5, som beskrevet ovenfor, men som har en aminosyresekvens som er forskjellig fra den til andre cytokinreseptorlignende proteiner funnet i naturen, enten på grunn av ved delesjon, substitusjon eller innskudd. Spesielt omfatter "setespesifikk mutant-DCRS5" et protein som har vesentlig sekvensidentitet med et protein ifølge tabell 1, og karakteristisk deler de fleste biologiske aktiviteter eller effekter av de her beskrevne former. Ulike naturlige, polymorfe variantsekven-ser vil også identifiseres.

Selv om setespesifikke mutasjonsseter er forhåndsbestemt, trenger ikke mutantene å være setespesifikke. Pattedyr-DCRS5-mutagenese kan utføres ved å lage aminosyreinnskudd eller

-delesjoner i genet, koblet med ekspresjon. Substitusjoner, delesjoner, innskudd eller mange kombinasjoner kan benyttes for å ende med en endelig konstruksjon. Innføyelser inkluderer amino- eller karboksyterminale fusjoner. Tilfeldig mutagenese kan utføres ved målkodonet, og de uttrykte pattedyr-DCRS5-mutantente kan deretter screenes for den ønskede aktivitet, forutsatt at det er et aspekt av struktur-aktivitets-sammenheng. Fremgangsmåter for å lage substitusjonsmutanter ved forhånds-bestemte seter i DNA som har en kjent sekvens er godt kjent innen teknikken, f.eks. ved M13-primermutagenese. Se også Sambrook et al. (1989), og Ausubel et al. (1987 og periodiske

supplementer). Særlig nyttige konstruksjoner vil være ekstracellulære deler av DCRS5 forbundet med IL-12R|3l-segmenter.

Mutasjonene i DNA-et bør normalt ikke plassere kodende sekvenser utenfor leserammene, og vil fortrinnsvis ikke skape komplementære regioner som fremkaller sekundære mRNA-strukturer, slik som løkker eller hårnåler, gjennom hybridisering.

Fosforamidittfremgangsmåten beskrevet av Beaucage og Carruthers (1981), Tetra. Letts., 22:1859-1862, vil fremstille egnede syntetiske DNA-fragmenter. Et dobbelttrådet fragment vil ofte oppnås enten ved syntetisering av komplementærtråden og annealing av tråden sammen under riktige betingelser eller ved tilsetning av komplementærtråden ved å bruke DNA-polymerase med en passende primersekvens.

Polymerasekjedereaksjons(PCR)teknikker kan ofte anvendes i mutagenese. Alternativt er mutageneseprimere vanlig anvendte metoder for å lage definerte mutasjoner ved forhånds-bestemte seter. Se f.eks. Innis et al. (red. 1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA, og Dieffenbach og Dveksler (1995, red.), PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, CSH, NY.

Visse utførelsesformer av oppfinnelsen er rettet på kombinasjonspreparater omfattende de beskrevne reseptorsekven-sene. I andre utførelsesformer kan funksjonelle deler av sekvensene forenes, slik at de koder for fusjonsproteiner. I andre former kan varianter av de beskrevne sekvensene være substituert .

IV. Proteiner, peptider

Som beskrevet ovenfor, beskrives primat-DCRS5, f.eks. hvis sekvenser er vist i tabell 1, og beskrevet ovenfor. Allele og andre varianter er også planlagt, inkludert f.eks. fusjonsproteiner som kombinerer deler av slike sekvenser med andre, omfattende f.eks. IL-12RP1, markørepitoper og funksjonelle domener.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også rekombinante proteiner, f.eks. heterologe fusjonsproteiner, ved å anvende segmenter fra disse primat- eller gnagerproteinene. Et heterologt fusjonsprotein er en fusjon mellom proteiner eller segmenter som naturlig ikke er normalt forent på samme måte. Så ledes er fusjonsproduktet av en DCRS5 med en annen cytokinreseptor et kontinuerlig proteinmolekyl som har sekvenser forent med en typisk peptidbinding, karakteristisk laget som ett enkelt translasjonsprodukt og som utviser egenskaper, f.eks. sekvens eller antigenisitet, avledet fra hver peptidkilde. Et lignende konsept gjelder for heterologe nukleinsyresekvenser. Kombinasjoner av ulike utvalgte proteiner i komplekser er også tilveiebrakt .

I tillegg kan nye konstruksjoner lages ved å kombinere lignende funksjonelle eller strukturelle domener fra andre beslektede proteiner, f.eks. cytokinreseptorer eller Toll-lignende reseptorer, omfattende artsvarianter. For eksempel kan ligandbindende eller andre segmenter bli "utvekslet" mellom ulike nye fusjonspolypeptider eller fragmenter. Se f.eks. Cunningham et al. (1989), Science, 243:1330-1336, og 0'Dowd et al. (1988), J. Biol. Chem., 263:15985-15992. Nye kimæriske polypeptider som utviser nye kombinasjoner av spesifisiteter, vil således være et resultat av den funksjonelle sammenkoblingen av reseptorbindende spesifisiteter. For eksempel kan ligandbindende domener fra andre beslektede reseptormolekyler legges til eller erstattes med andre domener fra dette eller beslektede proteiner. Det resulterende protein vil ofte ha hybridfunksjon og egenskaper. For eksempel et fusjonsprotein kan omfatte et målsøkende domene som kan tjene til å begrense fusjonsproteinet til en bestemt subcellulær organelle.

Fusjonspartnerkandidater og sekvenser kan velges fra ulike sekvensdatabaser, f.eks. GenBank, c/o IntelliGenetics, Mountain View, CA, og BCG, University of Wisconsin Biotechnology Computing Group, Madison, WI. I særdeleshet er kombinasjoner av polypeptidsekvenser tilveiebrakt i tabellene 1 og 3 særlig foretrukket. Variantformer av proteinene kan være byttet ut i de beskrevne kombinasjoner.

Det beskrives spesielt muteiner som binder cytokinlignende ligander, og/eller som er påvirket i signaltransduk-sjon. Strukturell gruppering av human DCRS5 med andre medlemmer av cytokinreseptorfamilien viser konserverte trekk/residuer. Se tabell 3. Gruppering av den humane DCRS5-sekvensen med andre medlemmer av cytokinreseptorfamilien indikerer ulike strukturelle og funksjonelle fellestrekk. Se også Bazan et al. (1996), Nature, 579:591, Lodi et al. (1994), Science, 265:1762-1766, Sayle og Milner-White (1995), TIBS, 20:374-376, og Gronenberg et al. (1991), Protein Engineering, 4:263-269.

Substitusjoner med enten musesekvenser eller human-sekvenser er særlig foretrukket. På den annen side vil konservative substitusjoner vekk fra ligandbindende interaksjonsområdene antakelig bevare de fleste signalaktivitetene, og konservative substitusjoner vekk fra de intracellulært domenene vil antakelig bevare de fleste ligandbindende egenskaper.

"Derivater" av primat-DCRS5 omfatter aminosyresekvens-mutanter, glykosyleringsvarianter, metabolske derivater og kovalente eller aggregerte konjugater med andre kjemiske deler. Kovalente derivater kan fremstilles ved binding av funksjonelle grupper til grupper som finnes i aminosyresidekjedene eller ved den N-terminale enden til DCRS5, f.eks. ved fremgangsmåter som er vel kjent innen teknikken. Disse derivatene kan inkludere, uten begrensning, alifatiske estere eller amider av karboksyl-terminalen, eller av residuer inneholdende karboksylsidekjeder, residuer inneholdende O-acylderivater av hydroksylgrupper og N-acylderivater av den aminoterminale aminosyre eller residuer inneholdende aminogrupper, f.eks. lysin eller arginin. Acyl-grupper er utvalgt fra gruppen av alkyldeler, omfattende C3-C18-normalalkyl, hvorved det dannes alkanoylaroyltyper.

Spesielt inkluderes glykosyleringsendringer, f.eks. laget ved modifisering av glykosyleringsmønsteret til et polypeptid under dets syntese og bearbeiding, eller i ytterligere bearbeidingstrinn. Særlig foretrukne fremgangsmåter for å oppnå dette er ved eksponering av polypeptidet for glykosylerende enzymer avledet fra celler som normalt tilveiebringer slik bearbeiding, f.eks. glykosyleringsenzymer fra pattedyr. Deglyko-syleringsenzymer er også overveid. Versjoner av den samme primære aminosyresekvens som har andre mindre modifikasjoner, inkludert fosforylerte aminosyreresiduer, f.eks. fosfotyrosin, fosfoserin eller fosfotreonin er også omfattet.

En hovedgruppe av derivater er kovalente konjugater av reseptorene eller fragmenter derav med andre proteiner eller polypeptider. Disse derivatene kan syntetiseres i rekombinant kultur, slik som N-terminale fusjoner eller ved anvendelse av midler kjent innen fagområdet for deres egnethet ved kryss- binding av proteiner via reaktive sidegrupper. Foretrukne derivatiseringsseter for kryssbindende midler er frie aminogrupper, karbohydratdeler og cysteinresiduer.

Fusjonspolypeptider mellom reseptorene og andre homologe eller heterologe proteiner er også tilveiebrakt. Homologe polypeptider kan være fusjoner mellom ulike reseptorer, som resulterer i f.eks. et hybridprotein som utviser bindingsspesi-fisitet for mange forskjellige cytokinligander eller en reseptor som har utvidet eller svekket spesifisitet for substrateffekt. Likeledes kan heterologe fusjoner konstrueres som vil utvise en kombinasjon av egenskaper eller aktiviteter fra de avledede proteiner. Typiske eksempler er fusjoner mellom et reporterpoly-peptid, f.eks. luciferase, og et segment eller domene fra en reseptor, f.eks. et ligandbindende segment, slik at tilstedeværelse eller lokalisasjon av den ønskede ligand lett kan bestemmes. Se f.eks. Dull et al., US patentskrift nr. 4 859 609. Andre genfusjonspartnere omfatter glutation-S-transferase (GST), bakteriell p-galaktosidase, trpE, protein A, p-laktamase, alfa-amylase, alkoholdehydrogenase og gjæralfa-paringsfaktor. Se f.eks. Godowski et al. (1988), Science, 241:812-816. Merkede proteiner vil ofte være substituert i de beskrevne kombinasjoner av proteiner. Forbindelser mellom DCRS5 og IL-12Rpi er særlig betydningsfull, som beskrevet.

Fosforamidittfremgangsmåten beskrevet av Beaucage og Carruthers (1981), Tetra, Letts., 22:1859-1862, vil fremstille egnede syntetiske DNA-fragmenter. Dobbelttrådede fragmenter vil ofte oppnås enten ved syntetisering av komplementærtråden og annealing av trådene sammen under egnede betingelser eller ved tilføyelse av den komplementære tråden ved anvendelse av DNA-polymerase med en egnet primersekvens.

Slike polypeptider kan også ha aminosyreresiduer som er blitt kjemisk modifisert ved fosforylering, sulfonering, biotin-ylering eller tilføyelse eller fjerning av andre deler, særlig de som har molekylformer som ligner fosfatgrupper. I noen utførelsesformer vil modifikasjonene være nyttige merkings-ingsreagenser eller fungere som rensingsmål, f.eks. affinitets-ligander.

Fusjonsproteiner vil karakteristisk lages enten ved rekombinant nukleinsyre-fremgangsmåter eller ved syntetiske polypeptidfremgangsmåter. Teknikker for nukleinsyremanipulering og -ekspresjon er beskrevet generelt, f.eks. i Sambrook et al.

(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. utg.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, og Ausubel et al. (red. 1987 og periodiske supplementer), Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Teknikker for syntese av polypeptider er beskrevet f.eks. i Merrifield (1963), J. Amer. Chem. Soc, 85:2149-2156, Merrifield (1986), Science, 232:341-347, og Atherton et al. (1989), Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. Se også Dawson et al.

(1994), Science, 266:116- 719, for fremgangsmåter for å lage større polypeptider.

Denne oppfinnelsen overveier også anvendelse av derivater av en DCRS5 andre enn variasjoner i aminosyresekvens eller glykosylering. Slike derivater kan omfatte kovalente eller aggregatforbindelser med kjemiske deler. Disse derivatene faller generelt inn i tre klasser: (1) salter, (2) kovalente sidekjede-og terminalresidumodifikasjoner og (3) adsorpsjonskomplekser, f.eks. med cellemembraner. Slike kovalente eller aggregat-derivater er nyttige som immunogener, som reagenser i immunanalyser eller ved fremgangsmåter for rensing, slik som for affinitetsrensing av en reseptor eller andre bindende molekyler, f.eks. et antistoff. En cytokinligand kan f.eks. immobiliseres ved kovalent binding til et fast støttemateriale, slik som cyanogenbromidaktivert Sepharose, ved fremgangsmåter som er vel kjent innen fagområdet, eller adsorbert på polyolefinoverflater, med eller uten glutaraldehydkryssbinding, for anvendelse i analysen eller rensing av en cytokinreseptor, antistoffer eller andre lignende molekyler. Ligander kan også merkes med en påvisbar gruppe, f.eks. radiojodert ved hjelp av kloramin-T-fremgangsmåten, kovalent bundet til sjeldne jordchelater, eller konjugert til en annen fluorescerende gruppe for anvendelse i diagnostiske analyser.

En kombinasjon, f.eks. omfattende en DCRS5, kan anvendes som at immunogen for produksjon av antisera eller antistoffer som er spesifikke, f.eks. som er i stand til å skille mellom andre cytokinreseptorfamiliemedlemmer, for kombinasjonene beskrevet. Kompleksene kan anvendes til å screene monoklonale antistoffer eller antigenbindende fragmenter frem stilt ved immunisering med ulike former av urene preparater inneholdende proteinet. Spesielt omfatter uttrykket "antistoffer" også antigenbindende fragmenter av naturlige antistoffer, f.eks. Fab, Fab2, Fv etc. Den rensede DCRS5 kan også anvendes som et reagens til å påvise antistoffer dannet ved respons på nærværet av forhøyede nivåer av ekspresjon, eller immunologiske forstyrrelser som fører til antistoffproduksjon mot den endogene reseptor. I tillegg kan DCRS5-fragmenter også fungere som immunogener til fremstilling av antistoffer, som beskrevet umiddelbart nedenfor. For eksempel overveier denne oppfinnelsen antistoffer med bindingsaffinitet til eller som er laget mot aminosyresekvenser vist i tabell 1, fragmenter derav eller ulike homologe peptider. Denne oppfinnelsen omfatter i særdeleshet antistoffer med bindingsaffinitet til, eller som har vært laget mot, spesifikke fragmenter som er forutsett å være eller faktisk er eksponert på den ytre proteinoverflaten til den native DCRS5. Komplekser av kombinasjoner av proteiner vil også være nyttige, og antistoffpreparater til disse kan lages.

I visse andre utførelsesformer kan løselige konstruksjoner f.eks. av det ekstracellulære ligandbindingssegmentet til DCRS5 med IL-12RP1 være bindingssammensetningen for liganden og kan være nyttig som ligandantagonist eller som antigen til å blokkere ligandmediert signalisering. Slike kan være nyttige enten diagnostisk, f.eks. for histologisk merking av ligand, eller terapeutisk, f.eks. som ligandantagonister.

Blokkeringen av den fysiologiske responsen til resep-torligandene kan være et resultat av inhibisjon av binding av liganden til reseptoren, sannsynligvis gjennom kompetitiv inhibisjon. Således vil in vitro-analyser ifølge foreliggende oppfinnelse ofte anvende antistoffer eller antigenbindende segmenter av disse antistoffene, løselige reseptorkonstruksjoner eller fragmenter bundet til fastfasematerialer. Disse analysene vil også tillate diagnostisk bestemmelse av effekten av enten ligandbindingsregionmutasjoner og modifikasjoner eller andre mutasjoner og modifikasjoner, f.eks. som påvirker signalisering eller enzymatisk funksjon.

Det beskrives også anvendelse av kompetitive medikamentscreeningsanalyser, f.eks. hvor nøytraliserende antistoffer mot reseptorkompleksene eller fragmentene konkurrerer med en testforbindelse med hensyn på binding til en ligand eller annet antistoff. På denne måten kan de nøytraliserende antistoffene eller fragmenter anvendes til å påvise nærværet av et polypeptid som deler ett eller flere bindingsseter med en reseptor, og kan også anvendes til å okkupere bindingsseter på en reseptor som ellers kan binde en ligand. Løselige reseptor-konstruksjoner som kombinerer de ekstracellulære eller ligandbindende domenene til DCRS5 med IL-12R|$1, kan være nyttige som antagonister for kompetitiv binding av p40/IL-B30-ligand.

V. Tillaging av nukleinsyrer og protein

DNA som koder for proteinet eller fragmenter derav, kan skaffes til veie ved kjemisk syntese, screening av cDNA-bibliotek eller ved screening av genomiske biblioteker fremstilt fra en lang rekke cellelinjer eller vevsprøver. Naturlige sekvenser kan isoleres ved å anvende standardfremgangsmåter og de her tilveiebrakte sekvenser, f.eks. i tabell 1. Andre artsmotstykker kan identifiseres ved hybridiseringsteknikker, eller ved ulike PCR-teknikker, kombinert med eller ved søk i sekvensdatabaser, f.eks. GenBank.

Dette DNA kan uttrykkes i en lang rekke vertsceller for syntese av reseptoren i dens fulle lengde eller fragmenter av reseptoren som igjen f.eks. kan anvendes til å generere polyklonale eller monoklonale antistoffer, til bindingsstudier, til konstruksjon og ekspresjon av modifisert ligandbinding eller kinase-/fosfatasedomener, og til struktur/funksjons-studier. Varianter eller fragmenter kan uttrykkes i vertsceller som er transformert eller transfektert med egnede ekspresjonsvektorer. Disse molekylene kan være fundamentalt frie for protein eller cellulære kontaminanter andre enn de avledet fra den rekombinante vert, og er derfor særlig nyttige i farmasøytiske preparater når de er kombinert med en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller fortynner. Proteinet eller deler derav kan uttrykkes som fusjoner med andre proteiner. Kombinasjoner av de beskrevne proteiner, eller nukleinsyrer som koder for disse, er særlig interessante.

Ekspresjonsvektorer er karakteristisk selvreplikerende DNA- eller RNA-konstruksjoner inneholdende det ønskede reseptor-gen, dets fragmenter eller kombinasjonsgener, vanligvis operabelt knyttet til egnede genetiske kontrollelementer som gjenkjennes i en egnet vertscelle. Disse kontrollelementene er i stand til å bevirke ekspresjon innen en egnet vert. Mange gener kan uttrykkes koordinert og kan forekomme i en polycistronisk budbringer. Den spesifikke type kontrollelementer som er nød-vendig for å bevirke ekspresjon, vil avhenge av den eventuelle vertscelle som anvendes. Generelt kan genetiske kontrollelementer omfatte et prokaryot promotersystem eller et eukaryot promoterekspresjonskontrollsystem og karakteristisk omfatte en transkripsjonspromoter, en valgfri operator for å kontrollere starten av transkripsjonen, transkripsjonsforsterkere for å øke nivået av mRNA-ekspresjon, en sekvens som koder for et egnet ribosombindingssete og sekvenser som terminerer transkripsjonen og translasjonen. Ekspresjonsvektorer inneholder også vanligvis et replikasjonsorigo som tillater vektoren å replikere uavhengig av vertscellen.

Vektorene som beskrives heri omfatter de som inneholder DNA som koder for en kombinasjon av proteiner, som beskrevet, eller et biologisk aktivt ekvivalent polypeptid. DNA-et kan være under fast kontroll av en viral promoter og kan kode for en seleksjonsmarkør. Denne oppfinnelsen overveier videre anvendelse av slike ekspresjonsvektorer som er i stand til å uttrykke eukaryote cDNA-er som koder for slike proteiner i en prokaryot eller eukaryot vert, hvor vektoren er kompatibel med verten, og hvor eukaryote cDNA-er er satt inn i vektoren, slik at veksten av verten inneholdende vektoren uttrykker de aktuelle cDNA-er. Vanligvis er ekspresjonsvektorer utformet for stabil replikasjon i deres vertsceller eller for oppformering for i sterk grad å øke det total antallet kopier av det ønskede gen eller gener pr. celle. Det er ikke alltid nødvendig å forlange at en ekspresjonsvektor replikerer i en vertscelle, f.eks. er det mulig å bevirke forbigående ekspresjon av proteinet eller dets fragmenter i ulike verter ved å anvende vektorer som ikke inneholder et replikasjonsorigo som gjenkjennes av vertscellen. Det er også mulig å anvende vektorer som forårsaker integrering av den proteinkodende delen inn i vertens DNA ved rekombinasjon.

Vektorer som anvendt her, omfatter plasmider, virus, bakteriofager, integrerbare DNA-fragmenter og andre vehikler som er i stand til integrering av DNA-fragmenter inn i genomet til verten. Ekspresjonsvektorer er spesialiserte vektorer som inneholder genetiske kontrollelementer som bevirker ekspresjon av operabelt sammenkoblet gener. Plasmider er den mest vanlig anvendte formen for vektor, men alle andre former for vektorer som tjener en ekvivalent funksjon og som er, eller kan bli, kjent innen fagområdet, er egnet for anvendelse heri. Se f.eks. Pouwels et al. (1985 og supplementer), Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., og Rodriguez et al. (red. 1988), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston.

Transformerte celler er celler, fortrinnsvis fra pattedyr, som er blitt transformert eller transfektert med vektorer konstruert ved bruk av rekombinant DNA-teknikker. Transformerte vertsceller uttrykker vanligvis de ønskede proteinene, men i den hensikt å klone, oppformere og manipulere deres DNA, er det ikke nødvendig å uttrykke de aktuelle proteinene. Denne oppfinnelsen overveier videre dyrkning av transformerte celler i et nærings-medium, for således å tillate proteinene å akkumulere. Proteinene kan gjenvinnes, enten fra kulturen eller i visse tilfeller fra kulturmediet.

For denne oppfinnelses formål er nukleinsekvensene operabelt sammenkoblet når de er funksjonelt beslektet med hverandre. DNA for en forsekvens eller sekretorisk "leader" er f.eks. operabelt sammenkoblet med et polypeptid dersom det er uttrykt som et preprotein eller deltar i styringen av polypeptidet til cellemembranen eller i utskillelse av polypeptidet. En promoter er operabelt sammenkoblet med en kodende sekvens dersom den kontrollerer transkripsjonen av polypeptidet. Et ribosombindende sete er operabelt sammenkoblet med en kodende sekvens dersom det er posisjonert for å tillate translasjon. Vanligvis betyr operabelt sammenkoblet tilstøtende og i leseramme, visse genetiske elementer, slik som repressorgener, er imidlertid ikke tilgrensende sammenkoblet, men binder likevel til operatorsekvensene som i sin tur kontrollerer ekspresjon.

Egnede vertsceller omfatter prokaryoter, lavere eukaryoter og høyere eukaryoter. Prokaryoter omfatter både gramnega-tive og grampositive organismer, f.eks. E. coli og B. subtilis. Lavere eukaryoter omfatter gjær, f.eks. S. cerevisiae og Pichia, og arter av genus Dictyostelium. Høyere eukaryoter omfatter etablerte vevskulturcellelinjer fra dyreceller, både av ikke-pattedyropprinnelse, f.eks. insektceller, og fugler, og av pattedyropprinnelse, f.eks. mennesker, primater og gnagere.

Prokaryote vertsvektorsystemer omfatter en lang rekke vektorer for mange ulike arter. Her anvendes E. coli og dens vektorer generisk for å inkludere ekvivalente vektorer anvendt i andre prokaryoter. En representativ vektor for DNA-oppformering er pBR322 eller mange av dens derivater. Vektorer som kan anvendes for å uttrykke reseptoren eller dens fragmenter, omfatter, men er ikke begrenset til, slike vektorer som de som inneholder lac-promoter (pUC-serier), trp-promoter (pBR322 trp), Ipp-promoter (pIN-serier), lambda-pP- eller -pR-promoterer (pOTS), eller hybridpromoterer, slik som ptac (pDR540). Se Brosius et al. (1988), "Expression Vectors Employing Lambda, and Ipp Derived Promoters", i Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses (red. Rodriguez og Denhardt), Buttersworth, Boston, kapittel 10, s. 205-236.

Lavere eukaryoter, f.eks. gjær og Dictyostelium, kan transformeres med DCRS5-sekvensinneholdende vektorer. For denne oppfinnelses formål er den mest vanlige lavere eukaryote vert bakegjær, Saccharomyces cerevisiae. Den vil anvendes generisk for å representere lavere eukaryoter, selv om et antall andre stammer og arter også er tilgjengelige. Gjærvektorer inneholder karakteristisk et replikasjonsorigo (med mindre det tilhører den integrerende typen), et seleksjonsgen, en promoter, DNA som koder for reseptoren eller dens fragmenter, og sekvenser for translasjonsterminering, polyadenylering og transkripsjons-terminering. Egnede ekspresjonsvektorer for gjær omfatter slike konstitutive promoterer som 3-fosfoglyseratkinase og ulike andre promotorer for gener som koder for glykolytiske enzymger, eller slike induserbare promoterer som alkoholdehydrogenase 2-promoter eller metallotioninpromoter. Egnede vektorer omfatter derivater av følgende typer: selvreplikerende med lavkopitall (slik som YRp-seriene), selvreplikerende med høykopitall (slik som YEp-seriene), integrerende typer (slik som Ylp-seriene) eller mini-kromosomer (slik som YCp-seriene).

Høyere eukaryote vevskulturceller er normalt foretrukne vertsceller for ekspresjon av de funksjonelt aktive interleukin-eller reseptorproteinene. I prinsippet er mange høyere eukaryote vevskulturcellelinjer brukbare, f.eks. insektbaculovirus-ekspresjonssysterner, enten det er fra en invertebrat- eller vertebratkilde. Pattedyrceller er imidlertid foretrukket. Trans-formasjon eller transfeksjon og oppformering av slike celler er blitt en rutinefremgangsmåte. Eksempler på egnede cellelinjer omfatter HeLa-celler, cellelinjer fra kinesisk hamsterovarium (CHO), babyrottenyrecellelinjer (BRK), insektcellelinjer, fugle-cellelinjer og apecellelinjer (COS). Ekspresjonsvektorer for slike cellelinjer omfatter vanligvis et replikasjonsorigo, en promoter, et translasjonsinitieringssete, et RNA-spleisesete (dersom genomisk DNA anvendes), et polyadenyleringssete og et transkripsjonstermineringssete. Disse vektorer inneholder også vanligvis et seleksjonsgen eller et forsterkende gen. Egnede ekspresjonsvektorer kan være plasmider, virus eller retrovirus som er bærere av promoterer avledet f.eks. fra slike kilder som adenovirus, SV40, parvovirus, vacciniavirus eller cytomegalo-virus. Representative eksempler på egnede ekspresjonsvektorer omfatter pCDNAl, pCD, se Okayama et al. (1985), Mol. Cell Biol., 5:1136-1142, pMClneo-polyA, se Thomas et al. (1987), Cell, 51:503-512, og en baculovirusvektor, slik som pAC 373 eller pAC 610.

For utskilte proteiner og noen membranproteiner koder en åpen leseramme vanligvis for et polypeptid som består av et fullengde- eller utskilt produkt kovalent som i sin N-terminale ende er bundet til et signalpeptid. Signalpeptidet spaltes av før utskillelse av fullengde- eller det aktive polypeptidet. Spaltingssetet kan forutsies med en høy grad av nøyaktighet basert på empiriske regler, f.eks. von-Heijne (1986), Nucleic Acids Research, 14:4683-4690, og Nielsen et al. (1997), Protein Eng., 10:1-12, og den nøyaktige aminosyresammensetningen til signalpeptidet viser seg ofte å ikke være kritisk for dets funksjon, f.eks. Randall et al. (1989), Science, 243:1156-1159, Kaiser et al. (1987), Science, 235:312-317. Fullengdeproteinene ifølge oppfinnelsen kan lett bestemmes ved å anvende standardfremgangsmåter.

Det vil ofte være ønskelig å uttrykke disse polypeptidene i et system som tilveiebringer et spesifikt eller definert glykosyleringsmønster. I dette tilfellet vil dette mønsteret være det som normalt tilveiebringes av ekspresjons- systemet. Mønsteret vil imidlertid modifiseres ved å eksponere polypeptidet, f.eks. en ikke-glykosylert form, for egnede glykosylerende proteiner innført i et heterologt ekspresjonssystem. Reseptorgenet kan f.eks. kotransformeres med ett eller flere gener som koder for pattedyr- eller andre glykosylerende enzymer. Ved å anvende denne fremgangsmåten vil visse pattedyr-glykosyleringsmønstre oppnås i prokaryote eller andre celler. Ekspresjon i prokaryote celler vil karakteristisk føre til ikke-glykosylerte proteinformer.

Kilden til DCRS5 kan være en eukaryot eller prokaryot vert som uttrykker rekombinant DCRS5, slik som beskrevet ovenfor. Kilden kan også være en cellelinje, men andre pattedyr-cellelinjer er også overveid ifølge denne oppfinnelsen, hvor den foretrukne cellelinje er fra den menneskelige organisme.

Nå som sekvensene er kjent, kan primat-DCRS5, fragmenter eller derivater derav fremstilles med vanlige fremgangsmåter for syntese av peptider. Disse fremgangsmåtene omfatter slike som er beskrevet av Stewart og Young (1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Bodanszky og Bodanszky (1984) , The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York, og Bodanszky (1984), The Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York. For eksempel kan en azidfremgangsmåte, en syrekloridfremgangsmåte, en syreanhydridfremgangsmåte, en blandet anhydridfremgangsmåte, en aktiv ester-fremgangsmåte (f.eks. p-nitrofenylester, N-hydroksysuksinimidester eller cyanometylester), en karbodiimidazolfremgangsmåte, en oksidativ- reduktiv prosess eller en disykloheksylkarbodiimid(DCCD)additivfremgangsmåte anvendes. Fastfase- og løsningsfasesyntese er begge anvendbare for de ovennevnte fremgangsmåter. Lignende teknikker kan anvendes på partielle DCRS5-sekvenser.

DCRS5-proteinene, fragmenter eller derivater er hensiktsmessig fremstilt i henhold til ovennevnte fremgangsmåter, som karakteristisk anvendes i peptidsyntese, generelt enten ved en såkalt trinnvis fremgangsmåte som omfatter kondensasjon av en aminosyre til den terminale aminosyre, én etter én i rekkefølge, eller ved kobling av peptidfragmenter til den terminale aminosyre. Aminogrupper som ikke anvendes i koblingsreaksjonen, må karakteristisk beskyttes for å forhindre kobling på et feilaktig sted.

Dersom en fastfasesyntese anvendes, er den C-terminale aminosyren bundet til en uløselig bærer eller et underlags-materiale gjennom sin karboksylgruppe. Den uløselige bæreren er ikke spesielt begrenset så lenge den har evne til å binde til en reaktiv karboksylgruppe. Eksempler på slike uløselige bærere omfatter halogenmetylharpiks, slik som klormetylharpiks eller brommetylharpiks, hydroksymetylharpiks, fenolharpiks, tert.-alkyloksykarbonylhydrazidert harpiks og lignende.

En aminogruppebeskyttet aminosyre er bundet i sekvens gjennom kondensasjon av dens aktiverte karboksylgruppe og den reaktive aminogruppen til det tidligere dannede peptidet eller kjeden, for å syntetisere peptidet trinn for trinn. Etter å ha syntetisert den fullstendige sekvensen, avspaltes peptidet fra den uløselige bæreren for å gi peptidet. Denne fastfasefrem-gangsmåten er generelt beskrevet av Merrifield et al. (1963) i J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2156.

Det fremstilte protein og fragmenter derav kan isoleres og renses fra reaksjonsblandingen ved fremgangsmåter for peptid-separering, f.eks. ved ekstraksjon, utfelling, elektroforese, ulike former for kromatografi, immunaffinitet og lignende. Reseptorene ifølge denne oppfinnelsen kan skaffes til veie med varierende grad av renhet, avhengig av den ønskede anvendelse. Rensing kan utføres ved anvendelse av proteinrensingsteknikker beskrevet heri, se nedenfor, eller ved anvendelse av de her beskrevne antistoffer i fremgangsmåter for immunabsorberende affinitetskromatografi. Denne immunabsorberende affinitets-kromatografien utføres ved først å binde antistoffene til et fast støttemateriale og deretter bringe de bundne antistoffene i kontakt med løseliggjorte lysater av egnede celler, lysater av andre celler som uttrykker reseptoren eller lysater eller super-natanter av celler som fremstiller proteinet som et resultat av DNA-teknikker, se nedenfor.

Generelt vil det rensede proteinet være minst ca. 40 % rent, ordinært minst ca. 50 % rent, vanligvis minst ca. 60 % rent, karakteristisk minst ca. 70 % rent, mer karakteristisk minst ca. 80 % rent, fortrinnsvis minst ca. 90 % rent og mer foretrukket minst ca. 95 % rent, og i særlige utførelsesformer 97-99 % eller mer. Renhet vil vanligvis defineres på vektbasis, men kan også defineres på mol-basis. Ulike analyser kan anvendes etter behov. Individuelle proteiner kan renses og deretter kombineres.

VI. Antistoffer

Antistoffer kan lages mot de ulike pattedyrproteinene, f.eks. primat-DCRS5-proteinene, og fragmenter derav, både i naturlig forekommende, native former og i deres rekombinante former, hvor forskjellen er den at antistoffene mot den aktive reseptor mer sannsynlig vil gjenkjenne epitoper som bare er til stede i de native konformasjonene. Antistoffer som gjenkjenner epitoper, f.eks. funksjonelle, presentert av kombinasjonen av DCRS5 og IL-12R|3l, er også overveid. Påvisning av denaturert antigen kan også være nyttig i f.eks. Western blot-analyser. Antiidiotypiske antistoffer er også overveid, som vil være nyttige som agonister eller antagonister for en naturlig reseptor eller et antistoff.

Antistoffer omfattende bindingsfragmenter og enkelt-kjedeversjoner, mot forhåndsbestemt fragmenter av proteinet kan lages ved immunisering av dyr med konjugater av fragmentene med immunogene proteiner. Monoklonale antistoffer fremstilles fra celler som utskiller det ønskede antistoff. Disse antistoffene kan screenes med hensyn på binding til normalt eller defekt protein, eller screenes med hensyn på agonistisk eller antago-nistisk aktivitet. Disse monoklonale antistoffene vil vanligvis binde med minst en Kd på ca. 1 mM, mer vanlig minst ca. 300 U.M, typisk minst ca. 100 U.M, mer karakteristisk minst ca. 30 U.M, fortrinnsvis minst ca. 10 U.M og mer foretrukket minst ca. 3U.M eller bedre.

Antistoffene omfattende antigenbindende fragmenter ifølge denne oppfinnelsen kan ha betydelig diagnostisk eller terapeutisk verdi. De kan være potente antagonister som binder til reseptoren og inhiberer bindingen til liganden eller inhiberer reseptorens evne til å utløse en biologisk respons, f.eks. virke på dens substrat. De kan også være nyttige som ikke-nøytraliserende antistoffer og kan kobles til toksiner eller radioaktive nuklider som kan binde til fremstillende celler eller celler lokalisert til interleukinets kilde. Videre kan disse antistoffene konjugeres til medikamenter eller andre terapeutiske midler, enten direkte eller indirekte, ved hjelp av en linker.

Antistoffene som beskrevet heri kan også være nyttige innen diagnostiske anvendelsesområder. Som "capture"- eller ikke-nøytraliserende antistoffer kan de binde til reseptoren uten å hemme ligand- eller substratbinding. Som nøytraliserende antistoffer kan de være nyttige i kompetitive bindingsanalyser. De vil også være egnet til påvisning eller kvantitering av ligander. De kan anvendes som reagenser i Western blot-analyser eller til immunutfelling eller immunrensing av det respektive protein. Likeledes kan nukleinsyrer og proteiner immobiliseres til faste underlag for affinitetsrensing eller påvisnings-fremgangsmåter. Disse underlagene kan f.eks. være faste harpiks-kuler eller plastikflak.

Proteinfragmenter kan forenes med andre materialer, særlig polypeptider, som sammenkoblede eller kovalent sammen-bundne polypeptider for anvendelse som immunogener. Pattedyr-cytokinreseptorer og fragmenter kan sammenkobles eller kovalent bindes til en rekke immunogener, slik som "keyhole limpet hemocyanin", bovint serumalbumin, tetanustoksoid etc. Se Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper og Row, 1969, Landsteiner (1962) , Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York, og Williams et al. (1967), Methods in Immunology and Immunochemistry, vol. 1, Academic Press, New York, for beskrivelse av fremgangsmåter til fremstilling av polyklonale antisera. En typisk fremgangsmåte omfatter hyperimmunisering av et dyr med et antigen. Blodet fra dyret samles deretter opp kort tid etter de gjentatte immuniseringene, og gammaglobulinet isoleres.

I noen tilfeller er det ønskelig å fremstille monoklonale antistoffer fra ulike pattedyrverter, slik som mus, gnagere, primater, mennesker etc. Beskrivelse av teknikkene for fremstilling av slike monoklonale antistoffer kan finnes i f.eks. Sites et al. (red.), Basic and Clinical Immunology (4. utg.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, og referanser sitert der, Harlow og Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Goding (1986), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. utg.), Academic Press, New York, og spesielt Kohler og Milstein (1975), i Nature, 256:495-4 97, som diskuterer én fremgangsmåte for generering av monoklonale antistoffer. Kort oppsummert vedrører denne metoden injeksjon av et dyr med et immunogen. Dyret avlives deretter, og celler som tas fra dets milt, fusjoneres med myelomceller. Resultatet er en hybridcelle eller "hybridom" som er i stand til å refremstille in vitro. Populasjonen av hybridomer er deretter screenet for å isolere individuelle kloner, som hver utskiller en enkelt antistofftype mot immunogenet. På denne måten oppnår man individuelle antistofftyper som er produsert av udødelig-gjorte og klonede enkelt-B-celler fra det immune dyret, dannet som respons på et spesifikt sete gjenkjent på den immunogene substans.

Andre egnede teknikker omfatter in vitro-eksponering av lymfocytter for de antigene polypeptidene eller alternativt utvelgelse fra biblioteker av antistoffer i fag eller lignende vektorer. Se Huse et al. (1989), "Generation of a Large Combina-torial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science, 246:1275-1281, Ward et al. (1989), Nature, 341:544-546. Polypeptidene og antistoffene som beskrevet heri kan anvendes med eller uten modifisering, omfattende kimæriske eller humaniserte antistoffer. Polypeptidene og antistoffene vil ofte merkes ved å knytte, enten kovalent eller ikke-kovalent, en substans som tilveiebringer et påvisbart signal. En lang rekke markører og konjugeringsteknikker er kjent og er omfattende rapportert både i den vitenskapelige og patentlitteraturen. Egnede markører omfatter radioaktive nuklider, enzymer, substrater, kofaktorer, inhibitorer, fluorescensgrupper, kjemi-luminescensgrupper, magnetiske partikler og lignende. Patenter som belærer anvendelse av slike markører, omfatter US patent-skrifter nr. 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350, 3 996 345, 4 277 437, 4 275 149 og 4 366 241. Også rekombinante eller kimæriske immunglobuliner kan fremstilles, se Cabilly,

US patentskrift nr. 4 816 567, eller lages i transgene mus, se Mendez et al. (1997), Nature Genetics, 15:146-156.

Antistoffer som beskrevet heri kan også anvendes til affinitetskromatografi for isolering av DCRS5-proteiner eller

-peptider. Kolonner hvor antistoffene er bundet til et fast støttemateriale, f.eks. partikler, slik som agarose, Sephadex

eller lignende, kan lages, hvor et cellelysat kan passere gjennom kolonnen, kolonnen vaskes, etterfulgt av økende konsentrasjoner av en mild denaturant, hvorved det rensede proteinet vil frigjøres. Alternativt kan proteinet anvendes til rensing av antistoff. Egnede kryssabsorpsjoner eller utarminger kan anvendes .

Antistoffer kan også anvendes for å screene ekspre-sjonsbiblioteker for bestemte ekspresjonsprodukter. Vanligvis vil antistoffer som anvendes i en slik fremgangsmåte, være merket med en gruppe som tillater lett påvisning av tilstedeværelse av antigen ved antistoffbinding.

Antistoffene laget mot en cytokinreseptor vil også anvendes for å lage antiidiotypiske antistoffer. Disse vil være nyttige i påvisning eller diagnostisering av ulike immunologiske tilstander relatert til ekspresjon av proteinet eller celler som uttrykker proteinet. De vil også være nyttige som agonister eller antagonister for ligandene, som kan være kompetitive reseptorinhibitorer eller som kan anvendes i stedet for naturlig forekommende ligander. Visse antistoffer mot reseptorsubenheter eller kombinasjoner kan tjene som aktiverende antistoffer som kan bevirke signalisering og derved fungere f.eks. som ligand-agonister.

Et cytokinreseptorprotein som spesifikt binder til

eller som er spesifikt immunreaktivt med et antistoff dannet mot et definert immunogen, slik som et immunogen bestående av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, er karakteristisk bestemt ved en immunanalyse. Immunanalyser anvender karakteristisk et polyklonalt antiserum som lages f.eks. mot et protein ifølge SEQ ID NO: 2. Dette antiserum er valgt å ha lav kryssreaktivitet mot andre cytokinreseptorfamiliemedlemmer, f.eks. IL-12R.p2-reseptor-subenhet eller IL-6-reseptorsubenhet gpl30, fortrinnsvis fra samme art, og enhver slik kryssreaktivitet er fjernet ved immunabsorpsjon før anvendelse i immunanalysen.

For å lage antisera til anvendelse i en immunanalyse kan proteinet, f.eks. ifølge SEQ ID NO: 2, isoleres som

beskrevet heri. For eksempel kan rekombinant protein fremstilles i en pattedyrcellelinje. En egnet vert, f.eks. en innavlet muse-stamme, slik som Balb/c, immuniseres med det utvalgte proteinet, hvor det karakteristisk anvendes et standardadjuvans, slik som

Freunds adjuvans, og en standardprotokoll for immunisering av mus (se Harlow og Lane, supra). Alternativt kan et syntetisk peptid avledet fra sekvensen beskrevet heri og konjugert til et bærerprotein anvendes som immunogen. Polyklonale sera samles opp og titreres mot det immunogene proteinet i en immunanalyse, f.eks. en fastfaseimmunanalyse, hvor immunogenet er immobilisert på et fast støttemateriale. Polyklonale antisera med et titer på IO<4>eller større velges ut og testes med hensyn på sin kryssreaktivitet mot andre cytokinreseptorfamiliernedlemmer, f.eks. gpl30 eller IL-12R|3l, ved å anvende en kompetitiv bindingsimmunanalyse, slik som den beskrevet av Harlow og Lane, supra, s. 570-573. Minst to cytokinreseptorfamiliemedlemmer anvendes fortrinnsvis ved denne bestemmelsen. Disse cytokinreseptor-familiemedlemmene kan være fremstilt som rekombinante proteiner og isolert ved å anvende standard molekylærbiologi- og protein-kjemiteknikker, som beskrevet heri.

Immunanalyser i form av kompetitiv binding kan anvendes for bestemmelse av kryssreaktivitet. For eksempel kan proteinet ifølge SEQ ID NO: 2 immobiliseres på et fast underlag. Proteiner tilsatt til analysen konkurrerer om bindingen av antisera med det immobiliserte antigenet. Evnen til de ovenfor nevnte proteinene til å konkurrere om bindingen av antisera med det immobiliserte proteinet sammenlignes med proteinene, f.eks. gpl30 eller IL-12R02. Prosent kryssreaktivitet for de ovenfor nevnte proteinene beregnes ved å anvende standard beregnings-metoder. De antisera som har mindre enn 10 % kryssreaktivitet med hvert av proteinene som er nevnt ovenfor, velges ut og slås sammen. Kryssreagerende antistoffer fjernes deretter fra de sammenslåtte antisera ved immunabsorpsjon med de ovenfor nevnte proteinene.

Immunabsorberte og sammenslåtte antisera anvendes deretter i en kompetitiv bindingsimmunanalyse, som beskrevet ovenfor, for å sammenligne et annet protein med proteinet brukt til immunisering (f.eks. DCRS5-lignende protein ifølge SEQ ID

NO: 2). For å kunne gjøre denne sammenligningen må hver av de to proteinene analyseres i en lang rekke konsentrasjoner, og mengden av hvert protein som er nødvendig for å hemme 50 % av bindingen av antisera til det immobiliserte proteinet, bestemmes. Dersom mengden som kreves av det andre proteinet er mindre enn to ganger mengden av de(t) utvalgte proteinet eller proteiner, er det andre proteinet sagt å binde spesifikt til et antistoff som er dannet mot immunogenet.

Det er underforstått at disse cytokinreseptorproteinene er medlemmer av en familie med homologe proteiner som omfatter mange identifiserte gener. For et bestemt genprodukt, slik som DCRS5, henviser uttrykket ikke bare til aminosyresekvensene vist heri, men også til andre proteiner som er allele, ikke-allele eller artsvarianter. Det er også underforstått at uttrykket omfatter ikke-naturlige mutasjoner innført ved tilsiktet mutasjon ved anvendelse av vanlig rekombinant teknologi, slik som enkelt-setemutasjon, eller ved fjerning av korte seksjoner av DNA som koder for de aktuelle proteiner, eller ved utbytting av nye aminosyrer, eller tilføyelse av nye aminosyrer. Slike mindre endringer vil typisk nok hovedsakelig bevare immunidentiteten til det opprinnelige molekylet og/eller dets biologiske aktivitet. Slike endringer omfatter således proteiner som er spesifikt immunreaktive med et bestemt, naturlig forekommende DCRS5-protein. De biologiske egenskapene til de endrede proteinene kan bestemmes ved å uttrykke proteinet i en egnet cellelinje og måle den angjeldende effekt, f.eks. på transfekterte lymfocytter. Spesielt overveide proteinmodifikasjoner vil omfatte konservative utbyttinger av aminosyrer med lignende kjemiske egenskaper, som beskrevet ovenfor for cytokinreseptorfamilien som en helhet. Ved å sammenligne et protein optimalt med proteinet til cytokinreseptorer, og ved å bruke vanlige immunanalyser beskrevet heri til å bestemme immunidentiteten, kan man bestemme proteinsammensetningen ifølge oppfinnelsen.

Videre kan antistoffer mot reseptorsubenheter tjene som sterisk blokkerende ligander som binder til den funksjonelle reseptoren. Slike antistoffer kan lages mot enten subenheter alene eller mot kombinasjonen av DCRS5 med IL-12RP1. Antistoff-antagonister vil være resultatet.

VII. Sett, diagnose og kvantitering

Både naturlig forekommende og rekombinante former av cytokinreseptorlignende molekyler som beskrevet heri er særlig egnet i sett og analysefremgangsmåter. For eksempel vil disse fremgangsmåtene også anvendes til screening av bindings- aktivitet, f.eks. for ligander til disse proteinene. Flere fremgangsmåter for automatiserte analyser er blitt utviklet i de senere år for å tillate screening av titusener av forbindelser pr. år. Se f.eks. BIOMEK automatisert arbeidsstasjon, Beckman Instruments, Palo Alto, California, og Fodor et al. (1991), Science, 251:767-773. Sistnevnte beskriver midler for testing av binding av et mangfold av definerte polymerer syntetisert på et fast underlag. Utviklingen av egnede analyser for å screene etter en ligand eller homologe agonist-/antagonistproteiner kan gjøres betydelig lettere på grunn av tilgjengeligheten av store mengder rene, løselige cytokinreseptorer i en aktiv form, slik som tilveiebrakt ifølge denne oppfinnelsen.

Renset DCRS5 kan belegges direkte på plater for anvendelse i de tidligere nevnte ligandscreeningsteknikkene. Ikke-nøytraliserende antistoffer mot disse proteinene kan imidlertid anvendes som tilfangetagelsesantistoffer for å immobilisere den aktuelle reseptor på den faste fase, anvendt f.eks. for diagnostisk bruk.

Denne oppfinnelsen overveier også anvendelse av DCRS5, fragmenter derav, peptider og deres fusjonsprodukter i en rekke diagnostiske sett og fremgangsmåter for påvisning av tilstedeværelse av proteinet og dets ligand. Alternativt eller i tillegg kan antistoffer mot molekylene innlemmes i settene og fremgangsmåtene. Typisk nok vil settene ha en seksjon som inneholder enten et DCRS5-peptid eller gensegment eller et reagens som gjenkjenner det ene eller det andre. Gjenkjennelsesreagensene kan, dersom det er et peptid, karakteristisk være en reseptor eller et antistoff, eller dersom det er et gensegment, vanligvis være en hybridiserende probe. Andre settkomponenter kan omfatte andre proteiner eller reagenser forbundet med p40-, IL-B30-eller IL-12Rpi-polypeptider i ligand-/reseptorparing.

Et foretrukket sett for bestemmelse av DCRS5-konsentra-sjonen i en prøve ville karakteristisk omfatte en merket forbindelse, f.eks. ligand eller antistoff, som har kjent bindingsaffinitet til DCRS5, en DCRS5-kilde (naturlig forekommende eller rekombinant) som positiv kontroll og midler til å separere den bundne fra den frie merkede forbindelse, f.eks. en fast fase til immobilisering av DCRS5 i testprøven. Seksjoner som inneholder reagenser og instruksjoner vil normalt tilveiebringes. Formåls tjenlige nukleinsyre- eller proteininneholdende sett er også tilveiebrakt.

Antistoffer omfattende antigenbindende fragmenter, spesifikke for pattedyr-DCRS5, eller et peptidfragment eller reseptorfragmenter er nyttige i diagnostiske anvendelser til påvisning av tilstedeværelse av forhøyede nivåer av ligand og/eller dets fragmenter. Diagnostiske analyser kan være homo-gene (uten et separasjonstrinn mellom fritt reagens og anti-stof f-antigenkompleks) eller heterogent (med et separasjonstrinn). Det forekommer ulike kommersielle analyser, slik som radioimmunanalyse (RIA), enzymbundet "immunsorbent" analyse (ELISA), enzymimmunanalyse (EIA), enzymmultiplisert immun-analyseteknikk (EMIT), substratmerket fluorescensimmunanalyse (SLFIA) og lignende. For eksempel kan umerkede antistoffer anvendes ved å benytte et sekundært antistoff som er merket og som gjenkjenner antistoffet mot en cytokinreseptor eller mot et bestemt fragment derav. Disse analysene har også vært vidt diskutert i litteraturen. Se f.eks. Harlow og Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH, og Coligan (red. 1991 og periodiske supplementer), Current Protocols In Immunology Greene/Wiley, New York.

Antiidiotypiske antistoffer kan ha lignende anvendelse for å tjene som cytokinreseptoragonister eller -antagonister. Disse skulle være anvendelige som terapeutiske reagenser under riktige omstendigheter.

Reagensene til diagnostiske analyser er ofte levert i sett for å optimalisere følsomheten til analysen. For oppfinnelsen tilveiebringes, avhengig av analysens beskaffenhet, protokollen og merkingen, enten merket eller umerket antistoff eller merket ligand. Dette kommer vanligvis sammen med andre tilsetninger, slik som buffere, stabilisatorer, materialer som er nødvendig for signalproduksjon, slik som substrater for enzymer og lignende. Settet vil også fortrinnsvis inneholde instruksjoner for korrekt anvendelse og destruksjon av innholdet etter bruk. Settet har vanligvis seksjoner for hvert nyttige reagens, og vil inneholde instruksjoner for korrekt anvendelse og destruksjon av reagensene. Det er ønskelig at reagensene tilveiebringes som et tørt, frysetørket pulver, hvor reagensene kan rekonstitueres i et vandig medium med formålstjenlige konsentrasjoner for utførelse av analysen.

De tidligere nevnte bestanddelene i de diagnostiske analysene kan anvendes uten modifikasjon eller kan modifiseres på mange måter. For eksempel kan merking oppnås ved kovalent eller ikke-kovalent sammenkobling av en gruppe som direkte eller indirekte tilveiebringer et påvisbart signal. I mange av disse analysene kan en testforbindelse, cytokinreseptor eller antistoffer mot disse, merkes enten direkte eller indirekte. Mulig-heter for direktemerking omfatter markørgrupper: radiomarkører, slik som<125>I, enzymer (US patentskrift nr. 3 645 090), slik som peroksidase og alkalisk fosfatase og fluorescensmarkører (US patentskrift nr. 3 940 475) som er i stand til å monitorere endringer i fluorescensintensitet, bølgelengdeskift eller fluor-escenspolarisering. Begge patentene er innlemmet heri gjennom henvisning. Mulighetene for indirekte merking omfatter biotin-ylering av én bestanddel, etterfulgt av binding til avidin koblet til en av de ovenfor nevnte markørgrupper.

Det er også en rekke fremgangsmåter for separering av den bundne fra den frie ligand, eller alternativt, den bundne fra den frie testforbindelse. Cytokinreseptoren kan immobiliseres på ulike matrikser, etterfulgt av vasking. Egnede matrikser omfatter plastikk, slik som en ELISA-plate, filtre og kuler. Fremgangsmåter for immobilisering av reseptoren til en matriks omfatter, uten begrensning, direkte adhesjon til plastikk, anvendelse av et tilfangetagelsesantistoff, kjemisk kobling og biotinavidin. Det siste trinnet i denne tilnærmings-måten omfatter utfelling av antistoff-antigenkompleks med enhver av flere fremgangsmåter omfattende de som benytter f.eks. et organisk løsningsmiddel, slik som polyetylenglykol, eller et salt, slik som ammoniumsulfat. Andre egnede separasjonsteknikker omfatter, uten begrensning, den fluorescerende antistoff-magnetiserbare partikkelfremgangsmåten beskrevet i Rattle et al.

(1984), Clin. Chem., 30(9):1457-1461, og den dobbelte, anti-stof fmagnetiske partikkelseparasjonen beskrevet i US patentskrift nr. 4 659 678.

Fremgangsmåter for binding av protein eller fragmenter til ulike markører er blitt omfattende rapportert i litteraturen og krever ingen detaljert diskusjon her. Mange av teknikkene omfatter anvendelse av aktiverte karboksylgrupper, enten gjennom anvendelse av karbodiimid eller aktive estere for å danne peptidbindinger, dannelse av tioetere ved reaksjon av en merkaptogruppe med et aktivert halogen, slik som kloracetyl, eller et aktivert olefin, slik som maleimid, til binding og lignende. Fusjonsproteiner vil også være nyttige innen disse anvendelsesområdene.

Et annet diagnostisk aspekt som beskrevet heri omfatter bruk av oligonukleotid- eller polynukleotidsekvenser tatt fra sekvensen til en cytokinreseptor. Disse sekvensene kan anvendes som prober for påvisning av nivåer av den aktuelle cytokinreseptor hos pasienter som antas å ha en immunlogisk forstyr-relse. Fremstilling av både RNA- og DNA-nukleotidsekvenser, merking av sekvensene og den foretrukne størrelse på ^sekvensen har vært utførlig beskrevet og diskutert i litteraturen. Normalt bør en oligonukleotidprobe ha minst ca. 14 nukleotider, vanligvis minst ca. 18 nukleotider, og polynukleotidprober kan være opptil flere kilobaser. Ulike markører kan anvendes, mest vanlig er radioaktive nuklider, særlig<32>P. Andre teknikker kan imidlertid også anvendes, slik som å bruke biotinmodifiserte nukleotider for introduksjon inn i et polynukleotid. Biotinet tjener derved som sete for bindingen til avidin eller antistoffer som kan merkes med en lang rekke markører, slik som radioaktive nuklider, fluorescerende forbindelser, enzymer eller lignende. Alternativt kan antistoffer anvendes som gjenkjenner spesifikke duplekser, omfattende DNA-duplekser, RNA-duplekser, DNA-RNA-hybridduplekser eller DNA-proteinduplekser. Antistoffene kan i sin tur være merket, og analysen kan utføres når dupleksen er bundet til en overflate, slik at ved dannelse av dupleks på overflaten kan nærværet av antistoffet bundet til dupleksen påvises. Anvendelse av prober mot det nye antisense-RNA-et kan utføres ved vanlige teknikker, slik som nukleinsyrehybridise-ring, pluss- og minusscreening, rekombinell probing, hybrid-frigjøringstranslasjon (HRT) og hybridfengslet translasjon (HART). Dette omfatter også oppformeringsteknikker, slik som polymerasekjedereaksjon (PCR).

Diagnostiske sett som også tester for det kvalitative eller kvantitative nærvær av andre markører, er også overveid. Diagnose eller prognose kan avhenge av kombinasjonen av mange indikasjoner brukt som markører. Sett kan således teste for kombinasjoner av markører. Se f.eks. Viallet et al. (1989), Progress in Growth Factor, Res. 1:89-97. Deteksjon av polymorfe variasjoner som kan gjenspeile funksjonelle forskjeller i reseptorsignalisering, kan være nyttige i bestemmelsen av terapeutisk strategi. Variasjoner som gjenspeiler større eller mindre respons på ligand, kan tillate undergruppering av responderende/ ikke-responderende pasientgrupper.

VIII. Terapeutisk nytte

Det tilveiebringes reagenser med betydelig terapeutisk betydning. Se f.eks. Levitzki (1996), Curr. Opin. Cell Biol., 8:239-244. Cytokinreseptorene (naturlig forekommende eller rekombinante), fragmenter derav, muteinreseptorer og antistoffer, sammen med forbindelser som er funnet å ha bindingsaffinitet til reseptorene eller antistoffene, skulle være nyttige i behandlingen av tilstander som utviser abnorm ekspresjon av reseptorene eller deres ligander. Slike abnormiteter vil typisk nok manifestere seg gjennom immunologiske forstyrrelser. Se WO 01/18051. I tillegg skulle denne oppfinnelsen tilveiebringe terapeutisk betydning for ulike sykdommer eller forstyrrelser forbundet med abnorm ekspresjon eller abnorm ut-løsning av respons på liganden. For eksempel har p40/IL-B30-liganden vært foreslått å være involvert i utvikling av celle-mediert immunitet, f.eks. antitumoraktivitet, basert på humoral og cellulær immunitet, og antivirale effekter. I særdeleshet ser det ut til at liganden aktiverer NK- og T-celler. Terapi kan kombineres med IL-18, IL-12, TNF, IFNy, stråle-/kjemoterapi, adjuvanser eller antitumor-, antiviral- eller antisopp-forbindelser.

På den annen side kan antagonister som kan kombineres med antagonister for TNF, IFNy, IL-18 eller IL-12, eller med IL-10 eller steroider, indiseres ved kroniske Thl-medierte sykdommer, autoimmunitet, eller transplant- og/eller forkastnings-situasjoner, multippel sklerose, psoriasis, kroniske inflammatoriske tilstander, reumatoid artritt, osteoartritt eller "inflammatory bowel disease". Antagonister kan ha form av antistoffer mot reseptorsubenhetene, løselig reseptor-konstruksjoner eller antisensenukleinsyrer mot én eller flere av reseptor subenhetene. Sammenstillingen av p40/lL-B30-liganden med reseptorsubenhetene DCRS5 og IL-12R|3l tilveiebringer innsikt i indikasjoner for anvendelse av agonistene og antagonistene.

Basert på de beskrevne aktivitetene til p40/IL-B30 kan antagonistene til cytokinets bevirke terapeutisk effekt, f.eks. ved løselig DCRS5, med eller uten løselig IL-12Rpi eller antistoffer mot en av reseptorsubenhetene. Antagonister kan være nyttige som inhibitorer av uønskede immun- eller inflammatoriske responser mot målhukommelses-T-celler, eller i kombinasjon med IL-12/IL-12R-antagonister, eller andre antiinflammatoriske eller immunsuppreserende substanser. Kliniske indikasjoner kan være kronisk inflammasjon eller transplantasjonssituasjoner. Ulike polymorfismer kan forsterke eller redusere reseptorfunksjonen, og dersom de er dominante, kan de muligens anvendes som tera-peutika. Identifisering av slike varianter kan tillate undergruppering av responderende eller ikke-responderende pasientgrupper. Reagensene kan være nyttige som påvisnings- eller markørreagenser eller ablative reagenser for hukommelses-T-celler og/eller NK-celler.

Genterapi kan gi ønskede cellepopulasjoner respons på p40/IL-B30-ligand, f.eks. som adjuvanser for tumorimmunterapi, for å fremme aktivering av tumorinfUtrerende lymfocytter, T-celler eller NK-celler. Antisensestrategier kan anvendes, f.eks. for å forhindre reseptorfølsomhet.

Ulike abnorme tilstander er kjent i celletyper som er vist å fremstille både IL-12-, p40- og/eller IL-B30-mRNA ved Northern blot-analyse. Se Berkow (red.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck&Co., Rahway, N.J., Thorn et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y., og Weatherall et al. (red.), Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Mange andre medisinske tilstander og sykdommer vil være følsomme for behandling med en her tilveiebrakt agonist eller antagonist. Se f.eks. Stites og Terr (red., 1991) , Basic and Clinical Immunology Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut, og Samter et al. (red.), Immunological Diseases Little, Brown and Co. Andre sannsynlige indikasjoner for behandling omfatter benomforming, seksuell dysfunksjon, forhindring av neurodegenerative sykdommer, demens, stress m. fl. Disse problemene burde være mottagelige for forebygging eller behandling som anvender preparatene som tilveiebringes heri.

Rekombinante cytokinreseptorer, muteiner, agonist-eller antagonistantistoffer dertil eller antistoffer kan renses og deretter administreres til en pasient. Disse reagensene kan kombineres for terapeutisk anvendelse med ytterligere aktive ingredienser, f.eks. i vanlige farmasøytisk akseptable bærere eller fortynnere, sammen med fysiologisk uskadelige stabilisatorer og eksipienser. Disse kombinasjonene kan være sterile, f.eks. filtrert, og plassert i doseformer ved frysetørking i doseglass eller lagret i stabiliserte vandige preparater. Denne oppfinnelsen overveier også anvendelse av antistoffer eller bindingsfragmenter derav som ikke er komplementbindende.

Ligandscreening ved bruk av cytokinreseptor eller fragmenter derav kan utføres for å identifisere molekyler som har bindingsaffinitet til reseptorene. Påfølgende biologiske analyser kan deretter benyttes for å bestemme om en antatt ligand kan tilveiebringe kompetitiv binding, som kan blokkere intrinsisk stimulerende aktivitet. Reseptorfragmenter kan anvendes som en blokkerer eller antagonist ved at den blokkerer aktiviteten til liganden. Likeledes kan en forbindelse med intrinsisk stimulerende aktivitet aktivere reseptoren og er således en agonist ved at den simulerer aktiviteten til liganden, f.eks. induserende signal. Denne oppfinnelsen overveier videre terapeutisk anvendelse av antistoffer mot cytokinreseptorer som antagonister.

Mengden reagenser som er nødvendig for effektiv behandling, vil avhenge av mange ulike faktorer, omfattende administrasjonsfremgangsmåte, målsete, reagensets fysiologiske levetid, farmakologisk liv, fysiologisk tilstand hos pasienten og andre medikamenter som administreres. Behandlingsdosene skulle således titreres for å optimalisere sikkerhet og effekti-vitet. Doser anvendt in vitro kan karakteristisk tilveiebringe nyttig veiledning angående mengdene som er nyttige for administrasjon in situ av disse reagensene. Testing på dyr for å finne effektive doser for behandling av bestemte forstyrrelser vil tilveiebringe ytterligere predikative indikasjoner på human dose. Ulike betraktninger er beskrevet f.eks. av Gilman et al.

(red. 1990), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of

Therapeutics, 8. utg., Pergamon Press, og Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. utg. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Fremgangsmåter for administrasjon er diskutert deri og nedenfor, f.eks. for oral, intravenøs, intraperitoneal eller intramuskulær administrasjon, transdermal diffusjon, og andre. Farmasøytisk akseptable bærere vil omfatte vann, saltvann, buffere og andre forbindelser beskrevet, f.eks. i Merck-indeksen, Merck&Co., Rahway, New Jersey. På grunn av den sannsynlige høyaffinitetsbindingen eller turnovertallet mellom en antatt ligand og dens reseptor vil lavdoser av disse reagensene i utgangspunktet forventes å være effektive. Og signaliseringsveien antyder at ekstremt lave mengder av liganden kan ha effekt. Således vil doseområdene ordinært forventes å være i mengder lavere enn 1 mM konsentrasjoner, typisk mindre enn ca. 10 U.M konsentrasjoner, vanligvis mindre enn ca. 100 nM, fortrinnsvis mindre enn ca. 10 pM (pikomolar), og mest foretrukket mindre enn ca. 1 fM (femtomolar), med en egnet bærer. Formuleringer for langsom frigjøring eller apparater for langsom frigjøring vil ofte benyttes for kontinuerlig administrasjon.

Cytokinreseptorer, fragmenter derav og antistoffer eller deres fragmenter, antagonister og agonister kan administreres direkte til verten som behandles, eller avhengig av størrelsen på forbindelsen kan det være ønskelig å konjugere dem til bærerproteiner, slik som ovalbumin eller serumalbumin før deres administrasjon. Terapeutiske formuleringer kan administreres som mange vanlige doseformuleringer. Mens det er mulig for den aktive ingrediens å administreres alene, er det foretrukket å presentere den som en farmasøytisk formulering. Formuleringene omfatter minst én aktiv ingrediens, som definert ovenfor, sammen med én eller flere akseptable bærere derav. Hver bærer må være både farmasøytisk og fysiologisk akseptabel i betydning av at den er kompatibel med andre ingredienser og ikke skadelig for pasienten. Formuleringene omfatter dem som er egnet for oral, rektal, nasal eller parenteral (inkludert subkutan, intramuskulær, intravenøs og intradermal) administrasjon. Formuleringene kan beleilig presenteres i enhetsdoseform og kan fremstilles ved fremgangsmåter vel kjent innen fagområdet farmasi. Se f.eks. Gilman et al. (red. 1990), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. utg.,

Pergamon Press, og Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. utg.

(1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn., Avis et al. (red. 1993), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY, Lieberman et al. (red. 1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY, og Lieberman et al. (red. 1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. Terapien ifølge denne oppfinnelsen kan kombineres med eller anvendes i forbindelse med andre terapeutiske midler, spesielt agonister eller antagonister av andre

cytokinreseptorfamiliemedlemmer.

IX. Screening

Medikamentscreening ved bruk av DCRS5 eller fragmenter derav kan utføres for å identifisere forbindelser som har bindingsaffinitet til reseptorsubenheten, omfattende isolasjon av assosierte forbindelser. Påfølgende biologiske analyser kan deretter benyttes for å bestemme om forbindelsen har intrinsisk stimulerende aktivitet og derfor er en blokkerer eller antagonist ved at den blokkerer aktiviteten til liganden.

Videre gir matching av p40/IL-B30-liganden med den funksjonelle reseptoren til DCRS3 med IL-12RP1 adgang til screening med hensyn på for antagonister og agonister med en positiv signaliseringskontroll. Småmolekyl- eller antistoff-screening kan utføres.

Én fremgangsmåte for medikamentscreening gjør bruk av eukaryote eller prokaryote vertsceller som er stabilt transformert med rekombinant DNA-molekyler som uttrykker DCRS5 i kombinasjon med en annen cytokinreseptorsubenhet, f.eks. IL-12Rpi. Signaliseringen er antatt å benytte STAT4. Celler som uttrykker en reseptor som er isolert fra andre funksjonelle reseptorer, kan isoleres. Slike celler, enten levende eller i fiksert tilstand, kan anvendes i standard antistoff-/antigen-eller ligand-/reseptorbindingsanalyser. Se også Parce et al.

(1989), Science, 246:243-247, og Owicki et al. (1990), Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 87:4007-401, som beskriver følsomme fremgangsmåter for påvisning av cellulære responser. Kompetitive analyser er særlig nyttige, hvor cellene er brakt i kontakt og inkubert med en merket reseptor eller et antistoff med kjent bindingsaffinitet til liganden, slik som<125>I-antistoff, og en testprøve hvis bindingsaffinitet til den bindende sammen-setningen blir målt. De bundne og frie merkede bindingssammen-setningene separeres deretter for å vurdere graden av ligandbinding. Mengden av testforbindelse bundet er omvendt propor-sjonal med mengden merket reseptorbinding til den kjente kilde. Mange teknikker kan anvendes for å separere bundet fra fri ligand for å vurdere graden av ligandbinding. Dette separasjons-trinnet kunne typisk nok omfatte involvere en slik fremgangsmåte som adhesjon til filteret, etterfulgt av vasking, adhesjon til plastikk, etterfulgt av vasking, eller sentrifugering av cellemembraner. Levende celler kunne også anvendes til screening av medikamenters virkninger på cytokinmedierte funksjoner, f.eks. STAT4-signalisering og andre. Noen deteksjonsfremgangsmåter tillater eliminering av et separasjonstrinn, f.eks. et nærhets-sensitivitetsdeteksjonssystem.

Det vide omfanget av denne oppfinnelsen er best for-stått med henvisning til de følgende eksempler, som ikke er ment å begrense oppfinnelsen til de spesifikke utførelsesformene.

Eksempler

I. Generelle fremgangsmåter

Noen av standardfremgangsmåtene er beskrevet eller referert, f.eks. av Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2.. utg.), vol. 1-3, CSH Press, NY, eller Ausubel et al. (1987 og supplementer), Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Fremgangsmåter for proteinrensing omfatter slike fremgangsmåter som ammoniumsulfat-utfelling, kolonnekromatografi, elektroforese, sentrifugering, krystallisering og andre. Se f.eks. Ausubel et al. (1987 og periodiske supplementer), Coligan et al. (red. 1996 og periodiske supplementer), Current Protocols In Protein Science, Greene/Wiley, New York, Deutscher (1990), "Guide to Protein Purification" i Methods in Enzymology, vol. 182, og andre volumer i denne serien, og produsentens litteratur på anvendelse av proteinrensingsprodukter, f.eks. Pharmacia, Piscataway, N.J., eller Bio-Rad, Richmond, CA. Kombinasjoner med rekombinante teknikker tillater fusjon av hensiktsmessige segmenter, f.eks. til en FLAG-sekvens eller en tilsvarende som kan forenes via en proteasefjernbar sekvens. Se f.eks. Hochuli (1990), "Purificaton of Recombinant Proteins With Metal Chelate Absorbent" i Setlow (red.), Genetic Engineering, Principle and Methods, 12:87-98, Plenum Press, N.Y., og Crowe et al. (1992), QIAexpress: The High Level Ekspressin&Protein Purification System, QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Computersekvensanalyse utføres f.eks. ved å anvende tilgjengelige programvarer, omfattende dem fra GCG

(U. Wisconsin) og GenBank-kilder. Offentlige sekvensdatabaser ble også anvendt, f.eks. fra GenBank og andre.

Mange teknikker egnet for IL-10-reseptorene kan anvendes for DCRS5, som beskrevet f.eks. i US patentskrift nr. 5 789 192 (IL-10-reseptor).

II. Funksjonell kloning

Det var observert at anti-hIL-12Rpi-antistoff blokkerte responsene til humane T-celler på p40/IL-B30 og p40/IL-B30 bundet til IL-12Rpl. Dette antyder at IL-12Rpl utgjorde én subenhet av reseptorkomplekset for p40/IL-B30.

En T-cellepopulasjon fra mus ble identifisert som responderte på p40/IL-B30, men ikke på IL-12, og en annen populasjon som responderte på IL-12, men ikke p40/IL-B30. I tillegg ble det observert at Ba/F3-celler som rekombinant uttrykte mIL-12Rpi og mIL-12Rp2, responderte på IL-12, men ikke på p40/IL-B30. Disse resultatene antydet kollektivt at reseptorkomplekset til p40/IL-B30 inneholdt IL-12RP1 og minst én annen subenhet som ikke var IL-12RP2. Som følge av dette ble en ekspresjonskloningsstrategi planlagt for å isolere denne andre reseptorkomponenten.

Et cDNA-bibliotek ble fremstilt fra mRNA isolert fra Kit225-celler, en IL-2-avhengig human T-cellelinje som responderte på både IL-12 og p40/IL-B30. cDNA-biblioteket ble laget ved å bruke en retroviral ekspresjonsvektor, pNlX. Ba/F3-celler som uttrykte rekombinant hIL-12Rpi, ble infisert med dette cDNA-biblioteket og tillatt å friskne til i 3-4 dager i IL-3, deretter vasket og fordelt med 15 000 celler/brønn i 96-brønners plater i medium bestående av 50 ng/ml hyper-hp40/hIL-B30. Se WO 01/18051. Kulturer ble tilført ytterligere hyper-hp40/hIL-B30hver 5. dag. Etter ca. 2 uker viste 5-10 % av brønnene celle-vekst. Cellene ble gjenvunnet fra hver brønn, ekspandert individuelt i større kulturer i hyper-hp40/hIL-B30, og testet med hensyn på vekstavhengighet for hyper-hp40/hIL-B30.

Cellene som var p40/IL-B30-avhengige for å vokse, ble analysert med PCR med hensyn på retrovirale cDNA-innskudd. Av mer enn 40 analyserte isolater inneholdt alle unntatt ett, cDNAer som kodet for den nye reseptoren DCRS5. Dette humane kandidat-cDNA-et ble klonet inn i en ekspresjonsvektor og transfektert inn i Ba/F3-celler som uttrykte hIL-12Rpi. Disse cellene ble følsomme for p40/IL-B30, og vi konkluderte således med at det nye cDNA-et kodet for den ønskede DCRS5, som er en funksj one11 IL-B30-reseptorsubenhet.

III. Trekk ved fullengde- DCRS5, kromosomal lokalisasjon

Det cytoplasmatiske domenet til DCRS5 er ikke totalt sett nært beslektet med andre cytokinreseptorers cytoplasmatiske domener, noe som er en vanlig observasjon for denne familien av molekyler. De cytoplasmatiske domenene inneholder sju tyr-residuer, minst tre av disse er en del av et gjenkjennbare SH2-bindingsmotiv: YEDI, YKPQ og YFPQ. YEDI-motivet ligner identifiserte bindingsseter for tyrosinfosfatase shp2. De to siste motivene er meget like sekvenser som er kjent for å binde hen-holdsvis Statl/Stat3 eller Stat3. YKPQ-motivet sammen med nærliggende flankesekvenser ligner også til en viss grad motivene i Stat4 og IL-12RP2, som er kjent for å binde Statl-3. Dette er i overensstemmelse med foreløpige data som antyder at p40/IL-B30 i likhet med IL-12 aktiverer Stat4.

PCR-primere avledet fra DCRS5-sekvensen anvendes for å sondere i et humant cDNA-bibliotek. Sekvensene kan avledes f.eks. fra tabell 1, fortrinnsvis de som er nærliggende endene til sekvensene. Fullengde-cDNA-er for DCRS5 fra primat, gnager eller andre arter er klonet, f.eks. ved DNA-hybridiserings-screening av X,gtl0-fag. PCR-reaksjoner utføres ved å anvende T. aquaticus- Taqplus-DNA-polymerase (Stratagene) under egnede betingelser.

Kromosomutstryk prepareres. In situ-hybridisering utføres på kromosompreparatene oppnådd fra fytohemagglutinin- stimulerte humanlymfocytter dyrket i 72 timer. 5-bromdeoksy-uridin tilsettes i de siste 7 timene av kulturen (60 u.g/ml medium) for å sikre en kromosomal båndstruktur av god kvalitet etter hybridisering.

Et PCR-fragment, oppformert ved hjelp av primere, klones inn i en hensiktsmessig vektor. Vektoren merkes med "nick"-translasjon med<3>H. Den radiomerkede proben hybridiseres til metafaseutstryk med en endelig konsentrasjon på 200 ng/ml med hybridiseringsløsning, som beskrevet av Mattei et al.

(1985), Hum. Genet., 69:327-331.

Etter å ha blitt overtrukket med "nuclear track"-emulsjon (KODAK NTB2), eksponeres objektglassene. For å unngå enhver glidning av sølvkorn under båndstrukturprosedyren farges først kromosomutstrykene med bufret Giemsa-løsning og foto-graferes i metafase. R-båndstrukturering utføres deretter med fluorokrom-fotolyse-Giemsa(FPG)metoden, og metafåsene refoto-graferes før analyse.

Lignende hensiktsmessige fremgangsmåter er anvendt for andre arter.

IV. Lokalisering av DCRS5- mRNA

Humane mange-vev-(Cat nr. 1, 2) og cancercellelinjeblot (Cat nr. 7757-1) inneholdende ca. 2 u.g poly (A)<+>RNA pr. spor ble innkjøpt fra Clontech (Palo Alto, CA). Prober ble radioaktivt merket med [a-32P]dATP, f.eks. ved å anvende Amersham Rediprime random primer labelling-sett (RPN1633). Prehybridisering og hybridiseringer ble utført f. eks. ved 65 °C i 0,5 M Na2HP04, 7 % SDS, 0,5 M EDTA (pH 8,0). Høystringente vasker ble utført, f.eks. ved 65 °C med to innledende vasker i 2 x SSC, 0,1 % SDS i 40 minutter, etterfulgt av en påfølgende vask i 0,1 x SSC, 0,1 % SDS i 20 minutter. Membranene ble så eksponert ved -70 °C til røntgenfilm (Kodak) i nærvær av forsterkende filmer. Mer detal-jerte studier av cDNA-biblioteker med Southern blot ble utført med utvalgte hensiktsmessige human-DCRS5-kloner for å undersøke deres ekspresjon i hematopoetiske eller andre celleundergrupper.

Alternativt ble to egnede primere valgt fra tabell 1. RT-PCR anvendes på en egnet mRNA-prøve valgt på bakgrunn av nærværet av budbringer for å fremstille et cDNA, f.eks. en prøve som uttrykker genet.

Fullengde kloner kan isoleres ved hybridisering av cDNA-biblioteker fra egnede vev forhåndsutvalgt ved PCR-signal. Northern blot kan utføres.

Budbringer for gener som koder for DCRS5 kan analyseres med egnet teknologi, f.eks. PCR, immunanalyse, hybridisering eller på annen måte. Vevs- og organ-cDNA-preparater er tilgjengelige f.eks. fra Clontech, Mountain View, CA. Identifisering av kilder for naturlig ekspresjon er nyttig, som beskrevet. Og identifikasjonen av den funksjonelle reseptorsubenhets-kombinasjonen tillater forutsigelse av hvilke celler som uttrykker kombinasjonen av reseptorsubenheter som vil resultere i en fysiologisk følsomhet overfor hver av cytokinligandene.

For distribusjon i mus kan f.eks. Southern-analyse utføres: DNA (5 u.g) fra et forhåndsoppformert cDNA-bibliotek ble fordøyd med egnede restriksjonsenzymer for å frigjøre inn-skuddene, kjørt på 1 % agarosegel og overført til en nylon-membran (Schleicher and Schuell, Keene, NY).

Prøver for isolering av muse-mRNA kan omfatte: hvilende musefibroblastisk L-cellelinje (C200), Braf:ER ("Braf fusion to estrogen receptor") transfekterte celler, kontroll (C201), T-celler, THl-polariserte (Mell4 bright, CD4+-celler fra milt, polarisert i 7 dager med IFN-y og anti-IL-4, T200) , T-celler, TH2-polariserte (Mell4 bright, CD4+-celler fra milt, polarisert i 7 dager med IL-4 og anti-IFN-y, T201), T-celler, meget THl-polariserte (se Oppenshaw et al. (1995), J. Exp. Med., 182:1357-1367, aktivert med anti-CD3 i 2, 6, 16 timer sammenslått, T202), T-celler, meget TH2-polariserte (se Openshaw et al. (1995), J. Exp. Med., 182:1357-1367, aktivert med anti-CD3 i 2, 6, 16 timer sammenslått, T203), CD44-CD25+-pre-T-celler, sortert fra thymus (T204), THl-T-celleklon Dl.l, hvilende i 3 uker etter siste stimulering med antigen (T205) , THl-T-celleklon Dl.l, 10 u.g/ml ConA-stimulert i 15 timer (T206), TH2-T-celleklon CDC35, hvilende i 3 uker etter siste stimulering med antigen (T207), TH2-T-celleklon CDC35, 10 u.g/ml ConA-stimulert i 15 timer (T208), Mell4+-native T-celler fra milt, hvilende (T209) , Mell4+-T-celler, polarisert til Thl med IFN-y/IL-12/anti-IL-4 i 6, 12, 24 timer sammenslått (T210), Mell4+-T-celler, polarisert til Th2 med IL-4/anti-IFN-y i 6, 13, 24 timer sammenslått (T211), ustimulert fullengde-B-celleleukemicellelinje A20 (B200), ustimulert B-cellelinje CH12 (B201), ustimulerte store B-celler fra milt (B202), B-celler fra totalmilt, LPS-aktiverte (B203), metrizamidanrikede dendrittiske celler fra milt, hvilende (D200), dendrittiske celler fra benmarg, hvilende (D201), monocyttcellelinje RAW 264.7 aktivert med LPS i 4 timer (M200), benmargmakrofager avledet med GM og M-CSF (M201), makrofagcellelinje J774, hvilende (M202), makrofagcellelinje J774 + LPS + anti-IL-10 ved 0,5, 1, 3, 6, 12 timer sammenslått (M203), makrofagcellelinje J774 + LPS + IL-10 ved 0,5, 1, 3, 5, 12 timer sammenslått (M204), aerosoleksponert muselungevev, Th2-primere, aerosol-OVA-eksponert 7, 14, 23 timer sammenslått (se Garlisi et al. (1995), Clinical Immunology and Immunopathology, 75:75-83, X206), Nippostrongulus-infisert lungevev (se Coffman et al.

(1989), Science, 245:308-310, X200), total voksen lunge, normal

(0200) , total lunge, rag-1 (se Schwarz et al. (1993), Immuno-deficiency, 4:249-252, O205), IL-10 K.O. milt (se Kuhn et al.

(1991), Cell, 75:263-274, X201), total voksen milt, normal

(0201) , total milt, rag-1 (O207), IL-10 K.O. Peyerske flekker

(0202) , totale Peyerske flekker, normal (O210), IL-10 K.O. mesenteriske lymfeknuter (X203), totale mesenteriske lymfeknuter, normale (0211), IL-10 K.O. colon (X203), total colon, normal (0212), NOD-musepankreas (se Makino et al. (1980), Jikken Dobutsu, 29:1-13, X205), total thymus, rag-1 (O208), total nyre, rag-1 (O209), totalt hjerte, rag-1 (O202), total hjerne, rag-1

(0203) , totale testikler, rag-1 (O204), total lever, rag-1 (O206), normalt leddvev fra rotte (O300), og artrittisk leddvev fra rotte (X300). Prøver til isolering av human-mRNA kan omfatte: perifere blodmononukleære celler (monocytter, T-celler, NK-celler, granulocytter, B-celler), hvilende (T100), perifere blodmononukleære celler, aktivert med anti-CD3 i 2, 6, 12 timer sammenslått (T101), T-celle, THO-klon Mot 72, hvilende (T102), T-celle, THO-klon Mot 72, aktivert med anti-CD28 og anti-CD3 i 3, 6, 12 timer sammenslått (T103), T-celle, THO-klon Mot 72, anergisk behandlet med spesifikt peptid i 2, 7, 12 timer sammenslått (T104), T-celle, THl-klon HY06, hvilende (T107), T-celle, THl-klon HY06, aktivert med anti-CD28 og anti-CD3 i 3, 6, 12 timer sammenslått (T108), T-celle, THl-klon HY06, anergisk behandlet med spesifikt peptid i 2, 6, 12 timer sammenslått (T109), T-celle, TH2-klon HY935, hvilende (T110), T-celle, TH2-klon HY935, aktivert med anti-CD28 og anti-CD3 i 2, 7, 12 timer sammenslått (Till), T-celler CD4+CD45RO-T-celler polarisert 27 dager i anti-CD28, IL-4 og anti IFN-y, TH2-polariserte, aktivert med anti-CD3 og anti-CD28 i 4 timer (T116), T-celletumorlinjer Jurkat og Hut78, hvilende (T117), T-cellekloner, sammenslått, AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, hvilende (T118), T-celle, tilfeldig y8-T-cellekloner, hvilende (T119), splenocytter, hvilende (B100), splenocytter aktivert med anti-CD40 og IL-4 (B101), B-celle-EBV-linje sammenslått WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY, hvilende (B102), B-cellelinje JY, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer sammenslått (B103), NK20-kloner sammenslått, hvilende (K100), NK20-kloner sammenslått, aktivert med PMA og ionomycin i 6 timer (K101), NKL-klon, avledet fra perifert blod hos LGL-leukemipasient, IL-2-behandlet (K106), NK-cytotoksisk klon 640-A30-1, hvilende (K107) , hematopoetiske forløperlinje TF1, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer sammenslått (C100), U937-monocyttforløperlinje, hvilende (M100), U937- monocyttforløperlinje, aktivert med PMA og ionomycin il, 6 timer sammenslått (M101), utvaskede monocytter, aktivert med LPS, IFNy, anti-IL-10 i 1, 2, 6, 12, 24 timer sammenslått (M102), utvaskede monocytter, aktivert med LPS, IFNy, IL-10 i 1, 2, 6, 12, 24 timer sammenslått (M103), utvaskede monocytter, aktivert med LPS, IFNy, anti-IL-10 i 4, 16 timer sammenslått (M106), utvaskede monocytter, aktivert med LPS, IFNy, IL-10 i 4, 16 timer sammenslått (M107), utvaskede monocytter, aktivert med LPS i 1 time (M108), utvaskede monocytter, aktivert med LPS i 6 timer (M109), DC 70 % CDla+, fra CD34+-GM-CSF, TNFa i 12 dager, hvilende (D101), DC 70 % CDla+, fra CD34+-GM-CSF, TNFa i 12 dager, aktivert med PMA og ionomycin i 1 time (D102), DC 70 % CDla+, fra CD34+-GM-CSF, TNFa i 12 dager, aktivert med PMA og ionomycin i 6 timer (D103), DC 95 % CDla+, fra CD34+-GM-CSF, TNFa i 12 dager, FACS-sortert, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer sammenslått (D104), DC 95 % CD 14+, ex CD34+-GM-CSF, TNFa i 12 dager, FACS-sortert, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer sammenslått (D105), DC-CDla+-CD86+, fra CD34+-GM-CSF, TNFa i 12 dager, FACS-sortert, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer sammenslått (K106), DC fra monocytter GM-CSF, IL-4 i 5 dager, hvilende (D107), DC fra monocytter GM-CSF, IL-4 i 5 dager, hvilende (D108), DC fra monocytter GMCSF, IL-4 i 5 dager, aktivert med LPS i 4, 16 timer sammenslått (D109) , DC fra monocytter GM-CSF, IL-4 i 5 dager, aktivert med TNFa, mono-cyttsupe i 4, 16 timer sammenslått (DUO), leiomyom LII benign tumor (X101), normalt myometrium M5 (0115), malignt leiomyo-sarkom GS1 (X103), lungefibroblastsarkomlinje MRC5, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer sammenslått (C101), nyreepitel-karsinomcellelinje CHA, aktivert med PMA og ionomycin i 1, 6 timer sammenslått (C102), føtal mannlig nyre, 28 uker (O100), føtal mannlig lunge, 28 uker (0101), føtal mannlig lever, 28 uker (0102 , føtalt mannlig hjerte, 28 uker (0103), føtal mannlig hjerne, 28 uker (0104), føtal mannlig galleblære, 28 uker (0106), føtal mannlig tynntarm, 28 uker (0107), føtalt mannlig fettvev, 28 uker (0108), føtalt kvinnelig ovarium, 25 uker (0109) , føtal kvinnelig uterus, 25 uker (OHO) , føtale mannlige testikler, 28 uker (0111), føtal mannlig milt, 28 uker

(0112), voksen placenta, 28 uker (0113), og inflammerte tonsiller fra 1-åring (X100).

Lignende prøver ble isolert i andre arter for evaluering.

V. Kloning av artmotstykker av DCRS5

Ulike strategier anvendes for å oppnå artsmotstykker av DCRS5, fortrinnsvis fra andre primater eller gnagere. Én fremgangsmåte er ved krysshybridisering ved å anvende nært beslektede arts-DNA-prober. Det kan være nyttig å gå inn i utviklings-messig like arter som mellomtrinn. En annen fremgangsmåte er å anvende spesifikke PCR-primere basert på identifiseringen av blokker med likhet eller forskjeller mellom gener, f.eks. områder med meget konserverte eller ikke-konserverte polypeptid-eller nukleotidsekvenser.

Databasesøk kan identifisere lignende sekvenser og tillate produksjon av egnede prober.

VI. Fremstilling av pattedyr- DCRS5- protein

En hensiktsmessig, f.eks. GST, fusjonskonstruksjon kan konstrueres for ekspresjon, f.eks. i E. coli. For eksempel konstrueres et muse-IGIF-pGex-plasmid og transformeres inn i E. coli. Nylig transformerte celler dyrkes, f.eks. i LB-medium inneholdende 50 u.g/ml ampicillin og induseres med IPTG (Sigma, St. Louis, MO). Etter induksjon over natten høstes bakteriene, og pelletene inneholdende DCRS5-proteinet isoleres. Pelletene homogenseres, f.eks. i TE-buffer (50 mM Tris-base, pH 8,0, 10 mM EDTA og 2 mM pefabloc) i 2 liter. Dette materialet passeres gjennom en mikrofluidiserer (Microfluidics, Newton, MA) tre ganger. Den fluidiserte supernatanten spinnes ned på en Sorvall GS-3-rotor i 1 time ved 13 000 rpm. Den resulterende supernatant inneholdende cytokinreseptorproteinet filtreres, og passeres over en glutation-Sepharose-kolonne brakt til likevekt i 50 mM Tris-base, pH 8,0. Fraksjonene inneholdende DCRS5-GST-fusjonsproteinet slås sammen og spaltes, f.eks. med trombin (Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN). Den spaltede poolen passeres deretter over en Q-Sepharose-kolonne brakt i likevekt til 50 mM Tris-base. Fraksjonene inneholdende DCRS5 slås sammen og fortynnes i kaldt destillert H20, for å redusere ledningsevnen og føres tilbake over en ny Q-Sepharose-kolonne, alene eller etterfulgt av en immunaffinitetsantistoffkolonne. Fraksjoner inneholdende DCRS5-proteinet slås sammen, fordeles og lagres i -70 °C-fryseren.

Sammenligning av CD-spekteret med cytokinreseptorprotein kan antyde at proteinet er korrekt foldet. Se Hazuda et al. (1969), J. Biol. Chem., 264:1689-1693.

VII. Fremstilling av antistoffer som er spesifikke for DCRS5

Innavlede Balb/c-mus immuniseres intraperitonealt med rekombinante former av proteinet, f.eks. renset DCRS5 eller stabilt transfekterte NIH-3T3-celler. Dyrene revaksineres ved hensiktsmessige tidspunkter med protein, med eller uten til-leggsadjuvans, for ytterligere å stimulere antistoffproduksjon. Serum samles opp, eller hybridomer fremstilles med høstede milter.

Alternativt immuniseres Balb/c-mus med celler, enten endogene eller eksogene, som er transformert med genet eller fragmenter derav, eller med isolerte membraner anriket med hensyn på ekspresjon av antigenet. Serum tappes ved et passende tidspunkt, karakteristisk etter mange flere administrasjoner. Ulike genterapiteknikker kan være nyttige, f.eks. ved protein-produksjon in situ, for dannelse av en immunrespons. Serum- eller antistoffpreparater kan kryssabsorberes eller immun-selekteres for å fremstille betydelig rensede antistoffer med definert spesifisitet og høy affinitet.

Monoklonale antistoffer kan lages. For eksempel kan miltceller fusjoneres med en hensiktsmessig fusjonspartner, og hybridomer selekteres i vekstmedium ved standardfremgangsmåter. Hybridomsupernatantene screenes for tilstedeværelse av antistoffer som binder til DCRS5, f.eks. ved hjelp av ELISA eller andre analyser. Antistoffer som spesifikt gjenkjenner spesifikke DCRS5-utførelsesformer, kan også selekteres eller fremstilles.

I en annen fremgangsmåte presenteres syntetiske peptider eller renset protein til et immunsystem for å danne monoklonale eller polyklonale antistoffer. Se f.eks. Coligan (red. 1991), Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, og Harlow og Lane (1989), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. I passende situasjoner kan bindings-reagenset enten merkes som beskrevet ovenfor, f.eks. med fluor-escens eller på annen måte, eller immobiliseres til et støtte-materiale for "panning"-fremgangsmåter. Nukleinsyrer kan også introduseres i celler i et dyr for å fremstille antigenet, som tjener til å fremkalle en immunrespons. Se f.eks. Wang et al.

(1993) , Proe. Nat'l. Acad. Sei., 90:4156-4160, Barry et al.

(1994) , BioTechniques, 16:616-619, og Xiang et al. (1995), Immunity, 2:129-135.

VIII. Produksjon av fusjonsproteiner med DCRS5

Ulike fusjonskonstruksjoner kan lages med DCRS5, omfattende utførelsesformer som kombinerer slike med IL-12RP1-sekvens. En del av det egnede genet fusjoneres til en epitop-markør, f.eks. en FLAG-markør, eller til en tohybridsystem-konstruksjon. Se f.eks. Fields og Song (1989), Nature, 340:245-246.

Epitopemarkøren kan anvendes i en ekspresjonsklonings-fremgangsmåte med deteksjon med anti-FLAG-antistoff for å påvise en bindende partner, f.eks. ligand for den respektive cytokinreseptor. De to hybridsysternene kan også anvendes for å isolere proteiner som spesifikt binder til DCRS5.

IX. Struktur- aktivitet- sammenheng

Informasjon om kritikaliteten til bestemte residuer bestemmes ved å anvende standardfremgangsmåter og -analyser. Standardmutageneseanalyse utføres f.eks. ved generering av mange ulike varianter ved bestemte posisjoner, f.eks. ved posisjoner definert ovenfor, og evaluering av den biologiske aktiviteten til variantene. Dette kan utføres slik at man kan bestemme posisjoner som modifiserer aktiviteten eller fokusere på spesifikke posisjoner for å bestemme residuene som kan byttes ut for enten å bevare, blokkere eller modulere biologisk aktivitet.

Alternativt kan analyser av naturlige varianter indikere hvilke posisjoner som tolererer naturlige mutasjoner. Dette kan være et resultat av populasjonsanalyse med hensyn på variasjon mellom individer eller mellom stammer eller arter. Prøver fra utvalgte individer analyseres, f.eks. ved PCR-analyse og sekvensering. Dette tillater evaluering av populasjons-polymorfisme.

X. Koekspresjon av DCRS5 og IL- 12RP1

En vektor eller vektorer som koder for de respektive genene, kan transfekteres inn i en celle. En slik vektor vil fortrinnsvis ha seleksjonsmarkører for å identifisere hvilke celler som vellykket er blitt transformert. Koekspresjon av de to genene vil tillate genproduktene å være korrekt assosiert for å danne aktive reseptorkomplekser.

Alternativt er anvendelse av fremgangsmåter som forårsaker assosiasjon av funksjonelle dimerer, tilgjengelig. Se f.eks. 0'Shea et al. (1989), Science, 245:646-648, Kostelny et al. (1992), J. Immunol., 148:1547-1553, og Patel et al. (1996), J. Biol. Chem., 271:30386-30391. Ekspresjon av ekstracellulære domener og fysisk assosiasjon, f.eks. drevet av Fos/Jun, leucin-zipperaffinitet, vil resultere i ligandbindingskonstruksjoner som burde virke som bindingsforbindelser til diagnostisk eller terapeutisk bruk.

Claims

1. Betydelig rent eller rekombinant antigenpolypeptid,karakterisert vedat det omfatter aminosyrerestene 1 til 606 i SEQ ID NO: 2.

2. Isolert eller rekombinant nukleinsyre,karakterisert vedat den koder for polypeptidet ifølge krav 1.

3. Isolert eller rekombinant nukleinsyre ifølge krav 2,karakterisert vedat det omfatter nukelotid-restene 188-2005 i SEQ ID NO: 1.

4 . Betydelig rent eller rekombinant antigenpolypeptid ifølge krav 1, karakterisert vedat det omfatter aminosyrerestene -23 til 606 i SEQ ID NO: 2.

5. Isolert eller rekombinant nukleinsyre ifølge krav 2,karakterisert vedat den koder for polypeptidet ifølge krav 4.

6. Isolert eller rekombinant nukleinsyre ifølge krav 5,karakterisert vedat den omfatter nukleotid-restene 119-2005 i SEQ ID NO: 1.

7. Ekspresjonsvektor, karakterisert vedat den omfatter nukleinsyrene ifølge krav 2.

8. Vertscelle, karakterisert vedat den omfatter ekspresjonsvektoren ifølge krav 7.

9. Vertscelle ifølge krav 8, karakterisert vedvertscellen er en pattedyrcelle .

10. Vertscelle ifølge krav 8, karakterisert vedvertscellen er en insekts-celle.

11. Vertscelle ifølge krav 8, karakterisert vedvertscellen er en bakteriecelle .

12. Vertscelle ifølge krav 8, karakterisert vedvertscellen er en gjærcelle.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid,karakterisert vedat den omfatter: a) dyrkning av vertscellen ifølge krav 8 under betingelser som er egnet for ekspresjon av polypeptidet, og b) isolering eller rensing av polypeptidet.

14. Bindingsforbindelse, karakterisert vedat den består av et antistoff eller antigenbindende fragment derav som spesifikt binder til et polypeptid som består av aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 2.

15. Bindingsforbindelse ifølge krav 14,karakterisert vedat bindingsforbindelsen spesifikt binder til et polypeptid som består av restene 1-606 i SEQ ID NO: 2.

16. Bindingsforbindelse ifølge krav 15,karakterisert vedat bindingsforbindelsen spesifikt binder til et polypeptid som består av restene 356-606 i SEQ ID NO: 2.

17. Bindingsforbindelse ifølge ethvert av kravene 14, 15 eller 16, karakterisert vedat bindingsforbindelsen er et monoklonalt antistoff eller antigenbindende fragment derav.

18. Bindingsforbindelse ifølge ethvert av kravene 14, 15 eller 16, karakterisert vedat bindingsforbindelsen er et Fab-, Fab2- eller Fv-fragment.

19. Sett, karakterisert vedat det omfatter: a) bindingsforbindelse ifløge ethvert av kravene 14, 15 eller 16, og b) instruksjoner for anvendelse.

20. Fremgangsmåte for fremstilling av et antigen: antistoffkompleks,karakterisert vedat det omfatter at bindingsforbindelsen ifølge ethvert av kravene 14, 15 eller 16 bringes i kontakt med et antigenpolypeptid ifølge SEQ ID NO: 2 under betingelser som er egnet for dannelsen av komplekset.

21. Heterodimert preparat, karakterisert vedat det omfatter: a) et polypeptid omfattende aminosyrerestene 1 til 606 i SEQ ID NO: 2, og b) IL-12R(31.

22. Preparat ifølge krav 21, karakterisert vedat det kan binde IL-B30/p40.

23. Sett, karakterisert vedat det omfatter: a) et polypeptid omfattende aminosyrerestene 1 til 606 i SEQ ID NO: 2, og b) instruksjoner for anvendelse.

24. Preparat, karakterisert vedat det består av et antagonistantistoff eller antigenbindende fragment derav som binder til et kompleks som består av: i) et polypeptid som består av aminosyrene 1-328 i SEQ ID NO: 2, og ii) den ekstracellulære del av IL-12RJ31 for anvendelse som et medikament.

25. Preparat ifølge krav 24, i kombinasjon med en antagonist av: a) IL-12, b) IL-18, c) TNF, eller d) IFNy for anvendelse som et medikament.

26. Anvendelse av preparatet som angitt i krav 24, ved fremstilling av et medikament for behandling av en pasient som har: a) en kronisk Thl-mediert sykdom, b) multippel sklerose, c) reumatoid artritt, d) osteoartritt, e) inflammatorisk tarmsykdom, f) diabetes, g) psoriasis, h) sepsis, eller i) et allogent transplantat.