CZ304022B6 - Savcí receptorové proteiny, cinidla a metody, které se jich týkají - Google Patents

Savcí receptorové proteiny, cinidla a metody, které se jich týkají Download PDF

Info

Publication number
CZ304022B6
CZ304022B6 CZ20023698A CZ20023698A CZ304022B6 CZ 304022 B6 CZ304022 B6 CZ 304022B6 CZ 20023698 A CZ20023698 A CZ 20023698A CZ 20023698 A CZ20023698 A CZ 20023698A CZ 304022 B6 CZ304022 B6 CZ 304022B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polypeptide
seq
binding
composition
dcrs5
Prior art date
Application number
CZ20023698A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20023698A3 (cs
Inventor
Chiraca@Madaline
A. Kastelein@Robert
W. Moore@Kevin
L. Parham@Christi
Original Assignee
Merck Sharp & Dohme Corp.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22753958&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ304022(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Merck Sharp & Dohme Corp. filed Critical Merck Sharp & Dohme Corp.
Publication of CZ20023698A3 publication Critical patent/CZ20023698A3/cs
Publication of CZ304022B6 publication Critical patent/CZ304022B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

Je popsán antigenní polypeptid obsahující 606 aminokyselin nazvaný DCRS5 (IL-30R). Tento polyptid vytvárí spolecne s IL-12R.beta.1 receptor pro p40/IL-B30 (IL-23). Dále se popisují polyklonální a monoklonální protilátky proti tomuto polyptidu a zpusoby pouzití prostredku pro diagnostické a terapeutické pouzití.

Description

Savčí receptorové proteiny, činidla a metody, které se jich týkají
Oblast techniky
Vynález popisuje prostředky a metody ovlivnění fyziologie savců zahrnující funkci imunitního systému. Zvláště se popisují metody regulující vývoj a/nebo imunitní systém. Popisuje se také diagnostická a terapeutická použití těchto materiálů.
Dosavadní stav techniky
Technologie rekombinace DNA znamená v obecném případě způsob začlenění genetické informace z dárce do vektorů za účelem dalšího zpracování. Vektory se mohou zavést do hostitele, kde se vytvoří kopie přenesené genetické informace, a/nebo se exprimují v novém prostředí. V běžném případě existuje genetická informace ve formě komplementární DNA (cNA) získané z messengerové RNA (mRNA) kódující požadovaný proteinový produkt. Nosičem je často plazmid, který vykazuje kapacitu začlenit cDNA za účelem pozdější replikace do hostitele a v některých případech dokonce řídit expresi cDNA, čímž řídí syntézu kódovaného produktu v hostiteli (popisuje se například v publikaci Sambrook, et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.) vis. 1—3, CSH Press, NY).
Je známo, že imunitní odezva savců je založena na sérii komplexních buněčných interakcí, které se nazývají „imunitní síť“. Současný výzkum poskytuje nový pohled na vnitřní vazby v této síti. Zatímco je zřejmé, že ve skutečnosti se imunitní odezva příliš nepodílí na interakcích lymfocytů, makrofágů, granulocytů a jiných buněk, imunologové v současné době prosazují názor, že rozpustné proteiny známé jako lymfokiny, cytokiny nebo monokiny mají důležitou úlohu při řízení těchto buněčných interakcí. Je důležité izolovat a charakterizovat buněčné modulační faktory a porozumět jejich mechanizmu působení, což povede ke zlepšení diagnózy a terapie řady zdravotních abnormalit, například poruch imunitního sytému.
Lymfokiny zjevně různým způsobem zprostředkovaní buněčné aktivity (popisuje se například v publikaci Paul (ed. 1996) Fundamental Immunology 3d ed., Raven Press, New York a Thomson (ed. 1994) The Cytokine Handbook 2d ed., Academie Press, San Diego). Ukazuje se, že cytokiny podporují proliferaci, růst a/nebo diferenciaci pluripotencionálních krvetvorných kmenových buněk do nesmírného počtu progenitorů, které obsahují odlišné diverzní linie, jenž tvoří komplexní imunitní systém. Správné a vyvážené interakce mezi buněčnými komponenty jsou nezbytné pro zdravou imunitní odpověď. V případě, že se lymfokiny aplikují ve spojení s jinými činidly, různé buněčné linie často odpovídají odlišným způsobem.
Buněčná linie, které jsou zvláště důležité pro imunitní odezvu zahrnují dvě třídy lymfocytů: B-buňky, které mohou produkovat a vylučovat imunoglobuiiny (proteiny se schopností rozeznávat a vázat se na cizorodé látky za účelem jejich odstranění) a T-buňky různých subtypů, které vylučují lymfokiny a vyvolávají a potlačují B-buňky a různé jiné buňky (zahrnující jiné T-buňky), které tvoří imunitní síť. Tyto lymfokiny reagují s řadou jiných typů buněk.
Překážkou výzkumu za účelem lépe porozumět a léčit různé poruchy imunity je obecná neschopnost udržet buňky imunitního systému in vitro. Imunologové zjistili, že kultivace řady buněk může být doprovázena použitím T-buněk a jiných buněčných supematantů, které obsahují různé růstové faktory zahrnující řadu lymfokinů.
Existují různé růstové a regulační faktory, které modulují morfogenní vývoj. Je známa řada receptorů vhodných pro cytokiny. Často ve funkčním receptorů existují alespoň dvě kritické podjednotky (popisuje se v publikaci Heinrich, et al., (1998) Biochem. J. 334: 297-314, Gonda and D’Andrea (1997) Blood 89: 355-369, Presky, et al., (1996) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:
- 1 CZ 304022 B6
14002-1407, Grachman and Kaushansky (1995) Curr. Opin. Hematol. 2: 22-28, Theze (1994) Eur. Cytokine Netw. 5: 353-368 a Lemmon and Schlessinger (1994) Trends Biochem. Sci. 19: 459-463).
Se shora uvedených informací vyplývá, že objev a vývoj nových rozpustných proteinů a jejich receptor, které zahrnují ty podobné lymfokinům, by se mohly podílet na nových terapiích širokého rozsahu degenerativních nebo abnormálních podmínek, které přímo nebo nepřímo zahrnují vývoj, diferenciaci nebo funkci například imunitního systému a/nebo krvetvorných buněk. Velmi výhodné bude objevení a porozumění funkci nových receptorů vhodných pro molekuly podobné ío lymfokinům, které zesilují nebo umožňují výhodné aktivity jiných lymfokinů. Vynález popisuje nové receptory ligandů, které vykazují podobnost s látkami, jenž jsou podobné cytokinům, a příbuzné sloučeniny a metody jejich použití.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje nové receptory příbuzné receptorům cytokinů, jako jsou například molekulové struktury podobné receptorům cytokinů, označená podjednotky receptorů cytokinů DNAX (DDRS), a jejich biologické aktivity. Vynález zvláště popisuje jednu podjednotku označovanou
DCRS5. Vynález také zahrnuje nukleové kyseliny kódující samotné polypeptidy a metody jejich produkce a využití. Nukleové kyseliny podle vynálezu se charakterizují svou homologii se zde uvedenými klonovými komplementárními sekvencemi DNA (cDNA).
Navíc vynález popisuje spojení ligandu p40/IL-B30 s podjednotkami receptoru DCRS5 a IL—
12RP1, přičemž uvedené párování je indikací pro použití agonistů a antagonistů založených na činidlech řízených na tyto receptoiy.
Vynález popisuje v podstatě čisté nebo rekombinantní polypeptidy obsahující zbytky aminokyselin 1 až 606 ze sekvence SEQ ID NO: 2. V jistých provedeních vynálezu polypeptid obsahuje alespoň 25 sousedících aminokyselin vnitrobuněčné části sekvence SEQ ID NO: 2. Dále může být polypeptid rekombinantní obsahující vnitrobuněčnou část sekvence SEQ ID NO: 2. Dále může polypeptid obsahovat alespoň deset sousedících aminokyselin části, která není extrabuněčná a je popsána sekvencí SEQ ID NO: 2, nebo přirozenou sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo je v podstatě čistým přirozeným polypeptidem. Mezi jinými rekombinantní polypeptid může obsahovat přirozenou sekvenci uvedenou v tabulce č. 1 a je neglykosylovaným polypeptidem, pochází z člověka, obsahuje alespoň 40 sousedících aminokyselin ze sekvence SEQ ID NO: 2, vykazuje alespoň tři nepřekrývající se segmenty tvořené z 15-ti sousedících aminokyselin ze sekvence SEQ ID NO: 2, je přirozená polymorfní varianta sekvence SEQ ID NO: 2, má délku alespoň okolo 30-ti aminokyselin, vykazuje alespoň dva nepřesahující epitopy, které jsou specifické pro DCRS5 primáta, má molekulovou hmotnost alespoň 30 000 s přirozenou glykosylací, je syntetickým polypeptidem, existuje ve sterilní formě, je ve vodném nebo pufrovaném roztoku, je připojen na pevný substrát, je konjugovaný s jinou chemickou částí nebo je fyzikálně spojen s polypeptidem IL-12Rpi.
Jiná provedení vynálezu popisují v podstatě čistý nebo rekombinantní polypeptid obsahující alespoň dva odlišné nepřekrývající se segmenty alespoň šesti sousedících aminokyselin vnitrobuněčné části sekvence SEQ ID NO: 2, v podstatě čistý nebo rekombinantní polypeptid obsahující alespoň dvanáct sousedících aminokyselin vnitrobuněčné části sekvence SEQ ID NO: 2 nebo v podstatě čistou přirozenou sekvenci polypeptidu obsahující zralou sekvenci SEQ ID NO: 2.
Polypeptidy se mohou vyskytovat v určitých formách, polypeptid obsahuje alespoň dva rozdílné nepřekrývající se segmenty tvořené alespoň šesti sousedícími aminokyselinami vnitrobuněčné části sekvence SEQ ID NO: 2, kde rozdílné nepřekrývající se segmenty zahrnují jeden tvořený alespoň dvanácti aminokyselinami, zahrnují jeden tvořený alespoň sedmi aminokyselinami a druhý tvořený alespoň devíti aminokyselinami, zahrnuje třetí odlišný segment tvořený alespoň šesti aminokyselinami nebo obsahuje jeden segment vybraný z R355-L373, P378-L405, V407-2CZ 304022 B6
D426, K428-D439, P441-V452,I454-G460,1465-T587 nebo N592-606 nebo polyppeptid dále obsahuje alespoň dva rozdílné nepřekrývající se segmenty tvořené alespoň šesti sousedícími aminokyselinami extrabuněčné části sekvence SEQ ID NO: 2. V jiném případě polypeptid obsahující alespoň dvanáct sousedících aminokyselin intrabuněčné části sekvence SEQ ID NO: 2 bude ten, kde segment s dvanácti aminokyselinami obsahuje jeden zR355-L373, P378-L405, V407-D426, K428-D439, P441-V452, I454-G460, I465-T587 nebo N592-606, nebo polypeptid dále obsahuje alespoň dva odlišné nepřesahující segmenty tvořené alespoň šesti sousedícími aminokyselinami extrabuněčné části sekvence SEQ ID NO: 2. Nebo čistá, přirozená sekvence polypeptidu obsahující zralou sekvenci SEQ ID NO: 2 může dále obsahovat epitop vhodný pro čištění nebo detekci. Takové polypeptidy mohou obsahovat zralou sekvenci uvedenou v tabulce č. 1, může být neglykosylovaným polypeptidem, může pocházet z člověka, obsahuje alespoň 40 sousedících aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 2, vykazuje alespoň tři nepřesahující segmenty alespoň 15-ti sousedících aminokyselin ze sekvence SEQ ID NO: 2, je přirozenou polymorfní variantou sekvence SEQ ID NO: 2, má délku alespoň přibližně 30 aminokyselin, vykazuje alespoň dva nepřekrývající se epitopy, které jsou specifické pro DCRS5 primátů, mají molekulovou hmotnost alespoň 30 000 s přirozenou glykosylací, je syntetickým polypeptidem, je ve sterilní formě, vyskytuje se ve vodném nebo pufrovaném roztoku, je zachycen na pevném substrátu, je konjugován s jinou chemickou částí neboje fyzikálně spojen s polypeptidem IL-12Rj31.
Vynález popisuje různé jiné prostředky, které například obsahují v podstatě čistý polypeptid kombinovaný s proteinem IL-12Rpi, nebo takový polypeptid a nosič, kde nosič je vodná sloučenina zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je upraven pro orální, rektální, nasální, povrchovou nebo parenterální aplikaci.
Vynález popisuje sady obsahující popsaný polypeptid a kompartment s polypeptidem, kompartment obsahující polypeptid IL-12Rpi, kompartment obsahující p40, IL-B30 nebo polypeptid p40/IL-B30 nebo instrukce vhodné pro použití pro likvidaci činidel v sadě.
Popisují se protilátky a jiné vazebné sloučeniny, které například obsahují vazebné místo na antigen pocházející z protilátek, které specificky váže vnitrobuněčnou část DCRS5, kde vazebná sloučenina je v kontejneru, polypeptid pochází z člověka, vazebná sloučenina může být fragment Fv, Fab nebo Fab2, vazebná sloučenina se konjugovala s jinou chemickou částí. Protilátka je řízena proti peptidové sekvenci zralého polypeptidu uvedené v tabulce č. 1, protilátka je určena proti zralému DCRS5, čištěnému lidskému DCRS5, vybrala se imunologickou metodou, je polyklonální protilátkou, váže se na denaturovaný DCRS5, vykazuje hodnotu konstanty Kd vůči antigenu alespoň 30 μΜ, je zachycena na pevném substrátu, který zahrnuje kuličky nebo plastovou membránu, je ve formě sterilního prostředku nebo je detekovatelně značená, přičemž zahrnuje radioaktivní nebo fluorescenční značky. Také se popisuje sady obsahující vazebnou sloučeninu a kompartment obsahující vazebnou sloučeninu, kompartment obsahující polypeptid p40, polypeptid IL-B30, polypeptid DCRS5 a/nebo polypeptid p40, polypeptid IL-B30, polypeptid DCRS5 a/nebo polypeptid IL-12RP1, kompartment obsahující protilátku, která se selektivně váže na polypeptid p40, polypeptid IL-B30, polypeptid DCRS5 a/nebo polypeptid IL—12Κβ1 nebo instrukce pro použití nebo likvidaci činidel obsažených v sadě.
Vynález dále popisuje metody například produkci komplexu antigen: protilátka zahrnující kontakt polypeptidu primáta CDRS5 s protilátkou za vhodných podmínek, což umožňuje vytvoření komplexu. Taková metoda se může použít při izolaci komplexu od jiných cytokinových receptorů, komplex se izoluje od jiné protilátky, kontakt je se vzorkem, který obsahuje interferon, kontakt umožňuje kvantitativní detekci antigenu, kontakt je se vzorkem obsahujícím protilátku nebo kontakt umožňuje kvantitativní detekci protilátky. Vynález popisuje i jiné prostředky. Je to například prostředek obsahující sterilní vazebnou sloučeninu nebo vazebnou sloučeninu a nosič, kde nosičem je vodná sloučenina zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je upravena pro orální, rektální, nasální nebo povrchovou nebo parenterální aplikaci.
-3CZ 304022 B6
Vynález také popisuje izolovanou nebo rekombinantní nukleovou kyselinu kódující polypeptid DCRS5, kde DCRS5 pochází z člověka, nebo nukleovou kyselinu kódující sekvenci antigenního peptidů uvedenou v tabulce č. 1 nebo kóduje velké množství sekvencí antigenních peptidů uvedených v tabulce č. 1, vykazuje shodu alespoň 14-ti nukleotidů s přirozenou cDNA kódující segment, je expresívním vektorem, dále obsahuje počátek replikace, pochází z přirozeného zdroje, obsahuje detekovatelnou značku, obsahuje syntetickou nukleotidovou sekvenci, ale menší než 6 kb, přednostně je menší než 3 kb, pochází z primáta, obsahuje přirozenou kódující sekvenci plné délky, je hybridizační sondou pro gen kódující DCRS5 nebo je primer PCR, produkt PCR nebo primer pro mutagenezi. Popisují se buňky obsahující rekombinantní nukleovou kyselinu zahrnující prokaryontní buňku, eukaryotní buňku, bakteriální buňku, kvasinkovou buňku, hmyzí buňku, myší buňku, buňku primáta nebo lidskou buňku.
Vynález dále popisuje sadu, která obsahuje nukleovou kyselinu a kompartment obsahující nukleovou kyselinu,kompartment obsahující nukleovou kyselinu kódující polypeptid p40, polypeptid IL-B30, polypeptid DCRS5 a/nebo polypeptid IL-12β1, kompartment obsahující protilátku, která se selektivně váže na polypeptid p40, polypeptid IL-B30, polypeptid DCRS5 a/nebo polypeptid IL-12Rpid nebo instrukce pro použití nebo likvidaci činidel v sadě.
Vynález dále popisuje nukleovou kyselinu, která hybridizuje za podmínek promývání po dobu 30 minut při teplotě 30 °C a v méně než 2mM soli s části sekvence SEQ ID NO: 1 kódující vnitrobuněčnou část nebo vykazující shodu pruhu alespoň 30-ti nukleotidů s vnitrobuněčnou částí DCRS5 primáta. Taková nukleová kyselina je s výhodou ta, kde promývací podmínky hybridizace jsou teplota 45 °C a/nebo 500mM sůl nebo teplota 55 °C a/nebo 150mM sůl nebo pruh je tvořen alespoň 55 nebo 75 nukleotidy.
Terapeutické použití zahrnuje způsoby modulace fyziologie nebo výroby buňky zahrnující kontakt buňky s antagonistou p40/IL-B30, který je komplex obsahující extrabuněčnou část DCRS5 primáta a/nebo extrabuněčnou část IL—12Κβ1 primáta, antagonistou p40/IL-B30, kterýje protilátkou vázající se na komplex obsahující DCRS5 primáta a/nebo IL-12RP1, antagonistou p40/IL-B30, který je protilátkou vůči IL—12Κβ 1, antagonistou p40/IL-B30, který je antisense nukleová kyselina vůči DCRS5 nebo IL-12Rpi nebo agonistou p40/IL-B30, kteiý je protilátkou vázající se na komplex obsahující DCRS5 primáta a/nebo IL-12Rpi primáta. Při jednom typu metod ke kontaktu dochází s antagonistou a kontakt probíhá v kombinaci s antagonistou vůči IL-12, IL—18, TNF a/nebo IFNy nebo buňka pochází z hostitele, který vykazuje znaky nebo symptomy chronického onemocnění zprostředkované TH1, vykazuje symptomy nebo znaky roztroušené sklerózy, revmatické artritidy, osteoartritidy, zánětlivého onemocnění střev, cukrovky, lupénky nebo sepse, nebo hostitel obdržel alogenní transplantáty. Naopak způsob může zahrnovat kontakt s agonistou a pak ke kontaktu dochází v kombinaci s IL-12, IL-18, TNF nebo IFNy nebo buňka pochází z hostitele, který vykazuje znaky nebo symptomy chronické odezvy Th2, trpí růstem nádoru, virovým nebo plísňovým onemocněním, aplikovala se mu vakcína nebo trpí alergickou odpovědí.
Osnova
I. Obecně
II. Aktivity
III. Nukleové kyseliny
A. kódující fragmenty sekvence, sondy
B. mutace, chiméry, fuze
C. příprava nukleových kyselin
D. vektory, buňky obsahující vektory
IV. Proteiny, peptidy
A. fragmenty, sekvence, imunogeny, antigeny
-4CZ 304022 B6
B. muteiny C. agonisty/antagonisty, funkční ekvivalenty D. příprava proteinů V. Příprava nukleových kyselin, proteinů A. syntetické B. rekombinantní C. přirozené zdroje VI. Protilátky A. polyklonální B. monoklonální C. fragmenty, Kd D. anti-idiotypické protilátky E. buněčné linie hybridomů VII. Sady, diagnostika a kvantifikace A. ELISA B. test mRNA kódující C. kvalita/kvantita D. sady VIII. Terapeutické prostředky, metody A. kombinační prostředky B. jednotková dávka C. aplikace IX. Testování
I. Obecně
Vynález popisuje aminokyselinovou sekvenci a sekvenci DNA savce, v tomto případě primáta, podjednotky molekul podobných receptoru cytokinů, kdy tato podjednotka označená jednotka 5 receptoru cytokinů DNAC (DCRS5) má určitým způsobem definované vlastnosti a to jak strukturální tak biologické. Různé cDNA kódující tyto molekuly se získaly z primáta, například z knihovny sekvencí lidské cDNA. Požadují se také části z jiných primátů nebo savců.
Navíc vynález popisuje párování ligandu p40/IL-B30 s podjednotkami receptoru DCRS5 a IL-12Rpi, jejichž párování poskytuje proniknutí do indikací použití agonistů a antagonistů založených na činidlech.
Některé ze standardních metod se popisují v publikaci Maniatis, et al., (1982) Molecular Clonign, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.) vols. 13, CSH Press NY, Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY nebo Ausubel, et al., (1987 a periodické doplňky) Current Protocols in Molecular Biology, Green/Wiley, New York).
Nukleotidová (SEQ ID NO: 1) a odpovídající aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 2) primáta, jako je například člověk, kódující segment DCRS5 je zobrazena v tabulce č. 1. Předpokládaná signální sekvence je určena, ale může záviset na typu buněk nebo může obsahovat v obou směrech několik zbytků navíc. Potenciální N- glykosylační zbytky jsou asparagin 6, 24, 58, 118, 157, 209 a 250. Je pravděpodobné, že disulfidové můstky se nacházejí mezi cysteinovými zbytky v polohách 29 a 78 a konzervovaný motiv C-CXW se nachází v polohách 110/121/123. V poloze 219 je patrný tiyptofan a motiv WxxWS je patrný od polohy 281 do 285. Segment v polohách 1 až 101 je v doméně Ig, v polohách 102 do 195 je doména 1 vázající cytokin, v polohách 196 až 297 je doméně 2 vázající cytokin, oblast 298 až 330 je linker, oblast 329 až 354 je transmembránový segment a oblast 356 až 606 je vnitrobuněčná oblast. Vnitrobuněčné rysy zahrnují vazebná místa purativní SH2 v polohách Y374-I377, Y461-Q464 aY588-Q591 a potencionálně důležité tyrosinové zbytky v poloze 406, 427, 440 a 453. Tato místa a hranice jsou patrné.
-5CZ 304022 B6
ORF obsahuje purativní signální sekvenci. Předpokládá se, že tato sekvence bude štěpena v místě CHG/GIT, jak se uvádí shora v textu. Předpovězenou extrabuněčnou oblast obsahující 328 aminokyselin následuje putativní transmembránový segment a nakonec cytoplazmatická oblast obsahující přibližně 252 aminokyselin. Funkce vázat ligand přináleží zbytku vextrabuněčné oblasti.
Reverzní translace sekvence nukleové kyseliny je uvedena v tabulce č. 2.
Tabulka ě. 1: Nukleotidové a polypeptidové sekvence forem podobných podjednotce receptorů cytokinu DNAX (DCRS5). Forma primáta například člověk (SEQ ID NO: 1 a 2). Předpokládaná signální sekvence je určená, ale může se měnit v několika polohách a závisí na typu buněk. Určité polohy variace jsou v nukleotidech 127 a 563, ve kterých se párují G aG (předkládají se na kombinace Q a G) nebo T a A (předkládají se na H a R).
gtggtacggg aattccattg tgttgggcag ccaacaaggg tggcagcctg gctctgaagr 60 ggaattatgt gcttcaaaca ggttgaaaga gggaaacagt cttttcctgc ttccagac 11Θ
atg Het aat cak gtc act att caa tgg gat Gin Trp Asp -15 gca Ala gta ata Val Ile gcc ctt tac ata 166
Asn Xaa Val Thr Ile -20 Ala Leu -10 Tyr Ile
ctc ttc agc tgg tgt cat gga gga att aca aat ata aac tgc tet ggc 214
Leu Phe Ser Trp Cys His Gly Gly Ile Thr Asn Ile Asn Cys Ser Gly
-5 -1 1 5
cac atc tgg gta gaa cca gcc aca att ttt aag atg ggt atg aat atc 262
His ile Trp Val Glu Pro Ala Thr Ile Phe Lys Met Gly Met Asn Ile
10 15 20 25
tet ata tat tgc caa gca gca att aag aac tgc caa cca agg aaa ctt 310
Ser ile Tyr Cys Gin Ala Ala Ile Lys Asn Cys Gin Pro Arg Lys Leu
30 35 40
cat ttt tat aaa aat ggc atc aaa gaa aga ttt caa atc aca agg att 358
His Phe Tyr Lys Asn Gly Ile Lys Glu Arg Phe Gin Ile Thr Arg Ile
45 50 55
aat aaa aca aca gct cgg ctt tgg tat aaa aac ttt ctg gaa cca cat 406
Asn Lys Thr Thr Ala Arg Leu Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His
60 65 70
gct tet atg tac tgc act gct gaa tgt ccc aaa cat ttt caa gag aca 454
Ala Ser Met Tyr Cys Thr Ala Glu Cys Pro Lys His Phe Gin Glu Thr
75 80 85
ctg ata tgt gga aaa gac att tet tet gga tat ccg cca gat att cct 502
Leu Ile Cys Gly Lys Asp Ile Ser Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro
90 95 100 105
gat gaa gta acc tgt gtc att tat. gaa tat tca ggc aac atg act tgc 550
Asp Glu Val Thr Cys Val Ile Tyr Glu Tyr Ser Gly Asn Met Thr Cys
110 115 120
acc tgg aat gct rgg aag ctc acc tac ata gac aca aaa tac gtg gta 598
Thr Trp Asn Ala Xaa Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr val Val
125 130 135
-6CZ 304022 B6
cat gtg aag agt tta gag aca gaa gaa gag caa cag tat ctc acc tea
His Val Lys 140 Ser Leu Glu Thr Glu 145 Glu Glu Gin Gin Tyr 150 Leu Thr Ser
age tat att aac atc tcc act gat tea tta caa ggt ggc aag aag tac
Ser Tyr 155 Ile Asn Ile Ser Thr 160 Asp Ser Leu Gin Gly Gly 165 Lys Lys Tyr
ttg gtt tgg gtc caa gca gca aac gca cta ggc atg gaa gag tea aaa
Leu 170 Val Trp Val Gin Ala 175 Ala Asn Ala Leu Gly 180 Met Glu Glu Ser Lys 1B5
caa ctg caa att cac ctg gat gat ata gtg ata cct tet gca gcc gtc
Gin Leu Gin Ile His 190 Leu Asp Asp Ile Val 195 Ile Pro Ser Ala Ala 200 Val
att tcc agg gct gag act ata aat gct aca gtg ccc aag acc ata att
Ile Ser Axg Ala 205 Glu Thr Ile Asn Ala 2 ) Thr Val Pro Lys Thr 215 Ile Ile
tat tgg gat agt caa aca aca att gaa aag gtt tcc tgt gaa atg aga
Tyr Trp Asp 220 Ser Gin Thr Thr Ue 225 Glu Lys Val Ser Cys 230 Glu Met Arg
tac aag gct aca aca aac caa act tgg aat gtt aaa gaa ttt gac acc
Tyr Lys 235 Ala Thr Thr Asn Gin 240 Thr Trp Asn Val Lys 245 Glu Phe Asp Thr
aat ttt aca tat gtg caa cag tea gaa ttc tac ttg gag cca aac att
Asn. 250 Phe Thr Tyr Val Gin 255 Gin Ser Glu Phe Tyr 260 Leu Glu Pro Asn Ile 265
aag tac gta ttt caa gtg aga tgt caa gaa aca ggc aaa agg tsC tgg
Lys Tyr Val Phe Gin 270 Val Arg Cys Gin Glu 275 Thr Gly Lys Arg Tyr 280 Trp
cag cct tgg agt tea ccg ttt ttt cat aaa aca cct gaa aca gtt ccc
Gin Pro Trp Ser 285 Ser Pro Phe Phe His 290 Lys Thr Pro Glu Thr 295 Val Pro
cag gtc aca tea aaa gca ttc caa cat gac aca tgg aat tet ggg cta
Gin Val Thr 300 Ser Lys Ala Phe Gin 305 Eis Asp Thr Trp Asn 310 Ser Gly Leu
aca gtt gct tcc atc tet aca ggg cac ctt act tet gac aac aga gga
Thr Val 315 Ala Ser Ile Ser Thr 320 Gly His Leu Thr Ser 325 Asp Asn Arg Gly
gac att gga ctt tta ttg gga atg atc gtc ttt gct gtt atg ttg tea
Asp 330 Ile Gly Leu Leu Leu 335 Gly Met Ile Val Phe 340 Ala Val Met Leu Ser 345
att ctt tet ttg att ggg ata ttt aa ga tea ttc ega act ggg att
Ile Leu Ser Leu Ile 350 Gly Ile Phe As». Arg 355 Ser Phe Arg Thr Gly 360 Ile
aaa aga agg atc tta ttg tta ata cca aag tgg ctt tat gaa gat att
Lys Arg Arg Ile 365 Leu Leu Leu Ile Pro 370 Lys Trp Leu Tyr Glu 375 Asp Ile
646
694
742
790
338
886
934
982
1030
1078
1126
1174
1222
1270
1318
-7CZ 304022 B6
cct aat atg aaa aac age aat gtt gtg aaa atg eta cag gaa aat agt 1366
Pro Asn Met 380 Lys Asn Ser Asn Val 385 Val Lys Met Leu Gin 390 Glu Asn Ser
gaa ctt atg aat aat aat tcc agt gag cag gtc eta tat gtt gat ccc 1414
Glu Leu Met Asn Asn Asn Ser Ser Glu Gin Val Leu Tyr Val Asp Pro
395 400 405
atg att aca gag ata aaa gaa atc ttc atc cca gaa cac aag cct aca 1462
Met Ile Thr Glu Ile Lys Glu Ile Phe Ile Pro Glu His Lys Pro Thr
410 415 420 425
gac tac aag aag gag aat aca gga ccc ctg gag aca aga gac tac ccg 1510
Asp Tyr Lys Lys Glu Asn Thr Gly Pro Leu Glu Thr Arg Asp Tyr Pro
430 435 440
caa aac tcg eta ttc gac aat act aca gtt gta tat att cct gat ctc 1558
Gin Asn Ser Leu Phe Asp Asn Thr Thr Val Val Tyr Ile Pro Asp Leu
445 450 455
aac act gga tat aaa ccc caa att tea aat ttt ctg cct gag gga age 1606
Asn Thr Gly Tyr Lys Pro Gin Ile Ser Asn Phe Leu Pro Glu Gly Ser
460 465 470
cat ctc age aat aat aat gaa att act tcc tta aca ctt aaa cca cca 1654
His Leu Ser Asn Asn Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Leu Lys Pro Pro
475 480 485
gtt gat tcc tta gac tea gga aat aat ccc agg tta caa aag cat cct 1702
Val Asp Ser Leu Asp Ser Gly Asn Asn Pro Arg Leu Gin Lys His Pro
490 495 500 505
aat ttt get ttt tet gtt tea agt gtg aat tea eta age aac aca ata 1750
Asn Phe Ala Phe Ser Val Ser Ser Val Asn Ser Leu Ser Asn Thr Ile
510 515 520
ttt ctt gga gaa tta age ctc ata tta aat caa gga gaa tgc agt tet 1798
Phe Leu Gly Glu Leu Ser Leu Ile Leu Asn Gin Gly Glu cys Ser Ser
525 530 535
cct gac ata caa aac tea gta gag gag gaa acc acc atg ctt ttg gaa 1846
Pro Asp Ile' Gin Asn Ser Val Glu Glu Glu Thr Thr Met Leu Leu Glu
540 545 550
aat gat tea ccc agt gaa act att cca gaa cag acc ctg ctt cct gat 1894
Asn Asp Ser Pro Ser Glu Thr Ile Pro Glu Gin Thr Leu Leu Pro Asp
555 560 565
gaa ttt gtc tcc tgt ttg ggg atc gtg aat gag gag ttg cca tet att 1942
Glu Phe Val Ser Cys Leu Gly Ile Val Asn Glu Glu Leu Pro Ser Ile
370 575 580 585
aat act tat ttt cca caa aat att ttg gaa age cac ttc aat agg att 1990
Asn Thr Tyr Phe Pro Gin Asn Ile í<eu Glu Ser His Phe Asn Arg Ile
590 595 600
-8CZ 304022 B6 tca ctc ttg gaa aag tagagctgtg tggtcaaaat caatatgaga aagctgcctt Ser Leu Leu Glu Lys
605
gcaatctgaa cttgggtttt ccctgcaata gaaattgaat tctgcctctt tttgaaaaaa 2105
atgtattcac atacaaatct tcacatggac acatgttttc atttcccttg gataaatacc 2165
taggtagggg attgctgggc catatgataa gcatatgttt cagttctacc aatcttgttt 2225
ccagagtagt gacatttctg tgctcctacc atcaccatgt aagaattccc gggagctcca 2285
tgccttttta attttagcca ttcttctgcc tmatttctta aaattagaga attaaggtcc 2345
cgaaggtgga acatgcttca tggtcacaca tacaggcaca aaaacagcat tatgtggacg 2405
cctcatgtat tttttataga gtcaactatt tcctctttat tttccctcat tgaaagatgc 2465
aaaacagctc tctattgtgt acagaaaggg taaataatgc aaaatacctg gtagtaaaat 2525
aaatgctgaa aattttcctt taaaatagaa tcattaggcc aggcgtggtg gctcatgctt 2585
gtaatcccag cactttggta ggctgaggtr ggtggatcac ctgaggtcag gagttcgagt 2645
ccagcetggc caatatgctg aaaccctgtc tctactaaaa ttacaaaaat tagccggcca 2705
tggtggcagg tgcttgtaat cccagctact tgggaggctg aggcaggaga atcacttgaa 2765
ccaggaaggc agaggttgca ctgagctgag attgtgccac tgcactccag cctgggcaac 2825
aagagcaaaa ctctgtctgg aaaaaaaaaa aaaa 2859
MU (O/H) VTIOWDAVIALYILFSWCEGGITOINCSGHIWVEPATrFKMGMNISIYCQAAIKNCQPRKLHP YKNGIKERFQITRINKTTARLWYKNFLEPHASMYCTAECPKHFQETLICGKDISSGYPPDIPDEVTCVIY EYSGNMTCTWNA (G/R) KLTY1DTKYWHVK3LETEEEQQYLTSSYINXSTDSLQGGKKYLVWVQAANAL GMEESKQLQIHLDDIVIPSAAVTSRAETINATVPKTIIYWDSQTTIEKVSCEMRYKATTNQTWNVKEFDT NFTYVQQSEFYLEPNIKYVFQVRCQETGKRYWQPWSSPFFHKTPETVPQVTSKAFQHDTWNSGLTVASIS TGHLTSDNRQDrQLLLGMIVFAVMLSILSLIGIFNRSFRTGIKRRILLLIPKWLYEPrPNMKNSMWKML QENSELMNMNSSEQVLYVDPMITEIKEIFIPEHKPTDYKKENTGPLETRDYPQNSLFDNTTWYIPDLNT GYKPQISNFLPEGSHLSNNNEITSLTLKPPVDSLDSGNNPRLCKEPNFAFSVSSVNSLSNTIFLGELSLI LNQGECSSPDXQNSVEEETTMLLENDSPSETIPSQTLLPDEFVSCLGrVNEELPSINTYFPQNILESHFN RISLLEK
-9CZ 304022 B6
Tabulka č. 2: Reverzní translace DCRS5 primáta, například člověka (SEQ ID NO: 3)
ATGAAYCAYGTKACNATHCARTGGGAYGCNGTNATHGClTYTNTAYATHYTNTTYWSNTGGTGYCAyGGIíGGlIAT
HACNAAYATHAAYTGYMSNGGNCAYATHTGGGTNGARCCSGaiACNATHTTYAARATGGOiATGAAYATHWSMA
THTAYTGYCARGCNGCNATHAARAAYTGYCARCCNMGNAARYTNCAYTTYTAYAARAAYGGNATHAARGAEMGN
TTYCARATHACNMGNATHAAYAARACNACNGCNMGNYTirrGGTAYAAHAAYTTYYTNGAB.CCNCAYGCNWSlIAT
GTAYTGYACHGatGARTGyCCNAARCAYTTYCARGAHACNYTNACTTGYGGIlAARGAYATHWSIWSÍíGGIinAYC
CNCCNGAYATHCCNGAYGARGTMAQJTGYGTNATHTAYGARTAYWSNGGNAAYATGACNTGYACNTGGAAYGCN
MGNAARYTNACNTAYATHGAYACNAARTAYGTNGTNCAYGTNAARWSNYTNGARACNGAKGARGARCARCARTA
YYINACNWSínfSíraAYATHAAZATHWSIlACitGAYWSSYTNCARGaNGGQIAAKAARTAYYTOGTNTGGCTSrCARG
CNGCNAAYGCNYTNGGNATGGAH.GARWSNAAB.CARYTNCASATHCAYYTNGAYGAYATHGTNATSCCNWSNGCN
GCNGTNATHWSNMGNGCNGARACNATHAAYGCNACNGTNCCNAARACNATHATHTAYTGGGAYWSSCARACNAC
NATHGARAARGTNWSNTGYGARATGMGNTAYAARGCIÍACNACÍÍAAYCARACNTGGAAYGTNAARGAHTTYGAYA
CNAAYTTYACIJTAYGTNCARCARHSNGARTTYTAYYTNGARCCNAAYATHAARTAYGTNTTYCARGTNMGNTGY
CARGARACNGGNAARMGNTAYTGGCAa.CCNTGGWSNWSNCCNTTYTTYCAYAARACNCC2IGAÍlAQIGTNCCiICA
RGTNACMWSNAARGCNTTYCAACAYGAYACNTGGAAYWSWGGNYTWACNGTííGCNWSNATHWSNAaíGGlICAYY
TNACNWSNGAYAAYMGNGGNGAYATHGGNYTNYTNYTNGGNATGATHGTNTGYGCNGTNATGYTNWSNATEYTN
WSNYTNATHGGMATBTTYAAYMGNWSNTTYMGNACNGGNATIIAARMGNMGNATHYYNYINYTNAYHCCNAAB.TG
GYTNTAYGARGAYATHCCNAAYATGAARAAYWSNAAYGTNGTNTlARATGYTNCARGARAAYWSNGASYTNATGA
AYAAYAAYWSNWSNGARCARGTNYlSlAYGTlIGAYCCKATGATHAClTGARATHAAJRGARAIHTTYATHCaiGAR
CAYAARCCaiACHGAYTAYAARAARGASAAYACBGGNCCHYTNGARAClIMGNGAYTAYCCaiCASAAYWSNYEHTT
YGAYAAYACNACNGTNGTNTAYATHCCNGAYYTNAAYACNGGNTAYAARCCÍICARATHWSNAAYTTYYTNCCaíG
ARGGNWSNCAYYTNWSMAAXAAYAAYGARATHACNWSimNACNYTNAARCClíCCNGTIIGAYWSKYTOGAYWSN
GGtlAAYAAYCCaiMGNYTtlCARAAaCAYCCNAAYTTYGCirrTYWSNGTNWSSWSNGTNAAYWSSYTaniSMAAYAC
NATHTTYYTNGGNGARYTNWSNYTNATHYTiTAAYCARGGNGARTGYWSNWSNCCNGAYATHCARAAYWSNGTNG
ABGARGARACHACSATGYOTřTHGARAAYGAYWSNCCSWSNGABACNATHCCNGARCAKACSYnilYTOCCHGAY
GARTTYGTNWSNTGYYTNGGKATHGTNAAYGARGARYTNCCNWSNATHAAYACNTAYTTYCCNCABAAYATHYT
NGARWSNCAYTTYAAYMGNAIHWSNYTNYTOGARAAR
- 10CZ 304022 B6
Tabulka č. 3: Uspořádání podjednotek různých cytokinových receptorů, protein gpl30 receptoru lidského IL-6 je SEQ ID NO: 4 (GenBank M57230), podjednotka beta receptoru lidského 11-12 je SEQ ID NO: 5 (GenBank U64198)
huIL-12R 2 1
hugpl30 1
huDCRSS 1
huIL-12R 2 49
huapl30 46
huDCRSS 50
huIL-12R 2 96
hugpl30 96
huDCRSS 94
huIL-12R 2 143
hugpX30 144
huDCRS5 144
huII»-12R 2 193
hugpl30 191
huDCRSS 190
huIL-12R 2 243
hugpl30 241
huDCRSS 239
hulli-12R 2 286
hugpl3 0 291
huDCRSS 286
hulli-12R 2 336
hugpl30 341
huDCRSS 321
huIL-12R 2 385
hugpl30 388
huDCRSS 358
huIL-12R 2 435
hugpl30 437
huDCRSS 388
MAHTFRGCSIiAFMFIITWLLIKAKZDACKRGDVTVKPSHVILIiGSTVN 48 MLTLQTWWQALFIFLTTESTGHLLDPCG---YISPESPWQLHSNFT 45
MNHVTIQWDAVIALYILFSWCHGGITJÍIECS -GHIWVEPATIFKMGMNIS 4 9 * *
ITCSLKPRQGCFHYSRRNKLILYKFDRRINFHHGHSLNSQVTGLPLG- - - 95
AVCVLKEKCMD YFHVNANYIVWKTNEFTIPKEQYTIINRTAS S VTFTD XA 95 IYCQAAIKN- -CQP- --RKLEFYKNGZKHR-FQITRINKTTARLWYKNFL 93 ★ . · * · ·
- -TTLFVCKLACINSD-EIQICGASIFVGVAPEQPQNLSCIQKGEQGTVA 142 SLNIQLTCNILTFGQL-EQNVYGZTIZSGLPPEKPKNLSCIVN-EGKKMR 143 EPHASMYCTAECPKHFQETLICGKDZSSGYPPDIPDEVTCVIYEYSGNMT 143 * « *.****.*·.*. .
CTWERGRDTHLYTEYTLQLSG5XNLTWQKQCKDIYCDYLDFGINLTPESP 192 CEWDGGRETHLETNFTLKS - -EWATEKFADCKAKRDTPTSCTVDYS-TVY 190 CTWNARKLTYIDTKYWEVKSLETEEEQQYLTSSYXNISTDSLQGG- - - - 189 **·*·*.«.
ESNFTAKVTAVNSLGSSSSLPSTFTFLDIVRPLPPWDIRIKFQKASVSR.C 242 FVNIEVWVEAENALGKVTSDHIN7DPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSIL 240
-KKYLVWVQAANALGMEESKQLQIHLDDIVIPSAAVISRAETINATVPKT 23 8 ***'*# * * *
TLYWRD----EGLVLLNRLRYRPSNSSLWNMVN---VTKAKGRHDLLDLK 285
KLTWINPSIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLK 290 IIYWDS - - QTTIEKVS CEMRYKATTNQTWNVKEFD - TNFTYVQQSEFYLE 2 85 * . . . *. * . *
PFTEYEFQISSKLHLYKGSWSDWSESLRAQTPEEEPTGMLDVWYMKRHID 335 PPTEYVFRIRCMKEDGKGYWSDWSEEASGITYEDRPSKAPSFWYKIDPSH 34 0
PNIKYVFQVRCQ-ETGKRYWQPWSSPFFHKTPETVP--------------320 * **·.· * * ** * * ★
YS-RQQISLFWKNLSVSEARGKILHYQVTLQELTGGKAMTQNITGHTSWT 3 84
TQGYRTVQLVWKTLPPFEANGK: DYEVT---LTRWKSHLQNYTVNATKL 337
-----QVTSKAFQHDTWNSGLTY JISTG------HLTSDN--RGDIGLL 357
TVIPRTGNWAVAVSAANSKGSSLPTRINIMNLCEAGLLAPRQVS ANSEGM 434 TVNLTNDRYLATLTVRNLVGKSDAAVLTIP -ACDFQATHPVMDLKAFPKD 43 6 LGMIVFAVMLSILSLIGIFNRSFRTGIKRR--------------------387
DNILVTWQPPRKDPS AVQEYWEWRELHPG - GDTQVPLNWLRSRP YNVSA 483
NMLWVEWTTPRE - - -SVKKYILEWCVLS DKAPCITDWQQEDGTVHRT 480
----------------ILLLIPKWLYEDIPNMKNSNWKMLQEN----SE 417
- 11 CZ 304022 B6 huIL-12R 2 484 LISENIKSYICYElRVYALSGDQ-GGCSSIIiGNSKHKAPLSGPHINAITE 532 hugpl30 481 YLRGNLAESKCYLITVTPVYADGPGSPESIKAYLKQAPPSKGPTVRTKKV 530 huDCRSS 418 LMNNKSSB--------QVLYVDP-----MITEIKEIFIPEHKPTDYKKE- 453 ★ * * ★ ★ huIIi“12R 2 533 EKGSILISWNSIPVQEQMGCLLEYRIYWKERDSNSQPQLCEIPYRVSQNS 582 hugpl30 531 GKNBAVLEMDQLPVDVQKGPIRNYTIFYRTIIGN----ETAVNVDSSHTE i.76 huDCRSS 454 --NTGPLETRDYP---QNSLPDNTTWYIPDLNTG------YKPQXSN— 490 huIL-12R 2 583 HPINSLQPRVTYVLWMTALTAAGESSHGNEREFCLQGKAN-WMAFVAPSI 631 hugpl30 577 YTLSSLTSDTLYMVRMAAYTDEG-GKDGPEFTFTTPKFAQGEIEAIWPV 62S huDCRSS 491------------------FLPEG---------------------------495 huIL-12R 2 632 hugpl30 626 huDCRSS 496
CIAIIMVGIFSTHYFQQKVFVLLAALRP-----------QWCSREIPDPA 670
CLAFLLTTLLGVLFCFNKRDLIKKHIWPNVPDPSKSHIAQWSPHTPPRHN 675 ..........-SHLSNNN-EITSLTLKP--------------PVDSLDSG 519 e ★ huIL-12R 2 hugpl30 huDCRSS
671 NSTCAKXYPIAEEXTQLPLDRLLID-WPTPEDPEPLVIS—EVLHQVTPV 717 676 FNSKDQMYSDGNFTDVSWEIEANDKKPFPEDLKSLDLFKKEKINTEGHS 725 520 NNPRLQKHPN-FAFSVSSVNSLSNT-------------1---FLGELSLI 552 hUlL-12R 2 718 FRHPPCSNWPQREKGIQGHQASEKDMMHSASSPPPPRALQAESRQLVDLY 767 hugpl30 726 SGIGGSSCMSSSRPSISSSDENESSQNTSSTVQYSTWHSGYRHQVPŠVQ 775 huDCRSS 553 LNQGBCS---S—PDIQNSVBEETTMLLENDSP-----------------580 .* * * huIL-12R 2 768 KVLESRGSDPKPENPACPWTVLPAGDLPTEDGYLPSN- - -IDDLPSHEAP 814 hugpl30 776 VFSRSESTQPLLDSEERPEDLQLVDHVDGGDGILPRQQYFKQNCSQEESS 825 huDCRSS 581 --SETIPEQTLLPDEFVSCLGIVNEELPSINTYFPQN---ILESHFNR-- 623 huIL-12R 2 hugpl30 huDCRS5 huIL-12R 2 hugpl30 huDCRS5
815 LADSLEELEPQHXSLS-----VFPSSSLHPLTFSCG-----------------
826 PDISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQSCGSGQMKMFQEVSAAD 875 624 --ISLLEK 629 * *
846 ..........DKLTLDQLKMRCDSLML 862
876 AFGPGTEGQVERFETVGMEAATDEGMPESYLPQTVRQGGYMPQ 918
Nejbližší příbuzní extrabuněčné oblasti „IL-30R“ jsou signální transduktor IL-6 gpl30 a IL12R32. Méně blízcí příbuzní jsou receptor GCSF, receptor leptinu, receptor faktoru inhibující leukémii a receptor CNTF. Tak „IL-30R“ je člen třídy I větve superrodiny receptoru cytokinů a je úzce příbuzný rodině IL-6R/IL-12R.
Tabulka 3 zobrazuje porovnání dostupných sekvencí podjednotek receptoru primátu s DCRS5(IL-30R) primáta, například člověka. CDRS5 vykazuje podobnost s podjednotkou gpl30 receptoru IL-6 (například podjednotka IL-6R) a s podjednotkou 1L-12RP2. CDRS5 vykazuje struktuio rální rysy podjednotky beta, ale skutečná sekvence proteinových interakcí a signalizace zůstává nevyřešena.
Termín DCRS5 se může použít k popisu proteinu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v tabulce č. 1. V mnoha případech jeho podstatný fragment bude funkční a strukturní ekvivalent zahrnující další extracelulámí segmenty. Vynález dále popisuje variace proteinu alely
- 12CZ 304022 B6
DCRS5, jejíž sekvence se popisuje shora v textu, například muteiny nebo jiná konstrukce. V typickém případě takové variace budou vykazovat méně než přibližně 10% rozdíl sekvence ve srovnání s cílovou oblastí, takže budou často mít jednu až jedenáct substitucí, například 2, 3, 5, 7 substitucí. Zdůrazňují se také alelové a jiné varianty, například přirozený polymorfizmus, popsaného proteinu. V typickém případě se budou vázat s vysokou afinitou na odpovídající biologický ligand, možná v dimenzovaném stádiu s podjednotkou receptoru alfa, například alespoň s přibližnou koncentrací lOOmM, obvykle lépe než přibližně 30nM, s výhodou lépe než přibližně lOnM ještě výhodněji lépe než přibližně 3nM. Termín také zahrnuje příbuzné přirozeně se vyskytující formy, například alely polymorfní varianty a metabolické varianty proteinu savce. Výhodné formy receptorových komplexů se budou vázat na vhodný ligand s afinitou a selektivitou vhodnou pro interakci ligand-receptor.
Tento vynález dále zdůrazňuje kombinace proteinů nebo peptidů, které vykazují podstatnou identitu aminokyselinové sekvence uvedené v tabulce č. 1. Budou zahrnovat varianty sekvence s relativně malým množstvím substitucí, například s výhodou méně než přibližně 3 až 5.
Podstatný polypeptidový „fragment4 nebo „segment“ je pruh aminokyselinových zbytků obsahujících alespoň přibližně 8 aminokyselin, v obecném případě alespoň 10 aminokyselin, více obecně alespoň 12 aminokyselin, často alespoň 14 aminokyselin, častěji alespoň 16 aminokyselin, v typickém případě alespoň 18 aminokyselin, více typické je, když obsahují alespoň 20 aminokyselin, obvykle alespoň 22 aminokyselin, obvykleji alespoň 24 aminokyselin, výhodné je alespoň 26 aminokyselin, výhodnější je alespoň 28 aminokyselin a ve zvláště výhodném provedení vynálezu alespoň přibližně 30 nebo více aminokyselin. Sekvence segmentů různých proteinů se mohou porovnávat jeden s druhým ve vhodné délce pruh. V mnoha situacích fragmenty mohou vykazovat funkční vlastnosti nedotčených podjednotek, například extrabuněčná oblast transmembránového receptoru si může ponechat schopnost vázat se na ligand a může se použít v případě rozpustného komplexu podobného receptoru.
Homologie aminokyselinové sekvence nebo shora sekvence se stanoví optimalizací párování zbytků. Při určitém porovnání je možné začlenit mezery, je-li to nutné (popisuje se například v publikaci Needleham, et al., (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, Sankoff et al., (1983) kapitola jedna v Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and practice of sequence comparison, Addison-Wesley, Reading, Ma, použil se software IntelliGenetics, Mountain View, CA a the University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Masison, WI). To se mění, když se jako párování uvažují konzervativní substituce. Konzervativní substituce v typickém případě zahrnují substituce v následujících skupinách: glycin, alanin, valin, izoleucin, leucin, kyselina asparagová, kyselina glutamová, asparagin, glutamin, serin, threonin, lyzin, arginin a fenylalanin, tyrosin. Předpokládá se, že homologní aminokyselinové sekvence zahrnují v sekvenci cytokinu přirozené alelové a vnitrodruhové variace. Typické homologní proteiny nebo peptidy vykazují 50 až 100% homologie (v případě, že se zavedou mezery), 60 až 100% homologie (v případě, že budou zahrnovat konzervativní substituce), když se srovnávají se segmentem aminokyselinové sekvence uvedeného v tabulce č. 1. Míra homologie je alespoň přibližně 70 %, v obecném případě alespoň 76 %, dále alespoň 81 %, často alespoň 85 %, častěji alespoň 88 %, v typickém případě alespoň 90 %, dále alespoň 92 %, obvykle alespoň 94 %, obvykleji alespoň 95 %, s výhodou alespoň 96 % a výhodněji alespoň 97 % a ve zvláště výhodných provedeních alespoň 98 % a více. Stupeň homologie bude kolísat s délkou porovnávaných segmentů. Homologní proteiny nebo peptidy, jako jsou alelové varianty, budou sdílet většinu biologických aktivit s provedením popsaným v tabulce č. 1, zvláště ve vnitrobuněčné části.
Termín „biologická aktivita“ se používá k popisu účinků na signalizaci, zánětlivé odezvy, přirozené imunity a/nebo morfogenního vývoje ligandů podobných cytokinu. Tyto receptory zprostředkovávají například aktivity fosfatázy nebo fosforylázy, které se obvykle měří standardními postupy (popisuje se například v publikaci Hardie et al., (eds. 1995) The protein kinase FactBook vols I and II, Academie Press, San Diego, CA, Hanks, et al., (1991) Meth. Enzymol.
- 13CZ 304022 B6
200: 38-62, Hunter, et al., (1992) Cell 70: 375-388, Lewin (1990) Cell 61: 743-752, Pines, et al., (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56: 449-462 a Parker, et al., (1993) Nátuře 363: 736-738). Receptory nebo jejich části se mohou použít jako enzymy značící fosfatázou ke značení obecných nebo specifických substrátů. Podjednotky mohou také být funkčními imuno5 geny, aby vyvolaly protilátky nebo antigeny schopné vázat protilátky.
Termíny ligand, agonista, antagonista analog například DCRS5 splňují rysy DCRS5 interakcí ligand-receptor, například v případě, kdy receptor je přirozený receptor nebo protilátka. Buněčné odezvy jsou v typickém případě zprostředkovány cestou receptorovou tyrosinovou kinázu.
io
Ligand je molekula, která slouží buď jako přirozený ligand, na který se uvedený receptor nebo jeho analog váže nebo molekula, která je funkční analog přirozeného ligandů. Funkční analog může být ligand s úpravami struktury nebo to může být zcela nepribuzná molekula s tvarem molekuly, který reaguje s vhodnými determinanty vázajícími se na ligand. Ligandy mohou sloužit jako agonisté nebo antagonisté (popisuje se například v publikaci Goodmann, et al., (eds 1990) Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon Press, New York.
Racionální vzhled léků může být také založen na studiích struktuiy tvaru molekul receptorů nebo protilátky a jejich efektů nebo ligand (popisuje se v publikaci Herz, et al., (1997) J. Recept. Signál Transduct. Res. 17: 671-776 a Chaiken, et al., (1996) Trends Biotechnol. 14: 369-375). Efektory mohou být další proteiny, které zprostředkovávají jiné funkce při odezvě na navázání ligandů nebo jiné proteiny, které v normálním případě reagují s receptorem. Jeden způsob stanovení míst reagujících se specifickými proteiny je stanovení fyzikální struktury, například krystalografie použitím paprsků X nebo dvourozměrná NMR. Tyto metody poskytují způsob zjištění, které aminokyselinové zbytky tvoří molekulové kontaktní oblasti. Detailnější popis stanovení struktury proteinu se popisuje například v publikaci Blundell and Johnson (1976) Protein Crystalography, Academie press New York.
II. Aktivity
Proteiny podobné receptorům cytokinů, když se přidají nebo odstraní ze specifického substrátu, mají řadu různých biologických aktivit, jako je například vnitrobuněčná signalizace například prostřednictvím STAT4, úpravou proliferace buněk nebo při metabolizmu fosforečnanů. To v obecném případě povede k úpravě zánětlivé funkce, přirozené imunitní odezvě nebo k morfologickému účinu. Podjednotka bude pravděpodobně mít specificky nízkou afinitu navázání s ligandem.
DCRS5 má charakteristické motivy signalizace receptorů prostřednictvím dráhy JAK (popisuje se v publikaci Hle, et al., (1997) Stem Cele 15 (suppl. 1): 105-111, Silvennoinen, et al., (1997) APMIS 105: 497-509, Levý (1997) Cytokine Growth Factor Review 8: 81-90, Winston nad Hunter (1996) Current Biol. 6: 668-671. Barret (1996) Baillieres Clin. Gastroenterol. 10: 1-15 a Briscoe, et al., (1996) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 351: 167-171. Středem zájmu jsou vazebné motivy SH2 popsané shora v textu.
Biologické aktivity podjednotek receptorů cytokinů souvisí s přidáním nebo odstraněním fosforečnanových částí do nebo z substrátů v typickém případu specifickým způsobem v netypickém případě nespecifickým způsobem. Substráty se mohou identifikovat nebo podmínky enzymatické aktivity se mohou testovat použitím standardních testů (popisuje se například v publikaci Hardie, et al., (eds. 1995) The protein kinase FactBook vols. I and II, Academie Press, San Diego, CA, Hanks, et al., (1991) Meth. Enzymol. 200: 38-62, Hunter, et al., (1992) Cell 70: 375-388, Lewin (1990) Cell 61: 743-752, Pines, et al., (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Giol. 56: 449-463 a Parker, et al., (1993) Nátuře 363: 736-738).
- 14CZ 304022 B6
Podjednotky receptorů se mohou kombinovat za vzniku funkčních komplexů, které se mohou například použít při navázání ligandu nebo přípravě protilátek. Ty se mohou použít pro diagnostické účely zahrnující detekci nebo kvantifikaci. Funkční vazba receptorů s ligandem p40/IL-B30 poskytuje důležitá proniknutí do klinické indikace, že je možné použít receptor. Tak antagonisté a agonisté budou mít předpokládané funkční účinky.
III. Nukleové kyseliny
Vynález popisuje použití izolované nukleové kyseliny nebo fragmentů, které například kódují uvedené nebo úzce příbuzné proteiny nebo jejich fragmenty. Kódují například odpovídající polypeptid, s výhodou ten, který je biologicky aktivní. Navíc tento vynález popisuje izolovanou a rekombinantní DNA, která kóduje kombinace takových proteinů nebo polypeptidů, které mají charakteristické sekvence, jako je například samotný DCRS5 nebo v kombinaci s jinými, jako je podjednotka IL-12Rpi (popisuje se v publikaci Showe, et al., (1996) Ann. N.Y. Acad. Sci, 795: 413-425, Gately, et al., (1998) Ann. Rev. Immunol. 16. 495-521, GenBank U03187, NM_005535). V typickém případě je nukleová kyselina schopna hybridizovat za vhodných podmínek se segmentem sekvence nukleové kyseliny zobrazeným v tabulce č. 1, ale s výhodou nehybridizuje s odpovídajícími segmenty jiných receptorů zobrazenými v tabulce č. 3. Uvedený biologicky aktivní protein nebo polypeptid může být protein v plné délce nebo jeho fragment a bude v typickém případě obsahovat vysoce homologní segment aminokyselinové sekvence, který například vykazuje podstatnou shodu se segmentem uvedeným v tabulce č. 1. Vynález dále popisuje použití izolované nebo rekombinantní nukleové kyseliny nebo jejího fragmentu, který kóduje proteiny obsahující fragmenty, které jsou ekvivalentní s proteiny DCRS5. Jako jsou například vnitrobuněčné části. Izolované nukleové kyseliny mohou mít regulační sekvence na 5‘ a 3‘ koncích. Jsou to například promotory, zesilovače, poly-A adiční signály a jiné, které pochází z přirozeného genu. Vynález také popisuje kombinace, například kombinace DCRS5 s IL-12Rpi nebo jejich extrabuněčné části vázající se na ligand, jako ligandové antagonisty. Důležitá je také možnost využití pro diagnostické účely, například polymorfní nebo jiné varianty.
Popisuje se izolovaná nukleová kyselina, například RNA, DNA nebo smíchaný polymer, který je v podstatě čistý, například separovaný od jiných komponentů, jenž přirozeně doprovází přirozenou sekvenci, jako jsou ribozomy, polymerázy, a přilehlé genomové sekvence z originálních druhů. Termín zahrnuje sekvenci nukleové kyseliny, která se vyňala ze svého přirozeného prostředí a zahrnuje rekombinantní a klonové izoláty DNA, které se tím stávají odlišitelné od přirozeně se vyskytujících látek a chemicky syntetizovaných analogů nebo analogů biologicky syntetizovaných heterologními systémy. V podstatě čistá molekula zahrnuje izolované formy molekuly, buď zcela nebo částečně čisté.
Izolovaná nukleová kyselina bude v obecném případě homogenní seskupení molekul, ale v některých provedeních bude obsahovat heterogenitu přednostně minoritní. Tato heterogenita byla v typickém případě zjištěna na koncích nebo v částech polymerů a zjistilo se, že není kritická pro požadovanou funkci nebo aktivitu.
Termín „rekombinantní“ nukleová kyselina se v typickém případě definuje svou metodou produkce nebo svou strukturou. Pokud jde o způsob produkce, například produkt připravený určitým způsobem, způsob používá metodu rekombinace nukleové kyseliny, například zahrnuje lidský zásah do nukleotidové sekvence. V typickém případě tento zásah zahrnuje manipulaci in vitro, ačkoli za jistých okolností může zahrnovat klasické metody šlechtění zvířat. V jiném případě se nukleová kyselina může připravit generováním sekvence obsahující fúzi dvou fragmentů, které přirozeně na sebe nenavazují, ale to znamená, že se vyjmou přirozené produkty, například přirozeně se vyskytující mutanti, které se nachází ve svém přirozeném stádiu. Popisují se například produkty přirozené transformací buněk pomocí vektorů, které se přirozeně nevyskytují, jako jsou nukleové kyseliny obsahující sekvenci získanou použitím libovolného způsobu syntézy oligonukleotidu. Takový způsob se často provádí, aby se nahradil například kodon redundantním kodonem, který kóduje stejnou nebo konzervativní aminokyselinu, zatímco
- 15CZ 304022 B6 v typickém případě zavádí nebo odstraňuje místo rozeznávané restrikčním enzymem nebo místo vhodné pro analýzu vztahu struktura - funkce. V jiném případě se použije způsob vhodný ke spojení segmentů nukleové kyseliny, které vykazují požadované funkce za vzniku jediné genetické identity obsahující požadovanou kombinaci funkcí, které nebyly nalezeny v běžně dostupných přirozených formách, například kódující fiizní proteiny. Místa rozeznávaná restrikěním enzymem jsou často cílem takových umělých manipulací, ale jako specifické cíle se mohou použít také jiná místa, jako jsou promotory, místa replikace DNA, regulační sekvence, řídicí sekvence nebo jiné použitelné rysy. Podobný koncept je určený pro rekombinantní polypeptid, například fuzní polypeptid. Tento polypeptid bude zahrnovat dimerickou repetici nebo fúzi
DCRS5 s podjednotkou IL-12Rpi. Specificky jsou zahrnuty syntetické nukleové kyseliny, které nadbytečným genetickým kódem kódují polypeptidy ekvivalentní s fragmenty DCRS5 a fuze sekvencí z různých odlišných příbuzných molekul, jako jsou jiní členové rodiny receptoru cytokinů.
Termín „fragment“ v kontextu s nukleovou kyselinou je souvislý segment obsahující alespoň 17 nukleotidů, v obecném případě obsahuje alespoň 21 nukleotidů, obecněji obsahuje alespoň 25 nukleotidů, obyčejně obsahuje alespoň 30 nukleotidů nebo alespoň 35 nukleotidů, často obsahuje alespoň 39 nukleotidů, více často obsahuje alespoň 45 nukleotidů, v typickém případě obsahuje alespoň 50 nukleotidů, více typické je, když obsahuje alespoň 55 nukleotidů, obvykle obsahuje alespoň 60 nukleotidů, více obvykle je, když obsahuje alespoň 66 nukleotidů, s výhodou obsahuje alespoň 72 nukleotidů, výhodnější je, když obsahuje alespoň 79 nukleotidů a zvláště se preferovaná jsou provedení obsahující alespoň 85 nebo více nukleotidů zahrnujících 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200 atd. nukleotidů. V typickém případě se fragmenty různých genetických sekvencí mohou vzájemně porovnávat v celé délce vhodného pruhu sekvence, zvláště definované segmenty, jako jsou oblasti popsané dále v textu.
Nukleová kyselina, která kóduje DCRS5 bude zvláště použitelná k identifikaci genů mRNA a cDNA, které kódují samotné DCRS5 nebo blízce příbuzné proteiny, jak je DNA, která kóduje polymorfní, alelové nebo jiné genetické varianty, které například pocházejí z různých jedinců nebo příbuzných druhů. Preferované sondy, které se mohou použít při takovém testování, jsou ty oblasti receptoru, které jsou konzervativní mezi různými polymorfhími variantami nebo které obsahují nukleotidy, jenž postrádají specifitu a budou se vyskytovat v plné délce nebo skoro v plné délce. V jiných situacích je lépe použít sekvence specifické pro polymorfní variantu. Mohou se také stanovit kombinace polymorfních variant DCRS5 s variantami IL-12Rpi.
Vynález dále popisuje rekombinantní molekuly nukleové kyseliny a fragmenty, které mají sekvenci nukleové kyseliny shodnou nebo vysoce homologní s izolovanou DNA popsanou dále v textu. Sekvence budou často operativně spojené se segmenty DNA, které řídí transkripci, translaci a replikaci DNA. Tyto adiční segmenty v typickém případě asistují při expresi požado40 váného segmentu nukleové kyseliny.
Homologní nebo vysoce shodné sekvence nukleové kyseliny, když se vzájemně srovnávají, například sekvence DCRS5, vykazují podstatnou podobnost. Standardy homologie v nukleových kyselinách jsou buď mírou homologie obecně užívaných v oboru porovnáním sekvence nebojsou založeny na podmínkách hybridizace. Porovnatelné podmínky hybridizace se popisují detailněji dále v textu.
Podstatná shoda při porovnání sekvence nukleových kyselin znamená buď, že segmenty nebo jejich komplementární řetězce jsou shodné, když jsou optimálně spárovány s vhodnými nukleo50 tidovými inzerty nebo delecemi, alespoň přibližně 60 % nukleotidů, v obecném případě alespoň 66 %, běžně alespoň 71 %, často alespoň 76 %, více často alespoň 80 %, obvykle alespoň 84 %, obvykleji alespoň 88 %, v typickém případě alespoň 93 %, více typické je alespoň přibližně 95 %, výhodné je alespoň 96 až 98 % nebo více a v určitých provedeních je shoda až 99 % nebo více. Tyto sekvence například zahrnují segmenty kódující strukturální oblasti nebo jiné popsané segmenty.
-16CZ 304022 B6
V jiném případě bude existovat podstatná shoda, když segmenty budou hybridizovat za podmínek selektivní hybridizace s řetězcem nebo jeho komplementem v typickém případě za použití sekvence získané z tabulky č. 1. V typickém případě k selektivní hybridizaci dojde, když pruh alespoň přibližně 14-ti nukleotidů vykazuje alespoň přibližně 55 % homologii, v typickém případě alespoň přibližně 65 % homologii, výhodná je alespoň přibližně 75 % homologie a výhodnější je alespoň přibližně 90 % homologie (popisuje se v publikaci Kanehisa (1984) Nucl. Acids Res. 12: 203-213). Délka homologního porovnávání se popisuje pro delší pruhy a v jistých provedeních vynálezu budou pruhy obsahovat alespoň 17 nukleotidů, v obecném případě alespoň 20 nukleotidů, obyčejně alespoň přibližně 24 nukleotidů, obvykle alespoň přibližně 28 nukleotidů, v typickém případě alespoň přibližně 32 nukleotidů, více typické je alespoň přibližně 40 nukleotidů, výhodné je alespoň přibližně 50 nukleotidů a výhodnější je alespoň přibližně 75 až 100 nebo více nukleotidů. V tomto případě pruhy zahrnují například 125, 150, 175, 175, 200, 225,250,275, 300, 325, 350 atd. nukleotidů a jiné délky.
Přísné podmínky hybridizace s ohledem na homologii jsou přísné kombinované podmínky koncentrace soli, teploty, organického rozpouštědla a jiných parametrů, které v typickém případě řídí hybridizační reakce. Přísné teplotní podmínky hybridizace obvykle zahrnují teploty přesahující přibližně 30 °C, obvykle přesahují přibližně 37 °C, v typickém případě přesahují přibližně 45 °C, více typické je, když přesahují teplotu okolo 55 °C, s výhodou přesahují teplotu 65 °C a výhodnější je, když přesahují teplotu okolo 70 °C. Přísné podmínky koncentrace solí budou obyčejně nižší než přibližně 500mM, obvykle nižší než přibližně 400mM nebo nižší než 300mM, v typickém případě nižší než přibližně 200mM, s výhodou nižší než přibližně lOOmM a výhodnější nižší než přibližně 80mM, dokonce nižší než přibližně 50 nebo 20mM. Kombinace parametrů je však daleko důležitější než míra libovolného jediného parametru (popisuje se například v publikaci Wetmer and Davidson (1986) J. Mol. Biol. 31: 349-370).
Izolovaná DNA se může snadno upravit substitucí a deleci a začleněním nukleotidů a inverzemi nukleotidových pruhů. Tyto úpravy vedou ke vzniku nových sekvencí DNA, které kódují určitý protein nebo jeho deriváty. Tyto upravené sekvence se mohou použít při produkci mutantních proteinů (muteinů) nebo k zesílení exprese různých druhů. Zesílená exprese může zahrnovat amplifíkaci genů, zvýšenou transkripci a translaci a jiné mechanizmy. Takový mutant DCRS5 se liší od proteinů podobných receptorům cytokinů, které se přirozeně vyskytují, aminokyselinovou sekvencí upravenou deleci, substitucí nebo inzercí. Termín „místně specifický mutant DCRS5“ zahrnuje protein, který vykazuje podstatnou shodu sekvence s proteinem uvedeným v tabulce č. 1 a v typickém případě sdílí většinu biologických aktivit nebo účinků forem popsaných shora v textu. Také se definují různé přirozené polymorfní varianty sekvencí.
Ačkoli místa místně specifické mutace jsou předem stanovena, mutanti nemusí být místně specifičtí. Mutageneze savčího DCRS5 je možné dosáhnout začleněním nebo deleci aminokyselin v genu, což je spojené s expresí. Může být vytvořena substituce, delece, inzerce nebo řada kombinací, aby vznikla konečná konstrukce. Inzerce zahrnuje fuze N-konce nebo C-konce. Náhodnou mutagenezi je možné provést v cílovém kodonu a u exprimovaných mutantů savčího DCRS5 je možné testovat požadovanou aktivitu, což umožňuje nalézt vztah mezi strukturou a aktivitou. Metody přípravy substitučních mutantů v předem stanovených místech DNA, které mají známou sekvenci, jsou dobře známy v oboru, například mutageneze primerem Ml3 (popisuje se v publikaci Sambrook, et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.) vis. 1-3, CSH Press, NY, Ausubel, et al., (1987 a periodické doplňky) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York). Zvláště použitelné konstrukce jsou extrabuněčné části DCRS5 spojené se segmenty IL-12Rp 1).
Mutace v DNA by v normálním případě neměla umístit kódující sekvence mimo čtecí rámec a je výhodné, když nevzniknou komplementární oblasti, které by mohly hybridizovat za vzniku sekundární struktury mRNA, jako jsou smyčky nebo vlásenky.
- 17CZ 304022 B6
Fosforamiditová metoda popsaná v publikaci Beucage and Carruthers (1981) Tetra. letts. 22: 1859-1862 bude produkovat vhodné syntetické fragmenty DNA. Dvouřetězcový fragment je možné často získat buď syntézou komplementárního řetězce a teplotní hybridizaci řetězce za vhodných podmínek nebo adicí komplementárního řetězce za použití DNA polymerázy s vhodnou sekvencí primeru.
Metody polymerázových řetězcových reakcí (PCR) se mohou často aplikovat při mutagenezi.
V jiném případě primery pro mutagenezi jsou běžně užívanými metodami pro přípravu definovaných mutací v předem stanovených místech (popisuje se například v publikaci Innis et al., (eds. 1990) PCR Protocols: A guide to methods and applications academie press, San Diego, CA a Dieffenbach and Dveksler (1995, eds.) PCR primer: A laboratory manaual, Cold Spring Harbor Press, CSH, NY).
Jistá provedení vynálezu popisují kombinace látek obsahujících popsanou sekvenci receptorů.
V jiném provedení vynálezu funkční části sekvencí mohou být spojeny tak, aby kódovaly fuzní proteiny. V jiných formách se mohou substituovat varianty popsaných sekvencí.
IV. Proteiny, peptidy
Jak se uvádí shora v textu, vynález popisuje DCRS5 primáta, jehož sekvence jsou uvedeny v tabulce č. 1, jak se také popisuje shora v textu. Vynález zahrnuje také alelové nebo jiné varianty, kterými jsou například fuzní proteiny kombinující části takových sekvencí sjinými, které zahrnují například IL-12Rpi, epitop tag a funkční oblasti.
Vynález také popisuje rekombinantní proteiny, jako jsou například heterogenní fuzní proteiny, které obsahují segmenty z uvedených proteinů primátů nebo hlodavců. Heterogenní fuzní protein je fuze proteinu nebo segmentů, které netvoří přirozeně fuze stejným způsobem. Fúzní produkt DCRS5 s jiným cytokinovým receptorem je spojitá molekula proteinu, která má sekvence fúzované v typické peptidové spojení, v typickém případě připravené jako jediný translační produkt a vykazující vlastnosti získané z každého zdroje peptidů. Podobný koncept se aplikuje pro sekvence heterogenních nukleových kyselin. Také se popisují kombinace různých označených proteinů za vzniku komplexů.
Navíc nové konstrukce se mohou vytvořit kombinací podobných funkčních nebo strukturálních oblastí zjiných příbuzných proteinů, jako jsou například receptory cytokinů nebo receptory podobné Toll zahrnující varianty druhů. Segmenty vázající se na ligandy nebo jiné segmenty mohou být například přesunuty mezi nové fuzní polypeptidy nebo fragmenty (popisuje se například v publikaci Cunningham, et al., (1989) Science 243: 1330-1336 a O’Dowd, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992). Pak nové chimérické polypeptidy vykazující nové kombinace specificity vzniknou z funkčního spojení specifity navázání na receptor. Oblast vázající se na ligand zjiných příbuzných molekul se mohou přidat do jiných domén uvedeného nebo příbuzného proteinu nebo je mohou substituovat. Výsledný protein bude často mít funkci a vlastnosti hybridu. Fúzní protein může například zahrnovat oblast cílení, která může sloužit k zavedení fuzního proteinu do určité subbuněčné organely.
Kandidát fuzních partnerů a sekvencí se může vybrat z různých databází sekvencí, jako je například GenBank, c/o IntelliGenetics, Mountain View, CA a BCG, University of Wisconsin Biotechnology Computing Group? Madison, WI. Zvláště výhodné jsou kombinace polypeptidových sekvencí uvedených v tabulce č. 1 a 3. Variační formy proteinů se mohou substituovat v popsaných kombinacích.
Vynález dále popisuje muteiny, které se váží na ligandy podobné cytokinům a/nebo jejichž transdukce je ovlivněna. Strukturální uspořádání lidského DCRS5 sjinými členy rodiny receptorů cytokinů ukazuje konzervativní rysy/zbytky (uvádí se v tabulce č. 3). Seskupení sekvence lidského DCRS5 sjinými členy rodiny receptorů cytokinů indukuje různé strukturální
-18CZ 304022 B6 a funkčně sdílené rysy (popisuje se v publikaci Bazan et al., (1996) Nátuře 379: 591, Lodi, et al., (1994) Science 263: 1762-1766, Sayle and Milner-White (1995) TIBS 20: 374-376 a Gronenberg, et al., (1991) Protein Engeneering 4: 263-269).
Zvláště výhodné jsou substituce provedené s myšími sekvencemi nebo s lidskými sekvencemi. Naopak konzervativní substituce vzdálené od oblasti interakce vázající ligand budou pravděpodobně chránit většinu signalizačních aktivit a konzervativní substituce vzdálené od vnitrobuněčných oblastí budou pravděpodobně chránit většinu vlastností navázání na ligand.
Termín „deriváty“ DCRS5 primáta zahrnují aminokyselinovou sekvenci mutantů, glykosylační variace, metabolické deriváty a kovalentní nebo agregační konjugáty s jinými chemickými částmi. Kovalentní deriváty se mohou připravit spojením funkčnosti se skupinami, které se nacházejí ve vedlejších aminokyselinových řetězcích nebo na jejich N-konci, například způsoby, které jsou dobře známy v oboru. Tyto deriváty mohou zahrnovat bez omezení alifatické estery nebo amidy karboxylového konce nebo zbytky obsahující karboxylové boční řetězce, zbytky obsahující O-acylové deriváty hydroxylové skupiny a N-acylové deriváty N-terminální aminokyseliny nebo zbytky obsahující aminokyselinu, například lyzin nebo arginin. Acylové skupiny se vybraly ze skupiny alkylových částí, které zahrnují C3 až 08 normální alkyl, čímž se tvoří alkanoylaroylové druhy.
Zahrnují se také glykosylační změny, které vznikly například úpravou glykosylačních patemů polypeptidu během syntézy a zpracování nebo během dalších kroků zpracování. Zvláště výhodné způsoby provedení jsou vystavení polypeptidu glykosylačním enzymům získaným z buněk, které normálně poskytují takové zpracování, jako jsou například savčí glykosylační enzymy. Vynález také zahrnuje uvedené glykosylační enzymy. Vynález dále zahrnuje verze stejné primární aminokyselinové sekvence, která má jiné minoritní modifikace zahrnující fosforylované aminokyselinové zbytky, jako je například fosfotyrosin, fosfoserin nebo fosfothreonin.
Hlavní skupina derivátů jsou kovalentní konjugáty receptorů nebo jejich fragmentů s jinými proteiny polypeptidů. Tyto deriváty se mohou syntetizovat v rekombinantní kultuře, jako jsou N-terminální fuze nebo použitím činidel, jejichž použitelnost při řetězení proteinů prostřednictvím reaktivních vedlejších skupin je dobře známa v oboru. Výhodná derivatizační místa pomocí řetězících činidel jsou ve volných aminoskupinách, v sacharidových částech a na cysteinových zbytcích.
Popisují se fuzní polypeptidy mezi receptory a jinými homologními nebo heterologními proteiny. Homologní polypeptidy mohou tvořit fúze mezi různými receptory za vzniku hybridního proteinu, který vykazuje vazebnou specifitu pro řadu různých cytokinových ligandů nebo receptor, který může mít širokou nebo slabou specificitu substrátového účinku. Podobně se mohou zkonstruovat heterologní fuze, které budou vykazovat kombinaci vlastností nebo aktivit získaných proteinů. Typické příklady jsou fuze reportního polypeptidu, například luciferázy se segmentem nebo oblastí receptorů, jako je například segment vázající se na ligand ta, že je možné jednoduše stanovit přítomnost nebo lokaci požadovaného Iigandu (popisuje se například v publikaci Duli et al., patentový dokument USA 4 859 609). Další fuzní partneři zahrnují glutathion-S-transferázu (GST), bakteriální β-galaktrozidázu, trpE, protein A, β-laktamázu, alfa-amylázu, dehydrogenázu alkoholu a kvasinkový kopulační faktor alfa (popisuje se v publikaci Godowski, et al., (1988) Science 241: 812-816). Značené proteiny se budou často substituovat v popsaných kombinacích proteinů. Zvláště podstatná jsou spojení DCRS5 sIL-12Rpl.
Fosforamiditový způsob popsaný v publikaci Beaucage and Carruthers (1981) Tetra, Letts. 22: 1859-1862, bude produkovat vhodné syntetické fragmenty DNA. Dvouřetězcový fragment je možné často získat buď syntézou komplementárního řetězce a teplotní hybridizací řetězců za vhodných podmínek nebo adicí komplementárního řetězce za použití DNA polymerázy s vhodnou sekvencí primerů.
- 19CZ 304022 B6
Takové polypeptidy mohou také mít aminokyselinové zbytky, které mohou být chemicky upraveny fosfory lácí, sulfonací, biotinylací nebo adicí nebo odstraněním jiných částí zvláště těch, které mají molekulové tvary podobné fosfátovým skupinám. V některých provedeních úpravy budou použitelná značící činidla nebo budou sloužit jako cíle izolace, jako jsou například afinitní ligandy.
Fúzní proteiny budou v typickém případě vyrobeny metody rekombinace nukleových kyselin nebo metodou syntetických polypeptidů. Metody manipulace a exprese se obecně popisují v publikaci Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratoiy Manual, (2d ed.), vols. 13, CSH Press NY, nebo Ausubel, et al., (1987 a periodické doplňky) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York.) Metody syntézy polypeptidů se popisují například v publikaci Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156, Merrifield (1986) Science 232: 341-347 a metoda přípravy větších polypeptidů se popisuje v publikaci Atherton, et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A practical approach, IRL Press, Oxford a také Dawson, et al., (1994) Science 266: 776-779).
Tento vynález dále popisuje použití derivátů DCRS5 jiných než jsou variace v aminokyselinové sekvenci nebo glykosylace. Takové deriváty mohou zahrnovat kovalentní nebo agregativní spojení s chemickými částmi. Tyto deriváty v obecném případě spadají do tříd: 1) sole, 2) boční řetězec a kovalentní úprava terminálního zbytku a 3) adsorpční komplexy, například s buněčnými membránami. Takové kovalentní nebo agregativní deriváty je možné použít jako imunogeny, jako činidla v imunologických testech nebo při izolačních metodách, jako se používají při afinitním čištění receptoru nebo jiné vázající se molekuly, kterou je například protilátka. Ligand cytokinu se může mobilizovat kovalentní vazbou na pevný povrch, jako je safaróza aktivovaná kyanbromidem způsoby, které jsou dobře známy v oboru, nebo adsorbovat na polyolefinové povrchy se sesítěním s glutaraldehydem nebo bez něho za účelem použití v testu nebo při čištění receptoru cytokinu, protilátek nebo jiných podobných molekul. Ligand se může také značit detekovatelnou skupinou, jako je například značení radioaktivním jódem pomocí postupu s chloraminem T, kovalentně vázanou na řídce se vyskytující cheláty kovů alkalických zemin nebo konjugované na jiné fluorescenční části, které jsou vhodné pro použití v diagnostických testech.
Kombinace, která například zahrnuje DCRS5 podle vynálezu, se může použít jako imunogen při produkci antiséra nebo protilátek specifických pro popsané kombinace. Jsou například schopné rozlišit mezi jinými členy rodiny receptorů. Komplexy se mohou použít k testování monoklonálních protilátek nebo fragmentů vázajících antigen připravených imunizací s různými formami kontaminovaných přípravků, které obsahují protein. Termín „protilátky“ také zahrnuje fragmenty přirozených protilátek vázající antigen, například Fab, Fa£2, Fv atd. Izolovaný DCRS5 se může také použít jako činidlo pro detekci protilátek vytvořených jako odezva na zesilující expresi nebo imunologické poruchy, které vedou k produkci protilátek proti endogennímu receptoru. Navíc fragmenty DCRS5 mohou také sloužit jako imunogeny vhodné pro produkci protilátek podle vynálezu, jak se popisuje bezprostředně dále v textu. Tento vynález dále popisuje protilátky, které mají vazebnou afinitu nebo jsou řízeny proti aminokyselinovým sekvencím zobrazeným v tabulce č. 1, jejich fragmentům nebo různým homologním peptidům. Vynález dále popisuje protilátky vykazují vazebnou afinitu nebo protilátky, které vznikly proti specifickým fragmentů, které budou vystaveny na povrchu externích proteinů přirozeného DCRS5. Použitelné budou také komplexy kombinací proteinů a mohou se také vytvořit protilátkové přípravky.
V jistých jiných provedeních vynálezu rozpustné konstrukce, například segmenty DCRS5 vázající extrabuněčný ligand s 1L—12Ηβ 1, mohou být vazebné kompozice pro ligand a mohou se také použít jako ligandový antagonisty nebo jako antigeny k blokaci signalizace zprostředkované ligandem. Takové konstrukce se mohou použít k diagnostickým účelům například pro histologické značení ligandů nebo pro terapeutické účely například jako antagonisti ligandů.
-20CZ 304022 B6
Blokování fyziologické odezvy na ligandy receptorů může vzejít z inhibice navázání ligandů na receptor, pravděpodobně prostřednictvím kompetitivní inhibice. Pak testy in vitro podle vynálezu budou často používat protilátky nebo segmenty těchto protilátek vázající antigen, rozpustné konstrukce receptorů nebo fragmenty spojené se substráty pevné fáze. Tyto testy také umožňují diagnostické stanovení účinků mutací nebo modifikací oblastí vázající ligand nebo jiných nebo jiných mutací nebo modifikací, které například ovlivňují signalizaci nebo enzymatickou funkci.
Vynález dále popisuje použití kompetitivních testů pro testování léků, kde například protilátky neutralizující receptorové komplexy nebo fragmenty soutěží s testovanou sloučeninou o navázání na ligand nebo jinou protilátku. Tímto způsobem se mohou neutralizační protilátky nebo fragmenty použít k detekci přítomnosti polypeptidu, který sdílí jedno nebo více vazebných míst vůči receptorů a také se může použít při obsazování vazebných míst na receptorů, které se může tak vázat na ligand. Konstrukce rozpustných receptorů kombinující extrabuněčné oblasti DCRS5 nebo oblasti DCRS5 vázající ligand s IL—12RP1 se mohou použít jako antagonisté pro kompetitivní navázání ligandů p40/IL-B30.
V. Příprava nukleových kyselin a proteinu
Dna, která kóduje protein nebo jeho fragment se může získat chemickou syntézou, testování knihovny cDNA nebo testováním genomových knihoven připravených z mnoha buněčných linií nebo tkáňových vzorků. Přirozené sekvence se mohou izolovat použitím standardních metod a zde popsaných sekvencí (například v tabulce č. 1). Jiné doplňky druhů se mohou identifikovat hybridizací nebo různými metodami PCR kombinovanými s vyhledáváním v sekvenčních databází, jako je například GenBank.
Tato DNA se může exprimovat v různých hostitelských buňkách za účelem syntézy receptorů v plné délce nebo fragmentu, který se může naopak například použít k vytvoření polyklonálních nebo monoklonálních protilátek, ve vazebných studiích, při konstrukci a expresi oblastí vázajících ligand nebo oblasti kinázy/fosfatázy a ke studiu vztahu struktury a funkce. Varianty nebo fragmenty se mohou exprimovat v hostitelských buňkách, které se transformují a transfekují vhodnými expresívními vektoiy. Tyto molekuly mohou být v podstatě bez proteinu nebo buněčných kontaminant, spíše než ty získané z rekombinantního hostitele a proti je možné je použít ve farmaceutických prostředcích, kde se kombinují s farmaceuticky přijatelným nosičem a/nebo ředidlem. Protein nebo jeho části se mohou exprimovat jako fuze s jinými proteiny. Zvláště zajímavé jsou kombinace požadovaných proteinů nebo nukleových kyselin, které je kódují.
Expresívní vektory jsou v typickém případě sami se replikující konstrukce DNA nebo RNA, které obsahují požadovaný receptorový gen, jeho fragmenty nebo kombinace genů, obvykle operativně spojených s vhodnými genetickými řídicími elementy, které je možné najít ve vhodné hostitelské buňce. Řada genů může být postupně exprimována a mohou být na polycistronickém message. Specifický typu řídicích elementů nezbytný k dosažení exprese bude záviset na použití hostitelské buňky. V obecném případě genetické řídicí elementy mohou zahrnovat prokaryontní promotorový systém nebo eukaryotní promotorový systém řídicí expresi a v typickém případě zahrnuje transkripční promotor, operátor křížení začátku transkripce, zesilovače transkripce, které zesilují expresi mRNA, sekvenci, která kóduje místo pro navázání na ribozóm, a sekvence, které ukončují transkripci a translaci. Expresívní vektory také obvykle obsahují počátek replikace, který umožňuje replikaci vektoru nezávisle na hostitelské buňce.
Vektory podle vynálezu zahrnují ty, které obsahují DNA kódující popsanou kombinaci proteinů nebo biologicky aktivní ekvivalentní polypeptid. DNA může být řízena virovým promotorem a může kódovat selektivní markér. Vynález dále popisuje použití takových expresívních vektorů, které jsou schopny exprimovat eukaryotní cDNA kódující takové proteiny v prokaryontním nebo eukaryotním hostiteli, kde je vektor kompatibilní s hostitelem a kde eukaiyotní cDNA jsou začleněny do vektoru tak, že při růstu hostitelské buňky, která obsahuje vektor, se exprimuje
-21 CZ 304022 B6 diskutovaná cDNA. v obvyklém případě se exprimované vektory navrhují tak, aby mohla proběhnout stabilní replikace v jejich hostitelských buňkách nebo amplifikace, která velmi zvýší celkový počet kopií požadovaných genů v buňce. Není vždy nezbytné vyžadovat, aby se expresívní vektor replikoval v hostitelské buňce. Je například možné, aby proběhla dočasná exprese proteinu nebo jeho fragmentů v různých hostitelích za použití vektorů, který neobsahují počátek replikace, který je rozeznáván hostitelskou buňkou. Je také možné použít vektory, které způsobují integraci částí kódujících protein do hostitelské DNA pomocí rekombinace.
Zde používané vektory obsahují plazmidy, viry, bakteriofág, integrovatelné fragmenty DNA a jiné excipienty, které umožňují integraci fragmentů DNA do genomu hostitele. Expresívní vektory jsou specializované vektory, které obsahují genetické kontrolní elementy, jenž ovlivňují expresi operativně spojených genů. Plazmidy jsou běžně užívané forma vektoru, ale mohou se použít všechny jiné formy vektorů, které vykazují ekvivalentní funkci a které jsou nebo se stávají dobře známy v oboru (popisuje se například v publikaci Pouwels, et al., (1985 a doplňky) Cloning Vectors: A laboratory manual, Elsevier, N.Y., a Rodriguez, et al., (eds. 1988) Vectors: A survey of molecular clonning vectors and their uses, Buttersworth, Boston).
Transformované buňky jsou buňky, s výhodou savčí buňky, které se transformovaly nebo transfekovaly s vektory konstruovanými za použití metod rekombinace DNA. Transformované hostitelské buňky exprimují požadované proteiny, ale pro účely klonování, amplifikace a manipulace DNA nepotřebují exprimovat proteiny. Vynález dále popisuje kultivaci transformovaných buněk v nutričním médiu, což umožňuje akumulaci proteinu. Proteiny je možné izolovat buď z kultury nebo v jistých případech z kultivačního média.
Pro účely vynálezu jsou nukleové sekvence operativně spojeny, když jsou vzájemně funkčně příbuzné. Například DNA presekvence nebo sekreační vedoucí sekvence je operativně spojena s polypeptidem, jestliže se exprimuje jako preprotein nebo se účastní řízení polypeptidu do buněčné membrány nebo při jeho sekreci. Promotor je operativně spojen s kódující sekvencí v případě že řídí transkripci polypeptidu. Místo vázající se na ribozom je operativně spojen s kódující sekvencí, jestliže je umístěna tak, aby dovolovala translaci. V obvyklém případě operativně spojený znamená souvislý a v jednom čtecím rámci, avšak jisté genetické elementy, jako jsou represorové geny nejsou souvisle spojeny, ale stále se váží na operátorové sekvence, které naopak řídí expresi.
Vhodné hostitelské buňky zahrnují prokaryonty, nižší eukaryonty a vyšší eukaiyonty. Prokaryonty zahrnují gram negativní a gram pozitivní organizmy, jako jsou například E. coli a B. sublitis. Nižší eukaryonty zahrnují kvasinky, například S. cerevisiae a Pichia a druhy rodu Dictyostelium. Vyšší eukaryonty zahrnují tkáňové kultivační buněčné linie pocházející ze zvířecích buněk, které nejsou savčího původu, například hmyzí buňky a buňky ptáků a buňky savčího původu, jako jsou například lidské buňky, buňky primátů a hlodavců.
Prokaryontní hostitelské vektorové syntézy zahrnují různé vektory pro řadu různých druhů. Pro účely vynálezu se v obecném případě používá mikroorganizmus E. coli a jeho vektory. Mohou se použít ekvivalentní vektory používané v případě jiných prokaryontů. Reprezentativní vektor vhodný pro amplifikaci DNA je pBR322 nebo řada jejich derivátů. Vektory, které se mohou použít k expresi receptorů nebo jeho fragmentů zahrnují, ale nejsou omezeny na takové vektory, které obsahují promotor lac (série pUC), promotor trp (pBR322 trp), promotor Ipp (série pIN), lambda pP nebo promotory pR (pOTS) nebo hybridní promotory, jako je ptač (pDR540) (popisuje se v publikaci Brisuzsm et al., (1988) Expression vectors employing lambda and Ipp derived promotores, v Vectors: A survey of molecular clonning vectors and their uses (eds. Rodriguez and Denhardt), Buttersworth, Boston, Chapter 10, pp. 205 236).
Nižší eukaryonty například kvasinky a Dictyostelium se mohou transformovat vektory obsahujícími sekvenci DCRS5. Pro účely tohoto vynálezu nejběžnější nižším eukaryotním hostitelem jsou pekařské kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Tyto kvasinky se jsou používány k reprezentaci
-22CZ 304022 B6 nižších eukaryontů, ačkoli je také dostupná řada jiných kmenů a druhů. Kvasinkové vektory v typickém případě obsahují počátek replikace (vyjma integračních typů), selekční gen, promotor, DNA kódující receptor nebo jiné fragmenty a sekvence pro ukončení translace, polyadenylaci a ukončení transkripce. Vhodné expresívní vektory určené pro kvasinky zahrnují takové konstitutivní promotory jako promotory genů 3-fosfoglycerátové kinázy a různé jiné promotory genů glykolytického enzymu nebo také indukovatelné promotory, jako je promotor dehydrogenázy alkoholu nebo promotor metalothioninu. Vhodné vektory zahrnují deriváty následujících typů: samostatně se replikující s malým počtem kopií (jako jsou série Yrp), samostatně se replikující s vysokým počtem kopií (jako jsou série Yep), integrační typy (jako jsou série Yip) nebo minichromozómy (jako jsou série YCp).
Tkáňové buněčné kultury vyšších eukaryod jsou v normálním případě výhodné hostitelské buňky vhodné pro expresi funkčně aktivního interleukinu nebo receptorových proteinů. V principu je možné použít řadu buněčných linií tkáňových kultur vyšších eukaryontů, jako jsou například expresívní systémy hmyzích bakulovirů ať už pochází z bezobratlých nebo z obratlovců. Preferují se však buňky savců. Transformace nebo transfekce a pomnožení takových buněk se stává rutinním postupem. Příklady takových použitelných buněčných linií zahrnují buňky HeLa, buněčné linie vaječníků čínských křečků (CHO), buněčné linie ledvin mláďat krys (BRK), hmyzí buněčné linie, ptačí buněčné linie, buněčné linie opic (COS). Expresívní vektory vhodné pro takové buněčné linie zahrnují počátek replikace, promotor, místo počátku translace, místa sestřihu RNA (jestliže se použije pouze DNA), polyadenylační místo a místo ukončení transkripce. Tyto vektory také v obvyklém případě obsahují selektivní gen nebo amplifikační gen. Vhodnými expresívními vektory mohou být plazmidy, viry nebo retroviry, které nesou promotory získané například z takových zdrojů, jako jsou adenoviry, SV40, parvoviry, virus vakcinie nebo cytomegalovirus. Reprezentativní vzorky vhodných expresívních vektorů zahrnují pCNDNAl, pCD (popisuje se v publikaci Okayama, et al., (1985) Mol. Cell Biol. 5: 1136-1142), pMClneoPolyA (popisuje se v publikaci Thomas, et al., (1987) Cell 51: 503-512) a baculovirový vektor, jaké je pAC 373 nebo pAC 610.
V případě vylučovaných proteinů a některých membránových proteinů otevřený čtecí rámec v obvyklém případě kóduje polypeptid, který obsahuje zralý nebo vylučovaný produkt kovalentně spojený na N-konci se signálním peptidem. Signální peptid se štěpí před sekrecí zralého nebo aktivního polypeptidu. Místo štěpení je možné předpovědět s vysokým stupněm přesnosti z empirických pravidel (popisuje se například v publikaci von-Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14: 4683-4690 a Nielsen, et al. (1997) Protein Eng. 10: 1-12) a přesné složení aminokyselin signálního peptidů se často nejeví být kritické ve spojení s jeho funkcí (popisuje se v publikaci Randall, et al., (1989) Science 243: 1156-1159, Kaiser et al., (1987) Science 235: 317. Zralé proteiny podle vynálezu se mohou často stanovit za použití standardních metod.
Často bude nutné exprimovat tyto polypeptidy v systému, který poskytuje specifický nebo definovaný glykosylační patem. V tomto případě obvyklý patem bude ten, který je poskytován přirozeně expresívním systémem. Avšak patem se bude modifikovat polypeptidu, například neglykosylované formy, vhodným glykosylačním proteinům zavedeným do heterogenního expresívního systému. Receptorový gen se může společně transformovat s jedním nebo více geny, které kódují savčí nebo jiné glykosylační enzymy. Za použití uvedeného v prokaryotních nebo jiných buňkách. Exprese v prokaryotních buňkách v typickém případě povede k neglykosylačním formám proteinu.
Zdroj DCRS5 může být eukaiyotní nebo prokaryotní hostitel exprimující rekombinantní DCRS5, jak se popisuje shora v textu. Zdrojem může být také buněčná linie, ale jiné savčí buněčné linie, které také spadají do popisu uvedeného vynálezu. Výhodná buněčná linie pochází z lidského druhu.
V případě, že sekvence jsou známé, DCRS5 primáta, fragmenty nebo jeho deriváty se mohou připravit běžnými způsoby syntézy peptidů. Tyto syntézy zahrnují způsoby syntéz popsané
-23CZ 304022 B6 v publikaci Stewart and Young (1984) Solid phase peptide synthesis, Pierce Chemical Col., Rockford, IL, Bodanszky and Bodanszky (1984) The practice of peptide synthesis, Springer Verlag, New York a Bodanszky (1984) The principles of peptide synthesis, Springer Verlag, New York. Například se může použít azidový postup, postup za použití kyselých chloridů, postup za použití kyselého anhydridů, postup použití míchaného anhydridů, způsob aktivního esteru (například p-nitrofenylester, ester N-hydroxysukcinimidu nebo ester kyanomethylu), karbodiimidazolu, oxidačně-redukční postup nebo dicyklohexylkarbodiimidový aditivní postup (DCCD). V případě shora v textu popsaných postupů je možné použít pevnou fázi a syntézu na pevné a kapalné fázi. Podobné metody lze použít s určitými sekvencemi DCRS5.
Proteiny DCRS5, fragmenty nebo deriváty je možné připravit v souladu se shora v textu popsanými postupy, které se v typickém případě používají při syntéze peptidů. V obecném případě se používají tzv. postupné způsoby, které zahrnují kondenzaci aminokyseliny s terminální aminokyselinou, přičemž v sekvenci přibývá jedna za druhou, nebo připojení peptidových fragmentů k terminální aminokyselině. Aminoskupiny, které se nepoužily při párovací reakci se v typickém případě musí chránit, aby se předešlo interakci na špatném místě.
Jestliže se adoptovala syntéza na pevné fázi, C-terminální aminokyselina je vázána na nerozpustném nosiči nebo podpoře karboxylovou skupinou. Nerozpustný nosič není zvláště limitován, pokud je schopen se vázat na reaktivní karboxylovou skupinu. Příklady takových nerozpustných nosičů zahrnují halomethylové pryskyřice, jako je chloromethylová nebo bromomethylová pryskyřice, hydroxylmethylová, fenolová pryskyřice, terciární alkyloxykarbonylhydrazidátová piyskyřice a podobně.
Aminokyselina s chráněnou aminoskupinou se váže v sekvenci prostřednictvím kondenzace své aktivované karboxylové skupiny s reaktivní aminoskupinou dříve vytvořeného peptidu nebo řetězce za účelem postupné syntézy peptidu. Po syntéze kompletní sekvence se peptid oddělí od nerozpustného nosiče za vzniku peptidu. Tento přístup syntézy na pevné fázi se popisuje v publikaci Merrifield, et al., (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156.
Připravené proteiny nebo jejich fragmenty se mohou izolovat a čistit z reakční směsi způsoby separace peptidu. Je to například extrakce, srážení, elektroforéza, různé formy chromatografie, imunoafinity a podobně. Receptory podle vynálezu se mohou získat v různých stupních čistoty v závislosti na požadovaném použití. Čistoty je možné dosáhnout použitím metod čištění proteinu, který se popisuje dále v textu, nebo použitím protilátek, které se popisují v metodách imunoabsorpční afinitní chromatografie. Tato imunoabsorbční afinitní chromatografie se provádí: nejdříve se naváží protilátky na pevný povrch a pak přijdou do kontaktu s rozpuštěným lyzátem vhodných buněk, s lyzáty jiných buněk exprimujících receptor nebo s lyzáty nebo supematanty buněk produkujících protein jako výsledek metod DNA (popisuje se dále v textu).
V obecném případě izolované proteiny budou alespoň ze 40 % čisté, běžně alespoň z 50 % čisté, obvykle alespoň z 60 % čisté, v typickém případě alespoň ze 70 % čisté, ve více typickém případě alespoň z 80 % čisté, s výhodou alespoň z 90 % čisté a výhodnější je alespoň z 95 % čisté a v určitých provedeních alespoň z 97 až 99 % čisté nebo více. Čistota je obvykle stanovena na základě hmotnosti. Je-li to vhodné aplikují se různé testy. Mohou se izolovat jednotlivé proteiny a pak se kombinují.
VI. Protilátky
Protilátky mohou vzniknout proti různým savčím proteinům DCRS5 ajejich fragmentům, které se přirozeně vyskytují v nativních formách a v jejich rekombinantních formách. Rozdíl je, že protilátky vůči aktivnímu receptorů jsou rozeznávány epitopy přítomnými v přirozených konformacích. Dále se popisují protilátky rozeznávající epitopy prezentované kombinací DCRS5 sIL-12Rpl. Detekce denaturovaného antigenu je také použitelná například ve westernové
-24CZ 304022 B6 analýze. Také se popisují anti-idiotypické protilátky, které budou použitelné jako agonisté nebo antagonisté přirozeného receptoru nebo protilátky.
Protilátky, zahrnující vazebné fragmenty a verze jediného řetězce, proti předem definovaným fragmentům proteinu mohou vzniknout imunizací zvířat konjugáty fragmentů s imunogenními proteiny. Monoklonální protilátky jsou připravené z buněk vylučujících požadované protilátky. U těchto protilátek se může testovat jejich schopnost vázat se na normální nebo defektní protein nebo agonistická nebo antagonistická aktivita. Tyto monoklonální protilátky se budou obvykle vázat s hodnotou konstanty KD přibližně lmM, více obvyklá je přibližná hodnota 300μΜ, v typickém případě je přibližná hodnota alespoň 100μΜ, ve více typickém případě je tato hodnota konstanty alespoň přibližně 30μΜ. Přednostně je hodnota konstanty KD alespoň 10μΜ a více se preferuje hodnota konstanty alespoň přibližně 3μΜ nebo lepší.
Protilátky zahrnující fragmenty vázající antigen podle vynálezu mohou mít podstatnou diagnostickou nebo terapeutickou hodnotu. Mohou to být potencionální antagonisté, kteří se vážou na receptor a inhibují navázání na ligand nebo inhibují schopnost receptoru vyvolávat biologickou odezvu například působit na jeho substrát. Protilátky se mohou také použít jako protilátky, které nemají neutralizační vlastnosti a mohou se spojovat s toxiny nebo radionuklidy, aby se vázaly na produkující buňky nebo buňky lokalizované na zdroji interleukinu. Tyto protilátky se mohou dále konjugovat s léky nebo jinými terapeutickými činidly buď přímo nebo nepřímo pomocí linkeru.
Protilátky podle vynálezu se mohou také použít při diagnostických aplikacích. Jako záchytné nebo neneutralizační protilátky se mohou vázat na receptor bez inhibice ligandů nebo navázání substrátu. Neutralizační protilátky se mohou použít v kompetitivním vazebném testu. Budou se také moci použít při detekci nebo kvantifikaci ligand. Mohou se také použít jako činidla při analýze westernovým přenosem nebo při imunologickém srážení nebo imunologickém čištění proteinu. Podobně se mohou na pevných substrátech nebo plastových listech imobilizovat nukleové kyseliny a proteiny. Substráty mohou být například částice z pevné pryskyřice nebo listy plastu.
Fragmenty proteinů se mohou vázat na jiné materiály, zvláště peptidy, jako fúzované nebo kovalentně vázané polypeptidy, aby se mohly použít jako imunogeny. Savčí receptory cytokinů a fragmenty se mohou fiizovat nebo kovalentně vázat na různé imunogeny, jako je hemocyanin přílipkovitých plžů, albumin bovinního séra, toxoid tetanu (popisuje se v publikaci Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969, Landsteiner (1962) Specifity of serological reactions, Dover Publicatins, New York a Wiliams, et al., (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academie Press, New York), kde se také popisují metody přípravy polyklonálního antiséra. Typická metoda zahrnuje hyperimunizaci zvířete s antigenem. Krátce po opakované imunizaci se shromáždí krev zvířete a izoluje se gamaglobulin.
V některých případech je nutné připravit monoklonální protilátky z různých savčích hostitelů, jako je myš, hlodavci, primáti, lidé atd. Popis metod vhodných pro přípravu takových monoklonálních protilátek se nachází například v publikaci Stites, et al., (eds.) Basic and Clinical Immunology (4 th. ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, Harlow and Lané (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and practice (2d ed.) Academie Press, New York a zvláště v publikaci Kohler and Milstein (1975) in Nátuře 256: 495-497, kde se popisuje metoda generující monoklonální protilátky. Tato metoda zahrnuje zavedení imunogenu do zvířete injekcí. Zvíře se pak usmrtí a ze sleziny se odeberou buňky, které se pak fúzují s buňkami myelomu. Výsledek je hybridní buňka nebo „hybridom“, který je schopný se reprodukovat in vitro. Pak se testuje populace hybridomů za účelem izolovat jednotlivé klony, kdy každý z nich vylučuje jediný druh protilátek proti imunogenu. Tímto způsobem získané jednotlivé druhy protilátek jsou produkty imortalizovaných a klonovaných buněk B imunizovaného zvířete vytvořených jako odezva na specifické místo rozeznávané na imunogenní substanci.
-25CZ 304022 B6
Jiné vhodné metody zahrnují vystavení lymfocytů in vitro vůči antigenním polypeptidům nebo vjiném případě k selekci knihoven protilátek ve fágu nebo v podobných vektorech (popisuje se v publikaci Huse, et al., (1989) Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage Lambda, Science 246: 1275-1281 a Ward, et al., (1989) Nátuře 341: 544-546). Polypeptidy a protilátky podle vynálezu se mohou použít s úpravami nebo bez úprav, které zahrnují chimérové nebo humanizované protilátky. Polypeptidy a protilátky budou často značeny kovalentním nebo nekovalentním připojením látky, která poskytuje detekovatelný signál. Je známo široké rozmezí značících a konjugačních metod a jsou publikovány ve vědecké a patentové literatuře. K vhodnému značení se používají radionukleotidy, enzymy, substráty, kofaktoiy, inhibitory, fluorescenční části, chemiluminiscenční části, magnetické částice a podobně. Použití takových značek se popisuje v patentové literatuře zahrnující patenty US 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350, 3 996 345, 4 277 437, 4 275 149 a 4 366 241. Mohou se také produkovat rekombinantní nebo chimérické imunoglobuliny (popisuje se v patentovém dokumentu USA č. 4 816 567) nebo imunoglobuliny připravené v transgenní myši (popisuje se v publikaci Mendez, et al., (1997) Nátuře Genetics 15: 146-156).
Protilátky podle vynálezu mohou být použity při afinitní chromatografii při izolaci proteinů DCRS5 nebo peptidů. Mohou se připravovat kolony, kde protilátky jsou spojeny s pevným povrchem, například s částicemi jako je agaróza, Sephadex nebo podobně, kde buněčný lyzát může procházet kolonou. Kolona se promyje a pak následuje zvýšení koncentrací slabého denaturačního činidla, čímž se uvolní izolovaný protein. V jiném případě se protein může použít při čištění protilátek. Mohou se aplikovat vhodné zkřížené absorbance nebo deplece.
Protilátky se mohou také použít k testování expresívních knihoven za účelem získání jistých expresívních produktů. Obvykle protilátky užívané při takovém postupu budou značeny značkou umožňující jednoduchou detekci antigenu navázanou protilátkou.
Protilátky vytvořené proti cytokinovému receptoru se budou také moci použít k vytvoření anti-idiotypických protilátek. Tyto protilátky bude možné použít při detekci nebo diagnostice různých imunologických podmínek vztažených k expresi proteinu nebo buněk, které exprimují uvedený protein. Uvedené buňky se mohou také použít jako agonisté nebo antagonisté ligandu, který může být kompetitivním inhibitorem receptoru nebo substituentem přirozeně se vyskytujících ligand. Jisté protilátky proti podjednotkám receptoru nebo kombinacím mohou sloužit jako aktivační protilátky, které mohou působit signalizaci, čímž slouží například jako agonisté ligandu.
Protein receptoru cytokinů, který se specificky váže nebo je specificky imunoreaktivní s protilátkou vytvořenou proti definovanému imunogenu, jako je imunogen obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, je v typickém případě stanoven pomocí imunologického testu. Imunologický test v typickém případě používá polyklonální antisérum, které se vytvořilo například proti proteinu se sekvencí SEQ ID NO: 2. Toto antisérum se vybralo tak, aby vykazovalo nízkou zkříženou reaktivitu s jinými členy rodiny cytokinových receptorů, jako je například podjednotka receptoru IL-12RP2 nebo podjednotka gpl30 receptoru IL-6, s výhodou ze stejných druhů a libovolná taková zkřížená reaktivita je před použitím v imunologickém testu odstraněna imunoabsorpcí.
Za účelem produkovat antisérum vhodné pro použití v imunologickém testu, se izoluje protein například se sekvencí SEQ ID NO: 2. Rekombinantní protein se může například produkovat v savčí buněčné linii. Vhodný hostitel například imbrední kmen myši, jako je Balb/c je imunizován vybraným proteinem, v typickém případě se používá standardní adjuvans, jako je Freundovo adjuvans, a standardní imunizační protokol pro myši (popisuje se v publikaci Harlow and Lané (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and practice (2d ed.) Academie Press, New York). Vjiném případě se jako imunogen může použít syntetický peptid získaný ze zde popsaných sekvencí a je konjugován s nosičovým proteinem. Shromáždila se polyklonální antiséra a titrovala se proti imunogennímu proteinu
-26CZ 304022 B6 v imunologickém testu. Použil se například imunologický test a imunogenem mobilizovaným na pevném povrchu. Polyklonální antisérum s titrem 104 nebo vyšší se vybralo atestovalo za účelem zjištění jeho zkřížené reaktivity proti členům rodiny cytokinových receptorů, jako je například gpl30 nebo IL-12RP1 za použití kompetitivního vazebného imunologického testu, jak se popisuje v publikaci Harlow and Lané (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and practice (2d ed.) Academie Press, New York na stránkách 570-573). Při tomto stanovení se používají s výhodou dva členové rodiny cytokinových receptorů. Tyto členové rodiny cytokinových receptorů se mohou produkovat jako rekombinantní proteiny a izolovaly se za použití standardní molekulové biologie a popsaných metod chemie proteinů.
Imunologické testy v kompetitivním vazebném formátu se mohou použít při stanovení zkřížené reaktivity. Protein se sekvencí SEQ ID NO: 2 se může imobilizovat na pevný podklad. Proteiny přidané do testu mohou soutěžit s navázáním antiséra s i mobilizovaným antigenem. Schopnost shora popsaných proteinů soutěžit v navázání antiséra na imobilizovaný protein se porovnává s proteiny, jako je například gpl30 nebo IL-12R32. Procento zkřížené reaktivity shora uvedených proteinů se vypočítala za použití standardního výpočtu. Vybrala se a shromáždila se antiséra se zkříženou reaktivitou nižší než 10 % pro každý protein uvedený shora v textu. Zkříženě reagující protilátky se pak odstraní ze shromážděného antiséra imunologickou absorpcí se shora uvedenými proteiny.
Imunologicky absorbovaná a shromážděná antiséra se pak použily v kompetitivním vazebném imunologickém testu, jak se popisuje shora v textu, aby se porovnal druhý protein s imunogenním proteinem (například protein podobný DCRS5 se sekvencí SEQ ID NO: 2). Za účelem uskutečnit toto porovnání, se testoval každý ze dvou proteinů v širokém rozmezí koncentrací a stanovilo se množství každého proteinu nutné k inhibici 50 % navázání antiséra na imobilizovaný protein. Jestliže nutné množství druhého proteinu je nižší než dvojnásobek množství vybraného proteinu nebo proteinu, který je nutný, pak se dá říci, že druhý protein se specificky váže na protilátku vytvořenou proti imunogenu.
Rozumí se, že tyto proteiny receptoru cytokinů jsou členové rodiny homologních proteinů, které obsahují řadu identifikovaných genů. V případě určitého genového produktu, jako je DCRS5, termín neznamená pouze zde popsané aminokyselinové sekvence, ale také jiné proteiny, které jsou alelické, nealelické nebo druhové varianty. Rozumí se, že termíny zahrnují nepřirozené mutace zavedené záměrnou mutací za použití běžné rekombinantní technologie, jako jsou mutace v jedné poloze nebo vystřiženým krátkých sekcí DNA kódující proteiny nebo substitucí nových aminokyselin nebo přidáním nových aminokyselin. Takové minoritní změny v typickém případě v podstatě udržovat imunologickou shodu původní molekuly a/nebo svou biologickou aktivitu. Tak tyto změny zahrnují proteiny, které jsou specificky imunoreaktivní s označenými přirozeně se vyskytujícím proteinem DCRS5. Biologické vlastnosti změněných proteinů se mohou stanovit expresí proteinu ve vhodné buněčné linii a měřením vhodného účinku například na transfekovaných lymfocytech. Určité minoritní úpravy proteinu zahrnují konzervativní substituci aminokyselin s podobnými chemickými vlastnostmi, jak se popisuje shora v textu v případě rodiny cytokinových receptorů jako celku. Srovnáním proteinu s proteinem cytokinových receptorů a použitím běžných zde popsaných imunologických testů za účelem stanovení imunologické shody je možné stanovit složení proteinu podle vynálezu.
Protilátky vytvořené proti podjednotkám receptoru mohou sloužit k prostorovému zablokování navázání ligandu na funkční receptor. Takové protilátky se mohou vytvořit buď proti samotné podjednotce nebo proti kombinaci DCRS5 sIL-12Rpl. Výsledkem by měly být antagonisté protilátek.
-27CZ 304022 B6
VII. Sady, diagnózy a kvantifikace
V sadách a v testech podle vynálezu je možné použít přirozeně se vyskytující a rekombinantní formy molekul podobných receptorů cytokinů popsaných shora v textu. Tyto metody se mohou také aplikovat při testování vazebné aktivity, například ligandů, v případě uvedených proteinů.
V současné době se vyvinulo několik metod automatického testování, které umožňují testování desetitisíců sloučenin v jednom roce (popisuje se v publikaci BIOMEK automated workstation, Beckman Instruments, Palo Alto, California a Fodor, et al., (1991) Science 251: 767-773). Později se popisují způsoby testování vazebných schopností velkého množství definovaných polymerů syntetizovaných na pevném substrátu. Vývoj vhodných testů k testování ligandů nebo agonistických/antagonistických homologních proteinů je umožněn schopností izolovat velké množství izolovaných, rozpustných cytokinových receptorů v aktivním stádiu.
Při testování shora popsaných ligandů je možné izolovaný DCRS5 vázat přímo na destičky. Avšak protilátky, které nemají neutralizační účinek vůči uvedeným proteinům, se mohou použít jako záchytné protilátky k imobilizaci receptorů na pevné fázi, což se dá využít pro diagnostické účely.
Vynález dále popisuje použití DCRS5, jeho fragmentů, peptidů a jejich fuzních produktů v různých diagnostických sadách a metodách při detekci přítomnosti proteinu nebo jeho ligandu.
V jiném případě nebo navíc protilátky proti molekulám mohou být začleněny do sad a mohou se použít při různých metodách. V typickém případě sada bude mít nádobku obsahující buď peptid DCRS5 nebo segment genu nebo činidlo, které rozeznává peptid nebo genový segment.
V typickém případě rozeznávací činidlo v případě peptidů bude receptorem nebo protilátkou nebo v případě genového segmentu by jím obvykle mohla být hybridizační sonda. Jiné složky sady mohou zahrnovat jiné proteiny nebo činidla příbuzná s polypeptidy p40, IL-B30 nebo IL-12Rpi párování ligand/receptor.
Výhodná sada pro stanovení koncentrace DCRS5 ve vzorku bud v typickém případě obsahovat značenou sloučeninu, například ligand nebo protilátku, která vykazuje známou vazebnou afinitu pro DCRS5, zdroj DCRS5 (přirozeně se vyskytující nebo rekombinantní) jako pozitivní kontrolu a prostředky pro separaci navázaných sloučenin od volných nevázaných sloučenin, což je například pevná fáze pro imobilizaci DCRS5 v testovaném vzorku. V normálním případě sada obsahuje nádobky obsahující činidla a instrukce. Také jsou připraveny sady obsahující vhodnou nukleovou kyselinu nebo protein.
Protilátky zahrnující fragmenty vázající antigen specifické pro savčí DCRS5 nebo peptidový fragment nebo fragmenty receptorů jsou použitelné při diagnostických aplikacích za účelem detekce přítomnosti zvýšeného množství ligandu a/nebo jeho fragmentů. Diagnostické testy mohou být homogenní (bez kroku separace mezi volným činidlem a komplexem protilátkaantigen) nebo heterogenní (s krokem separace). Existují různé běžné testy, jako je radioimunologický test (RIA), test ELISA, enzymatický imunologický test (EIA), test EMIT, substrátový imunologický test za použití fluorescenčního značení (SLFIA) a podobně. Neznačené protilátky mohou být použity jako sekundární protilátky, které jsou značeny a které rozeznávají protilátky vůči receptorů cytokinu nebo kjeho určitému fragmentu. Tyto testy se také velmi diskutují ve vědecké literatuře (popisuje se například v publikaci Harlow and Lané (1988) Antibodies: A laboratory manual, CSH a Coligan (ed. 1991 and periodic supplements) Current protocols in immunology greene/Wiley, New York).
Anti-idiotypické protilátky mohou mít podobné použití. Mohou sloužit jako agonisté nebo antagonisté receptorů cytokinů. Mohou se také použít za vhodných okolností jako terapeutická činidla.
Činidla pro diagnostické testy jsou často dodávány přímo v sadách, aby se optimalizovala citlivost testu. Předmětem vynálezu v závislosti na podstatě testu je také protokol a značící
-28CZ 304022 B6 činidlo, značené nebo neznačené protilátky nebo značený ligand. To je obvykle v kombinaci s jinými aditivy, jako jsou pufry, stabilizátory, materiály nezbytné pro produkci signálu, jako jsou substráty pro enzymy a podobně. Sada bude s výhodou obsahovat instrukce pro použití a likvidaci činidel po použití. V typickém případě sada obsahuje nádoby pro každé použitelné činidlo a bude obsahovat instrukce pro vhodné použití a likvidaci činidel. Je-li to nutné činidla se budou vyskytovat jako suchý lyofilizovaný prášek, přičemž se činidla dají uvést do vodného média a tak dosáhnout správné koncentrace pro uskutečnění testu.
Shora v textu uvedené konstituenty diagnostických testů se mohou použít bez úpravy nebo se mohou upravovat různými způsoby. Například značení se může provést kovalentním nebo nekovalentním spojením části, která přímo nebo nepřímo poskytuje detekovatelný signál. V řadě uvedených testů testovaná sloučenina, receptor cytokinu nebo jejich protilátky se mohou značit buď přímo nebo nepřímo. Možnosti přímého značení zahrnují značící skupiny: radioaktivní značení, jako je 125I, enzymy (popisuje se v patentovém dokumentu USA 3 645 090), jako je peroxidáza a alkalická fosfatáza a fluorescenční značky (popisuje se v patentovém dokumentu USA 3 940 475) schopné monitorovat změny intenzity fluorescence, posun vlnové délky nebo polarizaci fluorescence. Pravděpodobnost nepřímého značení zahrnuje značení jedné složky biotinem, pak následuje navázání na avidin, který je spojený s jednou ze shora popsaných skupin.
Existuje řada metod separace navázaného ligandů od volného ligandů nebo v jiném případě navázané sloučeniny od volné testované sloučeniny. Cytokinový receptor se může imobilizovat na různých matricích, po kterých následuje promytí. Vhodné matrice zahrnují plasty, jako jsou destičky vhodné pro test ELISA, filtry a částice. Metody imobilizující receptor na matrici zahrnují přímou adhezi na plast, použití záchytových protilátek, chemické spojování a biotin avidin. Poslední krok uvedeného přístupu zahrnuje srážení komplexu protilátka/antigen libovolnou z několika metod zahrnující tu, která používá například organické rozpouštědlo, jako je polyethylenglykol nebo sůl, jako je sulfát amonný. Jiné vhodné separační postupy zahrnují bez omezení metodu používající magnetizovatelné částice fluoresceinem značených protilátek, jak se popisuje v publikaci Rattle et al., (1984) Clin. Chem. 30(9): 1457-1461 a dvojitou protilátkovou separaci za použití magnetických částic (popisuje se v patentovém dokumentu USA 4 659 678).
Popisují se způsoby pro navázání proteinu nebo fragmentů na různé značky, které se dostatečně popisují v literatuře a nevyžadují další diskuzi. Řada technik pro vznik vazby používá aktivovaných karboxylových skupin buď použitím karbodiimidu nebo aktivních esterů za vzniku peptidových vazeb, vytvoření thioetherů reakcí merkaptoskupiny s aktivovaným halogenem, jako je chloroacetyl nebo aktivovaný olefin, jako je maleimid. Podle vynálezu se může také použít metoda fuze proteinů.
Jiný diagnostický přístup podle vynálezu zahrnuje použití oligonukleotidové nebo polynukleotidových sekvencí získaných ze sekvence cytokinového receptorů. Tyto sekvence se mhou použít jako sondy pro detekci cytokinového receptorů u pacientů, u kterých se předpokládají imunologické poruchy. V literatuře se popisuje a diskutuje příprava nukleotidových sekvencí RNA a DNA, značení sekvencí a výhodné místo sekvencí. V normálním případě oligonukleotidová sonda by měla mít alespoň 14 nukleotidů, obvykle alespoň přibližně 18 nukleotidů a polynukleotidové sondy mohou být velikosti až několik kilobází. Mohou se použít různá značení, nejběžnější jsou radionukleotidy, zvláště 32P. Pro zavedení do polynukleotidů se mohou také použít nukleotidy upravené použitím biotinu. Biotin pak slouží jako místo pro navázání na avidin nebo protilátky, které se mohou značit rozmanitými druhy značících činidel, jako jsou radionukleotidy, fluorescenční činidla, enzymy nebo podobně. V jiném případě se mohou použít protilátky, které mohou rozpoznávat specifické duplexy, které zahrnují duplexy DNA a RNA, DNA a RNA hybridní duplexy nebo duplexy DNA a protein. Protilátky naopak mohou být značeny a testovány za účelem zjištění, kde je na povrchu vázán duplex tak, že na základě vytvoření duplexu na povrchu, je možné detekovat přítomnost protilátek na povrchu duplexu. Použití sond vůči nové antimediátorové RNA se může provést běžnými technikami, jako je hybridizace nukleových kyselin, testování plus a mínus, testování rekombinantními sondami,
-29CZ 304022 B6 translace za uvolnění hybridů (HRT) a translace blokovaná hybridem (HART). Tyto techniky také zahrnují amplifikaění metody, jako je polymerázová řetězcová reakce (PCR).
Vynález popisuje diagnostické sady, které se používají k testování přítomnosti kvalitativní nebo kvantitativní přítomnosti jiných markérů. Diagnóza a prognóza může záviset na kombinaci značících činidel (popisuje se v publikaci Viallet et al., (1989) Progress in growth factor res. 1: 89-97). Detekce polymorťních variant, které mohou odrážet rozdíly signalizace funkčního receptorů se mohou použít při stanovení terapeutické strategie. Variace, které odráží větší nebo menší odezvu na ligand umožňují vybrání pacientů, kteří vykazují nebo nevykazují odezvu.
VIII. Terapeutické využití
Vynález popisuje činidla s podstatnou terapeutickou hodnotou (popisuje se v publikaci Levitzki (1996) Curr. Opin. Cell Biol. 8: 239-244). Cytokinové receptory (přirozeně se vyskytující nebo rekombinantní), jejich fragmenty, receptory muteinu a protilátky spolu se sloučeninami, u nichž se ukázalo, že mají vazebnou afinitu vůči receptorům nebo protilátkám, by se měly použít při léčbě stavů, které vykazují abnormální expresi receptorů nebo jejich ligandů. Taková abnormalita se v typickém případě projevuje imunologickými poruchami (popisuje se v publikaci WO 01/18051). Vynález navíc uvádí terapeutickou hodnotu při různých onemocněních spojených s abnormální expresí nebo spouštěním odezvy vůči Iigandu. Naznačuje se, že například ligand p40/IL B30 se podílí na vývoji imunity zprostředkované buňkou, například protinádorové aktivity, vyvolání humorální a buněčné imunity a antivirových účinků. Ukazuje se, že ligand aktivuje buňky NK a T. Terapie může být kombinována sIL-18, IL-12, TNF, IFNy, radiaci/chemoterapii, adjuvans nebo antinádorovými, antivirovými nebo antifungicidními látkami.
V opačném případě antagonisté, které se mohou kombinovat s antagonisty TNF, IFNy, IL-18 nebo IL-12 nebo s IL—10 nebo steroidy mohou být indikovány u chronických onemocněních zprostředkovanými Thl, u autoimunity nebo při transplantaci nebo/a odmítnutí transplantátu, při roztroušené skleróze, lupénce, chronických zánětlivých stavech, revmatické artritidě, osteoartritidě nebo zánětlivém onemocnění střev. Antagonisté mohou mít formu protilátek proti podjednotkám receptorů, konstrukcím rozpustného receptorů nebo antisense nukleovým kyselinám vůči jedné nebo více podjednotek receptorů. Párování Iigandu p40/IL-B30 s podjednotkami receptorů DCRS5 a IL-12RP1 umožňuje proniknutí do použití agonistů a antagonistů.
Při terapii je možné na základě popsaných aktivit p40/IL-B30 ovlivnit antagonisty cytokinů, například pomocí rozpustného DCRS5 za přítomnosti rozpustného IL-12RP1 nebo bez jeho přítomnosti nebo pomocí protilátek vůči jejich podjednotce receptorů. Antagonisté se mohou použít jako inhibitory nežádoucí imunitní nebo zánětlivé odezvy, k cílení paměti buněk T nebo v kombinaci s antagonisty IL-12/IL-12R nebo s jinými protizánětlivými činidly nebo imunosupresory. Klinické indikace mohou být chronické zánětlivé nebo transplantační stavy. Různé polymorfizmy mohou zesílit nebo zeslabit funkci receptorů a jestli jsou dominantní, mohou se použít jako terapeutická činidla. Identifikace takových variant umožňuje určit pacienty vykazující nebo nevykazujících odezvu. Činidla se mohou použít jako detekční nebo značící činidla nebo ablační činidla pro paměť buněk T a/nebo NK.
Genová terapie může poskytovat požadovanou odezvu buněčných populací vůči Iigandu p40/IL-B30, jako je například adjuvans pro nádorovou imunoterapii, které umožňuje aktivaci lymfocytů, buněk T nebo NK infiltrujících se do nádoru. Antisense strategie se může aplikovat například za účelem prevence citlivosti receptorů.
U buněčných typů, které vykazují testem northemova přenosu produkci mRNA IL-12 p40 a/nebo IL-B30, jsou známy různé abnormální stavy (popisuje se v publikaci Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck and Co., Rahway, N. J., Thom, et al., Harrison's
-30CZ 304022 B6 principles of intemal medicine, McGraw-Hill, N.Y. a Weatherall, et al., (eds.) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Řada jiných zdravotních stavů a onemocnění bude vykazovat na léčbu zde popsaného agonisty nebo antagonisty (popisuje se v publikaci Stites and Terr (eds. 1991) Basic and Clinical Immunology Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut, aSamter, et al., (eds.) Immunological Diseases Little, Brown and Co.). Jiné pravděpodobné indikace léčby zahrnují přeměnu kostí, sexuální dysfunkci, prevenci neurodegenerativního onemocnění, demenci, stres a jiná onemocnění. Tyto problémy by měly být citlivé vůči prevenci nebo léčbě za použití zde popsaných sloučenin.
Mohou se izolovat rekombinantní cytokinové receptoiy, muteiny, agonistické nebo antagonistické protilátky nebo protilátky, které se pak aplikují pacientovi. Tato činidla se mohou kombinovat pro terapeutické účely s dalšími aktivními činidly například v přijatelných nosičích nebo ředidlech spolu s fyziologicky neškodnými stabilizátory a ekcipienty. Tyto kombinace mohou být sterilní (sterilizuje se například filtrací) a mohou tvořit dávkové formy například lyofilyzáty v kompartmentech nebo stabilizované vodné přípravky. Vynález dále také popisuje použití protilátek nebo jejich vazebných fragmentů, které se naváží na komplement.
Testování ligandů za použití receptorů cytokinů nebo jeho fragmentu se může uskutečnit za účelem identifikovat molekuly vykazující vazebnou afinitu vůči receptorům. Následné biologické testy se mohou pak použít ke stanovení, zda putativní ligand může poskytnout kompetitivní navázání, které může blokovat skutečnou stimulující aktivitu. Fragmenty receptorů se mohou použít jako blokační činidla nebo jako antagonisté, přičemž blokují aktivitu ligandů. Sloučenina vykazující intrinsickou stimulující aktivitu může aktivovat receptor a je tak antagonistou tím, že stimuluje aktivitu ligandů, který například indukuje signál. Vynález dále popisuje terapeutické použití protilátek proti receptorům cytokinů jako antagonistů.
Množství činidel nezbytných pro účinnou terapii bude záviset na řadě různých faktorů, které zahrnují způsoby aplikace, cílové místo, fyziologickou životnost činidla, farmaceutickou životnost činidla, fyziologický stav pacienta a jiné aplikované léčiva. Léčebné dávky by se měly titrovat za účelem optimalizace bezpečnosti a účinnosti. V typickém případě dávky užívané in vitro mohou být nápomocné při stanovení množství uvedených činidel použitelných při aplikaci in sítu. Testování dávek účinných pro léčbu určitých poruch na zvířatech poskytne další pomoc při stanovení lidské dávky. Různé možnosti se popisují v publikaci Gilman, et al., (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The pharmacological bases of therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press, a Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 17 th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn). Diskutují se zde metody aplikace. Jsou to například orální, intravenózní, intraperitoneální nebo intramuskulámí aplikace, transdermální difúze a jiné. Farmaceuticky přijatelné nosiče budou zahrnovat vodu, fyziologický roztok, pufry a jiné sloučeniny popsané například v publikaci Merck Index, Merck and Co., Rahway, New Jersey. Vzhledem k pravděpodobné vysoké afinitě navázání nebo číslu přeměny mezi putativním ligandem a jeho receptory, se očekává, že na počátku bude účinná nízká dávka uvedených činidel. Signalizační dráha naznačuje, že může být účinné extrémně malé množství ligandů. Očekává se, že rozmezí dávky je množství nižší než lmM koncentrace, v typickém případě nižší než přibližně koncentrace ÍOmM, obvykle nižší než přibližně lOOnM, s výhodou nižší než přibližně ÍOpM a nej výhodnější je množství nižší než koncentrace lfM (femtomolámí) s vhodným nosičem. V případě kontinuální aplikace se často používají prostředky nebo přístroj umožňující pomalé uvolňování.
Receptory cytokinů, jejich fragmenty a protilátky nebo jejich fragmenty, antagonisté a agonisté se mohou aplikovat přímo hostiteli, který se bude léčit, nebo v závislosti na velikosti sloučenin může být nutné konjugovat před aplikací molekuly s nosičovými proteiny, jako je ovalbumin nebo sérový albumin. Terapeutické prostředky se mohou aplikovat v řadě běžných dávkových formách. Zatímco je možné aplikovat samotnou aktivní složku, je výhodné ji prezentovat jako farmaceutický prostředek. Prostředky obsahují alespoň jednu aktivní složku, jak se definuje shora v textu, spolu s jedním nebo více přijatelnými nosiči. Každý nosič může být jak farmaceuticky tak fyziologicky přijatelný v tom smyslu, že je kompatibilní s dalšími složkami a není škodlivý
-31 CZ 304022 B6 pro pacienta. Prostředky zahrnují ty určené pro orální, rektální, nasální nebo parenterální (zahrnující subkutánní, intramuskulámí, intravenózní a intradermální) aplikaci. Prostředky se mohou běžně vyskytovat v jednotkové dávce a mohou se připravovat metodami známými v oboru farmacie (popisuje se například v publikaci Gilman, et al., (eds. 1990) Goodman and Gilmanů: The pharmacological bases of therapeutics, 8 th Ed., Pergamon Press, a Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 17 th ed. (190), Mack Publishing Co., Easton, Penn, Avis et al., (eds 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY, Lieberman, et al., (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY a Lieberman, et al., (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. Terapie podle vynálezu se může kombinovat nebo použít ve spojení sjinými terapeutickými činidly, zvláště agonisty nebo antagonisty jiných členů rodiny cytokinových receptorů.
IX. Testování
Testování léku za použití DCRS5 nebo jeho fragmentu se může uskutečnit za účelem identifikace sloučenin, které vykazují vazebnou afinitu na podjednotku receptoru zahrnující izolaci asociovaných komponentů. Následné biologické testy se mohou pak využívat ke stanovení, zda sloučenina vykazuje intrinsickou stimulující aktivitu a působí proto jako blokační činidlo nebo antagonista, čímž blokuje aktivitu ligandů.
Avšak párování ligandů p40/IL-B30 s funkčním receptorem DCRS3 slL-12Rpi, umožňuje testování za účelem zjištění antagonistů a agonistů s pozitivní kontrolou signálu. Může se uskutečnit testování malých molekul nebo protilátek.
Jedna metoda testování léků využívá eukaryontní nebo prokaryontní hostitelské buňky, které se stabilně transformují s molekulami rekombinantní DNA exprimující DCRS5 v kombinaci s jinou podjednotkou cytokinového receptoru, jako je například IL-12Rpi. Věří se, že signalizace používá STÁT 4. Mohou být izolovány buňky, které exprimují receptor separovaný od jiných funkčních receptorů. Takové buňky, buď v životaschopné nebo imobilizované formě, se mohou použít v případě standardního vazebného testu protilátka/antigen nebo ligand/receptor. V publikaci Parce et al., (1989) Science 246: 243-247 a Owicki, et al., (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. UAS 87: 4007-4011 se popisují citlivé metody detekující buněčné odezvy. Kompetitivní testy je možné zvláště použít v případě, že buňky přicházejí do kontaktu a inkubují se se značeným receptorem nebo protilátkou vykazující známou vazebnou afinitu vůči ligandů. Protilátka značená 125I přichází do kontaktu s testovaným vzorkem, jehož vazebná afinita vůči vazebné sloučenině se měří. Vázané a volné značené vazebné sloučeniny se pak separují, aby se odhadl stupeň navázání ligandů. Množství testované vázané sloučeniny je nepřímo úměrný množství značeného receptoru vázajícího se na známý zdroj. K separaci vázaného ligandů od volného ligandů za účelem zjištění stupně navázání ligandů. Tento krok separace se v typickém případě podílí na postupu, jako je adheze na filtry následovaná promýváním, adheze na plast následovaná promýváním nebo centrifugací buněčných membrán. Životaschopné buňky by se mohly také použít k testování účinků léků na funkce zprostředkované cytokinem, jako je například signalizace STAT4 a jiné. Některé detekční metody umožňují eliminovat krok separace, například použitím citlivého detekčního systému.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Obecné metody
Některé ze standardních metod se popisují například v publikaci Maniatis, et al., (1982) Molecular Clonning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY nebo Ausubel, et al., (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular
-32CZ 304022 B6
Biology, Greene/Wiley, New York. Metody čištění proteinů zahrnují takové metody, jako je srážení síranem amonným, kolonová chromatografie, elektroforéza, centrifugace, krystalizace a jiné (popisuje se v publikaci Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY nebo Ausubel, et al., (1987 a periodické doplňky) Current Protocols in Molecular Biology,
Greene/Wiley, New York, Deutscher (1990) Guide to protein purification, Methods in Enzymology, vol. 182 a jiné díly v této sérii, manuály od výrobce popisující použití produktů izolace proteinů (Pharmacia, Piscataway, N. J. nebo Bio-Rad, Richmond, CA). Kombinace s rekombinantními metodami umožňující fuze s vhodnými segmenty, například se sekvencí FLAG nebo s ekvivalentem, který může být fúzován prostřednictvím sekvence, kterou je možné io odstranit proteinázou (popisuje se v publikaci Hochuli (1990), Purification of recombinant proteins with metal chelate absorbent, Setlow (ed.) Genetic Engeneering, Principle and Methods 12: 87-98, Plenům Press, N.Y. a Crowe, et al., (1992) QIA express: The high level expression and Protein purification systém QUIAGEN, lne., Chatsworth, CA).
Počítačová analýza sekvence se uskutečnila například použitím softwarových programů, které zahrnují programy pocházející zGCG (U. Wisconsin) a ze zdrojů GenBank. Také se použila veřejná databáze sekvencí, jako je například GenBank a jiné.
Řada metod aplikovatelných na receptory IL-10 se mohou aplikovat na DCRS5, jak se popisuje v patentovém dokumentu 5 789 192 (receptor IL-10).
Příklad 2: Funkční klonování
Zjistilo se, že protilátky proti hIL-12Rpl blokovaly odezvy lidských buněk T na p40/IL-B30 a p40/IL-B30 vázaný na IL-12Rpl. To naznačuje, že IL-12Rp 1 je jedna podjednotka receptorového komplexu pro p40/IL-B30.
Identifikovala se jedna populace T buněk, která odpovídá na p40/IL-B30, ale nikoliv na IL-12, a jiné populace, které odpovídají na IL-12, ale nikoliv na p40/IL-B30. Navíc se pozorovalo, že buňky Ba/F3 exprimující rekombinantní mIL-12Rpl a mIL-12Rp2 odpovídaly na IL-12, ale neodpovídaly na p40/IL-B30. Tyto výsledky kolektivně indikovaly, že receptorový komplex pro p40/IL-B30 obsahoval IL-12Rpi a alespoň jednu jinou podjednotku, kterou nebyla IL-12Rpi. Podobně expresívní klonovací strategie se navrhla, aby se izoloval druhý receptorový komponent.
Knihovna cDNA se připravila z mRNA, která se izolovala z buněk Kit225, z buněčné linie lidských buněk T závislých na IL-2, která odpovídá na IL-12 i na p40/IL-B30. cDNA se připravila použitím retrovirového expresívního vektoru pMX. Buňky Ba/F3 exprimující rekombinantní hIL-12Rpl se infikovaly touto knihovnou cDNA, nechaly se po 3 až 4 dny inkubovat v IL-3, pak se promyly a nanesly se na destičky s 96 prohlubněmi s koncentrací přibližně 15 000 buněk na jednu prohlubeň v kultivačním médiu obsahujícím 50ng/ml hyperhp40/hIL-B30 (popisuje se v publikaci WO 01/18051). Kultury se doplňovaly každých 5 dní dalším hyper-hp40/hIL-B30. Přibližně po dvou týdnech 5 až 10 % prohlubní vykazovalo růst buněk. Shromáždily se buňky z každé prohlubně, jednotlivě se expandovaly do větších kultur v hyper-hp40/hIL-B30 a testovala se závislost jejich růstu na hyper-hp40/hIL-B30.
U buněk, jejichž růst závisel na p40/IL-B30, se analyzovala pomocí PCR přítomnost inzertů retrovirové cDNA. Ze 40 analyzovaných izolátů pouze jeden obsahoval cDNA kódující nový receptor DCRS5. Tento kandidát lidské cDNA se klonoval do expresívního vektoru atransfekoval se do buněk Ba/F3 exprimujících hIL-12Rpi. Tyto buňky začaly vykazovat odezvu na p40/IL-B30, což ukazuje, že nová cDNA kóduje požadovaný CDRS5, funkčně receptorovou jednotku IL-B30.
-33CZ 304022 B6
Příklad 3: Rysy proteinu DCRS5 plné délky, lokalizace na chromozomu
Cytoplazmatická oblast DCRS5 není blízce příbuzná jiným cytoplazmatickým oblastem cytokinového receptorů. Cytoplazmatická oblast obsahuje sedm zbytků tyr, alespoň tři z nich jsou částí rozeznatelných vazebných motivů SH2: YEDI, YKPQ a YFPQ. Motiv YEDI je podobný identifikovaným vazebným místům pro tyrozinovou fosfatázu shp2. Pozdější dva motivy jsou velice podobné sekvencím známým tím, že váží Statl/Stat3 nebo Statí. Motiv YKPQ spolu s nejbližšími sousedícími sekvencemi se také podobá stupni motivů v Stat4 a IL-12R32, o kterém se ví, že se váže na Statl-3. To souhlasí s dosavadními daty, která naznačují, že p40/IL-B30 jako IL—12 aktivuje Stat4.
Primery PCR získané ze sekvence DCRS5 se používají pro testování knihovny lidské cDNA. Sekvence se mohly získat například z tabulky č. 1, s výhodou jsou ty sekvence přilehlé ke koncům sekvencí. cDNA plné délky odpovídající DCRS5 primáta, hlodavce nebo jiných druhů se klonovala například testováním DNA hybridizace fága XgtlO. Reakce PCR se provedly použitím DNA polymerázy Taqplus z mikroorganizmu T.aquaticus (Stratagene) za vhodných podmínek.
Připravily se smíry chromozomů. Hybridizace in šitu se provedla s chromozomy získanými z lidských Iymfocytů stimulovaných fytohemaglutininem kultivovaných po dobu 72 hodin. 5-bromodeoxyuridin se přidával během posledních sedmi hodin kultivace (60 pg/ml kultivačního média), aby se zajistila dobrá viditelnost pruhů chromozomální DNA po hybridizaci.
Fragment PCR amplifikovaný pomocí primerů se klonoval do vhodného vektoru. Vektor je značen posunem jednořetězcového zlomu s 3H. Radioaktivně značená sonda se hybridizovala s metafázovým smírem v konečné koncentraci 200 ng/ml hybridizačního roztoku, jak se popisuje v publikaci Mattei, et al., (1985) Hum. Genet. 69: 327-331.
Po potažení jadernou emulzí (KODAK NTB2) se sklíčka exponovala. Aby se zabránilo sklouznutí libovolných částic stříbra během páskovací zobrazovací metody, chromozomální smír se nejdříve obarví pufrovaným roztokem Giemsa a metafáze se vyfotografuje. R-páskování se pak uskuteční metodou fluorochrom-fotolyze-Giemsa (FPG) a metafáze se před analýzou opět vyfotografuje.
V případě jiných druhů se používají podobné vhodné metody.
Příklad 4: Lokalizace mRNA DCRS5
Lidská mnohotná tkáň (kat.č. 1,2) a bloty buněčných linií zhoubného bujení (kat. č. 7751-7) obsahující přibližně 2 pg poly(A)+RNA v jedné dráze se získaly od firmy Clontech (Palo Alto, CA). Sondy se značily radioaktivně pomocí [a-32P]dATP, například použitím značících sad Amersham Rediprime náhodných primerů (RPN1633). Prehybridizace a hybridizace se provedly například při teplotě 67 °C v 0,5M Na2HPO4, 7% SDS, 0,5M EDTA (pH 8,0). Promývání za vysoké přísnosti se provedlo například při teplotě 65 °C, kdy na začátku se promývání opakuje dvakrát za podmínek 2x koncentrovaný SSC, 0,1 % SDS po dobu 40 minut, pak následuje promytí 0,lx koncentrovaným SSC, 0,1 % SDS po dobu 20 minut. Membrány se pak ozářily paprsky X na film Kodak při teplotě 70 °C za použití štítu, který zesiluje záření. Detailnější studie pomocí metody Southemovy hybridizace knihovny cDNA se provedla s vybranými vhodnými klony lidského DCRS5, kdy se testovala exprese v krvetvorných nebo jiných buňkách.
V jiném případě se z tabulky č. 1 vybraly dva vhodné primery. RT-PCR se použily při testování vhodného vzorku mRNA za účelem zjištění přítomnosti message k produkci cDNA, například vzorek, který exprimuje gen.
-34CZ 304022 Β6
Klony v plné délce se mohou izolovat hybridizací knihoven cDNA z vhodných tkání předem vybraným signálem PCR. Mohou se provést northem bloty.
Mesage vhodné pro geny kódující DCRS5 se budou testovat vhodnou technologií, například pomocí PCR, imunologickými testy, hybridizací nebo jinými způsoby. cDNA tkáně nebo orgánů je možné získat od firmy například Clontech, Mountain View, CA. Jak se popisuje, je možné použít identifikace zdrojů přirozené exprese. Stanovení párování funkčních receptorových podjednotek umožňuje předpovědět, co buňky exprimují při kombinaci receptorových podjednotek, jejichž odpovědí je fyziologická odezva na každý cytokinový ligand.
V případě distribuce u myší se provedla například Southemova analýza. DNA (v množství 5 pg) z primárně amplifikované knihovny cDNA se štěpila vhodnými restrikčními enzymy, aby se uvolnily inzerty, nechaly se dělit na 1% agarózovém gelu a přenesly se na nylonovou membránu (Schleicher and Shuell, Keene, NY).
Vzorky izolace mRNA z myší mohou zahrnovat buněčnou linii myších fibroblastových buněk L (C200), buňky transfekované BrafiER (Brafova fuze s receptorem estrogenu), kontrola (C201), T buňky THI polarizované („Mell4 bright“, buňky CD4+ pocházející ze sleziny se polarizovaly po dobu 7 dní pomocí IL-4 a anti-IFN-γ, T201), T buňky vysoce polarizované THI (popisuje se v publikaci Openshaw, et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1357-1367, aktivované santi-CD3 po dobu 2, 6 a 16 hod, T201) T buňky vysoce polarizované TH2 (popisuje se v publikaci Openshaw, et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1357-1367, aktivované anti-CD3 po dobu 2, 6, 16 hod, T203), CD44-A2D25+pre T buňky, získané z brzlíku (T204), THI T buňky klon Dl.l nechávají se v klidu po dobu 3 týdnů po poslední stimulaci antigenem (T205), buňky THI T klon Dl.l, které se stimulovaly ConA v koncentraci 10 pg/ml po dobu 15 hod (T206), buňky TH2 T klon CDC35, které se stimulovaly ConA v koncentraci 10 pg/ml (T208), naivní buňky Mell4+ pocházející ze sleziny (T209), T buňky Mell4+ polarizované na Thi pomocí IFN-y/IL-12/anti-IL-4 po dobu 6, 12, 24 hod (T210), buňky T mell4+ polarizované na Th2 pomocí IL-4/anti-IFN-y po dobu 6, 13, 24 hod (T211), nestimulované přirozené buňky B buněčné linie A20 (B200), nestimulovaná buněčná linie buněk B CHI2 (B201), nestimulované velké buňky B pocházející ze sleziny (B202), buňky B pocházející z celé sleziny aktivované pomocí LPS (B203), dendritické buňky obohacené metrizamidem pocházející ze sleziny (D200), dendritické buňky pocházející z kostní dřeně (D201), monocytická buněčná linie RAV 264.7 aktivovaná s LPS po dobu 4 hod (M200), makrofágy z kostní dřeně získané pomocí GM a M-CSF (M201), buněčná linie makrofágů J774 (M202), buněčná linie makrofágů J774+LPS-anti-IL-10 shromažďované po při 0,5, 1, 3, 6, 12 hod (M204), tkáň z plic myší imunizovaných aerosolem, primery Th2, aerosol OVA, imunizace po 7, 14, 23 hod (popisuje se v publikaci Garlisi et al., (1995) Clinical Immunology and Immunopathology 75: 75-83, X206), tkáň z plic infikovaná Nippostrongulus (popisuje se v publikaci Coffinan, et al., (1989) Science 245: 308-310, X200), Celé dospělé plíce, normální (0200), celé plíce, rag-1 (popisuje se v publikaci Schwarz, et al., (1993) Immunodeficiency 4: 249-252, 0205), IL—10 K.O. slezina (popisuje se v publikaci Kuhn et al., (1991) Cell 75: 263-274, X201), celá slezina dospělého jedince, normální (201), celá slezina, rag-1 (0207), IL-10 K.O. Peyerovy skvrny (0202), celé Peyerovy skvrny normální (0210), IL-10 K.O. mesenterické lymfoidní žlázy (X203), celé mesenterické lymfoidní žlázy, normální (0211), IL-10 K.O. střevo (X203), celé normální střevo (0212), pankreas myší NOD (popisuje se v publikaci Makino et al., (1980) Jikken Dobutsu 29: 1-13, X205), celý brzlík, rag-1 (0208), celé ledviny, rag-1 (0206), krysí normální kloubní tkáň (0300) a krysí artritická kloubní tkáň (X300).
Vzorek vhodný pro izolaci lidské mRNA může zahrnovat mononukleámí buňky periferní krve (monocyty, T buňky, buňky NK, granulocyty, buňky Β) (T100), shromážděné jednojademé buňky periferní krve aktivované pomocí anti-CD3 po dobu 2, 6, 12 hod (Tl01), T buňky THO. klon Mot 72 (T102), shromážděné T buňky THO klon Mot 72 aktivované pomocí anti-CD28 aanti-CD3 po dobu 2, 7, 12 hod (Tlil), T buňky CD4+CD45RO-T buňky polarizované po
-35CZ 304022 B6 dobu 27 dní v anti-CD28, IL-4 a anti-IFN-γ polarizované TH2 a aktivovaní pomocí anti-CD3 aanti-CD28 po dobu 4 hod (TI 16), T buňky nádorové linie Jurkat a Hut 78 (TI 17), klony T buněk, shromážděné AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, (TI 18), buňky T, náhodný klon γδ T buněk (TI 19), splenocyty (B100), splenocyty aktivované pomocí anti-CD40 a IL-4 (B101), shromážděné buňky B linií EBV WT49, RSB, JY, CVIR 721.221, RM3, HSY, (B102), linie buněk B JY aktivovaná pomocí PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 hod (B103), shromážděné klony buněk NK 20 aktivované PMA a ionomycinem po dobu 6 hod (K101), klon NKL získaný z periferní krve pacienta trpícího leukémií LGL, kterému se aplikovalo IL-2 (K106), NK cytotoxický klon 640-A30-1 (K107), krvetvorná prekurzorová buněčná linie TF1 aktivovaná pomocí PMA a ionomycinu po dobu 1, 6 hod (Cl00), U937 premonocytická linie (Ml00), shromážděná premonocytická linie (U937) aktivovaná pomocí PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 hodin (Ml01), shromážděné rozdružené monocyty aktivované pomocí LPS, IFNy, anti-IL-10 po dobu 1, 2, 6, 12, 24 hod (Ml02), rozdružené monocyty aktivované pomocí LPS, IFNy, anti-IL-10 po dobu 1, 2, 6, 12, 24 hod (Ml02), shromážděné rozdružené monocyty aktivované pomocí LPS, IFNy, anti-IL-10 po dobu 1, 2, 6, 12, 24 hod (M103), shromážděné rozdružené monocyty aktivované pomocí LPS, IFNy, anti-IL-10 po dobu 4, 16 hod (Ml 06), shromážděné rozdružené monocyty aktivované pomocí LPS, IFNy, anti-IL-10 po dobu 4 a 16 hod (Ml07), rozdružené monocyty aktivované pomocí LPS, po dobu 1 hod (Ml08), rozdružené monocyty aktivované pomocí LPS, po dobu 6 hod (Ml09), DC 70 % CDla+ z CD34+GM-CSF, TNFa 12 dní, (D101), DC 70 % CDla+ z CD34+GM-CSF, TNFa 12 dní, aktivované pomocí PMA a ionomycin po dobu 1 hod (D102), DC 70 % CDla+ z CD34+GMCSF, TNFa 12 dní, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 6 hodin (Dl03), shromážděné DC 95 % CDla+ z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní FACS, aktivované pomocí PMA a ionomycin po dobu 1, 6 hodin (D104), shromážděné DC 95 % CD14+ zex CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní FACS, aktivované pomocí PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 hodin (Dl05), shromážděné DC CDla+ CD86+ zCD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní FACS, aktivované pomocí PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 hodin (Dl06), DC zmonocytů GM-CSF, IL-4 5 dní (Dl07), DC zmonocytů GM-CSF, IL-4 5 dní (Dl08), shromážděné DC zmonocytů GM-CSF, IL-4 5 dní aktivované LPS po dobu 4, 16 hodin (Dl09), shromážděné DC z monocytů GM-CSF, IL-4 5 dní aktivované TNFa, monocyty supe po dobu 4,16 hodin (Dl 10), benigní nádor leiom LI 1 (X101), normální myometrium M5 (0115), maligní leiomyosarkom GS1 (XI03), shromážděná linie sarkomu plicního fibroblastů MRC5 aktivované pomocí PMA a ionomycinu po dobu 1, 6 hod (Cl01), shromážděná buněčná linie karcinomu ledvinového epitelu CHA aktivovaná pomocí PMA a ionomycinu po dobu 1, 6 hod (Cl02), ledviny plodu může stán 28 týdnů (0100), plíce plodu muže stáří 28 týdnů (O101), játra plodu muže stáří 28 týdnů (0102), srdce plodu muže stáří 28 týdnů (0103), mozek plodu muže stáří 28 týdnů (0104), žlučník plodu muže stáří 28 týdnů (0106), tenké střevo plodu muže stáří 28 týdnů (0107), tuková tkáň plodu muže stáří 28 týdnů (0108), vaječníky plodu ženy stáří 25 týdnů (0109), děloha plodu ženy stáří 25 týdnů (Ol 10), varlata plodu může stáří 28 týdnů (Ol 11), slezina plodu muže stáří 28 týdnů (0112), placenta ženy stáří 25 týdnů (0109), placenta dospělého jedince (0113) a zánětlivé mandle z jedince ve věku 12 let (XI00).
Podobné vzorky se mohou za účelem hodnocení izolovat i v jiných druzích.
Příklad 5: Klonování druhových doplňků DCRS5
Aby se získaly druhové doplňky DCRS5 přednostně z jiných primátů nebo hlodavců, používaly se jiné strategie. Jednou metodou je zkřížená hybridizace za použití DNA sond úzce příbuzných druhů. To je možné použít u vývojově podobných druhů, jako intermediální krok. Jinou metodou je použití specifických primerů PCR založených na identifikaci bloků podobnosti nebo rozdílů mezi geny, jako jsou například plochy vysoce konzervativního nebo nekonzervativního polypeptidu nebo nukleotidové sekvence.
-36CZ 304022 B6
Prohledáváním databáze se mohou identifikovat podobné sekvence a umožní se produkce vhodných sond.
Příklad 6: Produkce savčího proteinu DCRS5
Provedla se vhodná funkční konstrukce, například GST, pro expresi například v mikroorganizmu E. coli. Zkonstruoval se myší plazmid IGIF pGex a transformoval se do mikroorganizmu E. coli. Čerstvě transformované buňky se kultivovaly například v médiu LB, které obsahuje ampiciiin v koncentraci 50 pg/ml, a exprese se indukovala pomocí IPTG (firma Sigma, St. Louis, MO). Po indukci přes noc se bakterie sklízely a izoloval se pelet obsahující protein DCRS5. Pelety se homogenizovaly například v pufru TE (50mM báze Tris pH 8,0, lOmM EDTA a 2mM pefabloc) o objemu 2 litrů. Tento materiál procházel třikrát přes mikrofluidizér (Microfluidics, Newton, MA). Fluidizovaný supematant se centrifugoval na rotoru Sorwall GS-3 po dobu 1 hodiny při 13 000 otáčkách za minutu. Výsledný supematant obsahující cytokinový receptorový protein se filtroval a procházel přes kolonu naplněnou glutathion-Sepharose uvedenou do rovnováhy 50mM bází Tris pH 8,0. Shromáždily se frakce obsahující fuzní protein DCRS5-GST a štěpily se například trombinem (Enzyme Research Laboratory, lne. South Bend, IN). Štěpené frakce pak prošly kolonou naplněnou Q-Sepharose, která se uvedla do rovnováhy 50mM bází Tris. Frakce obsahující DCRS5 se shromáždily a ředily se chladnou destilovanou vodou, aby se snížila konduktivita. Pak znovu prošly samotnou kolonou s čerstvou náplní Q-Sepharose nebo následovala kolona s imunoafinitní protilátkou. Spojily se frakce obsahující protein DCRS5, vytvořily se alikvoty a uchovávaly se při teplotě -70 °C.
Porovnání spektra CD s proteinem cytokinového receptoru může naznačit, že protein je správně sbalen (popisuje se v publikaci Hazuda, et al., (1969) J. Biol. Chem. 264: 1689-1693).
Příklad 7: Příprava protilátek specifických pro DCRS5
Inbrední myši Balb/c se imunizovaly intraperitoneálně s rekombinantními formami proteinu, jako je například čištěný DCRS5 nebo stabilně transfekované buňky NIH-3T3. Zvířata se imunizovala zesilující dávkou ve vhodném časovém okamžiku s proteinem, ke kterému se přidalo adjuvans, za účelem dále stimulovat produkci protilátek. Shromáždilo se sérum nebo hybridoma produkované slezinou.
V jiném případě se myši Balb/c imunizovaly buňkami transformovanými genem nebo jeho fragmentem, buď endogenními nebo exogenními buňkami nebo izolovanými membránami obohacenými expresí antigenu. Ve vhodném čase se shromáždilo sérum, v typickém případě po řadě různých aplikacích. Mohou se použít různé techniky genové terapie. Může to být například produkce proteinu in sítu za účelem vyvolání imunitní odezvy. Přípravek séra nebo protilátky se může zkříženě absorbovat nebo imunologicky vybrat za účelem přípravy podstatně izolovaných protilátek s definovanou specifitou a vysokou afinitou.
Mohou se připravit monoklonální protilátky. Splenocyty se například fúzují s vhodným fuzním partnerem a hybridomy se selektují v růstovém médiu pomocí standardních postupů. Supematant hybridomů se testoval za účelem zjištění přítomnosti protilátek, které se vážou na DCRS5, například testem ELISA nebo jiným testem. Mohou se také vytvořit nebo připravit protilátky, které specificky rozeznávají specifické provedení DCRS5.
Při jiné metodě jsou syntetické peptidy nebo izolovaný protein prezentovány imunnímu systému za účelem vytvoření monoklonálních nebo polyklonálních protilátek (popisuje se v publikaci Coligan et al., (ed. 1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Grrene a Harlow and Lané (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. Ve vhodných situacích se vazebné činidlo buď značí, jak se popisuje shora v textu například fluoresceinem nebo jiným
-37CZ 304022 B6 prostředkem, nebo se imobilizuje na substrátu v případě panoramatických metod. Nukleové kyseliny se mohou také zavést do buněk zvířat za účelem produkce antigenu, který slouží k vyvolání imunitní odezvy (popisuje se v publikaci Wang et al., (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. 90: 4156-4160, Barry, et al., (1994) BioTechniques 16: 616-619 a Xiang et al., (1995) Immunity 2: 129-135).
Příklad 8: Produkce fuzních proteinů s DCRS5
Připravily se různé funkční konstrukce s DCRS5, které zahrnují provedení kombinující DCRS5 sIL-12Rβl. Část vhodného genu se fúzovala sepitopem tag, jako například FLAG tag nebo s konstrukcí dvou hybridních systémů (popisuje se například v publikaci Fields and Song (1989) Nátuře 340: 245-246).
Epitop tag se může použít při expresivním klonovacím postupu s detekcí s protilátkami proti FLAG za účelem detekovat vazebného partnera, jako je například ligand vhodný pro cytokinový receptor. Dva hybridní systémy se mohou také použít k izolaci proteinů, které se specificky váží na DCRS5.
Příklad 9: Vztah mezi strukturou a aktivitou
Použitím standardních postupů a analýz se získaly informace o kritické úloze určitých zbytků. Provedla se standardní analýza mutageneze například vytvořením řady různých variant v určité poloze, například v polohách identifikovaných shora v textu, a hodnocením biologických aktivit variant. To je možné uskutečnit za účelem rozšířit určující polohy, které upravují aktivitu nebo ukazují na specifické polohy za účelem stanovení zbytků, které se mohou substituovat, přičemž se uchovává, blokuje nebo se upravuje biologická aktivita.
Vjiném případě analýza přirozených variant může definovat polohy, které tolerují přirozené mutace. To může vyplývat z populační analýzy variací mezi jednotlivci nebo v kmenech nebo druzích. Vzorky z vybraných jednotlivců se analyzovaly například metodou PCR a sekvenováním. To umožňuje hodnotit polymorfizmy populace.
Příklad 10: Společná exprese DCRS5 a IL-12Rpi
Vektor nebo vektory kódující geny se mohou transfekovat do buňky. Takový vektor bude s výhodou zahrnovat selekční markéry za účelem identifikace, které buňky se úspěšně transformovaly. Společná exprese dvou genů umožní genovým produktům se správně spojit a vytvořit aktivní receptorový komplex.
V alternativním případě jsou dostupné metody způsobující spojení funkčních dimerů (popisuje se v publikaci O'Shea, et al., (1989) Science 245: 646-648, Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148: 1547-1553 a Patel, et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 30386-30391). Výsledkem exprese extrabuněčných domén a fyzikální asociace, například řízená afinitou leucinového zipu Fos/Jun, budou konstrukce vázající ligand, které by měly působit jako vazebné sloučeniny vhodné pro diagnostické nebo léčebné použití.
-38CZ 304022 B6
Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2 858 párů baží (B) TYP: nukleotidová (C) DRUH ŘETĚZCE:
io (D) TOPOLOGIE (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (iii) HYPOTETICKÁ:
(iv) POZITIVNÍ:
(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primát; domníváme se, že homo sapiens (ix) ZNAKY:
(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 119..2005 (ix) ZNAKY:
(A) Název/klíč: mat_peptid (B) Pozice: 188..2005 (ix) ZNAKY:
(A) Název/klíč: misc_feature (C) Pozice: 1-2859 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
gtggtacggg aattccattg tgttgggcag ccaacaaggg tagcagcctg gctctgaagt S0 ggaattatgt gcttcaaaca ggttgaaaga gggaaacagt cttttcctgc ttccagac 118
atg Met aat Asn cak gtc act Thr att caa tgg gat Asp -15 gca Ala gta Val ata gcc Xle Ala ctt tac ata 166
Xaa Val -20 lle Gin Trp Leu -10 Tyr lle
ctc ttc agc tgg tgt cat gga gga att aca aat ata aac tgc tet ggc 214
Leu Phe Ser Trp Cys His Gly Gly lle Thr Asn lle Asn Cys ser Gly
-5 -1 1 5
cac atc tgg gta gaa cca gcc aca att ttt aag atg ggt atg aat atc 262
His Xle Trp Val Glu Pro Ala Thr Xle Phe Lys Met Gly Met Asn lle
10 15 20 25
tet ata tat tgc caa gca gca att aag aac tgc caa cca agg aaa ctt 310
Ser Xle Tyr Cys Gin Ala Ala lle Lys Asn Cys Gin Pro Arg Lys Leu
30 35 40
-39CZ 304022 B6
cat ttt tat aaa Lys 45 aat ggc atc aaa gaa aga ttt caa atc Ile aca agg att 358
ais Phe Tyr Asn Gly Ile Lys Glu 50 Arg Phe Gin Thr Arg 55 Ile
aat aaa aca aca gct cgg ctt tgg tat aaa aac ttt ctg gaa cca cat 406
Asn Lys Thr 60 Thr Ala Arg Leu Trp 55 Tyr Lys Asn Phe Leu 70 Glu Pro His
gct tet atg tac tgc act gct gaa tgt ccc aaa cat ttt caa gag aca 454
Ala Ser 75 Met Tyr Cys Thr Ala 80 Glu Cys Pro Lys His 85 Phe Gin Glu Thr
ctg ata tgt gga aaa gac att tet tet gga tat ccg cca gat att cčt 502
Leu 90 Ile Cys Gly Lys Asp Ile 95 Ser Ser Gly Tyr 100 Pro Pro Asp Ile Pro 105
gat gaa gta acc tgt gtc att tat gaa tat tea ggc aac atg act tgc 550
Asp Glu Val Thr Cys Val Ile 110 Tyr Glu Tyr 115 Ser Gly Asn Met Thr 120 Cys
acc tgg aat gct rgg aag ctc acc tac ata gac aca aaa tac gtg gta 598
Thr Trp Asn Ala 125 Xaa Lys Leu Thr Tyr 130 Ile Asp Thr Lys Tyr Val 135 Val
cat gtg aag agt tta gag aca gaa gaa gac caa cag tat ctc acc tea 646
His Val Lys 140 Ser Leu Glu Thr Glu 145 Glu Glu Gin Gin Tyr 150 Leu Thr Ser
age tat att aac atc tcc act gat tea tta caa ggt ggc aag aag tac 694
Ser Tyr 155 Ile Asn Ile Ser Thr ISO Asp Ser Leu Gin Gly 165 Gly Lys Lys Tyr
ttg gtt tgg gtc caa gca gca aac gca Cta ggc atg gaa gag tea aaa 742
Leu 170 Val Tip Val Gin Ala Ala 175 Asn Ala Leu Gly 180 Met Glu Glu Ser Lys 185
caa ctg caa att cac ctg gat gat ata gtg ata cct tet gca gcc gtc 790
Gin Leu Gin Ile His Leu Asp 190 Asp Ile Val 195 Ile Pro Ser Ala Ala 200 Val
att tcc agg gct gag act ata aat gct aca gtg ccc aag acc ata att 838
Ile Ser Arg Ala 205 Glu Thr Ile Asn Ala 210 Thr Val Pro Lys Thr Ile 215 Ile
tat tgg gat agt caa aca aca att gaa aag gtt tcc tgt gaa atg aga 886
Tyr Trp Asp 220 Ser Gin Thr Thr Ile 225 Glu Ly3 val Ser Cys 230 Glu Met Arg
tac aag gct aca aca aac caa act tgg aat gtt aaa gaa ttt gac acc 934
Tyr Lys 235 Ala Thr Thr Asn Gin 240 Thr Trp Asn Val Lys 245 Glu Phe Asp Thr
aat ttt aca tat gtg caa cag tea gaa ttc tac ttg gag cca aac att 982
Asn 250 Phe Thr Tyr Val Gin Gin 255 Ser Glu Phe Tyr 260 Leu Glu Pro Asn Ile 265
aag tac gta ttt caa gtg aga tgt caa gaa aca ggc aaa agg tac tgg 1030
Lys Tyr Val Phe Gin Val Arg Cys Gin Glu Thr Gly Lys Arg Tyr Trp
270 27S 200
-40CZ 304022 B6
cag cct tgg agt tca ccg ttt ttt cat aaa aca cct gaa aca gtt CCC 1078
Gin Pro Trp Ser 285 Ser Pro Phe Phe His 290 Lys Thr Pro Glu Thr 295 Val Pro
cag gtc aca tca aaa gca ttc caa cat gac aca tgg aat tet ggg cta 1125
Gin val Thr 300 Ser Lys Ala Phe Gin 305 His Asp Thr Trp Asn 310 Ser Gly Leu
aca gtt gct tcc atc tet aca ggg cac ctt act tet gac aac aga gga 1174
Thr Val 315 Ala ser Ile Ser Thr 320 Gly His Leu Thr Ser 325 Asp Asn Arg Gly
gac att gga ctt tta ttg gga atg atc gtc ttt gct gtt atg ttg tca 1222
Asp 330 ile Gly Leu Leu Leu 335 Gly Met Ile val Phe 340 Ala Val Met Leu Ser 345
att cct tet ttg att ggg ata ttt aac aga tca ttc ega act ggg att 1270
Ile Leu Ser Leu Ile 350 Gly Ile Phe Asn Axg 355 Ser Phe Arg Thr Gly 360 Ile
aaa aga agg atc tta ttg tta ata cca aag tgg ctt tat gaa gat att 1318
Lys Arg Arg Ile 365 Leu Leu Leu Ile Pro 370 Lys Trp Leu Tyr Glu 375 Asp ile
cct aat atg aaa aac agc aat gtt gtg aaa atg cta cag gaa aat agt 1365
Pro Asn Met 380 Lys Asn Ser Asn Val 385 Val Lys Met Leu Gin 390 Glu Asn Ser
gaa ctt atg aat aat aat tcc agt gag cag gtc cta tat gtt gat ccc 1414
Glu Leu 395 Met Asn Asn Asn Ser 400 Ser Glu Gin Val Leu 405 Tyr Val Asp Pro
atg att aca gag ata aaa gaa atc ttc atc cca gaa cac aag cct aca 1462
Met 410 Ile Thr Glu Ile Lys 415 Glu Ile Phe Ile Pro 420 Glu His Lys Pro Thr 425
gac tac aag aag gag aat aca gga ccc ctg gag aca aga gac tac ccg 1510
Asp Tyr Lys Lys Glu 430 Asn Thr Gly Pro Leu 435 Glu Thr Arg Asp Tyr 440 Pro
caa aac tcg cta ttc gac aat act aca gtt gta tat att cct gat ctc 1558
Gin Asn Ser Leu 445 Phe Asp Asn Thr Thr 450 Val Val Tyr Ile Pro 455 Asp Leu
aac act gga tat aaa ccc caa att tca aat ttt ctg cct gag gga agc 1606
Asn Thr Gly 460 Tyr Lys Pro Gin Ile 465 Ser Asn Phe Leu Pro 470 Glu Gly Ser
cat ctc agc aat aat aat gaa att act tcc tta aca ctt aaa cca cca 1654
His Leu 475 Ser Asn Asn Asn Glu 480 Ile Thr Ser Leu Thr 485 Leu Lys Pro Pro
gtt gat tcc tta gac tca gga aat aat ccc agg tta caa aag cat cct 1702
Val 490 Asp Ser Leu Asp Ser 495 Gly Asn Asn Pro Arg 500 Leu Gin Lys His Pro 505
aat ttt gct ttt tet gtt tca agt gtg aat tca cta agc aac aca ata 1750
Asn Phe Ala Phe Ser 510 Val Ser Ser Val Asn 515 Ser Leu Ser Asn Thr 520 Ile
-41 CZ 304022 B6
ttt Phe ctt gga gaa tta Leu age ctc ata Ser Leu Ile tta aat caa gga gaa tgc agt tet Ser 1798
Leu Gly Glu 525 Leu 530 Asn Gin Gly Glu cys Ser 535
cct gac ata caa aac tea gta gag gag gaa acc acc atg ctt ttg gaa 1846
Pro Asp Ile Gin Asn Ser Val Glu Glu Glu Thr Thr Met Leu Leu Glu
540 545 550
aat gat tea ccc agt gaa act att cca gaa cag acc ctg ctt cct gat 1894
Asn Asp Ser Pro Ser Glu Thr Ile Pro Glu Gin Thr Leu Leu Pro Asp
555 560 565
gaa ttt gtc tcc tgt ttg 399 atc gtg aat gag gag ttg cca tet att 1942
Glu Phe Val Ser Cys Leu Gly Ile Val Asn Glu Glu Leu Pro Ser Ile
570 575 580 585
aat act tat ttt cca caa aat att ttg gaa age cac ttc aat agg att 1990
Asn Thr Tyr Phe Pro Gin Asn Ile Leu Glu ser His Phe Asn Arg Ile
590 595 600
tea ctc ttg gaa aag tagagctgtg tggtcaaaat caatatgaga aagctgcctt 2045 Ser Leu Leu Glu Lys
605
gcaatctgaa cttgggtttt ccctgcaata gaaattgaat tctgcctctt tttgaaaaaa 2105
atgtattcac atacaaatct tcacatggac acatgttttc atttcccttg gataaatacc 2165
taggtagggg attgctgggc catatgacaa gcatatgttt cagttctacc aatcttgttt 2225
ccagagtagt gacatttctg tgctcctacc atcaccatgt aagaattccc gggagctcca 2285
tgccttttta attttagcca ttcttctgcc tmatttetta aaattagaga attaaggtcc 2345
cgaaggtgga acatgcttca tggccacaca tacaggcaca aaaacagcat tatgtggacg 2405
cctcatgtat tttttataga gtcaactatt tcccctttac tttccctcat tgaaagatgc 2465
aaaacagctc tctactgtgt acagaaaggg taaataatgc aaaatacctg gtagcaaaat 2525
aaatgctgaa aattttcctt taaaatagaa tcattaggcc aggcgtggtg geteatgett 2585
gtaatcccag cactttggta ggctgaggtr ggtggatcac ctgaggtcag gagttcgagt 2645
ccagcctggc caatatgctg aaaccctgtc tctactaaaa ttacaaaaat tagccggcca 2705
tggtggcagg tgcttgcaat cccagctact tgggaggctg aggcaggaga atcacttgaa 2765
ccaggaaggc agaggttgca ctgagctgag attgtgccac tgcactccag cctgggcaac 2825
aagagcaaaa ctctgtctgg aaaaaaaaaa aaaa 2859
(2) Informace o SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 629 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE: TOPLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: protein
-42CZ 304022 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Met Aaa Xaa Val Thr Ile Gla Trp Asp Ala Val Ile Ala Leu Tyr Ile -20 -15 -10
Leu Phe Ser Trp Cys His Gly Gly Ile Thr Asn Ile Asn Cys Ser Gly
-5 -1 1 5
His Ile Trp Val Glu Pro Ala Thr ile Phe Lys Met Gly Met Asn Ile
10 15 20 25
Ser Ile Tyr Cys Gin Ala Ala Ile Lys Asn Cys Gin Pro Arg Lys Leu
30 35 40
His Phe Tyr Lys Asn Gly Ile Lys Glu Arg Phe Gin Ile Thr Arg Ile
45 50 55
Aaa Lys Thr Thr Ala Arg Leu Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His
€0 65 70
Ala Ser Met Tyr Cys Thr Ala Glu Cys Pro Lys HiS Phe Gin Glu Thr
75 80 85
Leu Ile Cys Gly Lys Asp Ile Ser Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro
90 95 100 105
Asp Glu Val Thr Cys Val Ile Tyr Glu Tyr Ser Gly Asn Met Thr Cys
110 115 120
Thr Trp Asn Ala Xaa Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr Val val
125 130 135
His Val Lys Ser Leu Glu Thr Glu Glu Glu Gin Gin Tyr Leu Thr Ser
140 145 150
Ser Tyr Ile Asn Ile Ser Thr Asp ser Leu Gin Gly Gly Lys Lys Tyr
155 ISO 165
Leu Val Trp Val Gin Ala Ala Asn Ala Leu Gly Met Glu Glu Ser Lys
170 175 180 185
Gin Leu Gin Ile His Leu Asp Asp Ile Val Ile Pro Ser Ala Ala val
190 195 200
Ile Ser Arg Ala Glu Thr Ile Asn Ala Thr Val Pro Lys Thr Ile Ile
205 210 215
Tyr Trp Asp Ser Gin Thr Thr Ile Glu Lys Val Ser Cys Glu Met Arg
220 225 230
Tyr Lys Ala Thr Thr Asn Gin Thr Trp Asn Val Lys Glu Phe Asp Thr
235 240 245
Asn Phe Thr Tyr Val Gin Gin Ser Glu Phe Tyr Leu Glu Pro Asn Ile
250 255 260 265
Lys Tyr val Phe Gin Val Arg Cys Gin Glu Thr Gly Lys Arg Tyr Trp
270 275 280
Gin Pro Trp Ser Ser Pro Phe Phe His Lys Thr Pro Glu Thr Val Pro
285 290 295
-43CZ 304022 B6
Gin Val Thr 300 Ser Lys Ala Phe Gin 305 His Asp Thr Trp Asn 310 . ser Gly Leu
Thr Val 315 Ala Ser Ile Ser Thr 320 Gly His Leu Thr Ser 325 Asp Asn Arg Gly
Asp 330 Ile Gly Leu Leu Leu 335 Gly Met Ile Val Phe 340 Ala Val Met Leu Ser 345
Ile Leu Ser Leu Ile 350 Gly Ile Phe Asn Arg 355 Ser Phe Arg Thr Gly 360 Ile
Lys Arg Arg Ile 365 Leu Leu Leu Ile Pro Lys 370 Trp Leu Tyr Glu 375 Asp Ile
Pro Asn Met 380 Lys Asn Ser Asn Val 385 Val Lys Met Leu Gin 390 Glu Asn Ser
Glu Leu 395 Met Asn Asu Asn Ser 400 Ser Glu Gin Val Leu 405 Tyr Val Asp Pro
Met 410 Ile Thr Glu Ile Lys 415 Glu Ile Phe Ile Pro 420 Glu His Lys Pro Thr 425
Asp Tyr Lys Lys Glu 430 Asn Thr Gly Pro Leu 435 Glu Thr Arg Asp Tyr 440 Pro
Gin Asn Ser Leu 445 Phe Asp Asn Thr Thr Val 450 val Tyr Ile Pro 4 55 Asp Leu
Asn Thr Gly Tyr Lys 460 Pro Gin Ile 465 Ser Asn Phe Leu Pro 470 Glu Gly Ser
His Leu 475 Ser Asn Asn Asn Glu 480 Ile Thr Ser Leu Thr 485 Leu Lys Pro Pro
val 490 Asp Ser Leu Asp Ser 495 Gly Asn Asn Pro Arg 500 Leu Gin Lys His Pro 505
Asn Phe Ala Phe Ser 510 Val Ser Ser Val Asn. 515 Ser Leu Ser Asn Thr 520 Ile
Phe Leu Gly Glu 525 Leu Ser Leu Ile Leu Asa 530 Gin Gly Glu Cys 535 Ser Ser
Pro Asp Ile 540 Gin Asn Ser Val Glu 545 Glu Glu Thr Thr Met 550 Leu Leu Glu
Asn Asp 555 Ser Pro Ser Glu Thr 560 Ile Pro Glu Gin Thr 565 Leu Leu Pro Asp
Glu 570 Phe Val Ser Cys Leu 575 Gly Ile Val Asn Glu 5B0 Glu Leu Pro Ser Ile 585
Asn Thr Tyr Phe Pro 590 Gin Asn Ile Leu Glu 595 Ser His Phe Asn Arg 600 Ile
Ser Leu Leu Glu Lys
605 .44 .
(2) Informace o SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1887 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:
(A) Název/klíč: misc_feature (D) Pozice: 1..1887 (D) Jiné informace:
/ poznámka: symbol a může být a, c, g nebo t/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
atgaaycayg tnacnathca rtgggaygcn gtnathgcny tntayathyt nttywsntgg 60 tgycayggng gnathacnaa yathaaytgy wsnggncaya thtgggtnga rccngcnacn 120 athttyaara tgggnatgaa yathwsnath taytgycarg cngcnathaa raaytgycar 180 ccnmgnaary tncayttyta yaaraayggn athaargarra gnttycarat hacnmgnath 240 aayaaracna cngcnmgnyt ntggtayaar aayttyytng arccncaygc nwsnatgtay 300 tgyacngcng artgyccnaa rcayttvcar garacnvtna th.tgyggn.aa rgavathwsn 360 wsnggntayc cnccngayat hccngaygar gtnacntgyg tnathtayga rtaywsnggn 420 aayatgacnt gyacntggaa ygcamgnaar ytnacntaya thgayacnaa rtaygtngtn 480 caygtnaarw snytngarac ngargargar carcartayy tnacnwsnws ntayathaay 540 athwsnacng aywsnytnca rggnggnaar aartayytng tntaggtnca rgcngcnaay 600 gcnytnggna tggargarws aaarcarytn carathcayy tngaygayat hgtnathccn 660 wsngcngcng tnathwsmng ngcngaracn athaaygcna cngtnccnaa racnathath 720 taytgggayw sncaracnac nathgaraar gtnwsntgyg aratgmgnta yaargcnacn 780 acnaaycara cntggaaygt naargartty gayacnaayt tyacntaygt ncarcarwsn 840 garttytayy tngarccnaa yathaartay gtnttycarg tnmgntgyca rgaracnggn 900 aarmgntayt ggcarccntg gwsnwsnccn ttyttycaya aracnccnga racngtnccn 960 cargtnacnw snaargcntt ycarcaygay acntggaayw snggnytnac ngtngcnwsn 1020 athwsnacng gncayytnac awsngayaay mgnggngaya thggnytnyt nytnggnatg 1080 athgtnttyg cngtnatgyt nwsnathytn wsnytnathg gnathttyaa ymgnwsntty 1140
-45CZ 304022 B6 mgnacnggna thaaxragnrag nathytayta ytaathccna artggytnta ygargayath 1200 ccnaayatga araaywsnaa ygtngtnaar atgytncarg araaywsnga rytnatgaay 1250 aayaaywsaw sagarcargt nytntaygtn gayccnatga thacngarat naargarath 1320 ttyathccng arcayaarcc nacngaytay aaraargara ayacaggacc nytagaracn 1380 mgngaytayc cncaraayws nytnttygay aayacuacng tngtntayat hccagayytn 1440 aayaenggnt ayaarccaca rathwsnaay ttyytaccag arggnwsaca yytnwsaaay 15Ó0 aayaaygara thacnwsnyt nacnytnaař ccnccngtng aywsaytnga ywsnggnaay 1560 aayccnmgny tncaraarca yccnaaytty gcnttywsag tnwsnwsngt naaywsnytn 1620 wsnaayacna thttyytngg ngarytnwsn ytnathytna aycarggnga rtgywsnwsn 1680 ccngayathc araaywsngt zigargargar acnacnatgy tnytngaraa ygaywsnccn 1740 wsagaracna thccngarca racnytnytn ccngaygart tygtnwsntg yytnggnath 1800 gtnaaygarg arytnccnws nathaayacn tayttyccnc araayathyt ngarwsncay 1860 ttyaaymgna thwsnytnyt ngaraar 1887
-46CZ 304022 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 918 párů bází (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPLOGIE:
ío (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primát, domníváme se, že homo sapiens 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
Met 1 Leu Thr Leu Gin 5 Thr Trp Val Val Gin 10 Ala Leu Phe lle Phe 15 Leu
Thr Thr Glu Ser 20 Thr Gly Glu Leu Leu 25 Asp Pro Cys Gly Tyr 30 lle Ser
Pro Glu Ser 35 Pro Val Val Gin Leu 40 His Ser Asn Phe Thr 45 Ala Val Cys
Val Leu 50 Lys Glu Lys Cys Met 55 Asp Tyr Phe His Val 60 Asn Ala Asn Tyr
lle 65 Val Trp Lys Thr Asn 70 His Phe Thr lle Pro 75 Lys Glu Gin Tyr Thr 80
lle lle Asn Arg Thr 85 Ala Ser Ser Val Thr 90 Phe Thr Asp Xle Ala 95 Ser
Leu Asn lle Gin 100 Leu Thr Cys Asn lle 105 Leu Thr Phe Gly Gin 110 Leu Glu
Gin Asn Val 115 Tyr Gly lle Thr lle 120 lle Ser Gly Leu Pro 125 Pro Glu Lys
Pro Lys 130 Asn Leu Ser Cys lle 135 Val Asn Glu Gly Lys 140 Lys Met Arg Cys
Glu 145 Trp Asp Gly Gly Arg 150 Glu Thr His Leu Glu 155 Thr Asn Phe Thr Leu 160
Lys ser Glu Trp Ala 185 Thr His Lys Phe Ala 170 Asp Cys Lys Ala Lys 175 Arg
Asp Thr Pro Thr 180 Ser Cys Thr Val Asp 185 Tyr Ser Thr Val Tyr 190 Phe Val
Asn lle Glu 195 Val Trp Val Glu Ala 200 Glu Asn Ala Leu Gly 205 Lys Val Thr
-47CZ 304022 B6
Ser Asp 210 His Ile Asn Phe Asp 215 Pro Val Tyr Lys Val 220 Lys Pro Asn Pro
Pro 225 His Asn Leu Ser Val 230 Ile Asn Ser Glu Glu 235 Leu Ser Ser Ile Leu 240
Lys Leu Thr Trp Thr 245 Asn Pro Ser Ile Lys 250 Ser Val Ile Ile Leu 255 Lys
Tyr ΑΒΠ Ile Gin 260 Tyr Arg Thr Lys Asp 265 Ala Ser Thr Trp Ser 270 Gin Ile
Pro Pro Glu 275 Asp Thr Ala Ser Thr 280 Arg Ser Ser Phe Thr 285 Val Gin Asp
Leu Lys 290 Pro Phe Thr Glu Tyr 295 Val Phe Arg Ile Arg 300 Cys Met Lys Glu
Asp 305 Gly Lys Gly Tyr Trp 310 Ser Asp Trp Ser Glu 315 Glu Ala Ser Gly Ile 320
Thr Tyr Glu Asp Arg 325 Pro Ser Lys Ala Pro 330 Ser Phe Trp Tyr Lys 335 Ile
ASp Pro Ser His 340 Thr Gin Gly Tyr Arg 345 Thr Val Gin Leu Val 350 Trp Lys
Thr Leu Pro 355 Pro Phe Glu Ala Asn 360 Gly Lys Ile Leu Asp 365 Tyr Glu Val
Thr Leu 370 Thr Arg Trp Lys Ser 375 His Leu Gin Asn Tyr 380 Thr Val Asn Ala
Thr 385 Lys Leu Thr val Asn 390 Leu Thr Asn Asp Arg 395 Tyr Leu Ala Thr Leu 400
Thr val Arg Asn Leu 405 Val Gly Lys Ser Asp 410 Ala Ala Val Leu Thr 415 Ile
Pro Ala Cys Asp 420 Phe Gin Ala Thr His 425 Pro Val Met Asp Leu 430 Lys Ala
Phe Pro Lys 435 Asp Asn Met Leu Trp 440 Val Glu Trp Thr Thr 445 Pro Arg Glu
Ser Val 450 Lys Lys Tyr Ile Leu 455 Glu Trp Cys Val Leu 460 Ser Asp Lys Ala
Pro 465 Cys Ile Thr Asp Trp 470 Gin Gin Glu Asp Gly 475 Thr Val His Arg Thr 480
Tyr Leu Arg Gly Asn 485 Leu Ala Glu Ser Lys 490 Cys Tyr Leu Ile Thr 495 Val
Thr Pro Val Tyr 500 Ala Asp Gly Pro Gly 505 Ser Pro Glu Ser Ile 510 Lys Ala
Tyr Leu Lys Gin Ala Pro Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys
515 520 525
-48CZ 304022 B6
Lys Val 530 Gly Lys Asn Glu Ala 535 Val Leu Glu Trp Asp 540 Gin Leu Pro Val
Asp 545 Val Gin Asn Gly Phe 550 lle Arg Asn Tyr Thr 555 lle Phe Tyr Arg Thr 560
lle lle Gly Asn Glu 565 Thr Ala Val Asn Val 570 Asp Ser Ser His Thr 575 Glu
Tyr Thr Leu Ser 580 Ser Leu Thr Ser Asp 585 Thr Leu Tyr Met Val 590 Arg Met
Ala Ala Tyr 595 Thr Asp Glu Gly Gly 600 Lys Asp Gly Pro Glu 605 Phe Thr Phe
Thr Thr 610 Pro Lys Phe Ala Gin 615 Gly Glu lle Glu Ala 620 lle Val Val Pro
Val 625 Cys Leu Ala Phe Leu 630 Leu Thr Thr Leu Leu 635 Gly Val Leu Phe Cys 640
Phe Asn Lys Arg Asp 645 Leu lle Lys Lys His 650 lle Trp Pro Asn Val 655 Pro
Asp Pro Ser Lys 660 Ser His lle Ala Gin 665 Trp Ser Pro His Thr 670 Pro pro
Arg His Asn 675 Phe Asn Ser Lys Asp 680 Gin Met Tyr Ser Asp 685 Gly Asn Phe
Thr Asp 690 Val Ser Val Val Glu 695 lle Glu Ala Asn Asp 700 Lys Lys Pro Phe
Pro 705 Glu Asp Leu Lys Ser 710 Leu Asp Leu Phe Lys 715 Lys Glu Lys lle Asn 720
Thr Glu Gly His Ser 725 Ser Gly lle Gly Gly 730 Ser Ser Cys Met Ser 735 Ser
Ser Arg Pro Ser 740 lle Ser Ser Ser Asp 745 Glu Asn Glu Ser Ser 750 Gin Asn
Thr Ser Ser 755 Thr Val Gin Tyr Ser 760 Thr Val Val His Ser 765 Gly Tyr Arg
His Gin 770 Val Pro Ser Val Gin 775 Val Phe Ser Arg Ser 780 Glu Ser Thr Gin
Pro 785 Leu Leu Asp Ser Glu 790 Glu Arg Pro Glu Asp 795 Leu Gin Leu Val Asp 800
His Val Asp Gly Gly Asp 805 Gly lle Leu Pro 810 Arg Gin Gin Tyr Phe 815 Lys
Gin Asn Cys Ser 820 Gin His Glu Ser Ser 825 Pro Asp lle Ser His 830 Phe Glu
Arg Ser Lys 835 Gin Val Ser Ser Val 840 Asn Glu Glu Asp Phe 845 Val Arg Leu
-49CZ 304022 B6
Lys Gin 850 Gin lle Ser Asp His 855 lle Ser Gin Ser Cys 860 Gly Ser Gly Gin
Met 865 Lys Met Phe Gin Glu 870 Val Ser Ala Ala Asp 875 Ala Phe Gly Pro Gly 880
Thr Glu Gly Gin Val 885 Glu Arg Phe Glu Thr 890 Val Gly Met Glu Ala 895 Ala
Thr Asp Glu Gly 900 Met Pro Lys Ser Tyr 905 Leu Pro Gin Thr Val 910 Arg Gin
Oly Gly Tyr Met Pro Gin
915
-50CZ 304022 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 862 aminokyselinových zbytků 5 (Β) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:
(D) TOPOLOGIE:
(ii) DRUH MOLEKULY: protein o
(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primát, domníváme se, že homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
Met 1 Ala His Thr Phe 5 Arg Gly cys Ser Leu 10 Ala Phe Met Phe Ile 15 Ile
Thr Trp Leu Leu 20 Ile Lys Ala Lys Ile 2S Asp Ala cys Lys Arg 30 Gly Asp
Val Thr Val 35 Lys Pro Ser His Val 40 Ile Leu Leu Gly Ser 45 Thr Val Asn
Ile Thr 50 Cys Ser Leu Lys Pro 55 Arg Gin Gly Cys Phe 60 His Tyr Ser Arg
Arg 65 Asn Lys Leu Ile Leu 70 Tyr Lys Phe Asp Arg 75 Arg Ile Asn Phe His 80
His Gly His Ser Leu 85 Asn Ser Gin Val Thr 90 Gly Leu Pro Leu Gly 95 Thr
Thr Leu Phe Val 100 Cys Lys Leu Ala Cys 105 Ile Asn Ser Asp Glu 110 Ile Gin
Ile Cys Gly 115 Ala Glu Ile Phe Val 120 Gly Val Ala Pro Glu 125 Gin Pro Gin
Asn Leu 130 Ser Cys Ile Gin Lys 135 Gly Glu Gin Gly Thr 140 Val Ala Cys Thr
Trp 145 Glu Arg Gly Arg Asp 150 Thr His Leu Tyr Thr 155 Glu Tyr Thr Leu Gin 160
Leu Ser Gly Pro Lys 165 Asn Leu Thr Trp Gin 170 Lys Gin cys Lys Asp 175 Ile
Tyr Cys Asp Tyr ISO Leu Asp Phe Gly Ile 185 Asn Leu Thr Pro Glu 190 Ser Pro
-51 CZ 304022 B6
Glu Ser Asn Phe Thr Ala Lys Val Thr Ala Val Asn Ser Leu Gly Ser
195 200 205
Ser Ser 210 Ser Leu Pro Ser Thr Phe 215 Thr Phe Leu Asp Ile 220 Val Arg Pro
Leu Pro 225 Pro Trp Asp Ile 230 Arg Ile Lys Phe Gin Lys Ala 235 Ser Val Ser 240
Arg Cys Thr Leu Tyr Trp 245 Arg Asp Glu Gly Leu Val Leu 250 Leu Asn Arg 255
Leu Arg Tyr Arg Pro Ser 260 Asn Ser Arg Leu Trp Asn Met 265 Val Asn Val 270
Thr Lys Ala Lys Gly Arg 275 His Asp 280 Leu Leu Asp Leu Lys 285 Pro Phe Thr
Glu Tyr 290 Glu Phe Gin Ile Ser Ser 295 Lys Leu His Leu Tyr 300 Lys Gly Ser
Trp Ser 305 Asp Trp Ser Glu 310 Ser Leu Arg Ala Gin Thr Pro 315 Glu Glu Glu 320
Pro Thr Gly Met Leu Asp 325 Val Trp Tyr Met Lys Arg His 330 Ile Asp Tyr 335
Ser Arg Gin Gin Ile Ser 340 Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ser 345 Val Ser Glu 350
Ala Arg Gly Lys Ile Leu 355 Kis Tyr 360 Gin Val Thr Leu Gin 365 Glu Leu Thr
Gly Gly 370 Lys Ala Met Thr Gin Asn 375 Ile Thr Gly His Thr 380 Ser Trp Thr
Thr Val 385 Ile Pro Arg Thr 390 Gly Asn Trp Ala Val Ala Val 395 Ser Ala Ala 400
Asn Ser Lys Gly Ser Ser 405 Leu Pro Thr Arg Ile Asn Ile 410 Met Asn Leu 415
Cys Glu Ala Gly Leu Leu 420 Ala Pro Arg Gin Val Ser Ala 425 Asn Ser Glu 430
Gly Met Asp Asn Ile Leu 435 Val Thr 440 Trp Gin Pro Pro Arg 445 Lys Asp Pro
Ser Ala 450 Val Gin Glu Tyr Val Val 455 Glu Trp Arg Glu Leu 460 His Pro Gly
Gly Asp 465 Thr Gin Val Pro 470 Leu Asn Trp Leu Arg Ser Arg 475 Pro Tyr Asn 480
Val Ser Ala Leu Ile Ser 485 Glu Asn Ile Lys Ser Tyr Ile 490 Cys Tyr Glu 495
Ile Arg Val Tyr Ala Leu 500 Ser Gly Asp Gin Gly Gly Cys 505 Ser Ser Ile 510
-52CZ 304022 B6
Leu Gly Asn 515 Ser Lys His Lys Ala 520 Pro Leu Ser Gly Pro 525 His lle Asn
Ala lle 530 Thr Glu Glu Lys Gly 535 Ser lle Leu Xle Ser 540 Trp Asn Ser lle
Pro 545 Val Gin Glu Gin Met 550 Gly Cys Leu Leu Bis 555 Tyr Arg Xle Tyr Trp 560
Lys Glu Arg Asp Ser 565 Asn Ser Gin Pro Gin 570 Leu cys Glu Xle Pro 575 Tyr
Arg Val Ser Gin 580 Asn ser His Pro Xle 585 Asn Ser Leu Gin Pro 590 Arg val
Thr Tyr Val 595 Leu Trp Met Thr Ala 600 Leu Thr Ala Ala Gly 605 Glu Ser Ser
His Gly 610 Asn Glu Arg Glu Phe 615 Cys Leu Gin Gly Lys 620 Ala Asn Trp Met
Ala 625 Phe Val Ala Pro Ser 630 Xle Cys lle Ala lle 635 Xle Met Val Gly lle 640
Phe Ser Thr His Tyr 645 Phe Gin Qln Lys Val 650 Phe Val Leu Leu Ala 655 Ala
Leu Arg Pro Gin 660 Trp Cys Ser Arg Glu 665 lle Pro Asp Pro Ala 670 Asn Ser
Thr Cys Ala 675 Lys Lys Tyr Pro lle 680 Ala Glu Glu Lys Thr 685 Gin Leu Pro
Leu Asp 690 Arg Leu Leu lle Asp 695 Trp Pro Thr Pro Glu 700 Asp Pro Glu Pro
Leu 705 Val lle Ser Glu val 710 Leu His Gin Val Thr 715 Pro Val Phe Arg His 720
Pro Pro Cys Ser Asn 725 Trp Pro Gin Arg Glu 730 Lys Gly lle Gin Gly 735 His
Gin Ala Ser Glu 740 Lys Asp Met Met His 745 Ser Ala Ser Ser Pro 750 Pro Pro
Pro Arg Ala 755 Leu Gin Ala Glu Ser 760 Arg Gin Leu Val Asp 765 Leu Tyr Lys
Val Leu 770 Glu Ser Arg Gly Ser 775 Asp Pro Lys Pro Glu 780 Asn Pro Ala Cys
Pro 785 Trp Thr Val Leu Pro 790 Ala Gly Asp Leu pro 795 Thr His Asp Gly Tyr 800
Leu Pro Ser Asn Xle 805 Asp Asp Leu Pro Ser 810 His Glu Ala Pro Leu 815 Ala
Asp Ser Leu Glu Glu Leu Glu Pro Gin His Xle Ser Leu Ser Val Phe
820 825 830
-53CZ 304022 B6
Pro Ser Ser Ser Leu His Pro Leu Thr Phe Ser Cys Gly Asp Lys Leu 835 840 845
Thr Leu Asp Gis Leu Lys Met Arg Cys Asp Ser Leu Met Leu 850 855 860

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    5 1. Izolovaný nebo rekombinantní antigenní polypeptid, obsahující zbytky aminokyselin 1 až
    606 ze SEQ. ID NO: 2.
  2. 2. Izolovaná nebo rekombinantní nukleová kyselina s kódovou sekvencí pro polypeptid z nároku 1.
  3. 3. Izolovaná nebo rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 2, obsahující nukleotidové zbytky 188 až 2005 ze SEQ ID NO: 1.
  4. 4. Izolovaný nebo rekombinantní antigenní polypeptid podle nároku 1, obsahující zbytky
    15 aminokyselin -23 až 606 ze SEQ. ID NO: 2.
  5. 5. Izolovaná nebo rekombinantní nukleová kyselina škodovou sekvencí pro polypeptid z nároku 4.
    20
  6. 6. Izolovaná nebo rekombinantní nukleová kyselina podle nároku 5, obsahující nukleotidové zbytky 119 až 2005 ze SEQ ID NO: 1.
  7. 7. Expresivní vektor, obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 2.
    25
  8. 8. Hostitelská buňka, obsahující expresivní vektor podle nároku 7.
  9. 9. Hostitelská buňka podle nároku 8, kterou je savčí buňka.
  10. 10. Hostitelská buňka podle nároku 8, kterou je hmyzí buňka.
  11. 11. Hostitelská buňka podle nároku 8, kterou je bakteriální buňka.
  12. 12. Hostitelská buňka podle nároku 8, kterou je kvasinková buňka.
    35
  13. 13. Způsob výroby polypeptidu podle nároku 1, vyznačující se tím, že se
    a) pěstuje hostitelská buňka z nároku 8 za podmínek, které jsou pro expresi tohoto polypeptidu vhodné a
    40 b) polypeptid se izoluje nebo čistí.
  14. 14. Vazebná sloučenina, kterou je protilátka, nebo fragment této protilátky, schopný vázat antigen, který se specificky váže na polypeptid, tvořený sekvencí aminokyselin SEQ ID NO: 2.
    45 15. Vazebná sloučenina podle nároku 14, která se specificky váže na polypeptid, tvořený zbytky
    1 až 606 sekvence aminokyselin SEQ ID NO: 2.
    -54CZ 304022 B6
    16. Vazebná sloučenina podle nároku 14 nebo 15, kde vazebnou sloučeninou je monoklonální protilátka nebo její fragment, schopný vázat antigen.
    17. Vazebná sloučenina podle nároku 14 nebo 15, kde vazebnou sloučeninou je fragment Fab, Fab2 nebo Fv.
    18. Sada, vyznačující se tím, že obsahuje
    a) vazebnou sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 14,15 nebo 16 a
    b) instrukce pro použití.
    19. Způsob přípravy komplexu antigen:protilátka, vyznačující se tím, že se uvede do styku vazebná sloučenina podle nároku 14 nebo 15 santigenním polypeptidem se SEQ. ID NO: 2 za podmínek, vhodných pro vytvoření tohoto komplexu.
    20. Heterodimer, který obsahuje
    a) polypeptid, obsahující zbytky aminokyselin 1 až 606 ze SEQ. ID NO: 2 a
    b) IL-12Rpl.
    21. Heterodimer podle nároku 20, který je schopný vázat IL-B30/p40.
    22. Sada, vyznačující se tím, že obsahuje
    a) polypeptid, obsahující zbytky aminokyselin 1 až 606 ze SEQ. ID NO: 2 a
    b) instrukce pro použití.
    23. Sada podle nároku 22, vyznačující se tím, že dále obsahuje
    a) polypeptid 1L-12RP1 a
    b) polypeptidy p40 nebo IL-B30 nebo komplex IL-B30/p40.
    24. Prostředek pro použití jako léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje antagonistickou protilátku nebo její fragment, schopný vázat antigen, který se váže na polypeptid, tvořený zbytky aminokyselin 1 až 328 ze SEQ ID NO: 2.
    25. Prostředek pro použití jako léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje antagonistickou protilátku nebo její fragment, schopný vázat antigen, který se váže na komplex, obsahující
    a) polypeptid, tvořený aminokyselinami 1 až 328 ze SEQ ID NO: 2 a
    b) extracelulámí část IL-12Rp 1.
    26. Prostředek pro použití jako léčivo, vyznačující se t í m , že obsahuje komplex
    a) polypeptidu, obsahujícího aminokyseliny 1 až 328 ze SEQ ID NO: 2 a
    b) extracelulámí část IL-12Rp 1.
    27. Prostředek pro použití jako léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje antisense nukleovou kyselinu k polynukleotidu, který kóduje polypeptid tvořený sekvencí SEQ ID NO: 2.
    -55CZ 304022 B6
    28. Prostředek pro použití jako léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje agonistickou protilátku nebo její fragment, schopný vázat antigen, který se váže na komplex, obsahující
    5 a) polypeptid, tvořený aminokyselinami 1 až 328 ze SEQ ID NO: 2 a
    b) extracelulámí část IL-12RP1.
    29. Prostředek podle kteréhokoliv z nároků 24 až 27 v kombinaci s antagonistou
    a) IL-12;
    b) IL-18;
  15. 15 c) TNF nebo
    d) IFNy pro použití jako léčivo.
    30. Prostředek podle nároku 28 v kombinaci s IL-12; IL-18; TNF nebo IFNy pro použití jako léčivo.
    31. Použití prostředku, který obsahuje antagonistickou protilátku nebo její fragment, schopný
    25 vázat antigen, který se váže na polypeptid, tvořený aminokyselinami 1 až 328 ze SEQ ID NO: 2 pro výrobu léčiva pro léčení nemocných, kteří trpí roztroušenou sklerózou, revmatoidní artritidou, osteoartritidou, zánětlivým onemocněním tračníku, cukrovkou nebo sepsí.
    32. Použití prostředku podle nároku 31 v kombinaci s antagonisty IL—12; IL—18; TNF nebo
    30 IFNy.
    33. Použití prostředku, který obsahuje
    a) antagonistickou protilátku nebo její fragment, schopný se vázat na komplex, obsahující poly35 peptid, tvořený aminokyselinami 1 až 328 ze SEQ ID NO: 2, a extracelulámí část IL—12Εβ 1;
    b) komplex, obsahující polypeptid, tvořený aminokyselinami 1 až 328 ze SEQ ID NO: 2, a extracelulámí část IL—12Rpi; nebo
    40 c) antisense nukleovou kyselinu ke kódovému polynukleotidu pro SEQ ID NO: 2, pro výrobu léčiva pro léčení nemocných, kteří trpí roztroušenou sklerózou, revmatoidní artritidou, osteoartritidou, zánětlivým onemocněním tračníku, cukrovkou nebo sepsí.
    45 34. Použití prostředku, který obsahuje antagonistickou protilátku nebo její fragment, schopný se vázat na komplex, obsahující polypeptid, tvořený aminokyselinami 1 až 328 ze SEQ ID NO: 2, a extracelulámí část IL-12Rpi, pro výrobu léčiva pro léčení nemocných s chronickou Th2 reakcí; nádorem; virovou infekcí; fungálním růstem; nebo alergickou reakcí.
    50 35. Použití prostředku podle nároku 34 v kombinaci s IL-12; IL—18; TNF nebo IFNy.
    36. Použití prostředku, který obsahuje antagonistickou protilátku nebo její fragment, schopný se vázat na komplex, obsahující polypeptid, tvořený aminokyselinami 1 až 328 ze SEQ ID NO: 2,
    -56CZ 304022 B6 a extracelulámí část IL·- 12Rpl, pro výrobu léčiva pro léčení nemocných, jimž je podávána vakcína.
    37. Použití prostředku podle nároku 36 v kombinaci s IL—12; IL—18; TNF nebo IFNy.
CZ20023698A 2000-05-10 2001-05-10 Savcí receptorové proteiny, cinidla a metody, které se jich týkají CZ304022B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20342600P 2000-05-10 2000-05-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20023698A3 CZ20023698A3 (cs) 2003-04-16
CZ304022B6 true CZ304022B6 (cs) 2013-08-28

Family

ID=22753958

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20023698A CZ304022B6 (cs) 2000-05-10 2001-05-10 Savcí receptorové proteiny, cinidla a metody, které se jich týkají

Country Status (25)

Country Link
US (7) US6756481B2 (cs)
EP (3) EP1287130B2 (cs)
JP (6) JP5073909B2 (cs)
KR (1) KR100869621B1 (cs)
CN (2) CN101654479A (cs)
AT (1) ATE396264T1 (cs)
AU (2) AU6135101A (cs)
CA (1) CA2408571C (cs)
CY (1) CY1108545T1 (cs)
CZ (1) CZ304022B6 (cs)
DE (1) DE60134136D1 (cs)
DK (1) DK1287130T3 (cs)
ES (1) ES2307618T3 (cs)
HK (1) HK1049862B (cs)
HU (1) HUP0302339A3 (cs)
IL (2) IL152414A0 (cs)
MX (1) MXPA02011081A (cs)
NO (2) NO331408B1 (cs)
NZ (1) NZ522146A (cs)
PL (1) PL209128B1 (cs)
PT (1) PT1287130E (cs)
SI (1) SI1287130T1 (cs)
SK (1) SK287984B6 (cs)
WO (1) WO2001085790A2 (cs)
ZA (1) ZA200208795B (cs)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030082734A1 (en) * 1999-06-01 2003-05-01 Dowling Lynette M. Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
WO2000075314A1 (fr) 1999-06-02 2000-12-14 Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. Proteine receptrice d'hemopoietine
ES2254224T3 (es) * 1999-09-27 2006-06-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nueva proteina del receptor de hematopoyetina, nr12.
US7422743B2 (en) 2000-05-10 2008-09-09 Schering Corporation Mammalian receptor protein DCRS5;methods of treatment
DE60134136D1 (de) 2000-05-10 2008-07-03 Schering Corp Zytokinrezeptoruntereinheit-proteine aus säugetieren, damit zusammenhängende reagenzien und methoden
ES2329673T3 (es) * 2002-10-30 2009-11-30 Genentech, Inc. Inhibicion de la produccion de il-17.
ATE515514T1 (de) 2002-12-23 2011-07-15 Schering Corp Verwendungen von säuger-cytokin il-23 ; verwandte reagenzien
WO2004071517A2 (en) * 2003-02-06 2004-08-26 Schering Corporation Uses of il-23 related reagents
NZ541898A (en) 2003-03-10 2008-07-31 Schering Corp Uses of IL-23 antagonists for the manufacture of a medicament for the treatment of tumors
JP2007515939A (ja) 2003-05-09 2007-06-21 セントカー・インコーポレーテツド ＩＬ−２３ｐ４０特異的免疫グロブリン由来タンパク質、組成物、方法および用途
BRPI0507794A (pt) * 2004-02-17 2007-07-17 Schering Corp métodos de modular a atividade de il-23, reagentes relacionados
CN1993480A (zh) 2004-05-03 2007-07-04 先灵公司 Il－17表达预测皮肤炎症的用途；治疗方法
US20050287593A1 (en) * 2004-05-03 2005-12-29 Schering Corporation Use of cytokine expression to predict skin inflammation; methods of treatment
AR051444A1 (es) 2004-09-24 2007-01-17 Centocor Inc Proteinas derivadas de inmunoglobulina especifica de il-23p40, composiciones, epitopos, metodos y usos
US7820168B2 (en) * 2004-12-20 2010-10-26 Schering Corporation Treatment of diabetes using antibodies to IL-23, IL-23 receptor and IL-17
TR201902033T4 (tr) 2005-06-30 2019-03-21 Janssen Biotech Inc Anti-IL-23 antikorları, bileşimleri, yöntemleri ve kullanımları.
HUE049832T2 (hu) 2005-12-29 2020-10-28 Janssen Biotech Inc Humán anti-IL-23 ellenanyagok, készítmények, eljárás és alkalmazások
DK2047863T3 (da) 2006-06-08 2013-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Middel til forebyggelse eller behandling af inflammatoriske sygdomme
TWI426918B (zh) 2007-02-12 2014-02-21 Merck Sharp & Dohme Ｉｌ-２３拮抗劑於治療感染之用途
EP2057194B1 (en) * 2007-02-28 2013-03-20 Merck Sharp & Dohme Corp. Engineered anti-il-23r antibodies
EP2056838B1 (en) * 2007-02-28 2013-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Combination therapy for treatment of immune disorders
KR101595134B1 (ko) 2007-12-05 2016-02-17 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 소양증 치료제
MX2010012090A (es) * 2008-05-05 2011-04-11 Novimmune Sa Anticuerpos anti-il 17 a/il-17f de reactividad cruzada y metodos de uso de los mismos.
US20110158992A1 (en) * 2008-08-27 2011-06-30 Schering Corporation Engineered Anti-IL-23R Antibodies
AU2010230311B9 (en) * 2009-04-27 2012-09-20 Novartis Ag Composition and methods of use for therapeutic antibodies specific for the IL-12 receptore betal subunit
KR101811886B1 (ko) 2009-05-05 2017-12-22 노비뮨 에스 에이 항―ｉｌ―17ｆ 항체 및 이의 사용 방법
MX2019000046A (es) 2010-11-04 2023-10-05 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-il-23.
PL3326649T3 (pl) 2012-05-03 2022-04-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Przeciwciała anty-il-23p19
EP3708679A1 (en) 2014-07-24 2020-09-16 Boehringer Ingelheim International GmbH Biomarkers useful in the treatment of il-23a related diseases
EP3189153B1 (en) 2014-09-03 2021-06-16 Boehringer Ingelheim International GmbH Compound targeting il-23a and tnf-alpha and uses thereof
MX2020009265A (es) 2018-03-05 2020-10-01 Janssen Biotech Inc Metodos para tratar la enfermedad de crohn con un anticuerpo especifico anti-il23.
AU2019383017A1 (en) 2018-11-20 2021-06-03 Janssen Biotech, Inc. Safe and effective method of treating psoriasis with anti-IL-23 specific antibody
CN113874073A (zh) 2019-05-23 2021-12-31 詹森生物科技公司 用针对IL-23和TNFα的抗体的联合疗法治疗炎性肠病的方法
AU2021276930A1 (en) 2020-05-21 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1287130A2 (en) * 2000-05-10 2003-03-05 Schering Corporation Mammalian cytokine receptor subunit proteins, related reagents and methods

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2031216A1 (de) 1969-06-19 1971-01-14 Citizen Watch Co Ltd , Tokio Tag und Datum Stellvorrichtung fur Uhren mit Kalender
US3940475A (en) 1970-06-11 1976-02-24 Biological Developments, Inc. Radioimmune method of assaying quantitatively for a hapten
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4659678A (en) 1982-09-29 1987-04-21 Serono Diagnostics Limited Immunoassay of antigens
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4859609A (en) 1986-04-30 1989-08-22 Genentech, Inc. Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists
US5789192A (en) 1992-12-10 1998-08-04 Schering Corporation Mammalian receptors for interleukin-10 (IL-10)
US5888774A (en) 1994-12-19 1999-03-30 Cangene Corporation Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin
US6060284A (en) 1997-07-25 2000-05-09 Schering Corporation DNA encoding interleukin-B30
JPH11273358A (ja) 1998-03-26 1999-10-08 Kawasaki Steel Corp 半導体記憶装置
US20030082734A1 (en) 1999-06-01 2003-05-01 Dowling Lynette M. Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
WO2000073451A1 (en) * 1999-06-01 2000-12-07 Schering Corporation Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
JP4505166B2 (ja) 1999-09-09 2010-07-21 シェーリング コーポレイション 哺乳動物インターロイキン−１２ｐ４０およびインターロイキンｂ３０、その組成物、抗体、薬学的組成物における使用
JP2008099690A (ja) 1999-09-27 2008-05-01 Chugai Pharmaceut Co Ltd 新規ヘモポエチン受容体蛋白質、ｎｒ１２
ES2254224T3 (es) * 1999-09-27 2006-06-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nueva proteina del receptor de hematopoyetina, nr12.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1287130A2 (en) * 2000-05-10 2003-03-05 Schering Corporation Mammalian cytokine receptor subunit proteins, related reagents and methods

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Presky DH et al. A functional interleukin 12 receptor complex is composed of two beta-type cytokine receptor subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 14002-14007. *
Waterston RH, databaze EMBL, ac. no. AC026054, 20.3.2000 *
Wu CY et al. Biological function and distribution of human interleukin-12 receptor beta chain. Eur. J. Immunol., 1996, 26, 345-350. *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200208795B (en) 2004-02-09
JP2003532408A (ja) 2003-11-05
US7411041B2 (en) 2008-08-12
EP1287130B1 (en) 2008-05-21
WO2001085790A3 (en) 2002-07-18
AU6135101A (en) 2001-11-20
EP1287130A2 (en) 2003-03-05
IL152414A (en) 2010-05-31
JP5073909B2 (ja) 2012-11-14
US20120121601A1 (en) 2012-05-17
KR20020092472A (ko) 2002-12-11
NO20111147L (no) 2003-01-10
HK1049862B (en) 2008-08-01
HUP0302339A3 (en) 2011-01-28
PL209128B1 (pl) 2011-07-29
JP2008273961A (ja) 2008-11-13
US8110378B2 (en) 2012-02-07
EP1918377A1 (en) 2008-05-07
EP1918377B1 (en) 2013-12-04
JP2012070740A (ja) 2012-04-12
US7749718B2 (en) 2010-07-06
AU2001261351B2 (en) 2007-03-01
US7510853B2 (en) 2009-03-31
JP2015057396A (ja) 2015-03-26
EP2275548A1 (en) 2011-01-19
US20050100918A1 (en) 2005-05-12
PL365177A1 (en) 2004-12-27
ATE396264T1 (de) 2008-06-15
KR100869621B1 (ko) 2008-11-21
WO2001085790A2 (en) 2001-11-15
IL152414A0 (en) 2003-05-29
ES2307618T3 (es) 2008-12-01
JP2015110576A (ja) 2015-06-18
SI1287130T1 (sl) 2008-08-31
US6756481B2 (en) 2004-06-29
CN1575337A (zh) 2005-02-02
NO331408B1 (no) 2011-12-19
SK287984B6 (sk) 2012-08-06
DK1287130T3 (da) 2008-09-01
US20090060865A1 (en) 2009-03-05
US7964703B2 (en) 2011-06-21
HUP0302339A2 (hu) 2003-10-28
US20100261273A1 (en) 2010-10-14
US20050100917A1 (en) 2005-05-12
CN101654479A (zh) 2010-02-24
NO20025354L (no) 2003-01-10
CZ20023698A3 (cs) 2003-04-16
US20110243842A1 (en) 2011-10-06
EP1287130B2 (en) 2017-07-26
NZ522146A (en) 2004-10-29
PT1287130E (pt) 2008-09-01
CA2408571A1 (en) 2001-11-15
HK1049862A1 (en) 2003-05-30
NO20025354D0 (no) 2002-11-08
DE60134136D1 (de) 2008-07-03
CA2408571C (en) 2014-04-29
MXPA02011081A (es) 2003-03-10
US20030017617A1 (en) 2003-01-23
CY1108545T1 (el) 2014-04-09
SK15742002A3 (sk) 2003-03-04
JP2012187111A (ja) 2012-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2001261351B2 (en) Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
AU2001261351A1 (en) Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
JP2007269802A (ja) 哺乳動物レセプタータンパク質；関連する試薬および方法
WO1999040195A1 (en) Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
US20030082734A1 (en) Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
AU2007202362B2 (en) Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
HK1117192A (en) Mammalian cytokine receptor subunit proteins, related reagents and methods
HK1152072A (en) Mammalian cytokine receptor subunit proteins, related reagents and methods
MXPA00008848A (en) Human receptor proteins;related reagents and methods

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20160510