KR101595134B1

KR101595134B1 - 소양증 치료제

Info

Publication number: KR101595134B1
Application number: KR1020107014699A
Authority: KR
Inventors: 요시노부 히구치; 게이코 가스타니; 히데토모 기타무라; 마사카즈 하세가와
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2007-12-05
Filing date: 2008-12-05
Publication date: 2016-02-17
Also published as: CN101939025A; EP2241332A4; TW200932265A; JP5475460B2; CN101939025B; RU2014150548A; HK1200697A1; RU2010127291A; MY162546A; MX2010006097A; BRPI0821145B1; AU2008332276B2; KR20100100935A; WO2009072598A1; MY185647A; RU2596397C2; BRPI0821145A2; TWI441649B; AU2008332276A1; BRPI0821145B8

Abstract

본 발명자들은, 인간 항체 파지 라이브러리로부터, IL-31 의존성 Ba/F3 세포증식 어세이계에 있어서, 강한 증식 억제활성을 나타내는 클론 BM095를 얻었다. 이 항마우스 NR10 중화항체를 사용해서, 소양증 모델 마우스에 투여한 바, 현저한 증상의 억제효과가 나타났다. 항NR10 중화항체가 소양증 치료제로서 유용한 것이 명백해졌다.

Description

소양증 치료제{Therapeutic agent for pruritus}

본 발명은 소양증의 치료 또는 예방을 위한 약제에 관한 것이다.

각종 세포의 증식 분화, 또는 분화 성숙한 세포의 기능의 부활화에 관여하는 액성 인자로서, 수많은 사이토카인의 존재가 알려져 있다. 생체에서는, 사이토카인 자극을 받은 세포가 별도의 사이토카인을 생산하여, 복수의 사이토카인에 의한 네트워크가 형성되어 있다. 생체의 항상성은, 이 네트워크가 상호 서로 조절함으로써, 미묘한 균형 위에 유지되어 있다. 많은 면역 염증성의 질환은, 이들 사이토카인·네트워크의 파탄에 의해 발생한다고 생각되어, 단일클론항체에 의한 항사이토카인요법이 주목되고 있다. 예를 들면, 항TNF 항체나 항IL-6 수용체 항체는, 임상에서 높은 효과를 나타내고 있다. 그러나 한편으로, 실제의 병태에서는 대상경로가 작용하여, IL-4 등 하나의 사이토카인을 차단한 것만으로는 치료효과가 얻어지지 않아, 실패한 예도 많다.

본 발명자들은, IL-6의 시그날 전달수용체 gp130에 상동성이 높은, 신규 사이토카인 수용체 NR10의 단리에 성공하였다(특허문헌 1). NR10은, 온코스타틴 M 수용체(OSMR)와 헤테로다이머를 형성하고, IL-31의 수용체로서 기능한다(비특허문헌 1). NR10은, glm-r(비특허문헌 2), GPL(비특허문헌 3), IL-31RA(비특허문헌 4) 등의 이름으로도 알려져 있다. 또한, IL-31을 과잉 발현시킨 형질전환 마우스가 소양성 피부염을 자연 발증하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 4).

그러나, 마우스에 있어서의 사이토카인의 강제 발현이나, 병태 마우스에 있어서의 혈중 사이토카인 농도의 높이가, 실제로 질환의 원인이 되고 있다고 단언할 수는 없다. 항체에 의해 시그날을 차단했을 때 치료효과가 얻어지는지는, 전혀 불명확하다. 예를 들면, IL-18을 케라티노사이트로 과잉 발현시킨 형질전환·마우스는, 소양성 피부염을 발증한다. 또한, 아토피성 피부염 자연 발증모델 NC/Nga 마우스에서는, 혈중 IL-18 농도가 병태의 진행과 함께 상승한다. 이들로부터, IL-18의 과잉 발현이 질환의 원인으로서 추찰되었다. 그러나, 실제로는, 중화항체 투여에 의한 치료효과는 확인되지 않았다(비특허문헌 5).

이와 같이, 사이토카인의 발현이 상승하고 있는 질환에 있어서, 그 사이토카이의 기능을 저해했다고 해도 반드시 치료효과가 얻어지는 것은 아니기에, 사이토카인의 발현량으로부터 실제로 치료효과가 얻어지는 질환을 추측하는 것은 곤란하다. 따라서, 타겟으로 하는 사이토카인의 시그날 전달의 저해에 의해 실제로 치료효과가 얻어지는 질환을 발견하는 것이 중요하다.

또한, 본 발명의 선행기술문헌을 이하에 나타낸다.

특허문헌 1: WO00/75314

비특허문헌 1: IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis., J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb;117(2):418-25.

비특허문헌 2: A novel type I cytokine receptor is expressed on monocytes, signals proliferation, and activates STAT-3 and STAT-5.J Biol Chem 277, 16831-6, 2002

비특허문헌 3: GPL, a novel cytokine receptor related to GP130 and leukemia inhibitory factor receptor.J Biol Chem 278, 49850-9, 2003

비특허문헌 4: Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice.Nat Immunol 5, 752-60, 2004

비특허문헌 5: Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga., British Journal of Dermatology 149: 39-45, 2003

본 발명은 전술한 배경에 비추어 이루어진 것으로, 본 발명의 과제는 소양증의 치료 또는 예방을 위한 약제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하고자, 예의 연구를 행하였다. 본 발명자들은, NR10에 대한 중화항체 등의 NR10 안타고니스트가, 소양증에 대한 치료제 또는 예방제로서 유용한 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.

본 발명은 소양증의 치료 또는 예방을 위한 약제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는,

[1] NR10 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는, 소양증의 예방 또는 치료제,

[2] NR10 안타고니스트가 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체인, [1]에 기재된 예방 또는 료제,

[3] 항체가 단일클론항체인, [2]에 기재된 예방 또는 치료제,

[4] 항체가 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체인, [3]에 기재된 예방 또는 치료제,

[5] 항체가 재조합 항체인, [2]~[4] 중 어느 하나에 기재된 예방 또는 치료제,

[6] 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, [2]~[5] 중 어느 하나에 기재된 예방 또는 치료제,

를 제공하는 것이다.

도 1은 IL-31 유발의 소양행동을 평가한 그래프이다. 평균값±표준오차.
도 2는 진드기 항원 유발의 소양행동을 평가한 그래프이다. 평균값±표준오차.
도 3은 DSS 대장염 모델 마우스의 체중 변화율의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 4는 급성 Picryl chloride 접촉성 피부염 모델의 귓바퀴(耳介) 두께의 변화의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 5는 소양횟수를 지표로 한, 항NR10 항체 H0L0의 소양증에 대한 억제효과를 나타내는 그래프이다.

NR10은, 온코스타틴 M 수용체(OSMR)와 헤테로다이머를 형성하고, IL-31의 수용체로서 기능하는 단백질이다. glm-r(J Biol Chem 277, 16831-6, 2002), GPL(J Biol Chem 278, 49850-9, 2003), IL-31RA(Nat Immunol 5, 752-60, 2004) 등의 명칭으로도 알려져 있으며, 본 발명의 NR10에는, 이들의 명칭으로 불리는 단백질도 포함된다.

본 발명의 NR10에는, 인간이나 마우스, 기타 포유동물에 유래하는 NR10도 포함되고, 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 NR10으로서 인간이나 마우스 유래의 NR10을 들 수 있다. 인간 유래의 NR10으로서, 복수의 스플라이싱 배리언트가 알려져 있다(WO00/075314). 상기 스플라이싱 배리언트 중, NR10.1은 662 아미노산으로 되고, 세포막 관통영역을 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, NR10.2는 252 아미노산 서열로 되는 막관통영역을 갖지 않는 가용성 수용체 유사 단백질이다. 한편, 세포막 관통형 수용체 단백질로서 기능하는 NR10 스플라이싱 배리언트로서, NR10.3 및 IL-31RAv3가 알려져 있다. 본 발명에 있어서의 인간 NR10은, 온코스타틴 M 수용체(OSMR)와 헤테로다이머를 형성하고, IL-31의 수용체로서 기능하는 것이면 특별히 제한되지 않으나, 바람직한 NR10으로서는 NR10.3(ILRAv4로도 불림(Nat Immunol 5, 752-60, 2004)) 및 IL-31RAv3를 들 수 있다. NR10.3(IL-31RAv4)는 662 아미노산으로 되고(WO00/075314, Nat Immunol 5, 752-60, 2004), IL-31RAv3는 732 아미노산으로 된다(GenBank Accession No: NM_139017). IL-31RAv4의 아미노산 서열을 서열번호:6에, IL-31RAv3의 아미노산 서열을 서열번호:7에 나타낸다. 한편, 마우스 유래의 NR10으로서는, 서열번호:5에 기재된 아미노산 서열로 되는 단백질을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 NR10 안타고니스트란, NR10에 결합함으로써, NR10 활성화에 기인하는 세포내 시그날 전달을 차단하여, 세포의 생리적 활성을 상실시키거나 또는 억제하는 물질을 의미한다. 여기서 생리적 활성으로서는, 예를 들면, 생리활성물질(예를 들면, 케모카인, 염증성 사이토카인 등)의 생산유도활성, 생산억제활성, 분비촉진활성, 분비억제활성, 증식활성, 증식유도활성, 생존활성, 분화활성, 분화유도활성, 전사활성, 막 수송활성, 결합활성, 단백질 분해활성, 인산화/탈인산화활성, 산화환원활성, 전이활성, 핵산분해활성, 탈수활성, 세포사유도활성, 아포토시스유도활성 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

안타고니스트활성 유무의 판정은 당업자에게 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 예를 들면, 세포 표면 상에 발현시킨 NR10에, 리간드의 존재하에서 피검 화합물을 접촉시키고, NR10의 활성화의 지표가 되는 세포내 시그날 전달이 발생하는지 여부를 판정하면 된다. 이와 같은 판정은, 예를 들면, 문헌 「Dillon SR, et al., Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol. 2004 Jul; 5(7):752-60.」에 기재된 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 리간드 자극에 응답한 세포내 시그날 전달을 저해하는 화합물은, NR10의 안타고니스트라고 생각된다.

본 발명에 있어서의 안타고니스트는, 천연의 화합물이어도 되고 인공의 화합물이어도 된다. 본 발명에 있어서의 안타고니스트로서는 공지의 것을 사용할 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 안타고니스트활성을 갖는다고 판정된 신규화합물을 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서의 NR10 안타고니스트의 하나의 태양으로서는, NR10에 결합하는 항체를 들 수 있다. NR10에 결합하는 항체는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 NR10에 특이적으로 결합하는 항체이다. NR10에 결합하는 항체의 바람직한 태양으로서는, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체를 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 「NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체」란, NR10에 기인하는 생리활성을 억제하는 작용을 갖는 항체를 의미한다. 본 발명에 있어서의 「NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체」는 다클론항체여도 되고 단일클론항체여도 되나, 바람직한 태양으로서는 단일클론항체를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는, NR10에 결합하는 항체라면 특별히 한정되지 않고, 키메라(chimeric) 항체, 인간화(humanized) 항체, 인간 항체 등의 재조합 항체도 포함된다. 키메라 항체란, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상영역(constant region)으로 되는 항체이다. 키메라 항체는, 기지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여, 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 숙주에 도입함으로써 행하는 것이 가능하다(예를 들면, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는, 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체의 가변영역(V영역)의 cDNA를 합성한다. 목적으로 하는 항체의 V영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이것을 목적하는 인간 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 삽입한다. 또는, 항체의 V영역을 코드하는 DNA를, 인간 항체 C영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터에 삽입해도 된다. 발현제어영역, 예를 들면, 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입한다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여, 키메라 항체를 발현시킬 수 있다.

인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불리며, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR; complementarity determining region)을 인간 항체의 상보성 결정영역으로 이식한 것으로, 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA서열을, 말단부에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 수 개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 삽입하여, 이것을 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어진다(유럽 특허출원 공개번호 EP 239400, 국제특허출원 공개번호 WO 69/02576 참조). CDR을 매개로 하여 연결되는 인간 항체의 FR은, 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원 결합부위를 형성하도록 항체의 가변영역의 프레임워크영역의 아미노산을 치환해도 된다(Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

또한, 인간 항체의 취득방법도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 림프구를 인 비트로(in vitro)에서 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포로 감작하고, 감작 림프구를 인간 골수종 세포, 예를 들면 U266와 융합시켜, 항원으로의 결합활성을 갖는 목적하는 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(일본국 특허공고 평1-59878 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물을 목적하는 항원으로 면역함으로써 목적하는 인간 항체를 취득할 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조).

또한, 인간 항체 파지 라이브러리를 사용하여, 패닝법에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변영역을 단일쇄 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 명확해지면, 당해 서열을 갖는 적당한 발현 벡터를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들의 방법은 주지로, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388 등을 참고로 할 수 있다.

중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은, NR10에 대한 중화활성을 갖는 한, NR10에 대한 중화활성이 확인된 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열에 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있고, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 조제하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 단백질에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면, 부위 특이적 변이유발법(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492) 등을 사용하여, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열에 적절히 변이를 도입함으로써, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역과 기능적으로 동등한 변이체를 조제할 수 있다. 이와 같이, 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 변이되어 있고, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역도 또한 본 발명의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역에 포함된다.

아미노산 잔기를 개변하는 경우에는, 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 별도의 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들면 아미노산 측쇄의 성질로서는, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 황원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 및 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)을 들 수 있다(괄호 안은 모두 아미노산의 1문자 표기를 나타냄). 이들의 각 그룹 내의 아미노산의 치환을 보존적 치환이라 부른다. 어느 한 아미노산 서열에 대한 1 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 그 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다(Mark, D. F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:5662-6; Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res.(1982)10:6487-500; Wang, A. et al., Science(1984)224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79:6409-13). 이와 같은 변이체는, 아미노산 변이 전의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 보다 바람직하게는 90% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는다. 본 명세서에 있어서 서열의 동일성은, 서열 동일성이 최대가 되도록 필요에 따라 서열을 정렬화하고, 적절히 갭 도입한 후, 토대가 된 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열의 잔기와 동일한 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열의 동일성은, 전술한 방법에 의해 결정할 수 있다.

또한, 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어, NR10에 대한 중화활성을 갖는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은, 그 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 되는 핵산에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로부터 얻는 것도 가능하다. 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 되는 핵산에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산을 단리하기 위한, 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건으로서는, 6M 요소, 0.4% SDS, 0.5×SSC, 37℃의 조건 또는 이것과 동등한 스트린젠시의 하이브리다이제이션 조건을 예시할 수 있다. 보다 스트린젠시가 높은 조건, 예를 들면, 6M 요소, 0.4% SDS, 0.1×SSC의 조건, 42℃를 사용하면, 보다 상동성이 높은 핵산의 단리를 기대할 수 있다. 단리한 핵산의 서열의 결정은, 후술하는 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 단리된 핵산의 상동성은, 염기서열 전체에서, 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 서열의 동일성을 갖는다.

상기 하이브리다이제이션 기술을 이용하는 방법 대신에, 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열정보를 토대로 합성한 프라이머를 사용하는 유전자 증폭법, 예를 들면, 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)법을 이용하여, 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 되는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산을 단리하는 것도 가능하다.

염기서열 및 아미노산 서열의 동일성은, Karlin and Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-7)에 의해 결정할 수 있다. 이 알고리즘을 토대로 하여, BLASTN이나 BLASTX로 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul et al., J.Mol.Biol.(1990)215:403-10). BLAST를 토대로 하여 BLASTN에 의해 염기서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들면 score=100, wordlength=12로 한다. 또한, BLAST를 토대로 하여 BLASTX에 의해 아미노산 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들면 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이들의 해석방법의 구체적인 수법은 공지이다(NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)의 웹사이트를 참조; http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

또한 본 발명에 있어서의 항체는, 저분자화 항체여도 된다. 본 발명의 저분자화 항체는, 전장 항체(whole antibody, 예를 들면 whole IgG 등)의 일부분이 결손되어 있는 항체 단편을 포함하고, NR10으로의 중화활성을 갖는 한 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 저분자화 항체는, 전장 항체의 일부분을 포함하는 한 특별히 한정되지 않으나, 중쇄 가변영역(VH) 또는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 VH와 VL의 양쪽을 포함하는 저분자화 항체이다. 또한, 본 발명의 저분자화 항체의 다른 바람직한 예로서, 항체의 CDR을 포함하는 저분자화 항체를 들 수 있다. 저분자화 항체에 포함되는 CDR은 항체의 6개의 CDR 전부가 포함되어 있어도 되고, 일부의 CDR이 포함되어 있어도 된다.

본 발명에 있어서의 저분자화 항체는, 전장 항체보다도 분자량이 작아지는 것이 바람직하나, 예를 들면, 다이머, 트리머, 테트라머 등의 다량체를 형성하는 경우 등도 있어, 전장 항체보다도 분자량이 커지는 경우도 있다.

본 발명에 있어서의 저분자화 항체의 하나로서, scFv 항체를 들 수 있다. scFv 항체는, 중쇄 가변영역([VH]) 및 경쇄 가변영역([VL])을 링커 등으로 결합하여 단일쇄 폴리펩티드로 한 항체이다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988) 85, 5879-5883, Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, Resenburg 및 Moore편, Springer Verlag, New York, pp.269-315,(1994)). 결합되는 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 순서는 특별히 한정되지 않고, 어떤 순서로 나열되어 있어도 되며, 예를 들면, 이하와 같은 배치를 들 수 있다.

[VH]링커[VL]

[VL]링커[VH]

중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은, 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 또한, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 회합시킨 경우에, 항원 결합활성을 갖는 한, 일부를 결손시켜도 되고, 다른 폴리펩티드를 부가해도 된다. 또한, 가변영역은 키메라화나 인간화되어 있어도 된다.

본 발명에 있어서, 항체의 가변영역을 결합하는 링커는, 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커, 또는 합성 화합물 링커, 예를 들면, Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996에 개시되는 링커를 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서 바람직한 링커는 펩티드 링커이다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하나, 통상, 1~100 아미노산, 바람직하게는 3~50 아미노산, 더욱 바람직하게는 5~30 아미노산, 특히 바람직하게는 12~18 아미노산(예를 들면, 15 아미노산)이다.

펩티드 링커의 아미노산 서열로서는, 예를 들면, 이하와 같은 서열을 들 수 있다.

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호:8)

Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호:9)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호:10)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호:11)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호:12)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호:13)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호:14)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호:15)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호:10))n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호:11))n

[n은 1 이상의 정수이다] 등을 들 수 있다.

합성 화합물 링커(화학가교제)는, 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예를 들면, N-히드록시숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜스베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)스베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜 비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜 비스(설포숙신이미딜숙시네이트)(설포-EGS), 디숙신이미딜 타르타르산염(DST), 디설포숙신이미딜 타르타르산염(설포-DST), 비스[2-(숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 비스[2-(설포숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES) 등이고, 이들의 가교제는 시판되고 있다.

본 발명의 항체에는, 본 발명의 항체의 아미노산 서열에 복수개의 아미노산 잔기가 부가된 항체도 포함된다. 또한, 이들 항체와 다른 펩티드 또는 단백질이 융합된 융합 단백질도 포함된다. 융합 단백질을 제작하는 방법은, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 다른 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 프레임이 일치하도록 연결하여 이것을 발현 벡터에 도입하고, 숙주에서 발현시키면 되기에, 당업자에게 공지의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 항체와의 융합에 부여되는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드로서는, 예를 들면, FLAG(Hopp, T. P. et al., BioTechnology(1988) 6, 1204-1210), 6개의 His(히스티딘) 잔기로 되는 6×His, 10×His, 인플루엔자 응집소(HA), 인간 c-myc의 단편, VSV-GP의 단편, p18HIV의 단편, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T 항원의 단편, lck tag, α-tubulin의 단편, B-tag, Protein C의 단편 등의 공지의 펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체와의 융합에 부여되는 다른 폴리펩티드로서는, 예를 들면, GST(글루타티온-S-트랜스페라아제), HA(인플루엔자 응집소), 면역글로블린 정상영역, β-갈락토시다아제, MBP(말토오스 결합 단백질) 등을 들 수 있다. 시판되고 있는 이들 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 융합시키고, 이것에 의해 조제된 융합 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써, 융합 폴리펩티드를 조제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 히알루론산, 방사성물질, 형광물질, 발광물질, 효소, 톡신 등의 각종 분자와 결합한 콘쥬게이트 항체여도 된다. 이와 같은 콘쥬게이트 항체는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 또한, 항체의 수식방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다(예를 들면, US 5057313, US 5156840). 본 발명에 있어서의 「항체」에는 이들의 콘쥬게이트 항체도 포함된다.

또한, 특별히 한정되지 않으나, 본 발명에 있어서의 항NR10 항체의 바람직한 태양의 하나로서 도메인 1을 인식하는 항체를 들 수 있다. 본 발명에 있어서 도메인 1이란 서열번호:7에 기재된 인간 NR10의 아미노산 서열에 있어서 시그날 펩티드를 포함하고 있는 상태에서의 번호로 21번째의 아미노산에서 120번째의 아미노산까지의 영역(LPAKP~LENIA)을 말한다.

본 발명의 항체는, 후술하는 그것을 생산하는 세포나 숙주 또는 정제방법에 의해, 아미노산 서열, 분자량, 등전점 또는 당쇄의 유무나 형태 등이 상이할 수 있다. 그러나, 얻어진 항체가, NR10 안타고니스트로서의 기능을 갖고 있는 한, 본 발명에 포함된다. 예를 들면, 본 발명의 항체를 원핵세포, 예를 들면 대장균에서 발현시킨 경우, 본래의 항체의 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 본 발명의 항체는 이와 같은 항체도 포함한다.

NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체는, 예를 들면, 인간이나 마우스 등의 포유동물에 유래하는 NR10 또는 그의 단편 펩티드를 면역원으로 하여, 공지의 방법에 의해 항NR10 단일클론항체를 조제한 후, 얻어진 항NR10 단일클론항체 중에서 NR10 중화활성을 갖는 항체를 선별함으로써, 얻을 수 있다. 즉, 목적하는 항원이나 목적하는 항원을 발현하는 세포를 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라 면역한다. 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시키고, 통상의 스트리닝법에 의해, 단일클론항체 생산세포(하이브리도마)를 스크리닝함으로써, 항NR10 단일클론항체를 제작하는 것이 가능하다. 면역되는 동물로서는, 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 양, 원숭이, 염소, 당나귀, 소, 말, 돼지 등의 포유동물을 사용할 수 있다. 항원의 조제는, 공지 NR10 유전자 서열을 사용하여, 공지의 방법, 예를 들면 바큘로바이러스를 사용한 방법(WO98/46777 등) 등에 준하여 행할 수 있다.

하이브리도마의 제작은, 예를 들면, 밀스테인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol.(1981) 73: 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우에는, 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대분자와 결합시켜, 면역을 행해도 된다.

본 발명의 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 일태양으로서, 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체를 들 수 있다. 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체를 제작하기 위한 면역원으로서는, 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체를 제작할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 인간 NR10에는 복수의 배리언트의 존재가 알려지나, 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체를 제작할 수 있는 한, 어떤 배리언트를 면역원으로 해도 된다. 또는 동일한 조건하에, NR10의 단편 펩티드나, 천연 NR10 서열에 인위적인 변이를 가한 것을 면역원으로 해도 된다. 인간 NR10.3는, 본 발명의 NR10에 대한 결합활성 및/또는 중화활성을 갖는 항체를 제작할 수 있는 측면에서, 바람직한 면역원의 하나이다.

또한, 항체의 NR10에 대한 중화활성의 측정은, 예를 들면, 참고예에 기재된, 그 IL-31 의존성 세포주의 증식 억제효과를 관찰하는 방법에 의해 행할 수 있다.

한편, 단일클론항체는, DNA 면역(DNA Immunization)에 의해서도 얻을 수 있다. DNA 면역이란, 면역동물 중에서 항원 단백질을 코드하는 유전자가 발현할 수 있는 태양으로 구축된 벡터 DNA를 당해 면역동물에 투여하고, 면역 항원을 면역동물의 생체 내에서 발현시킴으로써, 면역 자극을 부여하는 방법이다. 단백질 항원을 투여하는 일반적인 면역방법과 비교하여, DNA 면역에는, 다음과 같은 우위성을 기대할 수 있다.

－막단백질의 구조를 유지하여 면역 자극을 부여할 수 있다

－면역 항원을 정제할 필요가 없다

그러나 한편으로, DNA 면역에 있어서는, 애쥬번트 등의 면역 자극수단과 조합하는 것이 곤란하다.

DNA 면역에 의해 단일클론항체를 얻는 데는, 먼저, NR10을 코드하는 DNA를 면역동물에 투여한다. NR10을 코드하는 DNA는, PCR 등의 공지의 방법에 의해 합성할 수 있다. 얻어진 DNA를 적당한 발현 벡터에 삽입하고, 면역동물에 투여한다. 발현 벡터로서는, 예를 들면 pcDNA3.1 등의 시판의 발현 벡터를 이용할 수 있다. 벡터를 생체에 투여하는 방법도, 일반적으로 사용되고 있는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터를 흡착시킨 금입자를, 유전자총(gene gun)으로 세포내에 넣음으로써 DNA 면역을 행할 수 있다. DNA 면역 후에, NR10 발현세포에 의한 추가 면역(boost)을 행하는 것은, 단일클론항체를 얻는 바람직한 방법이다.

이와 같이 포유동물이 면역되고, 혈청 중에 있어서의 목적하는 항체량의 상승이 확인된 후에, 포유동물로부터 면역세포가 채취되어, 세포융합에 부여된다. 바람직한 면역세포로서는, 특히 비장세포를 사용할 수 있다.

상기의 면역세포와 융합되는 세포로서, 포유동물의 골수종 세포가 사용된다. 골수종 세포는, 스크리닝을 위한 적당한 선택 마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택 마커란, 특정 배양조건하에서 생존할 수 있는(또는 할 수 없는) 형질을 가리킨다. 선택 마커에는, 히포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스페라아제 결손(이하 HGPRT 결손으로 생략한다), 또는 티미딘 키나아제 결손(이하 TK 결손으로 생략한다) 등이 공지이다. HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 감수성(이하 HAT 감수성으로 생략한다)을 갖는다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택배지 중에서 DNA 합성을 행할 수 없어 사멸되나, 정상세포와 융합하면 정상세포의 샐비지 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속할 수 있기 때문에 HAT 선택배지 중에서도 증식하게 된다.

HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는, 각각 6 티오구아닌, 8 아자구아닌(이하 8AG로 생략한다), 또는 5'브로모데옥시우리딘을 포함하는 배지에서 선택할 수 있다. 정상세포는 이들 피리미딘 아날로그를 DNA 중에 삽입해 버리기 때문에 사멸되나, 이들 효소를 결손한 세포는, 이들 피리미딘 아날로그를 삽입할 수 없기 때문에 선택배지 중에서 생존할 수 있다. 이 밖에 G418 내성으로 불리는 선택 마커는, 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민계 항생물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 부여한다. 세포융합에 적합한 각종 골수종 세포가 공지이다.

기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면, 쾰러와 밀스테인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol.(1981)73, 3-46) 등에 준하여, 면역세포와 골수종 세포의 세포융합이 행해진다.

보다 구체적으로는, 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양 배양액 중에서, 세포융합을 실시할 수 있다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등을 사용할 수 있다. 추가적으로 융합효율을 높이기 위해 목적하는 바에 따라 디메틸설폭시드 등의 보조제를 첨가하는 것도 가능하다.

면역세포와 골수종 세포의 사용 비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 골수종 세포에 대해 면역세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 세포융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면, 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이 종의 세포 배양에 사용되는 통상의 배양액을 이용할 수 있다. 또한, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 배양액에 첨가할 수 있다.

세포융합은, 면역세포와 골수종 세포의 소정량을 배양액 중에서 잘 혼합하고, 사전에 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액을 혼합함으로써 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 세포융합법에 있어서는, 예를 들면 평균 분자량 1000~6000 정도의 PEG를, 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가할 수 있다. 계속해서, 상기에 예로 든 적당한 배양액을 축차 첨가하고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써, 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등이 제거된다.

이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 세포융합에 사용된 골수종이 갖는 선택 마커에 따른 선택 배양액을 이용함으로써 선택할 수 있다. 예를 들면 HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택할 수 있다. 즉, HAT 감수성의 골수종 세포를 세포융합에 사용한 경우, HAT 배양액 중에서, 정상세포와의 세포융합에 성공한 세포를 선택적으로 증식시킬 수 있다. 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간, 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속된다. 구체적으로는, 일반적으로, 수일에서 수 주간의 배양에 의해, 목적으로 하는 하이브리도마를 선택할 수 있다. 이어서, 통상의 한계 희석법을 실시함으로써, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 실시할 수 있다. 또는, NR10을 인식하는 항체를 국제공개 WO03/104453에 기재된 방법에 의해 제작하는 것도 가능하다.

목적으로 하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝은, 공지의 항원 항체반응을 토대로 하는 스크리닝방법에 의해 적합하게 실시할 수 있다. 예를 들면, 폴리스티렌 등으로 된 비즈나 시판의 96웰의 마이크로타이터 플레이트 등의 담체에 항원을 결합시키고, 하이브리도마의 배양상청과 반응시킨다. 이어서 담체를 세정한 후에 효소로 표지한 2차 항체 등을 반응시킨다. 만일 배양상청 중에 감작 항원과 반응하는 목적으로 하는 항체가 포함되는 경우, 2차 항체는 이 항체를 매개로 담체에 결합한다. 최종적으로 담체에 결합하는 2차 항체를 검출함으로써, 목적으로 하는 항체가 배양상청 중에 존재하고 있는지 여부를 결정할 수 있다. 항원에 대한 결합능을 갖는 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 한계 희석법 등에 의해 클로닝하는 것이 가능해진다. 이때, 항원으로서는 면역에 사용한 것을 비롯하여, 실질적으로 동질의 NR10 단백질을 적합하게 사용할 수 있다. 예를 들면 NR10을 발현하는 세포주, NR10의 세포외 도메인, 또는 당해 영역을 구성하는 부분 아미노산 서열로 되는 올리고펩티드를, 항원으로서 이용할 수 있다.

또한, 인간 이외의 동물의 항원을 면역함으로써 상기 하이브리도마를 얻는 방법 이외에, 인간 림프구를 항원 감작하여 목적으로 하는 항체를 얻는 것도 가능하다. 구체적으로는, 먼저 인 비트로에 있어서 인간 림프구를 NR10 단백질로 감작한다. 이어서 면역 감작된 림프구를 적당한 융합 파트너와 융합시킨다. 융합 파트너로는, 예를 들면 인간 유래로서 영구 분열능을 갖는 골수종 세포를 이용할 수 있다(일본국 특허공고 평1-59878호 공보 참조). 이 방법에 의해 얻어지는 항체는, NR10 단백질로의 결합활성을 갖는 인간 항체이다.

전술한 바와 같이 하여 취득된 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, NR10을 인식하는 항체의 서열을 토대로, 당업자에게 공지의 유전자 재조합기술을 사용하여 제작하는 것이 가능하다. 구체적으로는, NR10을 인식하는 항체의 서열을 토대로 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 구축하고, 이것을 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시키면 된다(예를 들면, Co, M. S. et al., J. Immunol.(1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol.(1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol.(1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol.(1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol.(1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol.(1991) 9, 132-137 참조).

벡터의 예로서는, M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한, cDNA의 서브 클로닝, 잘라내기를 목적으로 한 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들면, pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다. 본 발명의 항체를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히, 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 예를 들면, 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우는, 벡터가 대장균에서 증폭되는 상기 특징을 갖는 것 외에, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는, 대장균에서 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward 등, Nature(1989) 341, 544-546;FASEB J.(1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터(Better 등, Science(1988) 240, 1041-1043), 또는 T7 프로모터 등을 갖고 있는 것이 불가결하다. 이와 같은 벡터로서는, 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(파마시아제), 「QIAexpress system」(퀴아겐제), pEGFP, 또는 pET(이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 들 수 있다.

또한, 벡터에는, 항체 분비를 위한 시그날 서열이 포함되어 있어도 된다. 항체 분비를 위한 시그날 서열로서는, 대장균의 페리플라즘으로 생산시키는 경우, pelB 시그날 서열(Lei, S. P. et al., J. Bacteriol.(1987)169, 4379)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면 염화칼슘법, 전기천공법(electroporation method)을 사용해서 행할 수 있다.

대장균 이외에도, 예를 들면, 본 발명의 항체를 제조하기 위한 벡터로서는, 포유동물 유래의 발현 벡터(예를 들면, pcDNA3(인비트로겐사제)나, pEF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(기브코 BRL제), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면, pZIPneo), 효모 유래의 발현 벡터(예를 들면, 「Pichia Expression Kit」(인비트로겐제), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터(예를 들면, pPL608, pKTH50)를 들 수 있다.

CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan 등, Nature(1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima 등, Nucleic Acids Res.(1990) 18, 5322), CMV 프로모터 등을 갖고 있는 것이 불가결하고, 세포로의 형질전환을 선발하기 위한 유전자(예를 들면, 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이와 같은 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들면, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.

또한, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한, 세포내에서의 유전자의 카피 수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면, pSV2-dhfr(「Molecular Cloning 2nd edition」 Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)) 등)를 도입하고, 메토트렉세이트(MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있으며, 또한, 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS 세포를 사용하여 SV40의 복제 기점을 갖는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는, 또한, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 소유두종 바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 사용하는 것도 가능하다. 또한, 숙주세포계에서 유전자 카피 수의 증폭을 위해, 발현 벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드 트랜스페라아제(APH) 유전자, 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴구아닌 포스포리보실트랜스페라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

이것에 의해 얻어진 본 발명의 항체는, 숙주세포내 또는 세포외(배지 등)로부터 단리하여, 실질적으로 순수하고 균일한 항체로서 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는, 통상의 항체의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 전혀 한정되지 않는다. 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하면 항체를 분리, 정제할 수 있다.

크로마토그래피로서는, 예를 들면 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들 크로마토그래피는, 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용해서 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들면, 프로테인 A를 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose FF(GE Amersham Biosciences) 등을 들 수 있다. 본 발명은 이들 정제방법을 사용하여 고도로 정제된 항체도 포함한다.

항체의 NR10에 대한 결합활성의 측정은, 당업자에 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 예를 들면, 항체의 항원 결합활성을 측정하는 방법으로서, ELISA(효소결합 면역흡착 검정법), EIA(효소 면역 측정법), RIA(방사 면역 측정법) 또는 형광 항체법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 효소 면역 측정법을 사용하는 경우, 항원을 코팅한 플레이트에, 항체를 포함하는 시료, 예를 들면, 항체 생산세포의 배양상청이나 정제 항체를 첨가한다. 알칼리포스파타아제 등의 효소로 표지한 이차 항체를 첨가하고, 플레이트를 인큐베이트하여, 세정한 후, p-니트로페닐인산 등의 효소 기질을 첨가하여 흡광도를 측정함으로써 항원 결합활성을 평가할 수 있다.

또한, 항체의 NR10에 대한 중화활성의 측정은, 예를 들면, 참고예 기재의, 그 IL-31 의존성 세포주의 증식 억제효과를 관찰하는 방법에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 NR10 안타고니스트 또는 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체는, 소양증의 예방 또는 치료제에 사용할 수 있다. 본 발명자들은, 마우스 NR10에 대한 중화항체를 소양증 모델 동물에 투여하고, 현저한 치료효과가 얻어지는 것을 실증하였다. 추가적으로, 항체 이외의 NR10 안타고니스트에 대해서도, 본 실시에에 있어서의 소견과 마찬가지로, 소양증에 대한 치료효과를 갖는 것으로 생각된다.

본 발명자들은, NR10에 대한 안타고니스트 항체가 소양증에 대해 치료효과를 갖고 있는 것을 발견하였다. 한편, 급성 접촉성 피부염 및 DSS 급성 대장염 모델에 있어서는, NR10에 대한 안타고니스트 항체가 그들의 질환 자체에는 치료효과를 갖지 않는 것이 판명되었다.

본 발명에 있어서는, 소양증의 치료와, 소양증의 원인이 되는 질환이나 증상(예를 들면, 이하에 기재되어 있는 아토피성 피부염, C형 간염 등의 질환)의 치료와는 구별된다. 따라서, 본 발명의 소양증의 치료제 또는 예방제는, 소양증의 원인이 되는 질환이나 증상 자체를 치료 또는 예방하는 것이 아니라, 소양증 자체의 예방 또는 치료를 타겟으로 하는 것이다. 본 발명의 치료제 또는 예방제는, 소양증의 원인이 되는 질환이나 증상을 치료 또는 예방할 목적은 아니고, 소양증의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게, 소양증을 치료 또는 예방할 목적으로 투여된다.

본 발명에 의해 치료되는 소양증은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 소양증이어도 된다. 본 발명에 의해 치료되는 소양증의 구체적인 예로서, 예를 들면, 개선(疥癬), 이 기생증, 벌레에 쏘이고 물린 상처, 두드러기, 아토피성 피부염, 접촉 피부염, 편평태선, 습진, 포진상 피부염, 건피증, 담도폐색, 원발성 담즙성 간경변(PBC), C형 간염 등의 감염성 간염, 요독증, 만성 신부전, 신장투석, 림프종, 백혈병, 진성 일차성 적혈구 증가증, 임신, 약물의 복용(바르비투레이트, 살리실산 등), 갑상선기능항진증, 진성 당뇨병, 내장암 등에 있어서의 소양증을 들 수 있다.

본 발명의 소양증의 예방 또는 치료제는, 전술한 NR10 안타고니스트 또는 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다. NR10 안타고니스트를 「유효성분으로서 함유하는」이란, NR10 안타고니스트를 활성성분의 하나 이상으로서 포함한다는 의미이며, 그 함유율을 제한하는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 소양증의 예방 또는 치료제는, NR10 안타고니스트와 함께 다른 소양증의 예방 또는 치료를 촉진하는 성분을 함유해도 된다.

본 발명의 소양증 치료제 또는 예방제가 대상으로 하는 소양증은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 원인에 의한 소양증이어도 되나, 바람직하게는 IL-31이 관여하는 소양증이다. IL-31이 관여하는 소양증으로서는, IL-31에 의해 유발되는 소양증, IL-31이 고발현하고 있는 소양증 등을 들 수 있다.

본 발명의 NR10 안타고니스트는, 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있다(예를 들면, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A). 또한, 필요에 따라, 의약적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가물을 함께 포함해도 된다. 예를 들면, 계면활성제(PEG, Tween 등), 부형제, 산화방지제(아스코르브산 등), 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제(인산, 구연산, 다른 유기산 등), 킬레이트제(EDTA 등), 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료제는, 이들에 제한되지 않고, 기타 상용의 담체를 적절히 포함하고 있어도 된다. 구체적으로는, 연질 무수규산, 젖당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로오스칼슘, 카르멜로오스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염류 등을 들 수 있다. 또한, 기타 저분자량의 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 및 면역글로불린 등의 단백질, 및 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 및 리신 등의 아미노산을 포함하고 있어도 된다. 주사용의 수용액으로 하는 경우에는, NR10 안타고니스트를, 예를 들면, 생리식염수, 포도당 또는 기타 보조약을 포함하는 등장액에 용해한다. 보조약으로서는, 예를 들면, D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 또한, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, HCO-50) 등과 병용해도 된다.

또한, 필요에 따라 NR10 안타고니스트를 마이크로 캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로 캡슐)에 봉입하거나, 콜로이드 드러그 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 하는 것도 가능하다(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed.(1980) 등 참조). 또한, 약제를 서방성의 약제로 하는 방법도 공지로, NR10 안타고니스트에 적용할 수 있다(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res.(1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech.(1982)12: 98-105; 미국 특허 제3,773,919호; 유럽 특허출원 공개(EP) 제58,481호; Sidman et al., Biopolymers(1983)22:547-56; EP 제133,988호).

본 발명의 소양증의 예방 또는 치료제는, 경구 또는 비경구 중 어느 것으로도 투여 가능하나, 바람직하게는 비경구 투여된다. 구체적으로는, 주사 및 경피 투여에 의해 환자에게 투여된다. 주사제형의 예로서는, 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사 또는 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 염증을 억제하고자 하는 부위 또는 그 주변에 국소 주입, 특히 근육 내 주사해도 된다. 또한, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 투여량으로서는, 예를 들면, 1회에 체중 1 ㎏당 활성성분을 0.0001 ㎎~100 ㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또한, 예를 들면, 인간 환자에게 투여하는 경우, 환자당 활성성분을 0.001~1000 ㎎/㎏·body·weight의 범위에서 선택할 수 있고, 1회당 투여량으로서는, 예를 들면, NR10 안타고니스트가 0.01~50 ㎎/㎏·body·weight 정도의 양이 포함되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 소양증의 예방 또는 치료제는, 이들 투여량에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 IL-31 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 소양증 치료제를 제공한다. IL-31 안타고니스트는 IL-31에 결합하여, IL-31의 생물학적 활성을 저해하는 물질이면 특별히 한정되지 않는다. IL-31 안타고니스트의 바람직한 예로서, 항 IL-31 항체를 들 수 있다(예를 들면, WO 2006/088955, WO 2006/88956, WO 2006/122079). 항IL-31 항체의 제작, 개변, 수식, 제조, 정제, 투여, 제제화 등의 모든 것은 전술한 항NR10 항체의 기재를 준용할 수 있다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

[실시예 1]

IL -31 유발의 소양행동 평가

9주령, 자성(雌性) 정상 BALB/c 마우스(닛폰 찰스리버)에 10 ㎍의 마우스 IL-31(in house)을 정맥 내 투여하고, 투여 직후부터 12시간의 소양행동을 소양측정장치(MicroAct, 뉴로사이언스)를 사용해서 측정, 해석하였다. 그 결과, 비히클(vehicle)(0.5 % BALB/c 마우스 혈청 함유 PBS) 투여군(n=8)과 비교하여, IL-31 투여군(n=8)에서 투여 후 약 5시간을 피크로 하는 유의(有意)한 소양횟수의 증가가 확인되었다. 또한, 이 IL-31 유발의 소양행동은, IL-31 투여 전에 항마우스 NR10 중화항체인 BM095 350 ㎎/㎏의 정맥 내 투여에 의해(n=8), 완전히 억제되었다(도 1). 이 결과로부터, 항NR10 중화항체가 IL-31에 의해 야기된 소양증에 대한 억제효과를 갖는 것이 증명되었다.

진드기 항원 유발 피부염 모델에 대한 항 NR10 중화항체의 효과

9주령의 SPF 자성 NC/Nga Tnd Crlj 마우스(닛폰 찰스·리버)의 배쪽 귓바퀴 피내에, 진드기 항원으로서 Dermatophagoides pteronyssinus(Dp) 조(粗)추출물(Cosmo Bio LSL) 5 ㎍을 주 3회, 3주간 투여하여 피부염을 유발하였다(Int Arch Allergy Immunol 2004;133:55-63). Dp의 용매 대조군은, 생리적 식염수(오츠카제약) 5 μL를 동일한 스케줄로 투여하였다(n=7). 이 병태 모델에 대해, 항마우스 NR10 중화항체 BM-095 20 ㎎/㎏을 day 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21에 정맥 내 투여하였다(n=8). 용매 대조군으로서, 200 m㏖/L NaCl/20 m㏖/L Na acetate buffer(pH 5.5)를 동일한 스케줄로 정맥 내 투여하였다(n=8).

소양증의 평가는, day 21에 있어서 소양측정장치(MicroAct, 뉴로사이언스)를 사용해서 12시간의 측정시간 중의 소양횟수(Scratching)를 계측하였다. 그 결과, 용매 대조군의 소양횟수는 Dp의 용매 대조군에 대해 유의(p<0.005)하게 증가하였다. 이때, BM095 투여군은 용매 대조군에 대해 유의(p＜0.05)하게 소양횟수를 억제하였다(도 2).

이 결과로부터, 항NR10 중화항체가 소양증에 대해 억제효과를 갖는 것이 나타났다.

[실시예 2] 게잡이원숭이에 있어서의 IL-31 유발 소양증에 대한 H0L0의 억제효과

4-5년령의 게잡이원숭이에 게잡이원숭이 IL-31을 정맥 내 투여하여 유발되는 소양증에 대한 항인간 NR10 항체 H0L0(중쇄 아미노산 서열/서열번호:17, 경쇄 아미노산 서열/서열번호:18)의 영향을 검토하였다. PBS(vehicle) 또는 H0L0 0.01, 0.03, 0.06, 0.3, 0.6 ㎎/㎏을 정맥 내 투여 후 24시간째에 게잡이원숭이 IL-31 1 g/㎏을 정맥 내 투여하고, 그 후의 2시간의 행동을 비디오 촬영하였다. 촬영한 비디오는 재생하여, 3회 이상 연속한 소파(搔破)행동을 소양행동으로 하여 소양횟수를 계측하였다. 그 결과, H0L0는 게잡이원숭이 IL-31로 유발되는 소양횟수를 용량 의존적으로 억제하였다(도 5). 이 결과로부터, 항NR10 항체 H0L0가 소양증에 대한 억제효과를 갖는 것이 나타났다.

[참고예 1] NR10 및 OSMR 발현 Ba/F3 세포주의 수립

인간 NR10 cDNA(WO 0075314 SEQ ID No:1/서열번호:16)를 발현 벡터 pCOS1(Biochem Biophys Res Commun. 228, p838-45, 1996)에 삽입하여, pCosNR10.3로 하였다. 온코스타틴 M 수용체 cDNA(OSMR, GenBank accession No. NM003999)를 인간 태반 라이브러리로부터 PCR법에 의해 단리하여, 마찬가지로, 발현 벡터 pCos1-hOSMR을 구축하였다. 마우스 IL-3 의존성 pro-B 세포 유래 세포주 Ba/F3에, 각각의 벡터 10 ㎍씩을 동시에 전기천공법으로 도입하였다(BioRad Gene Pulser, 960 μF, 0.33 kV). 도입 후는, 인간 IL-31을 첨가·배양하여, IL-31 의존성으로 증식을 나타내는 세포주를 얻었다. 마찬가지로, 마우스 IL-31 의존성 세포주도, 마우스 NR10 및 마우스 OSMR 유전자를 발현시킨 Ba/F3 세포로 제작하였다.

모두 수 ng/mL의 ED50을 나타내고, 양호하게 증식하는 세포주가 얻어졌다. 인간 IL-31 의존성 세포주는 마우스 IL-31에 반응하지 않고, 인간 NR10 단백(세포외영역) 첨가에 의해 억제되었다. 마우스 IL-31 의존성 세포주는, 인간 IL-31에 반응하지 않고, 마우스 NR10 첨가 단백(세포외영역)에 의해 억제되지 않았다.

[참고예 2] NR10 단백(세포외영역)의 조제

인간 NR10 cDNA를 주형으로, PCR법에 의해 세포외영역만을 증폭하고, 또한 C 말단에 FLAG 태그 서열을 부가하여, 발현 벡터 pCXND3(WO 2005/005636)에 삽입하였다(pCXND3-NR10-flag). 직쇄상으로 한 이 벡터 10 ㎍을 차이니즈 햄스터 난소 세포주 DG44로 전기천공법에 의해 도입하여(BioRad Gene PulserII, 25 μF, 1.5 kV), 고발현을 나타내는 세포주를 얻었다. 이 세포주를 대량 배양한 배양상청으로부터 항FLAG 항체 칼럼(SIGMA제), 겔 여과법에 의해 정제 표품을 얻어, 이하의 실험에 제공하였다. C 말단에 FLAG 태그 서열을 부가한 마우스 NR10(세포외영역)도 동일하게 조제하였다.

[참고예 3] 항마우스 NR10 중화활성을 갖는 scFv의 단리와 키메라 IgG화 BM095의 조제

인간 항체 파지 라이브러리로부터, 비오틴화한 마우스 NR10 단백(세포외영역)을 사용해서, 패닝법에 의해 후보 클론을 가려내었다. 이들 클론으로부터 분비 scFv를 정제하고, 이것을 참고예 1에 기재된 IL-31 의존성 Ba/F3 세포 증식 어세이계에 첨가하였다. 그 결과, 강한 증식 억제활성을 나타내는 클론 BM095를 얻는 것에 성공하였다.

PCR법에 의해, BM095의 인간 H쇄 가변영역 서열(VH)을 마우스 IgG2a 정상영역(CH1 이후)에, 인간 L쇄 가변영역 서열(VL)을 마우스 λ쇄 정상영역에 연결하여, 발현 벡터를 구축하였다. 이때의 VH의 아미노산 서열을 서열번호:1에, 그 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:2에 나타낸다. 또한, VL의 아미노산 서열을 서열번호:3에, 그 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:4에 나타낸다. 직쇄상으로 한 각각의 발현 벡터를 동시에 DG44주에 도입하고, 키메라 IgG의 높은 발현량을 나타내는 세포주를 선별하였다. 이 세포주를 대량 배양한 배양상청으로부터, 프로테인 A(rProtein A Sepharose Fast Flow, GE Amersham Biosciences제) 칼럼, 양이온 교환(SP-TOYOPEARL 650M, TOSOH제) 칼럼 크로마토그래피에 의해, 정제 표품을 얻었다. 또한, ActiClean Etox(Sterogen제) 수지에 의해 파이로젠(pyrogen)을 검출 한계 이하까지 저감하였다.

[참고예 4] Dextran Sulfate Sodium(DSS) 유발 대장염에 대한 BM095의 약효

염증성 장질환(IBD)의 병태 모델로서 보고되어 있는 DSS 유발 대장염 모델(J Immunol 2003;171:5507-5513)을 제작하여, 항마우스 NR10 중화항체인 BM-095의 효과를 검토하였다. Dextran Sulfate Sodium Salt(와코순약제)의 5%(w/v) 수용액을, 0.22 ㎛ 필터(Millipore제)로 여과 멸균한 증류수를 사용해서 조제하고, 6주령의 웅성(雄性) Balb/cAnN Crj 마우스(닛폰 찰스·리버제)에 급수병으로 7일간 자유 섭취시키고, 체중을 측정하여, DSS 투여 개시일의 체중에 대한 변화율을 약효의 평가항목으로 하였다.

본 모델에 있어서, IL-31 시그날링 중화에 의해 병태가 개선되는지 여부를, 항마우스 NR10 중화항체인 BM095를 DSS 투여 전날에 10 ㎎/㎏의 용량으로 정맥 내 투여하여 체중 감소를 평가하였다(n=10). 용매 대조군으로서, 용매(초산 완충액[20 m㏖/L 초산나트륨, 20 m㏖/L 염화나트륨]과 인산 완충 생리식염수[PBS, GIBCO제]를 용량비 1:5로 혼합한 것)를, DSS 투여 전날에 정맥 내 투여한 군(Vehicle군, n=10)을 마련하였다. 또한, 정상 마우스의 체중 변화율의 추이를 파악하기 위해, DSS 투여군과 동일 주령, 성별의 Balb/cAnN Crj 마우스의 체중 변화율의 추이도 관찰하였다(n=1).

체중의 추이를 도 3에 나타내었다. Vehicle군에 있어서는 DSS 투여에 의해 체중 변화율이 저하되었다. 한편, BM095 투여군에 있어서도 Vehicle군과 동일한 체중 추이를 나타내었으나, DSS 투여 후 4 및 5일 후에는 BM095군에서는 Vehicle군보다도 유의하게 체중 변화율이 저하되었다. 이들 결과로부터, BM095 투여에 의한 본 모델의 대장염 치료효과는 확인되지 않았다.

본 모델에 있어서는, IL-31RA의 발현이 항진하는 것이 보고되어 있으나(WO 2004/003140), 상기 실험의 결과, 동 분자의 중화항체는 본 모델의 대장염에 대해 치료효과가 없는 것이 명백해졌다.

[참고예 5] 급성 Picryl chloride 접촉성 피부염 모델에 대한 BM095의 약효

급성 접촉성 피부염의 모델로서 보고되어 있는(Clin Immunol 2003; 108: 257-262), 염화피크릴 도포에 의한 감작·유발에 의한 지연형 과민증반응의 결과 발생하는 피부염을 제작하여, 항마우스 NR10 중화항체인 BM-095의 효과를 검토하였다. 8주령의 자성 Balb/cAnN Crj 마우스(닛폰 찰스·리버제)의 복부 피부에, 50 μL의 7% 염화피크릴(nacalai tesque, Inc.)용액(에탄올:아세톤=3:1, v/v)을 도포하여 감작하고, 5일 후에 20 μL의 1% 염화피크릴용액(아세톤:올리브=1:4, v/v)을 오른쪽 귓바퀴 피부에 도포하여 접촉성 피부염을 야기하였다(유발). 용매의 귓바퀴 두께로의 영향을 평가하기 위한 대조로서, 20 μL의 용매(아세톤:올리브=1:4, v/v)를 동일 마우스의 왼쪽 귓바퀴 피부에 도포하였다(양성 대조군, n=6). 유발 직전 및 유발 후 24, 48, 72시간에 좌우의 귀의 두께를 Dial thickness gauge(오자키제작소제)로 측정하여, 유발 직전의 귓바퀴의 두께에 대한 변화를 약효평가항목으로 하였다.

병태의 성립을 평가하기 위한 대조군으로서, 감작시에 염화피크릴을 포함하지 않는 에탄올:아세톤 혼합액(3:1, v/v)을 복부 피부에 도포하고, 그 5일 후에 20 μL의 1% 염화피크릴용액을 오른쪽 귓바퀴 피부에, 용매(아세톤:올리브=1:4, v/v) 20 μL를 왼쪽 귓바퀴 피부에 도포한 군(음성 대조군, n=6)을 마련하였다.

본 계 병태에 있어서의 항NR10 항체 투여의 효과를 평가하기 위해, 상기 양성 대조군의 방법으로 급성 접촉성 피부염을 야기하고, 감작 전일 및 유발 전일에 BM095 10 ㎎/㎏을 정맥 내 투여한 군(BM095군, n=6)과, 동일한 타이밍에 용매(초산완충액[20 m㏖/L 초산나트륨, 20 m㏖/L 염화나트륨]와 인산 완충 생리식염수[PBS, GIBCO제]를 용량비 1:5로 혼합한 것)를 투여한 군(Vehicle군, n=5)을 마련하였다.

유발 후 72시간까지의 귓바퀴 두께의 변화를 도 4에 나타내었다. 양성 대조군은 유발 후 24, 48, 72시간 중 어느 것에 있어서도 음성 대조군에 대해 유의하게 귓바퀴가 비후되어 있어, 병태가 성립한 것이 나타났다. 이때, BM-095군은 Vehicle군과 동일한 귓바퀴 두께의 추이를 나타내, 유의한 억제는 인정되지 않았다.

이들 결과로부터, BM095 투여에 의한 본 모델에서 관찰되는 급성 접촉성 피부염에 대한 치료효과는 확인되지 않는 것이 판명되었다.

본 발명에 의해 제공되는 NR10에 대한 중화항체 등의 NR10 안타고니스트는, 소양증에 대한 치료제 또는 예방제로서 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING PRURITUS <130> C1-A0713P <150> JP 2007-315144 <151> 2007-12-05 <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Val Val Pro Ala Ala Met Ser Phe Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaggac 300 gtagtaccag ctgctatgtc attctactac ggtatggacg tctggggccg aggaaccctg 360 gtcaccgtct cgagt 375 <210> 3 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Thr Asp Arg Pro Ala Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Asp His 85 90 95 Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 4 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ctgcctgtgc tgactcagcc cccctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa actgtgtact ggtaccagca ggagccaggc 120 caggcccctg tgttggtcgt ctatgatgat accgaccggc ccgcaggaat ccctgagcgc 180 ttctctggcg ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta ctgatcatgg ggttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327 <210> 5 <211> 716 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Trp Thr Leu Ala Leu Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser 1 5 10 15 Leu Ala Val Leu Pro Thr Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr 20 25 30 Phe Asp Arg Asn Leu Thr Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn 35 40 45 Asp Thr Ser Tyr Ile Val Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn 50 55 60 Tyr Ser Asp Asn Ala Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys 65 70 75 80 Ala Met Pro Pro Asp Ile Cys Ser Val Glu Val Gln Ala Gln Asn Gly 85 90 95 Asp Gly Lys Val Lys Ser Asp Ile Thr Tyr Trp His Leu Ile Ser Ile 100 105 110 Ala Lys Thr Glu Pro Pro Ile Ile Leu Ser Val Asn Pro Ile Cys Asn 115 120 125 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aaattgagac 180 aggaaggcag agtgtcagct tgttccacct cagctgggaa tgtgcatcag gcaactcaag 240 tttttcacca cggcatgtgt ctgtgaatgt ccgcaaaaca ttttaacaat aatgcaatcc 300 atttcccagc ataagtgggt aagtgccact ttgacttggg ctgggcttaa aagcacaaga 360 aaagctcgca gacaatcaga gtggaaacac tcccacatct tagtgtggat aaattaaagt 420 ccagattgtt cttcctgtcc tgacttgtgc tgtgggaggt ggagttgcct ttgatgcaaa 480 tcctttgagc cagcagaaca tctgtggaac atcccctgat acatgaagct ctctccccag 540 ccttcatgtg ttaacctggg gatgatgtgg acctgggcac tgtggatgct cccctcactc 600 tgcaaattca gcctggcagc tctgccagct aagcctgaga acatttcctg tgtctactac 660 tataggaaaa atttaacctg cacttggagt ccaggaaagg aaaccagtta tacccagtac 720 acagttaaga gaacttacgc tttcggagaa aaacatgata attgtacaac caatagttct 780 acaagtgaaa atcgtgcttc gtgctctttt ttccttccaa gaataacgat cccagataat 840 tataccattg aggtggaagc tgaaaatgga gatggtgtaa ttaaatctca tatgacatac 900 tggagattag agaacatagc gaaaactgaa ccacctaaga ttttccgtgt gaaaccagtt 960 ttgggcatca aacgaatgat tcaaattgaa tggataaagc ctgagttggc gcctgtttca 1020 tctgatttaa aatacacact tcgattcagg acagtcaaca gtaccagctg gatggaagtc 1080 aacttcgcta agaaccgtaa ggataaaaac caaacgtaca acctcacggg gctgcagcct 1140 tttacagaat atgtcatagc tctgcgatgt gcggtcaagg agtcaaagtt ctggagtgac 1200 tggagccaag aaaaaatggg aatgactgag gaagaagctc catgtggcct ggaactgtgg 1260 agagtcctga aaccagctga ggcggatgga agaaggccag tgcggttgtt atggaagaag 1320 gcaagaggag ccccagtcct agagaaaaca cttggctaca acatatggta ctatccagaa 1380 agcaacacta acctcacaga aacaatgaac actactaacc agcagcttga actgcatctg 1440 ggaggcgaga gcttttgggt gtctatgatt tcttataatt ctcttgggaa gtctccagtg 1500 gccaccctga ggattccagc tattcaagaa aaatcatttc agtgcattga ggtcatgcag 1560 gcctgcgttg ctgaggacca gctagtggtg aagtggcaaa gctctgctct agacgtgaac 1620 acttggatga ttgaatggtt tccggatgtg gactcagagc ccaccaccct ttcctgggaa 1680 tctgtgtctc aggccacgaa ctggacgatc cagcaagata aattaaaacc tttctggtgc 1740 tataacatct ctgtgtatcc aatgttgcat gacaaagttg gcgagccata ttccatccag 1800 gcttatgcca aagaaggcgt tccatcagaa ggtcctgaga ccaaggtgga gaacattggc 1860 gtgaagacgg tcacgatcac atggaaagag attcccaaga gtgagagaaa gggtatcatc 1920 tgcaactaca ccatctttta ccaagctgaa ggtggaaaag gattctccaa gacagtcaat 1980 tccagcatct tgcagtacgg cctggagtcc ctgaaacgaa agacctctta cattgttcag 2040 gtcatggcca acaccagtgc tgggggaacc aacgggacca gcataaattt caagacattg 2100 tcattcagtg tctttgagat tatcctcata acttctctga ttggtggagg ccttcttatt 2160 ctcattatcc tgacagtggc atatggtctc aaaaaaccca acaaattgac tcatctgtgt 2220 tggcccaccg ttcccaaccc tgctgaaagt agtatagcca catggcatgg agatgatttc 2280 aaggataagc taaacctgaa ggagtctgat gactctgtga acacagaaga caggatctta 2340 aaaccatgtt ccacccccag tgacaagttg gtgattgaca agttggtggt gaactttggg 2400 aatgttctgc aagaaatttt cacagatgaa gccagaacgg gtcaggaaaa acaatttagg 2460 aggggaaaag aatgggacta gaattctgtc ttcctgccca acttcaatat aagtgtggac 2520 taaaatgcga gaaaggtgtc ctgtggtcta tgcaaattag aaaggacatg cagagttttc 2580 caactaggaa gactgaatct gtggccccaa gagaaccatc tccgaagact gggtatgtgg 2640 tcttttccac acatggacca cctacggatg caatctgtaa tgcatgtgca tgagaagtct 2700 gttattaagt agagtgtgaa aacatggtta tggtaatagg aacagctttt aaaatgcttt 2760 tgtatttggg cctttcacac aaaaaagcca taataccatt ttcatgtaat gctatacttc 2820 tatactattt tcatgtaata ctatacttct atactatttt catgtaatac tatacttcta 2880 tactattttc atgtaatact atacttctat attaaagttt tacccactcc aaaaaaagaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2969 <210> 17 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Ile Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 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Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Glu Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims

NR10에 대한 중화활성을 갖는 항NR10 단일클론항체를 유효성분으로서 함유하는 소양증의 예방 또는 치료제로서, 상기 항체가 서열번호:7에 기재된 아미노산 서열에 있어서 21번째의 아미노산에서 120번째의 아미노산까지의 영역을 인식하는 항체이고,
상기 항NR10 단일클론항체가 서열번호:17에 기재된 중쇄 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열, 및 서열번호:18에 기재된 경쇄 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 가지며, 또한
서열번호:17에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호:18에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체와 기능적으로 동등한 변이체인 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서,
상기 항NR10 단일클론항체가 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체인 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서,
상기 항NR10 단일클론항체가 인간 NR10 및 게잡이원숭이 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체인 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서,
상기 항NR10 단일클론항체가 재조합 항체인 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서,
상기 항NR10 단일클론항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서,
상기 항NR10 단일클론항체가 서열번호:17에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호:18에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 각각 코드하는 핵산에 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건 하에서 각각 하이브리다이즈하는 핵산에 의해 각각 코드되는 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열을 갖는 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서,
상기 항NR10 단일클론항체가 서열번호:17에 기재된 중쇄 아미노산 서열을 갖는 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서,
상기 항NR10 단일클론항체가 서열번호:17에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호:18에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 갖는 예방 또는 치료제.
소양증의 예방 또는 치료제의 제조를 위한 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항NR10 단일클론항체의 사용방법으로서, 상기 항체가 서열번호:7에 기재된 아미노산 서열에 있어서 21번째의 아미노산에서 120번째의 아미노산까지의 영역을 인식하는 항체이고,
상기 항NR10 단일클론항체가 서열번호:17에 기재된 중쇄 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열, 및 서열번호:18에 기재된 경쇄 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열을 가지며, 또한
서열번호:17에 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호:18에 기재된 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체와 기능적으로 동등한 변이체인 사용방법.
제9항에 있어서,
상기 항NR10 단일클론항체가 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체인 사용방법.
제9항에 있어서,
상기 항NR10 단일클론항체가 인간 NR10 및 게잡이원숭이 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체인 사용방법.
제9항에 있어서,
상기 항NR10 단일클론항체가 재조합 항체이고, 또한 카메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 사용방법.
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