PL201461B1 - Czynnik zapobiegający lub terapeutyczny do leczenia zapalenia jelita, zawierający antagonistę IL-6 jako składnik aktywny - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie antagonisty interleukiny-6 (IL-6) do wytwarzania czynnika zapobiegaj acego lub terapeutycznego do leczenia choroby zapalenia jelita, przy czym antagonista interleukiny-6 (IL-6) jest przeciwcia lem przeciwko receptorowi IL-6. 7. Zastosowanie wed lug zastrz. 4, znamienne tym, ze przeciwcia lo monoklonalne jest przeciw- cia lem MR16-1. 8. Zastosowanie wed lug zastrz. 1, albo 3, znamienne tym, ze przeciwcia lo przeciwko recepto- rowi IL-6 jest chimerycznym lub humanizowanym przeciwcia lem przeciwko receptorowi IL-6. PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 342938	(11) 201461 (13) B1
	(22) Data zgłoszenia: 16.03.1999	(51) Int.Cl. A61K 39/395 (2006.01)
	(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:	A61K 45/00 (2006.01)
etp	16.03.1999, PCT/JP99/01298	A61P 1/04 (2006.01)
Urząd Patentowy	(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
Rzeczypospolitej Polskiej	23.09.1999, WO99/47170 PCT Gazette nr 38/99

(54) Czynnik zapobiegający lub terapeutyczny do leczenia zapalenia jelita, (54) zawierający antagonistę IL-6 jako składnik aktywny
	(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo: 17.03.1998,JP,10-67250	CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA,Tokio,JP Kishimoto Tadamitsu,Osaka,JP
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 16.07.2001 BUP 15/01	(72) Twórca(y) wynalazku: Hiroaki Ito,Hyogo,JP Mitsunari Yamamoto,Osaka,JP
	Tadamitsu Kishimoto,Osaka,JP
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2009 WUP 04/09	(74) Pełnomocnik:
	Bartnik Urszula, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o.

⁽⁵⁷⁾ 1. Zastosowanie antagonisty interleukiny-6 (IL-6) do wytwarzania czynnika zapobiegającego lub terapeutycznego do leczenia choroby zapalenia jelita, przy czym antagonista interleukiny-6 (IL-6) jest przeciwciałem przeciwko receptorowi IL-6.

7. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne jest przeciwciałem MR16-1.

8. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 3, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest chimerycznym lub humanizowanym przeciwciałem przeciwko receptorowi IL-6.

PL 201 461 B1

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy czynnika zapobiegającego lub terapeutycznego do leczenia zapalenia jelita, zawierającego antagonistę interleukiny-6 (IL-6) jako składnik aktywny. Niniejszy wynalazek dotyczy również czynnika zapobiegającego lub terapeutycznego dla choroby Crohna lub wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, zawierającego antagonistę IL-6 jako składnik aktywny.

Tło wynalazku

IL-6 jest cytokiną zwaną również czynnikiem stymulującym komórki B 2 (BSF2) lub interferonem β2. IL-6 została odkryta jako czynnik różnicowania biorący udział w aktywacji komórek B-limfocytowych (Hirano, i wsp., Nature (1986) 324, 73-76). Następnie, okazała się wielofunkcyjną cytokiną, wpływającą na różnorodne funkcje komórek (Akira, S. i wsp., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78). Wykazano, że IL-6 indukuje dojrzewanie komórek T-limfocytowych (Lotz, M. i wsp., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258).

IL-6 przekazuje sygnał biologiczny poprzez dwa białka na powierzchni komórki. Jednym z nich jest receptor IL-6, białko wiążące IL-6, o masie cząsteczkowej około 80 kD, (Taga, T. i wsp., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981; Yamasaki, K. i wsp., Science (1987) 241, 825-828). Receptor IL-6 istnieje nie tylko w formie związanej z błoną z domeną transbłonową ulegającą ekspresji na powierzchni komórki, ale również jako rozpuszczalny receptor IL-6, składający się głównie z regionu pozakomórkowego.

Drugim białkiem jest związane z błoną białko gp130 posiadające masę cząsteczkową około 130 kD, które bierze udział w transdukcji sygnału nie indukowanej związaniem ligandu. IL-6 i receptor IL-6 tworzą kompleks IL-6/receptor IL-6, który po związaniu gp130 przekazuje sygnał biologiczny do komórki (Taga, T. i wsp., Cell (1989) 58, 573-581).

Antagoniści IL-6 są substancjami, które hamują transdukcję aktywności biologicznej IL-6. Podobnie jak antagoniści IL-6, znane jest również przeciwciało przeciwko IL-6 (przeciwciało anty-IL-6), przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 (przeciwciało anty-receptor-IL-6) oraz przeciwciało przeciwko gp130 (przeciwciało anty-gp130), zmieniona IL-6, częściowe peptydy IL-6 lub receptora IL-6, itd.

Przeciwciało anty-receptor IL-6 zostało opisane w kilku doniesieniach (Novick D. i wsp., Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, Y. W. i wsp., Hybridoma (1993)12, 621-630, Publikacji Zgłoszenia Międzynarodowego WO 95/09873, publikacji francuskiego opisu patentowego FR 2694767, dokumencie patentowym St. Zjedn. Am. US 521628). Humanizowane przeciwciało PM-1, jak wiadomo zostało otrzymane poprzez przeszczepienie regionu determinującego komplementarność (CDR) mysiego przeciwciała PM-1 (Hirata, Y. i wsp. J. Immunology (1989) 143, 2900-2906) do matrycy ludzkiego przeciwciała (Zgłoszenie Międzynarodowe WO 92-19759).

Zapalenie jelita (IBD) jest niespecyficznym zapaleniem reprezentowanym przez wrzodziejące zapalenie jelita grubego oraz chorobę Crohna. Uważana się jednak, że przyczyną choroby są zakłócenia immunologiczne, jednak nie doprowadziło to do wyjaśnienia etiologii. Uważa się, że w uszkodzeniach śluzówki biorą udział skupiska monocytów i limfocytów obecne w miejscach lezji, a na szczególną uwagę zasługują czynniki zapalne, w szczególności cytokiny (takie jak IL1 β, TNFa oraz IL-6).

Spośród mediatorów zapalnych, w odniesieniu do IL-6, uwagę zwraca jej związek ze statusem choroby oraz możliwością zastosowania jako specyficzny wskaźnik dla IBD. Poziom IL-6 w surowicy wzrasta zarówno w chorobie Crohna, jak i wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego, i poziom koreluje ze stadium choroby (Holtkamp, W. i wsp., J. Clin. Gastroenterology (1995) 20, 123-126, Niederau, C. i wsp., Hepato-Gastroenterology (1997) 44, 90-107). Pomiar ilości mRNA IL-6 w tkance jako produktu PGR (łańcuchowa reakcja polimeryzacji) wykazał, że mRNA koreluje dobrze ze stadium choroby zarówno we wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego, jak i chorobie Crohna (Stevens, C. i wsp., Dig. Dis. Sci. (1992) 37, 818-826). W trakcie wzrostu produkcji IL-6 podczas aktywnego IBD, analizowano mechanizm, odkrywając, że w czasie stymulacji komórek jednojądrzastych w błonie podstawnej mitogenem Pokeweed, stopień produkcji IL-6 jest dobrze skorelowany ze stadium choroby (Reinecker, H. -C. i wsp., Clin. Exp. Immunol. (1993) 94, 174-181).

Następnie, obserwowano korelację pomiędzy produkcją IL-6 a stanem choroby w hodowli komórek jednojądrzastych otrzymanych z błony podstawnej oraz w hodowli tkankowej śluzówki pacjentów. W pierwszym przypadku, wykazano również, że liczba komórek produkujących IL-6 w tkance śluzówki również wzrosła. Spośród jednojądrzastych komórek produkujących IL-6 najważniejszymi są makrofagi i potwierdzono również obecność dużej liczby makrofagów CD68+, które intensywnie produkują IL-6 w błonie podstawnej pacjentów z IBD w stadium aktywnym (Kusugami, K. i wsp. Dig. Dis. Sci. (1995), 40, 949-959).

PL 201 461 B1

Odkryto również, że produkcja IL-6 koreluje z endoskopowymi obserwacjami u pacjentów z chorobą Crohna (Reimund, J. M. i wsp, Gut (1996) 39, 684-689). Dodatkowo, istnieją pewne doniesienia, że nie tylko stężenie IL-6 ale również stężenie rozpuszczalnego receptora IL-6 w surowicy dobrze koreluje ze stanem choroby (Mitsuyama, K. i wsp. Gut (1995) 36, 45-49).

Wielkość produkcji innych niż IL-6 czynników zapalnych IL-1 β, również koreluje ze stadium choroby. Z drugiej strony, nie zawsze jest to prawą dla TNFa a poziom produkcji jest może mieć tendencję do wzrostu przy niskiej aktywności w stanie choroby (Reinecker, H. C. i wsp., Glin. Exp. Immunol. (1993) 94, 174-181, Reimund, J. M. i wsp., Gut (1996) 39, 684-689).

Na obecny sposób leczenia IBD składa się łącznie dieta wraz z leczeniem przepisanym salazosulfapirydyną, glukokortykoidami, itd. Lekarstwa te bywają jednak nie tolerowane przez pacjentów z powodu efektów ubocznych, i przez to problemów pojawiających się w trakcie długotrwałego podawania.

Z drugiej strony, prowadzone są badania nad nowym leczeniem IBD, mającym na celu zatrzymanie rozwoju choroby poprzez zahamowanie aktywności cytokin. Głównymi celami są IL-1 oraz TNF-α (Van Deventer, S.J.H. Gut (1997) 40, 443-448); dla IL-1, antagoniści receptorów IL-1 (Cominelli F. i wsp., Gastroenterology (1992) 103, 65-71) oraz inhibitor IL-1, CGP47969A (Casini-Raggi i wsp., Gastroenterology (1995) 109, 812-818) oraz inne, które są w trakcie etapu badań klinicznych lub na zwierzętach. Odnośnie TNFa, pacjentom z chorobą Crohna podawano swoiste, monoklonalne przeciwciało przy którym obserwowano zmniejszenie aktywności oraz wyleczenie wrzodów (Van Dullemen, H. M. i wsp., Gastroenterology (1995) 109, 129-135). Nie wiadomo było jednakże, że antagonista IL-6 może leczyć IBD, specyficznie hamując biologiczną aktywność IL-6.

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie antagonisty interleukiny-6 (IL-6) do wytwarzania czynnika zapobiegającego lub terapeutycznego do leczenia choroby zapalenia jelita, przy czym antagonista interleukiny-6 (IL-6) jest przeciwciałem przeciwko receptorowi IL-6.

Przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 korzystnie jest przeciwciałem monoklonalnym przeciwko receptorowi IL-6, a bardziej korzystnie jest przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6.

Także korzystnie, przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6.

Przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 także korzystnie jest przeciwciałem rekombinowanym.

Zgodnie z wynalazkiem, przeciwciało monoklonalne korzystnie jest przeciwciałem PM-1 lub bardziej korzystnie jest przeciwciałem MR16-1.

Korzystnie przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest chimerycznym lub humanizowanym przeciwciałem przeciwko receptorowi IL-6, a bardziej korzystnie jest humanizowanym przeciwciałem PM-1.

W zastosowaniu według wynalazku zapalenie jelita jest chorobą Crohna lub wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie antagonisty przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi IL-6 do produkcji czynnika zapobiegającego utracie wagi w chorobie zapalenia jelita.

Praktyczne wykonanie wynalazku

Antagoniści IL-6 stosowani w niniejszym wynalazku mogą być dowolnego pochodzenia, dowolnego rodzaju oraz w dowolnej postaci, dopóki posiadają działanie zapobiegające lub terapeutyczne dla zapalenie jelita, bądź wpływają na kontrolę utraty wagi w zapaleniu jelita.

Antagoniści IL-6 blokują transdukcję sygnału przez IL-6 oraz hamują aktywność biologiczną IL-6. Jako antagonistów IL-6 można wymienić korzystnie przeciwciało anty-IL-6, przeciwciało anty-receptor IL-6, przeciwciało anty-gp130, zmienioną IL-6, zmieniony rozpuszczalny receptor IL-6, częściowy peptyd IL-6 lub receptor IL-6, oraz niskocząsteczkowe substancje mające podobną do nich aktywność.

Przeciwciała anty-IL-6 stosowane w niniejszym wynalazku można otrzymać jako monoklonalne lub poliklonalne przy użyciu znanej metody. W niniejszym wynalazku korzystnie stosowane są przeciwciała monoklonalne anty-IL-6, szczególnie o pochodzeniu ssaczym. Monoklonalne przeciwciała pochodzenia ssaczego dotyczą tych, które są produkowane przez hybrydomy i przeciwciała rekombinowane wytwarzane przez komórkę gospodarza tranformowaną wektorem ekspresyjnym zawierającym genetycznie zmodyfikowane geny przeciwciał. Przeciwciała te, poprzez wiązanie z IL-6, blokują wiązanie IL-6 z receptorem IL-6, a tym samym blokują transdukcję sygnałów biologicznej aktywności IL-6 do komórki.

PL 201 461 B1

Przykłady takich przeciwciał obejmują MH166 (Matsuda i wsp., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) oraz SK2 (Sato, K. i wsp., The 21st Ninon Mennekigakkai Soukai (General Meeting of the Japan Immunology Society), Academic Record (1991) 21, 166) itp.

Hybrydoma produkująca przeciwciało anty IL-6 może zostać zasadniczo skonstruowana przy użyciu znanej metody opisanej poniżej. A zatem, IL-6 może być użyta jako antygen uczulający w konwencjonalnej metodzie immunizacji. Otrzymane w ten sposób immunizowane komórki ulegają fuzji ze znanymi komórkami rodzicielskimi w trakcie konwencjonalnego procesu fuzji komórek, a następnie, komórki produkujące przeciwciała monoklonalne są wyszukiwane konwencjonalną metodą przesiewową celem przygotowania docelowej hybrydomy.

Konkretnie, przeciwciało anty-IL-6 można otrzymać w następujący sposób. Na przykład, ludzka IL-6 stosowana jako antygen uczulający dla otrzymania przeciwciała może zostać uzyskana przy użyciu genu/sekwencji aminokwasowej IL-6 zawartej w Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Immuno. (1988) 140, 1534-1541, lub Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688.

Po transformowaniu odpowiedniej komórki gospodarza poprzez wprowadzenie sekwencji genu IL-6 do znanego systemu wektora ekspresyjnego, białko IL-6 jest oczyszczane z komórek gospodarza lub ich supernatantu hodowlanego. Oczyszczone białko IL-6 może być stosowane jako antygen uczulający.

Alternatywnie, białko fuzyjne IL-6 i innego białka może również być stosowane jako białko uczulające.

Stosowane w niniejszym wynalazku przeciwciała anty-receptor IL-6 mogą być otrzymywane jako poliklonalne lub monoklonalne przy zastosowaniu znanej metody. Korzystnie w niniejszym wynalazku stosowane są przeciwciała monoklonalne anty IL-6, szczególnie o pochodzeniu ssaczym. Monoklonalne przeciwciała pochodzenia ssaczego dotyczą tych, które są produkowane hybrydomy oraz produkowane przez komórkę gospodarza tranformowaną wektorem ekspresyjnym zawierającym genetycznie zmodyfikowane geny przeciwciał. Przeciwciała te, poprzez wiązanie z receptorem IL-6, blokują wiązanie IL-6 do receptora IL-6, a tym samym blokują transdukcję sygnałów biologicznej aktywności IL-6 do komórki.

Przykłady takich przeciwciał dotyczą MR16-1 (Tamura, T., i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), PM-1 (Hirata, i wsp., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906), lub AUK12-20, AUK64-7 lub AUK146-15 (Zgłoszenie Międzynarodowe publikacja WO 92/19759), itd. Spośród nich najkorzystniejsze jest przeciwciało PM-1.

Linia komórkowa hybrydomy produkująca przeciwciało PM-1 została międzynarodowo złożona do depozytu w ramach Budapest Treaty jako PM-1, dnia 10 lipca 1990 r., w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-2998. Dodatkowo, linia komórkowa hybrydomy, która produkuje przeciwciało MR-16 została złożona do depozyty w ramach Budapest Treaty jako MR16-1 dnia 13 marca 1997 r., w The National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-5875.

Hybrydoma produkująca monoklonalne przeciwciało anty-receptor IL-6 może być zasadniczo skonstruowana przy zastosowaniu znanej procedury opisanej poniżej. A zatem, receptor IL-6 używany jest jako antygen uczulający zgodnie z konwencjonalną metodą immunizacji. Otrzymane w ten sposób komórki immunizowane ulegają fuzji ze znanymi komórkami rodzicielskimi w konwencjonalnym procesie fuzji komórek, a następnie komórki produkujące przeciwciała monoklonalne mogą być wyszukiwane konwencjonalną metodą przesiewową, celem przygotowania docelowej hybrydomy.

Konkretnie, przeciwciało anty-receptor IL-6 może zostać przygotowane w następujący sposób. Na przykład, ludzki receptor ludzkiej IL-6 stosowany jako antygen uczulający może być otrzymany przy użyciu genu/sekwencji aminokwasowej receptora IL-6 zawartej w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 325474, zaś mysi receptor IL-6 może być otrzymany stosując ten opisany w japońskiej nie badanej publikacji patentowej (Kokai) 3(1991)-155795.

Istnieją dwa typy białek receptora IL-6: Receptor IL-6 ulegający ekspresji na błonie komórkowej oraz receptor IL-6 oddzielony od błony komórkowej (rozpuszczalny receptor IL-6) (Yasukawa, K. i wsp., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Przeciwciał o rozpuszczalnego receptora IL-6 zasadniczo składa się z zewnątrz-komórkowego regionu receptora IL-6 związanego z błoną komórkową, a tym samym z różni się od związanego z błoną receptora IL-6 tym, że ten ostatni nie ma regionu transbłonowego lub zarówno regionu transbłonowego jak i wewnątrzkomórkowego. Jako białko receptora IL-6

PL 201 461 B1 w roli antygenu uczulają cego do produkcji przeciwciał a dla receptora IL-6 stosowanego w niniejszym wynalazku, użyty może zostać jakikolwiek receptor IL-6.

Po wstawieniu sekwencji sekwencji genu dla receptora IL-6 do znanego systemu wektorowego ekspresji transformującego odpowiednie komórki gospodarza, docelowe białko receptora IL-6 może zostać oczyszczone z komórek gospodarza lub innych supernatantu hodowlanego przy użyciu znanej metody. Oczyszczone w ten sposób białko receptora IL-6 może być użyte jako antygen uczulający. Alternatywnie, jako antygen uczulający mogą być użyte komórki wykazujące ekspresję receptora IL-6 lub białko fuzyjne receptora 11-6 i innego białka.

E. coli mająca plazmid pIBIBSF2R zawierający cDNA kodujący ludzki receptor IL-6 została międzynarodowo złożona do depozytu w ramach Budapest Treaty jako HB101-pIBIBSF2R 9 stycznia 1989 w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-2232.

Stosowane w niniejszym wynalazku przeciwciała anty gp130 mogą być otrzymywane jako poliklonalne lub monoklonalne przy zastosowaniu znanej metody. Korzystnie w niniejszym wynalazku jako przeciwciała anty-gp130 stosowane są przeciwciała monoklonalne, szczególnie o pochodzeniu ssaczym. Monoklonalne przeciwciała pochodzenia ssaczego dotyczą tych, które są produkowane przez hybrydomy oraz produkowane przez komórkę gospodarza stranformowaną wektorem ekspresyjnym zawierającym genetycznie zmodyfikowane geny przeciwciał. Przeciwciała te, poprzez wiązanie do gp130, hamują wiązanie kompleksu IL-6/receptor IL-6 z gp130, a tym samym blokują transdukcję sygnałów biologicznej aktywności IL-6 do komórki. Przykłady takich przeciwciał dotyczą przeciwciała AM64 (japońska nie badana publikacja patentowa (Kokai) 3(1991)-219894), przeciwciała 4B11 oraz 2H4 (US 5571513), przeciwciała S12 oraz B-P8 (japońska nie badana publikacja patentowa (Kokai) 8(1996)-291199).

Zasadniczo hybrydoma produkująca przeciwciało monoklonalne może być przygotowana według znanej procedury, jak opisano poniżej. A zatem, gp130 może zostać użyte jako antygen uczulający jako oraz stosowany do immunizacji w zwykłej metodzie immunizacji. Otrzymane w ten sposób immunizowane komórki podlegają fuzji ze znanymi komórkami rodzicielskimi w konwencjonalnym procesie fuzji komórek, a następnie wyszukiwane są hybrydomy produkujące przeciwciała monoklonalne, konwencjonalną metodą przeszukiwania, celem przygotowania docelowej hybrydomy.

Konkretnie, przeciwciało monoklonalne może zostać otrzymane w następujący sposób. Na przykład, gp130 zastosowany jako antygen uczulający do produkcji przeciwciała może zostać otrzymany poprzez zastosowanie sekwencji genu/sekwencji aminokwasowej gp130 zawartej w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym EP 411946.

Po wstawieniu sekwencji genu gp130 do znanego systemu wektora ekspresji, odpowiednie komórki gospodarza są transformowane systemem wektorowym, a białko gp130 jest oczyszczane z komórek gospodarza lub ich nadsą czu hodowlanego. Oczyszczone białko receptora gp130 moż e zostać użyte jako antygen uczulający. Alternatywnie, jako antygen uczulający może zostać użyte białko fuzyjne białka gp130 oraz innego białka.

Choć nie istnieje ograniczenie co do ssaków mogących być uczulonymi antygenem, korzystnie są one wybierane w zależności od ich zgodności z komórką rodzicielską stosowaną w fuzji komórek. Ogólnie dotyczy to gryzoni takich jak myszy, szczury, chomiki i tym podobne.

Immunizacja zwierząt antygenem uczulającym jest przeprowadzona według znanego sposobu. Metoda ogólna, na przykład, obejmuje dootrzewnowe lub podskórne podanie zwierzęciu antygenu uczulającego. Specyficznie, antygen uczulający, który został rozcieńczony i zawieszony w odpowiedniej ilości buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) lub soli fizjologicznej itd., jest mieszany, w zależności od potrzeby, z odpowiednią ilością konwencjonalnego adjuwanta, na przykład pełnego adjuwanta Freunda. Po zemulgowaniu jest korzystnie podawany ssakowi kilka razy co każde 4 do 21 dni. Alternatywnie, odpowiedni nośnik może zostać użyty w czasie immunizacji antygenem uczulającym.

Po immunizacji i potwierdzeniu wzrostu miana pożądanego przeciwciała w surowicy, immunizowane komórki są pobierane ze zwierzęcia i poddawane fuzji komórek. Preferowane komórki uczulane dotyczą w szczególności komórek śledziony.

Ssacze komórki szpiczaka jako inne komórki rodzicielskie, które są poddawane fuzji komórkowej ze wspomnianymi powyżej komórkami immunologicznymi korzystnie dotyczą różnych znanych linii komórkowych takich jak P3X63Ag8.653) (Kearney, J. F. i wsp., J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550), P3X63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G. i Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. i wsp. Cell (1976) 8: 4056

PL 201 461 B1

-415), SP2/0 (Shulman, M. i wsp. Nature (1978) 276: 269-270), FO (de St. Groth, S. F. i wsp., J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323), R210 (Galfre, G. i wsp., Nature (1979) 277: 131-133) i tym podobne.

Fuzja komórek pomiędzy powyższymi komórkami immunologicznymi i komórkami szpiczaka może być zasadniczo przeprowadzona w zgodzie ze znaną metodą, taką jak opisywana w Milstein i wsp. (Kohler, G. i Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) i tym podobne.

Konkretniej, powyższa fuzja komórkowa jest przeprowadzana w konwencjonalnym bulionie wzrostowym w obecności, na przykład, przyspieszacza fuzji komórkowej. Jako przyspieszacze fuzji komórkowej zastosowane mogą być: glikol polietylenowy (PEG), wirus Sendai (HVJ) oraz tym podobne. Dodatkowo, w zależności od potrzeby, dodany może być adiuwant taki jak dimetylosulfotlenek itd. celem zwiększenia wydajności fuzji.

Korzystny stosunek używanych komórek immunologicznych do komórek szpiczaka wynosi, na przykład, 1 do 10 razy więcej komórek immunologicznych niż komórek szpiczaka. Przykładami stosowanego podłoża hodowlanego do powyższej fuzji komórkowej są podłoża hodowlane RPMI1640 i MEM, odpowiednie do hodowli powyższych linii komórkowych szpiczaka i konwencjonalne podłoż e hodowlane stosowane do tego typu hodowli komórkowych oraz dodana może być surowica, taka jak płodowa surowica cielęca (FCS).

W trakcie fuzji komórkowej, określone ilości powyższych komórek immunologicznych oraz komórek szpiczaka są bobrze mieszane w powyższym podłożu hodowlanym, do którego dodawany jest uprzednio ogrzany do temperatury około 37°C roztwór PEG, na przykład roztwór PEG o średniej masie cząsteczkowej około 1000 do 6000, w stężeniu od 30 do 60% (w/v) oraz mieszany do otrzymania pożądanych komórek fuzyjnych (hybrydom).

Następnie, poprzez kolejne dodawanie odpowiedniego podłoża hodowlanego oraz wirowanie celem usunięcia supernatantu, usunięte mogą być czynniki fuzji komórkowej, itd., które są szkodliwe dla wzrostu hybrydomy.

Wspomniana hybrydoma jest selekcjonowana poprzez hodowlę w konwencjonalnym podłożu selekcyjnym, na przykład podłożu HAT (podłoże hodowlane zawierające hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę ). Hodowla w podł oż u HAT jest kontynuowana przez okres czasu wystarczają cy na obumarcie komórek innych niż pożądana hybrydoma (komórki niefuzyjne), generalnie kilka dni do kilku tygodni. Przeprowadzana jest konwencjonalna metoda ograniczających rozcieńczeń, w której wyszukiwane i klonowane są hybrydomy produkujące pożądane przeciwciało.

Oprócz otrzymania powyższej hybrydomy poprzez immmunizację antygenem zwierzęcia innego niż człowiek, możliwe jest uczulenie ludzkich limfocytów in vitro pożądanym antygenem lub komórkami wykazującymi ekspresję pożądanego antygenu, prowadząc do uczulonych limfocytów B, które ulegają fuzji z ludzkimi komórkami szpiczaka, na przykład U266, celem otrzymania pożądanego ludzkiego przeciwciała posiadającego aktywność wiązania pożądanego antygenu lub pożądanych komórek wykazujących ekspresję antygenu (patrz japońska publikacja patentowa po badaniu (Kokoku) 1 (1989)-59878). Co więcej, transgeniczne zwierzę posiadające repertuar genów dla wszystkich ludzkich przeciwciał jest immunizowane antygenem lub komórkami wykazującymi ekspresję antygenu celem otrzymania pożądanego ludzkiego przeciwciała opisaną powyżej metodą (patrz publikacja międzynarodowa WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 oraz WO 96/33735).

W ten sposób skonstruowane hybrydomy produkują ce monoklonalne przeciwciał a mog ą być hodowane w konwencjonalnym podłożu hodowlanym, lub mogą być przechowywane przez dłuższy okres czasu w ciekłym azocie.

Celem otrzymania monoklonalnych przeciwciał z wymienionej hybrydomy, zastosowana może być metoda, w której wspomniana hybrydoma jest hodowana konwencjonalną metodą, a przeciwciało otrzymywane w supernatancie, bądź metodą, w której hybrydoma jest podawana i hodowana w kompatybilnym ze wspomnianą hybrydomę ssaku, zaś przeciwciało jest otrzymywane w wysiękach. Pierwsza metoda jest odpowiednia do otrzymywania wysoce oczyszczonych przeciwciał, zaś druga umożliwia produkcję przeciwciał na dużą skalę.

Specyficznie, hybrydoma produkująca przeciwciało anty-receptor 1L-6 może zostać skonstruowana stosując metodę zawartą w japońskiej nie badanej publikacji patentowej (Kokai) 3(1989)-139293. Może to być wykonane sposobem, w którym hybrydoma produkująca przeciwciało PM-1, zdeponowana w ramach Budapest Treaty jako FERM BP-2998 dnia 10 lipca 1990 r., w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japan, jest wstrzykiwana dootrzewnowo myszy BALB/c

PL 201 461 B1 celem otrzymania wysięków, z których oczyszczane jest przeciwciało PM-1. Inną zastosowaną metodą może być hodowanie wspomnianej hybrydomy w odpowiednim podłożu hodowlanym, takim jak RPMI1640, zawierającym 10% cielęcej surowicy płodowej i 5% BM-Condimed HI (produkowanym przez Boehringer Mannheim), podłożu SFM dla hybrydom (produkowanym przez GIBCO-BRL), podłożu PFHM-II (produkowanym przez GIBCO-BRL) itp., zaś przeciwciało PM-1 może być oczyszczane z supernatantu.

Jako przeciwciało monoklonalne w niniejszym wynalazku może być zastosowane rekombinowane przeciwciało, produkowane technologią rekombinacji genów, w której gen dla przeciwciała został sklonowany z hybrydomy i wprowadzony do odpowiedniego wektora, którym następnie transformowano komórki gospodarza (patrz, na przykład, Borrebaeck C.A.K., i Larrick J.W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, opublikowana w Wielkiej Brytanii przez MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).

Specyficznie, mRNA kodujący region zmienny (V) pożądanego przeciwciała jest izolowany z komórek produkujących przeciwciało takich, jak hybrydomy. Izolacja mRNA jest przeprowadzana poprzez przygotowanie całkowitego RNA stosując, na przykład, znaną metodę taką, jak metoda ultrawirowania w guanidynie (Chirgwin, J.M. i wsp. Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), metodą AGPC (Chomczynski, P. i wsp., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), następnie mRNA jest oddzielany od całkowitego RNA stosując mRNA Purification kit (produkowany przez Pharmacia) itd. Alternatywnie, mRNA może zostać bezpośrednio przygotowany przy zastosowaniu Quick Prep mRNA Purification Kit (produkowanym przez Pharmacia).

cDNA regionu V przeciwciała może być zsyntetyzowane z mRNA stosując odwrotną transkryptazę. cDNA może być zsyntetyzowany stosując zestaw AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit itp. Alternatywnie, do syntezy i amplifikacji cDNA zastosowane mogą być metody korzystające z PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy): 5'-Ampli FINDER RACE Kit (produkowanym przez Clontech) oraz metoda 5'-RACE (Frohman, M.A. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. i wsp., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932). Pożądany fragment DNA jest oczyszczany z otrzymanego produktu PCR i ligowany z wektorem DNA. Co więcej, skonstruowany rekombinowany wektor jest transformowany do E. coli itd, a następnie selekcjonowane są kolonie celem przygotowania pożądanego rekombinowanego wektora. Sekwencja nukleotydowa docelowego DNA może zostać potwierdzona zaznana metodą, taką jak dideoksy.

Po otrzymaniu DNA kodującego region V z docelowego przeciwciała, może ono zostać zligowane z DNA kodującym stały region z docelowego przeciwciała, a następnie wintegrowane do wektora ekspresyjnego. Alternatywnie, DNA kodujące region V przeciwciała może być wintegrowane do wektora ekspresyjnego, w którym zawarty już jest DNA kodujący region C przeciwciała.

Celem produkcji stosowanego w niniejszym wynalazku przeciwciała, gen przeciwciała jest integrowany, jak opisano poniżej, do wektora ekspresyjnego tak, aby zachodziła ekspresja pod kontrolą regionu regulatorowego ekspresji, na przykład wzmacniacza i/lub promotora. Następnie, wektor ekspresyjny może być wtransformowany do komórki gospodarza, zaś przeciwciało może ulec tam ekspresji.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, sztucznie zmienione przeciwciało rekombinowane, takie jak przeciwciało chimeryczne oraz przeciwciało humanizowane mogą być zastosowane celem zmniejszenia heterologicznej antygenowości wobec ludzi. Zmienione przeciwciało może być produkowane przy użyciu znanego sposobu.

Przeciwciało chimeryczne może być otrzymane poprzez zligowanie tak otrzymanego DNA kodującego region V przeciwciała z DNA kodującym region C ludzkiego przeciwciała, a następnie integrację DNA z wektorem ekspresyjnego i transformację komórek gospodarza dla produkcji przeciwciał (patrz europejskie zgłoszenie patentowe EP 125023, oraz patent międzynarodowy WO 92/19759). Stosując tę znaną metodę, dla niniejszego wynalazku otrzymane może zostać chimeryczne przeciwciało.

Dla przykładu, plazmid zawierający DNA kodujące łańcuch L regionu V lub łańcuch H regionu V chimerycznego przeciwciała PM-1 został oznaczony jako pPM-k3 lub pPM-hl, odpowiednio, zaś E. coli zawierającą ten plazmid została zdeponowana w ramach Budapest Treaty jako NCIMB 40366 i NCIMB 40362, odpowiednio, 11 lutego 1991 w National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited.

Humanizowane przeciwciało, zwane również remodelowanym ludzkim przeciwciałem, zostało wytworzone poprzez przeniesienie regionów determinujących komplementarność (CDR) przeciwciała innego ssaka niż człowiek np., przeciwciała myszy do CDRs ludzkiego przeciwciała. Ogólna technika rekombinacji DNA do przygotowania takich przeciwciał jest również znana (patrz europejski wniosek patentowy EP 125023 oraz patent między narodowy WO 92-19759).

PL 201 461 B1

Specyficznie, sekwencja DNA, która została przeznaczona do ligacji-CDR z mysiego przeciwciała z regionem zrębowym (FR) ludzkiego przeciwciała, jest syntetyzowana z kilku oddzielnych oligonukleotydów mających na każdym z końców zachodzące na siebie regiony. Otrzymany w ten sposób DNA jest ligowany z DNA kodującym region C ludzkiego przeciwciała a następnie integrowany z wektorem ekspresyjnym, transformującym komórki gospodarza do produkcji przeciwciał (patrz europejskie zgłoszenie patentowe EP 239400 oraz publikacja międzynarodowa WO 92-19759).

Dla FR z ludzkiego przeciwciała związanego poprzez ligację z CDR, wybierana jest region determinujący komplementarność, który tworzy najlepszą strukturę wiążącą antygen. Wtedy gdy jest to pożądane, aminokwasy w regionie szkieletowym regionu zmiennego przeciwciała mogą być podstawione tak, że region determinujący komplementarność odtworzonego ludzkiego przeciwciała może tworzyć odpowiednią strukturę wiążącą antygen (Sato, K. i wsp. Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Na przykładzie, do przeciwciała chimerycznego lub humanizowanego stosowany jest region C ludzkiego przeciwciała. Jako region C ludzkiego przeciwciała zastosowane mogą być Cy, a wymienione, na przykład, Cyl, Cy2, Cy3, oraz Cy4. Region C ludzkiego przeciwciała może zostać zmodyfikowany, aby zwiększyć stabilność przeciwciała lub jego produkcję.

Przeciwciało chimeryczne składa się z regionu zmiennego przeciwciała otrzymanego z ssaka innego niż człowiek oraz regionu C otrzymanego w ludzkiego przeciwciała, podczas gdy humanizowane przeciwciało składa się z regionów determinujących komplementarność przeciwciał otrzymanych ze ssaka innego niż człowiek oraz regionów zrębowych i regionu C otrzymanego z ludzkiego przeciwciała. Zgodnie z powyższym, ich antygeniczność w ludzkim ciele została zredukowana w taki sposób, że są one skuteczne jako przeciwciała stosowane w niniejszym wynalazku.

Korzystnym wykonaniem humanizowanego przeciwciała, stosowanym w niniejszym wynalazku jest humanizowane przeciwciało PM-1 (patrz międzynarodowy patent WO 92-19759).

Skonstruowane jak powyżej geny przeciwciał mogą ulegać ekspresji, zaś produkt może zostać otrzymany znanymi metodami. W przypadku ssaczych komórek, ekspresji można dokonać stosując wektor zawierający konwencjonalnie stosowany użyteczny promotor, mający ulec ekspresji gen przeciwciała oraz DNA, w którym sygnał poli A jest operacyjnie związany poniżej 3' bądź wektor zawierający wspomniany DNA. Przykłady promotora/wzmacniacza dotyczą bezpośredniego wczesnego promotora/wzmacniacza ludzkiego cytotnegalowirusa.

Dodatkowo, jako promotor/wzmacniacz, które mogą być zastosowane w niniejszym wynalazku do ekspresji przeciwciała są stosowane wirusowe promotory/wzmacniać ze takie jak retrowirusa, wirusa poliomy, adenowirusa, szympansiego wirusa 40 (SV40), oraz promotory/wzmacniacze otrzymane z komórek ssaczych takie jak ludzki czynnik elongacyjny 1α (HEF1 α).

Na przykładzie, ekspresja może zostać łatwo uzyskana metodą Mulligan i wsp. (Mulligan, R. C. i wsp. Nature (1979) 277, 108-114), w której stosowany jest promotor/wzmacniacz SV40, lub metodą Mizushima i wsp. (Mizushima, S. i Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) z użyciem promotora/wzmacniacza HEF1 α.

W przypadku E.coli ekspresja może być przeprowadzona poprzez operacyjne połączenie zwyczajowo stosowanego użytecznego promotora, sekwencji sygnałowej do sekrecji przeciwciała oraz mającego ulec ekspresji genu przeciwciała, a następnie ich ekspresję. Jako promotor wspomniany może zostać, na przykład, promotor lacZ oraz araB. Przy użyciu promotora araB zastosowana może być metoda Warda i wsp. (Ward E.S. i wsp., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E.S. i wsp., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) oraz dla promotora araB metoda Bettera i wsp. (Better, M. i wsp., Science (1988) 240, 1041-1043).

Sekwencja pelB jest stosowana jako sekwencja sygnałowa dla sekrecji przeciwciała, produkowanego w peryplazmie E. coli, (Lei, S. P. i wsp., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383). Po oddzieleniu przeciwciała zakumulowanego w peryplazmie, struktura przeciwciała jest odpowiednio ponownie składana przed zastosowaniem (patrz, na przykład, WO 96/30394).

Jako miejsce inicjacji replikacji zastosowane może być miejsce pochodzące z SV40, wirusa poliomy, adenowirusa, bydlęcego wirusa brodawczaka (BPV) itd. Co więcej, celem amplifikacji liczby kopii genu w komórce, wektory ekspresyjne mogą zawierać jako markery selekcyjne gen fosfotransferazy aminoglikozydowej (APH), gen kinazy tymidynowej (TK), gen transferazy guanidynofosforybozylo ksantyny z E. coli (Ecogpt), gen reduktazy dihydrofolianu (dhfr) itp.

Do produkcji stosowanego w niniejszym wynalazku przeciwciała zastosowany może być jakikolwiek system produkcji. System produkcji preparatu przeciwciał dotyczy systemów in vitro lub

PL 201 461 B1 in vivo. Jako system produkcji in vitro wspomnieć można system produkcji korzystający z komórek eukariotycznych, jak również system korzystający z komórek prokariotycznych.

Kiedy stosowane są komórki eukariotyczne, istnieją systemy wykorzystujące komórki zwierzęce, roślinne lub grzybowe. Znane komórki zwierzęce to: (1) komórki ssacze takie jak CHO, COS, szpiczak, niemowlęce komórki nerki chomika (BHK), HeLa oraz Vero, (2) komórki płazów takie jak oocyty Xenopus, lub (3) komórki owadzie takie jak sf9, sf21, oraz Tn5. Znane komórki roślinne to, na przykład, te otrzymane z Nicotiana tabacum, które mogą być poddane hodowli wierzchołkowej. Znane komórki grzybów to komórki drożdży takich jak rodzaj Saccharomyces, w szczególności Saccharomyces cereviceae, lub grzybów pleśniowych takich jak rodzaj Aspergillus, a w szczególności Aspergillus niqer.

Jeśli stosowane są komórki prokariotyczne, istnieją systemy produkcyjne korzystające z komórek bakteryjnych. Znane komórki bakteryjne to Escherichia coli (E. coli), oraz Bacillus subtilis.

Poprzez transformację genu docelowego przeciwciała do komórek oraz hodowlę transformowanych komórek in vitro, można otrzymać przeciwciało. Hodowla jest przeprowadza według znanych metod. Na przykład, jako podłoże hodowlane zastosowane mogą być DMEM, MEM, RPMI1640 oraz IMDM, zaś dodatkowo stosowany może być dodatek zarodkowej surowicy cielęcej (FCS). Ponadto, przeciwciała mogą być produkowane in vivo poprzez wstrzyknięcie komórek stransformowanych genem przeciwciała do jamy brzusznej zwierzęcia itd.

Jako systemy produkcji in vivo wspomnieć można te, które stosują zwierzęta oraz rośliny. W odniesieniu do zwierzęcych systemów istnieją są systemy produkcji wykorzystujące ssaki oraz owady.

Jako ssaki stosowane mogą być kozy, świnie, owce, myszy oraz bydło (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Jako owady stosowane mogą być jedwabniki.

W przypadku roślin użyty może być, na przykład, tytoń. Geny przeciwciał są transformowane do tych zwierząt lub ludzi, zaś przeciwciała produkowane w takich zwierzętach i roślinach są odzyskiwane. Na przykład, gen przeciwciała jest wprowadzany do środka genu kodującego białko takie jak kozia β kazeina produkowana w sposób naturalny w mleku. Fragmenty DNA zawierające gen fuzyjny, w którym został wstawiony gen przeciwciała są wstrzykiwane do zarodka koziego, a zarodek przenoszony do samicy kozy. Docelowe przeciwciało jest otrzymywane z mleka produkowanego przez kozę transgeniczną urodzoną przez kozę, która otrzymała embrion lub jej potomstwo. Celem zwiększenia ilości mleka zawierającego pożądane przeciwciało, transgenicznej kozie mogą być podawane odpowiednie hormony (Ebert, K.M. i wsp., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Jeśli stosowane są jedwabniki, są one zakażane bakulowirusem, do którego został wprowadzony pożądany gen, a żądane przeciwciało jest oczyszczone z płynu ciała jedwabnika. (Maeda S. i wsp., Nature (1985) 315, 592-594). Co więcej, jeśli stosowany jest tytoń, docelowy gen przeciwciała jest wstawiany do wektora ekspresyjnego dla roślin, na przykład pMON 530, a następnie wektorem zakażana jest bakteria taka, jak Agrobacterium tumefaciens. Bakteria jest wówczas stosowana do zakażania tytoniu - Nicotiana tabacum celem otrzymania docelowego przeciwciała z liści tytoniu (Julian, K.-C. Ma i wsp., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Kiedy przeciwciało jest produkowane w systemach produkcji in vitro lub in vivo, jak opisano powyżej, DNA kodujący łańcuch ciężki (łańcuch H) lub łańcuch lekki (łańcuch L) przeciwciała może być oddzielnie wintegrowane z każdym wektorem ekspresyjnym, zaś gospodarze są transformowani jednocześnie lub DNA kodujące łańcuch H i łańcuch L może być włączane do pojedynczego wektora ekspresyjnego i użyte do transformacji gospodarza (patrz międzynarodowy patent WO 94-11523).

Przeciwciała stosowane w niniejszym wynalazku mogą być fragmentami przeciwciał lub ich zmodyfikowanymi formami, dopóki mogą być korzystnie stosowane. Na przykład, jako fragmenty przeciwciał wspomnieć można Fab, F(ab')2, Fv lub jednołańcuchowe (scFv), w którym Fv z łańcucha H i ł a ń cucha L są połączone poprzez odpowiedni łącznik.

W szczegółach zaś, przeciwciała są poddawane działaniu enzymu, na przykład, papainy lub pepsyny, celem powstania fragmentów przeciwciał, bądź konstruowane są geny kodujące fragmenty przeciwciał, a następnie zintegrowane z wektorem ekspresyjnym, który ulega ekspresji w odpowiedniej komórce gospodarza (patrz, na przykład, Cox M. S. i wsp., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. i Horwitz, A.H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. i Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1986) 121, 652663; Rousseaux, J. i wsp., Methods in Enzymology (1986) 121, 663-669; Bird, R.E. i wsp., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

scFv może być otrzymane poprzez połączenie regionu V łańcucha H z regionem V łańcucha L przeciwciała. W scFv, region V łańcucha H oraz region V łańcucha L są korzystnie połączone łączni10

PL 201 461 B1 kiem, korzystnie łącznikiem peptydowym (Huston, J.S. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). Region V łańcucha H i region V łańcucha L scFv może być otrzymany z któregokolwiek z wyżej wspomnianych przeciwciał. Jako łącznik peptydowy, łączący regiony V zastosowany może być jednołańcuchowy peptyd zawierający, na przykład, 12-19 reszt aminokwasowych.

DNA kodujący scFv może być otrzymane stosując DNA kodujące łańcuch H lub region V łańcucha H z powyższego przeciwciała oraz DNA kodujący łańcuch L lub region V łańcucha L powyższego przeciwciała jako matrycę do powielenia części DNA kodującego pożądaną sekwencję aminokwasową spośród powyższych sekwencji techniką PGR z parami starterów definiującymi oba końce, oraz dalszego powielania kombinacji DNA kodującego cześć łącznika peptydowego i pary starterów, które definiują i oba końce wspomnianego DNA zligowanego z łańcuchem H i łańcuchem L, odpowiednio.

Po skonstruowaniu DNA kodującego scFv, za pomocą konwencjonalnych metod otrzymuje się zawierający go wektor ekspresyjny oraz gospodarza transformowanego wspomnianym wektorem, a scFv może być otrzymane stosując stransformowanego gospodarza przy użyciu konwencjonalnych metod.

Te fragmenty przeciwciał mogą być produkowane poprzez otrzymanie ich genów w sposób podobny do wspomnianego powyżej oraz poprzez umożliwienie jego ekspresji w gospodarzu. „Przeciwciało” jak stosowano w zastrzeżeniach niniejszego zgłoszenia, zawiera te fragmenty przeciwciał.

Jako zmodyfikowane przeciwciała stosowane mogą być przeciwciała związane z różnymi cząsteczkami, takimi jak glikol polietylenowy (PEG). „Przeciwciało”, jak stosowano w zastrzeżeniach niniejszego wynalazku, dotyczy tych zmodyfikowanych przeciwciał. Te zmodyfikowane przeciwciała mogą być otrzymane poprzez modyfikacje chemiczną już otrzymanych. Metody te są już znane fachowcom.

Przeciwciała opisane i poddane ekspresji, jak opisano powyżej, mogą być oddzielane z wewnątrz lub zewnątrz komórki gospodarza, a następnie oczyszczane do jednorodności. Oddzielanie i oczyszczanie przeciwciał a stosowanego w niniejszym wynalazku moż e zostać dokonane za pomocą chromatografii powinowactwa. Jako kolumnę stosowaną do takiej chromatografii powinowactwa wspomnieć można kolumnę białka A oraz białka G. Przykładami nośnika stosowanego w kolumnie białka A są Hyper D, POROS, Sefaroza F. itd. Alternatywnie, metody konwencjonalnego oddzielania i oczyszczania biał ek mogą być stosowane bez ograniczeń . Oddzielanie i oczyszczanie przeciwciał a stosowanego w niniejszym wynalazku może zostać osiągnięte poprzez łączenie, w razie potrzeby, chromatografii innej niż wspomniana powyżej chromatografia powinowactwa, filtracji, ultrafiltracji, wysalania, dializy itd. Chromatografia dotyczy, na przykład, chromatografii jonowymiennej, chromatografii hydrofobowej, filtracji w żelu i innych. Chromatografie te mogą być stosowane z wysokosprawnościową chromatografią cieczową (HPLC). Alternatywnie, zastosowany może być HPLC o odwróconych fazach.

Stężenie otrzymanego przeciwciała może być określane poprzez pomiar absorbancji lub płytkowym testem immunoenzymatycznym fazy stałej (ELISA), itd. A zatem, jeśli stosowany jest pomiar absorbancji, próbka jest odpowiednio rozcieńczana PBS(-) a następnie mierzona jest absorbancja przy

280 nm, po której następują obliczenia z zastosowaniem współczynnika absorpcji 1,35 OD dla 1 mg/ml.

Kiedy stosowana jest metoda ELISA, pomiar jest dokonywany następująco: 100 μΐ koziego anty ludzkiego IgG (produkowanej przez TAGO) rozcieńczonego do 1 μg/ml w 0.1 M buforze z wodorowęglanowym, pH 9,6, jest dodawane do 96-studzienkowej płytki (produkowanej przez Nunc), i jest inkubowane przez noc w 4°C celem unieruchomienia przeciwciała. Po blokowaniu, 100 μl każdego z odpowiednio rozcieńczonych przeciwciał według niniejszego wynalazku lub próbki zawierającej przeciwciało, lub 100 μl ludzkiej IgG (produkowanej przez CAPPEL) jako standard, dodaje się i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.

Po przemyciu, 100 μl 5000-krotnie rozcieńczonego znakowanego fosfatazą alkaliczną przeciwciała anty ludzka IgG (produkowane przez BIO SOURCE) było dodawane i inkubowane w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po przemyciu, dodawano roztwór substratu i inkubowano, a następnie mierzono absorbancję przy 405 nm, stosując czytnik Microplate Reader Model 3550 (produkowany przez Bio-Rad) celem obliczenia stężenia docelowego przeciwciała.

Zmienione przeciwciało IL-6 stosowane w niniejszym wynalazku posiada aktywność wiążącą receptor IL-6 oraz nie przenosi aktywności biologicznej IL-6. A zatem, zmienione przeciwciało IL-6, chociaż współzawodniczy z IL-6 o wiązanie z receptorem IL-6 receptor, nie wykazuje aktywności biologicznej IL-6, a zatem blokuje transdukcję sygnału przez IL-6.

Zmienione IL-6 może zostać skonstruowane poprzez wprowadzenie mutacji przez zastąpienie reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej IL-6. IL-6, źródło zmienionej IL-6, może mieć dowolne pochodzenie, ale jeśli rozważa się antygenowość, korzystna jest ludzka IL-6.

PL 201 461 B1

Konkretnie, struktura drugorzędowa IL-6 jest określana stosując znany program do modelowania sekwencji aminokwasowych, na przykład WHATIF (Vriend i wsp., J. Mol. Graphics (1990), 8, 52-56), podobnie jak oceniany jest ogólny wpływ na usuwanych aminokwasów. Po określeniu odpowiedniej reszty aminokwasowej, mutacja jest wprowadzana konwencjonalnie stosowaną reakcją łańcuchowej polimerazy (PCR) z wektorem zawierającym sekwencje nukleotydową kodującą ludzki gen IL-6, otrzymując tym samym gen kodujący zmienioną IL-6. Jest on następnie integrowany, w zależności od potrzeby, z odpowiednim wektorem ekspresyjnym, z którego można otrzymać zmienioną IL-6 według ekspresji, produkcji i oczyszczania wspomnianego rekombinowanego przeciwciała.

Specyficzne przykłady zmienionej IL-6 są zawarte w Brakenhoff i wsp., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, and Savino i wsp., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96-18648, and WO 96-17869.

Częściowe peptydy IL-6 lub receptora IL-6, stosowane w niniejszym wynalazku, posiadają aktywność wiązania receptora IL-6 lub IL-6, odpowiednio, i nie przenoszą aktywności biologicznej IL-6. A zatem, częściowe peptydy IL-6 lub receptora IL-6 wiążą się z receptorem, IL-6 lub IL-6, odpowiednio, a tym samym wychwytują go. W wyniku tego, nie przenoszą aktywności biologicznej IL-6 oraz blokują transdukcję sygnału przez IL-6.

Częściowe peptydy IL-6 lub receptora IL-6 są peptydami zawierającymi część lub całość sekwencji aminokwasowej regionu biorącego udział w wiązaniu IL-6 lub receptora IL-6 w sekwencji aminokwasowej IL-6 lub receptora IL-6. Takie peptydy generalnie zawiera 10 - 80, korzystnie 20 - 50, a bardziej korzystnie 20 - 40 reszt aminokwasowych.

Częściowe peptydy IL-6 lub receptora IL-6 mogą być skonstruowane poprzez określenie regionu biorącego udział w wiązaniu do IL-6 lub receptora IL-6 w sekwencji aminokwasowej IL-6 lub receptora IL-6, oraz produkcję części lub całości sekwencji aminokwasowej konwencjonalną metodą, taką jak technologia inżynierii genetycznej lub metoda syntezy peptydów.

Celem wyprodukowania częściowych peptydów IL-6 lub receptora IL-6 technologią inżynierii genetycznej, sekwencja DNA kodująca docelowy peptyd jest integrowana z wektorem ekspresyjnym, z którego peptyd moż e zostać otrzymany poprzez ekspresję , produkcję i oczyszczanie wspomnianego rekombinowanego przeciwciała.

Produkcja częściowego peptydu IL-6 lub receptora IL-6 metodą syntezy peptydu może być wykonana stosując metodę powszechnie stosowaną w syntezie peptydów, taką jak synteza w stałej fazie lub płynnej.

Specyficznie, może być stosowana metoda opisana w Zokulyakuhin no Kaihatsu (Sequel to Development of Pharmaceuticals), tom 14, Peputido Gousei (Peptide Synthesis), wydanej przez Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten, 1991. Synteza w fazie stałej dotyczy, na przykład, reakcji, w której aminokwas odpowiadający C-końcu mającemu być syntetyzowanym peptydu jest sprzęgany z nośnikiem, nierozpuszczalnym w rozpuszczalnikach organicznych, a następnie aminokwas, w którym grupa α-aminowa lub grupa funkcyjna łańcucha bocznego zostały zabezpieczone odpowiednią grupa zabezpieczającą, jest kondensowany jeden aminokwas na raz, od C-końca w kierunku końca N, zaś reakcja, w której wspomniana grupa zabezpieczająca grupę α-aminową aminokwasu lub peptydu sprzężonego z żywicą, jest usuwana alternatywnie powtarza się celem wydłużenia łańcucha. Metody syntezy w fazie stałej dzielą się na metodę Boc i metodę Fmoc w zależności od zastosowanej grupy zabezpieczającej.

Po zakończeniu syntezy docelowego peptydu, przeprowadzana jest reakcja odbezpieczania oraz odcięcia łańcucha polipeptydowego od nośnika. Generalnie, do odcinania od łańcucha peptydowego stosowane są fluorowodorek lub kwas trifluorometanosulfonowy w metodzie Boc i TFA w metodzie Fmoc. W metodzie Boc, na przykład, powyższa żywica peptydowa jest traktowana fluorowodorem w obecności anizolu. Następnie, grupa zabezpieczająca jest eliminowana, a peptyd odzyskiwany poprzez odcięcie od podłoża. Liofilizując, można otrzymać surowy peptyd. Z drugiej strony, w metodzie Fmoc, TFA, na przykład, jest stosowany w sposób podobny do powyższego, celem odbezpieczenia oraz reakcji odcinania peptydu od podłoża.

Otrzymany w ten sposób surowy peptyd może zostać poddany HPLC celem oddzielenia i oczyszczenia. Jego elucja może być przeprowadzona w systemie rozpuszczalników woda: acetonitryl, powszechnie stosowanym do oczyszczania białka w warunkach optymalnych. Frakcja odpowiadająca szczytowi otrzymanego profilu chromatografii jest zbierana i liofilizowana. Oczyszczona w ten sposób frakcja jest identyfikowana poprzez poddanie jej analizie masy cząsteczkowej w spektroskopii masowej, analizie składu aminokwasowego lub analizie sekwencji aminokwasowej, itd.

PL 201 461 B1

Specyficzne przykłady częściowego peptydu IL-6 lub częściowego peptydu receptora IL-6 są zawarte w japońskim nie badanym zgłoszeniu patentowym (Kokai) 2(1990)-188600, japońskim nie badanym zgłoszeniu patentowym (Kokai) 7(1995)-324097, japońskim nie badanym zgłoszeniu patentowym (Kokai) 8 (1996)-311098, i patencie St. Zjedn. Am. Nr 5210075.

Aktywność antagonisty IL-6 stosowanego w niniejszym wynalazku może być oceniona stosując konwencjonalną metodę. Hodowana jest zależna od IL-6 linia MH60.BSF2, do której dodawana jest IL-6, zaś aktywność oceniana stosując włączanie ³H-tymidyny do zależnej od IL-6 linii w obecności antagonisty IL-6. Alternatywnie, ocena może zostać dokonana na hodowli U266, komórek z ekspresją receptora IL-6, dodając ¹²⁵I-wyznakowaną IL-6 oraz antagonistę IL-6 w tym samym czasie, następnie określając IL-6¹²⁵I związanego komórkami z ekspresją receptora IL-6. W powyższym systemie testowym, kontrolę negatywną stanowi grupa nie zawierająca antagonisty IL-6, oprócz dodatkowej grupy w której jest obecny antagonista receptora IL-6. Otrzymane wyniki s ą porównywane celem oceny aktywności hamującej IL-6 antagonisty receptora IL-6.

Celem potwierdzenia wyników osiągniętych przez niniejszy wynalazek, antagonista IL-6 stosowany w wynalazku, jest podawany zwierzętom, u których rozwinęło się zapalenie jelita poprzez, wstrzyknięcie CD4+ oraz CD45RB-silnie dodatnich komórek (komórki CD4+CD45RB^highCD4+CD45RB^high), ocenione może zostać zahamowanie wagi oraz poprawa stanu zapalnego jelita. Dodatkowymi efektami niniejszego wynalazku są: efekt supresji anoreksji, zredukowanie bólu brzusznego, zniesienie biegunki oraz zapobieganie nawrotowi zapalenia jelita.

Komórki CD4⁺CD45RB^high, które są przenoszone do zwierząt przez antagonistę IL-6 mogą być izolowane przy użyciu, na przykład, metody opisanej w przykładzie poniżej. Zwierzęta, z których otrzymywane są komórki ⁺CD45RB^high są wybrane spośród zazwyczaj stosowanych w eksperymentach: myszy i szczurów.

Jako opisano w przykładzie poniżej, podawanie zwierzętom, u których rozwinęło się zapalenie jelita przeciwciała dla receptora IL-6 prowadziło do zmniejszenia utraty wagi i poprawy stanu zapalenia jelita, a więc, wykazano, że antagoniści IL-6 tacy jak przeciwciało anty receptor IL-6 wykazują efekt terapeutyczny w zapaleniu jelita.

Podmiotami terapii w niniejszym wynalazku są korzystnie ssaki. Podmiotami terapii są korzystnie ludzie.

Czynniki zapobiegające lub terapeutyczne według niniejszego wynalazku mogą być podawane zarówno doustnie, jak i pozajelitowe, systemowo lub miejscowo. Na przykład, wybrane mogą zostać: zastrzyk dożylny taki jak wlew dożylny, zastrzyk domięśniowy, dootrzewnowy, podskórny, czopki, lewatywa, powlekane tabletki jelitowe, i tym podobne, zaś odpowiednia metoda podania jest wybierana w zależności od wieku i stanu pacjenta. Efektywne dawkowanie jest wybrane w zakresie od 0,01 mg do 100 mg na kg masy ciała na jedno podanie. Alternatywnie, wybrana może być dawka w zakresie od 1 do 1000 mg, korzystnie od 5 do 50 mg na pacjenta.

Czynniki terapeutyczne lub zapobiegające zapaleniu jelita według niniejszego wynalazku mogą zawierać farmaceutyczne akceptowalne nośniki lub dodatki w zależności od drogi podania. Przykłady takich nośników lub dodatków dotyczą wody, farmaceutycznie akceptowanego rozpuszczalnika organicznego, kolagenu, alkoholu poliwinilowego, poliwinylopirolidonu, polimeru karboksywinylowego, karboksymetylocelulozy sodowej, poliakrylanu sodu, alginianu sodu, rozpuszczalnego w wodzie dekstranu, karboksymetyloskrobi, pektyny, metylocelulozy, etylocelulozy, gumy ksantanowej, gumy arabskiej, kazeiny, żelatyny, agaru, digliceryny, glikolu propylenowego, glikolu polietylenowego, wazeliny, parafiny, alkoholu stearylowego, kwasu stearynowego, ludzkiej albuminy osocza (HSA), mannitolu, sorbitolu, laktozy, farmakologicznie dopuszczalnego środka powierzchniowo czynnego, surfaktenta, itd. Zastosowane dodatki są wybrane spośród, ale nie ograniczone do, kombinacji powyższych, w zależ noś ci od formy dawkowania.

Leczonym podmiotem w niniejszym wynalazku jest zapalenie jelita. Zapalenie jelita dotyczy wrzodziejącego zapalenia jelita grubego oraz choroby Crohna. Choroby te pojawiają się głównie u młodych ludzi około dwudziestego roku życia, i niewiele jest wiadomo, do chwili obecnej o przyczynach lub mechanizmach patologii zapalenia. Jednakże, intensywne badania są w trakcie wykrywania ich za pomocą różnego rodzaju komórek i cytokin.

W ostatnich kilku latach zaobserwowano postęp w analizie komórek, które powodują zapalenie jelita. A zatem, stało się widocznym, że model zwierzęcy zapalenia jelita może być konstruowany poprzez transfer CD4-pozytywnych oczyszczonych, CD45RB-silnie pozytywnych komórek (CD⁺45RB^high) do myszy

PL 201 461 B1 z niedoborem odporności (SCID) (Morrissey, P. J. i wsp. J. Exp. Med. (1993) 178, 237-244; Leach, M. W. i wsp.. Atn. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515; Aranda, R. i wsp., J. Immunol. (1997) 158, 3464-3473).

Z drugiej strony, wykazano, że komórki CD4-pozytywne, CD45RB-słabo pozytywne (CD4+CD45RB^low) nie mogą indukować zapalenia jelita, zaś indukcja zapalenia jelita jest zatrzymywana przez CD4-pozytywne, CD45RB-silnie pozytywne komórki (Powrie, F. R. i wsp., J. Exp. Med. (1994) 179, 589-600). Wiadomo, że wielkość ekspresji CD45RB na komórkach koreluje ze wzorem produkcji cytokin. A zatem, uważa się, że CD4-pozytywne, CD45RB-silnie pozytywne komórki są rodzaju komórek pomocniczych typu 1 (Th1), które produkują IFN-γ oraz TNF-α, podczas gdy CD4-pozytywne, CD45RBsłabo pozytywne komórki są komórkami pomocniczymi typu 2 (Th2), które produkują IL-4, IL-10, i tym podobne (Lee, W. i wsp., J. Immunol. (1990) 144, 3288-3295).

A zatem, uważa się, że początek IBD jest najbardziej prawdopodobnie związany z zachwianą równowagą pomiędzy Th1 i Th2, i zostało to potwierdzone przez fakt, że chroniczne zapalenie jelita, przypominające ludzkie wrzodziejące zapalenie jelita rozwinęło u myszy z niedoborem genu IL-10 metodą celowania w gen (Kuhn, R. i wsp. Cell (1993) 75, 263-274.

Model zwierzęcy zastosowany w przykładach jest bardzo podobny do pacjentów ze wrzodziejącym zapaleniem jelita i chorobą Crohna w cechach histologicznych jelita grubego. (Leach, M. w. i wsp., Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515). We wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego szeroko postępujące lezje są obserwowane od strony odbytnicy, zaś nabłonek śluzowy jest specyficznie uszkodzony. W niniejszym modelu, patologie kliniczne są bardzo podobne pod tym względem, że obejmują duże obszary, choć głównie zlokalizowane są w odbytnicy oraz wrzodziejących uchyłkach.

Z drugiej strony choroba Crohna stanowi grubą warstwę zapalenia, niezlokalizowanego w śluzówce i rozsianego wszędzie w przewodzie pokarmowym od jamy ustnej do odbytu. Histologicznie charakteryzuje się nieserowaciejącym ziarniniakowym zapaleniem. Model ten jest bardzo podobny do choroby Crohna, ponieważ nie jest zlokalizowany w warstwie śluzowej, gdzie gromadzą się makrofagi, limfocyty oraz komórki wielojądrzaste i często przyjmuje postać ziarniaka oraz z rzadka znajdowane są wrzodziejące uchyłki.

Odnotowane jak dotąd w badaniach klinicznych zostały przypadki, w których wrzodziejące zapalenie jelita koegzystuje z chorobą Crohna (Tanaka, M. i wsp, Hepatogastroenterology (1990) 37, 18-31). W zapaleniu jelita znaleziono w nabłonku zwiększoną ekspresję głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II (Trejdosiewicz, L. K. i wsp., Dig. Dis. Sci. (1989) 34, 1449-1456), i to samo odnosi się do niniejszego modelu. W tym modelu, pojawia się charakterystyczne zgrubienie tkanki nabłonkowej, co uważa się za związane ze wzmożonymi podziałami komórek u pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego (Serafini, E. P. i wsp., Gut (1981) 22, 648-652).

Niniejszy model jest bardzo podobny do klinicznego zapalenia jelita i może powodować w ostrych przypadkach utratę wagi. W eksperymencie stosującym niniejszy model, ubytki histologiczne są znacząco zmniejszone i nie jest obserwowana utrata wagi, co wskazuje, że antagonista IL-6 działa jako czynnik terapeutyczny w zapaleniu jelita takim jak wrzodziejące zapalenie lub choroba Crohna.

P r z y k ł a d

Śledzionę pobierano sterylnie od samców myszy Balb/C, homogenizowano i rozpipetowywano celem uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie, celem usunięcia czerwonych komórek, grudkę komórkową traktowano roztworem lizującym (mieszanina 9:1, odpowiednio, 0,16 M NH4Cl i buforu 0,17 M Tris o pH 7,2) po czym dwukrotnie przepłukiwano solą fizjologiczną buforowaną fosforanem uzyskując w ten sposób komórki śledziony myszy.

Przepłukane komórki zawieszano w podłożu RPMI1640 z 2% FCS, i po zliczeniu komórek, doprowadzane do 1,1 x 10⁸/ml. Do uzyskanych komórek dodano przeciwciała anty-mysie CD4 (L3T4 Microbeads, produkowane przez Miltenyi Biotec) w 1/9 objętości. Wiązanie antygen przeciwciało przeprowadzano na lodzie przez 15 minut (gęstość komórek 1 x 10⁸/ml). Następnie frakcja CD4-pozytywnych komórek została zebrana z wykorzystaniem systemu rozdzielającego Mini MACS (wytwarzanego przez Miltenyi Biotec). Po zliczeniu i zawieszeniu w roztworze soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem z dodatkiem 2% FCS doprowadzając komórki do gęstości 4 x 10⁷/ml.

Do zawiesiny CD4-pozytywnych komórek dodano 1/100 objętości znakowanych PE szczurzych przeciwciał anty-mysim CD4 (L3T4) (0,2 mg/ml, klon RM4-5, wytwarzane przez Pharmingen) oraz 1/100 objętości znakowanych FITC szczurzych przeciwciał anty-mysich (0.5 mg/ml, klon 16A, wytwarzane przez Pharmingen). Przeciwciało było wiązane poprzez zostawienie na lodzie na 20 minut. Do wyznakowanych komórek dodano 2% FCS w RMI140, żwirowano i ponownie zawieszono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 2 %FCS i przechowywano w chłodnym ciemnym miejscu.

PL 201 461 B1

Dzięki użyciu cytometru przepływowego (FACS Vantage, produkowany przez Becton Dickinson) z grupy komórek CD4-pozytywnych wydzielona została grupa komórek CD4-pozytywnych i jednocześnie wobec silnie pozytywnych CD45RB (komórki CD4⁺CD45RB^high). Grupa ta, o silnej ekspresji CD45RB stanowiła górne 50% komórek CD4- i CD45RB-pozytwnych. Otrzymane komórki następnie zwirowywano i zawieszano w soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem, tak aby osiągnąć stężenie 4 x 10⁶/ml. Czystość komórek sięgała 97% komórek CD45RB pozytywnych a przeżywalność 98%.

Uzyskane w ten sposób wysoce oczyszczone komórki były następnie wstrzykiwane dootrzewnowo w ilości 4 x 10⁵ ml (po 100 μl każdego 4 x 10⁶ ml) myszom C.B-17scid, aby przygotować model zapalenia jelita (Leach, M. W. i wsp., Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515, Aranda, R. i wsp., J. Immunol. 158, 3464-3473). Eksperyment przebiegał następująco; myszy podzielono na trzy grupy w zależności od metody traktowania: grupie pierwszej (1) wstrzyknięto komórki, ale nie podano przeciwciał anty-IL-6 receptorowych, 5 myszy, grupie drugiej (2) wstrzyknięto komórki i podano przeciwciała anty-IL-6 receptorowych 3 myszy, grupie trzeciej (3) nie wstrzyknięto komórek 3 myszy.

Przeciwciała anty-receptor IL-6 MR16-1 podano w następujący sposób: po pierwsze, rozpuszczono je w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do 20 mg/ml, 100 μl podano dootrzewnowo każdej myszy na 15 do 30 minut przed wstrzyknięciem powyższych komórek. Tydzień później doprowadzono solą fizjologiczną buforowaną fosforanem do 10 mg/ml i podano dootrzewnowe 100 μl na mysz. Czynność tę powtarzano co tydzień aż do ósmego tygodnia po transferze komórek. Natomiast grupie, która nie otrzymywała przeciwciał podawano bufor fosforanowy, w ten sam sposób.

Myszy w ósmym i dziewiątym tygodniu po podaniu komórek były ważone, izolowano z nich tkankę okrężnicy (zstępujące odcinki jelita grubego) i zatapiano w związku OTC. Otrzymane próbki mrożono w -80°C. Przy pomocy cryostatu, zamrożone bloczki były krojone na skrawki o grubości 6 pl, a następnie utrwalane w 10% formalinie. Utrwalone skrawki barwiono podwójnie metodą hematoksylinaeozyna do analizy histologicznej.

Efekt leczniczy oceniano na podstawie zmian wagi ciała (stosunek przed i po podaniu komórek) i analizy histologicznej przed indukcją zapalenia jelita przez transfer komórek i 8-9 tygodni po podaniu komórek. W celu histologicznej analizy tkanki każdej myszy oceniano na podstawie następujących 4 stadiów chorobowych zapalenia jelita (w niniejszej pracy określane jako stopnie chorobowe) (Ito, H. i wsp., J. Autoimmunity (1997) 10, 455-459).

Stadia zapalenia jelita

Stopień 0 (zerowy) nie do odróżnienia od normalnych myszy BALB/c

Stopień 1 (minimalny) obserwowano słabą hipertrofię tkanki nabłonkowej

Stopień 2 (pośredni) pośredni pomiędzy stopniem 1 a 3

Stopień 3 (ostry) znaczna hipertrofia tkanki nabłonkowej połączona ze znaczną infiltracją komórek zapalnych oraz deficytem komórek kubkowych.

Zmiany w masie ciała i stopnie zapalenia jelita pokazuje fig. 1.

U myszy, którym implantowano CD-pozytywne i CD4.5RB-silnie pozytywne komórki obserwowano rozwój zapalenia jelita, a zapalenie było również widoczne histologicznie. Obserwowano ogólne osłabienie spowodowane stanem chorobowym oraz 11% spadek średniej masy ciała. Z drugiej strony u myszy, którym podawano przeciwciała anty-receptor IL-6 obserwowano statystycznie istotną supresję utraty masa ciała, masa ciała utrzymywała się w tym samym zakresie co przed podaniem komórek. Co więcej, histologiczny obraz zapalenia jelita wskazywał na polepszenie stanu.

Do analizy statystycznej zmian masy ciała przeprowadzono najpierw test ANOVA (Analiza wariancji, SPSS dla Windows ver. 6, SPSS Inc.) celem potwierdzenia istotności, a następnie przeprowadzono wieloczynnikowe porównanie metodą Boferroni, w którym istotność obserwowano przy poziomie istotności 5%.

Opisany model jest bardzo podobny do ludzkiego zapalenia jelita, a w związku z tym wykazano, że przeciwciała anty-receptor IL-6 skutecznie zapobiegają lub są związkami terapeutycznymi dla zapalenia jelita takiego jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego lub choroba Crohna.

T a b e l a 1

Supresja utraty wagi ciała i pogorszenie zapalenia jelita przez przeciwciała anty-receptor IL-6.

Wstrzyknięte komórki	Leczenie	Liczba zwierząt	Zmiany w masie ciała (%)	Stopień choroby
CD4+CD45RBhigh	Sól fizjol. buforowana fosforanem	5	88,8 ± 6.7	2,4

PL 201 461 B1

CD4+CD45RBhigh	Przeciwciało anty- receptor IL-6	3	100,9 s 4.5	1,0
Brak	Sól fizjol. buforowana fosforanem	3	107,7 ± 0.9	0,3

Zmiany w wadze ciała wyrażono jako średnia ± odchylenie standartowe. Stopień zapalenia jelita wyrażano jako średnią grupy.

Przykład odwoławczy 1. Przygotowywanie ludzkiego rozpuszczalnego receptora IL-6

Rozpuszczalny receptor IL-6 został przygotowany metodą PCR z użyciem plazmidu pBSF2R.236 zawierającego cDNA kodujący receptor IL-6 uzyskany zgodnie z metodą Yamasaki K. i wsp., (Yamasaki i wsp., Science (1988) 241, 825-828). Plazmid pBSF2R.236 trawiono enzymem restrykcyjnym Sph I celem otrzymania cDNA receptora IL-6, który następnie wstawiano do mp18 (wytwarzanego przez Amersham). Dzięki zastosowaniu syntetycznych oligostarterów z miejscami do insercji kodonu stop do cDNA dla receptora IL-6, i użyciu metody PCR in vitro Mutagenesis System (wytwarzanego przez Amersham), pojawiła się mutacja w cDNA receptora IL-6. Procedura doprowadziła do insercji kodonu stop w 345 pozycji aminokwasowej, i w efekcie otrzymano cDNA kodujący rozpuszczalny receptor dla IL-6.

Celem ekspresji cDNA rozpuszczalnego receptora IL-6 w komórkach CHO, włączono cDNA receptora do plazmidu pSV (produkowany przez Pharmacia) otrzymując plazmid pSV L344. W dalszej kolejności cDNA rozpuszczalnego receptora IL-6 został pocięty przez Hind III-Sal I, a następnie wstawiony do plazmidu zawierającego pECEdhfr, uzyskując w ten sposób plazmid pECEdhfr344, którego ekspresja może zachodzić w komórkach CHO.

Następnie dziesięcioma μg plazmidu pECEdfhr344 trasfekowano komórki dhfr-CHO linii DXB-11 (Urland i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 77, 4216-4220) metodą strącania fosforanem wapnia (Chen C i wsp., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2752). Transfekowane komórki CHO były hodowane przez 3 tygodnie w wolnym od nukleozydów podłożu selekcyjnym α MEM, zawierającym 1 mM glutaminę, 10% dializowanej FCS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.

Wybrane komórki CHO były przeszukiwane metodą ograniczonych rozcieńczeń, tak aby otrzymać pojedynczy klon komórek CHO. Następnie klon komórek CHO był amplifikowany w 20nM-200nM metotreksacie (MTX), uzyskując w ten sposób linię komórek CHO 5E27 produkujących ludzki rozpuszczalny receptor dla IL-6. Komórki z tej linii komórkowej hodowano w podłożu Dulbecco ISCOV modyfikowanym (IMDM, wytwarzanym przez Gibco) zawierającym 5% FBS. Supernatant pochodzący z hodowanych kultur był kolekcjonowany, a stężenie rozpuszczalnego receptora dla IL-6 zostało zbadane testem ELISA, co potwierdziło obecność rozpuszczalnego receptora dla IL6 w hodowanym supernatancie

Przykład odwoławczy 2. Przygotowywanie ludzkich przeciwciał IL-6

Dziesięcioma μg rekombinowanej IL-6 (Hirano i wsp., Immunol. Lett., 17:41, 1988) immunizowano myszy BALB/c wraz z pełnym adjuwantem Freunda. Czynność tę powtarzano co tydzień dopóki nie stwierdzono przeciwciał anty-IL-6 w surowicy. Komórki immunologiczne były izolowane z lokalnych węzłów chłonnych, a następnie przeprowadzano fuzję z komórkami szpiczaka linii P3U1 przy użyciu glikolu polietylowego 1500. Hybrydy selekcjonowano według metody Oi i wsp., (Selective Methods in Cellular Immunology, Freeman and CO., San Francisco, 351, 1980) przy użyciu podłoża HAT, ustalając hybrydomę produkującą ludzkie przeciwciała anty-IL-6.

Hybrydomy produkujące ludzkie IL-6 przeciwciała były poddane następującemu testowi wiązania IL-6. A zatem, 96-studzienkowa płytka do mikromianowania wykonana z plastycznego poliwinylu (produkowane przez Dynatech Laboratories, Inc., Aleksandria, VA) opłaszczano 100 μl kozich antymysich Ig (10 μΓ^Γ) (produkowane przez Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA) przez noc w temperaturze 4°C. Następnie, płytkę poddano działaniu PBS z 1% albuminą wyizolowaną z osocza bydła (BSA), w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Po przemyciu PBS-em dodawano 100 μl supernatantu pochodzącego z hodowli hybrydom, po czym inkubowano przez całą noc w 4°C. Następnie płytkę przemywano i dodawano ¹²⁵I-znakowane rekombinowane przeciwciała IL-6 w ilości 2000 cpm/0.5 ng/na studzienkę, po czym mierzono radioaktywność każdej studzienki licznikiem promieniowania gamma (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA). Spośród 216 hybrydom klonów 32 było pozytywnych w teście wiązania IL-6. Z tych klonów uzyskano ostatecznie stabilną linię MH166.BS2. Przeciwciała MH166 anty-IL-6 produkowane przez wspomnianą hybrydomę były podtypu IgG1 κ.

PL 201 461 B1

W następnym etapie badano neutralizujący wpływ przeciwciał MH166 na wzrost mysich klonów hybrydom zależnych od IL-6 MH60.BSF2. W tym celu dodawano 1 x 10⁴/200 μl/komórek MH60.BSF2 na studzienkę, dodawano próbki zawierające przeciwciała MH 166, hodowano przez 48 godzin po czym dodawano 0.5 gCi/na studzienkę znakowanej ³H tymidyny (New England Nuclear, Boston, MA) i kontynuowano hodowlę przez dalsze 6 godzin. Komórki umieszczano na szklanych papierze filtra szklanego i automatycznie zbierano (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan). Jako kontroli użyto króliczych przeciwciał anty IL-6.

W rezultacie przeciwciała MH166 hamowały w sposób zależny od stężenia wbudowywanie ³H-tymidyny do komórek MH60.BSF2 indukowanych przez IL-6. Wykazano, że przeciwciała MH166 neutralizują aktywność IL-6.

Przykład odwoławczy 3. Przygotowywanie ludzkiego przeciwciała dla receptora IL-6.

Przeciwciało anty-receptor-IL-6 MT18 sporządzone metodą Hirata i wsp. (Hirata, Y. i wsp. J. Immunol., 143, 2900-2906, 1989) było wiązane z aktywowaną CNBr Sefarozą 4B (wytwarzaną przez Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) zgodnie z dołączonynymi wymaganiami (Yamasaki, K. i wsp., Science (1988) 241, 825-828) i oczyszczono receptor IL-6. Ludzka linia szpiczaka U266 została rozpuszczona w 1mM chlorowodorku fluorku p-paraaminofenylometanosulfonylu (wytwarzany przez Wako Chemicals) zawierającym 1% digitoniny (wytwarzany przez Wako Chemicals), 10 mM trietannolaminie (pH 7.8) i 0.15 M. NaCl (bufor digitoninowy), po czym mieszano z przeciwciałem MT15 związanym z kulkami Sepharozy 4B. Następnie kulki przemyto sześciokrotnie buforem digitoniny aby przygotować częściowo oczyszczony receptor IL-6.

Myszy BALB/c immunizowano cztery razy co dziesięć dni wyżej wymienionym, częściowo oczyszczonym receptorem IL-6, otrzymanym z 3x10⁹ U266 komórek wykorzystanych później do przygotowania hybrydom standardowymi metodami. Supernatant uzyskany z rosnących kultur komórek hybrydomy badano na aktywność wiązania receptora IL-6 według poniższych metod. 5 x 10⁷ komórek U266 znakowano ³⁵S- metioniną (2,5 mCi) i rozpuszczano w powyższym buforze digitoninowym. Solubilizowane komórki U266 mieszano z 0,04 ml przeciwciał MT18 związanych z kulkami Sepharose 4B, po czym przemywano sześciokrotnie buforem digitoninowym. Receptor IL-6 znakowany ³⁵S-metioniną był wypłukiwany 0,25 ml buforu digitoninowego (pH 3.4) po czym neutralizowany je 0,025 ml 1 M TRIS-u (pH 7,4).

0,05 ml supernatantu hybrydomy zostało zmieszane z 0,01 ml sefarozy Protein G (wytwarzanego przez Pharmacia). Po przemyciu, sefarozę inkubowano z 0,005 ml znakowanego ³⁵S roztworu receptora IL-6 przygotowanego sposobem opisanym powyżej. Immunoprycipitat analizowano na SDS-PAGE celem wyszukania supernatantów hodowli hybrydomy reagujących z receptorem IL-6. W rezultacie, otrzymano pozytywny klon hybrydomy PM-1 produkujący przeciwciała podtypu IgG1K.

Aktywność hamująca wiązania IL-6 z ludzkim receptorem IL-6 przeciwciała produkowanego przez komórki hybrydomy linii PM-1 była badana z użyciem ludzkich linii szpiczaka U266. Ludzką rekombinowaną IL-6 uzyskiwano z E. coli (Hirano i wsp., Immunol. Lett., 17: 41-45, 1988) i znakowano ¹²⁵I, stosując odczynnik Bolton-Hunter (New England Nuclarl, Boston, MA) Taaga, T. I wsp., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981). 4 x 10⁶ komórek linii U266 hodowano z 70% (v/v) supernatantem hybrydomy PM-1 wraz z 14000cpm znakowanej ¹²⁵I IL-6, przez godzinę, w temperaturze pokojowej. Na 300 μl FCS umieszczonego w 400 μl polietylenowej probówce wirówkowej naniesiono 70 μl próbki, odwirowano, a po odwirowaniu badano radioaktywność komórek.

W rezultacie stwierdzono że przeciwciała produkowane przez hybrydomę PM-1 hamują wiązanie IL-6 z receptorem IL-6.

Przykład odwoławczy 4. Sporządzenie przeciwciała przeciwko mysiemu receptowi dla IL-6

Monoklonalne przeciwciała przeciw mysiemu receptorowi IL-6 sporządzano metodą opisaną przez Satio i wsp., J. Immunol. (1993) 147, 168-173.

Komórki CHO produkujące rozpuszczalny receptor IL-6 hodowano w podłożu IMDM zawierającym 10% FCS. Z supernatantów kultur oczyszczono mysi rozpuszczalny receptor IL-6, przez dodanie mysiego przeciwciała rozpuszczalnego receptora IL-6 RS12 (zobacz Satio i wsp., supra ) na kolumnie powinowactwa załadowanej Affigel 10 (wytwarzanej przez Biorad).

Rozpuszczalne mysie receptory dla IL-6 (50 μg) zmieszano z kompletnym adiuwantem Freuda i wstrzyknięto do jamy brzusznej szczurów rasy Wistard. W dwa tygodnie po wstrzyknięciu zwierzętom podano dawkę przypominającą z niekompletnym adiuwantem Freuda. W 45 dniu od uśmierconych szczurów pobrano śledzionę i około 2 x 10⁸ komórek połączono z 1 x 10⁷ komórek szpiczaka w 50%

PL 201 461 B1

P3U1 w PEG 1500 (Boehringer Mannhein) z zastosowaniem konwencjonalnych metod a następnie dodawano do medium hodowlanego HATw celu przesiewu.

Następnie, supernatant z hybryd nakładano na płytki pokryte króliczymi anty-szczurzymi przeciwciałami IgG (wytwarzane przez Cappel) i dodano mysi rozpuszczalny receptor IL-6. Na dalszym etapie, dla wykrycia hybrydom produkujących anty-mysie przeciwciała przeciw rozpuszczalnym receptorom dla IL-6, użyto króliczych anty-mysich przeciwciał przeciwko receptorom IL-6 i znakowanych alkaliczną fosfatazą owczych anty-szczurzych IgG. Wykrywanie przeprowadzano metodą ELISA. W dalszej kolejności potwierdzano produkcję żądanych typów przeciwciał, a dwukrotne przesiewanie klonów hybrydom pozwoliło wyodrębnić pojedyncze komórki hybrydomy. Klony opisano jako MR16-1.

Neutralizującą aktywność przeciwciał produkowanych przez hybrydomę na transdukcję sygnału przez IL-6, badano poprzez wbudowywanie ³H-tymidyny do komórek MH60.BSF2 (Matsuda, T. I wsp.,

J. Immunol. (1988) 18, 951-956). Komórki MH60.BSF2 przygotowywano w ilości 1 x 10⁴ komórek/200μl/na studzienkę w 96-studzienkowej mikropłytce. 10 pg/ml mysiej IL-6 i przeciwciała MR16-1 lub przeciwciała RS12 w ilości 12.3 -1000 ng/ml dodano do każdej studzienki a następnie hodowano w 37°C przez 44 godziny w 5% CO₂, po czym do każdej dodano po 1 μθί/na studzienkę 3H-tymidyny. Po czterech godzinach mierzono wbudowywanie ³H-tymidyny. W rezultacie stwierdzono zahamowanie wbudowywania ³H-tymidyny do komórek MH60.BSF2 spowodowane przez przeciwciała MR16-1.

W ten sposób wykazano, że przeciwciała produkowane przez hybrydomę MR16-1 hamują wiązanie Il-6 z receptorem dla IL-6.

Możliwości zastosowania przemysłowego.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem wykazano, że antagoniści IL-6, tacy jak przeciwciała przeciwko receptorowi IL-6 mają terapeutyczne zastosowanie w zapaleniu jelita. Wykazano więc przydatność antagonistów IL-6, jako czynnika terapeutycznego w wypadku choroby Crohna lub wrzodziejącego zapalenia jelita.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie antagonisty interleukiny-6 (IL-6) do wytwarzania czynnika zapobiegającego lub terapeutycznego do leczenia choroby zapalenia jelita, przy czym antagonista interleukiny-6 (IL-6) jest przeciwciałem przeciwko receptorowi IL-6.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym przeciwko receptorowi IL-6.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1 do 4, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem rekombinowanym.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne jest przeciwciałem PM-1.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne jest przeciwciałem MR16-1.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 3, znamienne tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest chimerycznym lub humanizowanym przeciwciałem przeciwko receptorowi IL-6.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że humanizowane przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest humanizowanym przeciwciałem PM-1.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że zapalenie jelita jest chorobą Crohna lub wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego.
11. 11. Zastosowanie antagonisty przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi IL-6 do produkcji czynnika zapobiegającego utracie wagi w chorobie zapalenia jelita.