KR100407811B1 - 인터루킨-6 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제 - Google Patents

인터루킨-6 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제 Download PDF

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Abstract

인터루킨-6(IL-6)안타고니스트, 예를 들면 IL-6수용체에 대한 항체를 유효성분으로하는 염증성 장질환, 예를 들면 크론병, 궤양성 대장염 등에 대한 예방 또는 치료제.

Description

인터루킨-6 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제{PREVENTIVES OR REMEDIES FOR INFLAMMATORY INTESTINAL DISEASES CONTAINING AS THE ACTIVE INGREDIENT IL-6 ANTAGONISTS}
IL-6는 세포자극인자 2(BSF2) 또는 인터페론 β2로도 호칭된 사이토카인이다. IL-6는 B임파구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자(分化因子)로서 발견되고(Hirano, T. et al., Nature(1986) 324, 73-76), 그 후 여러가지의 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인 것이 명백해졌다.(Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78). IL-6는, T임파구계세포의 성숙화를 유도하는 것이 보고되어있다(Lotz, M. et al., J. Exp. Med (1988) 167, 1253-1258).
IL-6는 세포상에서 2종류의 단백질을 통해서 그의 생물학적 활성을 전달한다. 하나는, IL-6가 결합하는 분자량 약 80kD의 리간드결합성 단백질의 IL-6 수용체이다(Taga, T. et al., J. Exp. Med(1987) 166, 967-981, Yamasaki, K. et al.,Science (1987) 241, 825-828). IL-6 수용체는, 세포막을 관통해서 세포막상에 발현하는 막결합형 외에, 주로 그의 세포외 영역으로부터 되는 가용성 IL-6 수용체로서도 존재한다.
또 하나는, 비리간드 결합성의 시그날 전달에 관련되는 분자량 약 130kD의 막단백질 gp130이다. IL-6와 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6 수용체복합체를 형성하고, 이어서 gp130과 결합함으로써, IL-6의 생물학적 활성이 세포내에 전달된다(Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581).
IL-6 안타고니스트는, IL-6의 생물학적 활성의 전달을 저해하는 물질이다. 이제까지, IL-6에 대한 항체(항IL-6항체), IL-6 수용체에 대한 항체(항IL-6 수용체항체), gp130에 대한 항체(항gp130항체), IL-6개변체, IL-6 또는 IL-6 수용체 부분펩티드 등이 알려져 있다.
항IL-6 수용체 항체에 관해서는, 몇개의 보고가 있다(Novick D. et al., Hybridoma(1991) 10, 137-146, Huang, Y.W. et al., Hybridoma(1993) 12, 621-630,국제특허출원 공개번호 WO95-09873, 프랑스특허출원 공개번호 FR2694767, 미국특허 제 521628). 그 중 하나인 마우스항체 PM-1(Hirata, Y. et al., J. Immunol.(1989) 143, 2900-2906)의 상보성결정영역(CDR)을 인간항체에 이식함으로써 얻어진 인간형화 PM-1 항체가 알려져 있다(국제특허출원 공개번호 WO92-19759).
염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD)은, 궤양성 대장염과 크론병을 대표하는 비특이적 염증이다. 질환의 성립에 관해서는, 면역학적 이상의 관여가 깊이 시준되어 있지만, 병원인 해명에는 이르지 못했다. 그러나, 병변부위에 떼를이룬 단구, 임파구가 점막장해에 관여하고 있는 것으로 생각되어지고, 이들 세포로부터 생산되는 염증성 메디에이터(inflammatory mediators), 특히 사이토카인 (IL1β, TNFα, IL-6 등)이 주목되고 있다.
이들 염증성 메디에이터 중, IL-6에 대해서는 질환활동성과의 관계, 즉 IBD 특이적 지표로 된다든지 하는 점에 초점이 맞추어져 왔다. 우선, 혈청 중 IL-6 농도는 크론병과 궤양성 대장염의 어느 것에 있어서도 증가하고, 그의 농도는 질환활동성과 상관한다(Holtkamp, W. et al., J. Clin. Gastroenterology(1995) 20, 123-126, Niederau, C. et al., Hepato-Gastroenterology(1997) 44, 90-107). 또, 조직 중 IL-6 mRNA량을 PCR(polymerase chain reaction) 생성물로서 검출한 결과, 궤양성 대장염, 크론병과 함께 활동성과 좋게 상관하여 증가하는 것이 개시되어 있다(stevens, C. et al., Dig. Dis. Sci. (1992) 37, 818-826). 이와 같은 활동기 IBD에 있어서 IL-6 생산량 증가에 대해서, 그의 메카니즘이 해석되어, 점막고유층 중의 단핵세포를 Pokeweed mitogen으로 자극했을 때의 생산량이 질환 활동성과 상관하는 것이 명백해졌다(Reinecker, H.-C. et al., Clin. Exp. Immunol. (1993) 94, 174-181).
그 후, 무자극의 점막고유층 유래 단핵세포 또는 환자 점막의 조직배양 어느 것에 있어서도 IL-6 생산과 질환 활동성과의 상호관련이 인정되고, 전자에 있어서는 점막조직 중 IL-6 생산 세포수가 증가하는 것도 나타났다. 이 단핵세포 중, 가장 중요한 IL-6 생산 세포는 대식세포(macrophages)이고, 활동기 IBD 환자의 점막 고유층 중에는 왕성하게 IL-6를 생산하고 있는 CD68 양성 대식세포가 다수 존재하는 것이 확인되고 있다(Kusugami, K et al., Dig. Dis. Sci. (1995), 40, 949-959).
IL-6의 생산은, 크론병 환자의 내시경적 관찰결과와도 상관하는 것이 밝혀졌다(Reimund, J.-M. et al., Gut(1996) 39, 684-689). 또, IL-6 뿐만 아니라 혈청 중 가용성 IL-6 수용체 농도와 질환활동도가 상호관련한다는 보고도 있다 (Mitsuyama. K. et al., Gut (1995) 36, 45-49).
IL-6 이외의 염증 메디에이터에서는, IL-1β생산량이 IL-6와 동일하게 질환 활동성과 상호관련하는 것이 알려졌다. 한편, TNFα의 생산량에 대해서는 반드시 상호관련하지 않고, 활동성이 낮은 상태에서도 생산량은 높은 경향이다(Reinecker, H.-C. et al., Clin. Exp. Immunol. (1993) 94, 174-181, Reimund, J.-M. et al., Gut (1996) 39, 684-689).
현행 IBD 치료법은, 식사요법과 약물요법의 조합으로부터 되고, 살라조설파피리딘, 글루코코르티코이드 등이 처방되어 있다. 그러나, 이들 약물에는 부작용에 의한 불내성환자가 존재하여 장기간 투여에는 문제가 있다.
한편, 새로운 IBD의 치료로서 사이토카인 활성의 저해에 의해, 병태를 개선하려고 하는 시도가 진행되고 있다. 그의 주된 표적은 IL-1과 TNFα(Van Deventer, S. J. H. Gut (1997) 40, 443-448)이고, IL-1에 대해서는, IL-1 수용체 안타고니스트(Cominelli F et al., Gastroenterology (1992) 103, 65-71), IL-1 저해제인 CGP47969A(Casini-Raggi et al., Gastroenterology (1995) 109, 812-818) 등에 의한 임상 또는 실험동물 수준에서 검토되고 있다. 또, TNFα에 대해서는, 특이적 모노클로날항체를 크론병 환자에 투여하고, 다른 치료에 저항성이 있었던 크론병 환자 10인 중 8인에서, 활동성의 저하와 궤양의 치료가 인정되었다(Van Dullemen, H.M. et al., Gastroenterology (1995) 109, 129-135). 그러나, IL-6 안타고니스트를 사용하여 IL-6의 생물학적 활성을 특이적으로 억제함으로써, IBD에 치료효과를 나타내는 것은 알려지지 않았다.
본 발명은 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다. 또, 본 발명은, IL-6 안타고니스트를 유효성분으로 하는 크론병(Crohn's disease) 또는 궤양성 대장염의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
본 발명은, 상기한 결점을 갖지 않는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제를 제공하는 것이다.
즉, 본 발명은, (1) IL-6 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제를 제공한다.
본 발명은, 또 (2) IL-6 수용체에 대한 항체를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제를 제공한다.
본 발명은, 또 (3) IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제를 제공한다.
본 발명은, 또 (4) 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제를 제공한다. 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체는 바람직하게는 PM-1 항체이다.
본 발명은, 또 (5) 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제를 제공한다. 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체는 바람직하게는 MR 16-1 항체이다.
본 발명은, 또 (6) IL-6 수용체에 대한 재조합형 항체를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제를 제공한다. IL-6 수용체에 대한 재조합형 항체, 바람직하게는 인간항체정상영역(C영역)을 갖는다.
본 발명은, 또 (7) IL-6 수용체에 대한 키메라항체 또는 인간형화항체를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제를 제공한다.
본 발명은, 또 (8) 인간형화 PM-1 항체를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제를 제공한다.
본 발명은, 또 (9) 상기 (1)~(8)에 기재된 IL-6 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 크론병 또는 궤양성 대장염의 예방 또는 치료제를 제공한다.
본 발명은, 또 (10) 상기 (1)~(8)에 기재된 IL-6 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환에 있어서 체중감소억제제를 제공한다.
본 발명은, 또 (11) 상기 (3)~(8)에 기재된 IL-6 수용체에 대한 항체를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환에 있어서 체중감소억제제를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 안타고니스트는, 염증성 장질환의 예방 또는 치료효과, 또는 염증성 장질환에 있어서 체중감소억제효과를 나타내는 것이라면, 그의 유래, 종류, 및 형상을 불문한다.
IL-6 안타고니스트는, IL-6에 의한 시그날 전달을 차단하여, IL-6의 생물학적 활성을 저해하는 물질이다. IL-6 안타고니스트는, 바람직하게는 IL-6, IL-6 수용체 및 gp 130의 어느 것의 결합에 대한 저해작용을 갖는 물질이다. IL-6 안타고니스트로서는, 예를 들면 항IL-6항체, 항IL-6 수용체항체, 항gp130항체, IL-6개변체, 가용성 IL-6수용성 개변체, 또는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드 및, 이들과 동일한 활성을 나타내는 저분자 물질을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항IL-6 항체는, 공지의 수단을 사용해서 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항IL-6항체로서, 특히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에 의해 생산되는 것, 및 유전자공학적수법에 의해 항체 유전자를 함유하는 발현 벡타로 형질전환한 숙주에 의해 생산되는 것이 있다. 이 항체는 IL-6와 결합함으로써, IL-6의 IL-6 수용체로의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포내로의 전달을 차단한다.
이와 같은 항체로서는, MH166(Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956)나 SK2 항체(Sato, K. et al., 제 21회, 일본면역학회총회, 학술기록 (1991) 21, 166) 등을 들 수 있다.
항IL-6항체생산 하이브리도마는, 기본적으로는 공지기술을 사용하여, 이하와 같이 해서 제조할 수 있다. 즉, IL-6을 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라서 면역하여 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해서 공지의 모세포(parent cells)와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로날 항체생산 세포를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다.
구체적으로는, 항IL-6항체를 제조하기 위하여는 다음과 같이 하면 좋다. 예를 들면, 항체취득의 감작항원으로서 사용되는 인간IL-6는, Eur. J. Biochem(1987)168, 543-550, J. Immunol.(1988) 140, 1534-1541, 또는 Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688에 개시된 IL-6 유전자/아미노산 서열을 사용하여 얻어진다.
IL-6의 유전자 서열을 공지의 발현 벡타계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그의 숙주세포 중, 또는 배양상징액 중으로부터 목적하는 IL-6 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 IL-6 단백질을 감작항원으로서 사용하면 좋다. 또, IL-6 단백질과 다른 단백질과의 융합단백질을 감작항원으로서 사용해도 좋다.
본 발명에서 사용되는 항IL-6 수용체 항체는, 공지의 수단을 사용해서 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항IL-6 수용체 항체로서, 특히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에 의해 생산되는 것, 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체유전자를 함유하는 발현벡타로 형질전환한 숙주에서 생산되는 것이 있다. 이 항체는 IL-6 수용체와 결합함으로써, IL-6의 IL-6 수용체로의 결합을 저해해서 IL-6의 생물학적 활성의 세포내로의 전달을 차단한다.
이와 같은 항체로서는, MR16-1 항체(Tamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993) 90, 11924-11928), PM-1 항체(Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 항체, AUK64-7항체 또는 AUK146-15항체(국제특허출원 공개번호 WO92-19759) 등을 들 수 있다. 이들 중에서, 특히 바람직한 항체로서 PM-1 항체를 들 수 있다.
또한, PM-1 항체 생산 하이브리도마 세포주는 PM-1로서 공업기술원생명공학공업기술연구소(이바라키껭 쯔꾸바시 히가시 1초메 1반 3고)에 1990년 7월 10일에 FERM BP-2998로서 부다페스트 조약에 기초해 국제기탁되어 있다. 또, MR16-1 항체생산 하이브리도마 세포주는, Rat-mouse hybridoma MR16-1로서, 공업기술원생명공학공업기술연구소(이바라키껭 쯔꾸바시 히가시 1초메 1반 3고)에 1997년 3월 13일에 FERM BP-5875로서 부다페스트조약에 기초해 국제기탁되어 있다.
항IL-6 수용체 모노클로날 항체 생산 하이브리도마는, 기본적으로는 공지기술을 사용해서 이하와 같이 해서 제조할 수 있다. 즉, IL-6 수용체를 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라서 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해서 공지의 모세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로날 항체 생산 세포를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다.
구체적으로는, 항IL-6 수용체 항체를 제작하기 위하여는 다음과 같이 하면 좋다. 예를 들면, 항체취득의 감작항원으로서 사용되는 인간IL-6 수용체는, 유럽특허출원 공개번호 EP325474에, 마우스IL-6 수용체는 일본국특허출원 공개번호 1991-155795호에 기재된 IL-6 수용체 유전자/아미노산 서열을 사용해서 얻어진다.
IL-6 수용체 단백질은, 세포막상에 발현해 있는 것과 세포막에서 이탈해 있는 것(가용성 IL-6수용체)(Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676)의 2종류이다. 가용성 IL-6 수용체 항체는 세포막에 결합해 있는 IL-6 수용체의 실질적으로 세포외 영역으로부터 구성되어 있고, 세포막관통영역 또는 세포막관통영역과 세포내영역이 결손해 있는 점에서 막결합형 IL-6 수용체와 다르다. IL-6 수용체 단백질은, 본 발명에서 사용되는 항IL-6 수용체 항체의 제조의 감작항원으로서 사용될 수 있는 한, 어느 IL-6 수용체를 사용해도 좋다.
IL-6 수용체의 유전자 서열을 공지의 발현벡타계에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그의 숙주세포 중, 또는 배양상징액 중으로부터 목적하는 IL-6 수용체 단백질을 공지의 방법으로 정제하여, 이 정제 IL-6 수용체 단백질을 감작항원으로서 사용하면 좋다. 또, IL-6 수용체를 발현하고 있는 세포나 IL-6 수용체 단백질과 다른 단백질과의 융합단백질을 감작항원으로서 사용해도 좋다.
인간IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pIBIBSF2R를 함유하는 대장균(E.coli)은 1989년 1월 9일자로 공업기술원생명공학공업기술연구소에 HB101-PIBIBSF2R로서 수탁번호 FERM BP-2232로서 부다페스트 조약에 기초해 국제기탁되어 있다.
본 발명에서 사용되는 항 gp130항체는, 공지의 수단을 이용해서 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 gp130항체로서, 특히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날항체로서는 하이브리도마에 의해서 생산되는 것, 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체유전자를 함유하는 발현벡타로 형질전환한 숙주세포에 의해서 생산되는 것이 있다. 이 항체는 gp130과 결합함으로써, IL-6/IL-6 수용체 복합체의 gp130으로의 결합을 저해해서 IL-6의 생물학적 활성의 세포내로의 전달을 차단한다.
이와 같은 항체로서는 AM64항체(특개평 3-219894호), 4B11항체 및 2H4항체(미국특허 제 5571513호), B-S12항체 및 B-P8항체(특개평 8-291199) 등을 들 수 있다.
항gp130 모노클로날 항체 생산 하이브리도마는, 기본적으로는 공지기술을 사용하여 이하와 같이해서 제조할 수 있다. 즉, gp130을 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라서 면역하여 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해서 공지의 모세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로날 항체 생산 세포를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다.
구체적으로는, 모노클로날 항체를 제조하기 위해서는 이하와 같이하면 좋다. 예를 들면, 항체취득의 감작항원으로서 사용되는 gp130은, 유럽특허출원 공개번호 EP411946에 기재된 gp130 유전자/아미노산 서열을 사용함으로써 얻어진다.
gp130의 유전자 서열을 공지의 발현벡터계에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그의 숙주세포 중, 또는 배양상징액 중으로부터 목적하는 gp130 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 gp130 수용체 단백질을 감작항원으로서 사용하면 좋다. 또, gp130을 발현하고 있는 세포나 gp130 단백질과 다른 단백질과의 융합단백질을 감작항원으로서 사용해도 좋다.
감작항원으로 면역되는 포유동물로서는 특히 한정되는 것은 아니지만, 세포융합에 사용하는 모세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직하며, 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면 마우스, 랫트, 햄스타(hamsters) 등이 있다.
감작항원을 동물에 면역하는데는, 공지의 방법에 따라서 행해진다. 예를 들면, 일반적 방법으로서, 감작항원을 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석·현탁한 것을 소망에 따라 통상의 보조약, 예를 들면프로인드 완전 보조약(Freund's complete adjuvant)를 적당량 혼합해서 유화시킨 후, 포유동물에 4∼21일 마다 수차례 투여하는 것이 바람직하다. 또, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수 있다.
이와 같이 면역하여, 혈청 중에 소망의 항체레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유동물로부터 면역세포를 취출하여 세포융합시킨다. 세포융합시키는 바람직한 면역세포로서는 특히 비장세포를 들 수 있다.
상기 면역세포와 세포융합되는 다른 모세포로서 포유동물의 미엘로마 세포(mammalian myeloma cells)는 이미 공지된 여러가지의 세포주, 예를 들면 P3X63Ag8.653(Kearney, J. F. et al., J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1(Kohler, G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11(Margulies D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO(de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 등이 적당히 사용된다.
상기 면역세포와 미엘로마 세포의 세포융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 밀스테인(Milstein) 등의 방법(Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol.(1981) 77, 3-46) 등에 따라서 행할 수 있다.
더욱 구체적으로는, 상기 세포융합은, 예를 들면 세포융합촉진제의 존재하에통상의 영양배양액 중에서 실시된다. 융합촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되며, 또한 소망에 따라 융합효율을 높이기 위하여 디메틸설폭시드 등의 보조제를 첨가 사용할 수도 있다.
면역세포와 미엘로마세포와의 사용비율은, 예를 들면 미엘로마세포에 대해서 면역세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면, 상기 미엘로마 세포주의 증식에 적당한 RPMI 1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이 종류의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용가능하고, 또한 소의 태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 사용할 수도 있다.
세포융합은, 상기 면역세포와 미엘로마세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하여, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액, 예를 들면 평균분자량 1000~6000 정도의 PEG 용액을, 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가하여 혼합함으로써 목적하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 이어서, 적당한 배양액을 연속해서 첨가하고, 원심분리해서 상징액을 제거하는 조작을 되풀이함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거할 수 있다.
상기 하이브리도마는, 통상의 선택배양액, 예를 들면 HAT 배양액(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배양액)으로 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은, 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는데 충분한 시간, 통상 수일~수주간 계속한다. 이어서, 통상의 한계희석법을 실시하고, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 클로닝이 행해진다.
또, 인간 이외의 동물에 항원을 면역하여 상기 하이브리도마를 얻는 것 외에, 인간 임파구를 in vitro에서 소망의 항원단백질 또는 항원발현세포로 감작하고, 감작B임파구를 인간 미엘로마 세포, 예를 들면 U266과 융합시키고, 소망의 항원 또는 항원발현세포로의 결합활성을 갖는 소망의 인간항체를 얻을 수 있다(특공평 1-59878호 참조). 또한, 인간항체유전자의 레퍼터리(repertoire)를 갖는 트랜스제닉 동물(transgenic animal)에 항원 또는 항원발현세포를 투여하고, 전술한 방법에 따라 소망의 인간항체를 얻어도 좋다(국제특허출원 공개번호 WO93-12227, WO92/03918, WO94/02602, WO94/25585, WO96/34096, WO96/33735 참조).
이와 같이해서 제조되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양하는 것이 가능하고, 또 액체질소 중에서 장기간 보존하는 것이 가능하다.
상기 하이브리도마에서 모노클로날 항체를 얻는데는, 상기 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그의 배양상징액으로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시켜 그의 복수(腹水)로서 얻는 방법 등이 채택된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는데 적합하고, 한편 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합하다.
예를 들면, 항IL-6 수용체 항체 생산 하이브리도마의 제조는, 특개평 3-139293에 기재된 방법에 의해 행할 수 있다. 공업기술원생명공학공업기술연구소(이바라키껭 쯔꾸바시 히가시 1초메 1반 3고)에 1990년 7월 10일에 FERM BP-2998로서 부다페스트 조약에 기초해 국제기탁된 PM-1 항체 생산 하이브리도마를 BALB/c 마우스의 복강내로 주입해서 복수를 얻고, 이 복수로부터 PM-1항체를 정제하는 방ㅈ법이나, 이 하이브리도마를 적당한 배지, 예를 들면 10% 소의 태아혈청, 5%BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim 제)함유 RPMI 1640 배지, 하이브리도마 SFM 배지(GIBCO-BRL 제), PFHM-Ⅱ 배지(GIBCO-BRL 제) 등으로 배양하여, 그의 배양상징액으로부터 PM-1 항체를 정제하는 방법으로 행할 수 있다.
본 발명에는, 모노클로날 항체로서, 항체유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡타에 결합해서 이것을 숙주에 도입하여 유전자 재조합 기술을 사용해서 생산시킨 재조합형 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Borrebaeck C.A.K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조).
구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 생산하는 세포, 예를 들면 하이브리도마로부터 항체의 가변(V)영역을 코드하는 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는, 공지의 방법, 예를 들면 구아니딘 초원심법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 등에 의해 전RNA를 제조하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia 제) 등을 사용해서 mRNA를 조제한다. 또, QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia 제)를 사용해서 mRNA를 직접 제조할 수 있다.
얻어진 mRNA로부터 역전사효소를 사용해서 항체V영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은, AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit 등을 사용해서 행할 수 있다. 또, cDNA의 합성 및 증폭을 행하는 데는 5'-Ampli FINDERRACE Kit(clontech 제) 및 PCR를 사용한 5'-RACE법(Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8998-9002;Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)를 사용할 수 있다. 얻어진 PCR 생성물로부터 목적하는 DNA 단편을 정제하고, 벡타-DNA와 연결한다. 또한, 이것으로부터 재조합 벡타를 제조하여, 대장균에 도입해서 클로니를 선택해서 소망하는 재조합 벡타를 제조한다. 목적하는 DNA의 염기서열을 공지의 방법, 예를 들면 디데옥시법에 의해 확인한다.
목적하는 항체의 V영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이것을 소망의 항체정상영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결하여, 이것을 발현벡타로 결합한다. 또는, 항체의 V영역을 코드하는 DNA를 항체 C영역의 DNA를 함유하는 발현 벡타로 결합해도 좋다.
본 발명에서 사용되는 항체를 제조하는데는, 후술하는 바와 같이 항체유전자를 발현제어영역, 예를 들면 인핸서(enhancer) 및/또는 프로모터(promoter)의 제어하에서 발현하도록 발현 벡타에 결합한다. 다음에, 이 발현 벡타에 의해 숙주세포를 형질전환해서 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명에서는, 인간에 대한 이종항원성(異種抗原性)을 저하시키는 것 등을 목적으로 해서 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면 키메라항체, 인간형화항체를 사용할 수 있다. 이들의 개변항체는 공지의 방법을 사용해서 제조할 수 있다.
키메라항체는, 상기한 바와 같이 해서 얻은 항체 V영역을 코드하는 DNA를 인간항체 C영역을 코드하는 DNA와 연결하여, 이것을 발현 벡타에 결합해서 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어진다(유럽특허출원 공개번호 EP125023, 국제특허출원 공개번호 WO92-19759 참조). 이 공지의 방법을 사용해서 본 발명에 유용한 키메라항체를 얻을 수 있다.
예를 들면, 키메라 PM-1 항체의 L쇄 및 H쇄의 V영역을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드는, 각각 pPM-k3 및 pPM-h1로 명명되고, 이 플라스미드를 갖는 대장균은 National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited에, 1991년 2월 11일에 각각 NCIMB 40366, NCIMB 40362로서 부다페스트 조약에 기초해 국제기탁되어있다.
인간형화항체는, 재구성(reshaped) 인간항체로도 칭해지며, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스항체의 상보성결정영역(CDR)을 인간항체의 상보성결정영역으로 이식한 것이고, 그의 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다(유럽특허출원 공개번호 EP125023, 국제특허출원 공개번호 WO92-19759 참조).
구체적으로는, 마우스항체의 CDR와 인간항체의 프레임워크 영역 (FR;Framework region)을 연결하도록 설계한 DNA 배열을, 말단부에 오버랩 (overlap)하는 부분을 갖도록 제조한 몇개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간항체 C영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현벡타에 결합해서, 이것을 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어진다(유럽특허출원 공개번호 EP239400, 국제특허출원 공개번호 WO92-19759 참조).
CDR를 통해서 연결되는 인간항체의 FR는, 상보성결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라서, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적당한 항원결합부위를 형성하도록 항체의 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
키메라항체, 인간형화항체에는 인간항체 C영역이 사용된다. 인간항체 C영역으로서는, C영역으로서는, Cγ를 들 수 있으며, 예를 들면, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4를 사용할 수 있다. 또, 항체 또는 그의 생산의 안정성을 개선하기 위하여, 인간항체C영역을 수식해도 좋다.
키메라항체는, 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간항체 유래의 C영역으로부터 되고, 인간형화항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성결정영역과 인간항체 유래의 프레임워크 영역 및 C영역으로부터 되고, 안간체내에 있어서 항원성이 저하해 있기 때문에, 본 발명에 사용되는 항체로서 유용하다.
본 발명에 사용되는 인간형화항체의 바람직한 구체예로서는 인간형화 PM-1항체를 들 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO92-19759 참조).
상기와 같이 구축한 항체유전자는, 공지의 방법에 의해 발현시켜 얻을 수 있다. 포유류세포의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 발현되는 항체유전자, 그의 3'측 하류에 폴리A 시그날을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 이것을 함유하는 벡타에 의해 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 프로모터/인핸서로서는, 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/ enhancer)를 들 수 있다.
또, 기타 본 발명에서 사용되는 항체발현에 사용할 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로바이러스(retrovirus), 폴리오마바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스(adenovirus), 시미안바이러스(simian virus)40(SV40)등의 바이러스 프로모터/인핸서나 인간 엘롱게이션 팩터(human elongation factor)1α(HEF1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인핸서를 사용하면 좋다.
예를 들면, SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, 물리간(Mulligan) 등의 방법(Mulligan, R.C. et al., Nature (1979) 277, 108-114), 또 HEF1α프로모터/인핸서를 사용하는 경우, 미즈시마(Mizushima) 등의 방법(Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 따르면 용이하게 실시할 수 있다.
대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체분비를 위한 시그날 배열, 발현시키는 항체유전자를 기능적으로 결합시켜서 발현시킬 수 있다. 예를 들며, 프로모터로서는 lacZ프로모터, araB프로모터를 들 수가 있다. lacZ프로모터를 사용하는 경우, 와드(Ward) 등의 방법(Ward, E.S. et al., Nature(1989) 341, 544-546; Ward, E.S. et al., FASEB J.(1992) 6, 2422-2427), araB프로모터를 사용하는 경우, 베터(Better) 등의 방법(Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043)에 따르면 좋다.
항체분비를 위한 시그날배열로서는, 대장균의 페리플라즘(periplasm)에 생산시키는 경우, pelB 시그날배열(Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)을 사용하면 좋다. 페리플라즘에 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절히 리폴드(refold)해서 사용한다(예를 들면, WO96/30394 참조).
복제기원으로서는, SV40, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소의 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus, BPV)등의 유래의 것을 사용할 수 있고, 또한 숙주세포계에서 유전자 카피수(gene copy number) 증폭을 위해, 발현벡타는 선택 마커로서 아미노글리코시드포스포트란스페라제(APH)유전자, 티미딘키나제(TK)유전자, 대장균 크산틴 구아닌포스포리보실 트란스페라제(Ecogpt)유전자, 디히드로엽산환원효소(dhfr)유전자 등을 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체를 제조하기 위하여, 임의의 생산계를 사용할 수 있다. 항체제조를 위한 생산계는, in vitro 및 in vivo 생산계가 있다. in vitro 생산계로서는, 진핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수가 있다.
진핵세포를 사용하는 경우, 동물세포, 식물세포, 진균세포를 사용하는 생산계가 있다. 동물세포로서는, (1) 포유류 세포, 예를 들면, CHO, COS, 미엘로마, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero, (2) 양생류 세포, 예를 들면 크세노푸스 오우사이트(Xenopus oocytes), 또는 (3) 곤충세포, 예를 들면, sf9, sf21, Tn5가 알려져 있다. 식물세포로서는, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져있고, 이것을 칼루스 배양(callus culture)하면 좋다. 진균세포로서는 효모, 예를 들면 사카로미세스(Saccharomyces)속, 예를 들면 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들면 아스퍼길루스 속(Aspergillus), 예를 들면 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger) 등이 알려져 있다.
원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는 대장균(E.coli), 고초균(枯草菌)이 알려져 있다.
이들의 세포에, 목적하는 항체유전자를 형질전환에 의해 도입하고, 형질전환된 세포를 in vitro에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 배양은, 공지의 방법에 따라 행한다. 예를 들면, 배양액으로서, DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM을 사용할 수 있고, 소의 태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 사용할 수도 있다. 또, 항체유전자를 도입한 세포를 동물의 복강 등으로 옮김으로써 in vitro에서 항체를 생산해도 좋다.
한편, in vivo의 생산계로서는, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수가 있다. 동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다.
포유류 동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소를 사용할 수 있다(Viki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또, 곤충으로서는 누에를 사용할 수 있다. 식물을 사용하는 경우, 예를 들면 담배를 사용할 수 있다.
이들의 동물 또는 식물에 항체유전자를 도입하여, 동물 또는 식물의 체내에서 항체를 생산해서 회수한다. 예를 들면, 항체유전자를 염소β카제인과 같은 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 중앙에 삽입해서 융합유전자로서 제조한다. 항체유전자가 삽입된 융합유전자를 함유하는 DNA 단편을 염소의 배(胚)에 주입하고, 이 배를 암컷의 염소에 도입한다. 배(胚)를 수용한 염소로부터 태어나는 트란스제닉 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터 소망의 항체를 얻는다. 트란스제닉 염소로부터 생산되는 소망의 항체를 함유하는 유즙량을 증가시키기 위하여, 적당히 홀몬을 트란스제닉 염소에 사용해도 좋다(Ebert, K.M. et al., bio/Technology(1994) 12, 699-702).
또, 누에를 사용하는 경우, 목적하는 항체유전자를 삽입한 바큘로바이러스(baculovirus)를 누에에 감염시켜, 이 누에의 체액으로부터 소망의 항체를 얻는다(Maeda, S. et al, Nature (1985) 315, 592-594). 또한, 담배를 사용하는 경우, 목적하는 항체유전자를 식물 발현용 벡타, 예를 들면 pMON 53에 삽입하여, 이 벡타를 Agrobacterium tumefaciens와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면 Nicotiana tabacum에 감염시켜, 이 담배의 입으로부터 소망하는 항체를 얻는다(Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
상기한 바와 같이, in vitro 또는 in vivo의 생산계로 항체를 생산하는 경우, 항체 중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA를 따로따로 벡타에 결합해서 숙주를 동시에 형질전환시켜도 좋고, 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA를 단일의 발현 벡타에 결합해서, 숙주를 형질전환시켜도 좋다(국제특허출원 공개번호 WO94-11523 참조).
본 발명에서 사용되는 항체는, 본 발명에 적합하게 사용될 수 있는 한, 항체의 단편이나 그의 수식물이어도 좋다. 예를 들면, 항체의 단편으로서는, Fab, F(ab')2, Fv 또는 H쇄와 L쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 싱글체인(single-chain) Fv(scFv)를 들 수 있다.
구체적으로는 항체를 효소, 예를 들면 파파인(papain), 펩신으로 처리하여 항체단편을 생성시키든가, 또는 이들 항체단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이것을 발현벡타에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킨다(예를 들면, Co. M.S. et al., J. Immunol.(1994) 152, 2968-2976), Better, M. Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. Skerra, A.Methods in Enzymology (1989) 178,476-496, Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J, et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669, Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137 참조).
scFv는, 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결함으로써 얻어진다. 이 scFv에 있어서, H쇄 V영역과 L쇄 V영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 통해서 연결된다(Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988) 85, 5879-5883). scFv에 있어서 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은, 상기 항체로서 기재된 것의 어느 것의 유래이어도 좋다. V영역을 연결하는 펩티드 링커로서는, 예를 들면 아미노산 12-19 잔기로부터 되는 임의의 1본쇄 펩티드가 사용된다.
scFv를 코드하는 DNA는, 상기 항체의 H쇄 또는 H쇄 V영역을 코드하는 DNA, 및 L쇄 또는, L쇄 V영역을 코드하는 DNA 주형으로 하고, 이들의 서열 중 소망하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 부분을, 그의 양단을 규정하는 프라이머쌍(primer pair)을 사용해서 PCR법에 의해 증폭하고, 이어서 또한 펩티드 링커부분을 코드하는 DNA 및 그의 양단을 각각 H쇄, L쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머쌍을 조합해서 증폭함으로써 얻어진다.
또, 일단 scFv를 코드하는 DNA가 제조되면, 이들을 함유하는 발현벡타 및 이 발현벡타에 의해 형질전환된 숙주를 사용해서 통상의 방법에 따라서 scFv를 얻을 수 있다.
이들 항체의 단편은, 상기와 동일하게 해서 그의 유전자를 얻어 발현시켜 숙주에 의해 생산할 수가 있다. 본원 특허청구의 범위에서 말하는「항체」에는 이들항체의 단편도 포함된다.
항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다. 본원 특허청구의 범위에서 말하는「항체」에는 이들의 항체수식물도 포함된다. 이와 같은 항체수식물을 얻는데는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 이들의 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.
상기와 같이 생산, 발현된 항체는 세포 내외, 숙주로부터 분리하여 균일하게 될 때까지 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리·정제는 어피니티 크로마토그라피(affinity chromatography)에 의해 행할 수 있다. 어피니티 크로파토그라피에 사용되는 칼럼으로서는, 예를 들면 프로테인 A칼럼, 프로테인 G칼럼을 들 수 있다. 프로테인 A칼럼에 사용하는 담체로서는, 예를 들면 Hyper D, POROS, Sepharose F.F. 등을 들 수 있다. 기타, 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 좋고, 하등 한정하는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 어피니티 크로마토그라피 이외의 크로마토그라피, 필타, 한외여과, 염석, 투석 등을 적당히 선택, 조합하면 본 발명에서 사용되는 항체를 분리, 정제할 수 있다. 크로마토그라피로서는, 예를 들면 이온교환 크로마토그라피, 소수성 크로마토그라피, 겔여과 등을 들 수가 있다. 이들의 크로마토그라피는 HPLC(High performance liquid chromatography)에 적용하여 얻는다. 또, 역상 HPLC를 사용해도 좋다.
이와 같이해서 얻어진 항체의 농도측정은 흡광도의 측정 또는 ELISA 등에 의해 행할 수 있다. 즉, 흡광도의 측정에 의한 경우에는, PBS(-)로 적당히 희석한 후, 280nm의 흡광도를 측정하여, 1mg/㎖를 1.35OD로 해서 산출한다. 또, ELISA에의한 경우는 이하와 같이 측정할 수 있다. 즉, 0.1M 중탄산염 완충액(pH9.6)에서 1㎍/㎖로 희석한 염소항인간 IgG(TAGO제) 100㎕를 96웰 플레이트(Nunc제)에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 배양하여 항체를 고상화한다. 블로킹 후, 적당히 희석한 본 발명에서 사용되는 항체 또는 항체를 함유하는 샘플, 또는 표품(標品)으로서 인간IgG(CAPPEL 제) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 배양한다.
세정 후, 5000배로 희석한 알카리포스파타제표지 항인간IgG(BIO SOURCE제) 100㎕을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양한다. 세정 후, 기질용액을 첨가해 배양한 후, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad 제)을 사용해서 405nm에서 흡광도를 측정하여 목적하는 항체의 농도를 산출한다.
본 발명에서 사용되는 IL-6개변체는, IL-6 수용체와의 결합활성을 갖고, 또한 IL-6의 생물학적활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 개변체는 IL-6 수용체에 대해서 IL-6와 경합적으로 결합하지만, IL-6의 생물학적활성을 전달하지 않기 때문에, IL-6에 의한 시그날 전달을 차단한다.
IL-6 개변체는, IL-6의 아미노산 서열의 아미노산 잔기를 치환함으로써 변이를 도입해서 제조된다. IL-6 개변체의 기초로 되는 IL-6는 그의 유래를 불문하지만, 항원성 등을 고려하면, 바람직하게는 인간 IL-6이다.
구체적으로는, IL-6의 아미노산 서열을 공지의 분자 모델링 프로그램, 예를 들면 WHATIF(Vriend et al., J. Mol. Graphics(1990) 8, 52-56)를 사용해서 그의 이차구조를 예측하며, 또한 치환되는 아미노산 잔기의 전체에 미치는 영향을 평가함으로써 행해진다. 적절한 치환아미노산 잔기를 결정한 후, 인간 IL-6유전자를 코드하는 염기서열을 함유하는 벡타를 주형으로 해서, 통상 행해지는 PCR법에 의해 아미노산이 치환되도록 변이를 도입함으로써, IL-6개변체를 코드하는 유전자가 얻어진다. 이것을 필요에 따라서 적당한 발현벡타에 결합하여, 상기 재조합형 항체의 발현, 생산 및 정제방법에 따라서 IL-6개변체를 얻을 수 있다.
IL-6개변체의 구체예로서는, Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, 및 Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO96-18648, WO96-17869에 기재되어 있다.
본 발명에서 사용되는 IL-6부분 펩티드 또는 IL-6수용체 부분 펩티드는, 각각 IL-6 수용체 또는 IL-6와의 결합활성을 갖고, 또한, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6부분 펩티드 또는 IL-6수용체 부분 펩티드는 IL-6수용체 또는 IL-6에 결합하여, 이들을 포착함으로써 IL-6의 IL-6수용체로의 결합을 특이적으로 저해한다. 그 결과, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않기 때문에, IL-6에 의한 시그날 전달을 차단한다.
IL-6부분 펩티드 또는 IL-6수용체 부분 펩티드는, IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 서열에 있어서 IL-6와 IL-6수용체와의 결합에 관련되는 영역의 일부 또는 전부의 아미노산 서열로부터 되는 펩티드이다. 이와 같은 펩티드는, 통상 10~80, 바람직하기로는 20~50, 더욱 바람직하기로는 20~40개의 아미노산 잔기로부터 된다.
IL-6부분 펩티드 또는 IL-6수용체 부분 펩티드는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 서열에 있어서, IL-6와 IL-6 수용체와의 결합에 관련되는 영역을 특정하고, 그의 일부 또는 전부의 아미노산 서열을 통상 알려진 방법, 예를 들면 유전자공학적수법 또는 펩티드 합성법에 의해 제조할 수 있다.
IL-6부분 펩티드 또는 IL-6수용체 부분 펩티드를 유전자공학적수법에 의해 제조하는데는 소망의 펩티드를 코드하는 DNA서열을 발현벡타에 결합하여, 상기 재조합형 항체의 발현, 생산 및 정제방법에 따라서 얻을 수 있다.
IL-6부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드를 펩티드합성법에 의해 제작하는데는, 펩티드합성에 있어서 통상 사용되고 있는 방법, 예를 들면 고상합성법 또는 액상합성법을 사용할 수 있다.
구체적으로는, 속의약품의 개발, 제 14권 펩티드 합성, 야지마 하루아끼(矢島治明), 광천서점(廣川書店) 1991년에 기재된 방법에 따라서 행하면 좋다. 고상합성법으로서는, 예를 들면 유기용매에 불용성인 지지체에 합성하려고 하는 펩티드의 C말단에 대응하는 아미노산을 결합시켜, α-아미노기 및 측쇄관능기를 적절한 보호기로 보호한 아미노산을 C말단으로부터 N말단 방향의 순서로 1개 아미노산씩 축합시키는 반응과 수지상에 결합한 아미노산 또는 펩티드의 α-아미노기의 상기 보호기를 제거시키는 반응을 교대로 되풀이함으로써, 펩티드쇄를 신장시키는 방법이 사용된다. 고상 펩티드합성법은 사용되는 보호기의 종류에 의해 Boc법과 Fmoc법으로 대별된다.
이와 같이해서 목적하는 펩티드를 합성한 후, 탈보호반응 및 펩티드쇄의 지지체로부터 절단반응을 한다. 펩티드쇄와의 절단반응에는, Boc법에서는 불화수소 또는 트리플루오로메탄술폰산을, 또, Fmoc법에서는 TFA를 통상 사용할 수 있다. Boc법에서는, 예를 들면 불화수소 중에서 상기 보호펩티드 수지를 아니솔 존재하에서 처리한다. 이어서, 보호기의 제거와 지지체로부터의 전달을 행하여 펩티드를 회수한다. 이것을 동결건조함으로써, 조펩티드가 얻어진다. 한편, Fmoc법에서는, 예를 들면 TFA 중에서 상기한 것과 동일한 조작으로 탈보호반응 및 펩티드쇄의 지지체로부터 절단반응을 행할 수 있다.
얻어진 조펩티드는 HPLC에 적용함으로써 분리·정제할 수 있다. 그의 용출에 있어서, 단백질의 정제에 통상 사용되는 물-아세토니트릴계 용매를 사용해서 최적조건하에서 행하면 좋다. 얻어진 크로마토그라피의 프로파일(profile)의 피크에 해당하는 획분을 모아서, 이것을 동결건조한다. 이와 같이해서 정제한 펩티드획분에 대해서 질량분광검사법(mass spectroscopy)에 의한 분자량분석, 아미노산조성분석 또는 아미노산 서열분석 등에 의해서 동정한다.
IL-6 부분 펩티드 및 IL-6 수용체 부분 펩티드의 구체예는 특개평 2-188600, 특개평 7-324097, 특개평 8-311098 및 미국특허 제 5210075에 기재되어 있다.
본 발명에서 사용되는 IL-6안타고니스트의 IL-6시그날전달저해활성은 통상 사용되는 방법에 의해 평가할 수 있다. 구체적으로는, IL-6의존성 세포 MH60.BSF2를 배양하여, 이것에 IL-6를 첨가하고, 동시에 IL-6안타고니스트를 공존시킴으로써 IL-6의존성세포의3H-티미딘 결합을 측정하면 좋다. 또, IL-6수용체발현세포인 U266을 배양하고,125I표지IL-6을 첨가하고, 동시에 IL-6안타고니스트를 첨가함으로써 IL-6수용체발현세포에 결합한125I표지IL-6를 측정한다. 상기 분석계에 있어서, IL-6안타고니스트를 존재시키는 군 이외에, IL-6안타고니스트를 함유하지 않는 음성대조군을 두고, 양자에서 얻어진 결과를 비교하면 IL-6안타고니스트의 IL-6 저해활성을 평가할 수 있다.
본 발명의 효과를 확인하는데는, CD양성 및 CD45RB 강양성의 세포(CD4+CD45RBhigh세포)를 주입해서 염증성 장질환을 발병한 동물에 본 발명에서 사용되는 IL-6 안타고니스트를 투여하여 체중감소억제효과나 염증성 장질환 평점의 개선효과를 평가함으로써 행할 수 있다. 또, 본 발명의 다른 효과로서, 염증성 장질환에 있어서 식욕부진억제효과, 복통경감효과, 설사경감효과 또는 염증성 장질환의 재발방지효과가 있다.
IL-6안타고니스트에 의한 동물에 주입되는 CD+CD45RBhigh세포는 예를 들면 후기하는 실시예에 기재된 방법을 사용함으로써 단리할 수 있다. CD+CD45RBhigh세포가 유래하는 동물로서는, 통상 실험에 이용되는 동물이면 좋고, 예를 들면 마우스, 랫트 등을 이용할 수 있다.
하기 실시예에 기재한 바와 같이, 항IL-6 수용체항체의 투여에 의해, 염증성 장질환을 발병한 실험동물에 있어서, 체중감소의 억제 및 장질환 평점의 개선이 인정되었으므로, 항IL-6수용체항체 등의 IL-6안타고니스트는 염증성 장질환 치료효과를 갖는 것으로 나타났다.
본 발명에 있어서 치료대상은 포유동물이다. 치료대상의 포유동물은 바람직하기로는 인간이다.
본 발명의 예방 또는 치료제는, 경구적으로 또는 비경구적으로 전신 또는 국속적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 적주(滴注) 등의 정맥내주사, 근육내주사, 복강내주사, 피하주사, 좌약, 장세척, 경구성 장용제 등을 선택할 수 있다. 환자의 연령, 증상에 의해 적당히 투여방법을 선택할 수 있다. 유효투여량은 1회에 체중 1㎏당 0.01~100mg의 범위에서 선택된다. 또는, 환자당 1~100mg, 바람직하기로는 5~50mg의 투여량을 선택할 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료제는, 투여경로에 따라서 약학적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 함유하는 것이어도 좋다. 이와 같은 담체 및 첨가물의 예로서, 물, 약학적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐 폴리머, 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 크산탄검, 아라비아고무, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 와셀린, 파라핀, 스테아릴알콜, 스테아르산, 인간혈청알부민 (HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토스, 의약첨가물로서 허용되는 계면활성제 등을 들 수 있다. 사용되는 첨가물은, 제형에 따라서 상기한 것 중에서 적당히 선택하든지 또는 조합해서 선택하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 치료대상질환은 염증성 장질환이다. 염증성 장질환에는 궤양성 대장염과 크론병이 포함된다. 이들의 질환은 어느 것도 주로 20세 전후의 젊은 사람에게 발병하는 만성질환이고, 아직도 그의 원인이 되는 항원, 염증병태의 메카니즘은 거의 해명되지 않고 있다. 그러나. 이것을 해명하려는 연구는 세포·사이토카인 등을 가지고 집중적으로 행해지고 있다.
최근 수년 사이에 장질한을 야기하는 세포에 관한 분석이 주로 마우스계를 사용해서 진행하고 있다. 즉, 정제한 CD4 양성 CD45RB강양성세포(CD4 +CD45RBhigh)를 면역부전 마우스(SCID마우스)에 이식함으로써 만성장 질환의 병태를 유도할 수 있는 것이 명백해지고 있다(Morrissey, P. J, et al., J. Exp. Med. (1993) 178, 237-244, Leach, M, W. et al., Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515, Aronda, R. et al., J. Immunol. (1997) 158, 3464-3473).
한편, CD4양성 CD45RB약양성세포(CD+CD45RBlow)는 장질환을 야기할 수 없고, 오히려 CD4양성 CD45RB강양성세포에 의한 장질환의 유발을 억제하는 것이 나타나 있다(Powrie,F.R.et al.,J.Exp.Med.(1994)179,589-600).CD45RB발현량은 사이토카인생산패턴과 상호관련된 것이 알려져 있다. 즉, CD4양성CD45RB강양성세포는, IFN-r, TNFα등을 생산하는 1형 헬퍼세포(Th1)와 같은 것인데 대해서, CD4양성 CD45RB약양성세포는 IL-4, IL-10등을 생산하는 2형 헬퍼세포(Th2)같은 것으로 생각되고 있다(Lee, W. et al., J. Immurol. (1990) 144, 3288-3295).
따라서, IBD의 발병은 TH1과 Th2와의 밸런스가 붕괴되는 것과 관계하고 있을 가능성이 높은 것으로 생각되지만, 이것은 Th1기능을 억제하는 IL-10 유전자를 유전자 타게팅법(gene targeting method)에 의해 결손시킨 마우스에 있어서, 인간 궤양성 대장염에 유사한 만성 장염이 발생하는 사실로부터도 인정된다(Kuhn, R. et al., Cell (1993) 75, 263-274).
본 발명의 실시예에서 사용된 모델동물은, 대장의 조직학적 특징이 궤양성대장염 및 크론병환자와 대단히 유사하다(Leach, M. W. et al., Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515). 궤양성 대장염은, 직장으로부터 연속성으로 광역에 병변이 보여지는 것이 많고, 점막상피가 특이적으로 장해된다. 본 발명의 모델에서는, 장해되는 부위가 주로 대장에 국한하는 것이지만 넓은 범위에 미치는 것, 음와(陰窩)가 신장하는 것이 임상병태와 유사하다.
한편, 크론병은 구강으로 부터 항문까지 소화관의 어느 곳에서도 산재성으로 발생하여 점막에 국한하지 않은 전층성 염증이다. 또, 조직학적으로는 비건낙성육아종염증소(非乾酪性肉芽腫炎症巢)를 특징으로하고 있다. 본 발명의 모델에서는, 점막층에 국한하지 않는 염증이 발견되고, 마크로파지, 임파구, 다핵거세포 등이 집적하는 것, 종종 육아종 형태를 취하는 것, 음와 농상이 거의 발견되지 않는 것 등은 크론병과 유사하다.
이와 같이, 궤양성 대장염과 크론병의 특징이 혼재하는 증상의 예는 이제까지도 임상에서 보고되어 있다(Tanaka, M. et al., Hepato gastroenterology (1990) 37, 18-31). 또, 염증성 장질환에 있어서는 상피세포에 있어서 주요조직적합성항원 classⅡ의 발현증진이 발견되지만(Trejdosiewicz, L. K. et al., Dig. Dis. Sci. (1989) 34, 1449-1456), 본 발명의 모델에 있어서도 동일하다. 또한, 본 발명의 모델에 있어서는 상피조직의 비대가 특징적으로 나타나지만, 이 것은 궤양성대장염의 환자에서 발견되는 세포증식의 증진(Serafini, E. P. et al., Gut (1981) 22, 648-652)과 관계하고 있는 것으로 생각되어 진다.
본 발명의 모델에서는 임상에서의 염증성 장질환과 유사성이 높고, 중증시에는 체중감소를 일으킨다. 본 발명의 모델을 사용한 실험에 의해, 조직학적으로 장해가 현저하게 경감되고, 체중감소가 인정되지 않은 것은, IL6안타고니스트가 궤양성 대장염 또는 크론병 등의 염증성 장질환에 대해 치료효과를 발휘하는 것을 나타내는 것이다.
이하, 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
BALB/c계 숫컷 마우스로부터 비장을 무균적으로 채취하여, 이 것을 균질화한 후, 좋게 피페팅(pipetting)해서 단세포현탁액으로 했다. 다음에 적혈구를 제거하기 위해, 세포 필렛(Cell pellet)을 용해용액(lysis solution, 0.16M NH4cl과 pH7.2의 0.17M Tris완충액을 9:1의 비율로 혼합한 것)으로 처리하고, 또한 인산완충식염수로 2회 세정하여 마우스 비장세포를 얻었다.
세정한 마우스 비장세포를 2% FCS첨가 RPMI 1640배지에 현탁해서 세포수를 계측한 후, 1.1×108/㎖로 조제했다. 이 것에 항마우스 CD4항체(L3T4 Microbeads, Miltenyi Biotech사제)를 1/9용적 첨가하고, 빙온하에서 15분간 세포에 결합시켰다(세포밀도 1×108/㎖). 또한, Mini MACS separation system(Miltenyi Biotech사제)을 사용한 칼럼조작에 의해, CD4양성세포획분을 모았다. 세포수 계측 후, 2%FCS첨가 인산완충식염수에 현탁하고, 세포밀도를 4×107/㎖로 조정했다.
CD4양성세포현탁액에 1/100용적의 PE표지 랫트항마우스 CD4(L3T4)항체 (0.2 ㎎/㎖, clone RM4-5, Pharmingen사제)와 1/100용적의 FITC표지 랫트항마우스 CD45RB항체(0.5㎎/㎖, clone 16A, Pharmingen사제)를 첨가했다. 이것을 20분간 빙온하에서 방치함으로써 항체를 결합시켰다. 표지한 세포는, 2% FCS첨가 RPMI1640배지를 첨가해서 원심분리해서 세정하고, 2%FCS첨가 인산완충식염수에 현탁한 즉시, 냉암소에 보존했다.
표지한 CD4양성세포로부터 CD4 양성 및 CD45RB강양성의 세포군(CD4+CD45RBhigh)을 플로우 사이토미터(flow cytometer, FACS Vantage, Becton Dickenson사제)를 사용해서 모았다. 이 세포군은, CD4, CD45RB 양양성세포 중, CD45RB 발현량이 많은 상위 약 50%에 상당한다. 얻어진 세포는 원심분리 후, 4×106/㎖가 되도록 인산완충식염수에 현탁했다. 세포의 순도는 CD45RB강양성세포로서 97%이고, 그의 생존율은 98%이였다.
고도로 정제한 이 세포군을 4×105개씩 (4×106/㎖를 100㎕씩), C.B-17 scid 마우스의 복강내에 이식함으로써 염증성 장질환 모델을 제조했다(Leach, M. W. et al., Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515, Aranda, R. et al., J. Immunol. (1997) 158, 3464-3473). 실험은 처리방법에 따라 이하의 3군으로 수행했다. (1) 세포이식·항IL-6수용체항체비투여군, 마우스 5마리, (2) 세포이식·항IL-6수용체항체투여군, 마우스 3마리, (3) 세포비이식군, 마우스 3마리.
항IL-6수용체항체 MR16-1의 투여는 이하와 같이 행하였다. 우선, 인산완충식염수로 20㎎/㎖로 조정한 것을 마우스 한 마리 당 100㎕씩, 상기 세포를 이식하고 15~30분 전에 복강내 투여했다. 1주간 후, 인산완충식염수로 10㎎/㎖로 조정한 것을 마우스 1마리당 100㎕씩 복강내 투여하고, 이것을 1주일마다 되풀이해서 8주간까지 계속했다. 항체비투여군에 대해서는 인산완충식염수를 동일한 방법으로 투여했다.
세포이식 후, 8~9주간 후에 마우스의 체중을 측정한 후, 대장조직(하행결장부분)을 채취하여, OCT compound에 담가서 -80℃에서 냉각하여 동결시켰다. 이것을 저온조(cryostat)를 사용해서, 6㎛의 동결절편을 제작한 후, 10%포르말린액으로 고정했다. 고정한 조직절편은 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)법에 의해 중염색을 행하여 조직학적으로 해석했다.
약효의 평가는, 세포이식에 의해 염증성 장질환을 야기하기 전과 세포이식 후 8~9주간후의 체중변화(전자에 대한 비율로 표시) 및 조직학적해석에 의해 행하였다. 조직학적해석에서는, 각 마우스 조직에 대해서, 이하 4단계의 염증성 장질환 평점(이하, 장질환평점이라고도 함)으로 뷴류하는 것으로 평가했다(Ito, H. et al., J. Autoimmunity (1997) 10, 455-459).
염증성 장질환 평점
Grade 0(없음) : 정상의 BALB/c 마우스와 판별불능.
Grade 1(최소) : 약간의 상피조직비대가 보여진다.
Grade 2(중간) : Grade 1과 3의 중간.
Grade 3(심함) : 광범위에서의 염증성 침윤과 배세포(杯細胞)의 결손을 수반한 현저한 상피조직의 비대가 보여진다.
체중변화와 염증성 장질환 평점의 결과를 다음의 표1에 나타냈다. CD4양성 CD45RB강양성세포를 이식한 마우스는, 염증성 장질환을 발병하여, 조직학적으로도 현저한 염증상이 인정되었다. 또, 발병에 따라서 쇠약하여, 체중은 평균 11%감소했다. 한편, 항IL-6 수용체항체를 투여한 군에서는, 통계학적으로 상당한 체중감소의 억제가 관찰되고, 세포이식 전과 같은 정도의 체중을 유지했다. 또, 조직학적인 염증성 장질환 평점으로부터도 염증성 장질환이 경감되어 있는 것이 명백해졌다.
또한, 체중변화의 검정에는, 최초에 ANOVA법(Analysis of variance, SPSS for windows ver.6, SPSS Inc.)을 실시해서 중요성을 확인한 후, 본페로니법(Bonferroni method)에 의한 다중비교를 행한 결과, 위험율 5%이하로 중요성이 인정되었다.
이 모델은 인간의 염증성 장질환과 유사성이 높고, 따라서 항 IL-6 수용체항체가 궤양성 대장염 또는 크론병 등의 염증성 장질환의 예방 또는 치료제로서 유효한 것이 명백해졌다.
항 IL-6수용체 항체에 의한 체중감소와 장질환악화의 억제
이식세포 처리 마리수 체중변화(%) 장질환 평점
CD4+CD45RBhigh 인산완충식염수 5 88.8 ±6.7 2.4
CD4+CD45RBhigh 항IL-6수용체항체 3 100.9 ±4.5 1.0
없음 인산완충식염수 3 107.7 ±0.9 0.3
체중변화는 군의 평균치 ± 표준편차로 표기했다.
장질환 평점은 군의 평균치로 표기했다.
참고예 1. 인간 가용성 IL-6 수용체의 제조
야마사끼 등의 방법(Yamasaki, K. et al., Science(1988)241, 825-828)에 따라 얻어진 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pBSF2R.236을 사용해서, PCR법에 의해 가용성 IL-6수용체를 제조했다. 플라스미드 pBSF2R.236을 제한효소 SphI로 소화해서 IL-6수용체 cDNA를 얻고, 이것을 mp18(Amersham제)에 삽입했다. IL-6수용체 cDNA에 스톱코돈(stop codon)을 도입하도록 설계한 합성 올리고 프라이머(oligo primer)를 사용해서, 인비트로 변이유발 시스템(in vitro mutagenesis system, Amersham제)에 의해, PCR법으로 IL-6수용체 cDNA에 변이를 도입했다. 이 조작에 의해 스톱 코돈이 아미노산 345의 위치에 도입되어 가용성 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA가 얻어졌다.
가용성 IL-6 수용체 cDNA를 CHO세포에서 발현시키기 위하여, 플라스미드 pSV(Pharmacia 제)와 연결시켜, 플라스미드 pSVL344를 얻었다. dhfr의 cDNA를 함유하는 플라스미드 pECE dhfr에 HindⅢ-Sal I로 절단한 가용성 IL-6수용체 cDNA를 삽입하여, CHO 세포발현 플라스미드 pECEdh-fr344를 얻었다.
10㎍의 플라스미드 pECEdhfr344를 dhfr-CHO세포주 DXB-11(Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)로 인산칼슘침강법(Chen, C. et al., Mol. Cell. Biol.(1987) 7. 2745-2751)에 의해, 형질감염했다. 형질감염한 CHO세포를 1mM글루타민, 10%투석 FCS, 100U/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유하는 뉴클레오티드가 없는 αMEM선택배양액으로 3주간 배양했다.
선택된 CHO세포를 한계희석법으로 스크리닝하여 단일의 CHO세포 클론을 얻었다. 이 CHO세포 클론을 20mM-200mM의 농도의 메토트렉세이트(methotrexate)로 증폭하여 인간 가용성 IL-6수용체 생산 CHO 세포주 5E27을 얻었다. CHO세포주 5E27을 5% FBS 를 함유하는 이소코브 개변 둘베코 배양액(Iscov-modified Dulbeccos medium, IMDM, Gibco제)에서 배양했다. 배양상징액을 회수하여, 배양상징액 중의 가용성 IL-6수용체의 농도를 ELISA로 측정했다. 그 결과, 배양상징액 중에는 가용성 IL-6 수용체가 존재하는 것이 확인되었다.
참고예 2. 항인간 IL-6항체의 제조
10㎍의 재조합형 IL-6(Hirano, T.et al., Immunol. Lett., 17: 41,1988)을 프로인드 완전 보조약과 함께 BALB/c마우스를 면역하고, 혈청 중에 항 IL-6항체가 검출될 때까지 1주간 마다 이 것을 계속했다. 국부의 임파절로부터 면역세포를 적출하여 폴리에틸렌글리콜 1500을 사용해서 미엘로마 세포주 P3U1과 융합했다. 하이브리도마를 HAT배양액을 사용하는 Oi 등의 방법(Selective Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980)에 따라서 선택하여, 항인간 IL-6항체를 생산하는 하이브리도마를 수립했다.
항인간 IL-6 항체를 생산하는 하이브리도마는 하기와 같이해서 IL-6결합분석을 행했다. 즉, 유연한 폴리비닐제의 96웰 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate, Dynatech Laboratories, Inc. 제, Alexandria, VA)를 0.1M의 탄산수소탄산염 완충액 (pH9.6)중에서 100㎕의 염소항마우스 Ig(10㎕/㎖. Cooper Biomedical, Inc. 제. Malvern, PA)에 의해 4℃에서 하룻밤 동안 코팅했다. 이어서,상기 플레이트를 100㎕의 1% 소혈청알부민(BSA)를 함유하는 PBS에 의해 실온에서 2시간 동안 처리했다.
이것을 PBS로 세정한 후, 100㎕의 하이브리도마 배양상징액을 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 배양시켰다. 상기 플레이트를 세정하고, 2000cpm/0.5ng/well이 되도록125I표지 재조합형 IL-6를 각 웰에 첨가하고, 세정한 후 각 웰의 방사능을 감마 카운터(Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA)로 측정했다. 216 하이브리도마 클론 중 32의 하이브리도마 클론이 IL-6 결합분석에 의해 양성이였다. 이들의 클론 중에서 최종적으로 안정한 MH166.BSF2가 얻어졌다. 이 하이브리도마가 생산하는 항IL-6항체MH166은 IgG1k형의 서브타입을 갖는다.
다음에, IL-6 의존성 마우스 하이브리도마 클론 MH60.BSF2를 사용해서 MH166 항체에 의한 하이브리도마의 증식에 관한 중화활성을 조사했다. MH60.BSF2세포를 1×104/200㎕/웰이 되도록 분배하고, 이것에 MH166 항체를 함유하는 샘플을 첨가해 48시간 배양하고, 0.5μCi/웰의3H티미딘(New England Nuclear, Boston, MA)을 첨가한 후, 또 6시간 동안 배양을 계속했다. 세포를 글라스 필터 페이퍼상에 놓고, 자동 하비스터(automatic harvester, Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan)로 처리했다. 대조물로서, 토끼항IL-6항체를 사용했다.
그 결과, MH166항체를 IL-6에 의해 유도되는 MH60.BSF2세포의3H티미딘의 결합을 용량의존적으로 저해했다. 이것에 의해, MH166항체는 IL-6의 활성을 중화하는 것이 명백해졌다.
참고예 3. 항인간IL-6수용체 항체의 제조
히라타 등의 방법(Hirata, Y. et al., J. Immunol., 143:2900-2906, 1989)에 의해 제조한 항IL-6수용체항체 MT18을 CNBr에 의해 활성화시킨 세파로스 (Sepharose) 4B(Pharmacia Fine Chemicals제, Piscataway, NJ)와 첨부한 처방에 따라서 결합시켜, IL-6수용체(Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828)를 정제했다. 인간 미엘로마 세포주 U266을 1% 디기토닌(Wako Chemicals 제), 10mM 트리에탄올아민(pH 7.8) 및 0.15M NaCl을 함유하는 1mM p-파라-아미노페닐메탄술포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드(Wako Chemicals제)(디기토닌 완충액)로 용해시켜 세파로스 4B 비드(beads)와 결합시킨 MT18항체와 혼합했다. 그 후, 비드를 디기토닌 완충액으로 6회 세정하여, 면역하기 위한 부분정제 IL-6수용체로 했다.
BALB/c 마우스를 3×109개의 U266 세포로부터 얻은 상기 부분정제 IL-6 수용체로 10일 간격으로 4회 면역하고, 그 후 통상의 방법에 이해 하이브리도마를 제조했다. 성장양성웰(growth-positive well)로부터 하이브리도마 배양상징액을 하기의방법으로 IL-6 수용체로의 결합활성을 조사했다. 5×107개의 U266 세포를35S-메티오닌(2.5mCi)으로 표지하고, 상기 디기토닌 완충액으로 용해시켰다. 용해시킨 U266세포를 0.04㎖ 용량의 세파로스 4B 비드와 결합시킨 MT18 항체와 혼합하고, 그 후, 디기토닌 완충액으로 6회 세정하고, 0.25㎖의 디기토닌 완충액(pH3.4)에 의해35S-메티오닌표지 IL-6 수용체를 유출시키고, 0.025㎖의 1M Tris(pH7.4)로 중화했다.
하이브리도마 배양상징액 0.05㎖를 프로테인 G 세파로스(Pharmacia 제) 0.01㎖와 혼합했다. 세정한 후, 세파로스를 위에서 제조한35S표지IL-6 수용체 용액 0.005㎖와 함께 배양했다. 면역침강물질을 SDS-PAGE로 분석하여 IL-6 수용체와 반응하는 하이브리도마 배양상징액을 조사했다. 그 결과, 반응 양성 하이브리도마 클론 PM-1을 수립했다. 하이브리도마 PM-1로부터 생산되는 항체는 IgG1k형의 서브타입을 갖는다.
하이브리도마 PM-1로부터 생산하는 항체의 인간IL-6수용체에 대한 IL-6의 결합저해활성을 인간 미엘로마 세포주 U266을 사용해서 조사했다. 인간 재조합형 IL-6을 대장균으로부터 제조하고(Hirano, T. et al., Immunol. Lett. (1988) 17, 41-45), 볼톤-헌터 시약(Bolton-Hunter reagent, New England Nuclear, Boston, MA)에 의해125I 표지했다.(Taga, T. et al, J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981), 4×105개의 U266 세포를 1시간, 70%(v/v)의 하이브리도마 PM-1의 배양상징액 및 14000cpm의125I표지 IL-6와 함께 배양했디. 샘플 70㎕를 400㎕의 마이크로퓨즈 폴리에틸렌 튜브중의 300㎕의 FCS상에 층을 이루게하고, 원심분리시킨 후, 세포상의 방사능을 측정했다.
그 결과, 하이브리도마 PM-1이 생산하는 항체는 IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해하는 것이 명백해졌다.
참고예 4. 항마우스IL-6 수용체 항체의 제조
사이토 등의 방법(Saito, T. et al., J. Immunol. (1991) 147, 168-173)에 의해 마우스IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체를 제조했다.
마우스 가용성 IL-6 수용체를 생산하는 CHO세포를 10% FCS를 함유하는 IMDM 배양액으로 배양하고, 이 배양상징액으로부터 항마우스IL-6 수용체항체 RS12(상기 Saito, T. et al. 참조)를 Affigel 10겔(Biorad 제)에 고정한 어피니티 칼럼 (affinity column)을 사용해서 마우스 가용성 IL-6수용체를 정제했다.
얻어진 마우스 가용성 IL-6 수용체 50㎍을 프로인드완전보조약과 혼합하여 위스타 래트(Wistar rats)의 복부에 주사했다. 2주간 후 부터는 프로인드완전보조약으로 추가 면역했다. 45일째에 상기 랫트 비장세포를 채취하여, 2×108개를 1×107개의 마우스 미엘로마세포 P3U1과 50%의 PEG 1500(Boehringer Manheim 제)을 사용해서 통상의 방법에 의해 세포융합시킨 후, HAT 배지에 의해 하이브리도마를 스크리닝했다.
토끼항랫트IgG항체(Cappel 제)를 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양상징액을 첨가한 후, 마우스가용성 IL-6수용체를 반응시켰다. 이어서, 토끼항마우스IL-6수용체항체 및 알카리포스파타제표지 양항토끼 IgG에 의한 ELISA법에 의해 마우스가용성 IL-6수용체에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝했다. 항체의 생산이 확인된 하이브리도마 클론은 2회의 서브스크리닝을 행하여, 단일의 하이브리도마 클론을 얻었다. 이 클론을, MR16-1로 명명했다.
이 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 마우스 IL-6의 정보전달에 있어서 중화활성을 MH60·BSF2세포를 사용해서3H-티미딘 결합으로 조사했다(Matsuda, T. et al., J. Immunol. (1988) 18, 951-956). 96웰 플레이트에 MH60·BSF2 세포를 1×104개/200㎕/웰이 되도록 조제했다. 이 플레이트에 10pg/㎖의 마우스 IL-6와 MR16-1 항체 또는 RS12항체를 12.3-1000ng/㎖ 첨가해서 37℃, 5% CO2에서 44시간 배양한 후, 1μCi/웰의3H티미딘을 첨가했다. 4시간 후에3H티미딘의 결합을 측정했다. 그 결과, MR16-1 항체는 MH60·BSF2 세포의3H-티미딘 결합을 억제했다.
따라서, 하이브리도마 MR16-1이 생산하는 항체는 IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해하는 것이 명백해졌다.
본 발명에 의해, 항IL-6수용체항체 등의 IL-6 안타고니스트가 염증성 장질환의 치료효과를 갖는 것으로 나타났다. 따라서, IL-6 안타고니스트는 크론병 또는 궤양성 대장염 등의 치료제로서 유용한 것이 명백해졌다.

Claims (39)

  1. IL-6 수용체에 대한 항체를 유효성분으로서 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제.
  2. 삭제
  3. 제 2항에 있어서, IL-6수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 예방 또는 치료제.
  4. 제 3항에 있어서, IL-6수용체에 대한 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 예방 또는 치료제.
  5. 제 3항에 있어서, IL-6수용체에 대한 항체가 마우스IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 예방 또는 치료제.
  6. 제 2항 내지 5항 중 어느 하나의 항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 항체가 재조합형 항체인 예방 또는 치료제.
  7. 제 4항에 있어서, 인간IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체가 PM-1 항체인 예방 또는 치료제.
  8. 제 5항에 있어서, 마우스IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체가 MR16-1 항체인 예방 또는 치료제.
  9. 제 2항 내지 4항 중 어느 하나의 항에 있어서, IL-6수용체에 대한 항체가 IL-6수용체에 대한 키메라항체 또는 인간형화 항체인 예방 또는 치료제.
  10. 제 9항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체가 인간형화 PM-1 항체인 예방 또는 치료제.
  11. 제 1항에 있어서, 염증성 장질환이 크론병 또는 궤양성 대장염인 예방 또는 치료제.
  12. 염증성 장질환에서의 IL-6 수용체에 대한 항체를 유효성분으로 함유하는 체중감소억제제.
  13. 삭제
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