CN104349787B

CN104349787B - 含有荔枝草提取物或其馏分作为活性成分的预防或治疗stat-3介导疾病的药物组合物

Info

Publication number: CN104349787B
Application number: CN201380028657.2A
Authority: CN
Inventors: 鲁文喆; 吴炫美; 李雨松; 金相泫; 李胜雄; 朴灿善; 安极炫
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 2012-05-21
Filing date: 2013-05-21
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2033-05-21
Also published as: JP2015518861A; US20150174186A1; EP2878305B1; CN104349787A; EP2878305A4; WO2013176471A1; KR20130129868A; EP2878305A1; JP6117915B2; KR101487935B1

Abstract

本发明涉及一种预防或治疗STAT3‑介导疾病的药物组合物，其含有荔枝草提取物或其馏分作为活性成分，还涉及一种治疗STAT3‑介导疾病的方法，包括将所述组合物注射入疑似患有STAT3介导疾病的个体的步骤。此外，本发明涉及一种预防或改善STAT3‑介导疾病的食品组合物和准药品组合物，其含有荔枝草提取物或其馏分作为活性成分。

Description

含有荔枝草提取物或其馏分作为活性成分的预防或治疗 STAT-3介导疾病的药物组合物

技术领域

总的来说，本发明涉及一种预防或治疗信号传导与转录激活因子3(在此及下文中作“STAT3”)介导疾病的药物组合物，其含有荔枝草(Salvia plebeia R.Br.)提取物或其馏分(fraction)作为活性成分，以及涉及一种治疗STAT3介导疾病的方法，包括向疑似患有STAT3介导疾病的个体施用所述的组合物。此外，本发明涉及一种预防或改善STAT3介导疾病的食物组合物和准药品组合物(quasi-drug composition)，其含有荔枝草提取物或其馏分作为活性成分。

背景技术

通常，白介素-6(IL-6)是一种细胞因子，也被称为B细胞刺激因子(BSF2)或干扰素-2(INF-2)，其被发现是一种参与B淋巴细胞激活的分化因子。自此以后，IL-6被认为是一种能够影响多种细胞功能的多功能细胞因子。IL-6传递其经由细胞膜上两种不同蛋白介导的生物活性。其中一种蛋白作为IL-6的受体，其是一种穿膜表达的膜结合蛋白，分子量约为80kDa，而另一种蛋白则是膜蛋白gp130，其分子量约为130kDa，其参与非配体结合IL-6和IL-6受体共同形成的IL-6/IL6受体复合物(而后结合于gp130)的信号传导。配体和受体结合后，Janus激酶2(JAK2)经转磷酸化激活。激活的JAK2使受体胞浆区结构域中的多个酪氨酸残基磷酸化，并导致它们作为具有磷酸酪氨酸结合基序的胞内蛋白(如SH2或STAT3)的锚定位点。JAK2使得受体磷酸化后，与给定受体的胞浆区结构域结合的STAT3从该受体释放。如此激活的STAT3彼此结合形成同源二聚体或异源二聚体，进入细胞核，并结合于靶基因的识别序列，从而提高转录。

IL-6诱导的信号转导系统已知与炎症性疾病、自身免疫性疾病以及代谢性疾病相关。人们对抑制IL-6诱导的信号转导系统进行了积极研究，用于治疗炎症性疾病、自身免疫性疾病等。其中，采用抗IL-6受体抗体(IL-6R抗体)来抑制IL-6诱导的信号转导系统最为广为人知。例如，已知有用于治疗类风湿性关节炎的滑膜细胞生长抑制剂，其采用了IL-6R抗体(WO公开号96/011020)，以及采用抗IL-6R抗体的用于治疗IL-6产物诱导的浆细胞增多症、高免疫球蛋白血症、贫血、肾炎、恶病质、类风湿性关节炎、人畜共患病(livestock-farmer disease)以及系膜增生性肾炎(WO公开号96/012503)。此外，有报道称抗IL-6R抗体适用于治疗多发性硬化、葡萄膜炎、慢性甲状腺炎和敏感性T细胞相关疾病例如迟发型超敏反应和特应性皮炎(WO公开号98/042377)、治疗系统性红斑狼疮、治疗克罗恩氏病(WO公开号99/047170)、治疗胰腺炎(WO公开号00/010607)、治疗银屑病(WO公开号02/034292)，以及治疗青少年慢性关节炎(WO公开号02/080969)。然而，当将抗IL-R抗体引入机体时，由于其可能具有表位，因此可能被机体识别为外来蛋白从而使其仍具有免疫原性。因此，为了解决以上问题，进行了大量的研究，利用不会被免疫系统识别的小分子化合物，而非蛋白来开发IL-6和STAT3介导的治疗药物。

此外，白介素11(IL-11)是属于IL-6家族的促炎细胞因子，其具有与IL-6类似的信号转导系统，已知能够提高其在造血细胞、免疫反应细胞、炎症细胞和多种癌细胞中的表达。最近，有报道称IL-11与其受体IL-R和gp130结合，从而促进了胃癌细胞和直肠癌细胞的增殖以及癌细胞侵袭(Nakayama T等.,Int J Oncol,2007,30,825-833；Yoshizaki A等.,Int J Oncol,2006,29,869-876)，而当IL-11/STAT3信号激活smad7并且同时阻断TGF信号诱导的smad激活剂，就会使与抗凋亡基因、促血管生成基因或增殖基因相关的致癌程序激活。此外，IL-11参与了骨细胞的增殖和分化调控，并已知作为骨质疏松的治疗靶点(SimsNA等.,J Bone Miner Res.2005年7月；20(7):1093-102.)。基于以上的报道，经由IL-11的gp130/JAK/STA3通路成为了一个治疗多种疾病(包括骨质疏松症)的新靶点。

公开内容

技术问题

在致力于寻找一种靶向IL-6或IL-11激活的STAT3途径的天然物质之时，本发明的发明人发现荔枝草的提取物或其馏分能够抑制STAT3的转录活性和磷酸化，其中，STAT3是与IL-6激活的炎症和自身免疫性疾病相关的转录因子。其也有效地抑制了IL-6诱导的信号转导通路，从而完成了涉及预防或治疗STAT3-介导疾病的本发明药物组合物，所述的药物组合物含有荔枝草提取物或其馏分作为活性成分。

技术方案

本发明的一个目的在于提供一种用于预防或治疗STAT3-介导疾病的药物组合物，所述的药物组合物含有荔枝草提取物或馏分作为活性成分。

本发明的另一目的在于提供一种治疗STAT3-介导疾病的方法，包括向疑似患有一种或多种STAT3-介导疾病的对象施用上述的药物组合物。

本发明的另一目的在于提供一种用于预防或改善STAT3-介导疾病的食品组合物，所述的食品组合物含有荔枝草提取物或馏分作为活性成分。

本发明的又一目的在于提供一种用于预防或改善STAT3-介导疾病的准药品组合物，所述的类药组合物含有荔枝草提取物或馏分作为活性成分。

有益效果

本发明的荔枝草提取物或馏分来源于一种作为天然药物长期使用且不具有副作用的天然物质，从而使得其能够有效地抑制IL-6诱导的STAT3信号转导系统。因此，其可用于预防或治疗STAT3-介导疾病，例如，炎症性疾病、自身免疫性疾病，和代谢性疾病。

附图说明

图1显示了荔枝草乙醇提取物以及荔枝草乙酸乙酯馏分对IL-6诱导的荧光素酶表达的抑制效果。

图2显示了荔枝草乙醇提取物对IL-6诱导的STAT磷酸化的抑制效果。

图3显示了荔枝草乙酸乙酯馏分对IL-6诱导的STAT磷酸化的抑制效果。

图4显示了荔枝草乙醇提取物和荔枝草乙酸乙酯馏分对IL-6诱导的JAK2和ERK磷酸化的抑制效果。

图5显示了荔枝草乙醇提取物和荔枝草乙酸乙酯馏分对STAT3诱导的SOCS-3mRNA表达的抑制效果。

图6显示了荔枝草乙醇提取物对STAT3诱导的MCP-1mRNA表达的抑制效果。

图7显示了荔枝草乙醇提取物对STAT3诱导的ICAM-1mRNA表达的抑制效果。

图8显示了类风湿性关节炎小鼠模型的构建流程，其用于确定荔枝草乙醇提取物的效果。

图9显示了施用荔枝草乙醇提取物能够降低类风湿性关节炎诱导小鼠的肢端厚度水平。

图10显示了施用荔枝草乙醇提取物减轻类风湿性关节炎诱导小鼠的关节炎严重程度。

图11显示了施用荔枝草乙醇提取物降低类风湿性关节炎诱导小鼠的关节炎复发率。

图12显示了施用荔枝草乙醇提取物降低类风湿性关节炎诱导小鼠血中免疫球蛋白G1的水平。

图13显示了施用荔枝草乙醇提取物降低类风湿性关节炎诱导小鼠血中免疫球蛋白G2a的水平。

图14显示了构建特应性皮炎小鼠模型的流程。

图15证实荔枝草乙醇提取物降低了特应性皮炎诱导小鼠的耳部厚度，其中AD代表特应性皮炎，MEBC代表荔枝草提取物。

图16证实荔枝草乙醇提取物抑制了特应性皮炎诱导小鼠的血免疫球蛋白E水平。

图17证实荔枝草乙醇提取物抑制了特应性皮炎诱导小鼠的血免疫球蛋白G2a水平。

图18显示了荔枝草乙醇提取物抑制了特应性皮炎诱导小鼠的血组胺水平。

图19显示了荔枝草乙醇提取物抑制了特应性皮炎诱导小鼠的促炎细胞因子的分泌，其中AD代表特应性皮炎，MEBC代表荔枝草提取物。

最佳实施方式

本发明的一个方面，提供了一种预防或治疗STAT-3介导疾病的药物组合物，其含有荔枝草提取物或其馏分作为活性成分。

如本文所用，术语“荔枝草”(Salvia plebeia R.Br.)指唇形科属(LamiaceaeFamily)、唇形目(Lamiales Order)的一种二年生双子叶植物，也称为罗勒稷(Ocimumvirgatum)。形态学上，其具直立柱状茎并覆有平整的短毛，卵圆形或矛尖形叶片，末端钝圆或边缘锐利，基底部呈圆形或楔形。从药理学方面来说，已知荔枝草对治疗咯血、呕血、血尿、腹水、角膜云翳等，但与治疗STAT3-介导疾病的相关性还未所知。此外，荔枝草可购自商业市场，也可采用自耕种地采摘的荔枝草。

如本文所用，术语“荔枝草提取物”指自荔枝草提取的提取物。可通过加入约2-20倍、优选约3-5倍体积的水、极性溶剂如C1-C6的醇(如甲醇、乙醇、丁醇)，或按约1:0.1-1:10(相对于粉碎荔枝草的干重)比例的混合溶剂，在20℃-100℃(优选室温)的提取温度，约12小时-4天(优选3天)的提取周期，经热水提取、冷提取、回流提取、超声处理提取等洗脱荔枝草提取物。优选地，通过1-5次连续冷提取进行提取，对所得物进行减压过滤，将所得滤液在20℃-100℃下(优选室温下)通过旋转真空蒸发器进行减压浓缩，从而获得荔枝草粗提取物，其可溶于(但不限于)水、醇或其混合溶剂。其可包括任何液体提取物、稀释或浓缩的液体提取物、将液体提取物干燥后获得的干燥产物、或粗纯化产物或纯化产物，只要它们能表现出本发明的STAT3介导疾病治疗效果。荔枝草提取物可获自天然荔枝草、荔枝草杂交品种或变异品种的多个器官，例如根、地面部分、茎、叶、花、果实主体、果皮，也包括获自荔枝草植株组织的栽培产物。

本发明的一实施例中，可采用乙醇作为洗提溶剂，通过在室温下冷提取7天，然后减压过滤，并通过旋转真空蒸发器去除乙醇溶剂，从而自粉碎的荔枝草获得荔枝草提取物。

如本文所用，术语“馏分”指的是分馏获得的产物，可以是特定组分或多种组分构成的混合物的特定组。优选地，所述的馏分可以是通过采用溶剂(如正己烷、乙酸乙酯等)对荔枝草提取物进行溶剂分馏后获得的分馏产物，包括极性馏分和非极性馏分，特别是，己烷馏分、乙酸乙酯馏分等等。较优选地，所述的馏分可以是乙酸乙酯馏分，可包括(但不限于)任何可表现出本发明的STAT-3介导疾病治疗效果的馏分。优选地，本发明的所述馏分内可不包括无法抑制STAT3荧光素酶活性的水馏分。

可通过将上述获得的荔枝草粗提取物悬浮在蒸馏水中，加入约1-100倍、优选为1-5倍体积(相对于悬浮液的体积)的非极性溶剂(例如乙酸乙酯)，然后1-10次、优选2-5次的抽提和分离而获得非极性溶剂可溶层。

此外，可进一步进行常规分馏(Harborne J.B.《植物化学方法：现代植物分析技术指南》(Phytochemical methods:A guide to modern techniques of plant analysis),第3版.第6-7页,1998)。具体地，荔枝草的各溶剂提取物均可通过将荔枝草粗提取物悬浮在水中，然后将所得物置于用作溶剂的等量乙酸乙酯中进行连续抽提而获得。更具体地，可通过将荔枝草粗提取物悬浮在水中、然后加入等量的乙酸乙酯后获得乙酸乙酯可溶性馏分和水溶性馏分。

在本发明的一实施例中，乙酸乙酯可溶性馏分可通过以下方式获得：将荔枝草粗提取物悬浮于水中，加入等量的乙酸乙酯，使其混合并分馏，重复以上过程3次，然后减压浓缩所获的乙酸乙酯可溶性馏分(实施例1)。

如本文所用，术语“STAT3-介导疾病”是指以下情况下发生疾病的总称：当白介素(IL)-6或IL-11与其受体结合从而诱导STAT3磷酸化(即，STAT3的激活)，磷酸化的STAT3向细胞核移动，然后诱导参与自身免疫性反应、炎症性疾病、或代谢性疾病发生和发展的靶基因表达。所述STAT3介导的疾病可以为(但不限于)自身免疫性疾病、炎症性疾病、或代谢性疾病。

如本文所用，术语“自身免疫性疾病”是指当病态个体对自身抗原的免疫反应成为直接或非直接的病因时的疾病总称，在本发明目的中，指的是经IL-6或IL-11激活的STAT3介导的自身免疫性疾病。所述自身免疫性疾病可以为(并不限于)特应性皮炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、哮喘、移植物抗宿主病(GVHD)、免疫缺陷综合征、系统性红斑狼疮、或多发性硬化症。由于激活的STAT3在自身免疫性疾病中起到主要的转录因子的作用，可抑制IL-6介导的STAT3激活的本发明组合物就可用于自身免疫性疾病的治疗。

如本文所用，术语“炎症性疾病”指的是伴随炎症反应作为主要症状的疾病总称，可指IL-6或IL-11激活的STAT3介导的炎症性疾病。所述的炎症性疾病包括浆细胞增多症、高免疫球蛋白血症、贫血、肾炎、恶病质、人畜共患病、系膜增生性肾炎、葡萄膜炎、慢性甲状腺炎、迟发型超敏反应、克罗恩氏病、胰腺炎、幼年特发性关节炎、糖尿病，和阿尔兹海默症。含有荔枝草提取物或其馏分的本发明药物组合物可用于治疗炎症诱导性疾病，更可用于除皮肤区域以外的身体部分来治疗STAT3介导诱发的炎症。已知IL-6作为参与多种免疫反应的细胞因子，但其在皮肤上的作用似乎不同。具体地，皮肤的宿主防御中，IL-6通过参与增强角质层而保护皮肤免受刺激或炎症，并需要其他因子例如干扰素-γ进行其他作用，从而使其与其在其它部位(例如肠道器官)中参与的免疫反应作用不同。因此，对于炎症性疾病，IL-6更可用于除皮肤以外的身体部分的炎症治疗。

如本文所用，术语“代谢性疾病”指的是由于生物体代谢紊乱造成的疾病总称，根据本发明的目的，可指IL-6或IL-11激活的STAT3介导的代谢性疾病。所述的代谢性疾病可以是(但不限于)骨质疏松、动脉硬化、或心肌梗死。骨质疏松的一个病因可能是产生过多的IL-6促进了骨质吸收。因此，可抑制IL-6介导的STAT3活性的本发明组合物可以有效治疗骨质疏松。

在本发明的一实施例中，本发明人证实，荔枝草乙醇提取物和其乙酸乙酯馏分可浓度依赖性地抑制IL-6诱导的STAT3荧光素酶活性(图1)。此外，发明人还证实荔枝草乙醇提取物和其乙酸乙酯馏分能够浓度依赖性地有效抑制Il-6诱导的STAT3第705位酪氨酸残基(Tyr⁷⁰⁵)的磷酸化(图2和3)。另外，发明人还证实了荔枝草乙醇提取物和其乙酸乙酯馏分可有效抑制介导STAT3磷酸化的JAK2的磷酸化，且荔枝草乙醇提取物可降低作为STAT3靶基因的SOCS-3、MCP-1、和ICAM-1的mRNA表达(图7)。此外，本发明证实荔枝草乙醇提取物可有效治疗II型胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠的爪部水肿、关节炎的发生等，同时，通过将荔枝草乙醇提取物与市售关节炎治疗药物酮洛芬的效果进行比较，其显示了与酮洛芬相似的治疗效果(图9、10、和11)。此外，荔枝草乙醇提取物对胶原特异性免疫球蛋白G1和G2a的产生表现出有效抑制活性(图12和13)。综上所述，本发明荔枝草提取物被证实可有效地预防或治疗典型的自身免疫性疾病，即类风湿性关节炎，并证实其可用于治疗STAT-3介导疾病，如自身免疫性疾病。

此外，本发明证实本发明荔枝草提取物对尘螨和DCNB诱发的特应性皮炎模型小鼠具有治疗作用。详细地说，荔枝草乙醇提取物有效地降低特应性皮炎诱发小鼠的耳部水肿厚度(图15)，并对特应性皮炎造成的血中免疫球蛋白E和G2a的产生显示出抑制效果(图16和17)。另外，荔枝草乙醇提取物对特应性皮炎造成的组胺释放表现出抑制效果(图18)，以及对炎性细胞因子的产生和分泌均具有抑制作用(图19)。从上述结果可见，本发明荔枝草提取物能有效预防或治疗典型的自身免疫性疾病，即特应性皮炎。因此，其可用于治疗STAT-3介导的疾病，如自身免疫性疾病。总而言之，本发明荔枝草提取物或其馏分能够抑制IL-6诱导的STAT3的活性，能够有效地用于STAT-3介导疾病的预防和治疗。

如本文所用，术语“预防”指的是与通过施用上述的组合物来抑制或延缓STAT3介导疾病相关的所有活动，“治疗”指的是与通过施用上述组合物从而改善或有益于STAT-介导疾病症状相关的所有活动。

本发明药物组合物含有本发明荔枝草提取物或其馏分，还可进一步包含药物组合物制造中常规使用的合适载体、赋形剂或稀释剂。具体地，本发明荔枝草提取物或其馏分的含量(相对于所述组合物的总质量)优选为(但不限于)0.0001-10wt％，优选地为0.001-1wt％。

上述的药物组合物可制备成选自下组的任一种制剂：片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、混悬剂、内用液体药物、乳剂、糖浆、无菌水溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂、和栓剂，可以是口服施用或其他多种胃肠外施用的制剂。可采用常规的填充剂、扩充剂、粘结剂、润湿剂、崩解剂、稀释剂例如表面活性剂、或赋形剂用于制剂。口服给药的固体制剂可包括片剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂等等。固体制剂可通过将至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、或乳糖、明胶等与至少一种化合物混合制备获得。此外，除简单的赋形剂以外，如硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂也能使用。口服施用的液体制剂可包括混悬剂、内用液体药物、乳剂、糖浆等，除简单的稀释剂例如水和液状石蜡以外，其可含有多种赋形剂，如润湿剂、甜味剂方向机、防腐剂等。胃肠外制剂的例子包括无菌水溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂、和栓剂。非水性溶剂、混悬药物可包括丙烯乙二醇、聚乙二醇、菜油例如橄榄油、可注射的酯例如油酸乙酯等。可用于栓剂的基质可包括witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂、甘油明胶等。

本发明组合物可以药学上的有效量进行施用。

如本文所用，术语“药学上的有效量”指适用于医学治疗的、具有合理获益/风险比的治疗疾病的足够量，有效剂量的水平可根据多种因素决定，包括对象类型、年龄、形变、疾病的种类和严重程度、药物的活性、药物的敏感性、施用周期、施用途径以及药物代谢时间、治疗周期、联合用药、以及其他在医药领域熟知的因素。本发明组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂联合施用，可与其他治疗剂序贯施用或同时施用，也可单剂量施用或多剂量施用。根据以上所有的因素来进行药物施用是很重要的，这样才能在剂量最小且没有任何副作用的情况下获得最大的效益，这对于本领域技术人员而言较易判断。本发明组合物优选的施用剂量可根据对象的身体状况和体重、疾病严重程度、药物类型、以及施用途径和周期来决定。然而，优选地，本发明荔枝草提取物或其馏分可以每天0.0001-100mg/kg的量来施用，更优选地为0.001-100mg/kg。可每天施用一次或分剂量几次施用。

上述组合物可通过多中途径施用于多种哺乳动物，包括大鼠、牲畜、人等等。所有合适的施用途径均可以考虑，例如口服施用、直肠或静脉施用、肌肉内施用、皮下施用、子宫内施用、脑室内注射等。

在本发明的另一方面，提供了一种治疗STAT3-介导疾病的方法，包括将上述的组合物施用于疑似患有该疾病的对象。

具体地，本发明治疗方法包括将药学上的有效量的药物组合物施用于疑似患有STAT3-介导疾病的对象。所述的对象可指哺乳动物，包括(但不限于)犬、牛、马、兔、小鼠、大鼠、鸡、或人。所述药物组合物可通过胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、以及比内途径施用，若需进行局部免疫抑制治疗，可将其通过包括病灶内施用在内的合适方法进行施用。胃肠外施用可包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹内、或皮下施用。优选的施用可包静脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、和静脉输注。所使用的药物组合物的优选的量可根据对象的身体状况和体重、疾病的严重程度、药物类型、施用途径和周期而决定，但最好通过本领域技术人员来进行决定。疑似患有STAT3-介导疾病的对象可通过施用含有荔枝草提取物或其馏分作为活性成分的本发明药物组合物而进行治疗，从而预防STAT3-介导疾病的发生和发展。所述的STAT3-介导疾病如前所释。

在本发明的另一方面，提供了一种预防或改善STAT3-介导疾病的食品组合物，其含有荔枝草提取物或其馏分作为活性成分。

所述的荔枝草提取物或其馏分如前所释。更具体地，本发明所述的荔枝草提取物或其馏分可加入食品组合物中，用于预防或改善STAT3-介导的疾病，优选地，用于预防或改善自身免疫性疾病、炎性疾病或代谢性疾病。

当本发明所述荔枝草提取物或其馏分作为食品添加剂，荔枝草提取物或其馏分可单独加入或与其他食品或食品成分联合加入，且其可根据常规方法进行使用。可适当根据所预期的使用目的来决定活性成分的混合量。

本发明食品的类型并没有特别限制。加入了荔枝草或其馏分的食品的例子包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、饼干、披萨、拉面、面条、口香糖、乳制品包括冰激凌、多种汤类、饮料、茶、饮品、酒精饮料、维生素复合物等，所有常规意义上的食品，以及用于动物饲料的食物。

此外，本发明所述食品组合物还可含有多种营养素、微生物、电解质、增味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶状增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳酸生成剂等。此外，本发明所述食品组合物可含有用于制备果汁、果汁饮料和蔬菜汁的果肉。另外，所述的食品可根据已知的制造方法，制备成片剂、颗粒剂、胶囊剂、液态溶液、丸剂等。除了含有本发明荔枝草提取物或其馏分外，食品组合物的成分没有特别的限制，其还可以含有多种常规增味剂或天然碳水化合物等。

此外，本发明所述食品组合物还可含有多种营养素、维生素、电解质、增味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶状增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳酸生成剂等。此外，本发明所述食品组合物可含有用于制备果汁、果汁饮料和蔬菜汁的果肉。这些组分可单独使用或联合使用。

本发明的另一方面，提供了一种用于预防或改善STAT3-介导疾病的准药品组合物，其含有荔枝草提取物或其馏分作为活性成分。

所述的荔枝草提取物或其馏分如前所释。更具体地，本发明所述组合物可加入准药品组合物中，用于预防或改善STAT3-介导疾病，优选用于预防或改善自身免疫性疾病、炎症性疾病或代谢性疾病。

如本文所用，“准药品”指用于治疗、缓解、处理或预防人类或动物疾病目的的任一选自织物产品、橡胶产品、或其类似物的产品；所述产品不是工具、或机械，而是对人体的作用极小的或不具有任何作用的产品或其类似物；用作消毒、虫害控制或其类似用途以预防感染性疾病的制剂，即，除工具、机械或其类似物以外的用于治疗、缓解、处理或预防人类或动物疾病目的的产品；除工具、机械或其类似物以外的用于对人类或动物结构和功能产生药理作用目的的产品。此外，上述的准药品包括皮肤外用制剂和个人卫生产品。

当本发明荔枝草提取物或其馏分作为添加剂加入准药品时，所述提取物或其馏分可单独加入或与其他准药品或其含有的组分联合使用，其可根据常规的方法进行使用。可适当根据所预期的使用目的来决定活性成分的混合量。

上述皮肤外用制剂可以优选制成(但不限于)药膏、洗剂、喷雾剂、贴剂、霜剂、粉剂、混悬剂、凝胶制剂、或以凝胶形式。个人卫生产品可优选为(但不限于)肥皂、化妆品、湿巾、卫生纸、洗发剂、护肤霜、面霜、牙膏、唇膏、香水、彩妆、粉底、腮红、睫毛膏、眼影、防晒液、头发护理产品、空气清新凝胶、或洁面凝胶。此外，本发明所述类药品组合物还可包括消毒清洗剂、沐浴露、漱口液、湿巾、洗手液、加湿器填充剂、面膜、药膏或其他过滤滤芯。

本发明详述

在此及后文中，参考以下实施例和实验例对本发明进行具体描述。然而，以下实施例和实验例仅为举例说明，本发明范围不因此受任何形式的限制。

实施例1：荔枝草提取物的制备

实施例1-1：荔枝草的制备

用水充分洗净荔枝草并阴干，用搅碎机制成粉末。向8kg的荔枝草粉末中加入50L乙醇，然后在室温下进行7天冷提取，用滤纸(Whatmann PLC,USA)进行减压过滤。将所获得的过滤提取物置于旋转真空蒸发器中，室温下去除乙醇，提取所得剩余物即为1.1kg的荔枝草粗提取物。

实施例1-2：馏分制备

为了从上述粗提取物中分离活性馏分，将荔枝草粗提取物混悬于1L水中，加入等体积的乙酸乙酯并混合进行分馏。整个过程重复三次，获得1L的水溶性馏分和3L乙酸乙酯可溶性馏分，将乙酸乙酯可溶性馏分进行减压浓缩，从而获得145g乙酸乙酯可溶性提取物。余下的水溶性馏分进行减压浓缩得35g用作水馏分。

实施例2：荔枝草提取物和其馏分对IL-6诱导的STAT3转录活性的抑制作用

为了检测荔枝草提取物和其馏分对IL-6诱导的STAT3转录活性的抑制作用，进行了如下实验：

实施例2-1：制备导入荧光素酶的转化体

采用Lipofectamine(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，将含有STAT3报告基因的pStat3-Luc和pcDNA3.1(+)(克隆技术实验室，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国)(Clontech laboratories,Palo Alto,CA,USA)转染Hep3B细胞(ATCC HB-8064)。转染后两天，用浓度为100μg/ml的潮霉素处理所转染细胞，获得稳定表达荧光素酶的克隆。克隆上稳定表达的荧光素酶由荧光素酶检测验证。

实施例2-2：对IL-6反应性STAT3荧光素酶的检测

在血清饥饿下用DMEM(GIBCO 119950965)培养基培养经转染的细胞，然后如下所示处理转染的细胞1小时，加入10ng/ml IL-6(R&D system,美国)并培养12小时。

1：阴性对照(未处理组)；

2：阳性对照(IL-6,10ng/ml)；

3：提取物和馏分(1,3,6和10μg/ml)；和

4：染料木素(Genestein)-处理组(100μM)

用PBS洗涤上述反应后的细胞，加入50μL缓冲溶液(荧光素酶检测系统，普洛麦格，美国)(luciferase assay system,Promega,USA)溶解，搅拌20分钟，加入30-100μL荧光素酶底物(荧光素酶检测系统，普洛麦格，USA)，用分光光度计(EG&G BERTHOLD,美国)测定5分钟内的显色水平。结果显示，荔枝草乙醇提取物和其乙酸乙酯馏分浓度依赖性地抑制STAT3的荧光素酶活性。具体地，荔枝草乙醇提取物在10、6、3和1μg/ml的浓度下分别抑制了88％、73％、48％和23％的荧光素酶活性，乙酸乙酯馏分在6、3和1μg/ml浓度下分别抑制了100％、98％和72％的荧光素酶活性(图1)。

上述实验证明，荔枝草提取物或其馏分可有效地抑制IL-6诱导的STAT3激活。

STAT3已知能够提高铁调素(hepcidin)的表达，该蛋白在炎性贫血中激活并抑制巨噬细胞释放铁(Wrighting DM等.,Blood.2006年11月1日；108(9):3204-9)，其会在炎性疾病，如人肾炎(Arakawa T等.,Nephrol Dial Transplant.2008年11月；23(11):3418-26)、恶病质患者的骨骼肌、克罗恩氏病(Lovato P等.,J Biol Chem.2003年5月9日；278(19):16777-81)和慢性胰腺炎(Fukuda A等.,Cancer Cell.2011年4月12日；19(4):441-55)中激活。因此，含有荔枝草提取物或其馏分的本发明组合物可用于预防或治疗上述炎性疾病。

此外，STAT3被认为是类风湿性关节炎中骨质吸收的新靶点。对于哮喘，气道上皮细胞中出现的STAT3已知能够诱导过敏性炎症反应(Simeone-Penney MC等.,JImmunol.2007年5月15日；178(10):6191-9)，STAT3已知在移植物抗宿主反应疾病(GVHD)(Ma HH等.,Cell Immunol.2011；268(1):37-46)、多发性硬化患者和动脉粥样硬化ApopE-/-小鼠的情况中通过磷酸化而激活。

因此，上述结果证明了含有荔枝草提取物或其馏分的本发明组合物可用于预防或治疗自身免疫性疾病和代谢性疾病。

实施例2-3：验证荔枝草提取物或其馏分对IL-6诱导的STAT3、JAK2和ERK磷酸化的抑制作用

将Hep3B和U266细胞以5×10⁵细胞/孔的密度等份加入六孔板中，培养至细胞铺满80％的培养板。然后，将培养基换成血清饥饿培养基，再培养12小时，然后如下处理转染细胞60分钟。

1：阴性对照(未处理组)；

2：阳性对照(IL-6,10ng/ml)；

3：提取物和馏分(10,30,60μg/ml)；和

4：染料木素(Genestein)-处理组(100μM)

然后，将所获产物经20ng/mL浓度的IL-6处理并反应20分钟，用40μL裂解缓冲液进行溶解(pH8、20mM Tris-HCl、137mM NaCl、10％甘油、1％TritonX-100、1mM Na₃VO₄、2mMEDTA、1mM PMSF、20mM亮抑酶肽，20mg/mL抑肽酶(西格马(Sigma)，美国))，离心(13000g、15分钟)，收集含有溶解蛋白的上清液。用DC蛋白检测试剂盒(Bio-Rad,美国)对蛋白浓度进行定量，将蛋白上样至4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，在175mA下进行2小时电泳。完成电泳后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜(Westran S,孔径0.2；沃特曼(Whatman),美国)上，35V 90分钟。在室温下采用Tris缓冲溶液(T-TBS；50mM Tris-HCl、pH 7.6、150mM NaCl、0.2％吐温-20、5％脱脂牛奶；西格马，美国)对转移膜进行1小时封闭，并用T-TBS洗涤5次。上述的膜采用磷酸-STAT3、磷酸-JAK2和磷酸ERK(1:1000稀释)的多克隆抗体作为一抗处理4-12小时。用T-TBS洗涤所得物5次，使其与HRP-偶联抗小鼠抗体(1：5000稀释)和作为二抗的抗兔抗体反应1小时。T-TBS洗涤所得物，采用ECL试剂盒(Amersham,美国)使胶片在暗室中显影。结果证明，荔枝草乙醇提取物和其乙酸乙酯馏分抑制了IL-6诱导的STAT3、JAK2和ERK磷酸化(图2-4)。

以上结果显示，荔枝草提取物或其馏分抑制IL-6下游的JAK2磷酸化从而使其失活，还减少了经由JAK激活和磷酸化的STAT3磷酸化，即荔枝草提取物或其馏分抑制Il-6介导的信号转导系统。此外，上述结果支持了含有荔枝草提取物或其馏分作为活性组分的本发明组合物可用于预防或治疗由IL-6激活的STAT3介导的疾病。

实施例2-4：验证荔枝草提取物或其馏分对STAT3诱导的SOCS-3、MCP-1和ICAM-1mRNA表达的抑制作用

将Hep3B细胞以5×10⁵细胞/孔的密度等份加入六孔板中，培养至细胞铺满80％的培养板。然后，将培养基换成血清饥饿培养基，再培养12小时，然后如下处理转染细胞60分钟。

1：阴性对照(未处理组)；

2：阳性对照(IL-6,10ng/ml)；

3：提取物和馏分(10,30,60μg/ml)；和

然后，采用20ng/mL浓度的IL-6处理细胞，反应6小时，收集所获细胞至试管并离心去除培养基，PBS洗涤一次，用RNeasy Mini Elute Cleanup试剂盒从中提取RNA。所提取RNA的浓度和纯度经2100生物分析仪系统(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))测定，并用Maxime RT PreMix(随机引物，iNtRON生物科技有限公司)合成cDNA。

SOCS-3mRNA的表达水平采用TaqMan PCR master mix试剂盒(应用生物系统(Applied Biosystem))进行实时PCR测定。MCP-1和ICAM-1mRNAs表达水平用SYBRGreenmaster mix试剂盒(应用生物系统)进行实时PCR测定。

结果证明，荔枝草乙醇提取物抑制了SOCS-3(一种细胞因子抑制因子)、MCP-1(细胞因子)、和ICAM-1(细胞间黏附分子)的mRNA表达(图5-7)。该结果支持了荔枝草提取物或其馏分由于STAT3靶基因表达的下降而抑制了IL-6激活的STAT3信号转导通路。

实施例3：荔枝草提取物对胶原诱导性类风湿性关节炎的治疗效果

为了检测荔枝草提取物是否通过抑制牛II型胶原诱导的类风湿性关节炎而对类风湿性关节炎具有治疗效果，进行了以下实验：

实施例3-1：胶原诱导性类风湿性关节炎小鼠模型的建立以及关节炎抑制效果的验证

类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病，其为以关节滑膜鞘的慢性肥大和炎症造成软骨和骨质破坏导致关节破坏和变形为特征的慢性炎症性疾病。在本发明中，通过胶原诱导性关节炎(CIA)模型作为类风湿性关节炎典型动物模型来验证本发明荔枝草提取物对胶原诱导性关节炎的治疗效果。

具体地，在本发明中，所述胶原诱导性关节炎小鼠模型采用6-8周龄的BALB/c小鼠构建。将II型胶原(牛CII，Chondrex)与完全弗氏佐剂(Chondrex)混合，向小鼠尾部皮下注射100μg CII。免疫后21天，混合CII和完全弗氏佐剂并进行二次免疫。

然后，为了检测荔枝草提取物对关节炎诱导小鼠是否具有治疗作用，将荔枝草乙醇提取物溶解于三蒸水，浓度分别为2mg/kg、10mg/kg或50mg/kg，并从第一次免疫开始起算的第28天口服给药，对照组口服给予5mg/kg的Ketotop的主要成分酮洛芬(西格马)(溶于三蒸水后)，其为目前市售可得的关节炎治疗药物。上述的给药过程如图8所述，图8中“W”代表“周”。关节炎的临床数据，爪部水肿和红疹测定如下：0-4分(0：无水肿，1：1个关节的轻微水肿，2：至少2个关节的中度水平水肿，3：大多数关节的严重水肿，和4：全面严重水肿)。实验结果如图9-11所示。

结果如图9-11所示，口服服用荔枝草乙醇提取物有效地抑制了所有II型胶原诱导类风湿性关节炎小鼠的爪厚度、关节炎严重程度、和发病率，其效果与关节炎治疗药物酮洛芬相似(图9、10和11)。

实施例3-2：血免疫球蛋白G1和G2a的测定

完成以上实验后，处死小鼠并解剖，自腹部区域采集血样，3000rpm下离心15分钟以分离血清。用ELISA试剂盒(BD生物科技)进行免疫球蛋白G1和G2a的浓度测定如下：

具体地，将捕获的抗体(纯化的大鼠抗小鼠IgG1和抗小鼠IgG2a)分别在包被缓冲液(制备：将8.40g NaHCO₃和3.56g NaCO₃溶解于1L蒸馏水，pH 9.5)中按1:250的比例稀释，等份加入各孔(100μL/孔)，37℃下反应3小时，用洗涤缓冲液洗涤3次(0.05％吐温-20PBS)。然后向每个孔中(200μL/孔)等份加入检测稀释液(10％FBS PBS)，37℃下反应1小时，用洗涤缓冲液洗涤3次。小鼠血清在检测稀释液中按1:300的比例稀释，并等份加入各孔(100μL/孔)，37℃下反应2小时，洗涤5次。然后检测抗体(生物素大鼠抗小鼠IgG1，生物素化抗小鼠IgG2a)以及酶反应剂(SAv-HRP)分别在检测稀释剂中按1:250的比例稀释，等份加入各孔(100μL/孔)作为工作溶液，室温下反应1小时，然后分别进行7次1分钟洗涤。最后，向各孔中加入底物溶液(100μL/孔)，避光放置30分钟，并用50μL终止液处理。用ELISA读取器测定所得物在450nm下的吸光度，结果如图12和13所示。

结果如图12和13可见，本发明荔枝草提取物能有效降低血中IgG1和IgG2浓度(图12和13)。

实施例4：荔枝草提取物对特应性皮炎的抑制作用

为了测定荔枝草提取物对特应性皮炎的抑制作用，进行了以下实验：

实施例4-1：特应性皮炎小鼠模型的建立以及荔枝草提取物降低耳部厚度的效果验证

采用屋尘螨提取物(Dermatophagoides farinae提取物，DFE)和2,4-二硝基氯苯诱导小鼠的特应性皮炎，诱导特应性皮炎的过程如图14所示、

为了验证本发明荔枝草提取物是否能够抑制特应性皮炎(一种典型的自身免疫性疾病)，采用了上述的特应性皮炎小鼠模型，实验如下所示：

具体地，向特应性皮炎诱导性小鼠口服给予荔枝草提取物，并通过下述的实验对荔枝草提取物对特应性皮炎诱导性小鼠的耳部厚度的降低作用进行了测定。

1：阴性对照(未处理组)；

2：阳性对照(DFE/DNCB 20μg/mL)；

3：提取物(20mg/kg和100mg/kg)

在施用液体之前，用橡皮膏以相同的强度和次数对小鼠的耳部重复进行3-4次的剥脱，然后将20μg以10mg/mL浓度溶解的DFE分别在每周四施用于小鼠耳部的正面/反面。此外，将溶解于AOO(丙酮/橄榄油，1:3)的DNCB(1％)在每周一施用于小鼠耳部的正面/反面，并在每周二和周五测定耳部厚度。照此，用于小鼠皮肤的DFE和DNCB增加其耳部厚度，并对荔枝草提取物对其耳部厚度增加的抑制效果进行了测定。

结果如图15所述，口服给予荔枝草乙醇提取物显示浓度依赖性地降低了由于特应性皮炎引起的耳部厚度增加(图15)。

实施例4-2：验证荔枝草提取物对特应性皮炎引起的血中免疫球蛋白E和G2a量的抑制作用

完成四周的试验后，处死小鼠，自其采集血样，并在3000rpm下离心15分钟以分离小鼠血清。免疫球蛋白E和G2a的浓度采用ELISA试剂盒(BD生物科技)进行了如下测定：

将捕获的抗体(纯化的大鼠抗小鼠IgG1和抗鼠IgG2a)分别在包被缓冲液(制备：将8.40g NaHCO₃和3.56g NaCO₃溶解于1L蒸馏水，pH 9.5)中按1:250的比例稀释，等份加入各孔(100μL/孔)，37℃下反应3小时，用洗涤缓冲液洗涤3次(0.05％吐温-20PBS)。然后向每个孔中(200μL/孔)等份加入检测稀释液(10％FBS PBS)，37℃下反应1小时，用洗涤缓冲液洗涤3次。小鼠血清在检测稀释液中按1:300的比例稀释，并等份加入各孔(100μL/孔)，37℃下反应2小时，洗涤5次。然后检测抗体(生物素大鼠抗小鼠IgG1，生物素化抗小鼠IgG2a)以及酶反应剂(SAv-HRP)分别在检测稀释剂中按1:250的比例稀释，等份加入各孔(100μL/孔)作为工作溶液，室温下反应1小时，然后分别进行7次1分钟洗涤。最后，向各孔中加入底物溶液(100μL/孔)，避光放置30分钟，并用50μL终止液处理。用ELISA读取器测定产物在450nm下的吸光度，结果如图16和17所示。

结果如图16和17可见，本发明荔枝草提取物能浓度依赖性地抑制血清IgE和IgG2的含量(图15)。

实施例4-3：测定荔枝草提取物对特应性皮炎引起的组胺释放的抑制作用

将小鼠血清在微量离心管中由PBS稀释至1/100，然后加入450μL的0.1MHCl和50μL的60％高氯酸，将混合物在400g下离心20分钟。然后回收所得上清液800μL，将其加入含有500μL 5M NaOH、3mL蒸馏水、10mL正丁醇、1.2gNaCl的试管，搅拌，然后在500g下离心10分钟。在以上这些实验试管中，收集8mL的丁醇层，加入3mL 0.1M的HCl和10mL正庚烷后搅拌，并在500g下离心10分钟。向2mL所得水层中加入400μL 1M的NaOH和100μL 1％的邻苯二醛(西格马)，放置2分钟，并用荧光光谱仪(RF-5301PC,岛津(Shimadzu))对其在438nm发射波长以及353nm激发波长的荧光强度进行测定。

结果如图18可见，荔枝草乙醇提取物浓度依赖性地抑制了血清中组胺的释放，这意味着荔枝草乙醇提取物对特应性皮炎(一种典型的自身免疫性疾病)具有治疗作用。

实施例4-4：验证荔枝草提取物对特应性皮炎造成的炎症诱导性细胞因子分泌的抑制作用

完成了实验后，处死小鼠，并切下其耳部组织。为了测定耳部组织中炎症诱导性细胞因子的表达，采用Maxime RT PreMix(随机引物，iNtRON生物技术)合成了cDNA。每个试管中加入2μL cDNA、1μL正义和反义引物溶液(0.4μM)、12.5μL SYBR Premix EX Taq(Takara生物(Takarabio))，以及9.5μL dH₂O至最终体积为25μL。采用TP850软件对TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-31、和IL-17的mRNA表达水平进行了测定。

结果如图19所示，荔枝草乙醇提取物浓度依赖性地抑制了所有TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-31、和IL-17，即炎症诱导性细胞因子的表达，这显现出了对其分泌的抑制效果。

最后基于以上结果，本发明荔枝草提取物证实具有优异的预防或治疗类风湿性关节炎和特应性皮炎(典型的STAT3-介导疾病)的作用，这意味着本发明荔枝草提取物可用于治疗多种STAT-3介导疾病，例如炎性疾病、自身免疫性疾病，和代谢性疾病。

应理解，在此讨论的举例性实施例应仅作为描述性意义而非用于限制目的。每个实施例的特征或方面的描述应被考虑为可用于其他实施例其他类似特征和方面。本发明的一个或多个实施例参考了附图进行描述，应理解，对于本领域技术人员而言，对其进行形式和细节的修改应当不脱离本发明精神和本发明权利要求定义的范围。

Claims

1.荔枝草提取物或其馏分在制备预防或治疗STAT3-介导疾病的药物组合物中的用途，其特征在于，所述的STAT3-介导疾病是骨质疏松症、风湿性关节炎、特发性皮炎或克罗恩氏病。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的提取物经选自下组的提取溶剂获得：水、C_1-6的醇、及其混合溶剂。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的醇溶剂是乙醇。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的馏分是乙酸乙酯馏分。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物制备成选自下组的任一制剂：片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆、冻干制剂和栓剂。