ES2384222T3 - Inhibición del crecimiento anómalo de células sinoviales utilizando un antagonista de IL-6 como principio activo - Google Patents
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Abstract
El uso de un antagonista de interleuquina-6 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento anómalo de células sinoviales, en el que el antagonista de interleuquina es un anticuerpo humanizado contra un receptor de interleuquina-6 humano.
Description
Inhibici6n del crecimiento an6malo de celulas sinoviales utilizando un antagonista de IL-6 como principio activo.
Campo tecnico
La presente invenci6n se refiere a un inhibidor del crecimiento de celulas sinoviales que comprende un antagonista de interleuquina-6 como componente eficaz.
Antecedentes en la tecnica
La artritis reumatoide cr6nica es una enfermedad inflamatoria cr6nica sistemica en la que se produce un crecimiento an6malo del tejido conectivo, incluyendo tejido sinovial, en las articulaciones (Melnyk et al., Arthritis Rheum., 33:493500, 1990). Se ha demostrado que las articulaciones de los pacientes con artritis reumatoide cr6nica presentan un marcado crecimiento de celulas sinoviales, la formaci6n de una estructura de multiples capas debido a un crecimiento an6malo de las celulas sinoviales (formaci6n de pannus), la invasi6n de celulas sinoviales hacia el tejido cartilaginoso y el tejido 6seo, una vascularizaci6n hacia el tejido sinovial, y la infiltraci6n de celulas inflamatorias, tales como linfocitos y macr6fagos. Se ha indicado que los mecanismos de aparici6n de la artritis reumatoide cr6nica se basan en factores tales como la herencia, infecciones bacterianas y la contribuci6n de diversas citoquinas y factores del crecimiento, pero el mecanismo global de aparici6n sigue siendo poco claro.
En los ultimos anos se han detectado citoquinas y factores del crecimiento, incluyendo interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-8 (IL-8), factor de necrosis tumoral α (TNFα), factor del crecimiento tranformante β (TGFβ), factor del crecimiento de fibroblastos (FGF), y factor del crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en la membrana sinovial y el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide cr6nica (Nouri et al., Clin. Exp. Immunol., 55:295-302, 1984; Thornton et al., Clin. Exp. Immunol., 86:79-86, 1991; Saxne et al., Arthritis Rheum., 31:1041-1045, 1988; Seitz et al.,
J. Clin. Invest., 87:463-469, 1991; Lafyatis et al., J. Immunol., 143:1142-1148, 1989; Melnyk et al., Arthritis Rheum., 33:493-500, 1990).
Se cree que IL-1, TNFα y PDGF son factores del crecimiento de celulas sinoviales particularmente poderosos (Thornton et al., Clin. Exp. Immunol., 86:79-86, 1991; Lafyatis et al., J. Immunol., 143:1142-1148, 1989; Gitter et al., Immunology, 66:196-200, 1989). Tambien se ha sugerido que la estimulaci6n por IL-1 y TNF da como resultado la producci6n de interleuquina-6 (IL-6) por las celulas sinoviales (Ito et al., Arthritis Rheum., 35:1197-1201, 1992).
La IL-6 es una citoquina tambien conocida como factor 2 estimulante de celulas B o interfer6n β2. La IL-6 se descubri6 como un factor de diferenciaci6n que contribuye a la activaci6n de celulas linfoides B (Hirano, T. et al., Nature, 324, 73-76, 1986), y despues se descubri6 que era una citoquina multifuncional que influye en el funcionamiento de una diversidad de tipos celulares diferentes (Akira, S. et al., Adv. in Immunology, 54, 1-78, 1993). Son necesarias dos moleculas de la membrana funcionalmente diferentes para la inducci6n de las actividades IL-6. Una de estas es el receptor de IL-6 (IL-6R), con un peso molecular de aproximadamente 80 KD, que se une de modo especifico a IL-6.
La IL-6 existe en una forma de uni6n a membrana que se expresa sobre la membrana celular y penetra a traves de la membrana celular, asi como en forma de IL-6R soluble (sIL-6R) que consiste principalmente en el dominio extracelular. Otra proteina es gp130, con un peso molecular de aproximadamente 130 KD, que no se une al ligando sino que actua para mediar en la transducci6n de senales. La IL-6 y el IL-6R forman el complejo IL-6/IL-6R que, a su vez, se une a otra proteina de membrana gp130, para inducir la actividad biol6gica de IL-6 en la celula (Taga et al.,
J. Exp. Med., 196:967, 1987).
Se ha indicado que el suero o el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide cr6nica contiene cantidades excesivas de interleuquina-6 (IL-6) y receptor de IL-6 soluble (sIL-6R) (Houssiau et al., Arthritis Rheum., 31:784-788, 1988; Hirano et al., Eur. J. Immunol., 18:1797-1801, 1988; Yoshioka et al., Japn. J. Rheumatol., en imprenta), y puesto que se han obtenido resultados similares en modelos animales de artritis reumatoide (Takai et al., Arthritis Rheum., 32:594-600, 1989; Leisten et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 56:108-115, 1990), se ha sugerido que la IL-6 de alguna manera esta implicada en la artritis reumatoide cr6nica.
Sin embargo, la publicaci6n de patente no examinada japonesa nO 4-89433 indica que peptidos que estimulan poderosamente la producci6n de IL-6 son eficaces como terapias para la artritis reumatoide cr6nica.
Ademas Higaki et al. han sugerido que celulas sinoviales procedentes de pacientes con artritis reumatoide cr6nica tienen una reacci6n de crecimiento bajo frente a la IL-6, y que la IL-6, por tanto, tiene una funci6n inhibidora frente al crecimiento de celulas sinoviales (Clinical Immunology, 22:880-887, 1990). Asi, existen informes contradictorios con respecto a la relaci6n entre IL-6 y la artritis reumatoide cr6nica, y la relaci6n aun no esta clara.
En fechas recientes, Wendling et al. han indicado que la administraci6n de anticuerpos anti-IL-6 a pacientes con artritis reumatoide cr6nica alivia temporalmente los sintomas clinicos y biol6gicos, mientras que tambien aumenta los niveles de IL-6 en suero (J. Rheumatol., 20:259-262, 1993).
El documento EP-A-409607 divulga el anticuerpo humanizado contra un receptor de IL-6 que se reivindica en la presente, pero no menciona ningun uso en ningun tratamiento.
El documento JP-A-04187646 divulga el uso de un anticuerpo contra un receptor de IL-6 para suprimir la acci6n de IL-6 y su uso para tratar enfermedades provocadas por las acciones de IL-6.
Estos informes no proporcionan ningun dato sobre si IL-6 acelera el crecimiento de celulas sinoviales de la artritris reumatoide cr6nica o si tiene un efecto inhibidor, y por tanto sigue sin saberse si IL-6 tiene o no un efecto directo sobre las celulas sinoviales de pacientes con artritis reumatoide cr6nica.
Descripcion de la invencion
Se han utilizado agentes esteroideos antiinflamatorios, tales como corticoesteroides, como terapias para la artritis reumatoide, pero puesto que su uso continuado induce unos efectos secundarios indeseables, tales como danos en tejidos dermicos y la inhibici6n de la funci6n de la corteza adrenal, se han buscado farmacos con menos efectos secundarios.
Un objeto de la presente invenci6n es proporcionar una nueva composici6n farmaceutica sin las desventajas mencionadas anteriormente, para inhibir el crecimiento an6malo de celulas sinoviales en la artritis reumatoide cr6nica, cuyo componente eficaz es un antagonista de interleuquina-6.
Los presentes inventores han realizado una investigaci6n concienzuda acerca del papel de la IL-6 en celulas sinoviales de la artritis reumatoide, durante la cual no se descubri6 crecimiento de celulas sinoviales de la artritis reumatoide cr6nica s6lo con IL-6, y por tanto se investig6 otro factor distinto a IL-6, y esto dio como resultado la conclusi6n de la presente invenci6n que se basa en el descubrimiento de que, mientras IL-6 sola no muestra casi efectos de crecimiento sobre celulas sinoviales, se produce un poderoso efecto de crecimiento de celulas sinoviales en presencia de IL-6 e IL-6R soluble, y ademas este efecto de crecimiento de celulas sinoviales es suprimido por la adici6n de un antagonista que inhibe la actividad IL-6, tal como un anticuerpo de IL-6R.
De forma mas especifica, la presente invenci6n se refiere a una composici6n farmaceutica para suprimir el crecimiento an6malo de celulas sinoviales, que comprende un antagonista de IL-6 como componente eficaz.
La presente invenci6n tambien se refiere a un inhibidor del crecimiento de celulas sinoviales cuyo componente eficaz es un antagonista de IL-6.
Breve descripcion de lo dibujos
La figura 1 es una grafica que muestra la captaci6n de 3H-timidina hacia celulas sinoviales en presencia de IL-6 sola, de sIL-6R s6lo, y en presencia de ambos IL-6 y sIL-6R.
La figura 2 es una grafica que muestra el efecto de un anticuerpo de IL-6 o de un anticuerpo de IL-6R sobre la captaci6n de 3H-timidina hacia celulas sinoviales en presencia de ambos IL-1β y sIL-6R.
La figura 3 es una grafica que muestra el efecto de un anticuerpo de IL-6 o de un anticuerpo de IL-6R sobre la captaci6n de 3H-timidina hacia celulas sinoviales en presencia de ambos IL-6 y sIL-6R.
La figura 4 es una grafica que muestra el efecto supresor del anticuerpo de IL-6R sobre la aparici6n de artritis inducida por colageno en modelos de rat6n.
La figura 5 es una grafica que muestra los niveles de anticuerpos anticolageno en suero en ratones artriticos.
La figura 6 es una fotografia de un examen histopatol6gico de la articulaci6n de la pata trasera de un raton con artritis por colageno. (a) es una fotografia procedente de un rat6n del grupo al que se le administr6 anticuerpo del receptor de IL-6, y (b) es una fotografia procedente de un rat6n del grupo al que se le administr6 anticuerpo control. En el grupo al que se le administr6 anticuerpo del receptor de IL-6, la invasi6n de tejido de granulaci6n hacia el cartilago y el hueso (sinovitis proliferativa cr6nica) fue claramente suprimida.
Descripcion detallada de la invencion
Una composici6n farmaceutica segun la invenci6n es un farmaco que, cuando se administra a pacientes con artritis reumatoide cr6nica, suprime el crecimiento de celulas sinoviales en articulaciones y tiene un efecto aliviante y terapeutico sobre los sintomas.
El antagonista de IL-6 utilizado segun la invenci6n es un anticuerpo de IL-6R.
El anticuerpo utilizado como antagonista segun la invenci6n, tal como un anticuerpo de IL-6R, puede ser cualquier derivaci6n o tipo (monoclonal, policlonal), pero se prefieren especialmente anticuerpos monoclonales derivados de animales mamiferos. Estos anticuerpos se unen a IL-6R para inhibir la uni6n entre IL-6 e IL-6R y, por tanto, para bloquear la transducci6n de senales de IL-6, inhibiendo la actividad biol6gica de IL-6.
Las especies animales para las celulas productoras de anticuerpos monoclonales no estan particularmente limitadas con la condici6n de que sean de mamifero, y pueden utilizarse anticuerpos humanos o anticuerpos derivados de un mamifero distinto a un ser humano. Los anticuerpos monoclonales derivados de un mamifero distinto de un ser humano son preferiblemente anticuerpos monoclonales derivados de conejos o roedores porque son mas faciles de preparar. No existen restricciones particulares sobre los roedores, pero los ejemplos preferidos son ratones, ratas y hamsters.
Los ejemplos de anticuerpos de IL-6R incluyen el anticuerpo PM-1 (Hirata et al., J. Immunol., 143:2900-2906, 1989), el anticuerpo AUK12-20, el anticuepo AUK64-7 y el anticuerpo AUK146-15 (solicitud de patente no examinada internacional nO WO92-19759).
Entre estos, se prefiere el anticuerpo PM-1.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse de la siguiente manera, que se basa en una tecnica conocida. Es decir, el IL-6R se utiliza como antigeno sensibilizante para la inmunizaci6n segun un metodo de inmunizaci6n convencional, y los inmunocitos resultantes entonces se fusionan con celulas de origen conocidas mediante un metodo de fusi6n de celulas convencional, y las celulas productoras de anticuerpos monoclonales se seleccionan mediante un metodo de selecci6n convencional para preparar los anticuerpos.
De forma mas especifica, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse de la siguiente manera. Por ejemplo, si el antigeno sensibilizante es el IL-6R humano, los anticuerpos se obtienen utilizando la secuencia genica para el IL6R humano. La secuencia genica del IL-6R humano se inserta en un sistema de vector de expresi6n publico y se utiliza para transformar celulas hospedantes adecuadas, tras lo cual la proteina de IL-6R deseada se purifica de las celulas hospedantes o del sobrenadante del cultivo, y la proteina de IL-6R purificada entonces se utiliza como antigeno sensibilizante.
En el caso del IL-6R humano, la proteina de IL-6R puede obtenerse utilizando la secuencia genica descrita en la solicitud de patente europea nO EP325474. Existen dos tipos de IL-6R, uno que se expresa sobre la membrana celular, y una forma soluble (sIL-6R) que esta separada de la membrana celular. El sIL-6R consiste principalmente en el dominio extracelular de IL-6R que esta unido a la membrana celular, y se diferencia del IL-6R unido a la membrana porque carece del dominio transmembrana, o del dominio transmembrana y el dominio intracelular.
Los animales mamiferos inmunizados con el antigeno sensibilizante no tienen restricciones particulares, sino que se seleccionan preferiblemente en consideraci6n a su compatibilidad con las celulas de origen utilizadas para la fusi6n celular, y en general pueden utilizarse ratones, ratas, hamsters y conejos.
La inmunizaci6n de los animales con el antigeno sensibilizante puede realizarse mediante un metodo conocido publico. Por ejemplo, un metodo convencional implica la inyecci6n intraperitoneal o subcutanea de los animales mamiferos con el antigeno sensibilizante. De modo especifico, el antigeno sensibilizante se diluye preferiblemente con un equivalente de PBS (disoluci6n salina tamponada con fosfato) o disoluci6n salina fisiol6gica, se suspende y se utiliza junto con una cantidad adecuada de un adyuvante convencional, tal como adyuvante completo de Freund si se desea, y despues se administra a los animales mamiferos unas cuantas veces cada 4-21 dias. Tambien puede utilizarse un vehiculo apropiado para la inmunizaci6n con el antigeno sensibilizante.
Despues de esta inmunizaci6n y la confirmaci6n de un aumento en los niveles en suero del anticuerpo deseado, se extraen los inmunocitos de los animales mamiferos y se suministran para la fusi6n celular, siendo las celulas esplenicas los inmunocitos especialmente preferidos.
Las celulas de origen utilizadas para la fusi6n con los inmunocitos mencionados anteriormente pueden ser celulas de mieloma procedentes de animales mamiferos, y pueden utilizarse de forma adecuada una serie de cepas celulares ya conocidas por el publico, tales como P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol., 123:1548, 1978), p3-U1 (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81:1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol., 6:511-519, 1976), MPC-11 (Cell, 8:405-415, 1976), SP2/0 (Nature, 276:269-270, 1978), Of (J. Immunol. Meth., 35:1-21, 1980), S194 (J. Exp. Med., 148:313-323, 1978), R210 (Nature, 277:131-133, 1979). La fusi6n celular de los inmunocitos con las celulas de mieloma puede basarse en un metodo conocido publico, por ejemplo, el metodo de Milstein et al. (Milstein et al., Methods Enzymol., 73:3-46, 1981).
De forma mas especifica, la fusi6n celular mencionada anteriormente se realiza en un cultivo nutriente convencional en presencia de un promotor de la fusi6n celular. El promotor de la fusi6n utilizado puede ser, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o el virus Sendai (HVJ), y tambien puede anadirse si se desea un adyuvante, tal como dimetilsulf6xido, para aumentar la eficacia de la fusi6n.
Las proporciones de los inmunocitos y las celulas de mieloma utilizadas son preferiblemente una cantidad de 1 a 10 veces mayor de inmunocitos con respecto a las celulas de mieloma. El medio de cultivo utilizado para la fusi6n celular puede ser, por ejemplo, medio de cultivo RPMI1640 o medio de cultivo MEM, que son adecuados para el crecimiento de cepas de celulas de mieloma, u otros medios de cultivo habituales utilizados para este cultivo celular, y tambien pueden utilizarse con ellos disoluciones de suero suplementarias, tales como suero de ternera fetal (FCS).
La fusi6n celular se realiza mezclando a fondo las cantidades prescritas de inmunocitos y de celulas de mieloma en el medio de cultivo descrito anteriormente, anadiendo una disoluci6n de PEG precalentada hasta aproximadamente 37 OC, por ejemplo, teniendo el PEG un peso molecular medio de aproximadamente 1000 a 6000, al medio de cultivo habitualmente a una concentraci6n del 30% al 60% (en p/v), y despues mezclando para formar las celulas fusionadas deseadas (hibridomas). Despues, se repite el procedimiento de adici6n gradual de un medio de cultivo adecuado y una centrifugaci6n para eliminar el sobrenadante, para lograr la eliminaci6n del agente de fusi6n celular, etc., que es desfavorable para el crecimiento de los hibridomas.
Los hibridomas adecuados se seleccionan cultivando en un medio de cultivo de selecci6n normal, tal como un medio de cultivo HAT (que contiene hipoxantina, aminopterina y timina). El cultivo en el medio de cultivo HAT continua durante un tiempo dado, habitualmente de unos cuantos dias a unas cuantas semanas, que es suficiente para que mueran las celulas que no sean hibridomas (celulas no fusionadas). Despues se realiza una diluci6n limitada normal, y los hibridomas que producen los anticuerpos deseados se someten a enmascaramiento y monoclonaci6n.
Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales preparados de esta manera pueden subcultivarse en una disoluci6n de cultivo habitual y tambien pueden colocarse en nitr6geno liquido para una conservaci6n a largo plazo.
Para adquirir los anticuerpos monoclonales de los hibridomas, los hibridomas se cultivan segun un metodo convencional tras lo cual se recupera el sobranadante del cultivo, o bien se utiliza un metodo por el que los hibridomas son inyectados en un animal mamifero compatible, se hacen crecer y se obtiene el fluido de ascitis. El primer metodo es adecuado para obtener anticuerpos con alta pureza, mientras que el segundo metodo es adecuado para la producci6n en masa de anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales obtenidos mediante estos metodos entonces pueden purificarse hasta un alto grado utilizando medios de purificaci6n convencionales, tales como desalaci6n, filtraci6n en gel, cromatografia de afinidad,
o similares.
Los anticuerpos monoclonales preparados de esta manera entonces pueden comprobarse para el reconocimiento de alta sensibilidad y alta pureza del antigeno por medios inmunol6gicos habituales, tales como un radioinmunoensayo (RIA), un inmunoensayo ligado a enzimas (EIA, ELISA), la tecnica de anticuerpos fluorescentes (analisis de inmunofluorescencia), etc.
Los anticuerpos monoclonales utilizados segun la invenci6n no se limitan a anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas, y pueden haber sido modificados de modo artificial con el objetivo de disminuir su heteroantigenicidad contra seres humanos. Por ejemplo, puede utilizarse un anticuerpo quimerico que consiste en la regi6n variable de un anticuerpo monoclonal de un animal mamifero distinto de un ser humano, tal como un rat6n, y la regi6n constante de un anticuerpo humano, y dicho anticuerpo quimerico puede ser producido mediante un metodo conocido para producir anticuerpos quimericos, en particular una tecnica de recombinaci6n genica.
Tambien pueden utilizarse anticuerpos humanos remodelados segun la invenci6n. Estos se preparan utilizando la regi6n determinante de la complementariedad de un rat6n u otro animal mamifero no humano para sustituir la regi6n determinante de la complementariedad de un anticuerpo humano, y los metodos de recombinaci6n genica convencionales para ello son muy conocidos. Uno de los metodos conocidos puede utilizarse para obtener un anticuerpo humano remodelado que sea util segun la invenci6n. Un ejemplo preferido de dicho anticuerpo humano remodelado es hPM-1 (vease la solicitud de patente no examinada internacional nO WO92-19759).
Cuando sea necesario, pueden sustituirse aminoacidos de la regi6n de marco (FR) de la regi6n variable de un anticuerpo, de manera que la regi6n determinante de la complementariedad del anticuerpo humano remodelado forma un sitio de uni6n a anticuerpos adecuado (Sato et al., Cancer Res., 53:851-856, 1993). Ademas, el objeto mencionado anteriormente tambien puede lograrse construyendo un gen que codifique un fragmento de anticuerpo que se une al antigeno para inhibir la actividad IL-6, tal como Fab o Fv, o un Fv monocatenario (scFv), en los que el Fv de las cadenas H y L se une a traves de un conector apropiado, y se utiliza para la expresi6n en celulas hospedantes apropiadas (vease, por ejemplo, Bird et al., TIBTECH, 9:132-137, 1991; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988).
Una composici6n farmaceutica segun la invenci6n cuyo componente eficaz sea un antagonista de IL-6 es eficaz si bloquea la transducci6n de senales de IL-6 y suprime el crecimiento an6malo de celulas sinoviales inducido por IL-6, que estan implicados en la enfermedad. El ejemplo 1 demuestra el efecto supresor del crecimiento in vitro en celulas sinoviales derivadas de pacientes reumaticos. En el ejemplo 2, se administr6 un anticuerpo del receptor de IL-6 a modelos artriticos de ratones inmunizados con el colageno de tipo II, y los datos pertinentes demuestran (1) la supresi6n de la aparici6n de artritis basandose en el indice de artritis (figura 4), (2) la supresi6n de la producci6n de anticuerpos de anti-colageno de tipo II en la sangre de ratones inmunizados con colageno (figura 5), y (3) la supresi6n de la invasi6n de tejido de granulaci6n hacia el cartilago y el hueso (sinovitis proliferativa cr6nica) en las articulaciones de las patas traseras de modelos de ratones artriticos a los que se les administra anticuerpo del receptor de IL-6 (figura 6).
Con respecto a los anteriores (1) y (2), los resultados confirman un efecto supresor por el anticuerpo del receptor de
IL-6, en especial inicialmente, sobre la aparici6n de la artritis en modelos animales. Los resultados de (3) demuestran que se suprime la invasi6n de tejido de granulaci6n hacia el tejido cartilaginoso y 6seo, y esto apoya los resultados obtenidos en el ejemplo 1 (inhibici6n in vitro del crecimiento de celulas sinoviales).
Los resultados experimentales de (1) y (2) indican que la composici6n farmaceutica de la presente invenci6n tiene un excelente efecto inicial. La composici6n farmaceutica de la invenci6n se administra preferiblemente por via parenteral, por ejemplo mediante inyecci6n intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutanea, de forma sistemica o local. Ademas, puede estar en forma de un kit de formulaci6n medica junto con al menos un tipo de vehiculo o diluyente medico.
La dosificaci6n de la composici6n farmaceutica de la invenci6n, cuando se administra a seres humanos, sera diferente del trastorno patol6gico y de la edad del paciente, y de la via de administraci6n, y por tanto deben seleccionarse dosis adecuadas y apropiadas. Por ejemplo, puede seleccionarse un maximo de 4 dosis divididas en el intervalo de aproximadamente 1 a 1000 mg/paciente. Sin embargo, la composici6n farmaceutica de la invenci6n no se limita a estas dosificaciones.
La composici6n farmaceutica de la invenci6n puede formularse segun metodos convencionales. Por ejemplo, se prepara una formulaci6n en inyecci6n disolviendo el antagonista de IL-6 purificado en un disolvente, tal como disoluci6n salina fisiol6gica o una disoluci6n tamp6n, y despues anadiendo un inhibidor de la absorci6n, tal como Tween 80, gelatina, albumina de suero humana (HSA) o similares, y la mezcla puede liofilizarse antes de su uso para la reconstituci6n en disoluci6n. El excipiente utilizado para la liofilizaci6n puede ser un alcohol de azucar, tal como manitol, o glucosa o un sacarido.
Ejemplos
La presente invenci6n se explicara a continuaci6n con mas detalle mediante los siguientes ejemplos, ejemplos de referencia y ejemplos experimentales, entendiendo que la invenci6n no se limita de ninguna manera a estos.
Ejemplo de referencia 1. Preparacion del receptor de IL-6 soluble humano
Se prepar6 el IL-6R soluble (Yasukawa et al., J. Biochem., 108:673-676, 1990) mediante el metodo de PCR (reacci6n en cadena de polimerasa) utilizando el plasmido pBSF2R.236 que contiene ADNc que codifica el receptor de IL-6 (IL-6R) humano obtenido segun el metodo de Yamasaki et al. (Science, 241:825-828, 1988).
El plasmido mencionado pBSF2R.236 se digiri6 con la enzima de restricci6n SphI para obtener un fragmento de ADNc de IL-6R que entonces se insert6 en mp18 (Amersham Co.). Se emple6 el oligocebador sintetico ATATTCTCTAGAGAGATTCT, disenado para la introducci6n de un cod6n de fin en el ADNc de IL-6R, para introducir una mutaci6n en el ADNc de IL-6R mediante el metodo de PCR utilizando un sistema de mutagenesis in vitro (Amersham Co.). Este procedimiento da como resultado la introducci6n de un cod6n de fin en la posici6n del aminoacido 345 para obtener ADNc que codifica el IL-6R soluble (sIL-6R).
Para expresar el ADNc de sIL-6R en celulas CHO, el mencionado ADNc de sIL-6R cortado con HindIII-SalI se insert6 en el plasmido pECEdhfr (Clauser et al., Cell, 45:721-735, 1986) que tiene un ADNc que codifica la dihidrofolato reductasa (dhfr) insertado en el sitio de ruptura de la enzima de restricci6n PvuI, para obtener el plasmido de expresi6n en celulas CHO pECEdhfr344.
Se emplearon 10 μg del plasmido pECEdhfr344 para la transfecci6n de la linea celular dhfr-CHO DXB-11 (Urland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980) mediante el metodo de precipitaci6n de fosfato de calcio (Chen et al., Mol. Cell. Biol., 7:2745-2751, 1987).
Las celulas CHO transfectadas se cultivaron durante 3 semanas en un medio de cultivo selectivo αMEM sin nucle6sidos que contenia glutamina 1 mM, suero de ternera fetal dializado al 10% (FCS), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 μg/ml. Las celulas CHO seleccionadas se seleccionaron mediante el metodo de diluci6n limitante, y se obtuvo una unica linea de celulas CHO monoclonal. El clon de celulas CHO se amplific6 en metotrexato (MTX) de concentraci6n 20 nM a 200 nM, para obtener la linea de celulas CHO productora de sIL-6R humano 5E27.
La linea de celulas CHO 5E27 se cultiv6 en medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM, producto de Gibco Co.) que contenia FCS al 5%, se recuper6 el sobrenadante del cultivo, y se midi6 la concentraci6n de sIL-6R en el sobrenadante del cultivo mediante el metodo ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) segun el procedimiento habitual.
Ejemplo de referencia 2. Preparacion del anticuerpo de IL-6 humana
Se prepar6 un anticuerpo de IL-6 humana segun el metodo de Matsuda et al. (Eur. J. Immunol., 18:951-956, 1988).
Se inmunizaron ratones BALB/c con 10 μg de IL-6 recombinante (Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41, 1988) junto con adyuvante completo de Freund, y esto continu6 una vez a la semana hasta que se detectaron anticuerpos anti
IL-6 en el suero sanguineo.
Se extrajeron inmunocitos de los n6dulos linfaticos locales y se emple6 polietilenglicol 1500 para la fusi6n con la linea celular de mieloma P3U1. Los hibridomas se seleccionaron segun el metodo de Oi et al. (Selective Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980) utilizando un medio de cultivo HAT, y se estableci6 una linea de hibridoma productora de anticuerpos de IL-6 humana. El hibridoma productor de anticuerpos de IL-6 humana se someti6 a un ensayo de uni6n a IL-6 de la siguiente manera.
De modo especifico, una microplaca de 96 pocillos de polivinilo blando (producto de Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) se revisti6 durante la noche con 100 μl de anticuerpo anti-Ig de rat6n de cabra (10 μl/ml, producto de Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA) en una disoluci6n tamp6n de carbonato-bicarbonato 0,1 M (pH 9,6) a 4 OC. La placa entonces se trat6 durante 2 horas a temperatura ambiente con PBS que contiene 100 μl de albumina de suero bovina al 1% (BSA). Despues de lavar con PBS se anadieron 100 μl del sobrenadante del cultivo de hibridoma a cada pocillo, y se realiz6 una incubaci6n durante la noche a 4 OC.
Las placas entonces se lavaron y se anadi6 IL-6 recombinante marcada con 125I a cada pocillo hasta 2000 cpm/0,5 ng/pocillo, y despues de lavar se midi6 la radiactividad de cada pocillo con un contador gamma (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA). De los 216 clones de hibridoma, 32 clones de hibridoma fueron positivos para el ensayo de uni6n de IL-6. Entre estos clones se obtuvo finalmente el clon estable MH166.BSF2. El anticuerpo de IL-6 MH166 producido por este hibridoma tiene un subtipo IgG1K.
La linea celular de hibridoma de rat6n dependiente de IL-6 MH60.BSF2 (Matsuda et al., Eur. J. Immunol., 18:951956, 1988) entonces se utiliz6 para determinar la actividad neutralizante del anticuerpo MH166 sobre el crecimiento del hibridoma. Se dispensaron celulas MH60.BSF2 a una cantidad de 1 x 104/200 μl/pocillo, se le anadi6 una muestra que contenia anticuerpo MH166, se realiz6 el cultivo durante 48 horas, y se anadieron 15,1 Ci/mmol de 3Htimidina (New England Nuclear, Boston, MA), tras lo cual el cultivo continu6 durante 6 horas.
Las celulas se colocaron sobre un papel de filtro de vidrio y se trataron con un recolector automatico (Labo Mash Science Co., Tokio, Jap6n). Se utiliz6 anticuerpo anti-IL-6 de conejo como control. Como resultado, el anticuerpo MH166 inhibe la captaci6n de 3H-timidina por las celulas MH60.BSF2 de una manera dependiente de la dosis. Esto demuestra que el anticuerpo MH166 neutraliza la actividad IL-6.
Ejemplo de referencia 3. Preparacion de un anticuerpo del receptor de IL-6 humana
El anticuerpo anti-IL-6R MT18 construido mediante el metodo de Hirata et al. (J. Immunol., 143:2900-2906, 1989) se uni6 a Sepharose 4B (producto de Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) activado con CNBr, segun las instrucciones adjuntas, y el complejo unido se utiliz6 para purificar IL-6R (Yamasaki et al., Science, 241:825-828, 1988).
La linea celular de mieloma humano U266 se solubiliz6 con clorhidrato de sulfonilfluoruro de pparaaminofenilmetano 1 mM (producto de Wako Chemicals) que contenia digitonina al 1% (producto de Wako Chemicals), trietanolamina 10 mM (pH 7,8) y NaCl 0,15 M (disoluci6n tamp6n de digitonina), y se mezcl6 con anticuerpo MT18 unido a esferas de Sepharose 4B. Las esferas entonces se lavaron 6 veces con disoluci6n tamp6n de digitonina para obtener IL-6R parcialmente purificado para la inmunizaci6n.
Se inmunizaron ratones BALB/c 4 veces cada 10 dias con el IL-6R parcialmente purificado obtenido de 3 x 109 celulas U266, y despues se prepararon hibridomas mediante metodos convencionales. Los sobrenadantes del cultivo de los hibridomas procedentes de pocillos de crecimiento positivo se examinaron para la actividad de uni6n a IL-6 mediante el siguiente metodo. Despues de marcar 5 x 107 celulas U266 con 35S-metionina (2,5 mCi), se solubilizaron con la disoluci6n tamp6n de digitonina mencionada anteriormente. Las celulas U266 solubilizadas se mezclaron con 0,04 ml de anticuerpo MT18 unido a esferas de Sepharose 4B, y despues de lavar 6 veces con disoluci6n tamp6n de digitonina, el IL-6R marcado con 35S-metionina se retir6 mediante un lavado con 0,25 ml de disoluci6n tamp6n de digitonina (pH 3,4) y se neutraliz6 con 0,025 ml de Tris 1 M (pH 7,4).
Se mezclaronn 0,05 ml del sobrenadante del cultivo de hibridoma con 0,01 ml de proteina G-Sepharose (producto de Pharmacia). Despues de lavar, el Sepharose se incub6 con 0,005 ml de la disoluci6n de IL-6R marcado on 35S preparada antes. La sustancia inmunoprecipitada se analiz6 mediante SDS-PAGE, y se estudiaron los sobrenadantes del cultivo de hibridoma que reaccionan con IL-6R. Como resultado, se estableci6 un clon de hibridoma positivo a la reacci6n PM-1. El anticuerpo de IL-6R PM-1 producido por el hibridoma PM-1 tiene el subtipo IgG1K.
La actividad inhibidora del anticuerpo producido por el hibridoma PM-1 frente a la uni6n de IL-6 al IL-6R humano se investig6 utilizando la linea celular de mieloma humano U266. Se prepar6 IL-6 recombinante humana con E. coli (Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41, 1988) y reactivo de Bolton-Hunter marcado con 125I (New England Nuclear, Boston, MA) (Taga et al., J. Exp. Med., 166:967, 1987).
Se cultivaron 4 x 105 celulas U266 a temperatura ambiente en presencia de un exceso en 100 veces de IL-6 no
marcada durante una hora, junto con 70% (en v/v) de sobrenadante del cultivo de hibridoma PM-1 y 14000 cpm de IL-6 marcada con 125I. Se extendi6 una muestra de 70 μl sobre 300 μl de FCS colocados en un tubo de polietileno de microcentrifuga de 400 μl, y despues de una centrifugaci6n se midi6 la radiactividad sobre las celulas.
Como resultado se demostr6 que los anticuerpos producidos por el hibridoma PM-1 inhibian la uni6n de IL-6 a IL-6R.
Ejemplo de referencia 4. Preparacion del anticuerpo del receptor de IL-6 de raton
Se prepararon anticuerpos monoclonales contra el receptor de IL-6 mediante el metodo descrito en la solicitud de patente japonesa nO 6-134617.
Siguiendo el metodo de Saito et al. (J. Immunol., 147, 168-173, 1993), se cultivaron celulas CHO que producen el receptor de IL-6 soluble de rat6n en medio IMDM que contenia FCS al 10%, y el receptor de IL-6 soluble de rat6n se purific6 del sobrenadante del cultivo utilizando el anticuerpo del receptor de IL-6 soluble de rat6n RS12 (vease iiii. Saito et al.) y un gel Affigel 10 inmovilizante de columna de afinidad (Biorad).
Se mezclaron 50 μg del receptor de IL-6 soluble de rat6n obtenido con adyuvante completo de Freund y se inyectaron por via intraperitoneal en ratas Wistar (Nihon Charles River Co.). Se administraron inmunizaciones de refuerzo con adyuvante incompleto de Freund despues de 2 semanas. En el dia 45O se sacrificaron las ratas y se emplearon aproximadamente 2 x 108 celulas esplenicas para la fusi6n celular con 1 x 107 celulas de mieloma P3U1 de rat6n mediante un metodo convencional utilizando PEG1500 al 50% (Berlinger Mannheim), tras lo cual los hibridomas se seleccionaron con medio HAT.
Tras anadir los sobrenadantes del cultivo de hibridoma a una inmunoplaca revestida con anticuerpo anti-IgG de rata de conejo (Cappel Co.), el receptor de IL-6 soluble de rat6n se hizo reaccionar con estos y se seleccionaron los hibridomas que producen anticuerpos contra el receptor de IL-6 soluble de rat6n mediante el metodo ELISA utilizando un anticuerpo anti-receptor de IL-6 de rat6n de conejo y anti-IgG de conejo de oveja marcado con fosfatasa alcalina. Los clones de hibridoma en los que se confirm6 la producci6n de anticuerpos se sometieron a una subselecci6n dos veces para obtener un unico clon de hibridoma. Este clon se denomin6 MR16-1.
La actividad neutralizante del anticuerpo producido mediante este hibridoma contra la transducci6n de senales de IL6 de rat6n se investig6 mediante la incorporaci6n de 3H-timidina utilizando celulas MH60.BSF2 (Matsuda et al., J. Immunol., 18, 951-956, 1988). Se anadieron celulas MH60.BSF2 a una placa de 96 pocillos a 1 x 104 celulas/200 μl/pocillo, y despues se anadi6 IL-6 de rat6n (10 pg/ml) y anticuerpo MR16-I o anticuerpo RS12 a 12,3-1000 ng/ml antes de cultivar a 37 OC, en CO2 al 5% durante 44 horas, tras lo cual se anadi6 3H-timidina (1 μCi/pocillo) y se midi6 la captaci6n despues de 4 horas. Como resultado, se descubri6 que el anticuerpo MR16-1 inhibe la captaci6n de 3Htimidina por las celulas MH60.BSF2.
Experimento 1. Establecimiento de una linea de celulas sinoviales derivadas de la artritis reumatoide cronica
- (1)
- Preparaci6n de celulas sinoviales
Se obtuvo tejido sinovial durante una operaci6n quirurgica en la articulaci6n de un paciente con artritis reumatoide cr6nica. El tejido sinovial se pic6 con tijeras y despues se someti6 a una disociaci6n enzimatica mediante una incubaci6n durante una hora a 37 OC con 5 mg/ml de colagenasa de tipo I (producto de Sigma Chemical Co.) y 0,15 mg/ml de ADNasa pancreatica bovina (producto de Sigma Chemical Co.) en IMDM (medio de Dulbecco modificado de Iscove), y se hizo pasar a traves de un tamiz para obtener celulas individuales. Estas celulas obtenidas entonces se cultivaron durante la noche en un matraz de cultivo utilizando IMDM que contenia FCS al 5%, tras lo cual las celulas no adherentes se retiraron para obtener las celulas sinoviales. Se realizaron 3 a 6 transferencias con las celulas sinoviales y se utilizaron en el siguiente experimento.
- (2)
- Producci6n de IL-6 por las celulas sinoviales
Las celulas sinoviales obtenidas como se describi6 anteriormente se suspendieron en medio de cultivo IMDM que contenia FCS al 5% (producto de Hyclone Laboratories Inc.), 10 U/ml de penicilina G, y estreptomicina 100 μg/ml a una cantidad de 3 x 103 celulas/pocillo, y despues se cultivaron en una placa de microvaloraci6n de 96 pocillos (producto de Falcon Co.), a la que se le anadi6 interleuquina-1β (IL-1β) humana, factor de necrosis tumoral α (TNFα) humano, factor del crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) AB humano y factor del crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) humano, a unas concentraciones de 0,01 o 0,1, 0,1 o 1, 1 o 10, y 1 o 10 ng/ml, respectivamente, y tras cultivar a 37 OC durante 72 horas se recogieron los sobrenadantes del cultivo.
Se anadieron 100 μl de anticuerpo anti-IL-6 humana MH166 (1 μg/ml) a una placa de ELISA de 96 pocillos (Immunoplate, producto de Nunc Co.) y se incub6 a 4 OC durante 24 horas. Cada pocillo posteriormente se lav6 con PBS que contenia Tween20 al 0,05%, y se bloque6 a 4 OC durante la noche con PBS que contenia BSA al 1%. Los sobrenadantes del cultivo obtenidos previamente entonces se diluyeron con PBS que contenia BSA al 1%, se anadieron a los pocillos, y despues se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de lavar con PBS que contenia Tween20 al 0,05%, se anadieron 2,5 μg/ml de anticuerpo anti-IL-6 humana policlonal de conejo
purificado con una columna de proteina A de 100 μl (producto de Pharmacia).
Despues de incubar a temperatura ambiente durante 2 horas, el anticuerpo anti-IL-6 policlonal de conejo unido a IL-6 en los sobrenadantes del cultivo se hace reaccionar con un anticuerpo anti-IgG de conejo unido a fosfatasa alcalina (producto de Tago Co.), y despues se anadi6 1 mg/ml de sustrato de fosfatasa alcalina Sigma104 (producto de Sigma Co.) segun las instrucciones adjuntas, y se midi6 la absorbancia a 405-600 nm con un lector de microplacas MPR A4 (producto de Tosoh Co.).
Se prepararon curvas de calibraci6n para la IL-6 recombinante durante cada ensayo para la conversi6n de los valores de DO de absorbancia a concentraciones de IL-6 humana. Los resultados se ofrecen en la tabla 1.
Tabla 1. Producci6n de IL-6 aumentada de celulas sinoviales
- Tratamiento (ng/ml)
- IL-6 (ng/ml)
- No tratadas
- 0,096 ± 0,012
- IL-1β
- 0,01 6,743 ± 0,178
- 0,1
- 17,707 ± 0,259
- TNFα
- 0,1 0,575 ± 0,008
- 1
- 1,688 ± 0,034
- PDGF-AB
- 1 0,163 ± 0,035
- 10
- 0,165 ± 0,016
- bFGF
- 1 0,181 ± 0,009
- 10
- 0,230 ± 0,019
Nota: Las celulas sinoviales se cultivaron durante 3 dias con IL-1β, TNFα, PDGF-AB o bFGF. Despues del cultivo, las concentraciones de IL-6 de los sobrenadantes se midieron mediante ELISA.
Los resultados demuestran que IL-1β estimula en gran medida la producci6n de IL-6 por las celulas sinoviales.
Ejemplo 1
- (1)
- Las celulas sinoviales obtenidas en el experimento 1 (3 x 103/pocillo) se suspendieron en medio de cultivo IMDM que contenia FCS al 5% (producto de Hyclone Laboratories, Inc.), 10 U/ml de penicilina G, y 100 μg/ml de estreptomicina, y despues se anadieron a una placa de microvaloraci6n de 96 pocillos (nO 3072, producto de Falcon Co.) y se cultivaron durante 5 dias en presencia de diversas concentraciones de IL-6 sola, de sIL-6R solo, o en presencia de ambos IL-6 y sIL-6R. A las 72 horas despues de comenzar a cultivar se anadi6 3H-timidina (producto de Amersham International plc) a cada pocillo a 1 μCi/pocillo, y despues de completar el cultivo se midi6 la radiactividad en las celulas con un contador de centelleo. Los resultados se muestran en la figura 1.
Como resultado, la captaci6n de 3H-timidina de las celulas sinoviales fue baja con IL-6 sola o con sIL-6R solo, y no se observ6 crecimiento de las celulas sinoviales. En contraste, en presencia de al menos una concentraci6n de 10 ng/ml de IL-6 y una concentraci6n 100 ng/ml de sIL-6R, se observ6 una captaci6n significativa de 3H-timidina comparado con el grupo control. Asi, aunque no apareci6 apenas un efecto de crecimiento en las celulas sinoviales con IL-6 sola, en presencia de ambos IL-6 y sIL-6R se produjo claramente un poderoso efecto de crecimiento de las celulas sinoviales.
- (2)
- Se cultivaron celulas sinoviales (3 x 103/pocillo) en presencia de una cantidad suficiente de IL-β para producir IL6 (0,1 ng/ml), 100 ng/ml de sIL-6R y 25 μg/ml de anticuerpo de IL-6 o 25 μg/ml de anticuerpo de IL-6R. A las 72 horas despues de iniciar el cultivo, se anadi6 3H-timidina a cada pocillo hasta 1 μCi/pocillo, y despues de completar el cultivo se midi6 la radiactividad en las celulas con un contador de centelleo. Los resultados se muestran en la figura 2. La adici6n de un anticuerpo de IL-6 o de un anticuerpo de IL-6R suprime completamente el crecimiento de celulas sinoviales aumentado por sIL-6R.
- (3)
- Se cultivaron celulas sinoviales (3 x 103/pocillo) en presencia de 100 ng/ml de IL-6 (producto de Genzyme Co.), 100 ng/ml de sIL-6R y 25 μg/ml de anticuerpo de IL-6 o de anticuerpo de IL-6R, que se obtuvieron en los ejemplos de referencia mencionados anteriormente. A las 72 horas despues del inicio del cultivo, se anadi6 3H-timidina a cada pocillo hasta 1 μCi/pocillo, y despues de completar el cultivo se midi6 la radiactividad en las celulas con un contador de centelleo. Los resultados se muestran en la figura 3. La adici6n del anticuerpo de IL-6 o del anticuerpo del IL-6R suprime completamente el crecimiento de celulas sinoviales aumentado por sIL-6R.
Ejemplo 2
Se investig6 el efecto supresor del anticuerpo del receptor de IL-6 sobre la aparici6n de la artritis utilizando un modelo de artritis de rat6n.
Una disoluci6n de colageno de tipo II bovino (Collagen Technology Research Group) (4 mg/ml) disuelta en una disoluci6n de acido acetico acuosa 0,1 N y adyuvante completo H37Ra (DIFCO) se mezclaron en cantidades equivalentes para preparar un adyuvante. Se inyectaron por via subcutanea 100 μl del adyuvante en la base de la cola de ratones DBA/1J hembras de 8 a 9 semanas de edad (Charles River Jap6n). Se inyectaron 100 μl mas 20 dias despues bajo la piel dorsal para inducir la artritis.
Se administr6 por via intravenosa el anticuerpo del receptor de IL-6 de rat6n MR16-1 a 2 mg por rat6n tras la primera sensibilizaci6n con colageno, y cada rat6n recibi6 una inyecci6n por via subcutanea de 0,5 mg mas (n = 5) cada semana a partir de entonces durante 7 semanas. Como control se utiliz6 el anticuerpo anti-DNP KH-5 (Chugai Seiyaku) del mismo isotipo (n = 5).
Se evalu6 la gravedad de la artritis basandose en un indice de artritis. La evaluaci6n se bas6 en una escala de 4 puntos para cada extremidad, con un total de 16 puntos por individuo. La pauta de evaluaci6n fue la siguiente:
0,5: Eritema observado en un sitio de la articulaci6n.
1: Eritema observado en dos sitios de la articulaci6n, o enrojecimiento pero sin hinchamiento del dorso del pie.
2: Hinchamiento moderado observado.
3: Hinchamiento grave del dorso del pie, pero no alcanza a todos los dedos.
4: Hinchamiento grave del dorso del pie y de los dedos.
Los resultados se muestran en la figura 4. La aparici6n de la artritis desde una etapa temprana de artritis fue evidentemente suprimida en el grupo al que se le administra el anticuerpo del receptor de IL-6, comparado con el grupo al que se le administra el anticuerpo control.
Por otra parte, los resultados de la medici6n de la titulaci6n de anticuerpos anti-colageno de tipo II en la sangre de los ratones mostr6 una reducci6n significativa desde la artritris en etapa temprana en el grupo al que se le administra el anticuerpo del receptor de IL-6, comparado con el grupo al que se le administra el anticuerpo control (figura 5).
Los ratones se sacrificaron en el dia 35 despues de la inmunizaci6n con colageno, y las patas traseras se fijaron con formaldehido al 20%. Despues se sometieron a una desmineralizaci6n en una disoluci6n de EDTA (pH 7,6) y una deshidrataci6n con alcohol. Posteriormente se envolvieron en parafina y se cortaron en secciones de 2 μm de espesor. Las secciones se tineron con hematoxilina y eosina, y se observaron bajo un aumento de 125x (figura 6). Como resultado, la invasi6n del tejido de granulaci6n hacia el cartilago y el hueso, es decir, la sinovitis proliferativa cr6nica, fue suprimida en el grupo al que se le administra el anticuerpo del receptor de IL-6, comparado con el grupo al que se le administra el anticuerpo control.
La IL-6 es una citoquina que induce la diferenciaci6n de celulas B en celulas productoras de anticuerpos. La IL-6 tambien estimula la proliferaci6n de celulas sinoviales en presencia del receptor de IL-6. Puesto que en los modelos de artritis por colageno de rat6n, el anticuerpo anti-receptor de IL-6 suprime significativamente las titulaciones de anticuerpos anti-colageno de tipo II en los dias 21 y 35 despues de la sensibilizaci6n con colageno, comparado con el grupo al que se le administra el anticuerpo control, se cree que la inhibici6n de la producci6n de anticuerpos por el anticuerpo anti-receptor de IL-6 es un factor responsable del efecto supresor sobre la artritis. Ademas, aunque no se observ6 supresi6n de la producci6n de anticuerpos a partir del 49O dia despues de la sensibilizaci6n con colageno, debido al hecho de que se observa un efecto supresor adecuado sobre la aparici6n de la artritis incluso durante este periodo, y de que la tinci6n con HE del tejido que rodea el hueso del tarso muestra la supresi6n de la invasi6n del tejido de granulaci6n hacia el cartilago y el hueso en el grupo al que se le administrael anticuerpo del receptor de IL6, comparado con el grupo control, tambien se cree que el efecto supresor del crecimiento sinovial contribuye al efecto inhibidor de la artritis.
Aplicabilidad industrial
Las celulas sinoviales procedentes de pacientes con artritis reumatoide cr6nica proliferan en presencia de IL-6 y de sIL-6R. El hecho de que el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide cr6nica contiene una cantidad suficiente de IL-6 y sIL-6R para inducir el crecimiento de celulas sinoviales sugiere que la transducci6n de senales por IL-6 esta implicada en el crecimiento an6malo de las celulas sinoviales en la artritis reumatoide cr6nica.
Por tanto, se ha demostrado de modo concluyente que una terapia para la artritis reumatoide cr6nica cuyo componente eficaz sea un antagonista de IL-6 segun la presente invenci6n suprime el crecimiento de celulas sinoviales en pacientes con artritis reumatoide cr6nica en presencia de IL-6 y sIL-6R y, por tanto, tiene un efecto terapeutico frente a la artritis reumatoide cr6nica. Por consiguiente, el antagonista de IL-6 de la invenci6n es util como agente terapeutico para la artritis reumatoide cr6nica en la que se produce un crecimiento an6malo de las celulas sinoviales.
Claims (3)
- REIVINDICACIONES1.-El uso de un antagonista de interleuquina-6 para la preparaci6n de una composici6n farmaceutica para inhibir el crecimiento an6malo de celulas sinoviales, en el que el antagonista de interleuquina es un anticuerpo humanizado contra un receptor de interleuquina-6 humano.
- 2.-El uso segun la reivindicaci6n 1, en el que el anticuerpo humanizado contra un receptor de interleuquina-6 humano es un PM-1 humanizado.
- 3.-Una composici6n farmaceutica que comprende un anticuerpo humanizado contra un receptor de interleuquina-6 para su uso en el tratamiento de la artritis reumatoide cr6nica.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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2018
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