KR20030087655A - 소아 만성 관절염 관련질환 치료제 - Google Patents

소아 만성 관절염 관련질환 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로 하는 소아 만성 관절관련 질환, 예를 들면 소아 만성 관절염, 스틸병 등의 치료제에 관한 것이다.

Description

소아 만성 관절염 관련질환 치료제{REMEDIES FOR INFANT CHRONIC ARTHRITIS-RELATING DISEASES}
IL-6는 B세포 자극인자 2(BSF2) 또는 인터페론 β2라고도 호칭된 사이토카인 이다. IL-6는, B 임파구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로 발견되었고 (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76), 그 후, 여러가지 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인인 것이 밝혀졌다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology(1993) 54, 1-78). IL-6는, T 임파구계 세포의 성숙화를 유도하는 것이 보고되어 있다.(Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258).
IL-6는, 세포 위에서 두 종류의 단백질을 통하여 그의 생물학적 활성을 전달한다. 하나는, IL-6가 결합하는 분자량 약 80kD의 리간드 결합성 단백질인 IL-6수용체이다(Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981, Yamasaki, K. et al., Science(1987) 241, 825-828). IL-6수용체는, 세포막을 관통하여 세포막 위에서 발현하는 막 결합형 외에, 주로 그 세포외 영역으로부터 이루어지는 가용성 IL-6 수용체로도 존재한다.
또 하나는, 비리간드 결합성의 신호 전달에 관계하는 분자량 약 130kD의 막 단백질 gp130이다. IL-6와 IL-6수용체는 IL-6/IL-6수용체 복합체를 형성하고, 이어서 gp130과 결합함으로서, IL-6의 생물학적 활성이 세포 내로 전달된다(Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581).
IL-6 안타고니스트는, IL-6의 생물학적 활성의 전달을 저해하는 물질이다. 이제까지, IL-6에 대한 항체(항IL-6 항체), IL-6수용체에 대한 항체(항IL-6수용체 항체), gp130에 대한 항체(항gp130 항체), IL-6 개변체, IL-6 또는 IL-6수용체 부분 펩티드 등이 알려져 있다.
항IL-6수용체 항체에 관해서는, 몇개의 보고가 있다(Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630, 국제특허출원 공개번호 WO 95-09873, 프랑스 특허출원 공개번호 FR 2694767, 미국 특허 제521628호). 그 중 하나인 마우스 항체 PM-1(Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906)의 상보성 결정 영역(CDR; complementarity determining region)을 인간 항체로 이식함으로서 얻어진 인간형화 PM-1 항체가 알려져 있다(국제특허출원 공개번호 W0 92-19759).
소아 만성 관절염(Chronic Arthritides Diseases of Childhood)은, 16세 미만에 발병하는 만성관절염을 주체로 하는 질환으로, 소아에서 일어나는 교원병(膠原病) 중 가장 많은 질환이다. 성인의 만성관절 류마티스(Rheumatoid Arthritis (RA))와 달리 homogeneous한 질환이라고 할 수 없는 여러가지 병형(病型)을 갖기때문에, 성인의 만성 관절 류마티스와는 다른 질환으로 취급되는 경향이 있다.
소아 만성 관절염의 명칭으로서는, 일본에서는 미국의 진단기준에 따른 「연소성(年少性) 관절 류마티스(Juvenile Rheumatoid Arthritis(JRA)」가 사용되어 왔지만, 유럽에서는 주로 Juvenile Chronic Arthritis(JCA)가 사용되고 있었다. 최근에는 Idiopathic Chronic Arthritis(ICA)나 Juvenile Idiopathic Arthritis(JIA) 등의 명칭도 자주 사용되고 있다.
소아 만성 관절염의 병형은 여러가지 분류가 되어 있고, 아메리카 류마티스협회(American College of Rheumatology(ACR))에서는 16세 미만의 소아에서 발병하는, 6주간 이상 지속하는 관절염 질환으로서 1) 전신형(Systemic onset JRA), 2) 다관절형(Polyarticular), 3) 소관절형(Pauciarticular)의 3가지 병형으로 분류되어 있다(ARA 분류)(JRA Criteria Subcommittee of the Diagnostic and Therapeutic Criteria Committee of the American Rheumatism Association Arthritis Rheum 20(Suppl) 195, 1977). 또한, 유럽에서는 European League Against Rheumatism (EULAR)이, 관절염의 지속시간이 3개월 이상이라는 점, 또는 건선, 강직성 척추염 등을 원인으로 하는 관절염은 제외하는 점 등이 상기 ARA 분류와는 다르지만, 3 병형은 동일한 분류를 행하고 있다(Bulletin 4, Nomenclature and classification of Arthritis in Children. Basel, National Zeitung AG, 1977).
최근 이 분류를 재인식하려는 움직임이 있고, International League of Associations for Rheumatology(ILAR)는 1995년에 Idiopathic Arthritides of Childhood의 분류안을 제안하고(Fink CW, Proposal for the development ofclassification criteria for Idiopathic Arthritides of childhood. J. Rheumatol., vol.22, 1566 (1995)), 또한 1997년에는 그 개정을 ILAR 안으로서 제안하고 있다(Southwood TR, Classifying childhood arthritis. Ann. Rheum. Dis. Vol.56, 79(1997)). 이 분류에서는, 1) 전신형 관절염 (Systemic Arthritis), 2) 다관절형(RF 양성형)(Polyarthritis RF positive), 3) 다관절형 (RF 음성형) (Polyarthritis RF negative), 4) 소관절형 (Oligoarthritis), 5) 진전형 소관절형 (Extended oligoarthritis), 6) 부착부염 관련 관절염 (Enthesitis related Arthritis), 7) 건선 관련 관절염 (Psoriatic Arthritis), 8) 기타로 분류되어 있다.
또한 본 발명자들은, 소아 만성 관절염을,
1) 소아 1차성 만성 관절염 (Primary Chronic Arthritides of Childhood)
(1) SPRASH 증후군(SPRASH syndrome)(SPRASH: spiking fever, pericarditis , rash, arthritis, splenomegaly, hepatomegaly)
이장열(弛張熱)과 피부 발진에서 시작하여, 장막염, 간비종을 보이며, 동시에 또는 나중에 관절염을 함께 일으키지만, 관절염을 볼 수 없는 경우도 있다.
(2) 소아 특발성 만성 관절염(Idiopathic Chronic Arthritides of Childhood)
기초 질환이 없고, 관절염이 병태의 중심이다.
a) 류마토이드 인자(RF) 양성형
b) 항핵항체(ANA) 양성형
c) RF/ANA 음성형
2) 소아 2차성 만성 관절염(Secondary Chronic Arthritides of Childhood)
유전성, 비유전성의 원질환에 수반한 관절염이 발현한다.
로 분류하는 방법을 제안하고 있다(橫田俊平, 「소아 만성 관절염의 최근 치료법의 진보」, 류마티스, 제39권, 860, (1999)).
소아 만성 관절염에는 각종 사이토카인이 관여하고 있는 것으로 보고되어 있다. 특히 염증성 사이토카인인 IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α와, 항염증성 사이토카인인 IL-1γa(IL-1수용체 안타고니스트), IL-10, IL-13, sTNFR(가용성 TNF 수용체)의 불균형이 질환과 관련하고 있는 것으로 생각되고 있다.
소아 만성 관절염의 치료로서는, 비스테로이드계 항염증제, 부신피질 스테로티드제, 항류마티스제(금제 등), 면역억제제, 메소트렉세이트(MTX 등)가 이용되어 왔다. 그러나, 환자에 따라 그 치료 효과는 일정하지 않으므로, 더욱 유효한 치료법의 개발이 요망되고 있다.
스틸병(Still's disease)은, 1897년 영국의 소아과 의사 스틸에 의하여 보고되었던, 성인의 만성 관절 류마티스와는 명확히 다른 임상 형상을 갖는 질환으로서 보고된 소아 내지 성인(성인에서는 특히 청년기)에 발병하는 질환으로, 발열, 홍반, 관절염, 장막염 등을 주 증상으로 한다. 그 중에서 성인 발병예를 성인 스틸병(Adult onset Still's disease)으로 호칭하고 있다. 스틸병에서는 류마토이드 인자는 통상 음성이다.
스틸병은 소아에 있어서는, 16세 미만의 소아에 발생하는 만성 관절염인 연소성 관절 류마티스(Juvenile Rheumatoid Arthritis(JRA), JCA(Juvenile Chronic Arthritis), Juvenile Idiopathic Arthritis(JIA)) 중에서 전신 발병형(Systemic Type)의 다른 이름이다. 스틸병의 원인에 대해서는 바이러스 등의 환경 요인이나, HLA 등의 숙주 요인 및 면역 이상 등에 대한 보고가 있으나, 아직 명확하지 않다.
성인 스틸병과 소아의 스틸병은 발병 연령 이외에 약간의 임상 형상의 다른 점은 있지만 거의 동일 질환으로 생각되고 있다. 소아의 스틸병은 상술한 바와 같이 전신 발병형의 JRA을 가리키는 것이지만, JRA와 성인의 관절 류마티스 (Rheumatoid Arthritis, (RA))는 임상적으로도 다른 점이 많으므로, 다른 질환으로 취급되고 있고, 이 사실로부터도 성인 스틸병은 류마티스성 질환 중에서 독립한 질환 단위로서 취급되는 일이 많다.
스틸병의 진단 기준으로는, Yamaguchi(Journal of Rheumatology. 19(3):424-430, 1992), Reginato(Seminars in Arthritis & Rheumatism. 17(1)39-57, 1987), Cush(Rheumatology Grand Rounds, University of Pittsburgh Medical Center; Jan. 30, 1984), Goldman(Southern Medical Journal 73:555-563, 1980)들의 기준이 알려져 있다.
스틸병과 사이토카인과의 관계에 대해서는, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, TNF-α, IFN-γ 등의 사이토카인과의 관계가 보고되어 있고, 그 중에서도 IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-γ 등의 염증성 사이토카인과 스틸병의 병태에는 어떤 관련이 있는 것으로 생각되고 있다.
IL-6에 관해서는, de Benedetti 들이 소아 스틸병에서 혈청 중 IL-6치가 상승하고 있다는 보고(Arthritis Rheum. Vol.34, 1158, 1991)나, 마찬가지로 de Benedetti 들에 의하여, 소아 스틸병 환자의 혈청 중에는 IL-6/가용성 IL-6 수용체 (sIL-6R) 복합체가 많이 존재하고, 이 복합체 수준과 CRP 치에 상관 관계가 보인다는 보고(J.Clin. Invest. Vol.93, 2114, 1994)가 있다. 또한, Rooney 들은 소아 스틸병 환자에서는 혈장 중의 IL-6와 TNF-α의 수준이 상승하고 있다는 보고 (Br J Rheumatol. Vol.34 454, 1995)를 하고 있다.
스틸병의 치료법으로는, 비스테로이드계 항염증제, 부신피질 스테로이드제, 항류마티스제(금제 등), 면역억제제, γ-글로불린제제, 메소트렉세이트(MTX 등)가 이용되어 왔다. 그러나, 환자에 따라서 그 치료 효과는 일정하지 않으므로, 더욱 유효한 치료법의 개발이 요망되고 있다.
본 발명은 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 소아 만성 관절염 관련질환 치료제에 관한 것이다. 소아 만성 관절염 관련질환에는, 소아 만성 관절염 및 스틸병(Still's disease) 등이 포함된다.
따라서, 본 발명은, 종래의 소아 만성 관절염 관련질환 치료제와는 다른 타입의 신규한 소아 만성 관절염 관련질환 치료제를 제공하도록 하는 것이다. 본 발명에 있어서, 소아 만성 관절염 관련질환에는, 소아 만성 관절염 및 스틸병이 포함된다.
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위하여, 여러가지로 검토한 결과, 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트가, 소아 만성 관절염 관련질환 치료 효과를 갖는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은, 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하여 이루어지는 소아 만성 관절염 관련질환 치료제를 제공한다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 소아 만성 관절염 치료제를 제공한다.
본 발명은 또한, 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 스틸병 치료제를 제공한다.
상기 IL-6 안타고니스트는, 바람직하기는 IL-6 수용체에 대한 항체이고, 바람직하기는 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체 또는 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체이다. 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체로서는 PM-1 항체를 들 수 있고, 또한 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체로서는 MR16-1 항체를 들 수 있다.
상기의 항체는, 바람직하기는 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간 항체로서, 예를 들면 인간형화 PM-1 항체이다.
본 발명의 치료제에 의한 치료 대상이 되는 소아 만성 관절염으로는, 앞서의 ARA, EULAR, ILAR 및 발명자들의 분류의 모든 질환이 포함된다. 혈청학적 진단법의 진보, 치료법의 진보에 의하여, 현재 소아 만성 관절염의 병형 분류에 대해서는 세계적 규모로 재인식이 진행되고 있으므로, 이른바 「병형 분류의 혼란기」에 있다고 말할 수 있지만, 본 발명의 치료제의 바람직한 치료 대상으로는, ARA 분류에서는 전신형, 다관절형, 소관절형, EULAR 분류에서는 전신형, 다관절형, 소관절형, ILAR 분류에서는 전신형, 다관절형(RF 양성형), 다관절형(RF 음성형), 소관절형, 진전형 소관절형, 본 발명자들의 분류에서는, 소아 1차성 만성 관절염(SPRASH 증후군, 소아 특발성 만성 관절염(a. 류마토이드 인자(RF) 양성형, b. 항핵항체(ANA)양성형, c. RF/ANA 음성형))이고, 특히 바람직한 치료대상으로서는, ARA 분류에서는 전신형, 다관절형, EULAR 분류에서는 전신형, 다관절형, ILAR 분류에서는 전신형, 다관절형(RF 양성형), 다관절형(RF 음성형), 진전형 소관절형, 본 발명자들의 분류에서는, 소아 1차성 만성 관절염(SPRASH 증후군, 소아 특발성 만성 관절염 (a. 류마토이드 인자(RF) 양성형, b. 항핵항체(ANA) 양성형))이다. 또한 가장 바람직한 치료 대상으로서는 ARA 분류에서는 전신형, 다관절형, EULAR 분류에서는 전신형, 다관절형, ILAR 분류에서는 전신형, 다관절형(RF 양성형), 진전형 소관절형, 본 발명자들의 분류에서는, 소아 1차성 만성 관절염(SPRASH 증후군, 소아 특발성 만성 관절염(a. 류마토이드 인자(RF) 양성형)을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 안타고니스트는, 소아 만성 관절염 관련질환 치료효과를 나타내는 것이라면, 그 유래, 종류 및 형상을 불문한다.
IL-6 안타고니스트는, IL-6에 의한 신호 전달을 차단하고, IL-6의 생물학적 활성을 저해하는 물질이다. IL-6 안타고니스트는, 바람직하기는 IL-6, IL-6수용체 및 gp130의 어느 결합에 대하여 저해 작용을 갖는 물질이다. IL-6 안타고니스트로서는, 예를 들면 항IL-6 항체, 항IL-6 수용체 항체, 항gp130 항체, IL-6 개변체, 가용성 IL-6수용체 개변체, 또는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드 및, 이들과 동일한 활성을 나타내는 저분자 물질을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항 IL-6 항체는, 공지의 수단을 사용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 IL-6항체로서는, 특히 포유 동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에서 생산되는 것, 및 유전자공학적 방법에 의하여 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환한 숙주에서 생산되는 것이 있다. 이 항체는 IL-6와 결합함으로서, IL-6의 IL-6 수용체로의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포 내로의 전달을 차단한다.
이와 같은 항체로서는, MH166(Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956)이나 SK2 항체(Sato, K. et al., 제 21회 일본면역학회 총회, 학술기록(1991) 21, 166) 등을 들 수 있다.
항IL-6 항체 생산 하이브리도마는, 기본적으로는 공지기술을 사용하여, 이하와 같이 하여 제조할 수 있다. 즉, IL-6을 감작 항원으로서 사용하여, 이것을 통상의 면역 방법에 따라서 면역하여, 얻어진 면역 세포를 통상의 세포융합법에 따라서 공지의 모세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의하여, 모노클로날 항체 생산 세포를 스크리닝함으로서 제조할 수 있다.
구체적으로는, 항IL-6 항체를 제조하기 위해서는, 다음과 같이 하면 좋다. 예를 들어, 항체 취득의 감작항원으로서 사용되는 인간 IL-6는, Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541, 혹은 Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688에 개시된 IL-6 유전자/아미노산 서열을 사용함으로서 얻어진다.
IL-6의 유전자 서열을 공지의 발현 벡터계에 삽입하여 적당한 숙주 세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주 세포 중 또는, 배양 상청 중으로부터 목적하는 IL-6 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 IL-6 단백질을 감작 항원으로 사용하면좋다. 또한, IL-6 단백질과 다른 단백질과의 융합 단백질을 감작항원으로서 사용해도 좋다.
본 발명에서 사용되는 항IL-6수용체 항체는, 공지의 수단을 사용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항IL-6수용체 항체로서, 특히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에서 생산되는 것, 및 유전자공학적 방법에 의하여 항체 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환한 숙주에서 생산되는 것이 있다. 이 항체는, IL-6수용체와 결합함으로서, IL-6의 IL-6수용체로의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포 내로의 전달을 차단한다.
이와 같은 항체로서는, MR16-1항체(Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), PM-1항체(Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 항체, AUK64-7 항체 혹은 AUK146-15 항체(국제특허출원 공개번호 WO 92-19759호) 등을 들 수 있다. 이것들 중에서, 특히 바람직한 항체로서 PM-1항체를 들 수 있다.
또한, PM-1항체 생산 하이브리도마 세포주는, PM-1으로서, 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(현 명칭; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1-3)에 1990년 7월10일에, FERM BP-2998로 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁되어 있다. 또한, MR16-1항체 생산 하이브리도마 세포주는, 래트-마우스 하이브리도마 MR16-1로서, 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1-3)에 1997년 3월13에, FERM BP-5875로 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁되어 있다.
항IL-6수용체 모노클로날 항체 생산 하이브리도마는, 기본적으로는 공지 기술을 사용하여, 이하와 같이 하여 제조할 수 있다. 즉, IL-6수용체를 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라 면역하여, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의하여 공지의 모세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의하여, 모노클로날 항체 생산 세포를 스크리닝함으로서 제조할 수 있다.
구체적으로는, 항IL-6수용체 항체를 제조하기 위해서는 다음과 같이 하면 좋다. 예를 들어, 항체 취득의 감작항원으로서 사용되는 인간 IL-6수용체는, 유럽특허출원 공개번호 EP 325474에, 마우스 IL-6수용체는 일본 특허출원 공개번호 1991-155795호에 개시된 IL-6수용체 유전자/아미노산 서열을 사용함으로서 얻어진다.
IL-6수용체 단백질은, 세포막 위에 발현해 있는 것과 세포막으로부터 이탈하여 있는 것(가용성 IL-6수용체)(Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676)의 2 종류가 있다. 가용성 IL-6수용체 항체는 세포막에 결합해 있는 IL-6 수용체의 실질적으로 세포 외 영역으로 구성되어 있고, 세포막 관통 영역 또는 세포막 관통 영역과 세포 내 영역이 결손하여 있는 점에서 막 결합형 IL-6수용체와 다르다. IL-6수용체 단백질은, 본 발명에서 사용되는 항IL-6수용체 항체 제조의 감작항원으로서 사용될 수 있는 한, 어떤 IL-6수용체를 사용하여도 좋다.
IL-6수용체의 유전자 서열을 공지의 발현 벡터계에 삽입하여 적당한 숙주 세포를 형질전환시킨 후, 그의 숙주 세포 중 또는 배양 상청 중으로부터 목적하는IL-6수용체 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 IL-6수용체 단백질을 감작항원으로서 사용하면 좋다. 또한, IL-6수용체를 발현하고 있는 세포나 IL-6수용체 단백질과 다른 단백질과의 융합 단백질을 감작항원으로서 사용하여도 좋다.
인간 IL-6수용체를 코드하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pIBIBSF2R를 함유하는 대장균(E. coli)은, 1989년 1월 9일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에, HB101-pIBIBSF2R로서, 기탁번호 FERM BP-2232로 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁되어 있다.
본 발명에 사용되는 항gp130 항체는, 공지의 수단을 사용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을수 있다. 본 발명에 사용되는 항gp130 항체로서, 특히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에 생산되는 것, 및 유전자공학적 방법에 의해 항체 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환한 숙주에서 생산되는 것이 있다. 이 항체는 gp130과 결합함으로서, IL-6/IL-6수용체 복합체의 gp130으로의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포 내로의 전달을 차단한다.
이와 같은 항체로서는, AM64항체(일본국 특허공개 제1991-219894호), 4B11항체 및 2H4 항체(미국 특허 제5571513호) B-S12 항체 및 B-P8 항체(일본국 특허공개 제1996-291199호) 등을 들 수 있다.
항gp130 모노클로날 항체 생산 하이브리도마는, 기본적으로는 공지 기술을 사용하고, 이하와 같이 하여 제조할 수 있다. 즉, gp130을 감작항원으로 사용하고, 이것을 통상의 면역 방법에 따라서 면역하고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포융합법에 의하여 공지의 모세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의하여, 모노클로날 항체 생산 세포를 스크리닝함으로서 제작할 수 있다.
구체적으로는, 모노클로날 항체를 제작하기 위해서는 다음과 같이 하면 좋다. 예를 들면, 항체 취득의 감작항원으로서 사용되는 gp130은, 유럽 특허출원 공개번호 EP 411946에 개시된 gp130 유전자/아미노산 서열을 사용함으로서 얻을 수 있다.
gp130의 유전자 서열을 공지의 발현 벡터계에 삽입하여 적당한 숙주 세포를 형질전환시킨 후, 그의 숙주 세포 중 또는 배양 상청 중으로부터 목적하는 gp130 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 gp130 수용체 단백질을 감작항원으로서 사용하면 좋다. 또한, gp130를 발현하고 있는 세포나 gp130 단백질과 다른 단백질과의 융합 단백질을 감작항원으로서 사용하여도 좋다.
감작항원으로 면역되는 포유동물로서는, 특히 한정되는 것은 없으나, 세포 융합에 사용하는 모세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 설치류 동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터 등이 사용된다.
감작항원을 동물에 면역하는데는, 공지의 방법에 따라 행해진다. 예를 들어, 일반적인 방법으로서, 감작항원을 포유 동물의 복강 내 또는, 피하에 주사함으로서 행해진다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)이나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석, 현탁한 것을 필요에 따라 통상의 보조제 (adjuvant) , 예를 들어, 프로인트 완전 보조제를 적당량 혼합하고, 유화 후, 포유 동물에 매 4~21일마다 수회 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 감작항원 면역시에적당한 담체를 사용할 수 있다.
이와 같이 면역하여, 혈청 중에 원하는 항체 수준이 상승하는 것을 확인한 후, 포유 동물로부터 면역 세포를 적출하여, 세포 융합에 제공한다. 세포 융합에 제공되는 바람직한 면역 세포로서는, 특히 비장(spleen) 세포를 들 수 있다.
상기 면역 세포와 융합되는 다른 쪽의 모세포로서의 포유동물의 골수종 (myeloma) 세포는, 이미, 공지의 여러가지 세포주, 예를 들어, P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519), MPC-11(Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978) 276, 269-270), F0(de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods(1980) 35, 1~21), S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 등이 적당하게 사용된다.
상기 면역 세포와 골수종 세포의 세포 융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들어, 밀스테인 들의 방법(Kohler. G. and Milstein, C. , Methods Enzymol. (1981) 73, 3~46) 등에 준하여 행할 수 있다.
더욱 구체적으로는, 상기 세포 융합은 예를 들어, 세포융합 촉진제의 존재 하에 통상의 영양배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되며, 또한 필요에 따라 융합의 효율을 높이기 위하여 디메틸술폭사이드 등의 보조제를 첨가 사용할 수도 있다.
면역 세포와 골수종 세포와의 사용 비율은, 예를 들어, 골수종 세포에 대하여 면역 세포를 1 ~ 10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들어 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이런 종류의 세포 배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용 가능하고, 또한 소 태아 혈청 (FCS) 등의 혈청 보액을 병용할 수도 있다.
세포 융합은, 상기 면역 세포와 골수종 세포와의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가열한 PEG 용액, 예를 들어, 평균 분자량 1000 ~ 6000 정도의 PEG 용액을 통상, 30 ~ 60% (w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로서 목적하는 융합 세포(하이브리도마)가 형성된다. 이어서, 적당한 배양액을 순차적으로 첨가하고, 원심분리하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로서 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포 융합제 등을 제거할 수 있다.
이 하이브리도마는, 통상의 선택 배양액, 예를 들어, HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및, 티미딘을 함유하는 배양액)에서 배양함으로서 선택된다. 이 HAT 배양액에서의 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하기에 충분한 시간, 통상 수일 ~ 수주간 계속한다. 이어서, 통상의 한계 희석법을 실시하고, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 클로닝이 행하여진다.
또한, 인간 이외의 동물에 항원을 면역하여 상기 하이브리도마를 얻는 것 외에, 인간 임파구를 생체외(in vitro)에서 원하는 항원 단백질 또는 항원 발현 세포로 감작하고, 감작 B 임파구를 인간 골수종 세포, 예를 들어 U266과 융합시켜서,원하는 항원 또는 항원 발현 세포로의 결합 활성을 가지는 원하는 인간 항체를 얻을 수도 있다(일본국 특허공고 제1989-59878호 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 가지는 형질전환 동물에 항원 또는 항원 발현 세포를 투여하고, 전술한 방법에 따라 원하는 인간 항체를 취득하여도 좋다(국제특허출원 공개번호 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조).
이와 같이 하여 제작되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 통상의 배양액 중에서 계대 배양하는 것이 가능하고, 또한 액체 질소 중에서 장기 보존하는 것이 가능하다.
이 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 취득하기 위해서는, 이 하이브리도마를 통상의 방법에 따라서 배양하여, 그의 배양 상청으로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여해서 증식시켜서, 그의 복수(腹水)로서 얻는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은, 고순도의 항체를 얻는데 적합하고, 한편 후자의 방법은 항체의 대량 생산에 적합하다.
예를 들어, 항IL-6수용체 항체 생산 하이브리도마의 제조는, 일본국 특허공개 1991-139293호에 개시된 방법에 의하여 행할 수 있다. 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1-3)에 1990년 7월10에, FERM BP-2998로 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁된 PM-1 항체 생산 하이브리도마를 BALB/c 마우스 복강 내에 주입하여 복수를 얻어서, 이 복수로부터 PM-1 항체를 정제하는 방법이나, 이 하이브리도마를 적당한 배지, 예를 들어, 10%소태아 혈청, 5% BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim 제조) 함유 RPMI1640 배지, 하이브리도마 SFM 배지(GIBCO-BRL 제조), PFHM-Ⅱ 배지(GIBCO-BRL 제조) 등에서 배양하여, 그 배양 상청으로부터 PM-1 항체를 정제하는 방법으로 행할 수 있다.
본 발명에는, 모노클로날 항체로서, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡터에 병합하고, 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 사용하여 생산시킨 재조합형 항체를 사용할 수 있다(예를 들어, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조).
구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 생산하는 세포, 예를 들어 하이브리도마로부터 항체의 가변(V) 영역을 코드하는 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는 공지의 방법, 예를 들어 구아니딘 초원심법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 등에 의하여 전 RNA를 조제하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia 제조) 등을 사용하여 mRNA를 조제한다. 또한, QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia 제조)을 사용함으로서 mRNA를 직접 조제할 수 있다.
얻어진 mRNA으로부터 역전사효소를 사용하여 항체 V영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은, AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit 등을 사용하여 행할 수 있다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 행하는데는 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech 제조) 및 PCR을 사용한 5'-RACE법(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8998~9002; Belyavsky, A. et al.,Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)를 사용할 수 있다. 얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하여, 벡터 DNA와 연결한다. 또한, 이것으로부터 재조합 벡터를 작성하고, 대장균 등에 도입하고, 콜로니를 선택하여 원하는 재조합형 벡터를 조제한다. 목적하는 DNA의 염기서열을 공지의 방법, 예를 들어, 데옥시법에 의하여 확인한다.
목적하는 항체의 V 영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이것을 원하는 항체 정상 영역(C 영역)를 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 병합한다. 또는, 항체의 V 영역을 코드하는 DNA를, 항체 C 영역의 DNA를 함유하는 발현 벡터에 병합하여도 좋다.
본 발명에서 사용되는 항체를 제조하기 위해서는, 후술하는 바와 같이 항체 유전자를 발현 제어 영역, 예를 들어, 인핸서, 프로모터의 제어 하에서 발현하는 발현 벡터에 병합한다. 다음에, 이 발현 벡터에 의하여 숙주 세포를 형질 전환하여, 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명에서는, 인간에 대한 이종(異種) 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라(chimeric) 항체, 인간형화(humanized) 항체, 인간(human) 항체를 사용할 수 있다. 이들의 개변 항체는, 이미 알고 있는 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
키메라 항체는, 상기와 같이 하여 얻어진 항체 V 영역을 코드하는 DNA를 인간 항체 C 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 병합하여 숙주에 도입하여 생산시킴으로서 얻을 수 있다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023, 국제특허출원 공개번호 WO 92-19759 참조). 이미 알려진 이 방법을 사용하여, 본 발명에 유용한 키메라 항체를 얻을 수 있다.
예를 들어, 키메라 PM-1 항체의 L쇄 및 H쇄의 V 영역을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드는, 각각 pPM-k3 및 pPM-h1으로 명명되고, 이 플라스미드를 가지는 대장균은, National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited에 1991년 3월 12일에, 각각 NCIMB 40366 및 NCIMB 40362로 부다페스트 조약에 기초하여 국제기탁되었다.
인간형화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체로도 불리우며, 인간 이외의 포유동물, 예를 들어, 마우스 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 인간 항체의 상보성 결정 영역으로 이식한 것으로, 그의 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023, 국제특허출원 공개번호 WO 92-19759 참조).
구체적으로, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역 (FR; framework region)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 수개의 올리고누클레오티드로부터 PCR법에 의하여 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 병합하고, 이것을 숙주에 도입하여 생산시킴으로서 얻어진다(유럽 특허출원 공개번호 EP 239400, 국제특허출원 공개번호 WO 92-19759 참조).
CDR를 통하여 연결되는 인간 항체의 FR은, 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성한 것이 선택된다. 필요에 따라서, 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역의 프레임워크영역의 아미노산을 치환하여도 좋다(Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851~856).
키메라 항체, 인간형화 항체에는, 인간 항체 C 영역이 사용된다. 인간 항체 C 영역으로서는, Cγ를 들수 있는데, 예를 들어, Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4를 사용할 수 있다. 또한, 항체 또는 그의 생산의 안정성을 개선하기 위하여, 인간 항체 C 영역을 수식하여도 좋다.
키메라 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변 영역과 인간 항체 유래의 C 영역으로 이루어지고, 인간형화 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정 영역과 인간 항체 유래의 프레임워크 영역 및 C 영역으로 이루어져서, 인간 체내에서 항원성이 저하되므로, 본 발명에 사용되는 항체로서 유용하다.
본 발명에 사용된 인간형화 항체의 바람직한 구체예로서는, 인간형화 PM-1 항체를 들 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO 92-19759 참조).
또한, 인간 항체의 취득방법으로서는 앞서 기술한 방법 외에, 인간 항체 라이브러리를 사용하여, 패닝에 의하여 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변 영역을 단일가닥 항체(scFv)로서 파지디스플레이법에 의하여 파지의 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 것도 가능하다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 밝혀지면, 이 서열로 적당한 발현 벡터을 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 이미 공지되어 있고, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388을 참고할 수 있다.
상기와 같이 구축한 항체 유전자는, 공지의 방법에 의하여 발현시켜 취득할 수 있다. 포유류 세포의 경우, 통용되는 유용한 프로모터, 발현되는 항체 유전자, 그의 3'측 하류에 폴리A 신호를 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 그것을 포함하는 벡터에 의하여 발현시킬 수 있다. 예를 들어 프로모터/인핸서로서는, 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서 (human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 들 수 있다.
또한, 그 외에 본 발명에서 사용되는 항체 발현에 사용할 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로바이러스, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 시미안바이러스 40(SV40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서 또는 인간 신장인자-1α(human elongation factor 1α;HEF1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인핸서를 사용하면 좋다.
예를 들어, SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mulligan 들의 방법 (Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108~114), 또한 HEF1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mizushima 들의 방법 (Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 따르면 용이하게 실시할 수 있다.
대장균의 경우, 통용되는 유용한 프로모터, 항체 분비를 위한 신호 서열, 발현시킬 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜서 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 프로모터로서는, lacZ 프로모터, araB 프로모터를 들 수 있다. lacZ 프로모터를 사용하는 경우, Ward 들의 방법(Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544~546; Ward,E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422~2427), araB 프로모터를 사용하는 경우 Better 들의 방법(Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041~1043)에 따르면 좋다.
항체 분비를 위한 신호 서열로서는, 대장균의 외질(periplasm)에서 생산시키는 경우, pelB 신호서열 (Lei, S. P. et al J. Bacteriol (1987) 169, 4379~4383)을 사용하면 좋다. 외질에서 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절히 리폴드(refold)하여 사용한다(예를 들어, WO 96/30394를 참조).
복제 기원으로서는, SV40, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스(BPV) 등에서 유래한 것을 사용할 수 있고, 또한, 숙주 세포계에서 유전자 카피수 증폭을 위하여, 발현 벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드 포스포트랜스페라제(APH) 유전자, 티미딘 키나제(TK) 유전자, 대장균 키산틴구아닌 포스포리보실 트랜스페라제(Ecogpt) 유전자, 디히드로 엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위하여, 임의의 생산계를 사용할 수 있다. 항체 제조를 위한 생산계는, 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo)의 생산계가 있다. 생체 외의 생산계로서는, 진핵 세포를 사용하는 생산계나 원핵 세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.
진핵 세포를 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 또는 진균 세포를 사용하는 생산계가 있다. 동물 세포로서는, (1) 포유류 세포, 예를 들어, CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), Hela, Vero 등, (2) 양생류 세포로는, 예를 들어, 아프리카 발톱개구리 난모세포, 또는 (3) 곤충 세포, 예를 들어, sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 식물 세포로서는, 니코티아나·타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져 있고, 이것을 유합조직(callus) 배양하면 좋다. 진균 세포로서는, 효모, 예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 예를 들어, 사카로마이세스·세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들어, 아스퍼길러스(Aspergillus) 속, 예를 들어 아스퍼길러스·니거(Aspergillus niger) 등이 알려져 있다.
원핵 세포를 사용하는 경우, 세균 세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균 세포로는, 대장균(E. coli), 고초균(bacillus)이 알려져 있다.
이들의 세포에, 목적으로 하는 항체 유전자를 형질전환함에 의해 도입하고, 형질전환된 세포를 생체 외에서 배양함으로서 항체가 얻어진다. 배양은, 공지의 방법에 따라서 행한다. 예를 들어, 배양액으로서, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있고, 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다. 또한, 항체 유전자를 도입한 세포를 동물의 복강 등으로 옮김으로서, 생체 내에서 항체를 생산하여도 좋다.
한편, 생체 내의 생산계로서는, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 사용하는 생산계 등이 있다.
포유류 동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 곤충으로서는, 누에를 사용할 수 있다. 식물을 사용하는 경우, 예를 들어, 담배를 사용할 수 있다.
이들 동물 또는, 식물에 항체 유전자를 도입하여, 동물 또는 식물의 체 내에서 항체를 생산시켜서 회수한다. 예를 들어, 항체 유전자를 염소β카제인과 같은 유즙 중에서 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자 내에 삽입하여 융합유전자로 제조한다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배(胚)에 주입하고, 이 배를 암염소에게 도입한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그 자손이 생산하는 유즙으로부터 원하는 항체를 얻는다. 트랜스제닉 염소로부터 생산되는 원하는 항체를 함유하는 유즙량을 증가시키기 위하여, 적당한 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용하여도 좋다(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699~702).
또한, 누에를 사용하는 경우, 목적하는 항체 유전자를 삽입한 바귤로바이러스(baculovirus)를 누에에 감염시켜서, 이 누에의 체액으로부터 원하는 항체를 얻는다(Maeda, S. et al., Nature(1985) 315, 592~594). 또한, 담배를 사용하는 경우, 목적하는 항체 유전자를 식물 발현용 벡터, 예를 들어, pMON530에 삽입하고, 이 벡터를 Agrobacterium tumefaciens와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들어, Nicotiana tabacum에 감염시켜서, 이 담배의 잎으로부터 원하는 항체를 얻는다(Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131~138).
상술한 바와 같이 생체 외 또는 생체 내의 생산계에서 항체를 생산하는 경우, 항체 중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA를 따로따로 발현 벡터에 병합하여 숙주를 동시 형질전환시켜도 좋고, 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA를 단일한 발현 벡터에 병합하여, 숙주를 형질전환시켜도 좋다(국제특허출원 공개번호 WO 94-11523 참조).
본 발명에서 사용되는 항체는, 본 발명에 적합하게 사용될 수 있는한, 항체의 단편이나 그 수식물이라도 좋다. 예를 들어, 항체의 단편으로서는, Fab, F(ab')2, Fv 또는 H쇄와 L쇄의 Fv를 적당한 리간드로 연결시킨 단일쇄 Fv(scFv)를 들 수 있다.
구체적으로는, 항체를 효소, 예를 들어, 파파인, 펩신으로 처리하여 항체 단편을 생성시키거나 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이것을 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주 세포에서 발현시킨다 (예를 들어, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968~2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476~496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476~496, Lamoyi, E., Mothods in Enzymology (1989) 121, 652~663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology(1989) 121, 663~669, Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132~137 참조).
scFv는, 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결함으로서 얻어진다. 이 scFv에 있어서, H쇄 V영역과 L쇄 V영역은 링커, 바람직하기는, 펩티드 링커를 통하여 연결된다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879~5883). scFv에서의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은, 상기 항체로서 기재된 것 중어떤 것으로부터의 유래이어도 좋다. V영역을 연결하는 펩티드 링커로서는, 예를 들어, 아미노산 12-19 잔기로 구성되는 임의의 단일 가닥 펩티드가 사용된다.
scFv를 코드하는 DNA는, 상기 항체의 H쇄 또는, H쇄 V영역을 코드하는 DNA, 및 L쇄 또는, L쇄 V영역을 코드하는 DNA를 주형으로 하고, 그들의 서열 중 원하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 부분을, 그 양단을 규정하는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 의하여 증폭하고, 이어서, 또한 펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA 및 그 양단을 각각 H쇄, L쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머 쌍을 조합시켜 증폭함으로서 얻어진다.
또한, 일단 scFv를 코드하는 DNA가 제작되면, 그들을 함유하는 발현 벡터, 및 이 발현 벡터에 의하여 형질전환된 숙주를 통상의 방법에 따라서 얻을 수 있고, 또한, 그 숙주를 사용하여 통상의 방법에 따라 scFv를 얻을 수 있다.
이들 항체의 단편은, 상기와 같이 하여 그 유전자를 취득하고 발현시켜, 숙주에 의하여 생산시킬 수 있다. 본 발명에서 말한「항체」에는 이들의 항체 단편도 포함된다.
항체의 수식물로서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다. 본 발명에서 말한 「항체」에는 이들의 항체 수식물도 포함된다. 이와 같은 항체 수식물을 얻기 위해서는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시하여 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다.
상기와 같이 생산, 발현된 항체는, 세포 내외, 숙주로부터 분리하여 균일할 때까지 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리, 정제는 친화성 크로마토그래피에 의하여 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 예를 들어, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 프로테인 A 칼럼에 사용하는 담체로서, 예를 들어, Hyper D, POROS, Sepharose F.F. 등을 들 수 있다. 기타, 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 좋고, 하등 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 친화성 크로마토그래피 이외의 크로마토그래피, 필터, 한외여과, 염석, 투석 등을 적당히 선택, 조합시키면, 본 발명에서 사용되는 항체를 분리, 정제할 수 있다. 크로마토그래피로서는, 예를 들어, 이온교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 겔 여과 등을 들 수 있다. 이들 크로마토그래피는 HPLC (High performance liquid chromatography)에 적용할 수 있다. 또한, 역상 HPLC( reverse phase HPLC)를 사용하여도 좋다.
상기에서 얻어진 항체의 농도 측정은 흡광도 측정 또는 ELISA 등에 의하여 행할 수 있다. 즉, 흡광도의 측정에 의한 경우에는, PBS(-)로 적당히 희석한 후, 280nm의 흡광도를 측정하고, 1mg/ml를 1.35 OD로 하여 산출한다. 또한, ELISA에 의한 경우는 이하와 같이 측정할 수 있다. 즉, 0.1M 중탄산 완충액(pH 9.6)으로 1㎍/ml로 희석한 염소-항인간IgG(TAG 제조) 100㎕를 96웰 플레이트(Nunc 제조)에 첨가하고, 4℃에서 하루밤 배양하여, 항체를 고상화한다. 블로킹 후, 적당히 희석한 본 발명에서 사용되는 항체 또는 항체를 함유하는 샘플, 또는 표준품으로서 인간 IgG(CAPPEL 제조) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양한다.
세정 후, 5000배로 희석한 알칼리포스파타제 표지 항인간IgG(BIO SOURCE 제조) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양한다. 세정 후, 기질 용액을 첨가하여 배양후, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad 제조)를 사용하여 405nm에서의 흡광도를 측정하여, 목적하는 항체의 농도를 산출한다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 개변체는, IL-6수용체와의 결합 활성을 가지며, 또한 IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 개변체는 IL-6수용체에 대하여 IL-6와 경쟁적으로 결합하지만, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않기 때문에, IL-6에 의한 신호 전달을 차단한다.
IL-6 개변체는, IL-6의 아미노산 서열의 아미노산 잔기를 치환함으로서 변이를 도입하여 제작된다. IL-6 개변체의 기초가 되는 IL-6는 그 유래를 불문하지만, 항원성 등을 고려하면, 바람직하기는 인간 IL-6이다.
구체적으로는, IL-6의 아미노산 서열을 공지의 분자 모델링 프로그램, 예를 들어, WHATIF(Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52~56)를 사용하여 그의 2차 구조를 예측하고, 또한 치환되는 아미노산 잔기가 전체에 미치는 영향을 평가함으로서 행할 수 있다. 적절한 치환 아미노산 잔기를 결정한 후, 인간 IL-6 유전자를 코드하는 염기서열을 포함하는 벡터를 주형으로 해서, 통상 행하여지는 PCR법에 의하여 아미노산이 치환되도록 변이를 도입함으로서, IL-6 개변체를 코드하는 유전자가 얻어진다. 이것을 필요에 따라 적당한 발현 벡터에 병합하고, 상기 재조합형 항체의 발현, 생산 및 정제 방법에 따라서 IL-6 개변체를 얻을 수 있다.
IL-6 개변체의 구체예로서는, Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86~93, 및 Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357~1367, WO 96-18648, WO96-17869에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6수용체 부분 펩티드는, 각각 IL-6수용체 또는 IL-6와의 결합 활성을 가지고, 또한 IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6수용체 부분 펩티드는 IL-6수용체 또는 IL-6에 결합하고, 이들을 보충함으로서 IL-6의 IL-6수용체로의 결합을 특이적으로 저해한다. 그 결과, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않기 때문에, IL-6에 의한 신호 전달을 차단한다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6수용체 부분 펩티드는, IL-6 또는 IL-6수용체의 아미노산 서열에서 IL-6와 IL-6수용체와의 결합에 관계되는 영역의 일부 또는 전부의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드이다. 이와 같은 펩티드는, 통상 10 ~ 80, 바람직하기는, 20 ~ 50, 더욱 바람직하기는 20 ~ 40개의 아미노산 잔기로 이루어진다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6수용체 부분 펩티드는, IL-6 또는 IL-6수용체의 아미노산 서열에서, IL-6와 IL-6수용체와의 결합에 관계되는 영역을 특정하고, 그의 일부 또는 전부의 아미노산 서열을 통상 알려진 방법, 예를 들어, 유전자공학적 방법 또는 펩티드 합성법에 의하여 제작할 수 있다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6수용체 부분 펩티드를 유전자공학적 방법에 의하여 제작하기 위해서는, 원하는 펩티드를 코드하는 DNA 서열을 발현 벡터에 병합하고, 상기 재조합형 항체의 발현, 생산 및 정제 방법에 따라서 얻을 수 있다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6수용체 부분 펩티드를 펩티드 합성법에 의하여제작하기 위해서는, 펩티드 합성에서 통상 사용되고 있는 방법, 예를 들어 고상 합성법 또는 액상 합성법을 사용할 수 있다.
구체적으로는, 속의약품 발간 제14권 펩티드 합성(監修失島治明廣川書店 1991년)에 기재된 방법에 따라서 행하면 좋다. 고상 합성으로서는, 예를 들어, 유기 용매에 불용성인 지지체에, 합성하고자 하는 펩티드의 C 말단에 대응하는 아미노산을 결합시키고, α-아미노기 및 측쇄 관능기를 적절한 보호기로 보호한 아미노산을 C 말단으로부터 N 말단 방향의 순서로 1 아미노산씩 축합시키는 반응과, 수지 위에 결합한 아미노산 또는 펩티드의 α-아미노기의 이 보호기를 이탈시키는 반응을 교대로 반복함으로서, 펩티드 쇄를 신장시키는 방법이 사용된다. 고상 펩티드 합성법은, 사용되는 보호기의 종류에 의해 Boc법과 Foc법으로 크게 구별된다.
이와 같이 하여 목적하는 펩티드를 합성한 후, 탈보호반응 및 펩티드쇄의 지지체로부터의 절단 반응을 한다. 펩티드쇄와의 절단 반응에는, Boc법에서는 불화수소 또는 트리플루오로메탄술폰산을, 또한 Foc법에서는 TFA를 통상 사용할 수 있다. Boc법에서는, 예를 들어, 불화수소 중에서 상기 보호펩티드 수지를 아니솔 (anisol) 존재 하에서 처리한다. 이어서, 보호기의 이탈과 지지체로부터의 절단을 하여 펩티드를 회수한다. 이것을 동결건조함으로서, 조 펩티드가 얻어진다. 한편, Foc법에서는, 예를 들어, TFA 중에서 상기와 동일한 조작으로 탈보호반응 및 펩티드쇄의 지지체로부터의 절단 반응을 행할 수 있다.
얻어진 조 펩티드는, HPLC에 적용함으로서 분리, 정제할 수 있다. 그의 용출에 있어서, 단백질의 정제에 통상 사용되는 물-아세토니트릴계 용매를 사용하여최적 조건 하에서 행하면 좋다. 얻어진 크로마토그래피의 프로파일의 피크에 해당하는 분획을 분취하고, 이것을 동결건조한다. 이와 같이 해서 정제한 펩티드 분획에 대하여, 질량분광분석에 의한 분자량 해석, 아미노산 조성 분석, 또는 아미노산서열 해석 등에 의하여 동정한다.
IL-6 부분 펩티드 및 IL-6수용체 부분 펩티드의 구체예는, 일본국 특허공개 제1990-188600호, 동 제1995-324097호, 동 제1996-311098호 및 미국 특허 US 5210075호 공보에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 안타고니스트의 IL-6 신호전달 저해 활성은, 통상 사용되는 방법에 의하여 평가할 수 있다. 구체적으로는, IL-6 의존성 인간 골수종주(S6B45, KPMM2), 인간 렌네르트 T 임파종 세포주 KT3, 또는 IL-6 의존성 세포 MH60.BSF2를 배양하고, 이것에 IL-6를 첨가하고, 동시에 IL-6 안타고니스트를 공존시킴으로서 IL-6 의존성 세포의3H-티미딘 병합을 측정하면 좋다. 또한, IL-6수용체 발현 세포인 U266를 배양하고,125I 표지 IL-6를 첨가하고, 동시에 IL-6 안타고니스트를 첨가함으로서, IL-6수용체 발현 세포에 결합한125I 표지 IL-6를 측정한다. 상기 에세이계에 있어서, IL-6 안타고니스트를 존재시키는 군에 더하여, IL-6 안타고니스트를 함유하지 않는 음성 대조군을 두고, 양쪽에서 얻어진 결과를 비교하면, IL-6 안타고니스트의 IL-6 저해 활성을 평가할 수 있다.
후술하는 실시예에 나타난 바와 같이, 항IL-6수용체 항체의 투여에 의하여, 소아 만성 관절염 환자에 있어서 치료효과가 확인되었으므로, 항IL-6수용체 항체등의 IL-6 안타고니스트는 소아 만성 관절염 관련질환 치료제로서 유용한 것으로 시사되었다.
본 발명에 있어서의 치료 대상은 포유동물이다. 치료 대상의 포유동물은, 바람직하기는 인간이다.
본 발명의 소아 만성 관절염 관련질환 치료제는, 경구적으로 또는 비경구적으로 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 점적 등의 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사, 좌약, 관장(灌腸), 경구성 장용제 등을 선택할 수 있고, 환자의 연령, 증상에 따라 적당한 투여 방법을 선택할 수 있다. 유효 투여량은, 1회에 대하여 체중 1㎏ 당 0.01㎎ 내지 100㎎의 범위에서 선택된다. 또는, 환자당 1 ~ 1000㎎, 바람직하기는 5 ~ 50㎎의 투여량을 선택할 수 있다. 바람직한 투여량, 투여 방법은, 예를 들면 항IL-6수용체 항체의 경우에는, 혈 중에 유리 항체(free antibody)가 존재할 정도의 양이 유효 투여량이고, 구체적인 예로서는, 체중 1㎏ 당 1개월(4주간)에 0.5㎎ 내지 40㎎, 바람직하기는 1㎎ 내지 20㎎을 1회 내지 수회에 나눠서, 예를 들면 2회/주, 1회/주, 1회/2주, 1회/4주 등의 투여 스케줄로 점적 등의 정맥 내 주사, 피하 주사 등의 방법으로, 투여하는 방법 등이 있다. 투여 스케줄은, 병상태의 관찰 및 혈액 검사치의 동향을 관찰하면서 2회/주 또는 1회/주 내지 1회/2주, 1회/3주, 1회/4주와 같이 투여 간격을 넓혀가는 등 조정하는 것도 가능하다.
본 발명의 소아 만성 관절염 관련질환 치료제는, 투여 경로에 따라서 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 함유하는 것이어도 좋다. 이와 같은 담체 및첨가물의 예로서, 물, 의학적으로 허용되는 유기 용매, 콜라겐, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 아르긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 키산탄검, 아라비아고무, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 바세린, 파라핀, 스테아릴알콜, 스테아린산, 인간 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토오스, 의약 첨가물로 허용되는 계면 활성제 등을 들 수 있다. 사용되는 첨가물은, 제형에 따라서 상기의 것들 중에서 적당히 또는 조합하여 선택될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예, 참고예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1.
이하의 경과를 갖는 전신형 연소성 관절 류마티스 환자(5세, 남성)에 대하여, MRA 치료를 행하였다.
치료 전의 경과
이장열(매일 40℃까지의 일봉성(一峰性) 발열), 양 무릎 관절통, 피부 발진으로 증상이 시작되었다. 백혈구 증가, 항핵항체 음성, 류마토이드 인자 음성, 적침치(赤沈値) 항진, CRP의 높은 수치 등으로부터 진단한 후, 아스피린 투여가 개시되었으나, 이장열, 관절염의 개선은 인지되지 않았고, 전신 상태의 악화가 진행되었다. 그래서, 대량 스테로이드 제제(프레드니솔론 30㎎/일)의 경구 투여로 전환하여, 여러가지 증상의 개선을 보았다. 그러나 프레드니솔론을 점점 감량함에 따라 10㎎/일의 용량에서 다시 열이 나서, 재입원하고, 메틸프레드니솔론(mPSL) 펄스 요법, 혈장 교환 요법, 및 시클로스포린 A(Cs A)를 병용하였지만 개선을 보이지 않았고, 염증 증상이 강하여(백혈구 수 25400/㎕, CRP 11.2㎎/㎗), 혈장 교환 요법 + mPSL 펄스 요법 + Cs A에 관한 후치료법으로서 프레드니솔론 + 프로벤으로 이장열의 조절을 행하여, 임상적으로는 해열을 보았지만, 혈액 염증 소견은 높은 값을 유지한 채 경과하였고(CRP > 5㎎/㎗), 퇴원 이후에는, 주기적으로 이장열을 보였지만, 외래 중심의 치료 관찰을 해나갔다. 그러나, 발열시에 강해지는 등부위의 통증을 호소하게 되어, MBI 등의 정밀조사의 결과, 제 4 ~ 5 흉추파괴의 상처가 인지되었고, 스테로이드에 의한 압박 골절로 생각되었다. 흉추로의 하중을 면할 필요가 있으므로, 약 1년간에 걸쳐서 침상 위의 안정 상태를 계속하여, 하지근육이 현저히 쇠약해져 보행이 전혀 불가능한 상태에 이르렀다. 프레드니솔론 + 프로벤 + Cs A의 3자 요법이 계속되고 있으나, CRP는 5㎎/㎗ 이하로 저하하지 않았다.
치료의 결과
2㎎/㎏으로 투여를 개시하였지만 특히 부작용은 보이지 않았으므로, 4㎎/㎏로 증량하여, 주 1회의 투여를 행하였다. 그때까지 인지된 발열은 신속히 소실하고, CRP는 약 2주간 후에 음성화하였다. 전신 권태감도 없어지고, 환자가 활기를 띄게 되었다. 프레드니솔론도 서서히 감량이 가능하게 되어, 1㎎/일까지 감량하고 있다.
이상의 결과로부터, MRA는 아스피린, 프로벤 등의 비스테로이드성 항염증제,장기 대량의 스테로이드제(프레드닌, 메드롤 등), 시클로스포린 A, 메토트렉세이트 등의 면역 억제제으로도 병상태를 억제할 수 없었던 소아 만성 관절염의 치료에 유용한 것으로 밝혀졌다. 따라서, IL-6 안타고니스트, 특히 항IL-6수용체 항체는 소아 만성 관절염, 특히 ARA 분류의 전신형, EULAR 분류의 전신형, ILAR 분류의 전신형, 발명자 들의 분류의 SPRASH 증후군의 소아 만성 관절염의 치료제로서 유용하다고 할 수 있다.
실시예 2.
22세 여성. 1998년 4월, 대퇴ㆍ 전흉부ㆍ 손가락에 점상 홍반 출현, 5월에는 어깨ㆍ팔꿈치ㆍ무릎 관절통, 38℃ 대의 발열이 나타났다. 비스테로이드계 항염증제(NSAIDs)가 개시되었지만, 발열이 지속되었고, 7월에는 백혈구 수 18100/㎕, CRP 18.3㎎/㎗, 혈청 페리틴 440ng/㎖으로서, 성인 스틸병으로 진단되었다. 2000년 1월 초로부터 39℃ 대의 발열 및 관절통이 나타나서, 성인 스틸병의 재연(CRP 15.8㎎/㎗, 페리틴 205.8ng/㎖)이라고 생각되었다.
스테로이드 감량이 곤란하기 때문에, 메토트렉세이트(MTX) 및 시클로스포린 (Cs A)을 병용하였지만, 병세를 억제할 수 없었다. 병세의 진행 때문에 호흡 상태가 악화하여, 인공 호흡으로 관리되었다. 스테로이드 펄스 요법으로 병세는 개선 상태였지만, 중증 골조송증을 합병하고 있기도 하여, 인간형화 항IL-6수용체 항체 (MRA) 치료를 개시하였다. MRA 200㎎을 2주간 마다 점적으로 정맥 내 주사하였다. 염증반응은 투여 6일 후에는 음성화하였고, 부신피질 스테로이드제의 감량도 순조롭게 진행하였으며, 중대한 부작용도 인지되지 않았다.
이상의 결과로부터, MRA는 MTX와 Cs A의 병용으로도 병의 상태를 억제할 수 없었던 성인 스틸병의 치료에 유용한 것으로 밝혀졌다. 따라서, IL-6 안타고니스트, 특히 항IL-6수용체 항체는 스틸병, 특히 성인 스틸병의 치료제로서 유용하다고 할 수 있다.
참고예 1. 인간 가용성 IL-6 수용체의 조제
야마사키 들의 방법(Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828)에 따라서 얻어진 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA을 포함하는 플라스미드 pBSF2R.236을 사용하여, PCR법에 의하여 가용성 IL-6 수용체를 작성하였다. 플라스미드 pBSF2R. 236을 제한효소 SphⅠ으로 소화하여, IL-6수용체 cDNA를 얻고, 이것을 mp18 (Amersham 제)에 삽입하였다. IL-6수용체 cDNA에 정지 코돈을 도입하도록 디자인한 합성 올리고프리이머를 사용하여, 인비트로 뮤타제네시스 시스템(Amersham 제)에 의하여, PCR법으로 IL-6수용체 cDNA에 변이를 도입하였다. 이 조작에 의하여 정지 코돈이 아미노산 345의 위치에 도입되어, 가용성 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA가 얻어진다.
가용성 IL-6 수용체 cDNA를 CHO 세포에서 발현하기 위하여, 플라스미드 pSV (Pharmacia 제조)와 연결시켜서, 플라스미드 pSVL344를 얻었다. dhfr의 cDNA를 포함하는 플라스미드 pECEdhfr에 HindⅢ-SalⅠ으로 절단한 가용성 IL-6수용체 cDNA를 삽입하고, CHO 세포 발현 플라스미드 pECEdhfr 344를 얻었다.
10㎍의 플라스미드 pECEdhfr344를 dhfr-CHO 세포주 DXB-11(Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)에 칼슘 포스페이트 침전법(Chen, C. et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751)에 의하여, 형질감염하였다(transfection). 형질감염한 CHO 세포를 1mM 글루타민, 10% 투석 FCS, 100U/㎖의 페니실린 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유하는 누클레오티드를 함유하지 않은 αMEM 선택 배양액에서 3주간 배양하였다.
선택된 CHO 세포를 한계희석법으로 스크리닝하여, 단일의 CHO 세포 클론을 얻었다. 이 CHO 세포 클론을 20nM ~ 200nM 농도의 메토트렉세이트로 증폭하여, 인간 가용성 IL-6 수용체 생산 CHO 세포주 5E27을 얻었다. CHO 세포주 5E27을 5% FBS을 함유하는 이스코브 개변 달베코 배양액(IMDM, Gibco 제조)에서 배양하였다. 배양 상청을 회수하고, 배양 상청 중의 가용성 IL-6 수용체의 농도를 ELISA로 측정하였다. 그 결과, 배양 상청 중에는 가용성 IL-6 수용체가 존재하는 것이 확인되었다.
참고예 2. 항인간IL-6 항체의 조제
10㎍의 재조합형 IL-6(Hirano, T. et al., Immunol. Lett. (1988) 17, 41)을 프로인트 완전 보조제와 함께 BALB/c 마우스를 면역하고, 혈청 중에서 항IL-6 항체가 검출될 때까지 1주간 마다 이것을 계속하였다. 국부의 임파절로부터 면역 세포를 적출하고, 폴리에틸렌글리콜 1500을 사용하여 골수종 세포주P3U1과 융합시켰다. 하이브리도마를 HAT 배양액을 사용하는 Oi들의 방법(Selective Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980)에 따라서 선택하여, 항인간IL-6 항체를 생산하는 하이브리도마를 수립하였다.
항인간IL-6 항체를 생산하는 하이브리도마는 하기와 같이 하여 IL-6 결합 에세이를 행하였다. 즉, 유연한 폴리비닐제의 96웰 마이크로플레이트 (Dynatech Laboratories, Inc. 제, Alexandria, VA)를 0.1M의 carbonate-hydrogen carbonate 완충액(pH 9.6) 중에서 100㎕의 염소 항 마우스 Ig(10㎕/㎖, Cooper Biomedical, Inc 제, Malvern, PA)에 의하여 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 다음에, 플레이트를 100㎕의 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS에 의하여 실온에서 2시간 처리하였다.
이것을 PBS로 세정한 후, 100㎕의 하이브리도마 배양 상청을 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 플레이트를 세정하고, 2000cpm/0.5ng/웰이 되도록125I 표지 재조합형 IL-6을 각 웰에 첨가하고, 세정한 후 각 웰의 방사 활성을 감마 카운터(Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA)로 측정하였다. 216개의 하이브리도마 클론 중 32개의 하이브리도마 클론이 IL-6 결합 에세이에 의하여 양성이었다. 이들의 클론 중에서 최종적으로 안정한 MH166.BSF2가 얻어졌다. 이 하이브리도마를 생산하는 항IL-6 항체 MH166은 IgG1κ의 서브타입을 갖는다.
이어서, IL-6 의존성 마우스 하이브리도마 클론 MH60.BSF2를 사용하여 MH166 항체에 의한 하이브리도마의 증식에 관한 중화 활성을 조사하였다. MH60.BSF2세포를 1×104/200㎕/웰이 되도록 분주하고, 이것에 MH166 항체를 함유하는 샘플을 첨가하고, 48시간 배양하여, 0.5μCi/웰의3H 티미딘(New England Nuclear, Boston, MA)을 첨가한 후, 다시 6시간 배양을 계속하였다. 세포를 유리 필터 페이퍼 위에 놓고, 자동 하베스터(Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan)로 처리하였다. 대조로서 토끼 항IL-6 항체를 사용하였다.
그 결과, MH166 항체는 IL-6에 의하여 유도되는 MH60.BSF2 세포의3H 티미딘의 병합을 용량 의존적으로 저해하였다. 이 사실로부터, MH166 항체는 IL-6 활성을 중화하는 것으로 밝혀졌다.
참고예 3. 항 인간 IL-6수용체 항체의 조제
Hirata 들의 방법(Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906)에 의하여 작성한 항IL-6수용체 항체 MT18을 CNBr에 의하여 활성화시킨 세파로스 4B(Pharmacia Fine Chemicals 제조, Piscataway, NJ)와 첨부된 처방에 따라 결합시켜서, IL-6수용체(Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828)를 정제하였다. 인간 골수종 세포주 U266을 1% 디기토닌(Wako Chemicals 제조), 10mM 트리에탄올아민(pH 7.8) 및 0.15M NaCl을 함유한 1mM p-파라아미노페닐메탄술포닐플루오라이드하이드로클로라이드(Wako Chemicals 제조)(디기토닌 완충액)로 가용화하고, 세파로스 4B 비드와 결합시킨 MT18 항체와 혼합하였다. 그 후, 비드를 디기토닌 완충액으로 6회 세정하여, 면역하기 위한 부분정제 IL-6수용체로 하였다.
BALB/c 마우스를 3×109개의 U266 세포로부터 얻은 상기 부분 정제 IL-6수용체로 10일 간격으로 4회 면역하고, 그 후 통상의 방법에 의하여 하이브리도마를 작성하였다. 성장 양성 웰로부터의 하이브리도마 배양 상청을 하기의 방법으로 IL-6 수용체로의 결합 활성을 조사하였다. 5×107개의 U266 세포를35S-메티오닌(2.5mCi)로 표지하고, 상기 디기토닌 완충액으로 가용화하였다. 가용화한 U266 세포를 0.04㎖ 용량의 세파로스 4B 비드와 결합시킨 MT18 항체와 혼합하고, 그 후 디기토닌 완충액으로 6회 세정하고, 0.25㎖의 디기토닌 완충액(pH 3.4)에 의하여35S-메티오닌 표지 IL-6 수용체를 유출시켜서, 0.025㎖의 1M Tris(pH 7.4)로 중화하였다.
0.05㎖의 하이브리도마 배양 상청을 0.01㎖의 Protein G 세파로스(Pharmacia 제조)와 혼합하였다. 세정한 후, 세파로스를 상기에서 조제한 0.005㎖의35S 표지 IL-6수용체 용액과 함께 배양하였다. 면역 침전 물질을 SDS-PAGE로 분석하여, IL-6수용체와 반응하는 하이브리도마 배양 상청을 조사하였다. 그 결과, 반응 양성 하이브리도마 클론 PM-1(FERM BP-2998)을 수립하였다. 하이브리도마 PM-1으로부터 생산되는 항체는, IgG1κ의 서브 타입을 갖는다.
하이브리도마 PM-1이 생산하는 항체의 인간 IL-6수용체에 대한 IL-6의 결합 저해 활성을 인간 골수종 세포주 U266을 사용하여 조사하였다. 인간 재조합형 IL-6을 대장균으로부터 조제하고(Hirano, T. et al., Immunol. Lett. (1988) 17, 41-45), 볼튼-한타 시약(New England Nuclear, Boston, MA)에 의하여125I 표지하였다 (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981).
4×105개의 U266 세포를 1시간, 70%(v/v)의 하이브리도마 PM-1의 배양 상청 및 14000cpm의125I 표지 IL-6와 함께 배양하였다. 70㎕의 샘플을 400㎕의 마이크로퓨지 폴리에틸렌 튜브에서 300㎕의 FCS 위에 중층하고, 원심분리한 후, 세포 위의 방사활성을 측정하였다.
그 결과, 하이브리도마 PM-1이 생산하는 항체는, IL-6의 IL-6수용체에 대한결합을 저해하는 것으로 밝혀졌다.
참고예 4. 항마우스 IL-6 수용체 항체의 조제
Saito, T. et al., J. Immunol. (1991) 147, 168-173에 기재된 방법에 의하여, 마우스 IL-6수용체에 대한 모노클로날 항체를 제조하였다.
마우스 가용성 IL-6수용체를 생산하는 CH0 세포를 10% FCS를 함유하는 IMDM 배양액에서 배양하고, 그 배양 상청으로부터 항마우스 IL-6수용체 항체 RS12(상기 Saito, T. et al 참조)를 Affigel 10 겔(Biorad 제조)에 고정한 친화성 칼럼을 사용하여 마우스 가용성 IL-6수용체를 정제하였다.
얻어진 마우스 가용성 IL-6수용체 50㎍을 프로인트 완전 보조제와 혼합하고, 위스터 래트 복부에 주사하였다. 2주간 후부터는 프로인트 불완전 보조제로 추가 면역하였다. 45 일째에 래트 비장 세포를 채취하고, 2×108개 세포를 1×107개의 마우스 골수종 세포 P3U1과 50%의 PEG1500 (Boehringer Mannheim 제조)를 사용하여 통상의 방법에 의하여 세포 융합시킨 후, HAT 배지에서 하이브리도마를 스크리닝 하였다.
토끼-항래트IgG 항체 (Cappel 제조)를 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양 상청을 첨가한 후, 마우스 가용성 IL-6수용체를 반응시켰다. 이어서, 토끼-항마우스 IL-6수용체 항체 및 알칼리포스파타제 표지 양-항토끼IgG에 의한 ELISA 법에 의하여 마우스 가용성 IL-6수용체에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝 하였다. 항체의 생산이 확인된 하이브리도마 클론은 2회의 서브 스크리닝을 행하여, 단일의 하이브리도마 클론을 얻었다. 이 클론을 MR16-1로 명명하였다.
이 하이브리도마가 생산하는 항체의 마우스 IL-6의 정보 전달에 있어서 중화 활성을 MH60.BSF2 세포 (Matsuda, T. et al., J. Immunol. (1988) 18, 951~956)를 사용한3H 티미딘의 병합을 조사하였다. 96웰 플레이트에 MH60.BSF2 세포를 1×104개/200㎕/웰로 되도록 조제하였다. 이 플레이트에 10pg/ml의 마우스 IL-6와 MR16-1 항체 또는 RS12 항체를 12.3~1000ng/ml 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 44시간 동안 배양한 후, 1μCi/웰의3H 티미딘을 첨가하였다. 4시간 후에3H 티미딘의 병합을 측정하였다. 그 결과 MR16-1 항체는 MH60.BSF2 세포의3H 티미딘 병합을 억제하였다.
따라서, 하이브리도마 MR16-1(FERM BP-5875)가 생산한 항체는, IL-6의 IL-6수용체에 대한 결합을 저해하는 것이 명확해졌다.

Claims (26)

  1. 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하여 이루어지는 소아 만성 관절염 관련질환 치료제.
  2. 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로 함유하는 소아 만성 관절염 치료제.
  3. 제 2항에 있어서, IL-6 안타고니스트가 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 소아 만성 관절염 치료제.
  4. 제 3항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 소아 만성 관절염 치료제.
  5. 제 4항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 소아 만성 관절염 치료제.
  6. 제 4항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 소아 만성 관절염 치료제.
  7. 제 3항 내지 6항 중 어느 하나의 항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 항체가 재조합형 항체인 것을 특징으로 하는 소아 만성 관절염 치료제.
  8. 제 5항에 있어서, 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체가 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 소아 만성 관절염 치료제.
  9. 제 6항에 있어서, 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체가 MR16-1 항체인 것을 특징으로 하는 소아 만성 관절염 치료제.
  10. 제 3항 내지 5항 중 어느 하나의 항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 소아 만성 관절염 치료제.
  11. 제 10항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체가 인간형화 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 소아 만성 관절염 치료제.
  12. 제 2항 내지 11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 소아 만성 관절염이, ARA 분류에서는 전신형, 다관절형, 소관절형, EULAR 분류에서는, 전신형, 다관절형, 소관절형, ILAR 분류에서는 전신형, 다관절형(RF 양성형), 다관절형(RF 음성형), 소관절형, 진전형 소관절형, 본 발명자들의 분류에서는 소아 1차성 만성 관절염 (SPRASH 증후군, 소아 특발성 만성 관절염(a. 류마티토이드 인자(RF) 양성형, b. 항핵항체(ANA) 양성형, c. RF/ANA 음성형))인 소아 만성 관절염 치료제.
  13. 제 2항 내지 11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 소아 만성 관절염이, ARA 분류에서는 전신형, 다관절형, EULAR 분류에서는, 전신형, 다관절형, ILAR 분류에서는 전신형, 다관절형(RF 양성형), 다관절형(RF 음성형), 진전형 소관절형, 본 발명자들의 분류에서는 소아 1차성 만성 관절염(SPRASH 증후군, 소아 특발성 만성 관절염(a. 류마티토이드 인자(RF) 양성형, b. 항핵항체(ANA) 양성형))인 소아 만성 관절염 치료제.
  14. 제 2항 내지 11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 소아 만성 관절염이, ARA 분류로는 전신형, 다관절형, EULAR 분류로는, 전신형, 다관절형, ILAR 분류로는 전신형, 다관절형(RF 양성형), 진전형 소관절형, 본 발명자들의 분류로는 소아 1차성 만성 관절염(SPRASH 증후군, 소아 특발성 만성 관절염(a. 류마토이드 인자 (RF) 양성형))인 소아 만성 관절염 치료제.
  15. 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 스틸병 치료제.
  16. 제 15항에 있어서, IL-6 안타고니스트가 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 스틸병 치료제.
  17. 제 16항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 스틸병 치료제.
  18. 제 17항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 스틸병 치료제.
  19. 제 17항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 스틸병 치료제.
  20. 제 16항 내지 19항 중 어느 하나의 항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 항체가 재조합형 항체인 것을 특징으로 하는 스틸병 치료제.
  21. 제 18항에 있어서, 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체가 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 스틸병 치료제.
  22. 제 19항에 있어서, 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체가 MR16-1 항체인 것을 특징으로 하는 스틸병 치료제.
  23. 제 16항 내지 18항 중 어느 하나의 항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 항체가IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 스틸병 치료제.
  24. 제 23항에 있어서, IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체가 인간형화 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 스틸병 치료제.
  25. 제 15항 내지 24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스틸병이 성인 스틸병인 것을 특징으로 하는 스틸병 치료제.
  26. 제 15항 내지 24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스틸병이 소아 스틸병인 것을 특징으로 하는 스틸병 치료제.
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