CN101939425B - 抗il-6受体抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明人等成功地在TOCILIZUMAB的可变区、构架区和恒定区中发现了特定的氨基酸突变，该氨基酸突变增强与抗原的结合能力、提高药物动力学、降低免疫原性风险、提高在酸性条件下的稳定性、改善来自铰链区二硫键的异质性、改善高浓度制剂中的稳定性等。

Description

抗IL-6受体抗体
技术领域
本发明涉及含有抗IL-6受体抗体作为有效成分的药物组合物及其制造方法等。
背景技术
抗体在血浆中(血中)的稳定性高、副作用也少，因此作为药品而受到关注。其中，有多种IgG型抗体药物已上市，目前还有多种抗体药物正在开发中(非专利文献1、非专利文献2)。
IL-6是与各种自身免疫疾病有关的细胞因子(非专利文献3)，作为人源化抗IL-6受体IgG1抗体的TOCILIZUMAB与IL-6受体进行特异性结合、中和其生物学作用，由此认为TOCILIZUMAB可以用作类风湿性关节炎等与IL-6有关的疾病的治疗药(专利文献1、2、3、非专利文献4)。实际上，在日本TOCILIZUMAB已被承认作为卡斯尔曼病(Castleman’s disease)的治疗药(非专利文献5)。
作为可适用于第2代抗体药物的技术，人们开发了各种技术，有人报道了提高效应子功能、抗原结合能力、血浆中滞留性(血中滞留性)、稳定性的技术或降低免疫原性(抗原性)风险的技术等。
作为增强药效或者减少给药量的方法，有人报道了通过取代IgG抗体Fc区的氨基酸来增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC活性)或补体依赖性细胞毒性(CDC活性)的技术(非专利文献6)。另外，作为增强抗原结合能力、抗原中和能力的技术，有人报道了亲和力成熟技术(非专利文献7)，通过向可变区的CDR区等的氨基酸中导入突变，可以增强与抗原的结合活性。通过增强抗原结合能力，可以提高在体外的生物活性、或者减少给药量，还可以进一步提高在体内的药效(非专利文献8)。目前，发挥优于抗RSV抗体的第一代药物、即帕利珠单抗(Palivizumab)的效果的莫维珠单抗(Motavizumab)(利用亲和力成熟技术制作)的临床试验正在进行(非专利文献9)。此外，通过与不同表位结合，也可以产生更优异的效果。例如，有报道称：与作为抗CD20抗体的利妥昔单抗(Rituximab)识别不同表位的Oftamumab在体内发挥优于利妥昔单抗的效果，目前正在进行临床试验(非专利文献10)。在抗IL-6受体抗体中，迄今为止尚无具有强于1nM的亲和性的人抗体或人源化抗体或嵌合抗体的报道。
目前的抗体药物所面临的问题有：由于给药蛋白量非常多所导致的高制造成本。就人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB而言，给药量也设定为约8mg/kg/月的静脉内注射(非专利文献4)。关于给药方式，当为慢性自身免疫疾病时，优选皮下给药制剂。通常皮下给药制剂必需是高浓度制剂，当为IgG型抗体制剂时，从稳定性等方面考虑，通常认为100mg/mL左右的制剂是极限(非专利文献11)。为了能够发挥持续的治疗效果，通过延长抗体的血浆中半衰期来减少给药蛋白量、赋予高浓度制剂尽可能高的稳定性，从而可以以较长的给药间隔进行皮下给药，可以提供成本低且便利性高的第2代抗体药物。
作为提高抗体的血浆中半衰期的方法，有人报道了恒定区的人工氨基酸取代(非专利文献12、13)，但从免疫原性风险的角度考虑，并不优选向恒定区中导入天然不存在的序列。另外，从免疫原性的角度考虑，与恒定区相比，更希望对可变区进行氨基酸取代，但迄今为止未见通过可变区的氨基酸取代来提高抗体的血浆中半衰期的报道，也未见提高人或人源化或嵌合IL-6受体抗体的血浆中半衰期的报道。
作为改善稳定性的方法，有人报道了通过可变区构架的氨基酸取代或改组来提高物理化学稳定性(热变性中间温度)(非专利文献14、15)，但迄今为止尚无通过上述氨基酸取代使浓度超过100mg/mL的高浓度制剂中的稳定性得到改善(抑制聚集物的生成)的报道；对于人或人源化IL-6受体抗体也未见有关在超过100mg/mL的高浓度制剂中稳定的抗体分子的报道。
开发生物药品时，最重要的一个问题是免疫原性。通常，小鼠抗体通过人源化而使免疫原性降低。通过在人源化时的模板构架中使用种系(ジヤ一ムライン，germline)序列，可以进一步降低免疫原性的风险(非专利文献16)。但即使是作为完全人抗TNF抗体的阿达木单抗(Adalimumab)，也显现高频率(13％～17％)免疫原性，在显现出免疫原性的患者中发现治疗效果下降(非专利文献17、18)。即使是人抗体，也有可能在CDR区中存在T细胞表位，CDR上的T细胞表位有可能成为免疫原性的原因。有人报道了在计算机芯片上或者在体内预测T细胞表位的方法(非专利文献19、20)，认为通过除去采用上述方法预测的T细胞表位，可以降低免疫原性风险(非专利文献21)。作为人源化抗IL-6受体IgG1抗体的TOCILIZUMAB是将小鼠PM1抗体人源化得到的IgG1抗体。H链、L链分别使用人NEW、人REI的序列作为模板构架进行CDR嫁接，但作为对保持活性重要的氨基酸，有5个氨基酸作为小鼠序列残留在构架中(非专利文献22)。迄今为止尚无在不使作为人源化抗体的TOCILIZUMAB的构架中残留的小鼠序列活性降低的情况下将其取代成人序列的报道。TOCILIZUMAB的CDR序列是小鼠序列，与阿达木单抗一样，在CDR区中有可能存在T细胞表位，不能否定免疫原性的风险。并且，由于TOCILIZUMAB属于IgG1亚纲，所以有可能与Fcγ受体结合。由于Fcγ受体在抗原提示细胞中表达，所以与Fcγ受体结合的分子容易被抗原提示，有报道称：通过使蛋白或肽与IgG1的Fc部分结合，免疫原性增强(可以使其增强)(非专利文献23、专利文献4)。在TOCILIZUMAB的临床试验中，在8mg/kg的药效用量时没有确认到抗TOCILIZUMAB抗体的出现，但在4mg/kg和2mg/kg时确认到了免疫原性(专利文献5)。由此认为：在人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB的免疫原性上还存在改善的空间。但迄今为止尚无有关通过氨基酸取代使免疫原性风险得到改善的TOCILIZUMAB(人源化PM-1抗体)的报道。
近年来，人们非常重视抗体药物的安全性。认为在TGN1412的I期临床试验中发现的重大副作用的原因之一是抗体的Fc部分与Fcγ受体的相互作用(非专利文献24)。在以中和抗原的生物学作用为目的的抗体药物中，不必与对Fc区的ADCC等效应子功能重要的Fcγ受体结合。如上所述，从免疫原性和副作用的角度考虑，认为可能也不优选与Fcγ受体的结合。
作为虽然无法完全消除与Fcγ受体的结合但可以使其降低的方法，有人考虑将IgG抗体的同种型由IgG1变为IgG2或IgG4的方法(非专利文献25)。作为完全消除与Fcγ受体结合的方法，有人报道了向Fc区导入人工修饰的方法。例如，抗CD3抗体和抗CD4抗体的效应子功能会引起副作用。因此，在Fc区的Fcγ受体结合部分导入有野生型序列中不存在的氨基酸突变(非专利文献26、27)的Fcγ受体非结合型的抗CD3抗体和抗CD4抗体的临床试验正在进行(非专利文献24、28)。另外，通过将IgG1的FcγR结合位点(EU编号第233、234、235、236、327、330、331位)形成IgG2和IgG4的序列，可以制作Fcγ受体非结合型抗体(非专利文献29、专利文献6)。但这些分子中均出现能够形成天然不存在的T细胞表位肽的9～12个氨基酸的新的肽序列，认为存在免疫原性的风险。迄今为止，还没有关于能够解决上述课题的Fcγ受体非结合型抗体的报道。
另一方面，在开发抗体作为药品时，其蛋白质的理化性质、其中均匀性和稳定性极为重要。关于IgG2同种型，报道了来自铰链区的二硫键的异质性(heterogeneity)(非专利文献30)。难以在维持来源于此的目标物质/相关物质的异质性的制造间差的同时作为药品进行大量制造。优选作为药物开发的抗体分子尽可能是单一物质。
另外，IgG2和IgG4在酸性条件下的稳定性不足。通常IgG型抗体在采用了蛋白A的纯化步骤和病毒灭活步骤中被暴露在酸性条件下，所以IgG2和IgG4在同一步骤中有可能发生聚集、变性。因此，作为药物开发的抗体分子优选在酸性条件下也稳定。在天然型的IgG2和IgG4、以及来源于IgG2和IgG4的Fcγ受体非结合型抗体(非专利文献25、26、专利文献6)中存在上述问题，在作为药品开发时希望得到解决。
有报道称：IgG1型抗体在酸性条件下比较稳定、来自铰链区的二硫键的异质性也少，但在制剂保存中，铰链区的肽键在溶液中进行非酶性分解，生成作为杂质的Fab片段(非专利文献31)。在作为药品开发时，希望解决生成杂质的问题。
作为抗体C末端序列的异质性，有人报道了：由C末端氨基酸的Lys残基的缺失和C末端的2个氨基酸Gly、Lys的缺失引起的C末端氨基的酰胺化(非专利文献32)，作为药品开发时希望不存在上述异质性。
如上所述，以中和抗原为目的的抗体药物的恒定区优选上述所有问题均得到解决的恒定区序列，但迄今为止还没有关于满足上述所有条件的恒定区的报道。
迄今为止，尚无开发与第1代分子相比在增强抗原中和能力的同时减少给药频率、持续发挥治疗效果、并且免疫原性、安全性、理化性质得到改善的第2代分子的报道。另外，也未见下述报道：通过修饰人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的氨基酸序列，使上述各项更优异的第2代的TOCILIZUMAB。
需要说明的是，本发明的在先技术文献如下。
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专利文献1：WO 92/19759
专利文献2：WO 96/11020
专利文献3：WO 96/12503
专利文献4：US 20050261229A1
专利文献5：WO 2004096273(A1)
专利文献6：WO 99/58572
发明内容
发明所要解决的课题
本发明鉴于上述状况而设，其目的在于提供：包含优于TOCILIZUMAB的第2代分子的药物组合物、以及上述药物组合物的制造方法，所述优于TOCILIZUMAB的第2代分子是指通过修饰人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的氨基酸序列，使抗原中和能力增强、同时提高了药物动力学(提高血浆中滞留性)，从而减少了给药频率、持续发挥治疗效果，并且免疫原性、安全性、理化性质得到改善。
解决课题的方法
本发明人等为了研制优于TOCILIZUMAB的第2代分子进行了深入研究，所述优于TOCILIZUMAB的第2代分子是指通过修饰第1代人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的氨基酸序列，使药效增强、同时提高药物动力学，从而减少给药频率、持续发挥治疗效果，并且免疫原性、安全性、理化性质(稳定性和均匀性)得到改善。其结果，本发明人等在TOCILIZUMAB的可变区中发现了多个使与抗原的结合能力(亲和性)提高的CDR突变，利用这些突变的组合成功地大幅提高了亲和性。另外，本发明人等通过导入降低可变区序列的等电点的修饰，成功地提高了药物动力学。此外，本发明人等通过使残留在TOCILIZUMAB的构架中的、来自小鼠的序列和可变区中在计算机芯片上预测的T细胞表位肽的数目降低，成功地降低了免疫原性风险。同时，还成功地提高了高浓度中的稳定性。并且，本发明人等在TOCILIZUMAB的恒定区中成功地发现了新的恒定区序列，所述新的恒定区序列使新的T细胞表位肽的出现达到最低限度，同时不与Fcγ受体结合，使酸性条件下的稳定性、来自铰链区二硫键的异质性、来自H链C末端的异质性以及高浓度制剂中的稳定性得到改善。通过组合上述CDR区氨基酸序列的修饰、可变区氨基酸序列的修饰、恒定区氨基酸序列的修饰，成功地研制出优于TOCILIZUMAB的第2代分子。
本发明涉及包含人源化抗IL-6受体IgG抗体的药物组合物、以及上述药物组合物的制造方法，所述人源化抗IL-6受体IgG抗体是通过修饰人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的氨基酸序列，从而具有更优异的与抗原(IL-6受体)的结合能力，具有更优异的血浆中滞留性，具有更优异的安全性、免疫原性风险、理化性质(稳定性、均匀性)。更具体而言，本发明提供下述[1]～[41]。
[1]下述(a)～(y)中任一项所述的抗IL-6受体抗体：
(a)抗体，该抗体包含具有CDR1的重链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸；
(b)抗体，该抗体包含具有CDR1的重链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第5位的Trp被取代成其他氨基酸；
(c)抗体，该抗体包含具有CDR2的重链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第1位的Tyr被取代成其他氨基酸；
(d)抗体，该抗体包含具有CDR2的重链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第8位的Thr被取代成其他氨基酸；
(e)抗体，该抗体包含具有CDR2的重链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第9位的Thr被取代成其他氨基酸；
(f)抗体，该抗体包含具有CDR3的重链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸；
(g)抗体，该抗体包含具有CDR3的重链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第2位的Leu被取代成其他氨基酸；
(h)抗体，该抗体包含具有CDR3的重链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成其他氨基酸；
(i)抗体，该抗体包含具有CDR3的重链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第7位的Ala被取代成其他氨基酸；
(j)抗体，该抗体包含具有CDR3的重链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第8位的Met被取代成其他氨基酸；
(k)抗体，该抗体包含具有CDR3的重链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser和第5位的Thr被取代成其他氨基酸；
(l)抗体，该抗体包含具有CDR3的重链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第2位的Leu、第7位的Ala和第8位的Met被取代成其他氨基酸；
(m)抗体，该抗体包含具有CDR1的轻链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第1位的Arg被取代成其他氨基酸；
(n)抗体，该抗体包含具有CDR1的轻链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第4位的Gln被取代成其他氨基酸；
(o)抗体，该抗体包含具有CDR1的轻链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第9位的Tyr被取代成其他氨基酸；
(p)抗体，该抗体包含具有CDR1的轻链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第11位的Asn被取代成其他氨基酸；
(q)抗体，该抗体包含具有CDR2的轻链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第2位的Thr被取代成其他氨基酸；
(r)抗体，该抗体包含具有CDR3的轻链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第1位的Gln被取代成其他氨基酸；
(s)抗体，该抗体包含具有CDR3的轻链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第3位的Gly被取代成其他氨基酸；
(t)抗体，该抗体包含具有CDR1和CDR3的轻链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第9位的Tyr被取代成其他氨基酸，所述CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第3位的Gly被取代成其他氨基酸；
(u)抗体，该抗体包含具有CDR3的轻链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成其他氨基酸；
(v)抗体，该抗体包含具有CDR3的轻链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第1位的Gln和第5位的Thr被取代成其他氨基酸；
(w)抗体，该抗体包含具有CDR2和CDR3的重链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第9位的Thr被取代成其他氨基酸，所述CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser和第5位的Thr被取代成其他氨基酸；
(x)抗体，该抗体包含(k)所述的重链可变区和(v)所述的轻链可变区；或
(y)(x)所述的抗体，该抗体进一步包含(e)所述的CDR2。
[2]抗IL-6受体抗体，该抗体包含具有CDR2的轻链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第2位的Thr被取代成其他氨基酸。
[3]下述(a)～(y)中任一项所述的抗IL-6受体抗体：
(a)抗体，该抗体包含具有FR1的重链可变区，所述FR1在SEQID NO：7记载的氨基酸序列中第13位的Arg被取代成其他氨基酸；
(b)抗体，该抗体包含具有FR1的重链可变区，所述FR1在SEQID NO：7记载的氨基酸序列中第16位的Gln被取代成其他氨基酸；
(c)抗体，该抗体包含具有FR1的重链可变区，所述FR1在SEQID NO：7记载的氨基酸序列中第23位的Thr被取代成其他氨基酸；
(d)抗体，该抗体包含具有FR1的重链可变区，所述FR1在SEQID NO：7记载的氨基酸序列中第30位的Thr被取代成其他氨基酸；
(e)抗体，该抗体包含具有FR1的重链可变区，所述FR1在SEQID NO：7记载的氨基酸序列中第13位的Arg、第16位的Gln、第23位的Thr和第30位的Thr被取代成其他氨基酸；
(f)抗体，该抗体包含具有FR2的重链可变区，所述FR2在SEQID NO：8记载的氨基酸序列中第8位的Arg被取代成其他氨基酸；
(g)抗体，该抗体包含具有FR3的重链可变区，所述FR3在SEQID NO：9记载的氨基酸序列中第4位的Met被取代成其他氨基酸；
(h)抗体，该抗体包含具有FR3的重链可变区，所述FR3在SEQID NO：9记载的氨基酸序列中第5位的Leu被取代成其他氨基酸；
(i)抗体，该抗体包含具有FR3的重链可变区，所述FR3在SEQID NO：9记载的氨基酸序列中第16位的Arg被取代成其他氨基酸；
(j)抗体，该抗体包含具有FR3的重链可变区，所述FR3在SEQID NO：9记载的氨基酸序列中第27位的Val被取代成其他氨基酸；
(k)抗体，该抗体包含具有FR3的重链可变区，所述FR3在SEQID NO：9记载的氨基酸序列中第4位的Met、第5位的Leu、第16位的Arg和第27位的Val被取代成其他氨基酸；
(l)抗体，该抗体包含具有FR4的重链可变区，所述FR4在SEQID NO：10记载的氨基酸序列中第3位的Gln被取代成其他氨基酸；
(m)抗体，该抗体包含具有FR1的轻链可变区，所述FR1在SEQID NO：11记载的氨基酸序列中第18位的Arg被取代成其他氨基酸；
(n)抗体，该抗体包含具有FR2的轻链可变区，所述FR2在SEQID NO：12记载的氨基酸序列中第11位的Lys被取代成其他氨基酸；
(o)抗体，该抗体包含具有FR3的轻链可变区，所述FR3在SEQID NO：13记载的氨基酸序列中第23位的Gln被取代成其他氨基酸；
(p)抗体，该抗体包含具有FR3的轻链可变区，所述FR3在SEQID NO：13记载的氨基酸序列中第24位的Pro被取代成其他氨基酸；
(q)抗体，该抗体包含具有FR3的轻链可变区，所述FR3在SEQID NO：13记载的氨基酸序列中第27位的Ile被取代成其他氨基酸；
(r)抗体，该抗体包含具有FR3的轻链可变区，所述FR3在SEQID NO：13记载的氨基酸序列中第23位的Gln、第24位的Pro和第27位的Ile被取代成其他氨基酸；
(s)抗体，该抗体包含具有FR4的轻链可变区，所述FR4在SEQID NO：14记载的氨基酸序列中第10位的Lys被取代成其他氨基酸；
(t)抗体，该抗体包含具有FR4的重链可变区，所述FR4在SEQID NO：10记载的氨基酸序列中第5位的Ser被取代成其他氨基酸；
(u)抗体，该抗体包含具有FR4的重链可变区，所述FR4在SEQID NO：10记载的氨基酸序列中第3位的Gln和第5位的Ser被取代成其他氨基酸；
(v)抗体，该抗体包含具有FR3的重链可变区，所述FR3具有SEQID NO：184记载的氨基酸序列；
(w)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含(e)所述的FR1、(f)所述的FR2、(k)所述的FR3、和(l)或(u)所述的FR4；
(x)抗体，该抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含(m)所述的FR1、(n)所述的FR2、(r)所述的FR3和(s)所述的FR4；或
(y)抗体，该抗体包含(w)所述的重链可变区和(x)所述的轻链可变区。
[4]下述(a)～(l)中任一项所述的抗IL-6受体抗体：
(a)抗体，该抗体包含具有CDR1的重链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸；
(b)抗体，该抗体包含具有CDR2的重链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第9位的Thr被取代成其他氨基酸；
(c)抗体，该抗体包含具有CDR2的重链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第16位的Ser被取代成其他氨基酸；
(d)抗体，该抗体包含具有CDR2的重链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第9位的Thr和第16位的Ser被取代成其他氨基酸；
(e)抗体，该抗体包含具有CDR1的轻链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第1位的Arg被取代成其他氨基酸；
(f)抗体，该抗体包含具有CDR2的轻链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第2位的Thr被取代成其他氨基酸；
(g)抗体，该抗体包含具有CDR2的轻链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第4位的Arg被取代成其他氨基酸；
(h)抗体，该抗体包含具有CDR2的轻链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第2位的Thr和第4位的Arg被取代成其他氨基酸；
(i)抗体，该抗体包含具有CDR3的轻链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成其他氨基酸；
(j)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含(a)所述的CDR1、(d)所述的CDR2和具有SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列的CDR3；
(k)抗体，该抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含(e)所述的CDR1、(h)所述的CDR2和(i)所述的CDR3；或
(l)抗体，该抗体包含(j)所述的重链可变区和(k)所述的轻链可变区。
[5]下述(a)～(f)中任一项所述的抗IL-6受体抗体：
(a)抗体，该抗体包含具有CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸，所述CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第9位的Thr和第16位的Ser被取代成其他氨基酸，所述CDR3在SEQ IDNO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser和第5位的Thr被取代成其他氨基酸；
(b)抗体，该抗体包含具有CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第1位的Arg被取代成其他氨基酸，所述CDR2在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第2位的Thr和第4位的Arg被取代成其他氨基酸，所述CDR3在SEQID NO：6记载的氨基酸序列中第1位的Gln和第5位的Thr被取代成其他氨基酸；
(c)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO：22记载的氨基酸序列；
(d)抗体，该抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ IDNO：23记载的氨基酸序列；
(e)抗体，该抗体包含(a)所述的重链可变区和(b)所述的轻链可变区；或
(f)抗体，该抗体包含(c)所述的重链可变区和(d)所述的轻链可变区。
[6]下述(a)～(c)中任一项所述的人抗体恒定区：
(a)人抗体恒定区，其特征在于：在SEQ ID NO：19记载的氨基酸序列中，第329位(EU编号第446位)的Gly和第330位(EU编号第447位)的Lys均缺失；
(b)人抗体恒定区，其特征在于：在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中，第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失；
(c)人抗体恒定区，其特征在于：在SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列中，第326位(EU编号第446位)的Gly和第327位(EU编号第447位)的Lys均缺失。
[7]IgG2恒定区，其中，在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中，第209位(EU编号第330位)、第210位(EU编号第331位)和第218位(EU编号第339位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。
[8]IgG2恒定区，其中，在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中，第276位(EU编号第397位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。
[9]IgG2恒定区，其中，在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中，第14位(EU编号第131位)、第102位(EU编号第219位)和/或第16位(EU编号第133位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。
[10][9]所述的IgG2恒定区，其特征在于：在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中，第20位(EU编号第137位)和第21位(EU编号第138位)的氨基酸进一步被取代成其他氨基酸。
[11]IgG2恒定区，其中，在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中，第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的Arg和/或第298位(EU编号第419位)的Gln被取代成其他氨基酸；
[12]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在SEQ IDNO：20记载的氨基酸序列中，第209位(EU编号第330位)、第210位(EU编号第331位)、第218位(EU编号第339位)、第276位(EU编号第397位)、第14位(EU编号第131位)、第16位(EU编号第133位)、第102位(EU编号第219位)、第20位(EU编号第137位)和第21位(EU编号第138位)的氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[13]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在[12]所述的IgG2恒定区中，进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[14]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在SEQ IDNO：20记载的氨基酸序列中，第276位(EU编号第397位)、第14位(EU编号第131位)、第16位(EU编号第133位)、第102位(EU编号第219位)、第20位(EU编号第137位)和第21位(EU编号第138位)的氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[15]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在[14]所述的IgG2恒定区中，进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[16]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在SEQ IDNO：20记载的氨基酸序列中，第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser、第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的Arg和第298位(EU编号第419位)的Gln被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[17]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在[16]所述的IgG2恒定区中，进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[18]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在SEQ IDNO：20记载的氨基酸序列中，第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser、第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的Arg、第298位(EU编号第419位)的Gln和第313位(EU编号第434位)的Asn被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[19]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在[18]所述的IgG2恒定区中，进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[20]IgG4恒定区，其特征在于：在SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列中，第289位(EU编号第409位)的氨基酸被取代成其他氨基酸。
[21]IgG4恒定区，该IgG4恒定区具有下述氨基酸序列：在SEQ IDNO：21记载的氨基酸序列中，第289位(EU编号第409位)、第14、16、20、21、97、100、102、103、104和105位(分别为EU编号第131、133、137、138、214、217、219、220、221、222位)、第113、114、115位(分别为EU编号第233、234、235位)的氨基酸被取代成其他氨基酸、且第116位(EU编号第236位)的氨基酸缺失的氨基酸序列。
[22]IgG4恒定区，其中，在[21]所述的IgG4恒定区中，进一步缺失第326位(EU编号第446位)的Gly和第327位(EU编号第447位)的Lys。
[23]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在SEQ IDNO：20记载的氨基酸序列中，第209位(EU编号第330位)的Ala、第210位(EU编号第331位)的Pro、第218位(EU编号第339位)的Thr、第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[24]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在[23]所述的IgG2恒定区中，进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[25]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在SEQ IDNO：20记载的氨基酸序列中，第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
[26]IgG2恒定区，该IgG2恒定区具有下述氨基酸序列：在[25]所述的IgG2恒定区中，进一步具有第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
[27]恒定区，该恒定区具有SEQ ID NO：24记载的氨基酸序列。
[28]恒定区，该恒定区具有SEQ ID NO：118记载的氨基酸序列。
[29]恒定区，该恒定区具有SEQ ID NO：25记载的氨基酸序列。
[30]恒定区，该恒定区具有SEQ ID NO：151记载的氨基酸序列。
[31]恒定区，该恒定区具有SEQ ID NO：152记载的氨基酸序列。
[32]恒定区，该恒定区具有SEQ ID NO：153记载的氨基酸序列。
[33]恒定区，该恒定区具有SEQ ID NO：164记载的氨基酸序列。
[34]人抗体恒定区，该恒定区具有SEQ ID NO：194(M40ΔGK)记载的氨基酸序列。
[35]人抗体恒定区，该恒定区具有SEQ ID NO：192(M86ΔGK)记载的氨基酸序列。
[36]抗体，该抗体具有[6]～[35]中任一项所述的恒定区。
[37][36]所述的抗体，其特征在于：与IL-6受体结合。
[38]抗人IL-6受体抗体，该抗体与IL-6受体的结合活性为1nM以下。
[39]抗人IL-6受体抗体，其全长抗体的实测等电点为7.0以下、或者可变区的理论等电点为5.0以下。
[40]抗IL-6受体抗体，其特征在于：在20mM组氨酸-HCl、150mM NaCl、pH6.5～7.0的缓冲液中、在抗体浓度为100mg/mL的条件下，于25℃下经过1个月后抗体的聚集物比率的增加为0.3％以下。
[41]医药组合物，其中含有[36]～[40]中任一项所述的抗体。
附图说明
图1是显示WT和RD_6的BaF/gp130中和活性的曲线图。
图2是显示rhIL-s6R(R&D Systems)与WT的相互作用的传感图(センサ一グラフ)的曲线图。
图3是显示rhIL-s6R(R&D Systems)与RD_6的相互作用的传感图的曲线图。
图4-1是显示亲和性、中和活性较WT有所提高的CDR突变的列表的图。
图4-2是图4-1的续图。
图5是显示通过组合使亲和性、中和活性提高的CDR突变的列表的图。
图6是显示WT和RDC23的BaF/gp130中和活性的曲线图。
图7是显示rhIL-s6R(R&D Systems)与RDC23的相互作用的传感图的曲线图。
图8是显示rhsIL-6R与WT的相互作用的传感图的曲线图。
图9是显示rhsIL-6R与RDC23的相互作用的传感图的曲线图。
图10是显示SR344与WT的相互作用的传感图的曲线图。
图11是显示SR344与RDC23的相互作用的传感图的曲线图。
图12是显示WT和H53L28的BaF/gp130中和活性的曲线图。
图13是显示SR344与H53/L28的相互作用的传感图的曲线图。
图14是显示将WT、H53/L28对小鼠进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图15是显示将WT、H53/L28对小鼠进行皮下给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图16是显示WT和PF1的BaF/gp130中和活性的曲线图。
图17是显示SR344与PF1的相互作用的传感图的曲线图。
图18是显示WT、PF1的高浓度稳定性试验结果的曲线图。
图19是显示将WT、PF1对人IL-6受体转基因小鼠进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图20是显示将WT、PF1对人IL-6受体转基因小鼠进行静脉内给药后非结合型的人可溶型IL-6受体浓度变化的曲线图。
图21是显示利用凝胶过滤层析分析经盐酸洗脱法纯化的WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V、IgG4-R409K的聚集物含量的结果的图。
图22是显示WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4的阳离子交换层析(IEC)分析结果的图。
图23是显示WT-IgG2的铰链区的推定二硫键构象(結合様式)的图。
图24是显示WT-IgG2-SKSC的铰链区的推定二硫键构象的图。
图25是显示WT-IgG2和IgG2-SKSC的阳离子交换层析(IEC)分析结果的图。
图26是显示人源化PM-1抗体、H链C末端ΔK抗体和H链C末端ΔGK抗体的阳离子交换层析(IEC)分析结果的图。
图27是显示比较WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK与FcγRI的结合量的图。
图28是显示比较WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK与FcγRIIa的结合量的曲线图。
图29是显示比较WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK与FcγRIIb的结合量的曲线图。
图30是显示比较WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK与FcγRIIa(Val)的结合量的曲线图。
图31是显示在WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK的高浓度稳定性试验中聚集物增加量的图。
图32是显示在WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK的高浓度稳定性试验中Fab片段增加量的图。
图33是显示WT-IgG2、WT-M14ΔGK、WT-M31ΔGK的阳离子交换层析(IEC)分析结果的图。
图34是显示WT和F2H/L39-IgG1的BaF/gp130中和活性的曲线图。
图35是显示将WT、PF1、F2H/L39-IgG1以1.0mg/kg对食蟹猴进行皮下给药后血浆中抗体浓度变化的曲线图。
图36是显示食蟹猴的WT和F2H/L39-IgG1给药组的CRP浓度变化的曲线图。
图37是显示食蟹猴的WT和F2H/L39-IgG1给药组的非结合型食蟹猴IL-6受体浓度变化的曲线图。
图38是显示将WT-IgG1和WT-M14对人FcRn转基因小鼠进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图39是显示将WT-IgG1、WT-M14和WT-M58对人FcRn转基因小鼠进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图40是显示将WT-IgG1、WT-M44、WT-M58、WT-M73对人FcRn转基因小鼠进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图41是通过阳离子交换层析评价抗IL-6受体抗体WT、抗IL-6受体抗体F2H/L39、抗-IL-31受体抗体H0L0、抗RANKL抗体DNS的恒定区对异质性的影响的图。
图42是通过阳离子交换层析评价抗IL-6受体抗体WT、抗IL-6受体抗体F2H/L39的CH1结构域的半胱氨酸对异质性的影响的图。
图43是利用DSC评价抗IL-6受体抗体WT的CH1结构域的半胱氨酸对变性峰的影响的图。
图44是显示TOCILIZUMAB、对照和Fv5-M83对BaF/g130的中和活性的曲线图。
图45是显示TOCILIZUMAB、Fv3-M73和Fv4-M73对BaF/gp130的中和活性的曲线图。
图46是显示将TOCILIZUMAB、对照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83对食蟹猴进行静脉内给药后血浆中浓度变化的曲线图。
图47是显示将TOCILIZUMAB、对照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83对食蟹猴进行静脉内给药后CRP浓度变化的曲线图。
图48是显示将TOCILIZUMAB、对照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83对食蟹猴进行静脉内给药后可溶型IL-6受体的中和率变化的曲线图。
具体实施方式
本发明提供包含优于TOCILIZUMAB的第2代分子的药物组合物、以及上述药物组合物的制造方法，所述优于TOCILIZUMAB的第2代分子是指通过修饰人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的氨基酸序列，使药效增强、同时提高了药物动力学，从而减少了给药频率、持续发挥治疗效果，并且使免疫原性、安全性、理化性质得到改善。本发明还提供适合用作药物的抗体恒定区。
本发明涉及具有优异的抗原结合活性、中和活性、血浆中滞留性、稳定性和/或均匀性、且免疫原性风险有所降低的抗IL-6受体抗体。
优选抗IL-6受体抗体为人源化PM-1抗体(TOCILIZUMAB)。更具体而言，本发明通过氨基酸取代，提供抗原结合活性增强的人源化PM-1抗体、中和活性增强的人源化PM-1抗体、药物动力学有所提高的人源化PM-1抗体、免疫原性风险降低的人源化PM-1抗体、稳定性提高的人源化PM-1抗体、以及均匀性提高的人源化PM-1抗体。
人源化PM-1抗体与人IL-6受体结合，抑制人IL-6与人IL-6受体的结合。在本说明书中，人源化PM-1抗体的氨基酸序列与序列表的SEQ ID NO的对应关系如下：
重链氨基酸序列SEQ ID NO：15
轻链氨基酸序列SEQ ID NO：16
重链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO：17
轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO：18
重链CDR1(HCDR1)的氨基酸序列SEQ ID NO：1
重链CDR2(HCDR2)的氨基酸序列SEQ ID NO：2
重链CDR3(HCDR3)的氨基酸序列SEQ ID NO：3
重链FR1(HFR1)的氨基酸序列SEQ ID NO：7
重链FR2(HFR2)的氨基酸序列SEQ ID NO：8
重链FR3(HFR3)的氨基酸序列SEQ ID NO：9
重链FR4(HFR4)的氨基酸序列SEQ ID NO：10
轻链CDR1(LCDR1)的氨基酸序列SEQ ID NO：4
轻链CDR2(LCDR2)的氨基酸序列SEQ ID NO：5
轻链CDR3(LCDR3)的氨基酸序列SEQ ID NO：6
轻链FR1(LFR1)的氨基酸序列SEQ ID NO：11
轻链FR2(LFR2)的氨基酸序列SEQ ID NO：12
轻链FR3(LFR3)的氨基酸序列SEQ ID NO：13
轻链FR4(LFR4)的氨基酸序列SEQ ID NO：14
<亲和性、中和活性增强的抗体>
本发明提供对人IL-6受体的结合活性和/或中和活性高的抗人IL-6受体抗体。更具体而言，本发明提供下述(a)～(y)所述的抗体、以及该抗体的制造方法。
(a)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR1，所述重链CDR1在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第1位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Trp(RD_68)、Thr(RD_37)、Asp(RD_8)、Asn(RD_11)、Arg(RD_31)、Val(RD_32)、Phe(RD_33)、Ala(RD_34)、Gln(RD_35)、Tyr(RD_36)、Leu(RD_38)、His(RD_42)、Glu(RD_45)或Cys(RD_46)。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Trp的序列见SEQ ID NO：26。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Thr的序列见SEQ ID NO：27。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Asp的序列见SEQ ID NO：28。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Asn的序列见SEQ ID NO：29。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Arg的序列见SEQ ID NO：30。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Val的序列见SEQ ID NO：31。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Phe的序列见SEQ ID NO：32。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Ala的序列见SEQ ID NO：33。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Gln的序列见SEQ ID NO：34。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Tyr的序列见SEQ ID NO：35。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Leu的序列见SEQ ID NO：36。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成His的序列见SEQ ID NO：37。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Glu的序列见SEQ ID NO：38。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Cys的序列见SEQ ID NO：39。
(b)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR1，所述重链CDR1在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第5位的Trp被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Ile(RD_9)或Val(RD_30)。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第5位的Trp被取代成Ile的序列见SEQ ID NO：40。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第5位的Trp被取代成Val的序列见SEQ ID NO：41。
(c)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR2，所述重链CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第1位的Tyr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Phe(RD_82)。
在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第1位的Tyr被取代成Phe的序列见SEQ ID NO：42。
(d)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR2，所述重链CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第8位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Arg(RD_79)。
在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第8位的Thr被取代成Arg的序列见SEQ ID NO：43。
(e)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR2，所述重链CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Ser(RD_12)或Asn(RD_61)。
在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第9位的Thr被取代成Ser的序列见SEQ ID NO：44。
在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第9位的Thr被取代成Asn的序列见SEQ ID NO：45。
(f)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR3，所述重链CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Ile(RD_2)、Val(RD_4)、Thr(RD_80)或Leu(RD_5)。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Ile的序列见SEQ ID NO：46。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Val的序列见SEQ ID NO：47。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Thr的序列见SEQ ID NO：48。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成Leu的序列见SEQ ID NO：49。
(g)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR3，所述重链CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第2位的Leu被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Thr(RD_84)。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第2位的Leu被取代成Thr的序列见SEQ ID NO：50。
(h)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR3，所述重链CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Ala(RD_3)或Ile(RD_83)。其他优选的取代有：第5位的Thr被取代成Ser(RDC_14H)。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成Ala的序列见SEQ ID NO：51。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成Ile的序列见SEQ ID NO：52。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成Ser的序列见SEQ ID NO：53。
(i)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR3，所述重链CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第7位的Ala被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Ser(RD_81)或Val(PF_3H)。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第7位的Ala被取代成Ser的序列见SEQ ID NO：54。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第7位的Ala被取代成Val的序列见SEQ ID NO：55。
(j)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR3，所述重链CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第8位的Met被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Leu(PF_4H)。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第8位的Met被取代成Leu的序列见SEQ ID NO：56。
(k)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR3，所述重链CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser和第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选将第1位的Ser取代成Leu、将第5位的Thr取代成Ala(RD_6)。其他优选的取代有：第1位的Ser取代成Val、第5位的Thr取代成Ala(RDC_2H)；第1位的Ser取代成Ile、第5位的Thr取代成Ala(RDC_3H)；第1位的Ser取代成Thr、第5位的Thr取代成Ala(RDC_4H)；第1位的Ser取代成Val、第5位的Thr取代成Ile(RDC_5H)；第1位的Ser取代成Ile、第5位的Thr取代成Ile(RDC_6H)；第1位的Ser取代成Thr、第5位的Thr取代成Ile(RDC_7H)；以及第1位的Ser取代成Leu、第5位的Thr取代成Ile(RDC_8H)。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Leu、第5位的Thr取代成Ala的序列见SEQ ID NO：57。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Val、第5位的Thr取代成Ala的序列见SEQ ID NO：58。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Ile、第5位的Thr取代成Ala的序列见SEQ ID NO：59。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Thr、第5位的Thr取代成Ala的序列见SEQ ID NO：60。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Val、第5位的Thr取代成Ile的序列见SEQ ID NO：61。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Ile、第5位的Thr取代成Ile的序列见SEQ ID NO：62。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Thr、第5位的Thr取代成Ile的序列见SEQ ID NO：63。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Leu、第5位的Thr取代成Ile的序列见SEQ ID NO：64。
(l)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有重链CDR3，所述重链CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第2位的Leu、第7位的Ala和第8位的Met被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第2位的Leu取代成Thr、第7位的Ala取代成Val、第8位的Met取代成Leu(RD_78)。
在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列中第2位的Leu取代成Thr、第7位的Ala取代成Val、第8位的Met取代成Leu的序列见SEQ IDNO：65。
(m)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有轻链CDR1，所述轻链CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第1位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Phe(RD_18)。
在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第1位的Arg被取代成Phe的序列见SEQ ID NO：66。
(n)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有轻链CDR1，所述轻链CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第4位的Gln被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Arg(RD_26)或Thr(RD_20)。
在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第4位的Gln被取代成Arg的序列见SEQ ID NO：67。
在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第4位的Gln被取代成Thr的序列见SEQ ID NO：68。
(o)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有轻链CDR1，所述轻链CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第9位的Tyr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Phe(RD_73)。
在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第9位的Tyr被取代成Phe的序列见SEQ ID NO：69。
(p)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有轻链CDR1，所述轻链CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第11位的Asn被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Ser(RD_27)。
在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第11位的Asn被取代成Ser的序列见SEQ ID NO：70。
(q)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有轻链CDR2，所述轻链CDR2在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Gly。
在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第2位的Thr被取代成Gly的序列见SEQ ID NO：71。
(r)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有轻链CDR3，所述轻链CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第1位的Gln被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Gly(RD_28)、Asn(RD_29)或Ser(RDC_15L)。
在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第1位的Gln被取代成Gly的序列见SEQ ID NO：72。
在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第1位的Gln被取代成Asn的序列见SEQ ID NO：73。
在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第1位的Gln被取代成Ser的序列见SEQ ID NO：74。
(s)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有轻链CDR3，所述轻链CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第3位的Gly被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Ser。
在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第3位的Gly被取代成Ser的序列见SEQ ID NO：75。
(t)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有轻链CDR1和轻链CDR3，所述轻链CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第9位的Tyr被取代成其他氨基酸，所述轻链CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第3位的Gly被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第9位的Tyr被取代成Phe，优选在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第3位的Gly被取代成Ser(RD_72)。
(u)抗人IL-6受体抗体，该抗体具有轻链CDR3，所述轻链CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Arg(RD_23)或Ser。
在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成Arg的序列见SEQ ID NO：76。
在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第5位的Thr被取代成Ser的序列见SEQ ID NO：77。
(v)抗IL-6受体抗体，该抗体具有轻链CDR3，所述轻链CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第1位的Gln和第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第1位的Gln取代成Gly、第5位的Thr取代成Ser(RD_22)。其他优选的取代有：第1位的Gln取代成Gly、第5位的Thr取代成Arg(RDC_11L)。
在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第1位的Gln取代成Gly、第5位的Thr取代成Ser的序列见SEQ ID NO：78。
在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第1位的Gln取代成Gly、第5位的Thr取代成Arg的序列见SEQ ID NO：79。
(w)抗IL-6受体抗体，该抗体包含重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr被取代成其他氨基酸，所述重链CDR3在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser和第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
优选在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr被取代成Asn。在SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中，第1位的Ser和第5位的Thr取代后的氨基酸优选的组合有：Leu和Ala(RDC_27H)；Val和Ala(RDC_28H)；Ile和Ala(RDC_30H)；Thr和Ala(RDC_4H)；Val和Ile(RDC_29H)；Ile和Ile(RDC_32H)；Thr和Ile(RDC_7H)；Leu和Ile(RDC_8H)。
(x)抗体，该抗体包含两个可变区，其中一个可变区具有(k)所述的重链CDR3，另一个可变区具有(v)所述的轻链CDR3。
(y)(x)所述的抗体，该抗体进一步包含(e)所述的重链CDR2。
本发明提供抗体及该抗体的制造方法，所述抗体至少包含上述(a)～(y)中任一项所述的氨基酸取代。因此，在本发明的抗体中还包括：除了包含上述(a)～(y)中任一项所述的氨基酸取代之外、还包含上述(a)～(y)所述的氨基酸取代以外的氨基酸取代的抗体。本发明的抗体中，还包括组合有多个上述(a)～(y)中任一项所述的氨基酸取代的抗体。作为上述(a)～(y)所述的氨基酸取代，有上述CDR氨基酸序列取代成其他氨基酸。作为除上述(a)～(y)所述的氨基酸取代以外的氨基酸取代，例如有：其他CDR部分的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。此外，还有FR的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。还有恒定区的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。
在本发明的抗体中，还包括将本发明中发现的高亲和性CDR移植到除人源化PM-1抗体以外的任何构架中而得到的抗体。本发明的抗体中包括下述抗体：对于将本发明中发现的高亲和性CDR移植到除人源化PM-1抗体以外的任何构架中结果亲和性下降的抗体，为了获得具原始亲和性的抗体而向构架部分导入突变(例如参照Curr.Opin.Biotechnol.1994 Aug；5(4)：428-33))的抗体；以及为了获得具原始亲和性的抗体而向CDR部分导入突变(例如参照US2006/0122377)的抗体。
在本发明中，优选对人源化PM-1抗体进行上述(a)～(y)中任一项所述的氨基酸取代。在人源化PM-1抗体中，进行了上述(a)～(y)中任一项所述的氨基酸取代的抗体对IL-6受体具有高的中和活性。在人源化PM-1抗体中，进行了上述(a)～(y)中任一项所述的氨基酸取代的抗体，其作为与IL-6有关的类风湿性关节炎等炎症性疾病等的治疗药有效。
需要说明的是，包含上述(a)～(y)中任一项所述的氨基酸取代的抗体例如还可以以下述(1)或(2)的形式进行描述。此处虽然是以(a)的抗体为例进行描述，但对于(b)～(y)的抗体也可以同样来描述。
(1)抗体，该抗体包含具有CDR1的重链可变区，所述CDR1具有在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
(2)抗体，该抗体包含具有CDR1的H链，所述CDR1具有在SEQID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
<结合活性增强的抗体>
本发明还提供与IL-6受体的结合活性高的抗IL-6受体抗体。本发明中，“与IL-6受体的结合活性高的抗IL-6受体抗体”是指通常在生理条件下、于37℃下测定的亲和性为1nM以下的抗体，优选亲和性为0.1nM以下的抗体，进一步优选亲和性为0.04nM以下的抗体。认为这样的与IL-6受体的结合活性高的抗IL-6受体抗体，其中和抗原的生物作用的能力提高。
对本发明的与IL-6受体的结合活性高的抗IL-6受体抗体中所导入的氨基酸取代没有特别限定，例如有上述氨基酸取代。
对IL-6受体没有特别限定，但优选人IL-6受体。
结合活性的测定可以利用本领域技术人员所公知的方法来进行，例如可以利用使用了SPR的Biacore(BIACORE)等进行测定。
<CDR序列的免疫原性风险降低的抗体>
本发明还提供免疫原性降低的抗IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1抗体。认为若抗体序列中存在与HLA结合的T细胞表位，则抗体的免疫原性升高。因此，对抗体的序列进行取代以除去抗体序列中存在的T细胞表位，从而可以降低抗体的免疫原性风险。
本发明通过将抗体的氨基酸序列、特别是CDR序列中的氨基酸取代成其他氨基酸，提供除去了T细胞表位、免疫原性降低的人源化抗人IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1轻链可变区。本发明还提供包含该轻链可变区的抗体。
更具体而言，本发明提供在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr被取代成其他氨基酸的轻链CDR2。本发明还提供包含该轻链CDR2的轻链可变区。本发明还提供包含该轻链可变区的抗IL-6受体抗体。对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Gly。在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第2位的Thr被取代成Gly的序列见SEQ ID NO：71。该氨基酸取代优选在人源化PM-1抗体的轻链可变区中进行。
<H53/L28的FR和CDR>
本发明还提供药物动力学、稳定性和/或免疫原性得到改善的抗人IL-6受体抗体。关于IgG，发现具有同一的Fc区的IgG在血浆中的半衰期与pI以高的相关系数相关。因此，本发明人等尝试着改变抗不同抗原的2种抗体的可变区的pI时，成功地在不改变与抗原种类无关的Fc区的情况下控制了血浆中半衰期。认为抗体非特异性地进入内皮细胞中的速度依赖于带有负电荷的细胞表面与IgG的理化库伦相互作用(Coulomb interaction)。通过降低IgG的pI，使库伦相互作用降低，抗体非特异性地进入内皮细胞中的量减少，其结果，通过减少抗体在内皮细胞中的代谢，可以提高抗体的药物动力学。
即，本发明通过对抗IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1抗体的氨基酸序列进行取代，提供等电点降低、药物动力学提高的抗人IL-6受体抗体。具体而言，在Kabat编号(Kabat EA等人，1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest(目标免疫蛋白的1991序列).NIH)中，将人源化PM-1的H13(SEQ ID NO：7的第13位的氨基酸)、H16(SEQ ID NO：7的第16位的氨基酸)、H43(SEQ ID NO：8的第8位的氨基酸)、H81(SEQ ID NO：9的第16位的氨基酸)、H105(SEQ ID NO：10的第3位的氨基酸)、L18(SEQ ID NO：11的第18位的氨基酸)、L45(SEQ ID NO：12的第11位的氨基酸)、L79(SEQ ID NO：13的第23位的氨基酸)、L107(SEQ ID NO：14的第10位的氨基酸)、H31(SEQ IDNO：1的第1位的氨基酸)、L24(SEQ ID NO：4的第1位的氨基酸)和/或L53(SEQ ID NO：5的第4位的氨基酸)取代成等电点降低的其他氨基酸。由此可以在不影响人源化PM-1的结合活性和稳定性的情况下使等电点降低。另外，在人源化PM-1抗体中，将小鼠序列人源化时，为了保持结合活性而在小鼠序列中残留几个氨基酸残基。具体而言，在上述Kabat编号中，人源化PM-1抗体中的H27(SEQ ID NO：7的第27位的氨基酸)、H28(SEQ ID NO：7的第28位的氨基酸)、H29(SEQID NO：7的第29位的氨基酸)、H30(SEQ ID NO：7的第30位的氨基酸)和H71直接利用小鼠序列。关于HFR1，认为通过取代H13、H16、H23和H30，可以将HFR1转换成人序列，可以制作免疫原性风险较人源化PM-1抗体进一步降低的抗体。而且，由于人源化PM-1抗体是通过CDR嫁接而被人源化的抗体，所以认为在稳定性方面存在改善的空间。例如，认为在抗体可变区中，通过将暴露于表面的氨基酸残基取代成亲水性的氨基酸，可以使抗体稳定。并且，通过将CDR序列转化成共有序列，也可以使抗体稳定。关于人源化PM-1抗体，通过将上述Kabat编号中的H69(SEQ ID NO：9的第4位的氨基酸)的Met取代成Ile(疏水核结构的稳定化)、H70(SEQ ID NO：9的第5位的氨基酸)的Leu取代成Ser(暴露表面的残基的亲水化)、H58(SEQ IDNO：2的第9位的氨基酸)的Thr取代成Asn(将重链CDR2转化成共有序列)、H65(SEQ ID NO：2的第16位的氨基酸)的Ser取代成Gly(将β-转角部分取代成Gly、将重链CDR2转化成共有序列)、或L93(SEQID NO：6的第5位的氨基酸)的Thr取代成Ser(暴露表面的残基的亲水化)，可以使抗体稳定。通过将上述LCDR2(SEQ ID NO：5)的第2位、即L51的Thr取代成Gly，可以在不影响结合活性和稳定性的情况下除去在计算机芯片上预测的T细胞表位，从而可以降低免疫原性风险。将上述氨基酸取代组合起来，可以获得抗体的药物动力学、免疫原性、稳定性均得到改善的抗IL-6受体抗体。
这样的抗体的例子有：下述(1)～(37)中任一项所述的抗体。
(1)抗体，该抗体包含具有FR1的重链可变区，所述FR1在SEQID NO：7记载的氨基酸序列中第13位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Lys。
在SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列中第13位的Arg取代成Lys的序列见SEQ ID NO：80。
(2)抗体，该抗体包含具有FR1的重链可变区，所述FR1在SEQID NO：7记载的氨基酸序列中第16位的Gln被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列中第16位的Gln取代成Glu的序列见SEQ ID NO：81。
(3)抗体，该抗体包含具有FR1的重链可变区，所述FR1在SEQID NO：7记载的氨基酸序列中第23位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Ala。
在SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列中第23位的Thr取代成Ala的序列见SEQ ID NO：82。
(4)抗体，该抗体包含具有FR1的重链可变区，所述FR1在SEQID NO：7记载的氨基酸序列中第30位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Ser。
在SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列中第30位的Thr取代成Ser的序列见SEQ ID NO：83。
(5)抗体，该抗体包含具有FR1的重链可变区，所述FR1在SEQID NO：7记载的氨基酸序列中第13位的Arg、第16位的Gln、第23位的Thr和第30位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第13位的Arg取代成Lys、第16位的Gln取代成Glu、第23位的Thr取代成Ala、第30位的Thr取代成Ser。
在SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列中第13位的Arg取代成Lys、第16位的Gln取代成Glu、第23位的Thr取代成Ala、第30位的Thr取代成Ser的序列见SEQ ID NO：84。
(6)抗体，该抗体包含具有FR2的重链可变区，所述FR2在SEQID NO：8记载的氨基酸序列中第8位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO：8记载的氨基酸序列中第8位的Arg取代成Glu的序列见SEQ ID NO：85。
(7)抗体，该抗体包含具有FR3的重链可变区，所述FR3在SEQID NO：9记载的氨基酸序列中第4位的Met被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Ile。
在SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列中第4位的Met被取代成Ile的序列见SEQ ID NO：86。
(8)抗体，该抗体包含具有FR3的重链可变区，所述FR3在SEQID NO：9记载的氨基酸序列中第5位的Leu被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Ser。
在SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列中第5位的Leu取代成Ser的序列见SEQ ID NO：87。
(9)抗体，该抗体包含具有FR3的重链可变区，所述FR3在SEQID NO：9记载的氨基酸序列中第16位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Lys。
在SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列中第16位的Arg取代成Lys的序列见SEQ ID NO：88。
(10)抗体，该抗体包含具有FR3的重链可变区，所述FR3在SEQID NO：9记载的氨基酸序列中第27位的Val被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Ala。
在SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列中第27位的Val取代成Ala的序列见SEQ ID NO：89。
(11)抗体，该抗体包含具有FR3的重链可变区，所述FR3在SEQID NO：9记载的氨基酸序列(HFR3)中第4位的Met、第5位的Leu、第16位的Arg和第27位的Val被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第4位的Met取代成Ile、第5位的Leu取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第27位的Val取代成Ala。
在SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列中第4位的Met取代成Ile、第5位的Leu取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第27位的Val取代成Ala的序列见SEQ ID NO：90。
(12)抗体，该抗体包含具有FR4的重链可变区，所述FR4在SEQID NO：10记载的氨基酸序列(HFR4)中第3位的Gln被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列中第3位的Gln取代成Glu的序列见SEQ ID NO：91。
(13)抗体，该抗体包含具有FR1的轻链可变区，所述FR1在SEQID NO：11记载的氨基酸序列(LFR1)中第18位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Ser。
在SEQ ID NO：11记载的氨基酸序列中第18位的Arg取代成Ser的序列见SEQ ID NO：92。
(14)抗体，该抗体包含具有FR2的轻链可变区，所述FR2在SEQID NO：12记载的氨基酸序列(LFR2)中第11位的Lys被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO：12记载的氨基酸序列中第11位的Lys取代成Glu的序列见SEQ ID NO：93。
(15)抗体，该抗体包含具有FR3的轻链可变区，所述FR3在SEQID NO：13记载的氨基酸序列中第23位的Gln被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO：13记载的氨基酸序列中第23位的Gln取代成Glu的序列见SEQ ID NO：94。
(16)抗体，该抗体包含具有FR3的轻链可变区，所述FR3在SEQID NO：13记载的氨基酸序列中第24位的Pro被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Ala。
在SEQ ID NO：13记载的氨基酸序列中第24位的Pro取代成Ala的序列见SEQ ID NO：95。
(17)抗体，该抗体包含具有FR3的轻链可变区，所述FR3在SEQID NO：13记载的氨基酸序列中第27位的Ile被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸序列没有特别限定，但优选取代成Ala。
在SEQ ID NO：13记载的氨基酸序列中第27位的Ile取代成Ala的序列见SEQ ID NO：96。
(18)抗体，该抗体包含具有FR3的轻链可变区，所述FR3在SEQID NO：13记载的氨基酸序列(LFR3)中第23位的Gln、第24位的Pro和第27位的Ile被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第23位的Gln取代成Glu、第24位的Pro取代成Ala、第27位的Ile取代成Ala。
在SEQ ID NO：13记载的氨基酸序列中第23位的Gln取代成Glu、第24位的Pro取代成Ala、第27位的Ile取代成Ala的序列见SEQ IDNO：97。
(19)抗体，该抗体包含具有FR4的轻链可变区，所述FR4在SEQID NO：14记载的氨基酸序列(LFR4)中第10位的Lys被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO：14记载的氨基酸序列中第10位的Lys取代成Glu的序列见SEQ ID NO：98。
(20)抗体，该抗体包含具有FR4的重链可变区，所述FR4在SEQID NO：10记载的氨基酸序列(HFR4)中第5位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Thr。
在SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列中第5位的Ser取代成Thr的序列见SEQ ID NO：132。
(21)抗体，该抗体包含具有FR4的重链可变区，所述FR4在SEQID NO：10记载的氨基酸序列(HFR4)中第3位的Gln和第5位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第3位的Gln取代成Glu、第5位的Ser取代成Thr。
在SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列中第3位的Gln取代成Glu、第5位的Ser取代成Thr的序列见SEQ ID NO：133。
(22)抗体，该抗体包含(5)、(6)、(11)和(21)所述的进行了氨基酸取代的人源化PM-1重链可变区。
(23)抗体，该抗体包含(13)、(14)、(18)和(19)所述的进行了氨基酸取代的人源化PM-1轻链可变区。
(24)抗体，该抗体包含(22)所述的重链可变区和(23)所述的轻链可变区。
(25)抗体，该抗体包含具有CDR1的重链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第1位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Asp。
在SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列中第1位的Ser取代成Asp的序列见SEQ ID NO：28。
(26)抗体，该抗体包含具有CDR2的重链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第16位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Gly。
在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第16位的Ser取代成Gly的序列见SEQ ID NO：99。
(27)抗体，该抗体包含具有CDR2的重链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr和第16位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第9位的Thr取代成Asn、第16位的Ser取代成Gly。
在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第9位的Thr取代成Asn、第16位的Ser取代成Gly的序列见SEQ ID NO：100。
(28)抗体，该抗体包含具有CDR1的轻链可变区，所述CDR1在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第1位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Gln。
在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第1位的Arg取代成Gln的序列见SEQ ID NO：101。
(29)抗体，该抗体包含具有CDR2的轻链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第4位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Glu。
在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第4位的Arg取代成Glu的序列见SEQ ID NO：102。
(30)抗体，该抗体包含具有CDR2的轻链可变区，所述CDR2在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr和第4位的Arg被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第2位的Thr取代成Gly、第4位的Arg取代成Glu。
在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第2位的Thr取代成Gly、第4位的Arg取代成Glu的序列见SEQ ID NO：103。
(31)抗体，该抗体包含具有CDR3的轻链可变区，所述CDR3在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第5位的Thr被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Ser。
在SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列中第5位的Thr取代成Ser的序列见SEQ ID NO：77。
(32)抗体，该抗体包含(25)和(27)所述的进行了氨基酸取代的重链可变区。
(33)抗体，该抗体包含(28)、(30)和(31)所述的进行了氨基酸取代的轻链可变区。
(34)抗体，该抗体包含(32)所述的重链可变区和(33)所述的轻链可变区。
(35)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO：104记载的氨基酸序列(H53/L28的VH)。
(36)抗体，该抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ IDNO：105记载的氨基酸序列(H53/L28的VL)。
(37)抗体，该抗体具有(35)所述的重链可变区和(36)所述的轻链可变区。
优选对人源化PM-1抗体进行上述(1)～(37)中任一项所述的氨基酸取代。本发明提供至少包含上述(1)～(37)中任一项所述的氨基酸取代的抗体、以及该抗体的制造方法。因此，本发明的抗体中也包括：除包含上述(1)～(37)中任一项所述的氨基酸取代之外、还包含上述(1)～(37)所述的氨基酸取代以外的氨基酸取代的抗体。在本发明的抗体中，还包括组合有多个上述(1)～(37)中任一项所述的氨基酸取代的抗体。作为上述(1)～(37)所述的氨基酸取代，例如有上述FR和CDR的氨基酸序列的取代。作为除上述(1)～(37)所述的氨基酸取代以外的氨基酸取代，有除上述以外的FR和CDR序列的取代、缺失、添加和/或插入等。此外，还有恒定区的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。
并且，作为除上述氨基酸修饰以外的、在不降低抗IL-6受体抗体活性的情况下降低等电点的修饰，例如有：在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中将第15位的Lys和/或第16位的Ser取代成其他氨基酸的修饰。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第15位的Lys取代成Gln、第16位的Ser取代成Asp。在SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列中第15位的Lys取代成Gln、第16位的Ser取代成Asp的序列见SEQ ID NO：121。另外，可以对SEQ ID NO：100记载的氨基酸序列进行上述氨基酸取代。在SEQ ID NO：100记载的氨基酸序列中第15位的Lys取代成Gln、第16位的Gly取代成Asp的序列见SEQ ID NO：122。因此，本发明提供包含具有CDR2的重链可变区的抗体，所述CDR2在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：100记载的氨基酸序列中第15位的Lys和/或第16位的Ser被取代成其他氨基酸。
作为降低等电点的其他修饰，还有在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中将第4位的Gln取代成其他氨基酸的修饰。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Glu。在SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列中第4位的Gln取代成Glu的氨基酸序列见SEQ ID NO：123。可以对SEQ ID NO：101的氨基酸序列进行上述氨基酸取代。在SEQ ID NO：101记载的氨基酸序列中第4位的Gln取代成Glu的氨基酸序列见SEQID NO：124。因此，本发明提供包含具有CDR1的轻链可变区的抗体，所述CDR1在SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：101记载的氨基酸序列中第4位的Gln被取代成其他氨基酸。
并且，作为降低等电点的其他修饰，其例子有：在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中将第6位的His取代成其他氨基酸的修饰。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Glu。在SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列中第6位的His取代成Glu的氨基酸序列见SEQ IDNO：125。另外，可以对SEQ ID NO：103的氨基酸序列进行上述氨基酸取代。在SEQ ID NO：103记载的氨基酸序列中第6位的His取代成Glu的氨基酸序列见SEQ ID NO：126。因此，本发明提供包含具有CDR2的轻链可变区的抗体，所述CDR2在SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：103的氨基酸序列中第6位的His被取代成其他氨基酸。
并且，在SEQ ID NO：90记载的重链FR3的氨基酸序列中，作为降低免疫原性风险的修饰，其例子有：将第27位(Kabat编号H89)的Ala取代成Val的修饰。在SEQ ID NO：90记载的氨基酸序列中第27位的Ala取代成Val的氨基酸序列见SEQ ID NO：127。因此，本发明提供包含具有FR3的重链可变区的抗体，所述FR3在SEQ ID NO：90的氨基酸序列中第27位的Ala取代成Val。
在SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：90记载的重链FR3的氨基酸序列中唯一残留的小鼠序列、即第6位(Kabat编号H71)的Arg，认为通过使用H71位保有Arg的人VH1亚纲(SEQ ID NO：128)或人VH3亚纲(SEQ ID NO：129)的人序列作为FR3序列，可以制作构架完全是人序列的抗人IL-6受体抗体。因此，本发明提供包含重链可变区的抗体，所述重链可变区具有SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：129记载的FR3。
并且，在SEQ ID NO：10记载的重链FR4的氨基酸序列中，作为提高稳定性的修饰，其例子有：将第5位(Kabat编号H107)的Ser取代成Ile的修饰。在SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列中，第5位的Ser取代成Ile的氨基酸序列见SEQ ID NO：130。另外，也可以将该氨基酸导入到SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列中。在SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列中第5位的Ser取代成Ile的氨基酸序列见SEQ IDNO：131。因此，本发明提供包含具有FR4的重链可变区的抗体，所述FR4在SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列中第5位的Ser被取代成Ile。
优选对人源化PM-1抗体、H53/L28(包含SEQ ID NO：104的重链可变区和SEQ ID NO：105的轻链可变区的抗体)或PF1抗体(包含SEQID NO：22的重链可变区和SEQ ID NO：23的轻链可变区的抗体)进行上述氨基酸取代。本发明提供至少包含上述氨基酸取代的抗体及该抗体的制造方法。因此，本发明的抗体中也包括：除了包含上述氨基酸取代之外、还包含上述(1)～(37)所述的氨基酸取代和/或上述(1)～(37)以外的氨基酸取代的抗体。作为上述(1)～(37)所述的氨基酸取代以外的氨基酸取代，其例子有：上述以外的FR和CDR序列的取代、缺失、添加和/或插入等。此外，还有恒定区的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。
<低等电点的抗人IL-6受体抗体>
本发明还提供低等电点的抗IL-6受体抗体。本发明的低等电点的抗体包括：全长抗体的实测等电点低的抗体和可变区(VH/VL)的理论等电点低的抗体。
在本发明中，全长抗体的实测等电点低的抗IL-6受体抗体通常是指实测等电点为7.5以下的抗体，优选实测等电点为7.0以下的抗体，进一步优选实测等电点为6.0以下的抗体。实测等电点可以按照本领域技术人员所公知的方法进行测定，例如可以采用非变性凝胶等电点电泳或毛细管等电点电泳等方法进行测定。
在本发明中，可变区的理论等电点低的抗IL-6受体抗体通常是指理论等电点为5.5以下的抗体，优选理论等电点为5.0以下的抗体，进一步优选理论等电点为4.0以下的抗体。理论等电点可以通过本领域技术人员所公知的方法算出，例如通过使用GENETYX(GENETYXCORPORATION)等软件，可以算出可变区VH和VL的理论等电点。
在本发明的低等电点的抗IL-6受体抗体中，对所导入的氨基酸取代没有特别限定，例如有上述氨基酸取代。认为这样的低等电点的抗IL-6受体抗体，其药物动力学有所提高。
对IL-6受体没有特别限定，但优选人IL-6受体。
<在高浓度下稳定的抗人IL-6受体抗体>
本发明还提供在高浓度下稳定的抗IL-6受体抗体。
本发明中，“在高浓度下稳定”是指在适于皮下给药的pH6.5～7.0的范围内适当选择的缓冲液条件(例如20mM组氨酸-HCl、150mMNaCl)下，100mg/mL抗IL-6受体抗体的高浓度抗体溶液在25℃下经过1个月聚集物比率(凝胶过滤层析中聚集物峰面积/总峰面积×100)的增加为0.3％以下，优选0.2％以下，进一步优选为0.1％以下。需要说明的是，抗IL-6受体抗体的浓度只要是100mg/mL以上即可，例如可以是200mg/mL或300mg/mL等。
对本发明的在高浓度下稳定的抗IL-6受体抗体没有特别限定，例如可以利用上述氨基酸取代等来制作该抗体。
对IL-6受体没有特别限定，但优选人IL-6受体。
本发明还提供对进行了上述(1)～(37)中任一项所述的氨基酸取代的人源化PM-1抗体进一步进行上述(a)～(y)中任一项所述的、提高结合活性和/或中和活性的氨基酸取代的抗体。作为这样的抗体的一个方式，其例子有：具有重链可变区和轻链可变区的抗体(PF1)，所述重链可变区具有SEQ ID NO：22记载的氨基酸序列(PF1_H)，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：23记载的氨基酸序列(PF1_L)，但并不限于此。
本发明还提供下述抗体的(A)～(I)中任一项所述的抗IL-6受体抗体：
(A)重链可变区，该重链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1具有SEQ ID NO：165记载的氨基酸序列(VH5-M83的CDR1)，所述CDR2具有SEQ ID NO：166记载的氨基酸序列(VH5-M83的CDR2)，所述CDR3具有SEQ ID NO：167记载的氨基酸序列(VH5-M83的CDR3)；
(B)轻链可变区，该轻链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1具有SEQ ID NO：101记载的氨基酸序列(VL5的CDR1)，所述CDR2具有SEQ ID NO：168记载的氨基酸序列(VL5的CDR2)，所述CDR3具有SEQ ID NO：79记载的氨基酸序列(VL5的CDR3)；
(C)抗体，该抗体包含(A)所述的重链可变区和(B)所述的轻链可变区；
(D)重链可变区，该重链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1具有SEQ ID NO：169记载的氨基酸序列(VH3-M73的CDR1)，所述CDR2具有SEQ ID NO：170记载的氨基酸序列(VH3-M73的CDR2)，所述CDR3具有SEQ ID NO：171记载的氨基酸序列(VH3-M73的CDR3)；
(E)轻链可变区，该轻链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1具有SEQ ID NO：172记载的氨基酸序列(VL3的CDR1)，所述CDR2具有SEQ ID NO：173记载的氨基酸序列(VL3的CDR2)，所述CDR3具有SEQ ID NO：79记载的氨基酸序列(VL3的CDR3)；
(F)抗体，该抗体包含(D)所述的重链可变区和(E)所述的轻链可变区；
(G)重链可变区，该重链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1具有SEQ ID NO：169记载的氨基酸序列(VH4-M73的CDR1)，所述CDR2具有SEQ ID NO：174记载的氨基酸序列(VH4-M73的CDR2)，所述CDR3具有SEQ ID NO：171记载的氨基酸序列(VH4-M73的CDR3)；
(H)轻链可变区，该轻链可变区具有CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1具有SEQ ID NO：175记载的氨基酸序列(VL1的CDR1)，所述CDR2具有SEQ ID NO：173记载的氨基酸序列(VL1的CDR2)，所述CDR3具有SEQ ID NO：79记载的氨基酸序列(VL1的CDR3)；
(I)抗体，该抗体包含(G)所述的重链可变区和(H)所述的轻链可变区。
本发明还提供下述(a)～(q)中任一项所述的抗IL-6受体抗体：
(a)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO：159记载的氨基酸序列(H96-IgG1可变区)；
(b)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有下述氨基酸序列：在SEQ ID NO：159记载的氨基酸序列(H96-IgG1可变区)中第35位的Trp、第51位的Tyr、第63位的Ser、第65位的Lys、第66位的Gly、第99位的Val、第103位的Ile、第108位的Tyr、第111位的Glu、第113位的Thr中的至少1个氨基酸被取代成其他氨基酸的氨基酸序列；
(c)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有下述氨基酸序列：在SEQ ID NO：159记载的氨基酸序列(H96-IgG1可变区)中第65位的Lys、第66位的Gly、第99位的Val、第103位的Ile、第111位的Glu、第113位的Thr被取代成其他氨基酸的氨基酸序列；
(d)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有下述氨基酸序列：在SEQ ID NO：159记载的氨基酸序列(H96-IgG1可变区)中第35位的Trp、第51位的Tyr、第63位的Ser、第65位的Lys、第66位的Gly、第99位的Val、第103位的Ile、第108位的Tyr被取代成其他氨基酸的氨基酸序列；
(e)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO：160记载的氨基酸序列(F2H-IgG1可变区)；
(f)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO：161记载的氨基酸序列(VH5-M83可变区)；
(g)抗体，该抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区具有下述氨基酸序列：在SEQ ID NO：23记载的氨基酸序列(PF1L)中第27位的Gln和/或第55位的His被取代成其他氨基酸的氨基酸序列；
(h)抗体，该抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ IDNO：162记载的氨基酸序列(L39可变区)；
(i)抗体，该抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ IDNO：163记载的氨基酸序列(VL5-κ可变区)；
(j)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO：176记载的氨基酸序列(VH3-M73可变区)；
(k)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO：178记载的氨基酸序列(VH4-M73可变区)；
(l)抗体，该抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ IDNO：177记载的氨基酸序列(VL3-κ可变区)；
(m)抗体，该抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ IDNO：179记载的氨基酸序列(VL1-κ可变区)；
(n)抗体，该抗体包含(e)的重链可变区和(h)的轻链可变区；
(o)抗体，该抗体包含(f)的重链可变区和(i)的轻链可变区(FV5-M83的可变区组合)；
(p)抗体，该抗体包含(j)的重链可变区和(l)的轻链可变区(FV4-M73的可变区组合)；
(q)抗体，该抗体包含(k)的重链可变区和(m)的轻链可变区(FV3-M73的可变区组合)。
在上述(a)～(d)的重链可变区的氨基酸取代中，对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第35位的Trp取代成Val、第51位的Tyr取代成Phe、第63位的Ser取代成Thr、第65位的Lys取代成Gln、第66位的Gly取代成Asp、第99位的Val取代成Leu、第103位的Ile取代成Ala、第108位的Tyr取代成Val、第111位的Glu取代成Gln、第113位的Thr取代成Ile。在上述(g)的轻链可变区的氨基酸取代中，对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第27位的Gln取代成Glu、第55位的His取代成Glu。此外，可以进行上述氨基酸取代以外的氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加等。
对本发明的抗体恒定区没有特别限定，可以使用任何恒定区。例如可以使用具有IgG1、IgG2、IgG4等天然序列的恒定区、或通过对具有天然序列的恒定区中的氨基酸进行取代、缺失、添加和/或插入等而制作的修饰型恒定区等。修饰型恒定区的例子有后述的恒定区。
作为使用了上述本发明的可变区的抗体，其例子有下述抗体：
(1)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：134记载的氨基酸序列(H96-IgG1)的重链；
(2)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：135记载的氨基酸序列(F2H-IgG1)的重链；
(3)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：137记载的氨基酸序列(VH5-IgG1)的重链；
(4)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：139记载的氨基酸序列(VH5-M83)的重链；
(5)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：136记载的氨基酸序列(L39)的轻链；
(6)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：138记载的氨基酸序列(VL5-κ)的轻链；
(7)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：180记载的氨基酸序列(VH3-M73)的重链；
(8)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：182记载的氨基酸序列(VH4-M73)的重链；
(9)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：181记载的氨基酸序列(VL3-κ)的轻链；
(10)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：183记载的氨基酸序列(VL1-κ)的轻链；
(11)抗体，该抗体包含(2)的重链和(5)的轻链；
(12)抗体，该抗体包含(3)的重链和(6)的轻链；
(13)抗体，该抗体包含(4)的重链和(6)的轻链(FV5-M83)；
(14)抗体，该抗体包含(7)的重链和(9)的轻链(FV4-M73)；
(15)抗体，该抗体包含(8)的重链和(10)的轻链(FV3-M73)；
(16)抗体，该抗体与(1)～(15)中任一项所述的抗体具有同等的活性。
其中，“具有同等的活性”是指与抗原的结合活性和/或中和活性是同等的。本发明中，同等的活性未必是指相同的活性，而是指具有例如50％以上的活性、优选70％以上的活性、进一步优选90％以上的活性。
本发明还提供下述(i)～(xxii)中任一项所述的CDR或FR。
(i)重链FR1，其中具有SEQ ID NO：84记载的氨基酸序列(VH5的重链FR1)；
(ii)重链FR1，其中具有SEQ ID NO：186记载的氨基酸序列(VH3、VH4的重链FR1)；
(iii)重链FR2，其中具有SEQ ID NO：85记载的氨基酸序列(VH3、VH4、VH5的重链FR2)；
(iv)重链FR3，其中具有SEQ ID NO：184记载的氨基酸序列(VH3、VH4、VH5的重链FR3)；
(v)重链FR4，其中具有SEQ ID NO：133记载的氨基酸序列(VH3、VH4、VH5的重链FR4)；
(vi)轻链FR1，其中具有SEQ ID NO：92记载的氨基酸序列(VL1、VL3、VL5的轻链FR1)；
(vii)轻链FR2，其中具有SEQ ID NO：93记载的氨基酸序列(VL1、VL3、VL5的轻链FR2)；
(viii)轻链FR3，其中具有SEQ ID NO：97记载的氨基酸序列(VL1、VL3、VL5的轻链FR3)；
(ix)轻链FR4，其中具有SEQ ID NO：98记载的氨基酸序列(VL1、VL3、VL5的轻链FR4)；
(x)重链CDR1，其中具有SEQ ID NO：169记载的氨基酸序列(VH3、VH4的重链CDR1)；
(xi)重链CDR1，其中具有SEQ ID NO：165记载的氨基酸序列(VH5的重链CDR1)；
(xii)重链CDR2，其中具有SEQ ID NO：170记载的氨基酸序列(VH3的重链CDR2)；
(xiii)重链CDR2，其中具有SEQ ID NO：174记载的氨基酸序列(VH4的重链CDR2)；
(xiv)重链CDR2，其中具有SEQ ID NO：166记载的氨基酸序列(VH5的重链CDR2)；
(xv)重链CDR3，其中具有SEQ ID NO：171记载的氨基酸序列(VH3、VH4的重链CDR3)；
(xvi)重链CDR3，其中具有SEQ ID NO：167记载的氨基酸序列(VH5的重链CDR3)；
(xvii)轻链CDR1，其中具有SEQ ID NO：175记载的氨基酸序列(VL1的轻链CDR1)；
(xviii)轻链CDR1，其中具有SEQ ID NO：172记载的氨基酸序列(VL3的轻链CDR1)；
(xix)轻链CDR1，其中具有SEQ ID NO：101记载的氨基酸序列(VL5的轻链CDR1)；
(xx)轻链CDR2，其中具有SEQ ID NO：173记载的氨基酸序列(VL1、VL3的轻链CDR2)；
(xxi)轻链CDR2，其中具有SEQ ID NO：168记载的氨基酸序列(VL5的轻链CDR2)；
(xxii)轻链CDR3，其中具有SEQ ID NO：79记载的氨基酸序列(VL1、VL3、VL5的轻链CDR3)。
在本发明的抗体中，还包括含有上述任一项所述的氨基酸取代的抗体的片段或其修饰物。作为抗体片段，例如有Fab、F(ab’)2、Fv或将H链和L链的Fv经适当的接头连接而成的单链Fv(scFv)、H链单独结构域或L链单独结构域(例如Nat.Biotechnol.2005 Sep；23(9)：1126-36)，Unibody(WO2007059782A1)、SMIP(WO2007014278A2)。对抗体的来源没有特别限定，可以是人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体等。本发明的抗体还可以是嵌合抗体、人源化抗体、完全人源化抗体等。
具体而言，可以用酶、例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理抗体，生成抗体片段；或者，构建编码上述抗体片段的基因，将其导入表达载体中，之后使之在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.&Horwitz，A.H.Methodsin Enzymology(1989)178，476-496；Pluckthun，A.&Skerra，A.Methodsin Enzymology(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，Methods inEnzymology(1989)121，652-663；Rousseaux，J.等人，Methods inEnzymology(1989)121，663-66；Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv是通过连接抗体H链V区和L链V区而得到的。在该scFv中，H链V区与L链V区经由接头、优选肽接头进行连接(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以来自上述任一种抗体。作为连接V区的肽接头，例如可以使用由12～19个氨基酸残基构成的任意的单链肽。
<抗体恒定区>
本发明还提供下述(i)～(xxi)中任一项所述的、通过氨基酸取代而改良的抗体恒定区。恒定区是指IgG1、IgG2、IgG4型恒定区。人IgG1恒定区、人IgG2恒定区和人IgG4恒定区的氨基酸序列是公知的(人IgG1恒定区见SEQ ID NO：19；人IgG2恒定区见SEQ ID NO：20；人IgG4恒定区见SEQ ID NO：21)。需要说明的是，人IgG4恒定区是指导入了用于改善铰链部分的稳定性的修饰(Mol.Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8)的序列。本发明还提供包含该氨基酸被取代的抗体恒定区的抗体。抗体恒定区优选为人抗体恒定区。
需要说明的是，本发明的氨基酸被取代的抗体恒定区只要包含下述(i)～(xxi)中任一项所述的氨基酸取代即可，可以包含其他氨基酸取代或修饰。因此，在本发明中，对在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中已经有1个或多个氨基酸被取代和/或修饰的IgG2恒定区进行本发明的氨基酸取代时、或者在进行本发明的氨基酸取代后对1个或多个氨基酸进行取代和/或修饰时，具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区对应于本发明的进行了氨基酸取代的IgG2恒定区。具有SEQ ID NO：19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区、具有SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区的情况亦同。
EU编号(参照Sequences of proteins of immunological interest(目标免疫蛋白序列)，NIH Publication No.91-3242)第297位的糖链可以是任何糖链结构，也可以不结合糖链(例如大肠杆菌等、在未添加有糖链的宿主细胞中产生的恒定区等)。
(i)改善IgG2恒定区在酸性条件下的稳定性
本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区的一个方式为：在具有SEQID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中，第276位(EU编号第397位)的Met被取代成其他氨基酸的IgG2恒定区。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Val。通过将SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中第276位(EU编号第397位)的Met取代成其他氨基酸，可以提高抗体在酸性条件下的稳定性。
(ii)改善IgG2恒定区的异质性
本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区的一个方式为：在具有SEQID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中，第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、以及第102位(EU编号第219位)的Cys被取代成其他氨基酸的IgG2恒定区。对取代后的氨基酸没有特别限定，但第14位(EU编号第131位)的Cys优选取代成Ser，第16位(EU编号第133位)的Arg优选取代成Lys，第102位(EU编号第219位)的Cys优选取代成Ser(IgG2-SKSC)。
通过进行上述取代，可以降低来自IgG2的铰链区的异质性。在本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区中，包含上述3种氨基酸取代中的至少一种氨基酸被取代的IgG2恒定区。但优选第14位的Cys和第102位的Cys被取代成其他氨基酸、或者上述3种氨基酸均被取代。
(iii)降低IgG2恒定区与FcγR的结合
本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区的一种方式为：提供在具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中，第209位(EU330)的Ala取代成Ser、第210位(EU331)的Pro取代成Ser、和/或第218位(EU339)的Thr取代成Ala的IgG2恒定区。已有报道称：通过第209位(EU330)的Ala、第210位(EU331)的Pro的取代，可以降低IgG2恒定区与Fcγ受体的结合(Eur.J.Immunol.1999 Aug；29(8)：2613-24)，但是在该修饰中出现了能够形成T细胞表位的、来自非人的肽，所以从免疫原性风险的角度考虑并不优选。因此，通过同时将第218位(EU339)的Thr取代成Ala，可以在只使用来源于人的肽作为能够形成T细胞表位的9-12个氨基酸的情况下减少IgG2与Fcγ受体的结合。
本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区，只要上述3处氨基酸取代中的至少1处氨基酸被取代即可，但优选上述3处氨基酸均被取代。因此，本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区的优选方式为：在具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中，第209位(EU330)的Ala取代成Ser、第210位(EU331)的Pro取代成Ser、且第218位(EU339)的Thr取代成Ala的IgG2恒定区。
(iv)改善IgG2恒定区的C末端异质性
本发明提供在具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的IgG2恒定区。通过使上述两种氨基酸均缺失，首次可以降低来自抗体H链C末端的异质性。
(v)通过修饰IgG2恒定区来提高药物动力学
本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区的一种方式为：在具有SEQID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中，第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的Arg、第298位(EU编号第419位)的Gln被取代成其他氨基酸的IgG2恒定区。通过这些氨基酸取代，可以提高抗体的药物动力学。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第147位(EU编号第268位)的His取代成Gln、第234位(EU编号第355位)的Arg取代成Gln、第298位(EU编号第419位)的Gln取代成Glu。在本发明的氨基酸被取代的IgG2恒定区中，包含上述3种氨基酸取代中至少1种氨基酸被取代的IgG2恒定区，但优选上述3种氨基酸均被取代。
(vi)改善IgG4恒定区在酸性条件下的稳定性
本发明提供在具有SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区中第289位(EU编号第409位)的Arg被取代成其他氨基酸的IgG4恒定。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Lys。通过将SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列中第289位(EU编号第409位)的Arg取代成其他氨基酸，可以提高抗体在酸性条件下的稳定性。
(vii)改善IgG4恒定区的C末端异质性
本发明提供在具有SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区中第326位(EU编号第446位)的Gly和第327位(EU编号第447位)的Lys均缺失的IgG4恒定区。通过缺失上述两种氨基酸，首次可以降低来自抗体H链C末端的异质性。
(viii)改善IgG1恒定区的C末端异质性
本发明提供在具有SEQ ID NO：19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中第329位(EU编号第446位)的Gly和第330位的(EU编号第447位)的Lys均缺失的IgG1恒定区。通过缺失上述两种氨基酸，首次可以降低来自抗体H链C末端的异质性。
(ix)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG1恒定区：在具有SEQ IDNO：19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中，第317位(EU编号第434位)的Asn被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Ala。
(x)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区：在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中第209位(EU编号第330位)的Ala、第210位(EU编号第331位)的Pro、第218位(EU编号第339位)的Thr、第276位(EU编号第397位)的Met、第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu和第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第209位的Ala取代成Ser、第210位的Pro取代成Ser、第218位的Thr取代成Ala、第276位的Met取代成Val、第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly。
(xi)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区：在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中第209位(EU编号第330位)的Ala、第210位(EU编号第331位)的Pro、第218位(EU编号第339位)的Thr、第276位(EU编号第397位)的Met、第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu和第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸、且第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第209位的Ala取代成Ser、第210位的Pro取代成Ser、第218位的Thr取代成Ala、第276位的Met取代成Val、第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly。
(xii)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区：在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中第276位(EU编号第397位)的Met、第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第276位的Met取代成Val、第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly。
(xiii)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区：在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中第276位(EU编号第397位)的Met、第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu和第21位(EU编号第138位)的Ser被取代成其他氨基酸、且第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第276位的Met取代成Val、第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly。
(xiv)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区：在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号219第位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser、第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的Arg和第298位(EU编号第419位)的Gln被取代成其他氨基酸、且第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly、第147位的His取代成Gln、第234位的Arg取代成Gln、第298位的Gln取代成Glu。
(xv)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG2恒定区：在SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列中第14位(EU编号第131位)的Cys、第16位(EU编号第133位)的Arg、第102位(EU编号第219位)的Cys、第20位(EU编号第137位)的Glu、第21位(EU编号第138位)的Ser、第147位(EU编号第268位)的His、第234位(EU编号第355位)的Arg、第298位(EU编号第419位)的Gln和第313位(EU编号第434位)的Asn被取代成其他氨基酸、且第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser、第20位的Glu取代成Gly、第21位的Ser取代成Gly、第147位的His取代成Gln、第234位的Arg取代成Gln、第298位的Gln取代成Glu、第313位的Asn取代成Ala。
(xvi)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG4恒定区：在SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列中第289位(EU编号第409位)的Arg、第14位的Cys、第16位的Arg、第20位的Glu、第21位的Ser、第97位的Arg、第100位的Ser、第102位的Tyr、第103位的Gly、第104位的Pro和第105位的Pro(分别为EU编号第131、133、137、138、214、217、219、220、221、222位)、第113位的Glu、第114位的Phe和第115位的Leu(分别为EU编号第233、234、235位)被取代成其他氨基酸、且第116位(EU编号第236位)的Gly缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly、第97位(EU编号第214位)的Arg取代成Thr、第100位(EU编号第217位)的Ser取代成Arg、第102位(EU编号第219位)的Tyr取代成Ser、第103位(EU编号第220位)的Gly取代成Cys、第104位(EU编号第221位)的Pro取代成Val、第105位(EU编号第222位)的Pro取代成Glu、第113位(EU编号第233位)的Glu取代成Pro、第114位(EU编号第234位)的Phe取代成Val、第115位(EU编号第235位)的Leu取代成Ala、第289位(EU编号第409位)的Arg取代成Lys。
(xvii)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG4恒定区：在SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列中第289位(EU编号第409位)的Arg、第14位的Cys、第16位的Arg、第20位的Glu、第21位的Ser、第97位的Arg、第100位的Ser、第102位的Tyr、第103位的Gly、第104位的Pro和第105位的Pro(分别为EU编号第131、133、137、138、214、217、219、220、221、222位)、第113位的Glu、第114位的Phe和第115位的Leu(分别为EU编号第233、234、235位)被取代成其他氨基酸、且第116位(EU编号第236位)的Gly、第326位(EU编号第446位)的Gly和第327位(EU编号第447位)的Lys缺失的氨基酸序列。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly、第97位(EU编号第214位)的Arg取代成Thr、第100位(EU编号第217位)的Ser取代成Arg、第102位(EU编号第219位)的Tyr取代成Ser、第103位(EU编号第220位)的Gly取代成Cys、第104位(EU编号第221位)的Pro取代成Val、第105位(EU编号第222位)的Pro取代成Glu、第113位(EU编号第233位)的Glu取代成Pro、第114位(EU编号第234位)的Phe取代成Val、第115位(EU编号第235位)的Leu取代成Ala、第289位(EU编号第409位)的Arg取代成Lys。
(xviii)
本发明提供具有下述氨基酸序列的IgG1恒定区：在具有SEQ IDNO：19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中第317位(EU编号第434位)的Asn被取代成其他氨基酸、且第329位(EU编号第446位)的Gly和第330位(EU编号第447位)的Lys均缺失的氨基酸序列。
对第317位(EU编号第434位)的Asn的取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Ala。
(xix)
本发明中，作为铰链区的异质性得到改善和/或与Fcγ受体的结合活性下降的IgG2的优选方式，有下述IgG2。
抗体，该抗体在具有包含SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的恒定区的IgG2中，第209位的Ala、第210位的Pro、第218位的Thr、第14位的Cys、第16位的Arg、第102位的Cys、第20位的Glu和第21位的Ser被取代成其他氨基酸。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第209位(EU编号第330位)的Ala取代成Ser、第210位(EU编号第331位)的Pro取代成Ser、第218位(EU编号第339位)的Thr取代成Ala、第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys、第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly。
这样的IgG2恒定区的例子有：具有SEQ ID NO：191(M86)的氨基酸序列的IgG2恒定区。
本发明的IgG2恒定区的另一优选方式为：在上述IgG2恒定区中，进一步缺失第325位的Gly和第326位的Lys以降低C末端的异质性的IgG2恒定区。这样的抗体的例子有：具有包含SEQ ID NO：192(M86ΔGK)的氨基酸序列的恒定区的IgG2。
(xx)
本发明中，作为铰链区的异质性得到改善的IgG2恒定区的优选方式，还可以列举下述IgG2恒定区。
在具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中，第14位的Cys、第16位的Δrg、第102位的Cys、第20位的Glu、第21位的Ser被取代成其他氨基酸的IgG2恒定区。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Δrg取代成Lys、第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly。
这样的IgG2恒定区的例子有：具有SEQ ID NO：193(M40)的氨基酸序列的IgG2恒定区。
作为本发明的IgG2恒定区的另一优选方式，可以列举：在上述IgG2恒定区中进一步缺失第325位的Gly和第326位的Lys的IgG2恒定区。这样的抗体的例子有：具有SEQ ID NO：194(M40ΔGK)的氨基酸序列的IgG2恒定区。
(xxi)M14ΔGK、M17ΔGK、M11ΔGK、M31ΔGK、M58、M73、M83、M86ΔGK、M40ΔGK
本发明还提供具有SEQ ID NO：24记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M14ΔGK)。本发明还提供具有SEQ ID NO：116记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M17ΔGK)。本发明还提供具有SEQ ID NO：25记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M11ΔGK)。本发明还提供具有SEQ ID NO：118记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M31ΔGK)。本发明还提供具有SEQ ID NO：151记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M58)。本发明还提供具有SEQ ID NO：153记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M73)。本发明还提供具有SEQ ID NO：164记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M83)。本发明还提供具有SEQ ID NO：192记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M86ΔGK)。本发明还提供具有SEQ ID NO：194记载的氨基酸序列的抗体恒定区(M40ΔGK)。上述抗体恒定区具有与Fcγ受体的结合活性降低、免疫原性风险降低、酸性条件下的稳定性提高、异质性降低、药物动力学提高和/或与IgG1恒定区相比在制剂中的稳定性高的性质，是最优化的抗体恒定区。
本发明提供包含上述(i)～(xxi)中任一项所述的抗体恒定区的抗体。只要具有上述抗体恒定区即可，对抗原种类、抗体的来源等没有限定，可以是任何抗体。优选的抗体的例子有：与IL-6受体结合的抗体。其他优选的抗体的例子有：人源化抗体。这样的抗体的例子有：具有人源化PM-1抗体的可变区的抗体。可以对人源化PM-1抗体的可变区进行上述氨基酸取代，还可以进行其他氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入。具体的取代例子有：提高上述(a)～(y)的亲和性的修饰、降低(i)～(viii)的等电点的修饰、提高(α)～(ζ)的稳定性的修饰、降低免疫原性的修饰，但并不限于这些。
这样的抗体的一个方式为：包含具有SEQ ID NO：113记载的氨基酸序列(PF_1+M14ΔGK)的重链可变区和具有SEQ ID NO：23记载的氨基酸序列(PF1_L)的轻链可变区的抗体(PF1)(轻链恒定区可以是κ，也可以是λ，还可以是它们的修饰体)，但并不限于此。
另外，上述抗体恒定区和/或包含上述抗体恒定区的抗体分子还可以与抗体样结合分子(支架分子)、生理活性肽、结合肽等以Fc融合分子的形式结合。
本发明的抗体，除实施例记载的方法外，还可如下取得。在取得本发明抗体的一个方式中，首先，在选自本领域技术人员公知的抗IL-6受体抗体的CDR区、FR区和恒定区的至少一个区中，将1个或多个氨基酸残基取代成其他目标氨基酸。对本领域技术人员公知的抗IL-6受体抗体的取得方法没有限定。作为在选自CDR区、FR区和恒定区的至少一个区中将1个或多个氨基酸残基取代成其他目标氨基酸的方法，例如有位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh，T.，Mizuno，T.，Ogasahara，Y.，and Nakagawa，M.An oligodeoxyribonucleotide-directeddual amber method for site-directed mutagenesis(寡脱氧核糖核苷酸定向双琥珀色法位点定向诱变).Gene(1995)152，271-275；Zoller，M.J.，and Smith，M.Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragmentscloned into M13 vectors(DNA片段克隆到M13载体的寡聚核苷酸定向诱变).Methods Enzymol.(1983)100，468-500；Kramer，W，Drutsa，V，Jansen，H.W.，Kramer，B.，Pflugfelder，M，and Fritz，H.J.(1984).Thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction(带缺口的双链体DNA接近于寡聚核苷酸定向突变结构).Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W.，and Fritz H.J.(1987).Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplexDNA Methods(经由带缺口的双链体DNA法突变的寡聚核苷酸定向结构).Enzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Rapid and efficientsite-specific mutagenesis without phenotypic selection(无表型筛选的迅速及高效的位点特异性诱变法).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，488-492).利用该方法可以将抗体所期望的氨基酸取代成其他目标氨基酸。作为取代成其他氨基酸的方法，通过使用构架改组(Mol Immunol.2007Apr；44(11)：3049-60)和CDR修复(US2006/0122377)等文库技术，可以对适当的构架和CDR进行氨基酸取代。
作为用于取得抗体的另一方式，首先，按照本领域技术人员公知的方法得到与IL-6受体结合的抗体。当取得的抗体为非人动物抗体时，还可以将其人源化。之后，按照本领域技术人员公知的方法判定所取得的抗体是否具有中和活性。抗体的结合活性或中和活性可以按照实施例中记载的方法进行测定，但并不限于该方法。之后，将选自抗体的CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基取代成其他目标氨基酸。
更具体而言，本发明涉及包括下述步骤(a)和(b)的抗体的制造方法，所述抗体的中和活性增强、结合活性增强、稳定性提高或免疫原性降低。
(a)使编码H链的DNA和编码L链的DNA表达的步骤，所述H链中选自CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸，所述L链中选自CDR区和FR区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸。
(b)回收步骤(a)的表达产物的步骤。
在本发明的制造方法中，首先，使编码抗IL-6受体抗体突变体的H链的DNA、即编码选自CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的H链的DNA、以及编码抗IL-6受体抗体L链的DNA、即编码选自CDR区和FR区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的L链的DNA表达。编码选自CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的H链的DNA例如可以通过取得编码野生型H链的DNA的CDR区、FR区或恒定区部分，之后导入适当的取代，使编码选自该CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的特定氨基酸的密码子编码其他目标氨基酸而得到。至于编码选自CDR区和FR区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的L链的DNA，例如可以通过取得编码野生型L链的DNA的CDR区和/或FR区，之后导入适当的取代，使编码该CDR区、FR区中的特定氨基酸的密码子编码其他目标氨基酸而得到。
首先，设计编码选自野生型H链的CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的蛋白的DNA，化学合成该DNA，从而也可以得到编码选自CDR区、FR区和恒定区的至少1区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的H链的DNA。关于L链，也设计编码野生型L链的CDR区和/或FR区的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的蛋白的DNA，化学合成该DNA，从而也可以得到编码CDR区和/或FR区的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的L链的DNA。
作为氨基酸取代的种类，并不限于此，有本说明书中记载的取代。
另外，编码在选自CDR区、FR区和恒定区的至少1区中1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的H链的DNA可以分成部分DNA来制造。作为部分DNA的组合，例如有：编码可变区的DNA与编码恒定区的DNA、或者编码Fab区的DNA与编码Fc区的DNA等，但并不限于这些组合。编码L链的DNA也同样可以分成部分DNA来制造。
作为使上述DNA表达的方法，例举下述方法。例如，将编码H链可变区的DNA与编码H链恒定区的DNA同时整合到表达载体中，构建H链表达载体。同样，将编码L链可变区的DNA与编码L链恒定区的DNA同时整合到表达载体中，构建L链表达载体。这些H链和L链的基因也可以整合到同一载体中。作为表达载体，例如可以使用SV40病毒载体(SV40 virus-based vectors)、EB病毒载体(EBvirus-based vectors)和BPV(乳头瘤病毒)载体(BPV(papillomavirus)-based vectors)等，但并不限于这些。
利用按照上述方法制作的抗体表达载体共转化宿主细胞。作为宿主细胞，除CHO细胞(中国仓鼠卵巢)等上述细胞外，还可使用大肠杆菌、酵母或枯草杆菌等微生物或动植物个体(Nature Biotechnology 25，563-565(2007)；Nature Biotechnology 16，773-777(1998)；Biochemicaland Biophysical Research Communications 255，444-450(1999)；NatureBiotechnology 23，1159-1169(2005)；Journal of Virology 75，2803-2809(2001)；Biochemical and Biophysical Research Communications 308，94-100(2003))。进行转化时优选采用脂质转染法(R.W.Malone等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6077(1989)；P.L.Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413(1987))、电穿孔法、磷酸钙法(F.L.Graham&A.J.van der Eb，Virology 52，456-467(1973))、DEAE-葡聚糖法等。
制造抗体时，接下来，回收步骤(a)中得到的表达产物。表达产物的回收例如可以通过在培养转化体后，从转化体的细胞内或培养液中分离表达产物来进行。在抗体的分离、纯化中可以适当组合离心、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、1q、FcRn、蛋白A、蛋白G柱、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法来进行。
需要说明的是，对于本发明的恒定区，本领域技术人员可以按照抗体的取得方法适当进行制备。
本发明还涉及增强抗IL-6受体抗体与IL-6受体的结合活性或中和活性的方法，该方法包括选自下述步骤(A)～(X)的至少1个步骤：
(A)将SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第1位的Ser取代成其他氨基酸的步骤；
(B)将SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第5位的Trp取代成其他氨基酸的步骤；
(C)将SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第1位的Tyr取代成其他氨基酸的步骤；
(D)将SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第8位的Thr取代成其他氨基酸的步骤；
(E)将SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr取代成其他氨基酸的步骤；
(F)将SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser取代成其他氨基酸的步骤；
(G)将SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第2位的Leu取代成其他氨基酸的步骤；
(H)将SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤；
(I)将SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第7位的Ala取代成其他氨基酸的步骤；
(J)将SEQ ID NO：3记载的氨基酸片列(HCDR3)中第8位的Met取代成其他氨基酸的步骤；
(K)将SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser和第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤；
(L)将SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第2位的Leu、第7位的Ala和第8位的Met取代成其他氨基酸的步骤；
(M)将SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第1位的Arg取代成其他氨基酸的步骤；
(N)将SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第4位的Gln取代成其他氨基酸的步骤；
(O)将SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第9位的Tyr取代成其他氨基酸的步骤；
(P)将SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第11位的Asn取代成其他氨基酸的步骤；
(Q)将SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr取代成其他氨基酸的步骤；
(R)将SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第1位的Gln取代成其他氨基酸的步骤；
(S)将SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第3位的Gly取代成其他氨基酸的步骤；
(T)将SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第9位的Tyr取代成其他氨基酸的步骤和将SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第3位的Gly取代成其他氨基酸的步骤；
(U)将SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤；
(V)将SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第1位的Gln和第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤；
(W)将SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr取代成其他氨基酸的步骤、以及将SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)中第1位的Ser和第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤；
(X)(V)和(W)所述的步骤。
上述(A)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Trp、Thr、Asp、Asn、Arg、Val、Phe、Ala、Gln、Tyr、Leu、His、Glu或Cys。
上述(B)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Ile或Val。
上述(C)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Phe。
上述(D)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Arg。
上述(E)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Ser或Asn。
上述(F)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Ile、Val、Thr或Leu。
上述(G)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Thr。
上述(H)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Ala、Ile或Ser。其他优选的取代有：第5位的Thr取代成Ser。
上述(I)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Ser或Val。
上述(J)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Leu。
上述(K)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选第1位的Ser取代成Leu、第5位的Thr取代成Ala。其他优选的取代的例子有：第1位的Ser取代成Val和第5位的Thr取代成Ala；第1位的Ser取代成Ile和第5位的Thr取代成Ala；第1位的Ser取代成Thr和第5位的Thr取代成Ala；第1位的Ser取代成Val和第5位的Thr取代成Ile；第1位的Ser取代成Ile和第5位的Thr取代成Ile；第1位的Ser取代成Thr和第5位的Thr取代成Ile；或第1位的Ser取代成Leu和第5位的Thr取代成Ile。
上述(L)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选第2位的Leu取代成Thr、第7位的Ala取代成Val、第8位的Met取代成Leu。
上述(M)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Phe。
上述(N)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Arg或Thr。
上述(O)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Phe。
上述(P)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Ser。
上述(Q)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Gly。
上述(R)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Gly、Asn或Ser。
上述(S)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Ser。
上述(T)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)的Tyr取代成Phe、SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)的Gly取代成Ser。
上述(U)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选取代成Arg或Ser。
上述(V)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要亲和性提高即可，但优选第1位的Gln取代成Gly、第5位的Thr取代成Ser。其他优选的取代的例子有：第1位的Gln取代成Gly和第5位的Thr取代成Arg。
上述(W)中，优选SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)的第9位的Thr取代成Asn。SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列(HCDR3)的第1位的Ser和第5位的Thr取代后的氨基酸的优选组合有：Leu和Ala、Val和Ala、Ile和Ala、Thr和Ala、Val和Ile、Ile和Ile、Thr和Ile、或Leu和Ile。
在上述步骤(A)～(X)中，对进行氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。对重链可变区进行氨基酸取代时，取代前的原重链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的重链可变区的氨基酸序列。对轻链可变区进行氨基酸取代时，取代前的原轻链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的轻链可变区的氨基酸序列。另外，优选对人源化PM-1抗体进行上述步骤(A)～(X)中记载的氨基酸取代。
本发明的增强抗IL-6受体抗体的结合活性或中和活性的方法，只要至少包括上述(A)～(X)中任一项所述的步骤即可。即，本发明的方法可以包括上述(A)～(X)中任一项所述的步骤中2个以上的步骤。并且，只要包括上述(A)～(X)中任一项所述的步骤即可，还可以包括其他步骤(例如上述(A)～(X)以外的氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)。例如，可以进行FR的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等，还可以进行恒定区的氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等。优选对人源化PM-1抗体进行上述氨基酸取代。
<降低抗IL-6受体抗体的免疫原性风险的方法>
本发明还涉及降低抗IL-6受体抗体的免疫原性的方法，该方法包括将SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr取代成Gly的步骤。本发明的降低抗IL-6受体抗体的免疫原性的方法只要包括将SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第2位的Thr取代成Gly的步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以通过上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法来进行。
优选对人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体进行上述氨基酸取代。
<降低抗IL-6受体抗体的等电点的方法>
本发明还涉及降低抗IL-6受体抗体的等电点的方法，该方法包括选自下述(i)～(xv)的至少一个步骤。
(i)将SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列(HFR1)中第16位的Gln取代成其他氨基酸的步骤；
(ii)将SEQ ID NO：8记载的氨基酸序列(HFR2)中第8位的Arg取代成其他氨基酸的步骤；
(iii)将SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列(HFR3)中第16位的Arg取代成其他氨基酸的步骤；
(iv)将SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列(HFR4)中第3位的Gln取代成其他氨基酸的步骤；
(v)将SEQ ID NO：11记载的氨基酸序列(LFR1)中第18位的Arg取代成其他氨基酸的步骤；
(vi)将SEQ ID NO：12记载的氨基酸序列(LFR2)中第11位的Lys取代成其他氨基酸的步骤；
(vii)将SEQ ID NO：13记载的氨基酸序列(LFR3)中第23位的Gln取代成其他氨基酸的步骤；
(viii)将SEQ ID NO：14记载的氨基酸序列(LFR4)中第10位的Lys取代成其他氨基酸的步骤；
(ix)将SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列(HCDR1)中第1位的Ser取代成其他氨基酸的步骤；
(x)将SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)中第1位的Arg取代成其他氨基酸的步骤；
(xi)将SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列(LCDR2)中第4位的Arg取代成其他氨基酸的步骤；
(xii)将SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列(HFR1)中第13位的Arg取代成其他氨基酸的步骤；
(xiii)将SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HFR1)或SEQ ID NO：100记载的氨基酸序列中第15位的Lys和/或第16位的Ser取代成其他氨基酸的步骤；
(xiv)将SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列(LCDR1)或SEQ ID NO：101记载的氨基酸序列中第4位的Gln取代成其他氨基酸的步骤；
(xv)将SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列(LCDR2)或SEQ ID NO：103记载的氨基酸序列中第6位的His取代成其他氨基酸的步骤；
上述(i)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Glu。
上述(ii)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Glu。
上述(iii)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Lys。
上述(iv)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Glu。
上述(v)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Ser。
上述(vi)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Glu。
上述(vii)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Glu。
上述(viii)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Glu。
上述(ix)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Asp。
上述(x)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Gln。
上述(xi)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Glu。
上述(xii)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Lys。
上述(xiii)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选第15位的Lys取代成Gln、第16位的Ser取代成Asp。
上述(xiv)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Glu。
上述(xv)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要等电点降低即可，但优选取代成Glu。
在上述步骤(i)～(xv)中，对氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。对重链可变区进行氨基酸取代时，取代前的原重链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的重链可变区的氨基酸序列。对轻链可变区进行氨基酸取代时，取代前的原轻链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的轻链可变区的氨基酸序列。另外，优选对人源化PM-1抗体进行上述步骤(i)～(xv)中记载的氨基酸取代。
本发明的降低抗IL-6受体抗体等电点的方法，只要至少包括上述(i)～(xv)中任一项所述的步骤即可。即，本发明的方法可以包括上述(i)～(xv)所述的步骤中2个以上的步骤。并且，只要包括上述(i)～(xv)中任一项所述的步骤即可，还可以包括其他步骤(例如上述(i)～(xv)以外的氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)。例如还可以进行恒定区的氨基酸序列的取代、缺失、添加和/或插入等。
<提高抗IL-6受体抗体稳定性的方法>
本发明还涉及提高抗IL-6受体抗体稳定性的方法，该方法包括选自下述(α)～(ζ)的至少一个步骤。
(α)将SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列(HFR3)中第4位的Met取代成其他氨基酸的步骤；
(β)将SEQ ID NO：9记载的氨基酸序列(HFR3)中第5位的Leu取代成其他氨基酸的步骤；
(γ)将SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第9位的Thr取代成其他氨基酸的步骤；
(δ)将SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列(LCDR3)中第5位的Thr取代成其他氨基酸的步骤；
(ε)将SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列(HCDR2)中第16位的Ser取代成其他氨基酸的步骤；
(ζ)将SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列(FR4)中第5位的Ser取代成其他氨基酸的步骤。
上述(α)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要稳定性提高即可，但优选取代成Ile。
上述(β)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要稳定性提高即可，但优选取代成Ser。
上述(γ)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要稳定性提高即可，但优选取代成Asn。
上述(δ)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要稳定性提高即可，但优选取代成Ser。
上述(ε)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要稳定性提高即可，但优选取代成Gly。
上述(ζ)中，对取代后的氨基酸没有特别限定，只要稳定性提高即可，但优选取代成Ile。
在上述步骤(α)～(ζ)中，对氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。对重链可变区进行氨基酸取代时，取代前的原重链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的重链可变区的氨基酸序列。对轻链可变区进行氨基酸取代时，取代前的原轻链可变区的氨基酸序列优选为人源化PM-1的轻链可变区的氨基酸序列。另外，优选对人源化PM-1抗体进行上述步骤(α)～(ζ)的氨基酸取代。
本发明的提高抗IL-6受体抗体稳定性的方法，只要至少包括上述(α)～(ζ)中任一项所述的步骤即可。即，本发明的方法可以包括上述(α)～(ζ)所述的步骤中2个以上的步骤。并且，只要包括上述(α)～(ζ)中任一项所述的步骤即可，还可以包括其他步骤(例如上述(α)～(ζ)以外的氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)。例如可以进行恒定区的氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等。
<降低抗IL-6受体抗体的免疫原性的方法>
本发明还涉及降低抗IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1抗体的免疫原性的方法，该方法包括：将SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列(HFR1)中第13位的Arg取代成Lys、第16位的Gln取代成Glu、第23位的Thr取代成Ala和/或第30位的Thr取代成Ser的步骤。本发明的降低抗IL-6受体抗体的免疫原性的方法只要包括将SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列(HFR1)中第30位的Thr取代成Ser的步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。
本发明还涉及降低抗IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1抗体的免疫原性的方法，该方法包括：将SEQ ID NO：90记载的氨基酸序列(HFR3)中第27位的Ala取代成Val的步骤。本发明的降低抗IL-6受体抗体的免疫原性的方法只要包括将SEQ ID NO：90记载的氨基酸序列(HFR3)中第27位的Ala取代成Val的步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。
对氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
本发明还涉及通过将抗IL-6受体抗体、特别是人源化PM-1抗体、H53/L28或PF1抗体的FR3转换成具有SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：129的氨基酸序列的FR3来降低抗体免疫原性的方法。
<提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法>
本发明还涉及提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法，该方法包括：将SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列(IgG2)中第276位(EU编号第397位)的Met取代成其他氨基酸的步骤。本发明的提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法只要包括将SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列(IgG2)中第276位(EU编号第397位)的Met取代成其他氨基酸的步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Val。对氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定，但优选为抗人IL-6受体抗体，进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<改善来自IgG2恒定区铰链部分的异质性的方法>
本发明还涉及改善抗体异质性的方法，该方法包括将SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列(IgG2)中第14位(EU编号第131位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤、将第16位(EU编号第133位)的Arg取代成其他氨基酸的步骤、和/或将第102位(EU编号第219位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第14位的Cys取代成Ser、第16位的Arg取代成Lys、第102位的Cys取代成Ser。本发明的改善抗体异质性的方法只要包括对SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列(IgG2)中第14位(EU编号第131位)的Cys进行取代的步骤、对16位(EU编号第133位)的Arg进行取代的步骤、和/或对第102位(EU编号第219位)的Cys进行取代的步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。被取代的氨基酸可以是上述3个氨基酸均被取代，也可以是1个或2个(例如第14位和第102位等)氨基酸被取代。
对作为对象的抗体没有特别限定，但优选为抗人IL-6受体抗体，进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<降低来自IgG2恒定区的C末端氨基酸缺失的异质性的方法>
本发明还涉及改善抗体异质性的方法，该方法包括：使具有SEQID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys缺失的步骤。本发明的改善抗体异质性的方法只要包括使具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第325位(EU编号第446位)的Gly和第326位(EU编号第447位)的Lys缺失的步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定，但优选为抗人IL-6受体抗体，进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<在维持IgG2恒定区的人序列不变的情况下降低与FcγR结合的方法>
本发明还涉及降低抗体与FcγR结合的方法，该方法包括：将具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第209位(EU330)的Ala取代成Ser的步骤、将第210位(EU331)的Pro取代成Ser的步骤、以及将第218位(EU339)的Thr取代成Ala的步骤。本发明的降低抗体与FcγR结合的方法只要包括将具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第209位(EU330)的Ala取代成Ser的步骤、将第210位(EU331)的Pro取代成Ser的步骤、以及将第218位(EU339)的Thr取代成Ala的步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
<通过取代IgG2恒定区的氨基酸来提高药物动力学的方法>
本发明还涉及提高抗体的药物动力学的方法，该方法包括：将具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中第147位(EU268)的His、第234位(EU355)的Arg和/或第298位(EU419)的Gln取代成其他氨基酸的步骤。本发明的提高抗体的药物动力学的方法只要包括上述步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第147位(EU268)的His取代成Gln、第234位(EU355)的Arg取代成Gln、第298位(EU419)的Gln取代成Glu。
本发明还涉及提高抗体药物动力学的方法，该方法包括：将具有SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：151(M58)的氨基酸序列的IgG2恒定区中第313位(EU434)的Asn取代成其他氨基酸的步骤。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Ala。本发明的提高抗体药物动力学的方法只要包括上述步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。
对作为对象的抗体没有特别限定，但优选为抗人IL-6受体抗体，进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法、降低抗体的来自C末端异质性的方法、和/或降低抗体与FcγR结合的方法(M14ΔGK)，上述方法均包括对具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区进行下述(a)～(j)的步骤：
(a)将SEQ ID NO：20的第209位(EU编号第330位)的Ala取代成Ser的步骤；
(b)将SEQ ID NO：20的第210位(EU编号第331位)的Pro取代成Ser的步骤；
(c)将SEQ ID NO：20的第218位(EU编号第339位)的Thr取代成Ala的步骤；
(d)将SEQ ID NO：20的第276位(EU编号第397位)的Met取代成Val的步骤；
(e)将SEQ ID NO：20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser的步骤；
(f)将SEQ ID NO：20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys的步骤；
(g)将SEQ ID NO：20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser的步骤；
(h)将SEQ ID NO：20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly的步骤；
(i)将SEQ ID NO：20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly的步骤；以及
(j)使SEQ ID NO：20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
本发明的方法只要包括上述步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代和缺失的其他步骤。对氨基酸的取代和缺失的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定，但优选为抗人IL-6受体抗体，进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法、和/或降低抗体的来自C末端的异质性的方法(M31ΔGK)，上述方法均包括对具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区进行下述(a)～(g)的步骤：
(a)将SEQ ID NO：20的第276位(EU编号第397位)的Met取代成Val的步骤；
(b)将SEQ ID NO：20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser的步骤；
(c)将SEQ ID NO：20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys的步骤；
(d)将SEQ ID NO：20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser的步骤；
(e)将SEQ ID NO：20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly的步骤；
(f)将SEQ ID NO：20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly的步骤；以及
(g)使SEQ ID NO：20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、提高抗体药物动力学的方法、和/或降低抗体的来自C末端的异质性的方法(M58)，上述方法均包括对具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区中进行下述(a)～(i)的步骤：
(a)将SEQ ID NO：20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser的步骤；
(b)将SEQ ID NO：20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys的步骤；
(c)将SEQ ID NO：20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser的步骤；
(d)将SEQ ID NO：20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly的步骤；
(e)将SEQ ID NO：20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly的步骤；
(f)将SEQ ID NO：20的第147位(EU编号第268位)的His取代成Gln的步骤；
(g)将SEQ ID NO：20的第234位(EU编号第355位)的Arg取代成Gln的步骤；
(h)将SEQ ID NO：20的第298位(EU编号第419位)的Gln取代成Glu的步骤；以及
(i)使SEQ ID NO：20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、提高抗体药物动力学的方法、和/或降低抗体的来自C末端的异质性的方法(M73)，上述方法均包括对具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区进行下述(a)～(j)的步骤：
(a)将SEQ ID NO：20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser的步骤；
(b)将SEQ ID NO：20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys的步骤；
(c)将SEQ ID NO：20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser的步骤；
(d)将SEQ ID NO：20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly的步骤；
(e)将SEQ ID NO：20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly的步骤；
(f)将SEQ ID NO：20的第147位(EU编号第268位)的His取代成Gln的步骤；
(g)将SEQ ID NO：20的第234位(EU编号第355位)的Arg取代成Gln的步骤；
(h)将SEQ ID NO：20的第298位(EU编号第419位)的Gln取代成Glu的步骤；
(i)将SEQ ID NO：20的第313位(EU编号第434位)的Asn取代成Ala的步骤；以及
(j)使SEQ ID NO：20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、降低抗体的来自C末端的异质性的方法、和/或降低抗体与FcγR结合的方法(M86ΔGK)，上述方法均包括对具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区进行下述(a)～(i)步骤：
(a)将SEQ ID NO：20的第209位(EU编号第330位)的Ala取代成其他氨基酸的步骤；
(b)将SEQ ID NO：20的第210位(EU编号第331位)的Pro取代成其他氨基酸的步骤；
(c)将SEQ ID NO：20的第218位(EU编号第339位)的Thr取代成其他氨基酸的步骤；
(d)将SEQ ID NO：20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤；
(e)将SEQ ID NO：20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成其他氨基酸的步骤；
(f)将SEQ ID NO：20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤；
(g)将SEQ ID NO：20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成其他氨基酸的步骤；
(h)将SEQ ID NO：20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成其他氨基酸的步骤；以及
(i)使SEQ ID NO：20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第209位(EU编号第330位)的Ala取代成Ser、第210位(EU编号第331位)的Pro取代成Ser、第218位(EU编号第339位)的Thr取代成Ala、第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys、第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly。
本发明还涉及降低抗体的来自IgG2铰链部分的异质性的方法、和/或降低抗体的来自C末端的异质性的方法(M40ΔGK)，上述方法均包括对具有SEQ ID NO：20记载的氨基酸序列的IgG2恒定区进行下述(a)～(f)的步骤：
(a)将SEQ ID NO：20的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤；
(b)将SEQ ID NO：20的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成其他氨基酸的步骤；
(c)将SEQ ID NO：20的第102位(EU编号第219位)的Cys取代成其他氨基酸的步骤；
(d)将SEQ ID NO：20的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成其他氨基酸的步骤；
(e)将SEQ ID NO：20的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成其他氨基酸的步骤；以及
(f)使SEQ ID NO：20的第325位的Gly和第326位的Lys(分别为EU编号第446位和第447位)缺失的步骤。
对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser、第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys、第102位(EU编号第219位)的Cys取代成Ser、第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly、第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly。
本发明的方法只要包括上述步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代和缺失的其他步骤。对氨基酸的取代和缺失的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定，但优选为抗人IL-6受体抗体，进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<提高IgG4恒定区在酸性条件下的稳定性的方法>
本发明还涉及提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法，该方法包括将具有SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区(Mol.Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8)中第289位(EU编号第409位)的Arg取代成其他氨基酸的步骤。本发明的提高抗体在酸性条件下的稳定性的方法只要包括将SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列(人IgG4恒定区)中第289位(EU编号第409位)的Arg取代成其他氨基酸的步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Lys。对氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定，但优选为抗人IL-6受体抗体，进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<降低来自IgG4恒定区的C末端氨基酸缺失的异质性的方法>
本发明还涉及改善抗体异质性的方法，该方法包括使具有SEQ IDNO：21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区(Mol.Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8)中第326位(EU编号第446位)的Gly和第327位(EU编号第447位)的Lys缺失的步骤。本发明的改善抗体异质性的方法只要包括使具有SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区(Mol.Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8)中第327位(EU编号第447位)的Lys和/或第326位(EU编号第446位)的Gly缺失的步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定，但优选为抗人IL-6受体抗体，进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
本发明还涉及提高IgG4在酸性条件下的稳定性的方法、降低抗体来自C末端的异质性的方法、减少抗体与FcγR结合的方法(M11ΔGK)，上述方法均包括对具有SEQ ID NO：21记载的氨基酸序列的IgG4恒定区(Mol.Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8)进行下述(a)～(p)的步骤：
(a)将SEQ ID NO：21的第14位(EU编号第131位)的Cys取代成Ser的步骤；
(b)将SEQ ID NO：21的第16位(EU编号第133位)的Arg取代成Lys的步骤；
(c)将SEQ ID NO：21的第20位(EU编号第137位)的Glu取代成Gly的步骤；
(d)将SEQ ID NO：21的第21位(EU编号第138位)的Ser取代成Gly的步骤；
(e)将SEQ ID NO：21的第97位(EU编号第214位)的Arg取代成Thr的步骤；
(f)将SEQ ID NO：21的第100位(EU编号第217位)的Ser取代成Arg的步骤；
(g)将SEQ ID NO：21的第102位(EU编号第219位)的Tyr取代成Ser的步骤；
(h)将SEQ ID NO：21的第103位(EU编号第220位)的Gly取代成Cys的步骤；
(i)将SEQ ID NO：21的第104位(EU编号第221位)的Pro取代成Val的步骤；
(j)将SEQ ID NO：21的第105位(EU编号第222位)的Pro取代成Glu的步骤；
(k)将SEQ ID NO：21的第113位(EU编号第233位)的Glu取代成Pro的步骤；
(l)将SEQ ID NO：21的第114位(EU编号第234位)的Phe取代成Val的步骤；
(m)将SEQ ID NO：21的第115位(EU编号第235位)的Leu取代成Ala的步骤；
(n)使SEQ ID NO：21的第116位(EU编号第236位)的Gly缺失的步骤；
(o)将SEQ ID NO：21的第289位(EU编号第409位)的Arg取代成Lys的步骤；以及
(p)使SEQ ID NO：21的第236位(EU编号第446位)的Gly和第237位(EU编号第447位)的Lys缺失的步骤。
本发明的方法只要包括上述步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代和缺失的其他步骤。对氨基酸的取代和缺失的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
对作为对象的抗体没有特别限定，但优选为抗人IL-6受体抗体，进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
<降低来自IgG1恒定区的C末端氨基酸缺失的异质性的方法>
本发明还涉及改善抗体异质性的方法，该方法包括使具有SEQ IDNO：19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中第329位(EU编号第446位)的Gly和第330位(EU编号第447位)的Lys缺失的步骤。本发明的改善抗体异质性的方法只要包括使具有SEQ ID NO：19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中第330位(EU编号第447位)的Lys和第329位(EU编号第446位)的Gly缺失的步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。对氨基酸取代的方法没有特别限定，例如可以按照上述位点特异性诱变法或实施例中记载的方法进行。
<通过取代IgG1恒定区的氨基酸来提高药物动力学的方法>
本发明还涉及提高抗体药物动力学的方法，该方法包括将具有SEQ ID NO：19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区中第317位(EU434)的Asn取代成其他氨基酸的步骤。对取代后的氨基酸没有特别限定，但优选取代成Ala。本发明的提高药物动力学的方法只要包括上述步骤即可，还可以包括其他氨基酸取代。
本发明还涉及提高抗体药物动力学的方法和/或降低抗体的来自C末端的异质性的方法(M83)，上述方法包括对具有SEQ ID NO：19记载的氨基酸序列的IgG1恒定区进行下述(a)～(b)的步骤：
(a)将SEQ ID NO：19的第317位(EU 434)的Asn取代成Ala的步骤；以及
(b)使SEQ ID NO：19的第330位(EU编号第447位)的Lys和第329位(EU编号第446位)的Gly缺失的步骤。
对作为对象的抗体没有特别限定，但优选为抗人IL-6受体抗体，进一步优选为人源化PM-1抗体或其修饰(取代、缺失、插入)体。
上述本发明的恒定区可以和来自任何抗体的可变区组合，但优选与来自抗人IL-6受体抗体的可变区组合。抗人IL-6受体抗体的可变区的例子有：人源化PM-1抗体的可变区。人源化PM-1抗体的可变区可以是未进行氨基酸取代等的可变区，也可以是进行了上述氨基酸取代等的可变区。
本发明提供包含本发明抗体的医药组合物。本发明的医药组合物在类风湿性关节炎等与IL-6有关的疾病的治疗中有用。
本发明的医药组合物除包含抗体外，还可以导入医药上可接受的载体，按照公知的方法制成制剂。例如可以和水或除水以外的药学上可接受的液体制成无菌溶液或悬浮液剂的注射剂的形式，进行胃肠外给药。例如，考虑将其与药理学上可接受的载体或介质、具体有灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂等适当组合，按照通常认可的制药规则(製薬実施)所要求的单位用量形式进行混合，从而制成制剂。这些制剂中的有效成分量为得到所指示的范围的适当容量。
注射用无菌组合物可以使用注射用蒸馏水这样的媒介物，按照通常的制剂规则制成处方。
作为注射用水溶液，例如有生理盐水、含有葡萄糖或其他辅剂(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠)的等渗溶液。上述注射用水溶液可以和适当的助溶剂、例如醇、具体有乙醇、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂(例如聚山梨酯80(TM)、HCO-50)结合使用。
油性液体包括芝麻油、大豆油。上述油性液体可以和作为助溶剂的苯甲酸苄酯、苯甲醇结合使用。还可以与缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如苯甲醇、苯酚)、抗氧剂混合。所制备的注射液通常填充在适当的安瓿中。
给药方式优选为胃肠外给药，具体有注射剂型、经鼻给药剂型、经肺给药剂型、经皮给药剂型等。注射剂型的例子有：例如可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或局部给药。
可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。作为含有抗体或编码抗体的多核苷酸的医药组合物的给药量，例如可以在每次0.0001mg～1000mg/kg体重的范围内选择。或者，例如可以按照每名患者0.001～100000mg/人的范围选择给药量，但并不限于上述数值。给药量、给药方法可以根据患者的体重、年龄和症状等而变动，本领域技术人员可以适当选择。
本说明书中使用的氨基酸的三字母表示与单字母表示的对应关系如下。
丙氨酸：Ala(A)
精氨酸：Arg(R)
天冬酰胺：Asn(N)
天冬氨酸：Asp(D)
半胱氨酸：Cys(C)
谷氨酰胺：Gln(Q)
谷氨酸：Glu(E)
甘氨酸：Gly(G)
组氨酸：His(H)
异亮氨酸：Ile(I)
亮氨酸：Leu(L)
赖氨酸：Lys(K)
甲硫氨酸：Met(M)
苯丙氨酸：Phe(F)
脯氨酸：Pro(P)
丝氨酸：Ser(S)
苏氨酸：Thr(T)
色氨酸：Trp(W)
酪氨酸：Tyr(Y)
缬氨酸：Val(V)
需要说明的是，本说明书中引用的所有在先技术文献均作为参照而纳入本说明书中。
实施例
以下，通过实施例来具体说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
[实施例1]利用亲和力成熟技术通过修饰CDR来提高抗原结合能力
SR344的制备
制作J.Biochem.108，673-676(1990)中报道的、由N末端侧第1位～第344位氨基酸序列构成的可溶性人IL-6R(以下记作SR344)(Yamasaki等人，Science(1988)241，825-828(GenBank#X12830))的CHO细胞恒定表达株。
通过Blue Sepharose 6FF柱层析、固定有SR344特异性抗体的柱亲和层析、凝胶过滤柱层析这三种柱层析，从由SR344表达CHO细胞得到的培养上清中纯化SR344。
将培养上清直接添加到用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)平衡的Blue Sepharose 6FF柱(GE Healthcare Bio-Sciences)上，用相同缓冲液将未吸附的组分完全洗脱。之后，用含有300mM KCl的相同缓冲液清洗柱。再在含有300mM KCl的相同缓冲液中，利用0M～0.5MKSCN的直线浓度梯度洗脱吸附的蛋白。通过使用了SR344特异性抗体的蛋白质印迹法分析在KSCN浓度梯度下洗脱的组分，收集含SR344的组分。
将固定有SR344特异性抗体的柱预先用Tris-缓冲盐(TBS)平衡。将步骤一中得到的SR344组分用Amicon Ultra-15(MILLIPORE；分子量截断值为10kDa)进行超滤、进行浓缩，再用TBS稀释两倍，之后添加到上述柱中。用TBS清洗柱，之后用100mM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.5)洗脱吸附的蛋白。向洗脱的组分中添加1M Tris(pH8.1)，使其pH值回复至中性。用SDS-PAGE分析所得的组分，收集含SR344的组分。
将步骤二中得到的组分用Amicon Ultra-15(分子量截断值为10kDa)浓缩，之后添加到用PBS平衡的Superdex 200柱(GE HealthcareBio-Sciences)上。将作为主峰洗脱的组分作为SR344的最终纯品。
人gp130表达BaF3细胞株的建立
为了得到显示IL-6依赖性增殖的细胞株，如下建立表达人gp130的BaF3细胞株。
通过PCR扩增全长人gp130 cDNA(Hibi等人，Cell 1990；63：1149-1157(GenBank#NM_002184))，之后将其克隆到表达载体pCOS2Zeo中，构建pCOS2Zeo/gp130，所述表达载体pCOS2Zeo是通过除去pCHOI(Hirata等人，FEBS Letter；1994；356：244-248)的DHFR基因表达部位、并插入Zeocin耐性基因表达部位而得到的。通过PCR扩增全长人IL-6R cDNA，之后将其克隆到pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中，构建hIL-6R/pcDNA3.1(+)。
将10μg pCOS2Zeo/gp130混合在悬浮于PBS中的BaF3细胞(0.8×107细胞)中，之后使用Gene Pulser(Bio-Rad)以0.33kV、950μFD的容量施加脉冲。将通过电穿孔处理导入有基因的BaF3细胞在含有0.2ng/mL小鼠白介素-3(Peprotech)、10％胎牛血清(以下记作FBS；HyClone)的RPMI 1640培养基(Invitrogen)中培养一夜，加入含100ng/mL人白介素-6(R&D Systems)、100ng/mL人白介素-6可溶型受体(R&D Systems)和10％FBS的RPMI 1640培养基进行筛选，建立人gp130表达BaF3细胞株(以下记作BaF3/gp130)。由于该BaF/gp130在人白介素-6(R&D Systems)和SR344的存在下增殖，所以可以将其用于评价抗IL-6受体抗体的增殖抑制活性(即IL-6受体中和活性)。
CDR修饰文库的建立
首先，将人源化PM-1抗体(Cancer Res.1993 Feb 15；53(4)：851-6)转化成scFv。通过PCR扩增VH、VL区，制作在VH、VL之间具有接头序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：106)的人源化PM-1HL scFv。
以制作的人源化PM-1 HL scFv DNA为模板，通过PCR制作各CDR氨基酸中的1个氨基酸为X的目标文库、以及CDR中的仅HotSpot(热点)序列为随机序列的文库。各CDR氨基酸中的1个氨基酸为X的目标文库如下构建：使用以将要文库化的氨基酸作为NNS的引物，通过PCR反应构建文库部分，除此以外的部分通过普通PCR来制作，通过装配PCR法进行连接即得。此时，仅1个CDR形成文库(参考J.Mol.Biol.1996；256：77-88)。关于仅Hot Spot序列为随机序列的文库，使用以所有Hot Spot氨基酸为NNS的引物，通过PCR按照相同的方式进行构建。此时，构建了仅VH的Hot Spot被文库化的文库、仅VL的Hot Spot被文库化的文库(参考Nature Biotechnology 1999June；17：568-572)。
使用上述文库，按照J.Immunological Methods 1999；231：119-135构建核糖体展示用文库。为了基于大肠杆菌无细胞系统在体外进行翻译，在5’侧添加SDA序列(核糖体结合位点)和T7启动子，且以gene3部分序列作为核糖体展示用接头，使用SfiI与3’侧连接。
通过核糖体展示获取高亲和性scFv
按照Nature Biotechnology 2000 Dec；18：1287-1292，利用核糖体展示进行淘选。将制备的SR344用NHS-PEO4-Biotin(Pierce)进行生物素化用作抗原。为了高效率地获得高亲和性的scFv，参考JBC 2004；279(18)：18870-18877进行解离率(off-rate selection)筛选。生物素化抗原量为1nM，竞争抗原量为1μM，在第4轮(in the fourth round)的竞争时间为10O/N。
scFv：插入噬菌粒、抗原结合性和序列分析
以在第4轮得到的DNA库为模板，使用特异性引物进行PCR，从而使HL scFv复原。用SfiI进行消化，之后将所得片段插入同样用SfiI消化的噬菌粒载体pELBG lacI中，转化成XL1-Blue(Stratagene)。使用所得的集落，利用噬菌体ELISA进行抗原结合性评价，HL scFv序列分析。按照J.Mol.Biol 1992；227：381-388，使用经1μg/mL的SR344包被的平板进行噬菌体-ELISA。使用特异性引物对确认到SR344结合性的克隆进行序列分析。
由scFv向IgG转化、以及IgG的表达和纯化
使用动物细胞表达用载体进行IgG的表达。对于确认到突变位点的浓缩的克隆，通过PCR分别扩增它们的VH和VL，利用XhoI/NheI消化和EcoRI消化，将扩增的DNA插入动物细胞表达用载体中。各DNA片段的核苷酸序列通过使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems)，利用DNA序列分析仪(ABI PRISM 3730xL DNA序列分析仪或ABI PRISM 3700DNA序列分析仪(AppliedBiosystems))，按照附录说明书中所述的方法进行确定。
IgG化抗体的表达
抗体的表达采用下述方法进行。将来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)悬浮于含有10％胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中，以5～6×105细胞/mL的细胞密度在粘附细胞用培养皿(直径10cm；CORNING)的各皿中分别接种10mL，在37℃、5％CO2的培养箱内培养一昼夜，之后吸除培养基，添加6.9mL CHO-S-SFM-II培养基(Invitrogen)。将制备的质粒DNA混合液(总计13.8μg)与20.7μL1μg/mL的聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)和690μL CHO-S-SFMII培养基混合，在室温下静置10分钟，之后投入各皿的细胞中，在37℃、5％CO2的培养箱内培养4～5小时。之后，添加6.9mL CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基，在CO2培养箱内培养3天。回收培养上清，之后以约2000g的离心力在室温下离心5分钟以除去细胞，再通过0.22μm的滤器MILLEX(注册商标)-GV(Millipore)进行灭菌。该安瓿使用前一直在4℃下保存。
IgG化抗体的纯化
向所得培养上清中添加悬浮于TBS中的50μL rProtein ASepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，在4℃下倒置混合4小时以上。将该溶液移至0.22μm的滤杯Ultrafree(注册商标)-MC(Millipore)中，用500μL TBS清洗3次，然后将rProtein A SepharoseTM树脂悬浮于100μL 50mM的乙酸钠水溶液(pH3.3)中，静置2分钟，之后洗脱抗体。立即加入6.7μL的1.5M Tris-HCl(pH7.8)进行中和。洗脱2次，得到200μL纯化抗体。将2μL含有抗体的溶液供给分光光度计ND-1000(NanoDrop)、或者将50μL含有抗体的溶液供给分光光度计DU-600(BECKMAN)，测定280nm下的吸光度。使用下式由所得的值算出抗体浓度。
抗体浓度(mg/mL)＝吸光度×稀释倍率÷14.6×10
IgG化克隆的人IL-6受体中和活性的评价
使用显示IL-6/IL-6受体依赖性增殖的BaF3/gp130，评价IL-6受体中和活性。将BaF3/gp130用含有10％FBS的RPMI1640培养基清洗3次，之后悬浮于含有60ng/mL人白介素-6(TORAY)、60ng/mL重组可溶型人IL-6受体(SR344)和10％FBS的RPMI1640培养基中，使达到5×104细胞/mL的密度，再向96孔平板(CORNING)的各孔中分别注入50μL。接下来，将纯化的抗体用含有10％FBS的RPMI1640培养基稀释，向各孔中分别混合50μL。在37℃、5％CO2的条件下培养3天，以20μL/孔加入用PBS稀释2倍的WST-8试剂(细胞计数试剂盒8；株式会社同仁化学研究所)，之后立即使用SUNRISE CLASSIC(TECAN)测定450nm的吸光度(参比波长为620nm)。培养2小时后，再次测定450nm的吸光度(参比波长为620nm)，以2小时的吸光度变化为指标，评价IL-6受体中和活性。
其结果，得到多个活性较人源化PM-1抗体(野生型：WT)高的抗体。显示出高于WT的活性的抗体的突变位点见图4。例如，如图1所示，可知：与WT相比，RD_6在100％抑制浓度下显示出约50倍高的中和活性。
利用Biacore分析IgG化克隆的亲和性
对于活性高于野生型的克隆，使用Biacore T100(BIACORE)进行抗原抗体反应的速度论的分析。将1800RU～2600RU(共振单位)的rec-Protein A(ZYMED)(以下记作Protein A)固定在传感器芯片上，使各种抗体与该芯片结合，使抗原以分析物的形式流经芯片，测定抗体与抗原的相互作用。将调整成各种浓度的重组人IL-6R sR(R&DSystems)(以下记作rhIL-6sR)用作抗原。所有测定均在25℃下进行。由测定中得到的传感图算出动力学参数、即结合速度常数ka(1/Ms)和解离速度常数kd(1/s)，根据该值算出KD(M)。使用Biacore T100评估软件(BIACORE)计算各参数。
其结果，得到多个亲和性高于人源化PM-1抗体(野生型：WT)的抗体。例如，野生型(WT)和RD_6的传感图见图2和图3。由动力学参数分析结果可知：与WT相比，RD_6显示出约50倍高的亲和性(表1)。此外，得到了保有数十倍高的亲和性的抗体。显示出高于WT的亲和性的突变位点见图4。
[表1]
Figure GPA00001143028200991
[实施例2]利用各CDR修饰的组合来提高抗原结合能力
对活性及亲和性高的突变位点进行突变位点的融合，制作活性更高、亲和性更高的抗体。
修饰抗体的制作、表达、纯化
对所选定的位点进行用于制作修饰抗体的氨基酸修饰。具体而言，使用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)，按照附录说明书所述的方法，向制作的H(WT)可变区(H(WT)、SEQ ID NO：107)和L(WT)链可变区(L(WT)、SEQ ID NO：108)中导入突变。用XhoI和NotI消化确认为目标人源化抗体可变区基因序列的H链抗体基因片段插入质粒，之后用EcoRI消化插入有L链抗体基因片段的质粒，之后将反应液供于1％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)，按照附录说明书所述的方法纯化目标尺寸(约400bp)的DNA片段，用30μL无菌水进行洗脱。之后将抗体H链基因片段插入动物细胞表达用载体中，制作目标H链表达载体。进行相同的操作，制作L链表达载体。使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics)进行连接反应，转化大肠杆菌DH5α株(东洋纺织)。各DNA片段的核苷酸序列通过使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)，利用DNA序列分析仪(ABI PRISM 3730xL DNA序列分析仪或ABI PRISM 3700DNA序列分析仪(Applied Biosystems))，按照附录说明书所述的方法来确定。使用制作的表达载体，按照实施例1所述的方法进行表达、纯化。
人IL-6受体中和活性的评价
已纯化的抗体的中和活性的评价按照实施例1所述的方法进行。其中，使人白介素-6(TORAY)浓度达到600ng/mL，进行中和活性的评价。得到多个显示出高于WT的活性的新型抗体，这些抗体的CDR序列见图5。其中，作为显示出高活性的抗体，H链中使用了RDC_5H、L链中使用了RDC_11L的抗体(形成RDC_23)的中和活性见图6。可知：与WT相比，RDC_23在100％抑制浓度下具有约100倍高的活性。不仅在RDC_23、即H链中使用了RDC_5H、L链中使用了RDC_11L的抗体中确认到中和活性提高，在H链中使用了RDC_2H、RDC_3H、RDC_4H、RDC_5H、RDC_6H、RDC_7H、RDC_8H、RDC_27H、RDC_28H、RDC_29H、RDC_30H、RDC_32H、L链中使用了L(WT)的抗体(分别形成RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_27、RDC_28、RDC_29、RDC_30、RDC_32)、以及H链中使用了H(WT)、L链中使用了RDC_11L的抗体(形成RDC_11)中也确认到中和活性的提高，通过组合利用亲和力成熟技术发现的突变位点，可以取得具有更高活性的抗体。此外，由于组合有这些突变位点的抗体的中和活性有所提高，所以认为其亲和性也提高。
利用使用了蛋白A的Biacore进行亲和性分析
于是，在中和活性提高的抗体中，对于RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_11、RDC_23，使用BiacoreT100(BIACORE)进行抗原抗体反应的速度论的分析。通过胺耦合法将4400RU～5000RU的rec-蛋白A(ZYMED)固定在传感器芯片上，使各种抗体结合在芯片上，再使抗原以分析物的形式在芯片上流动，测定抗体与抗原的相互作用。抗原使用调整成各种浓度的rhIL-6sR。所有测定均在25℃下进行。由测定中得到的传感图算出动力学参数、即结合速度常数ka(1/Ms)和解离速度常数kd(1/s)，根据该值算出KD(M)。使用Biacore T100评估软件(BIACORE)计算各参数。其结果，组合有突变位点的RDC_2、RDC_3、RDC_4、RDC_5、RDC_6、RDC_7、RDC_8、RDC_11、RDC_23具有较同时测定的包含1个突变位点的RD_28小的KD值(表2)。其中，显示出高亲和性的RDC_23的传感图见图7。
[表2]
由此可知：与组合突变位点前的抗体相比，这些抗体的亲和性强。与中和活性一样，通过组合利用亲和力成熟技术发现的突变位点，可以获得具有更高亲和性的抗体。显示出高于WT的活性或亲和性的突变体的氨基酸序列如下(来自WT的突变位点带有下划线)。
(HCDR2)
SEQ ID NO：45YISYSGITNYNPSLKS
(HCDR3)
SEQ ID NO：57LLARATAMDY
SEQ ID NO：58VLARATAMDY
SEQ ID NO：59ILARATAMDY
SEQ ID NO：60TLARATAMDY
SEQ ID NO：61VLARITAMDY
SEQ ID NO：62ILARITAMDY
SEQ ID NO：63TLARITAMDY
SEQ ID NO：64LLARITAMDY
(LCDR3)
SEQ ID NO：79GQGNRLPYT
即，通过制作HCDR2的第9位氨基酸为Asn、HCDR3的第1位氨基酸为Leu、Val、Ile、Thr中的任一个、HCDR3的第5位氨基酸为Ala或Ile、LCDR3的第1位氨基酸为Gly、LCDR3的第5位氨基酸为Arg的抗体，可以制作中和活性和亲和性较WT显著提高的抗IL-6受体抗体。
利用使用了蛋白A/G的Biacore进行亲和性分析
使用Biacore T100(BIACORE)，进行WT和RDC_23的抗原抗体反应的速度论的分析。将纯化的重组蛋白A/G(Pierce)(以下记作蛋白A/G)固定在传感器芯片上，使各种抗体与芯片结合，使抗原以分析物的形式在芯片上流动，测定抗体与抗原的相互作用。抗原使用调整成各种浓度的rhIL-6sR(R&D Systems)和重组可溶型IL-6受体(实施例1中制备的SR344)。由杆状病毒感染的昆虫细胞产生的rhIL-6sR的糖链结构为高甘露糖型，相对于此，认为由CHO细胞产生的SR344的糖链结构为复合型糖链、且末端结合有唾液酸。实际上，人体内的可溶型IL-6受体的糖链结构为复合型糖链、且末端结合有唾液酸，所以认为SR344与人体内可溶型IL-6受体的结构更接近，在本实验中进行rhIL-6sR与SR344的比较试验。
由测定中得到的传感图算出动力学参数、即结合速度常数ka(1/Ms)和解离速度常数kd(1/s)，根据该值算出KD(M)。使用BiacoreT100评估软件(BIACORE)计算各参数。
传感器芯片是利用胺耦合法将约3000RU的蛋白A/G固定在CM5(BIACORE)上制作而成。使用制作的传感器芯片，进行与蛋白A/G结合的抗体(WT和RDC_23)、与rhIL-6sR和SR344这两种可溶型IL-6受体的相互作用的速度论的分析。运行缓冲液使用HBS-EP+，流速为20μL/分钟。各抗体制备成约100RU与蛋白A/G结合。用作分析物的rhIL-6sR使用HBS-EP+，制成0、0.156、0.313、0.625μg/mL。SR344制成0、0.0654、0.131、0.261μg/mL。测定中，首先使目标抗体WT和RDC_23与蛋白A/G结合，再使分析物溶液与其作用3分钟，之后换成HBS-EP+(BIACORE)，测定解离相10分钟。解离相的测定结束后，用10μL的10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)进行清洗，使传感器芯片再生。该结合、解离、再生构成1个分析周期。所有实验均在37℃下进行。
按照上述周期分别对WT和RDC_23进行测定，所得的rhIL-6sR和SR344这两种可溶型IL-6受体的传感图见图8、图9、图10和图11。使用Biacore专用的数据分析软件、即Biacore T100评估软件，对所得传感图进行速度论的分析(表3)。其结果可知：在rhIL-6sR和SR344的比较中，WT和RDC_23均为使用SR344时所得的亲和性弱2～3倍。与WT相比，RDC_23对rhIL-6sR和SR344两者的亲和性均提高约40～60倍，利用由亲和力成熟技术得到的各CDR修饰的组合，与WT相比，RDC_23对认为与人体内的可溶型IL-6受体的结构接近的SR344显示出非常强的亲和性。在以后的实施例中，使用了SR344和蛋白A/G的抗原抗体反应的速度论的分析均在37℃下进行
[表3]
Figure GPA00001143028201031
[实施例3]通过CDR和构架的修饰使药物动力学提高、以及免疫原性风险降低的H53/L28的研制
在Cancer Res.1993 Feb 15；53(4)：851-6中，对于人源化小鼠PM-1抗体(以下记作野生型或简记作WT；H链WT记作H(WT)；L链WT记作L(WT))，为了提高其药物动力学、降低免疫原性风险及提高稳定性，实施了如下修饰。为了提高药物动力学，向WT的H链可变区和L链可变区序列中导入降低等电点的修饰。
制作人源化PM-1抗体的立体结构模型
首先，为了确认暴露于人源化PM-1抗体(H(WT)/L(WT))可变区表面的氨基酸残基，使用MOE软件(Chemical Computing Group Inc.)，利用同源性模拟制作人源化小鼠PM-1抗体的Fv区模型。
选择用于降低人源化PM-1抗体的等电点的修饰位点
通过详细分析制作的模型，认为作为降低等电点的修饰导入位点，在FR序列中暴露于表面的氨基酸中的H16、H43、H81、H105、L18、L45、L79、L107(Kabat编号；Kabat EA等人，1991，Sequences ofProteins of Immunological Interest(目标免疫蛋白序列)，NIH)、以及作为CDR序列的H31、H64、H65、L24、L27、L53、L55成为不降低活性和稳定性、但可以降低等电点的候选位点。
除去人源化PM-1抗体中残留的小鼠序列
人源化PM-1抗体是将小鼠PM-1抗体人源化而得到的抗体序列(Cancer Res.1993 Feb 15；53(4)：851-6)。人源化PM-1抗体的H链是通过将CDR嫁接到作为人抗体可变区的NEW构架中而得到的，但H链的H27、H28、H29、H30、H71直接利用小鼠序列以保持活性。考虑到免疫原性的风险，认为小鼠序列越少越好，因此探索用于将H27、H28、H29、H30转化成人序列的序列。
选择用于提高人源化PM-1抗体稳定性的修饰位点
本发明人等认为通过将人源化PM-1抗体(H(WT)/L(WT))的可变区中H65的丝氨酸取代成甘氨酸(转角结构的稳定化；通过将HCDR2转化成共有序列而实现稳定化)、H69的甲硫氨酸取代成异亮氨酸(疏水核结构的稳定化)、H70的亮氨酸取代成丝氨酸(通过将暴露表面的残基亲水化而实现稳定化)、H58的苏氨酸取代成天冬酰胺(通过将HCDR2转化成共有序列而实现稳定化)、L93的苏氨酸取代成丝氨酸(通过将暴露表面的残基亲水化而实现稳定化)、H107的丝氨酸取代成异亮氨酸(β折叠的稳定化)，可以提高稳定性，认为这些修饰是提高稳定性的候选。
除去人源化PM-1抗体的在计算机芯片上预测的T细胞表位
首先，使用TEPITOPE(Methods 2004 Dec；34(4)：468-75)对人源化PM-1抗体(H(WT)/L(WT))的可变区进行分析。结果显示：在L链CDR2上存在多个与HLA结合的T细胞表位。因此，在TEPITOPE分析中研究降低L链CDR2的免疫原性风险但不降低稳定性、结合活性和中和活性的修饰。由结果可知：通过将L链CDR2的L51的苏氨酸取代成甘氨酸，可以在不降低稳定性、结合活性、中和活性的情况下除去与HLA结合的T细胞表位。
各构架序列的选择
由一般公开的Kabat数据库(ftp://ffp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)和IMGT数据库(http://imgt.cines.fr/)获取人抗体氨基酸序列数据，使用由此构建的数据库，区分各构架可以检索同源性。选择人构架时，从降低等电点、除去残留的小鼠序列、提高稳定性的角度考虑，利用数据库研究具有上述各项修饰的人构架序列。由结果可知：如下所示，通过使修饰抗体H53/L28的各构架形成下述序列，可以不降低结合活性、中和活性而满足上述各项。Source为该人序列的来源，而序列中下划线部分的氨基酸残基是与WT相比导入有修饰的氨基酸。
[表4]
Figure GPA00001143028201061
由于上述H53的FR3存在非人序列，所以希望进一步降低免疫原性风险。作为降低免疫原性风险的修饰，认为可以形成将H89的Ala取代成Val的序列(SEQ ID NO：127)。并且，由于在H53的FR3中H71位上的Arg对结合活性重要(Cancer Res.1993 Feb 15；53(4)：851-6)，所以认为通过使用H71位上保有Arg的人VH1亚纲的FR3序列(SEQID NO：128)或人VH3亚纲的FR3序列(SEQ ID NO：129)，可以制作H链、L链的构架均完全为人序列的抗人IL-6受体抗体。
各CDR序列的选择
选择CDR序列时，第一，从不降低结合活性和中和活性、而降低等电点、提高稳定性、除去T细胞表位的角度考虑，如下选择H53/L28的各CDR序列。
[表5]
Figure GPA00001143028201071
修饰抗体的表达载体的制作、表达、纯化
已被修饰的抗体的表达载体的制作、表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。向人源化小鼠PM-1抗体的H(WT)突变导入用载体、L(WT)突变导入用载体中依次导入修饰，使形成所选择的构架序列、CDR序列。使用最终得到的、编码具有所选择的构架序列、CDR序列的H53/L28(抗体氨基酸序列：H53，SEQ ID NO：104；L28，SEQ IDNO：105)的动物细胞表达用载体，进行H53/L28的表达、纯化，将其用于以下评价。
通过等电点电泳进行修饰抗体H53/L28的等电点评价
为了评价由可变区的氨基酸修饰引起的全长抗体的等电点变化，通过等电点电泳对WT和修饰抗体H53/L28进行分析。等电点电泳如下进行。使用Phastsystems Cassette(Amersham Biosciences社制)，将Phast-Gel Dry IEF(Amersham Biosciences社制)凝胶在下述膨润液中膨润约30分钟。
Milli-Q水                1.5mL
IEF用Pharmalyte 5-8(Amersham Biosciences社制)50μL
IEF用Pharmalyte 8-10.5(Amersham Biosciences社制)50μL
使用已膨胀的凝胶，利用PhastSystems(Amersham Biosciences社制)按照下述程序进行电泳。在步骤2中将样品添加到凝胶中。pI标记使用pI的校准试剂盒(Amersham Biosciences社制)。
步骤1：2000V    2.5mA  3.5W 15℃ 75Vh
步骤2：200V     2.5mA  3.5W 15℃ 15Vh
步骤3：2000V    2.5mA  3.5W 15℃ 410Vh
电泳后，将凝胶用20％TCA固定，之后使用银染色试剂盒、蛋白(Amersham Biosciences社制)，按照试剂盒中附带的操作指南进行银染色。染色后，由pI标记的已知等电点算出样品(全长抗体)的等电点。其结果，WT的等电点为约9.3，修饰抗体H53/L28的等电点为约6.5～6.7，通过对WT进行氨基酸取代得到了等电点下降了约2.7的H53/L28。通过GENETYX(GENETYX CORPORATION)计算该H53/L28可变区(VH、VL序列)的理论等电点时，理论等电点为4.52。由于WT的理论等电点为9.20，所以通过对WT进行氨基酸取代得到了可变区理论等电点下降了约4.7的H53/L28。
H53/L28的人IL-6受体中和活性的评价
按照实施例1所述的方法对WT和H53/L28进行评价。结果见图12。由结果可知：与WT相比，修饰抗体H53/L28对BaF/gp130的中和活性提高数倍。即，与WT相比，H53/L28可以在不降低等电点的同时提高中和活性。
利用Biacore进行H53/L28与人IL-6受体的亲和性的分析
关于WT和H53/L28与人IL-6受体的亲和性评价，使用BiacoreT100(BIACORE)进行速度论的分析。将纯化的重组蛋白A/G(Pierce)(以下记作蛋白A/G)固定在传感器芯片上，使各种抗体与芯片结合，使抗原以分析物的形式在芯片上流动，测定抗体与抗原的相互作用。抗原使用调整成各种浓度的重组可溶型IL-6受体(SR344)。测定条件与实施例2相同。
所得的WT和H53/L28的传感图见图13。使用Biacore专用的数据分析软件、即Biacore T100评估软件进行速度论的分析，结果见表6。由结果可知：与WT相比，H53/L28的KD下降约6倍、而亲和性提高约6倍。即，与WT相比，H53/L28可以在不降低等电点的同时提高亲和性约6倍。详细的研究结果认为：有助于提高亲和性的氨基酸突变为将L51的苏氨酸取代成甘氨酸的突变。即，认为通过将L51的苏氨酸取代成甘氨酸，可以提高亲和性。
[表6]
利用TEPITOPE预测H53/L28中的T细胞表位
进行H53/L28的TEPITOPE分析(Methods.2004 Dec；34(4)：468-75)。由结果可知：与WT相比，H53/L28中有可能与HLA结合的肽数大幅减少，由此认为在人体内的免疫原性风险降低。
[实施例4]H53/L28的血浆中滞留性的评价
评价修饰抗体H53/L28在正常小鼠血浆中的动力学
为了评价等电点降低的修饰抗体H53/L28在血浆中滞留性，对WT和修饰抗体H53/L28在正常小鼠血浆中的动力学进行了比较。
将WT和H53/L28以1mg/kg对小鼠(C57BL/6J；日本Charles River)进行静脉内和皮下单次给药，于给药前、和给药后15分钟、2小时、8小时、1天、2天、5天、7天、14天、21天、28天进行采血。其中，给药后15分钟仅从静脉内给药组采血。将采集的血液立即在4℃下以15,000rpm的转速离心15分钟，得到血浆。分离的血浆在实施测定前一直保存在被设定为-20℃以下的冷库中。
小鼠血浆中浓度测定按照ELISA法进行。首先，使用EZ-LinkTMSulfo-NFS-生物素化试剂盒(PIERCE社制)将重组人IL-6 sR(R&DSystems社制)生物素化。将该生物素化人-sIL-6R分别注入用Reacti-Bind高结合能链霉亲和素(HBC)包被的平板(PIERCE社制)中，在室温下静置1小时以上，制成人-sIL-6R-固定化平板。制备血浆中浓度为3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05μg/mL的标准曲线试样和小鼠血浆测定试样，分别注入人-sIL-6R-固定化平板中，在室温下静置1小时。之后使抗人IgG-AP(SIGMA社制)与其反应，使用BluePhosMicrowell磷酸酶底物系统(Kirkegaard&Perry Laboratories社制)作为底物进行显色反应，使用酶标仪(microplate reader)测定650nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices社制)，由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中浓度。WT和H53/L28静脉内给药后的血浆中浓度变化见图14、皮下给药后的血浆中浓度变化见图15。
使用药物动力学分析软件WinNonlin(Pharsight社制)，对所得的血浆中浓度变化数据进行非模型依赖性分析，算出药物动力学参数(AUC、清除率(CL)、半衰期(T1/2))。T1/2由最后3点或WinNonlin自动设定的最终相的血浆中浓度算出。BA由皮下给药后的AUC与静脉内给药后的AUC之比算出。所得的药物动力学参数见表7。
[表7]
Figure GPA00001143028201101
H53/L28静脉内给药后的血浆中半衰期(T1/2)延长至WT的约1.3倍，清除率降低约1.7倍。H53/L28皮下给药后的T1/2延长至WT的约2倍，清除率降低约2.1倍。如此，通过降低WT的等电点，可以大幅提高H53/L28的药物动力学。
与人源化PM-1抗体(WT)相比，H53/L28是结合活性及中和活性提高、免疫原性风险降低、同时药物动力学大幅提高的人源化抗IL-6受体抗体，所以认为在药物开发中，H53/L28中适用的修饰极为有用。
[实施例5]PF1抗体的制作
人源化PM-1抗体的表达载体和突变导入载体的制作
向实施例4中制成的H53/L28中导入在实施例2中发现的、提高RDC_23的亲和性的2处H链、2处L链、总计4处CDR突变。向H53/L28中导入了RDC_23的突变的H链命名为PF1_H、向H53/L28中导入了RDC_23的突变的L链命名为PF1_L，修饰抗体的制作、表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。PF1_H的氨基酸序列见SEQID NO：22，PF1_L的氨基酸序列见SEQ ID NO：23。
人IL-6受体中和活性的评价
已纯化的PF1抗体的中和活性评价按照实施例1所述的方法进行。其中，使人白介素-6(TORAY)的浓度达到600ng/mL，再进行中和活性的评价。WT和PF1的中和活性见图16。可知：与WT相比，PF1在100％抑制浓度下具有约100～1000倍的活性。
利用Biacore分析PF1抗体与人IL-6受体的亲和性
本测定在与实施例2相同的条件下进行。运行缓冲液使用HBS-EP+，流速为20μL/分钟。各抗体制备成约100RU与蛋白A/G结合。用作分析物的SR344使用HBS-EP+，调整成0、0.065、0.131、0.261μg/mL。测定中，首先使抗体溶液与蛋白A/G结合，再使分析物溶液与其作用3分钟，之后换成HBS-EP+，测定解离相10分钟或15分钟。解离相的测定结束后，用10μL的10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)进行清洗，使传感器芯片再生。该结合、解离、再生构成1个分析周期。按照该周期对各种抗体进行测定。
所得PF1的传感图见图17。使用Biacore专用的数据分析软件、即Biacore T100评估软件对所得传感图进行速度论的分析，分析结果、与WT和H53/L28的分析结果一并见表8。由结果可知：与WT相比，PF1的亲和性提高约150倍。通过将利用亲和力成熟的组合得到的高亲和性的RDC_23、和药物动力学提高且亲和性提高的H53/L28组合起来，由于协同效果PF1得到较上述RDC_23或H53/L28高的亲和性。
[表8]
Figure GPA00001143028201121
利用差示扫描量热法(DSC)评价PF1抗体的热稳定性
为了评价PF1抗体的热稳定性，利用差示扫描量热法(DSC)进行热变性中间温度(Tm值)的评价。将WT和PF1的纯化抗体用20mM乙酸钠、150mM NaCl、pH6.0的溶液进行透析(EasySEP，TOMY)。在约0.1mg/mL蛋白浓度下，在40℃～100℃范围内以1℃/分钟的升温速度进行DSC测定。由结果可知：WT的Fab部分的Tm值为约94℃，而PF1的Fab部分的Tm值为91℃。普通IgG1型抗体分子的Fab部分的Tm值为约60℃～85℃的范围(Biochem.Biophys.Res.Commun.2007Apr 13；355(3)：751-7；Mol Immunol.2007 Apr；44(11)：3049-60)，由此表明：与普通IgG1分子相比，所得的PF1抗体的热稳定性极高。
评价PF1抗体在高浓度下的稳定性
进行PF1抗体在高浓度制剂中的稳定性的评价。将WT和PF1的纯化抗体用20mM组氨酰氯、150mM NaCl、pH6.5的溶液进行透析(EasySEP，TOMY)，之后用超滤膜进行浓缩，进行在高浓度中的稳定性试验。条件如下。
抗体：WT和PF1
缓冲液：20mM组氨酰氯、150mM NaCl、pH6.0
浓度：145mg/mL
保存温度和保存时间：25℃下2周、25℃下4周或25℃下7周
聚集物评价方法：
系统：Waters Alliance
柱：G3000SWxl(TOSOH)
流动相：50mM磷酸钠、300mM KCl、pH7.0
流速、波长：0.5mL/分钟、220nm
将样品稀释100倍后进行分析
利用上述凝胶过滤层析法评价原始制剂(刚制成的制剂)中和在各种条件下保存后的制剂中聚集物的含量。原始制剂中聚集物的含量变化(增加量)见图18。其结果，WT和PF1均显示出非常高的稳定性；在25℃下保存7周后，WT和PF1中聚集物增加量分别为约0.7％和约0.3％；在25℃下保存1个月后，WT和PF1中聚集物增加量分别为约0.4％和约0.17％；可知：PF1在特别高的浓度下显示出极高的稳定性。WO 2003/039485中给出了作为IgG的高浓度制剂已上市的达珠单抗(Daclizumab)的100mg/mL制剂在25℃下的稳定性数据，但达珠单抗的100mg/mL制剂在25℃下保存1个月后聚集物增加量为约0.3％，即使与达珠单抗相比，PF1在高浓度下的稳定性也极其优异，在开发高浓度的溶液制剂作为药品中，聚集物的增加是重大问题，而PF1抗体在高浓度下聚集物的增加极少。
PF1是将WT加以修饰以达到下述目的的分子，所述目的包括：提高抗原结合能力、通过降低等电点来提高药物动力学、通过除去残留的小鼠序列和T细胞表位来降低免疫原性风险、以及提高稳定性。实际上已经明确：即使与WT相比，PF1在100mg/mL以上的高浓度制剂中的稳定性也非常高，通过使用这样的分子，可以提供稳定且便利性高的高浓度皮下给药制剂。
[实施例6]利用人IL-6受体转基因小鼠进行的PF1抗体的PK/PD试验
使用人IL-6受体转基因小鼠进行的体内动力学试验
评价WT和实施例5中制成的PF1在人IL-6受体转基因小鼠(hIL-6R tg小鼠；Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.1995 May 23；92(11)：4862-6)体内的动力学和人可溶型IL-6受体在体内的中和活性。将WT和PF1以10mg/kg对hIL-6R tg小鼠进行静脉内单次给药，于给药前、和给药后15分钟、2小时、4小时、8小时、1天、2天、4天、7天进行采血。采集的血液立即在4℃下以15,000rpm的速度离心15分钟，得到血浆。分离的血浆在实施测定前一直保存在被设定为-20℃以下的冷库中。
小鼠血浆中浓度测定按照ELISA法进行。制备血浆中浓度为6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1μg/mL的标准曲线试样。将标准曲线试样和小鼠血浆测定试样分别注入用抗人IgG(γ-链特异性)F(ab’)2(Sigma社制)固定的微板(immunoplate)(Nunc-Immuno Plate，Maxi Sorp(Nalge nunc International社制))中，在室温下静置1小时，之后使之与山羊抗人IgG-BIOT(Southem Biotechnology Associates社制)和链霉亲和素碱性磷酸酶缀合物(Roche Diagnostics社制)依次反应，使用BluePhos Microwell磷酸酶底物系统(Kirkegaard&Perry Laboratories社制)作为底物进行显色反应，使用酶标仪测定650nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices社制)，由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中浓度。WT和PF1的血浆中浓度变化见图19。与WT相比，PF1给药4天后的血浆中浓度高约5倍，由此可知：与WT相比，PF1在人IL-6受体转基因小鼠体内的药物动力学有所提高。
已知人IL-6受体转基因小鼠在血浆中产生人可溶型IL-6受体。因此，通过对人IL-6受体转基因小鼠给予抗人IL-6受体抗体，可以评价血浆中存在的人可溶型IL-6受体的中和效果。
为了评价通过给予WT或PF1人可溶型IL-6受体被中和的程度，测定小鼠血浆中非结合型的人可溶型IL-6受体浓度。将6μL小鼠血浆用含有BSA的稀释缓冲液稀释至2倍，将其添加到在0.22μm滤杯(Millipore)中已干燥的适量的rProtein A Sepharose Fast Flow resin(GEHealthcare)上，使血浆中存在的所有IgG型抗体(小鼠IgG、抗人IL-6受体抗体和抗人IL-6受体抗体-人可溶型IL-6受体复合体)均吸附在蛋白A上。之后，用高速离心机进行旋转下降(spinned-down)，回收通过的溶液。由于通过的溶液中不含与蛋白A结合的抗人IL-6受体抗体-人可溶型IL-6受体复合体，所以通过测定通过的溶液中的可溶型IL-6受体浓度，可以测定非结合型的可溶型IL-6受体浓度。可溶型IL-6受体的浓度测定使用Quantikine人IL-6sR(R&D Systems)来进行。将WT和PF1给予小鼠，4小时后、8小时后、24小时后、48小时后、96小时后、168小时后的非结合型的可溶型IL-6受体浓度的测定按照附录说明书进行。
结果见图20。WT和PF1以10mg/kg静脉内单次给药的4小时后、直至8小时后，在WT和PF1两者中，非结合型的可溶型IL-6受体浓度均为10ng/mL以下，确认人可溶型IL-6受体被中和。但给予WT 24小时后非结合型的可溶型IL-6受体浓度为约500ng/mL，相对于此，给予PF1后非结合型的可溶型IL-6受体浓度为10ng/mL以下，由此可知：与WT相比，PF1能够持续中和人可溶型IL-6受体。
PF1是将通过亲和力成熟技术发现的RDC_23和药物动力学等得到改善的H53/L28组合而得到的，认为其在体内可以发挥长血浆中滞留性和高中和活性。实际上，与WT相比，PF1在产生人可溶型IL-6受体的人IL-6受体转基因小鼠中显示出的中和效果和血浆中浓度更持久。
PF1在高浓度制剂中的稳定性和免疫原性风险均优于WT(人源化PM-1抗体)，而且即使在人IL-6受体转基因小鼠中IL-6受体中和效果和血浆中滞留性也优异。由此认为：在药品开发中，PF1中适用的修饰极为有用。
[实施例7]提高IgG2和IgG4在酸性条件下的稳定性
IgG2、IgG4化人源化IL-6受体抗体表达载体的制作、表达
虽然人源化PM-1抗体(Cancer Res.1993 Feb 15；53(4)：851-6)的恒定区为IgG1同种型，但为了降低其与Fcγ受体的结合性，制作将恒定区取代成IgG2的分子(WT-IgG2，SEQ ID NO：109)和将恒定区取代成IgG4(Mol.Immunol.1993 Jan；30(1)：105-8)的分子(WT-IgG4，SEQID NO：110)。在IgG的表达中使用动物细胞表达用载体。构建将实施例1中使用的人源化PM-1抗体(IgG1)的恒定区部分用NheI/NotI进行消化、之后通过连接将恒定区取代成IgG2或IgG4的表达载体。使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，利用DNA序列分析仪(ABI PRISM 3730xL DNA序列分析仪或ABI PRISM3700DNA序列分析仪(Applied Biosystems))，按照附录说明书所述的方法确定各DNA片段的核苷酸序列。使用WT作为L链，WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4的表达按照实施例1所述的方法进行。
(1)人源化PM-1抗体(WT-IgG1)H链：SEQ ID NO：15(氨基酸序列)
(2)WT-IgG2H链：SEQ ID NO：109(氨基酸序列)
(3)WT-IgG4H链：SEQ ID NO：110(氨基酸序列)
通过盐酸洗脱从蛋白A中纯化WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4
向得到的培养上清中添加悬浮于TBS中的50μL rProteinASepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，在4℃下倒置混合4小时以上。将该溶液移至0.22μm滤杯Ultrafree(注册商标)-MC(Millipore)中，用500μL TBS清洗3次，之后将rProteinA SepharoseTM树脂悬浮于100μL的10mM HCl、150mM NaCl(pH 2.0)中，静置2分钟，之后洗脱抗体(盐酸洗脱法)。立即加入6.7μL的1.5M Tris-HCl(pH7.8)进行中和。洗脱2次，得到200μL的纯化抗体。
通过盐酸洗脱法纯化的WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4的凝胶过滤层 析分析
为了评价通过盐酸洗脱法得到的纯品的聚集物含量，进行凝胶过滤层析分析。
聚集物评价方法：
系统：Waters Alliance
柱：G3000SWxl(TOSOH)
流动相：50mM磷酸钠、300mM KCl、pH7.0
流速、波长：0.5mL/分钟、220nm
结果见图21。WT-IgG1纯化后的聚集物含量为约2％，相对于此，WT-IgG2和WT-IgG4纯化后的聚集物含量为约25％。由此认为：IgG1对盐酸洗脱时的酸稳定，而IgG2和IgG4对盐酸洗脱时的酸不稳定，发生变性、聚集化，由此可知：与IgG1相比，IgG2和IgG4在酸性条件下的稳定性低。在IgG分子的纯化中往往会使用蛋白A，而从蛋白A中洗脱IgG分子时则在酸性条件下进行。此外，开发IgG分子作为药品时必需将病毒灭活，该灭活通常在酸性条件下进行。由此可知：虽然希望IgG分子在酸性条件下的稳定性高，但IgG2和IgG4分子在酸性条件下的稳定性较IgG1差，首次明确了在开发IgG2和IgG4分子作为药品时存在酸性条件下的变性、聚集化的问题。认为在开发IgG2和IgG4分子作为药品时希望解决变性、聚集化的问题，但迄今为止通过氨基酸取代来解决此问题的方法未见报道。
WT-IgG2、WT-IgG4的CH3结构域修饰体的制作和评价
由于IgG2和IgG4分子在酸性条件下的稳定性较IgG1差，所以研究IgG2和IgG4分子在酸性条件下的稳定性得到改善的修饰体。根据IgG2和IgG4分子的恒定区模型，认为在酸性条件下不稳定的要因在于CH3结构域中CH3/CH3界面的不稳定性，进行了各种研究，结果认为：IgG2中EU编号第397位的甲硫氨酸、IgG4中EU编号第409位的精氨酸分别使IgG2和IgG4的CH3/CH3界面不稳定。因此，制作了将IgG2的EU编号第397位的甲硫氨酸变成缬氨酸的抗体(IgG2-M397V，SEQ ID NO：111(氨基酸序列))和将IgG4的EU编号第409位的精氨酸变成赖氨酸的抗体(IgG4-R409K，SEQ ID NO：112(氨基酸序列))。
目标抗体的表达载体的制作、表达、纯化采用上述盐酸洗脱法来进行。为了评价通过盐酸洗脱法由蛋白A得到的纯品的聚集物含量，进行凝胶过滤层析分析。
聚集物评价方法：
系统：Waters Alliance
柱：G3000SWxl(TOSOH)
流动相：50mM磷酸钠、300mM KCl、pH7.0
流速、波长：0.5mL/分钟、220nm
结果见图21。WT-IgG1纯化后的聚集物含量为约2％，而WT-IgG2和WT-IgG4纯化后的聚集物含量为约25％。相对于此，作为CH3结构域修饰体的IgG2-M397V和IgG4-R409K的聚集物含量为约2％，与IgG1在同等水平。研究表明：通过将IgG2的EU编号第397位的甲硫氨酸变成缬氨酸、或者通过将IgG4的EU编号第409位的精氨酸变成赖氨酸，可以提高IgG2抗体和IgG4抗体在酸性条件下的稳定性。另外，按照与实施例5相同的方法测定WT-IgG2、WT-IgG4、IgG2-M397V、IgG4-R409K的热变性中间温度，结果表明：与WT-IgG2和WT-IgG4相比，IgG2-M397V和IgG4-R409K中分别导入了修饰的CH3结构域的Tm值均高。由此可知：与WT-IgG2和WT-IgG4相比，IgG2-M397V和IgG4-R409K的热稳定性也均优异。
由于IgG2和IgG4在使用了蛋白A的纯化步骤和病毒灭活步骤中被暴露在酸性条件下，所以上述步骤中的变性、聚集化成了问题。但通过使用IgG2-M397V和IgG4-R409K作为IgG2和IgG4的恒定区序列，可以解决上述问题。可知上述修饰在开发IgG2和IgG4抗体作为药品时极为有用。从IgG2-M397V和IgG4-R409K的热稳定性也优异方面考虑，两者也是有用的。
[实施例8]改善来自IgG2的二硫键的异质性
通过乙酸洗脱从蛋白A中纯化WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4
向实施例7中得到的培养上清中添加50μL悬浮于TBS中的rProteinA SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，在4℃下倒置混合4小时以上。将该溶液移至0.22μm滤杯Ultrafree(注册商标)-MC(Millipore)中，用500μL TBS清洗3次，之后将rProtein ASepharoseTM树脂悬浮于100μL的50mM乙酸钠水溶液(pH3.3)中，静置2分钟，之后洗脱抗体。立即加入6.7μL的1.5M Tris-HCl(pH7.8)进行中和。洗脱2次，得到200μL的纯化抗体。
WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4的阳离子交换层析(IEC)分析
为了评价纯化的WT-IgG1、WT-IgG2、WT-IgG4的均匀性，通过阳离子交换层析进行分析。
IEC评价方法：
系统：Waters Alliance
柱：ProPac WCX-10(Dionex)
流动相A：25mM MES-NaOH、pH6.1
B：25mM MES-NaOH、250mM乙酸钠、pH6.1
流速、波长：0.5mL/分钟、280nm
梯度B：分析WT-IgG1时，50％-75％(75分钟)
B：分析WT-IgG2和WT-IgG4时，30％-55％(75分钟)
结果见图22。由结果可知：在离子交换分析中，WT-IgG1和WT-IgG4为单峰，而WT-IgG2存在多个峰，与IgG1和IgG4相比，IgG2分子的异质性多。实际上，有人报道了IgG2的同种型的来自铰链区二硫键的异质性(不均匀性)(非专利文献30)，认为图22所示的IgG2的杂峰也是来源于此的目标物质/相关物质。难以在维持目标物质/相关物质的异质性的制造间差的同时作为药品大量制造，希望开发作为药品的抗体分子尽可能是均匀(异质性少)的物质，因此，对于野生型IgG2而言，当开发抗体作为药品时，在重要的均匀性方面存在问题。实际上，US20060194280(A1)中报道了：天然型IgG2在离子交换层析分析中观察到了来自二硫键的各种杂峰，这些峰之间生物活性不同。作为将该杂峰单一化的方法，US20060194280(A1)中报道了在纯化步骤中进行重折叠的方法，但由于在制造中采用上述步骤会使成本增加且繁杂，所以优选通过氨基酸取代将杂峰单一化的方法。虽然认为在开发IgG2作为药品时，希望解决来自铰链区二硫键的异质性，但迄今为止通过氨基酸取代来解决此问题的方法未见报道。
WT-IgG2的CH1结构域、铰链区的修饰体的制作和评价
如图23所示，认为IgG2分子存在各种二硫键构象。作为来自IgG2铰链区的二硫键的异质性的原因，认为是二硫键的不一致和游离半胱氨酸的存在。IgG2在上铰链区存在2个半胱氨酸(EU编号第219位和第220位)，作为与该上铰链的2个半胱氨酸相邻的半胱氨酸，有存在于H链CH1结构域的EU编号第131位的半胱氨酸和L链C末端的半胱氨酸、以及二聚化的伙伴H链的相同上铰链的2个半胱氨酸。即，在IgG2的上铰链周边在H2L2缔合状态下总计有8个半胱氨酸相邻，由此认为存在由于二硫键的不一致和游离半胱氨酸产生的各种异质性。
为了降低来自IgG2铰链区的异质性，对IgG2的铰链区序列和CH1结构域进行了修饰。进行了用于避免IgG2中由于二硫键的不一致和游离半胱氨酸产生的异质性的研究。对各种修饰体进行研究的结果认为：通过将野生型IgG2恒定区序列中存在于H链CH1结构域的EU编号第131位的半胱氨酸和第133位的精氨酸分别修饰成丝氨酸和赖氨酸、并将存在于H链上铰链的EU编号第219位的半胱氨酸修饰成丝氨酸(以下记作IgG2-SKSC)(IgG2-SKSC，SEQ ID NO：120)，可以在不降低热稳定性的情况下避免异质性。认为通过上述修饰，IgG2-SKSC的H链和L链的共价键在EU编号第220位的半胱氨酸与L链C末端的半胱氨酸之间通过二硫键形成均匀的共价键(图24)。
IgG2-SKSC的表达载体的制作、表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。为了评价纯化的IgG2-SKSC和野生型IgG2(WT-IgG2)的均匀性，通过阳离子交换层析进行分析。
IEC评价方法：
系统：Waters Alliance
柱：ProPac WCX-10(Dionex)
流动相A：25mM MES-NaOH、pH5.6
B：25mM MES-NaOH、250mM乙酸钠、pH5.6
流速、波长：0.5mL/分钟、280nm
梯度B：50％-100％(75分钟)
结果见图25。如上所述，由结果可知：WT-IgG2存在多个峰，而IgG2-SKSC以单峰的形式洗脱。这表明：通过导入IgG2-SKSC的修饰使在EU编号第220位的半胱氨酸与L链C末端的半胱氨酸之间形成单一的二硫键，可以避免来自IgG2铰链区二硫键的异质性。按照与实施例5相同的方法测定WT-IgG1、WT-IgG2、IgG2-SKSC的热变性中间温度，结果：在WT-IgG2中观察到Tm值较WT-IgG1低的Fab结构域的峰，而在IgG2-SKSC中没有确认到这样的峰。由此可知：与WT-IgG2相比，IgG2-SKSC的热稳定性优异。
在开发抗体作为药品时，认为野生型IgG2在重要的均匀性方面存在问题，但已经明确：通过使用IgG2-SKSC作为IgG2的恒定区序列可以解决此问题，在开发IgG2作为药品时IgG2-SKSC非常有用。此外，从IgG2-SKSC的热稳定性也优异方面考虑，其也是有用的。
[实施例9]IgG分子的C末端异质性的改善
WT-IgG1的H链C末端ΔGK抗体的表达载体的构建
作为抗体C末端序列的异质性，有人报道了：由C末端氨基酸的赖氨酸残基的缺失和C末端的2个氨基酸—甘氨酸和赖氨酸的缺失引起的C末端氨基的酰胺化(非专利文献32)，在开发抗体作为药品时，希望不存在上述异质性。实际上，即使在作为人源化PM-1抗体的TOCILIZUMAB中，其主要成分也是存在于核苷酸序列上的C末端氨基酸的赖氨酸在翻译后通过修饰而缺失的序列，残留有赖氨酸的副成分也以异质性的形式存在。因此，为了降低C末端氨基酸的异质性，对C末端氨基酸进行修饰。具体而言，通过预先使野生型IgG1的H链恒定区C末端的赖氨酸和甘氨酸从核苷酸序列上缺失，来研究是否可以抑制由C末端的2个氨基酸—甘氨酸和赖氨酸的缺失引起的C末端氨基的酰胺化。
使用实施例1中得到的人源化PM-1抗体(WT)的pB-CH载体，向H链C末端序列中导入突变。使用QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)，按照附录说明书中所述的方法，向编码EU编号第447位的Lys和/或EU编号第446位的Gly的核苷酸序列中导入突变，使其成为终止密码子。由此制作C末端的1个氨基酸—赖氨酸(EU编号第447位)预先缺失的抗体和C末端的2个氨基酸—甘氨酸和赖氨酸(分别为EU编号第446位和第447位)预先缺失的抗体的表达载体。通过表达人源化PM1抗体的L链，得到了H链C末端ΔK抗体和H链C末端ΔGK抗体。抗体的表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。
纯化的H链C末端ΔGK抗体的阳离子交换层析分析如下进行。使用纯化的H链C末端ΔGK抗体，按照下述方法通过阳离子交换层析进行分析，评价C末端缺失对异质性的影响。阳离子交换层析分析条件如下，比较人源化PM1抗体、H链C末端ΔK抗体、H链C末端ΔGK抗体的层析图。
柱：ProPac WCX-10、4×250mm(Dionex)
流动相A：25mmol/L MES/NaOH、pH6.1
B：25mmol/L MES/NaOH、250mmol/L NaCl、pH6.1
流速：0.5mL/分钟
梯度：25％B(5分钟)→(105分钟)→67％B→(1分钟)→100％B(5分钟)
检测：280nm
未修饰的人源化PM-1抗体、H链C末端ΔK抗体、H链C末端ΔGK抗体的分析结果见图26。根据非专利文献30，保留时间较主峰延迟的基峰中包含H链C末端第449位的Lys残留体和第447位的Pro酰胺体，在H链C末端ΔK抗体中没有确认到基峰的大幅减少，但在H链C末端ΔGK抗体中确认到了基峰的大幅减少，由此可知：通过使H链C末端的2个氨基酸缺失，首次可以降低H链C末端异质性。
为了评价H链C末端的2个残基的缺失对热稳定性的影响，通过DSC测定H链C末端ΔGK抗体的热变性温度。作为DSC测定用，通过用含150mM NaCl的20mM乙酸缓冲液(pH6.0)进行透析来置换缓冲液。将人源化PM-1抗体、H链C末端ΔGK抗体和参比溶液(透析外液)充分脱气，之后将上述溶液分别封入量热计盒中，在40℃下充分进行热平衡。接下来，以约1K/分钟的扫描速度在40℃～100℃范围内进行DSC扫描。参考非专利文献(Rodolfo等人，ImmunologyLetters，1999，第47-52页)，对所得变性峰进行峰指定时，确认C末端缺失对CH3结构域的热变性温度没有影响。
由此，通过预先使H链恒定区的C末端的赖氨酸和甘氨酸从核苷酸序列上缺失，可以在不影响抗体热稳定性的同时降低C末端氨基酸的异质性。由于在人抗体恒定区IgG1、IgG2、IgG4中C末端序列的EU编号第447位均为Lys、EU编号第446位均为Gly，所以认为在本实施例中等发现的降低C末端氨基酸异质性的方法也可适用于IgG2恒定区和IgG4恒定区、或它们的修饰体。
[实施例10]新型最优化恒定区M14ΔGK序列的制作
在以中和抗原为目的的抗体药物中，不需要Fc区所具有的ADCC等效应子功能，所以不必与Fcγ受体结合。从免疫原性和副作用的角度考虑，认为并不优选与Fcγ受体的结合(非专利文献24、25)。作为人源化抗IL-6受体IgG1抗体的TOCILIZUMAB与IL-6受体进行特异性结合，通过中和其生物学作用，可以用作类风湿性关节炎等与IL-6有关的疾病的治疗药，不必与Fcγ受体结合。
Fcγ受体非结合的最优化恒定区M14ΔGK的制作和评价
作为降低与Fcγ受体结合的方法，认为有将IgG抗体的同种型由IgG1变为IgG2或IgG4同种型的方法(Ann.Hematol.1998 Jun；76(6)：231-48)。作为完全消除与Fcγ受体结合的方法，有人报道了：向Fc区中导入人工修饰的方法。例如，由于抗CD3抗体和抗CD4抗体的效应子功能会引起副作用，所以向Fc区的Fcγ受体结合部分导入野生型序列中不存在的氨基酸突变(非专利文献26、27)，所得的Fcγ受体非结合型的抗CD3抗体和抗CD4抗体的临床试验正在进行中(非专利文献24、28)。有报道称：通过将IgG1的FcγR结合位点(EU编号第233、234、235、236、327、330、331位)转换成IgG2(EU编号第233、234、235、236位)和IgG4(EU编号第327、330、331位)的序列，可以制作Fcγ受体非结合型抗体(专利文献6)。但若将上述所有突变导入IgG1中，则出现能够形成天然不存在的T细胞表位肽的9个氨基酸的新型肽序列，免疫原性风险会升高。在开发抗体作为药品时，希望免疫原性风险极低。
为了解决上述课题，研究了IgG2恒定区的修饰。在IgG2恒定区的FcγR结合位点中，EU编号第233、234、235、236位是非结合型，而FcγR结合位点中EU编号第327、330、331位是不同于非结合型IgG4的序列，所以必需将EU编号第327、330、331位的氨基酸变成IgG4的序列(Eur.J.Immunol.1999 Aug；29(8)：2613-24中的G2Δa)。但IgG4中EU编号第339位的氨基酸是丙氨酸，而IgG2中是苏氨酸，所以只将EU编号第327、330、331位的氨基酸变成IgG4的序列，就可出现能够形成天然不存在的T细胞表位肽的9个氨基酸的新型肽序列，导致免疫原性风险升高，因此不优选。所以本发明人发现：除上述修饰外，还将IgG2的EU编号第339位的苏氨酸取代成丙氨酸，从而可以防止新的肽序列的出现。
除了导入上述突变外，还导入了下述突变：实施例7中发现的提高IgG2在酸性条件下的稳定性的、IgG2中EU编号第397位的甲硫氨酸取代成缬氨酸的突变；实施例8中发现的改善来自铰链区二硫键的异质性的、EU编号第131位的半胱氨酸取代成丝氨酸的突变、EU编号第133位的精氨酸取代成赖氨酸的突变、以及EU编号第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸的突变。并且，随着第131位和第133位的突变的导入，出现能够形成天然不存在的T细胞表位肽的9个氨基酸的新型肽序列，出现免疫原性风险，所以通过导入EU编号第137位的谷氨酸取代成甘氨酸的突变、第138位的丝氨酸取代成甘氨酸的突变，使第131位～第139位附近的肽序列与天然存在的人序列相同。并且，为了降低来自C末端的异质性，使H链C末端EU编号第446、447位的甘氨酸和赖氨酸缺失。将导入有上述所有突变的恒定区序列作为M14ΔGK(M14ΔGK，SEQ ID NO：24)。虽然M14ΔGK中存在1处由第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸的突变作为能够形成T细胞表位肽的9个氨基酸的新的肽序列，但由于半胱氨酸和丝氨酸作为氨基酸序列的性质近似，所以认为免疫原性的风险极小。利用TEPITOPE进行的免疫原性预测中，也没有确认到免疫原性的变化。
按照实施例1所述的方法制作具有WT作为可变区序列、具有M14ΔGK作为恒定区序列的抗体H链序列(M14ΔGK，SEQ ID NO：24；WT-M14ΔGK，SEQ ID NO：113)的表达载体，使用WT-M14ΔGK作为H链、使用WT作为L链，按照实施例1所述的方法进行表达、纯化。
按照相同的方法制作WT-M17ΔGK(M17ΔGK，SEQ ID NO：116；WT-M17ΔGK，SEQ ID NO：115)，在所述WT-M17ΔGK中，向IgG1恒定区的EU编号第233、234、235、236、327、330、331、339位中导入突变(Eur.J.Immunol.1999 Aug；29(8)：2613-24中的G1Δab)，以降低与Fcγ受体的结合，并且使EU编号第446位和第447位的氨基酸缺失，以降低C末端的异质性(实施例9)。制作WT-M11ΔGK(M11ΔGK，SEQ ID NO：25；WT-M11ΔGK，SEQ ID NO：114)的表达载体，在所述WT-M11ΔGK中，向IgG4恒定区的EU编号第233、234、235、236位中导入突变，以降低与Fcγ受体的结合(Eur.J.Immunol.1999Aug；29(8)：2613-24中的G4Δb；在该修饰中，由于产生新的非人序列，所以免疫原性风险提高)；为了降低免疫原性风险，除上述修饰外，还向EU编号第131、133、137、138、214、217、219、220、221、222位中导入突变，使铰链区二硫键的构象与M14ΔGK的相同；并且，向EU编号第409位中导入突变，以提高在酸性条件下的稳定性(实施例7)；使EU编号第446位和第447位的氨基酸缺失，以降低C末端异质性(实施例9)。使用WT-M17ΔGK或WT-M11ΔGK作为H链、使用WT作为L链，按照实施例1所述的方法进行表达、纯化。
WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK的Fcγ受体结合性的评 价
与FcγRI结合的评价如下进行。使用Biacore T100，使固定在传感器芯片上的来源于人的Fcγ受体I(以下记作FcγRI)与用作分析物的IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M1ΔGK 7进行相互作用，比较其结合量。来源于人的FcγRI使用重组人FcRIA/CD64(R&DSystems)，使用IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK作为样品进行测定。利用胺耦合法将FcγRI固定在传感器芯片CM5(BIACORE)上。hFcγRI的最终固定量为约13000RU(resonance units，共振单位)。运行缓冲液使用HBS-EP+，流速为20μL/分钟。将样品用HBS-EP+调整成100μg/mL的浓度。分析包括下述两个步骤：首先是2分钟的结合相，注入10μL抗体溶液，之后是4分钟的解离相，注入液切换成HBS-EP+。解离相结束后，注入20μL的5mM氢氧化钠，由此使传感器芯片再生。以此结合、解离、再生作为1个分析周期，注入各种抗体溶液，得到传感图。依次注入作为分析物的IgG4、IgG2、IgG1、M11、M14、M17，重复操作2次。测定的结合量数据的比较结果见图27。其结果，结合量按IgG1＞IgG4＞＞IgG2＝M11ΔGK＝M14ΔGK＝M17ΔGK的顺序递减，由此可知：与野生型IgG1、IgG4相比，野生型IgG2、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK与FcγRI的结合弱。
与FcγRIIa结合的评价如下进行。使用Biacore T100，使固定在传感器芯片上的来源于人的Fcγ受体IIa(以下记作FcγRIIa)与用作分析物的IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK发生相互作用，之后比较其结合量。来源于人的FcγRIIa使用重组人FcRIIA/CD32a(R&D Systems)，使用IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK作为样品进行测定。利用胺耦合法将FcγRIIa固定在传感器芯片CM5(BIACORE)上。FcγRIIa的最终固定量为约3300RU。运行缓冲液使用HBS-EP+，流速为20μL/分钟。之后，注入运行缓冲液直至基线稳定，基线稳定后开始测定。使作为分析物的各IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG4)和导入有突变的抗体(M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK)与固定的FcγRIIa发生相互作用，观察其结合量。运行缓冲液使用HBS-EP+，流速为20μL/分钟，测定温度为25℃。将各IgG和修饰体调整成100μg/mL，注入20μL分析物，使其与固定的FcγRIIa发生相互作用。进行相互作用后，注入200μL运行缓冲液，从而使分析物自FcγRIIa上解离，使传感器芯片再生。依次注入分析物IgG4、IgG2、IgG1、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK，重复操作2次。测定的结合量数据的比较结果见图28。其结果，结合量按IgG1＞IgG2＝IgG4＞M11ΔGK＝M14ΔGK＝M17ΔGK的顺序递减，由此可知：与野生型IgG1、IgG2、IgG4相比，M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK与FcγRIIa的结合弱。
与FcγRIIb结合的评价如下进行。使用Biacore T100，使固定在传感器芯片上的、来源于人的Fcγ受体IIb(以下记作FcγRIIb)与用作分析物的IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK发生相互作用，比较其结合量。来源于人的FcγRIIb使用重组人FcRIIB/C(R&D Systems)，使用IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK作为样品进行测定。通过胺耦合法将FcγRIIb固定在传感器芯片CM5(BIACORE)上，FcγRIIb的最终固定量为约4300RU。之后，注入运行缓冲液直至基线稳定，基线稳定后开始测定。使作为分析物的各IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG4)和导入有突变的抗体(M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK)与固定的FcγRIIb发生相互作用，观察其结合量。运行缓冲液使用HBS-EP+(10mM HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v Surfactant P20)，流速为20μL/分钟，测定温度为25℃。将各IgG及其修饰体调整成200μg/mL，注入20μL分析物，使其与固定的FcγRIIb发生相互作用。发生相互作用后，注入200μL运行缓冲液，使分析物自FcγRIIb上解离，使传感器芯片再生。依次注入分析物IgG4、IgG2、IgG1、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK，重复操作2次。测定的结合量数据的比较结果见图29。其结果，结合量按IgG4＞IgG1＞IgG2＞M11ΔGK＝M14ΔGK＝M17ΔGK的顺序递减，由此可知：与野生型IgG1、IgG2、IgG4相比，M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK与FcγRIIb的结合弱。
与FcγRIIIa结合的评价如下进行。使用Biacore T100，使固定在传感器芯片上的、来源于人的Fcγ受体IIIa(以下记作FcγRIIIa)与用作分析物的IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK发生相互作用，比较其结合量。来源于人的FcγRIIIa使用hFcγRIIIaV-His6(重组hFcγRIIIaV-His6：社内制品)，使用IgG1、IgG2、IgG4、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK作为样品进行测定。通过胺耦合法将FcγRIIIa固定在传感器芯片CM5(BIACORE)上，hFcγRIIIaV-His6的最终固定量为约8200RU(resonance units，共振单位)。运行缓冲液使用HBS-EP+，流速为5μL/分钟。将样品用HBS-EP+调整成250μg/mL的浓度。分析包括下述2个步骤：首先是2分钟的结合相，注入10μL抗体溶液，之后是4分钟的解离相，注入液切换成HBS-EP+。解离相结束后，注入20μL的5mM盐酸，从而使传感器芯片再生。将该结合、解离、再生作为1个分析周期，注入各种抗体溶液，得到传感图。依次注入作为分析物的IgG4、IgG2、IgG1、M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK。测定的结合量数据的比较结果见图30。其结果，结合量按IgG1＞＞IgG4＞IgG2＞M17ΔGK＞M11ΔGK＝M14ΔGK的顺序递减，这表明：与野生型IgG1、IgG2、IgG4相比，M11ΔGK、M14ΔGK、M17ΔGK与FcγRIIIa的结合弱。此外，与Eur.J.Immunol.1999 Aug；29(8)：2613-24中报道的、包含G1Δab突变的M17ΔGK相比，可知M11ΔGK、M14ΔGK与FcγRIIIa的结合更弱。
由上述结果确认：与野生型IgG1相比，WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK与各种Fcγ受体的结合明显降低。通过使用WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK作为恒定区，可以避免由于Fcγ受体介导的内化到APC中的免疫原性风险和由于ADCC等效应子功能引起的副作用，所以WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK作为以中和抗原为目的的抗体药物的恒定区序列是有用的。
WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK的高浓度稳定性试验
评价WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK在高浓度制剂中的稳定性。将WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK的纯化抗体用20mM组氨酰氯、150mM NaCl、pH6.5的溶液进行透析(EasySEP，TOMY)，之后用超滤膜进行浓缩，进行高浓度稳定性试验。试验条件如下。
抗体：WT-IgG1、WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK
缓冲液：20mM组氨酰氯、150mM NaCl、pH6.5
浓度：61mg/mL
保存温度和保存时间：40℃下2周、40℃下1个月、40℃下2个月
聚集物评价方法：
系统：Waters Alliance
柱：G3000SWxl(TOSOH)
流动相：50mM磷酸钠、300mM KCl、pH7.0
流速、波长：0.5mL/分钟、220nm
将样品稀释100倍后进行分析
利用上述凝胶过滤层析法评价原始制剂(刚制成的制剂)和在各种条件下保存后的制剂的聚集物含量，原始制剂中聚集物含量的变化量见图31。其结果，与WT-IgG1相比，WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK的聚集物增加量低，为WT中聚集物增加量的约1/2。如图32所示，就Fab片段的增加量而言，WT-IgG1和WT-M17ΔGK程度相同，但WT-M14ΔGK和WT-M11ΔGK中Fab片段的增加量为WT中的Fab片段增加量的约1/4。作为IgG型抗体制剂的变性途径(degeneration pathway)，如WO 2003/039485所述，主要是聚集物的生成和Fab分解物的生成。研究发现：与WT-IgG1相比，WT-M14ΔGK和WT-M11ΔGK在聚集物的生成及Fab片段的生成这两个方面制剂的稳定性均优异。由此认为：即使是在IgG1恒定区的稳定性不充分、无法制成可以开发作为药品的高浓度溶液制剂的抗体，通过使用WT-M14ΔGK、WT-M17ΔGK、WT-M11ΔGK作为恒定区，也可以制作具有更高稳定性的高浓度溶液制剂。
特别是M14ΔGK，认为其作为新的恒定区序列极为有用，所述新的恒定区序列使原始IgG2分子所具有的酸性条件下的不稳定性提高、改善了来自铰链区二硫键的异质性、不与Fcγ受体结合、将能够形成T细胞表位肽的9个氨基酸的新的肽序列抑制在最低限度、并且在高浓度制剂中的稳定性优于IgG1。
[实施例11]PF1-M14ΔGK抗体的制作
使用XhoI/NheI切出实施例5中制作的PF1(恒定区为IgG1)的可变区部分，使用NheI/NotI切出实施例7中制作的M14ΔGK(可变区为WT)的恒定区部分，将2个H链抗体基因片段插入动物细胞表达用载体中，制作目标PF1-M14ΔGK的H链表达载体(PF1_H-M14ΔGK，SEQID NO：117)。L链使用PF1_L，按照实施例1所述的方法进行PF1-M14ΔGK抗体的表达、纯化。
PF1-M14ΔGK抗体作为抗IL-6受体抗体药物在各方面都优于WT(人源化PM-1抗体)，认为其极为有用。
[实施例12]M31ΔGK的制作和评价
将实施例10中制作的M14ΔGK的EU编号第330、331、339位的氨基酸变成IgG2的序列，制作M31ΔGK(M31ΔGK，SEQ ID NO：118)。按照实施例1所述的方法制作具有WT作为可变区序列、具有M31ΔGK作为恒定区序列的抗体H链序列(WT-M31ΔGK，SEQ ID NO：119)的表达载体，使用WT-M31ΔGK作为H链、使用WT作为L链，按照实施例1所述的方法表达、纯化WT-M31。
除WT-M31外，同时表达、纯化的WT-IgG2和WT-M14ΔGK的阳离子交换层析分析如下进行。阳离子交换层析分析条件如下，比较WT-IgG2、WT-M14ΔGK、WT-M31ΔGK的层析图。
柱：ProPac WCX-10、4×250mm(Dionex)
流动相A：25mmol/L MES/NaOH、pH6.1
B：25mmol/L MES/NaOH、250mmol/L NaCl、pH6.1
流速：0.5mL/分钟
梯度：0％B(5分钟)→(65分钟)→100％B→(1分钟)
检测：280nm
WT-IgG2、WT-M14ΔGK、WT-M31ΔGK的分析结果见图33。由结果可知：WT-IgG2存在多个峰，但WT-M31ΔGK和WT-M14ΔGK一样以单峰的形式洗脱。这表明：即使在WT-M31ΔGK中也可以避免来自IgG2的铰链区二硫键的异质性。
[实施例13]完全人源化抗体F2H/L39-IgG1的制作
PF1抗体的构架序列的完全人源化
在实施例5制作的PF1_H中，仅第71位(Kabat编号；Kabat EA等人.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest(目标免疫蛋白序列).NIH)的精氨酸是原样残留的小鼠序列，所以从免疫原性的角度考虑并不优选。通常H链的第71位残基是决定HCDR2结构的重要序列，有报道称：实际上在制作人源化PM1抗体时，第71位的残基对小鼠PM1抗体的结合活性是重要的，已经明确：若将第71位由精氨酸取代成缬氨酸，则结合活性大幅下降(Cancer Research 53，851-856，1993)。同样，PF1_H被分类为人生殖系列基因的VH4家族，VH4家族中的第71位高度保存缬氨酸。确认到：若将第71位的精氨酸取代成缬氨酸，则中和活性大幅下降。
因此，为了保留第71位的精氨酸残基不变而完全除去小鼠序列，本发明人等研究了人生殖系列基因和所报道的人抗体序列，探索了第71位为精氨酸、且保有对维持抗体的立体结构重要的残基的序列。结果发现了一个候选序列，虽然该候选序列与表9所示的PF1_H的同源性低，但却保存有重要的残基。
[表9]
Figure GPA00001143028201321
通过将PF1_H-IgG1的Kabat编号第66位～第94位取代成上述候选序列，设计了H96-IgG1(SEQ ID NO：134氨基酸序列)。通过组合有合成寡DNA的PCR法(装配PCR)，制作抗体可变区。通过PCR法由IgG1的表达载体扩增恒定区。利用装配PCR法使抗体可变区与恒定区结合，之后插入动物细胞表达用载体中。H96/PF1L-IgG1的表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。
构架完全人源化抗体H96/PF1L-IgG1的评价
使用纯化的H96/PF1L-IgG1，按照实施例5所述的方法测定Tm值。亲和性的测定原则上是按照与实施例5相同的条件进行。其中，将SR344的浓度调整成0、0.36、1.4μg/mL，且测定解离相15分钟。其结果，H96/PF1L-IgG1显示出与PF1-IgG1几乎同等的Tm值和亲和性(表10)。
[表10]
  Tm(℃)   ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD(M)
  PF1抗体   91.3   1.4E+06   4.2E-05   3.1E-11
  H96/PF1L-IgG1   89.8   1.2E+06   4.8E-05   3.9E-11
如上所述，通过将PF1抗体的H链作为H96，在维持Tm值和亲和性不变的同时将PF1抗体中残留的小鼠序列完全除去，得到将PF1抗体构架完全人源化的抗体。由于H96/PF1L-IgG1的构架序列中不存在来源于小鼠的序列，所以从免疫原性的角度考虑，认为H96/PF1L-IgG1特别优异。
pI降低和免疫原性风险降低的F2H/L39-IgG1的制作
如实施例4所示，已经明确：通过修饰抗体可变区的氨基酸、降低pI，可以提高药物动力学。因此，向上述制作的H96-IgG1中进一步导入下述氨基酸取代。为了降低pI，将第64位的赖氨酸取代成谷氨酰胺、将第65位的甘氨酸取代成天冬氨酸。另外，为了降低免疫原性风险，将第105位的谷氨酸取代成谷氨酰胺、将第107位的苏氨酸取代成异亮氨酸。并且，作为实施例2中得到的增强亲和性的修饰，将第95位的缬氨酸取代成亮氨酸、将第99位的异亮氨酸取代成丙氨酸。按照实施例1所述的方法，向H96-IgG1中导入上述氨基酸取代，制作F2H-IgG1(SEQ ID NO：135(氨基酸序列))。
向PF1L中导入下述氨基酸取代。为了降低pI，将第27位的谷氨酰胺取代成谷氨酸、将第55位的亮氨酸取代成谷氨酸。按照实施例1所述的方法，向PF1L中导入上述氨基酸取代，制作L39(SEQ ID NO：136(氨基酸序列))。利用实施例1所述的方法进行F2H/L39-IgG1的表达、纯化。
利用Biacore分析F2H/L39-IgG1与人IL-6受体的亲和性
测定人源化PM1抗体(野生型、WT)、PF1抗体(实施例5中制作)和F2H/L39-IgG1的亲和性。本测定原则上是按照与实施例4相同的条件进行。其中，将SR344的浓度调整成0、0.36、1.4μg/mL，且测定解离相15分钟(表11)。
[表11]
Figure GPA00001143028201341
结果表明：F2H/L39-IgG1的KD值维持在10-11数量级，具有极强的亲和性，但是与PF1-IgG1相比，其ka值下降至约1/2。
F2H/L39-IgG1的人IL-6受体中和活性的评价
按照实施例1所示的方法，评价人源化PM1抗体(野生型、WT)和F2H/L39-IgG1的中和活性。其中，使人白介素-6(TORAY)的浓度达到600ng/mL，再进行中和活性的评价。如图34所示，可知：与WT相比，F2H/L39-IgG1在100％抑制浓度下保持100倍以上的极强的活性。
通过等电点电泳评价F2H/L39-IgG1的等电点
按照实施例3所述的方法测定F2H/L39-IgG1的等电点。F2H/L39-IgG1的等电点为5.5，与实施例5制作的PF1抗体相比，通过进一步降低等电点，使药物动力学进一步得到改善。
利用GENETYX(GENETYX CORPORATION)计算该F2H/L39可变区(VH、VL序列)的理论等电点时，其理论等电点为4.3。而WT的理论等电点为9.20，所以通过对WT进行氨基酸取代，得到了可变区的理论等电点下降约4.9的F2H/L39。
利用食蟹猴进行F2H/L39-IgG1的PK/PD试验
评价人源化PM1抗体(野生型、WT)、PF1抗体和F2H/L39-IgG1在食蟹猴体内的药物动力学(PK)和药效(PD)。将WT、PF1和F2H/L39-IgG1以1.0mg/kg进行皮下给药，于给药前和给药后随时间而采血。按照与实施例6相同的方式测定各抗体的血浆中浓度。WT、PF1和F2H/L39-IgG1的血浆中浓度变化见图35。为了评价各抗体中和膜型食蟹猴IL-6受体的药效，于抗体给药后第3天～第10天将食蟹猴IL-6以5μg/kg在腰背部连日进行皮下给药，测定24小时后各个体的CRP浓度。WT和F2H/L39给药后的CRP浓度变化见图36。为了评价各抗体中和可溶型食蟹猴IL-6受体的药效，测定食蟹猴血浆中非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体浓度。WT和F2H/L39给药后非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体的浓度变化见图37。
由上述结果可知：WT和PF1的血浆中浓度变化几乎相同，与这两种抗体相比，pI进一步降低的F2H/L39-IgG1抗体的血浆中浓度维持在高水平。另外发现：与WT相比，与IL-6受体亲和性强的F2H/L39-IgG1的CRP浓度和非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体浓度均维持在更低的水平。
[实施例14]WT-M14的血浆中滞留性的评价
人体内的血浆中滞留性的预测方法
IgG分子的血浆中滞留性长(消除慢)，这是由于作为IgG分子的补救受体而已知的FcRn在起作用(Nat.Rev.Immunol.2007 Sep；7(9)：715-25)。通过胞饮作用进入核内体中的IgG分子，其在核内体内的酸性条件下(pH6.0附近)与在核内体内表达的FcRn结合。无法与FcRn结合的IgG分子进入溶酶体内，被溶酶体分解，但与FcRn结合的IgG分子向细胞表面移动，在血浆中的中性条件下(pH7.4附近)自FcRn上解离，又返回到血浆中。
作为IgG型抗体，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同种型，有报道称，上述同种型在人体内的血浆中半衰期分别为：IgG1、IgG2的半衰期为约36天；IgG3的半衰期为约29天；IgG4的半衰期为16天(Nat.Biotechnol.2007 Dec；25(12)：1369-72)，认为IgG1和IgG2的血浆中滞留性最长。通常，抗体药物的同种型为IgG1、IgG2、IgG4，作为进一步提高上述IgG抗体的药物动力学的方法，有人报道了：通过修饰IgG恒定区的序列来提高上述的与人FcRn的结合性的方法(J.Biol.Chem.2007 Jan 19；282(3)：1709-17；J.Immunol.2006 Jan 1；176(1)：346-56)。
由于小鼠FcRn与人FcRn之间存在种特异性差异(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006 Dec 5；103(49)：18709-14)，所以为了预测恒定区序列已被修饰的IgG抗体在人体内的血浆中滞留性，认为希望评价与人FcRn的结合以及在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性(Int.Immunol.2006 Dec；18(12)：1759-69)。
与人FcRn结合的评价
FcRn是FcRn与β2-微球蛋白的复合体。根据公开的人FcRn基因序列(J.Exp.Med.(1994)180(6)，2377-2381)制作寡DNA引物。以人cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA，Clontech)为模板，使用制作的引物，通过PCR法调整编码全长基因的DNA片段。以得到的DNA片段为模板，通过PCR法扩增编码包含信号区的胞外区(Met1-Leu290)的DNA片段，之后将其插入动物细胞表达载体中(人FcRn氨基酸序列、SEQ ID NO：140)。同样，根据公开的人β2-微球蛋白基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99(26)，16899-16903(2002))制作寡DNA引物。以人cDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA，CLONTECH)为模板，使用制作的引物，利用PCR法制备编码全长基因的DNA片段。以所得的DNA片段为模板，通过PCR法扩增编码包含信号区的全长β2-微球蛋白(Met1-Met119)的DNA片段，之后将其插入动物细胞表达载体中(人β2-微球蛋白氨基酸序列、SEQ ID NO：141)。
可溶型人FcRn的表达按照下述程序进行。采用使用了10％胎牛血清(Invitrogen)的脂质转染法，将制备的人FcRn和人β2-微球蛋白的质粒导入来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)细胞中。回收所得的培养上清，之后使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(AmershamBiosciences)，按照(J.Immunol.2002 Nov 1；169(9)：5171-80)的方法进行纯化。之后，使用HiTrap Q HP(GE Healthcare)进行纯化。
评价与人FcRn的结合时使用Biacore 3000，使作为分析物的人FcRn与抗体相互作用，所述抗体与固定在传感器芯片上的蛋白L或兔抗人IgGk链抗体结合。由相互作用时的人FcRn的结合量算出亲和性(KD)。具体而言，使用含有150mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)作为运行缓冲液，利用胺耦合法将蛋白L或兔抗人IgGk链抗体固定在传感器芯片CM5(BIACORE)上。之后，用含有0.02％Tween20的运行缓中液稀释抗体并注入，使抗体与芯片结合，之后注入人FcRn，评价人FcRn与抗体的结合性[0]。
计算亲和性时使用BIA评估软件。由得到的传感图求出在人FcRn注入即将结束前与抗体结合的hFcRn的量，通过稳态亲和法进行拟合，算出抗体与人FcRn的亲和性。
人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性的评价
人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276+/+小鼠；Jackson Laboratories)的体内动力学的评价如下进行。将抗体以1mg/kg的给药量对小鼠进行静脉内单次给药，在适当的时间点采血。采集的血液立即在4℃下以15,000rpm的转速离心15分钟，得到血浆。分离的血浆在实施测定前一直保存在被设定为-20℃以下的冷库中。血浆中浓度按照ELISA法来测定。
WT-M14在人体内的血浆中滞留性的预测评价
利用BIAcore评价WT-IgG1和WT-M14与人FcRn的结合性，结果如表12所示，与WT-IgG1相比，WT-M14的结合性略强。
[表12]
          KD(μM)
WT-IgG1   2.07
WT-M14    1.85
但是，对WT-IgG1和WT-M14在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性进行了评价，其结果如图38所示，WT-IgG1和WT-M14显示出同等的血浆中滞留性，由此认为：即使在人体内M14恒定区也显示出与IgG1恒定区同等的血浆中滞留性。
[实施例15]药物动力学得到提高的WT-M44、WT-M58、WT-M73的制作
WT-M58分子的制作
如实施例14所示，WT-M14在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性与WT-IgG1同等。作为提高药物动力学的方法，已知有降低抗体等电点的方法和增强FcRn结合性的方法，但为了提高WT-M14的药物动力学，导入下述的修饰。具体而言，将实施例4中由WT-M14制作的WT-M31ΔGK的EU编号第397位的缬氨酸取代成甲硫氨酸、将第268位的组氨酸取代成谷氨酰胺、将第355位的精氨酸取代成谷氨酰胺、将第419位的谷氨酰胺取代成谷氨酸。将上述4处修饰导入WT-M31ΔGK中，制作WT-M58(SEQ ID NO：142(氨基酸序列))。表达载体的制作按照实施例1所述的方法进行。使用WT-M58作为H链、使用L(WT)作为L链。WT-M58的表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。
WT-M73分子的制作
另一方面，将IgG1的EU编号第434位的氨基酸取代成丙氨酸来制作WT-M44(SEQ ID NO：143(氨基酸序列))。再使M44的第446位的甘氨酸和第447位的赖氨酸缺失，以降低H链C末端的异质性，来制作WT-M83(SEQ ID NO：185(氨基酸序列))。将WT-M58的EU编号第434位的氨基酸取代成丙氨酸来制作WT-M73(SEQ ID NO：144(氨基酸序列))。
上述抗体的表达载体的制作按照实施例1的方法进行，使用WT-M44、WT-M58或WT-M73作为H链，使用L(WT)作为L链。WT-M44、WT-M58和WT-M73的表达、纯化按照实施例1所述的方法进行。
WT-M44、WT-M58、WT-M73在人体内的血浆中滞留性的预测评价
使用BIAcore评价WT-IgG1、WT-M44、WT-M58和WT-M73与人FcRn的结合性，结果如表13所示，WT-M44、WT-M58和WT-M73的结合性均较WT-IgG1优异，分别为WT-IgG1的约2.7倍、约1.4倍和约3.8倍左右。
[表13]
          KD(μM)
WT-IgG1   1.62
WT-M44    0.59
WT-M58    1.17
WT-M73    0.42
对WT-IgG1、WT-M44和WT-M58在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性进行了评价，其结果如图39所示，确认到：与WT-IgG1和WT-M44相比，WT-M58的药物动力学有所提高。并且，对WT-IgG1、WT-M44、WT-M58和WT-M73在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性进行了评价，其结果如图40所示，确认到：与WT-IgG1相比，WT-M44、WT-M58和WT-M73的药物动力学均有所改善，其药物动力学的改善效果与人FcRn结合能力相关。其中，与WT-IgG1相比，WT-M73在28天后的血浆中浓度改善约16倍，由此认为：即使在人体内，与具有IgG1恒定区的抗体相比，具有M73恒定区的抗体的药物动力学也大幅提高。
[实施例16]新的恒定区M14和M58降低各种抗体的异质性的效果
如实施例8所示，确认到：在作为抗IL-6受体抗体的人源化PM1抗体(WT)中，通过将恒定区由IgG2变成M14，可以降低来自IgG2的铰链区的异质性。因此，研究对于除人源化PM1抗体以外的IgG2型抗体，也进行了下述的研究：即通过将恒定区变成M14或M58，来研究其能否降低异质性。
作为除人源化PM1抗体以外的抗体，使用了作为抗IL-6受体抗体的F2H/L39(F2H/L39_VH氨基酸序列，SEQ ID NO：145；F2H/L39VL氨基酸序列，SEQ ID NO：146)、作为抗IL-31受体抗体的H0L0(H0L0_VH氨基酸序列，SEQ ID NO：147；H0L0_VL氨基酸序列，SEQID NO：148)、作为抗RANKL抗体的DNS(DNS_VH氨基酸序列，SEQID NO：149；DNS_VL氨基酸序列，SEQ ID NO：150)。对于各抗体，制作恒定区为IgG1(SEQ ID NO：19)、IgG2(SEQ ID NO：20)和M14(SEQ ID NO：24)或M58(SEQ ID NO：151)的抗体。
作为异质性的评价方法，通过阳离子交换层析进行评价。评价制作的抗体的异质性时，柱使用ProPac WCX-10(Dionex)，流动相A使用20mM乙酸钠(pH5.0)，流动相B使用20mM乙酸钠/1M NaCl(pH5.0)，采用适当的流速和梯度进行评价。通过阳离子交换层析(IEC)进行评价的结果见图41。
如图41所示，确认到：不仅在作为抗IL-6受体抗体的人源化PM1抗体(WT)中，即使在作为抗IL-6受体抗体的F2H/L39、作为抗IL-31受体抗体的H0L0、作为抗RANKL抗体的DNS中，通过将恒定区由IgG1变成IgG2，异质性也增大；通过将恒定区变成M14或M58，在所有抗体中均可降低异质性。由此表明：通过将存在于H链CH1结构域的EU编号第131位的半胱氨酸和存在于H链上铰链的EU编号第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸，无论可变区的抗体序列和抗原种类如何，均可降低来自天然型IgG2的异质性。
[实施例17]新的恒定区M58改善各种抗体的药物动力学的效果
如实施例15所示，发现在作为抗IL-6受体抗体的人源化PM1抗体(WT)中，通过将恒定区由IgG1变成M58，与人FcRn的结合性得到提高，在人FcRn转基因小鼠中药物动力学得到提高。因此，对于除人源化PM1抗体以外的IgG1抗体，也进行了下述的研究：即通过将恒定区变成M58，来研究其能否提高药物动力学。
作为除人源化PM1抗体(WT)以外的抗体，使用作为抗IL-31受体抗体的H0L0(H0L0_VH氨基酸序列，SEQ ID NO：147；H0L0_VL氨基酸序列，SEQ ID NO：148)、作为抗RANKL抗体的DNS(DNS_VH氨基酸序列，SEQ ID NO：149；DNS_VL氨基酸序列，SEQ ID NO：150)。相对于各抗体，制作恒定区为IgG1(SEQ ID NO：19)和M58(SEQID NO：151)的抗体，按照实施例14所述的方法评价其与人FcRn的结合性。结果见表14。
[表14]
如表14所示，确认到：即使在作为抗IL-31受体抗体的H0L0、作为抗RANKL抗体的DNS中，通过将恒定区由IgG1变成M58，和作为抗IL-6受体抗体的WT一样，与人FcRn的结合性提高。由此表明：无论可变区的抗体序列和抗原种类如何，通过将恒定区由IgG1变成M58，可以提高在人体内的药物动力学。
[实施例18]CH1结构域的半胱氨酸对异质性和稳定性的影响
如实施例8所示，为了降低天然型IgG2的异质性，对IgG2铰链部分的半胱氨酸和存在于CH1结构域的半胱氨酸进行修饰。研究各种修饰体，结果发现：在野生型IgG2恒定区序列中，通过使用SKSC(SEQID NO：154)，可以在不降低稳定性的情况下降低异质性，所述SKSC是将存在于H链CH1结构域的EU编号第131位的半胱氨酸和第133位的精氨酸分别取代成丝氨酸和赖氨酸、将存在于H链上铰链的EU编号第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸而得到的恒定区。
另一方面，作为降低异质性的方法，认为有只将存在于H链上铰链的第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸的方法、以及只将第220位的半胱氨酸取代成丝氨酸的方法。制作将IgG2的EU编号第219位的半胱氨酸取代成丝氨酸的恒定区SC(SEQ ID NO：155)和将IgG2的EU编号第220位的半胱氨酸取代成丝氨酸的恒定区CS(SEQ ID NO：156)，之后制作分别具有SC和CS作为恒定区的WT-SC(SEQ ID NO：157)和WT-CS(SEQ ID NO：158)，并与WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SKSC和WT-M58比较异质性和热稳定性。另外，由不同于WT的抗IL-6受体抗体、即F2H/L39(F2H/L39_VH氨基酸序列，SEQ ID NO：145；F2H/L39_VL氨基酸序列，SEQ ID NO：146)制作分别具有恒定区IgG1(SEQ ID NO：19)、IgG2(SEQ ID NO：20)、SC(SEQ ID NO：155)、CS(SEQ ID NO：156)、SKSC(SEQ ID NO：154)、M14(SEQ ID NO：24)的F2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、F2H/L39-M14，比较上述抗体的异质性和稳定性。
作为WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58、F2H/L39-IgG1、F2H/L39-IgG2、F2H/L39-SC、F2H/L39-CS、F2H/L39-SKSC、F2H/L39-M14的异质性的评价方法，通过阳离子交换层析进行评价。柱使用ProPac WCX-10(Dionex)，流动相A使用20mM乙酸钠(pH5.0)，流动相B使用20mM乙酸钠/1M NaCl(pH5.0)，采用适当的流量和梯度进行评价。利用阳离子交换层析进行评价的结果见图42。
其结果，如图42所示，在WT和F2H/L39的任一个中，通过将恒定区由IgG1变成IgG2，异质性均增大；但通过将恒定区变成SKSC和M14或M58，异质性均大幅下降。另一方面，当恒定区为SC时，与恒定区为SKSC时的情形一样，异质性大幅下降；而当恒定区为CS时，异质性没有得到充分改善。
通常，为了开发抗体作为药品，除了希望异质性少以外，还希望具有高稳定性，以制备稳定的制剂。因此，作为稳定性的评价方法，利用差示扫描量热法(DSC)测定热变性中间温度(Tm值)(VP-DSC、Microcal社制)。热变性中间温度(Tm值)是稳定性的指标，为了制备稳定的制剂作为药品，希望热变性中间温度(Tm值)高(J.Pharm.Sci.2008Apr；97(4)：1414-26)。将WT-IgG1、WT-IgG2、WT-SC、WT-CS、WT-SKSC、WT-M58用20mM乙酸钠、150mM NaCl、pH6.0的溶液进行透析(EasySEP；TOMY)，在约0.1mg/mL的蛋白浓度下以1℃/分钟的升温速度在40℃～100℃范围内进行DSC测定。所得的DSC变性曲线见图43，Fab部分的Tm值见下表15。
[表15]
           Tm/℃
WT-IgG1    94.8
WT-IgG2    93.9
WT-SC      86.7
WT-CS      86.4
WT-SKSC    93.7
WT-M58     93.7
WT-IgG1和WT-IgG2的Tm值大致相等，均为约94℃左右(IgG2的Tm值低约1℃)，而WT-SC和WT-CS的Tm值均为约86℃，与WT-IgG1和WT-IgG2相比，Tm值显著降低。另一方面，WT-M58和WT-SKSC的Tm值均为约94℃，与WT-IgG1和WT-IgG2大致相等。由于与IgG2相比，WT-SC和WT-CS的稳定性明显低，所以为了开发抗体作为药品，认为优选CH1结构域的半胱氨酸也取代成丝氨酸的WT-SKSC和WT-M58。与IgG2相比，WT-SC和WT-CS的Tm值大幅下降，认为其原因在于WT-SC和WT-CS在二硫键构象方面不同于IgG2。
比较DSC变性曲线时，WT-IgG1、WT-SKSC、WT-M58的Fab部分的变性峰窄且单一，相对于此，WT-SC和WT-CS的Fab部分的变性峰宽，确认WT-IgG2在Fab部分的变性峰的低温侧出现肩峰。认为当DSC的变性峰为单一成分时，通常显示窄变性峰，而当存在Tm值不同的多种成分(即异质性)时，变性峰变宽。即，上述结果表明：WT-IgG2、WT-SC和WT-CS中有可能存在多种成分，所以WT-SC和WT-CS的天然型IgG2的异质性没有得到充分的降低。由此认为：野生型IgG2的异质性不仅与铰链部分的半胱氨酸有关，还与存在于CH1结构域的半胱氨酸有关，为了降低DSC上的异质性，不仅必需修饰铰链部分的半胱氨酸，还必需修饰CH1结构域的半胱氨酸。如上所述，通过不仅修饰铰链部分的半胱氨酸、还修饰CH1结构域的半胱氨酸，首次有可能具有与野生型IgG2同等的稳定性。
根据上述结果认为：作为降低来自IgG2铰链区的异质性的恒定区，只将铰链部分的半胱氨酸取代成丝氨酸的恒定区SC和CS，从异质性和稳定性的角度考虑并不充分，发现除了将铰链部分的半胱氨酸取代成丝氨酸以外，还将存在于CH1结构域的EU编号第131位的半胱氨酸也取代成丝氨酸，从而首次可以在维持与IgG2同等的稳定性的同时大幅降低异质性。作为这样的恒定区，有上述M14、M31、M58、M73等，特别是M58和M73的药物动力学提高、稳定性高、异质性下降，因此认为其作为抗体药物的恒定区非常有用。
[实施例19]PK/PD得到改善的完全人源化抗IL-6受体抗体的制作
为了制作PK/PD得到改善的完全人源化抗IL-6受体抗体，通过修饰TOCILIZUMAB(H链，WT-IgG1(SEQ ID NO：15)；L链，WT(SEQ ID NO：105))，制作以下所示的分子。
为了提高F2H-IgG1的ka，进行实施例2中得到的亲和性增强的修饰，即：将第35位的色氨酸取代成缬氨酸、将第50位的酪氨酸取代成苯丙氨酸、和将第62位的丝氨酸取代成苏氨酸。另外，为了在不增加免疫原性风险的同时降低pI，将第102位的酪氨酸取代成缬氨酸、将第105位的谷氨酰胺取代成谷氨酸、将第107位的异亮氨酸取代成苏氨酸，并将恒定区由IgG1转换成M83，制成VH5-M83(SEQ IDNO：139(氨基酸序列))。为了提高L39的ka，制作第27位的谷氨酸被取代成谷氨酰胺的VL5-k(SEQ ID NO：181(氨基酸序列))。并且，制作组合有多个在上述实施例中发现的TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的突变以及新发现的突变的TOCILIZUMAB修饰体，进行各种筛选，结果发现了下述完全人源化IL-6受体抗体：Fv3-M73(H链VH4-M73 SEQ ID NO：182；L链VL1-kSEQ ID NO：183)、Fv4-M73(H链VH3-M73 SEQ ID NO：180；L链VL3-k SEQ ID NO：181)、Fv5-M83(H链VH5-M83 SEQ ID NO：139；L链VL5-k SEQ ID NO：138)。
将制作的Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83与IL-6受体的亲和性、和TOCILIZUMAB进行比较(方法参照参考例)。测定上述抗体与IL-6受体的亲和性，结果见表16。此外，比较了TOCILIZUMAB和对照(参考例的公知的高亲和性抗IL-6受体抗体、US 2007/0280945中的VQ8F11-21 hIgG1)的BaF/gp130中和活性(方法参照参考例)。测定这些抗体在BaF/gp130中的生物活性，结果见图44(IL-6的终浓度为300ng/mL：TOCILIZUMAB、对照、Fv5-M83)和图45(IL-6的终浓度为30ng/mL：TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73)。如表16所示，与TOCILIZUMAB相比，Fv3-M73和Fv4-M73具有约2～3倍强的亲和性；与TOCILIZUMAB相比，Fv5-M83显示出约100倍强的亲和性(由于Fv5-M83的亲和性难以测定，所以使用恒定区为IgG1的Fv5-IgG1来测定亲和性，认为恒定区通常对亲和性没有影响)。如图45所示，与TOCILIZUMAB相比，Fv3-M73、Fv4-M73显示出稍强的活性；如图44所示，与TOCILIZUMAB相比，Fv5-M83在50％抑制浓度下具有100倍以上的极强的活性，并且，与对照(公知的高亲和性抗IL-6受体抗体)相比，Fv5-M83在50％抑制浓度下也显示出约10倍高的中和活性。
[表16]
Figure GPA00001143028201461
利用本领域技术人员公知的方法，通过等电点电泳来测定TOCILIZUMAB、对照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83的等电点，结果：TOCILIZUMAB的等电点为约9.3、对照的等电点为约8.4～8.5、Fv3-M73的等电点为约5.7～5.8、Fv4-M73的等电点为约5.6～5.7、Fv5-M83的等电点为约5.4～5.5，与TOCILIZUMAB和对照相比，这些抗体的等电点均大幅下降。另外，利用GENETYX(GENETYXCORPORATION)来计算可变区VH/VL的理论等电点时，TOCILIZUMAB的理论等电点为9.20、对照的理论等电点为7.79、Fv3-M73的理论等电点为5.49、Fv4-M73的理论等电点为5.01、Fv5-M83的理论等电点为4.27，与TOCILIZUMAB和对照相比，这些抗体的理论等电点均大幅下降。由此认为：与TOCILIZUMAB和对照相比，Fv3-M73、Fv4-M73、Fv5-M83的药物动力学有所提高。
使用TEPITOPE(Methods.2004 Dec；34(4)：468-75)对存在于TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83的可变区序列的T细胞表位进行分析。其结果，虽然预测TOCILIZUMAB的多个序列存在与HLA结合的T细胞表位，但在Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83中被预测与T细胞表位结合的序列大幅减少。另外，Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83在构架中没有残留小鼠序列，被完全人源化。由此表明：与TOCILIZUMAB相比，Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83的免疫原性风险有可能大幅降低。
[实施例20]完全人源化抗IL-6受体抗体在猴体内的PK/PD试验
将TOCILIZUMAB、对照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83以1mg/kg对食蟹猴进行静脉内单次给药，评价血浆中浓度变化(方法参照参考例)。TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83静脉内给药后的血浆中浓度变化见图46。其结果，与TOCILIZUMAB和对照相比，Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83在食蟹猴体内的血浆中滞留性大幅改善。其中，与TOCILIZUMAB相比，Fv3-M73和Fv4-M73的血浆中滞留性大幅改善。
为了评价各抗体中和膜型食蟹猴IL-6受体的药效，在抗体给药后第6天～第18天(给予TOCILIZUMAB后第3天～第10天)将食蟹猴IL-6以5μg/kg对腰背部连日进行皮下给药，测定24小时后各个体的CRP浓度(方法参照参考例)。各抗体给药后的CRP浓度变化见图47。为了评价各抗体中和可溶型食蟹猴IL-6受体的药效，测定食蟹猴血浆中非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体的浓度，计算可溶型IL-6受体的中和率(方法参照参考例)。各抗体给药后可溶型IL-6受体的中和率变化见图48。
与TOCILIZUMAB和对照(公知的高亲和性抗IL-6受体抗体)相比，Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83均能更持续地中和膜型食蟹猴IL-6受体，长期抑制CRP的增加。而且，与TOCILIZUMAB和对照相比，Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83均能更持续地中和可溶型食蟹猴IL-6受体，长期抑制非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体的增加。由此发现：在中和膜型IL-6受体和可溶型IL-6受体的持续性方面，Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83均较TOCILIZUMAB和对照优异。其中，Fv3-M73和Fv4-M73的中和的持续性极其优异。另一方面，与Fv3-M73和Fv4-M73相比，Fv5-M83将CRP和非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体抑制在低水平。由此认为：与Fv3-M73、Fv4-M73和对照(公知的高亲和性抗IL-6受体抗体)相比，Fv5-M83更强效地中和膜型IL-6受体和可溶型IL-6受体。认为这是Fv5-M83与IL-6受体的亲和性较对照强、且Fv5-M83在BaF/gp130中的生物活性强在食蟹猴体内得到反映的结果。
上述研究表明：与TOCILIZUMAB和对照相比，Fv3-M73和Fv4-M73作为抗IL-6受体中和抗体作用的持续性极其优异，可以大幅降低给药频率和给药量；另外，Fv5-M83作为抗IL-6受体中和抗体作用强度极其优异，作用的持续性也优异。因此，认为Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83可以以IL-6拮抗剂的形式用作药物。
[参考例]
重组可溶型食蟹猴IL-6受体(cIL-6R)的制备
根据公开的恒河猴IL-6受体基因序列(Bimey等人，Ensembl 2006，Nucleic Acids Res.2006 Jan 1；34(Database issue)：D556-61)制作寡DNA引物，以由食蟹猴胰脏制备的cDNA为模板，使用引物，通过PCR法制备编码食蟹猴IL-6受体全长基因的DNA片段。将得到的DNA片段插入动物细胞表达载体中，使用该载体制作CHO恒定表达株(产生食蟹猴sIL-6R的CHO细胞)。将产生食蟹猴sIL-6R的CHO细胞的培养液用HisTrap柱(GE Healthcare Bioscience)纯化，之后使用Amicon Ultra-15 Ultracel-10k(Millipore)进行浓缩，用Superdex200pg16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare Bioscience)进一步纯化，得到可溶型食蟹猴IL-6受体(以下记作cIL-6R)的最终纯品。
重组食蟹猴IL-6(cIL-6)的制作
食蟹猴IL-6如下制备。制成编码在SWISSPROT Accession No.P79341中注册的212个氨基酸的核苷酸序列，将其克隆到动物细胞表达载体中，再将所得载体导入CHO细胞中，从而制作恒定表达细胞株(产生食蟹猴IL-6的CHO细胞)。将产生食蟹猴IL-6的CHO细胞的培养液用SP-Sepharose/FF柱(GE Healthcare Bioscience)纯化，之后用Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)浓缩，再用Superdex75pg26/60凝胶过滤柱(GE Healthcare Bioscience)进一步纯化，并用AmiconUltra-15 Ultracel-5k(Millipore)进行浓缩，得到食蟹猴IL-6(以下记作cIL-6)的最终纯品。
公知高亲和性抗IL-6受体抗体的制作
为了表达公知的高亲和性抗IL-6受体抗体、即US 2007/0280945A1中所述的高亲和性抗IL-6受体抗体VQ8F11-21 hIgG1(US2007/0280945A1，H链氨基酸序列、SEQ ID NO：19；L链氨基酸序列、SEQ ID NO：27)，构建动物细胞表达用载体。抗体可变区通过组合有合成寡DNA的PCR法(装配PCR)来制作，恒定区则使用IgG1。利用装配PCR法使抗体可变区与恒定区结合，之后插入动物细胞表达用载体中，制作目标H链表达载体和L链表达载体。所得表达载体的核苷酸序列按照本领域技术人员公知的方法来确定，使用制作的表达载体进行表达、纯化。表达、纯化按照实施例1所述的方法进行，得到高亲和性抗IL-6受体抗体(以下记作对照)。
利用Biacore评价与IL-6受体的结合
使用Biacore T100(GE Healthcare)，进行抗原抗体反应的速度论的分析。通过胺耦合法将适量的抗IgG(γ-链特异性)F(ab’)2固定在传感器芯片上，接下来，在pH7.4下使目标抗体结合，再于pH7.4下使调整成各种浓度的IL-6受体、即SR344以分析物的形式流动，测定抗体与SR344的相互作用。所有测定均在37℃下进行。由测定中得到的传感图算出动力学参数、即结合速度常数ka(1/Ms)和解离速度常数kd(1/s)，根据该值算出KD(M)。使用Biacore T100评估软件(GEHealthcare)计算各参数。
通过猴PK/PD试验测定血浆中抗体浓度、CRP浓度、以及非结合型 的可溶型IL-6受体浓度
食蟹猴血浆中浓度测定按照ELISA法、利用本领域技术人员公知的方法进行测定。CRP浓度利用Cias R CRP(关东化学株式会社)、使用自动分析装置(TBA-120FR、东芝Medical Systems株式会社)进行测定。
食蟹猴血浆中非结合型的可溶型食蟹猴IL-6受体浓度如下测定。将30μL食蟹猴的血浆添加到0.22μm的滤杯(Millipore)中已干燥的适量的rProtein A Sepharose Fast Flow resin(GE Healthcare)上，使血浆中存在的所有IgG型抗体(食蟹猴IgG、抗人IL-6受体抗体、抗人IL-6受体抗体-可溶型食蟹猴IL-6受体复合体)均吸附在蛋白A上。之后，用高速离心机进行旋转下降，回收通过的溶液。由于通过的溶液中不含与蛋白A结合的抗人IL-6受体抗体-可溶型食蟹猴IL-6受体复合体，所以通过测定通过蛋白A的溶液中的可溶型食蟹猴IL-6受体浓度，即可测定非结合型的可溶型IL-6受体浓度。至于可溶型食蟹猴IL-6受体浓度，以上述制作的可溶型食蟹猴IL-6受体(cIL-6R)作为标准品，利用测定人IL-6受体浓度的本领域技术人员公知的方法进行测定。可溶型IL-6受体的中和率通过下式来计算。
(抗体给予后的非结合型的可溶性IL-6受体浓度÷抗体给予前的可溶性IL-6受体浓度)×100
产业实用性
根据本发明，提供优于TOCILIZUMAB的第2代分子，所述优于TOCILIZUMAB的第2代分子是指通过修饰人源化抗IL-6受体IgG1抗体、即TOCILIZUMAB的可变区和恒定区的氨基酸序列，使抗原中和能力增强、同时提高药物动力学，从而降低给药频率、持续发挥治疗效果，并且使免疫原性、安全性、理化性质得到改善。本发明还提供适合作为药品的抗体恒定区。
序列表
<110>中外制药株式会社
<120>抗IL-6受体抗体
<130>C1-A0708P
<150>JP 2007-250165
<151>2007-09-26
<160>194
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>6
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>1
Ser Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>2
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>3
Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>4
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>5
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>6
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>7
<211>30
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
            20                  25                  30
<210>8
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>8
Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10
<210>9
<211>32
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>9
Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>10
Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>11
<211>23
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
            20
<210>12
<211>15
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>12
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>13
<211>32
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>13
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>14
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>15
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>15
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Mer His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
<210>16
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>17
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>18
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>19
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
    35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val ValThr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>20
<211>326
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>21
<211>327
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>21
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                   25                 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
                165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
    290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325
<210>22
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Leu Ala Arg Ile Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>23
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
            100                 105
<210>24
<211>324
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro
<210>25
<211>324
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Leu
<210>26
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>26
Trp Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>27
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>27
Thr Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>28
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>28
Asp Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>29
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>29
Asn Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>30
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>30
Arg Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>31
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>31
Val Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>32
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>32
Phe Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>33
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>33
Ala Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>34
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>34
Gln Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>35
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>35
Tyr Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>36
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>36
Leu Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>37
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>37
His Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>38
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>38
Glu Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>39
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>39
Cys Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>40
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>40
Ser Asp His Ala Ile Ser
1               5
<210>41
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>41
Ser Asp His Ala Val Ser
1               5
<210>42
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>42
Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>43
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>43
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Arg Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>44
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>44
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>45
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>45
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>46
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>46
Ile Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>47
Val Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>48
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>48
Thr Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>49
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>49
Leu Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>50
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>50
Ser Thr Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>51
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>51
Ser Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>52
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>52
Ser Leu Ala Arg Ile Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>53
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>53
Ser Leu Ala Arg Ser Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>54
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>54
Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ser Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>55
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>55
Ser Leu Ala Arg Thr Thr Val Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>56
Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>57
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>57
Leu Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>58
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>58
Val Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>59
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>59
Ile Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>60
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>60
Thr Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>61
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>61
Val Leu Ala Arg Ile ThrAla Met Asp Tyr
1               5                  10
<210>62
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>62
Ile Leu Ala Arg Ile Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>63
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>63
Thr Leu Ala Arg Ile Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>64
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>64
Leu Leu Ala Arg Ile Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>65
Ser Thr Ala Arg Thr Thr Val Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>66
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>66
Phe Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>67
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>67
Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>68
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>68
Arg Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>69
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>69
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Phe Leu Asn
1               5                   10
<210>70
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>70
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Ser
1               5                   10
<210>71
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>71
Tyr Gly Ser Arg Leu His Ser
1               5
<210>72
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>72
Gly Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>73
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>73
Asn Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>74
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>74
Ser Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>75
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>75
Gln Gln Ser Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>76
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>76
Gln Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>77
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>77
Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>78
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>78
Gly Gln Gly Asn Ser Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>79
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>79
Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>80
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>80
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
            20                  25                  30
<210>81
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>81
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
            20                  25                  30
<210>82
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>82
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
            20                  25                  30
<210>83
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>83
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser
            20                  25                  30
<210>84
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>84
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser
            20                  25                  30
<210>85
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>85
Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10
<210>86
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>86
Arg Val Thr Ile Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>87
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>87
Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>88
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>88
Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>89
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>89
Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>90
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>90
Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>91
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>91
Trp Gly Glu Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>92
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys
            20
<210>93
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>93
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>94
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>94
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210>95
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>95
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210>96
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>96
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210>97
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>97
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
            20                  25                  30
<210>98
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>98
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
1               5                   10
<210>99
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>99
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>100
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>100
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>101
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>101
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>102
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>102
Tyr Thr Ser Glu Leu His Ser
1               5
<210>103
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>103
Tyr Gly Ser Glu Leu His Ser
1               5
<210>104
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>104
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>105
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>105
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Tyr
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
            100                 105
<210>106
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>106
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>107
<211>414
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成核苷酸序列
<400>107
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag    60
gtccaactgc aggagagcgg tccaggtctt gtgagaccta gccagaccct gagcctgacc   120
tgcaccgtgt ctggctactc aattaccagc gatcatgcct ggagctgggt tcgccagcca   180
cctggacgag gtcttgagtg gattggatac attagttata gtggaatcac aacctataat   240
ccatctctca aatccagagt gacaatgctg agagacacca gcaagaacca gttcagcctg   300
agactcagca gcgtgacagc cgccgacacc gcggtttatt attgtgcaag atccctagct   360
cggactacgg ctatggacta ctggggtcaa ggcagcctcg tcacagtctc ctca         414
<210>108
<211>378
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成核苷酸序列
<400>108
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgac    60
atccagatga cccagagccc aagcagcctg agcgccagcg tgggtgacag agtgaccatc   120
acctgtagag ccagccagga catcagcagt tacctgaatt ggtaccagca gaagccagga   180
aaggctccaa agctgctgat ctactacacc tccagactgc actctggtgt gccaagcaga   240
ttcagcggta gcggtagcgg taccgacttc accttcacca tcagcagcct ccagccagag   300
gacatcgcta cctactactg ccaacagggt aacacgcttc catacacgtt cggccaaggg   360
accaaggtgg aaatcaaa                                                 378
<210>109
<211>445
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>109
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210>110
<211>446
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>110
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
                245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
            260                 265                 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
        275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
    290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
                 325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
            340                 345                 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
        355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
    370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                405                 410                 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
            420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>111
<211>445
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>111
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210>112
<211>446
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>112
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
                245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
            260                 265                 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
        275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
    290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
                325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
            340                 345                 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
        355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
    370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                405                 410                 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
            420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210>113
<211>443
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>113
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440
<210>114
<211>443
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>114
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
        435                 440
<210>115
<211>446
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>115
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
                245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
            260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
        275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
    290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
                325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln ValTyr Thr Leu
            340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
        355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
    370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
            420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
<210>116
<211>327
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>116
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
        115                 120                 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
    130                 135                 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145                 150                 155                 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
                165                 170                 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
            180                 185                 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
        195                 200                 205
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
    210                 215                 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225                 230                 235                 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
                245                 250                 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
            260                 265                 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
        275                 280                 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
    290                 295                 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305                 310                 315                 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                325
<210>117
<211>443
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>117
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Leu Ala Arg Ile Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440
<210>118
<211>324
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>118
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro
<210>119
<211>443
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>119
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser IleThr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440
<210>120
<211>445
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>120
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210>121
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>121
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Gln Asp
1               5                   10                  15
<210>122
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>122
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Gln Asp
1               5                   10                  15
<210>123
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>123
Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>124
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>124
Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>125
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>125
Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser
1               5
<210>126
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>126
Tyr Gly Ser Glu Leu Glu Ser
1               5
<210>127
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>127
Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>128
<211>32
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>128
Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>129
<211>32
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>129
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>130
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>130
Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>131
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>131
Trp Gly Glu Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>132
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>132
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>133
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>133
Trp Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>134
<211>449
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>134
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Leu Ala Arg Ile Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                  120                  125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                  135                  140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
Lys
<210>135
<211>449
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>135
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ile Leu Val Thr ValSer Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
Lys
<210>136
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>137
<211>449
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>137
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
            20                  25                  30
His Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
         35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Thr Leu
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Val Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
Lys
<210>138
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>138
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>139
<211>447
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>139
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
            20                  25                  30
His Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Thr Leu
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Val Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
<210>140
<211>267
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>140
Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser
1               5                   10                  15
Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro
            20                  25                  30
Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys
        35                  40                  45
Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu
    50                  55                  60
Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys
65                  70                  75                  80
Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys
                85                  90                  95
Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu
            100                 105                 110
Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly
        115                 120                 125
Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln
    130                 135                 140
Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro
145                 150                 155                 160
His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp
                165                 170                 175
Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly
            180                 185                 190
Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu
        195                 200                 205
Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly
    210                 215                 220
Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu
225                 230                 235                 240
Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His
                245                 250                 255
Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu
            260                 265
<210>141
<211>99
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>141
Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu
1               5                   10                  15
Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro
            20                  25                  30
Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys
        35                  40                  45
Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu
    50                  55                  60
Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys
65                  70                  75                  80
Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp
                85                  90                  95
Arg Asp Met
<210>142
<211>443
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>142
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
       195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440
<210>143
<211>449
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>143
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
Lys
<210>144
<211>443
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>144
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440
<210>145
<211>119
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>145
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>146
<211>107
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>146
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
            100                 105
<210>147
<211>120
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>147
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser ValLys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
           20                  25                  30
Ile Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Tyr Asp Asp Gly Pro Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>148
<211>107
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>148
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Lys Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Glu Ser Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>149
<211>122
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>149
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>150
<211>108
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>150
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>151
<211>324
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>151
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Ash Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro
<210>152
<211>330
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>152
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>153
<211>324
<212>PRT
<213>人L序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>153
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro
<210>154
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>154
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>155
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>155
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>156
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>156
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>157
<211>445
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>157
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210>158
<211>445
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>158
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210>159
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>159
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Leu Ala Arg Ile Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>160
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>160
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>161
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>161
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp
            20                  25                  30
His Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Thr Leu
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Val Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>162
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>162
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
            100                 105
<210>163
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>163
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
            100                 105
<210>164
<211>328
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>164
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
       115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
                325
<210>165
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>165
Asp Asp His Ala Val Ser
1               5
<210>166
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>166
Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Thr Leu Gln Asp
1               5                   10                  15
<210>167
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>167
Leu Leu Ala Arg Ala Thr Ala Met Asp Val
1               5                   10
<210>168
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>168
Tyr Gly Ser Glu Leu Glu Ser
1               5
<210>169
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>169
His Asp His Ala Trp Ser
1               5
<210>170
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>170
Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
<210>171
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>171
Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>172
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>172
Gln Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser His Leu Asn
1               5                   10
<210>173
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>173
Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser
1               5
<210>174
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>174
Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Thr Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
<210>175
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>175
Gln Ala Ser Arg Asp Ile Ser Ser His Leu Asn
1               5                   10
<210>176
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>176
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>177
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>177
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser His
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
            100                 105
<210>178
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>178
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Thr Leu
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>179
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>179
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Arg Asp Ile Ser Ser His
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
            100                 105
<210>180
<211>443
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>180
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Mer Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440
<210>181
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>181
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser His
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>182
<211>443
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>182
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Thr Leu
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440
<210>183
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>183
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Arg Asp Ile Ser Ser His
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>184
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>184
Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
            20                  25                  30
<210>185
<211>447
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>185
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
<210>186
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>186
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser
            20                  25                  30
<210>187
<211>445
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>187
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro ValThr ValSer Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val ValT hr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210>188
<211>443
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>188
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Mer Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440
<210>189
<211>445
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>189
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210>190
<211>443
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>190
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
            20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu ValLys
        355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
    370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
            420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440
<210>191
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>191
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>192
<211>324
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>192
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr ValGlu Arg Lys Ser Cys ValGlu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
           100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn ValPhe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro
<210>193
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>193
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
<210>194
<211>324
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽序列
<400>194
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln ValTyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Mer Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro

Claims (5)

1.包含SEQID NO：17的重链可变区和SEQID NO：18的轻链可变区的抗IL-6受体抗体，其中：
-重链CDR1中第1位的Ser被取代成Asp；
-重链CDR2中第9位的Thr和第16位的Ser分别被取代成Asn和Gly；
-重链FR1中第13位的Arg、第16位的Gln、第23位的Thr和第30位的Thr被分别取代成Lys、Glu、Ala和Ser；
-重链FR2中第8位的Arg被取代成Glu；
-重链FR3中第4位的Met、第5位的Leu、第16位的Arg和第27位的Val被分别取代成Ile、Ser、Lys和Ala；
-重链FR4中第3位的Gln和第5位的Ser被分别取代成Glu和Thr；
-轻链CDR1中第1位的Arg被取代成Gln；
-轻链CDR2中第2位的Thr和第4位的Arg被分别取代成Gly和Glu；
-轻链CDR3中第5位的Thr被取代成Ser；
-轻链FR1中第18位的Arg被取代成Ser；
-轻链FR2中第11位的Lys被取代成Glu；
-轻链FR3中第23位的Gln、第24位的Pro和第27位的Ile被分别取代成Glu、Ala和Ala；
-轻链FR4中第10位的Lys被取代成Glu。
2.包含SEQ ID NO：17的重链可变区和SEQ ID NO：18的轻链可变区的抗IL-6受体抗体，其中：
-重链CDR1中第1位的Ser被取代成Asp；
-重链CDR2中第9位的Thr和第16位的Ser分别被取代成Asn和Gly；
-重链CDR3中第1位的Ser和第5位的Thr被分别取代成Val和Ile；
-重链FR1中第13位的Arg、第16位的Gln、第23位的Thr和第30位的Thr被分别取代成Lys、Glu、Ala和Ser；
-重链FR2中第8位的Arg被取代成Glu；
-重链FR3中第4位的Met、第5位的Leu、第16位的Arg和第27位的Val被分别取代成Ile、Ser、Lys和Ala；
-重链FR4中第3位的Gln和第5位的Ser被分别取代成Glu和Thr；
-轻链CDR1中第1位的Arg被取代成Gln；
-轻链CDR2中第2位的Thr和第4位的Arg被分别取代成Gly和Glu；
-轻链CDR3中第1位的Gln和第5位的Thr被分别取代成Gly和Arg；
-轻链FR1中第18位的Arg被取代成Ser；
-轻链FR2中第11位的Lys被取代成Glu；
-轻链FR3中第23位的Gln、第24位的Pro和第27位的Ile被分别取代成Glu、Ala和Ala；
-轻链FR4中第10位的Lys被取代成Glu。
3.包含SEQ ID NO：17的重链可变区和SEQ ID NO：18的轻链可变区的抗IL-6受体抗体，其中：
-重链CDR1中第1位的Ser被取代成Asp；
-重链CDR2中第9位的Thr和第16位的Ser分别被取代成Asn和Gly；
-重链CDR3中第1位的Ser和第5位的Thr被分别取代成Val和Ile；
-重链FR1中第13位的Arg、第16位的Gln、第23位的Thr和第30位的Thr被分别取代成Lys、Glu、Ala和Ser；
-重链FR2中第8位的Arg被取代成Glu；
-重链FR3的氨基酸序列被SEQ ID NO：184的氨基酸序列取代；
-重链FR4中第3位的Gln和第5位的Ser被分别取代成Glu和Thr；
-轻链CDR1中第1位的Arg被取代成Gln；
-轻链CDR2中第2位的Thr和第4位的Arg被分别取代成Gly和Glu；
-轻链CDR3中第1位的Gln和第5位的Thr被分别取代成Gly和Arg；
-轻链FR1中第18位的Arg被取代成Ser；
-轻链FR2中第11位的Lys被取代成Glu；
-轻链FR3中第23位的Gln、第24位的Pro和第27位的Ile被分别取代成Glu、Ala和Ala；
-轻链FR4中第10位的Lys被取代成Glu。
4.包含SEQ ID NO：17的重链可变区和SEQ ID NO：18的轻链可变区的抗IL-6受体抗体，其中：
-重链CDR1中第1位的Ser被取代成Asp；
-重链CDR2的氨基酸序列被SEQ ID NO：122的氨基酸序列取代；
-重链CDR3中第1位的Ser和第5位的Thr被分别取代成Leu和Ala；
-重链FR1中第13位的Arg、第16位的Gln、第23位的Thr和第30位的Thr被分别取代成Lys、Glu、Ala和Ser；
-重链FR2中第8位的Arg被取代成Glu；
-重链FR3的氨基酸序列被SEQ ID NO：184的氨基酸序列取代；
-重链FR4中第5位的Ser被取代成Ile；
-轻链CDR1中第1位的Arg和第4位的Gln被分别取代成Gln和Glu；
-轻链CDR2的氨基酸序列被SEQ ID NO：126的氨基酸序列取代；
-轻链CDR3中第1位的Gln和第5位的Thr被分别取代成Gly和Arg；
-轻链FR1中第18位的Arg被取代成Ser；
-轻链FR2中第11位的Lys被取代成Glu；
-轻链FR3中第23位的Gln、第24位的Pro和第27位的Ile被分别取代成Glu、Ala和Ala；
-轻链FR4中第10位的Lys被取代成Glu。
5.医药组合物，其中含有权利要求1-4中任一项所述的抗体。
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