TWI438208B - 抑制慢性排斥反應之藥劑 - Google Patents

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TWI438208B
TWI438208B TW097102457A TW97102457A TWI438208B TW I438208 B TWI438208 B TW I438208B TW 097102457 A TW097102457 A TW 097102457A TW 97102457 A TW97102457 A TW 97102457A TW I438208 B TWI438208 B TW I438208B
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Atsushi Izawa
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Univ Shinshu
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Description

抑制慢性排斥反應之藥劑
本發明係關於一種用於抑制慢性排斥反應之藥劑，包含以一IL－6抑制劑作為有效成分，及其用途。本發明更關於用於抑制慢性排斥反應之方法，包含對於接受者投予一IL－6抑制劑之步驟。
IL－6為一細胞介素，亦稱B細胞刺激因子2(BSF2)或干擾素β 2。IL－6已發現作為一分化因子，涉及活化B細胞淋巴球(非專利文獻1)，且近來發現為一多功細胞介素，影響各種細胞之功能(非專利文獻2)。IL－6已被報告會誘導T淋巴細胞成熟(非專利文獻3)。
IL－6經由細胞上的2種蛋白質傳達其生物學活性。第1種為IL－6受體，為一種IL－6結合之配體結合蛋白質，分子量約80kDa(非專利文獻4及5)。該IL－6受體以膜結合形式存在，穿透並且表現在細胞膜上，且作為一可溶性IL－6受體，主要構成膜結合形式之胞外區域。
另一種蛋白質為膜蛋白質gp130，分子量約130kDa且涉及非配體結合信號傳遞。IL－6之生物學活性係經由形成IL－6及IL－6受體之IL－6/IL－6受體複合體，接著使此複合體與gp130結合，以傳達到細胞內(非專利文獻6)。
IL－6抑制劑為抑制傳達IL－6生物學活性之物質。目前已知之IL－6抑制劑包括：抗IL－6之抗體(抗IL－6抗體)、抗IL－6受體之抗體(抗IL－6受體抗體)、抗gp130之 抗體(抗gp130抗體)、IL－6變異體、IL－6或IL－6受體之部分胜肽等。
已有許多關於抗IL－6受體抗體之報告(非專利文獻7及8，及專利文獻1至3)。其中1份報告詳述一人類化PM－1抗體，其係藉由將為一抗IL－6受體抗體之小鼠抗體PM－1之互補決定區域(CDR)(非專利文獻9)，移植到人類抗體內(專利文獻4)而得到。
由於多藥物療法之進展以及臨床應用各種免疫抑制劑，已幾乎建立了器官移植後針對急性排斥反應之治療策略，且各種器官移植後1年內的存活率已顯著地改善。然而，即便是臨床個案中已將急性排斥反應以習知免疫抑制療法克服，但是慢性排斥反應在移植後1年後且療法已持續一段長時間仍成為問題。因此尚未建立對付慢性排斥反應之有效預防或治療方法。再者，對於此病理學狀況之機制尚未完全解明，且相較於急性排斥反應，較難以診斷。因此慢性排斥反應已知係影響接受者長期預後之一種併發症(非專利文獻10及11)。
已知慢性排斥反應之病理特性包括：組織間隙纖維化及由於被移植的器官中的管腔組織之內膜增厚導致內腔狹窄。尤其，血管狹窄為一重要的病理特徵，被稱為移植後血管病變(vascular lesion)或移植後動脈硬化。許多因子被認為複雜地影響病理狀態之進展，例如由於細胞性及體液免疫(humoral immunity)兩者造成排斥反應延長、器官之局部缺血－再灌流病症、血管內皮之功能性病症、接受者之動脈硬化之共通風險因子(糖尿病、高脂血症、高血壓 等)、免疫抑制劑之副作用、遺傳因子，及移植後感染巨細胞病毒(非專利文獻12及13)。
於既有醫藥製劑中，調鈣素(calcineurin)抑制劑例如環孢靈素(cyclosporine)及他克莫司(Tacrolimus)在對付慢性排斥反應尤其無效用，且其副作用例如高血壓、高脂血症、糖尿病被認為會有問題。再者尤於對於小兒接受者，移植後需要長期免疫抑制療法。因此，開發對於慢性排斥反應有效且副作用小之醫藥製劑是被期符的(非專利文獻13及14)。
上述開發針對抑制慢性排斥反應之新穎免疫抑制療法的需求，為本研究之背景。
本發明之相關先前技術文獻如下。
[專利文獻1]國際專利申請案公開號WO 95/09873 [專利文獻2]French Patent Application No.FR 2694767 [專利文獻3]United States Patent No.5216128 [專利文獻4]WO 92/19759
[非專利文獻1]Hirano,T.et al .,Nature(1986)324,73－76 [非專利文獻2]Akira,S.et al .,Adv.in Immunology(1993)54,1－78 [非專利文獻3]Lotz,M.et al .,J.Exp.Med.(1988)167,1253－1258 [非專利文獻4]Taga,T.et al .,J.Exp.Med.(1987)166,967－981 [非專利文獻5]Yamasaki,K.et al .,Science(1988)241,825－828 [非專利文獻6]Taga,T.et al .,Cell(1989)58,573－581 [非專利文獻7]Novick,D.et al .,Hybridoma(1991)10,137－146 [非專利文獻8]Huang,Y.W.et al .,Hybridoma(1993)12,621－630 [非專利文獻9]Hirata,Y.et al .,J.Immunol.(1989)143,2900－2906 [非專利文獻10]Wong,B.W.et al .,Cardiovasc.Pathol.(2005)14,176－80 [非專利文獻11]Hornick,P.et al .,方法Mol.Biol.(2006)333,131－44 [非專利文獻12]Ramzy,D.et al .,Can.J.Surg.(2005)48,319－327 [非專利文獻13]Valantine,H.,J.Heart Lung Transplant(2004)23(5 Suppl),S187－93 [非專利文獻14]Webber,S.A.et al .,Lancet(2006)368,53－69 [非專利文獻15]Izawa,A.,et al .,Circ.J.(2007)71(Suppl I),392(Annual Scientific Meeting of the Japanese Circulation Society,Kobe,Mar 15－Mar 17,2007；Abstract PE－269) [非專利文獻16]Izawa,A.,et al .,Am.J. Transplant.(2007)7(Suppl 11),426(American Transplant Congress,San Francisco,CA,Mar 5－Mar 9,2007；Abstract 1084)
本發明之提供－種用於抑制慢性排斥反應之藥劑，包含一IL－6抑制劑作為有效成分。
本發明之另一目標為提供－種用於抑制慢性排斥反應之方法，包含對於個體投予一IL－6抑制劑之步驟。
為達上述目標，本案發明人測試抗IL－6受體之抗體在抑制慢性排斥反應之效果。
本案發明人使用針對心臟移植後慢性排斥之小鼠模型，評估投予抗小鼠IL－6受體之抗體(MR16－1)之慢性排斥反應抑制效果。移植60天後，摘出移植心臟的組織病理學分析結果顯示，為慢性排斥反應之病理學狀況特徵的心肌纖維化及血管狹窄病變，該MR16－1處理群組相較於對照群組顯著地被抑制。因此證明投予MR16－1具有抑制慢性排斥反應之效果。
因此本案發明人首次發現投予抗IL－6受體抗體會抑制器官移植後於該慢性期之排斥反應，並因而完成本發明。
更具體而言，本發明提供以下發明：[1]一種用於抑制慢性排斥反應之藥劑，包含一IL－6抑制劑作為有效成分。
[2]如[1]之用於抑制慢性排斥反應之藥劑，其中該IL－6抑制劑為一抗體，該抗體辨識一IL－6。
[3]如[1]之用於抑制慢性排斥反應之藥劑，其中該IL－6抑制劑為一抗體，該抗體辨識一IL－6受體。
[4]如[2]或[3]之用於抑制慢性排斥反應之藥劑，其中該抗體為一單株抗體。
[5]如[2]或[3]之用於抑制慢性排斥反應之藥劑，其中該抗體為一抗體，該抗體辨識一人類IL－6或人類IL－6受體。
[6]如[2]或[3]之用於抑制慢性排斥反應之藥劑，其中該抗體為一重組抗體。
[7]如[6]之用於抑制慢性排斥反應之藥劑，其中該抗體為一嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
[8]如[1]至[7]中任一項之用於抑制慢性排斥反應之藥劑，其中用於抑制心臟移植中的慢性排斥反應。
[9]一種用於抑制慢性排斥反應之方法，包含對於一個體投予一IL－6抑制劑之步驟。
[10]如[9]之用於抑制慢性排斥反應之方法，其中該IL－6抑制劑為一抗體，該抗體辨識一IL－6。
[11]如[9]之用於抑制慢性排斥反應之方法，其中該IL－6抑制劑為一抗體，該抗體辨識一IL－6受體。
[12]如[10]或[11]之用於抑制慢性排斥反應之方法，其中該抗體為一單株抗體。
[13]如[10]或[11]之用於抑制慢性排斥反應之方法，其中該抗體為一抗體，該抗體辨識一人類IL－6或人類IL－6受體。
[14]如[10]或[11]之用於抑制慢性排斥反應之方法， 其中該抗體為一重組抗體。
[15]如[14]之用於抑制慢性排斥反應之方法，其中該抗體為一嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
[16]如[9]至[15]中任一項之用於抑制慢性排斥反應之方法，其抑制心臟移植中之慢性排斥反應。
[17]一種IL－6抑制劑之用途，係生產用於抑制慢性排斥反應之藥劑。
[18]如[17]之IL－6抑制劑之用途，其中該IL－6抑制劑為一抗體，該抗體辨識一IL－6。
[19]如[17]之IL－6抑制劑之用途，其中該IL－6抑制劑為一抗體，該抗體辨識一IL－6受體。
[20]如[18]或[19]之IL－6抑制劑之用途，其中該抗體為一單株抗體。
[21]如[18]或[19]之IL－6抑制劑之用途，其中該抗體為一抗體，該抗體辨識一人類IL－6或人類IL－6受體。
[22]如[18]或[19]之IL－6抑制劑之用途，其中該抗體為一重組抗體。
[23]如[22]之IL－6抑制劑之用途，其中該抗體為一嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
[24]一種IL－6抑制劑，用於抑制慢性排斥反應。
本案發明人發現投予抗IL－6受體抗體能抑制慢性排斥反應。本發明係依據此等發現而完成。
本發明係關於用於抑制慢性排斥反應之藥劑，包含 IL－6抑制劑作為有效成分。
在此，“IL－6抑制劑”為阻斷IL－6－媒介之信號傳遞及抑制IL－6生物學活性之物質。較佳地，IL－6抑制劑為具有對抗結合IL－6、IL－6受體或gp130之抑制性功能的物質。
本發明之IL－6抑制劑包括但不限於例如：抗IL－8抗體、抗IL－6受體抗體、抗gp130抗體、IL－6變異體、可溶性IL－6受體變異體，及IL－6或IL－6受體之部分胜肽，及顯示類似活性之低分子量化合物及蛋白質(例如：C326 Avimer(Nature Biotechnology(2005)23,1556－61))。本發明之較佳IL－6抑制劑，包括辨識IL－6受體之抗體。
本發明中抗體來源不特別限制；然而，抗體較佳為衍生自哺乳動物，更佳地為衍生自人類。
用於本發明之抗IL－6抗體，可使用已知的方法，以多株或單株抗體形式得到。尤其，從哺乳動物衍生之單株抗體為用於本發明較佳之抗IL－6抗體。從哺乳動物衍生之單株抗體，包括從融合瘤產生者，及藉由遺傳工程方法從以包含抗體基因之表現載體轉形之寄主產生者。藉由結合於IL－6，該抗體抑制IL－6結合於IL－6受體並因而阻斷傳達IL－6生物學活性進入細胞。
此種抗體包括MH166(Matsuda,T.et al .,Eur.J.Immunol.(1988)18,951－956)、SK2抗體(Sato,K.et al .,transaction of the 21st Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology(1991)21,166)等。
基本上，產生抗IL－6抗體之融合瘤可使用已知的技術 製備如下：具體而言，此種融合瘤可藉由使用IL－6作為一敏感化抗原，以習知免疫方法施行免疫，將得到之免疫細胞與母細胞以習知細胞融合方法融合，並以習知篩選方法篩選單株抗體產生細胞以製備。
更具體而言，抗IL－6抗體可生產如下：例如，用於作為敏感化抗原以得到抗體之人類IL－6，可採用揭露於Eur.J.Biochem.(1987)168,543－550；J.Immunol.(1988)140,1534－1541；及/或Agr.Biol.Chem.(1990)54,2685－2688之IL－6基因及/或胺基酸序列得到。
將合有IL－6基因序列之已知表現載體系轉形一適當的寄主細胞後，使用已知的方法從寄主細胞內或培養上清純化所望IL－6蛋白質。該經純化的IL－6蛋白質可用於作為一敏感化抗原。或者，該IL－6蛋白質與其他蛋白質之融合蛋白質可用於作為一敏感化抗原。
此種抗體包括MR16－1抗體(Tamura,T.et al .,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90,11924－11928)；PM－1抗體(Hirata,Y.et al .,J.Immunol.(1989)143,2900－2906)；AUK12－20抗體、AUK64－7抗體及AUK146－15抗體(國際專利申請案公開號WO 92/19759)等。其中，PM－1抗體為較佳之對抗人類IL－6受體之單株抗體之例，MR16－1抗體作為對抗小鼠IL－6受體之較佳之單株抗體例。
用於本發明之抗IL6受體之抗體，可使用已知的方法以多株或單株抗體形式得到。尤其用於本發明之抗IL－6受體抗體較佳為從哺乳動物衍生之單株抗體。該從哺乳動物衍生之單株抗體，包括從融合瘤產生者，及藉由遺傳工程 方法從以包含抗體基因之表現載體轉形之寄主產生者。藉著結合於一IL－6受體，該抗體抑制IL－6結合於IL－6受體且因而阻斷傳達IL－6生物學活性進入細胞。
基本上，生產抗IL－6受體單株抗體之融合瘤可使用已知的技術製備如下：具體而言，此種融合瘤可使用IL－6受體作為敏感化抗原以使用習知免疫方法施行免疫，將得到之免疫細胞與母細胞以習知細胞融合方法融合，並以習知篩選方法篩選單株抗體產生細胞以製備。
更具體而言，抗IL－6受體抗體生產如下：例如，可使用揭露於歐洲專利申請案公開號EP 325474及日本專利申請案公開號(JP－A)H03－155795(未審查，已公開日本專利申請案)得到IL－6受體基因及/或胺基酸序列，作為一敏感化抗原以得到人類IL－6受體或小鼠IL－6受體之抗體。
有二種IL－6受體蛋白質：一種表現在細胞膜上，另一種與細胞膜分離(可溶性IL－6受體)(Yasukawa,K.et al .,J.Biochem.(1990)108,673－676)。該可溶性IL－6受體主要構成細胞膜結合IL－6受體之胞外區域，其與膜結合IL－6受體不同點在於缺乏穿膜區域或穿膜及胞內區域兩者。任意IL－6受體可採用為IL－6受體蛋白質，只要能使用於作為一敏感化抗原以生產本發明使用之抗IL－6受體抗體即可。
於經過以插入有IL－6受體基因序列之已知表現載體系轉形一適當的寄主細胞後，使用已知的方法從寄主細胞內或培養上清純化所望IL－6受體蛋白質。該經純化的IL－6受體蛋白質可用於作為一敏感化抗原。或者，表現該IL－6 受體或該IL－6受體蛋白質與其他蛋白質之融合蛋白質的細胞，可用於作為一敏感化抗原。
用於本發明之抗gp130抗體可使用已知的方法以多株或單株抗體形式得到。尤其用於本發明之抗gp130抗體較佳為從哺乳動物衍生之單株抗體。哺乳動物衍生之單株抗體，包括從融合瘤產生者，及藉由遺傳工程方法從以包含抗體基因之表現載體轉形之寄主產生者。藉由結合於gp130，該抗體抑制gp130結合於該IL－6/IL－6受體複合體且因而阻斷電傳達IL－6生物學活性進入細胞。
此種抗體包括AM64抗體(JP－A(公開)H03－219894)、4B11抗體及2H4抗體(US 5571513)、B－S12抗體及B－P8抗體(JP－A(公開)H08－291199)等。
基本上，產生抗gp130單株抗體之融合瘤可使用已知的技術製備如下：具體而言，此種融合瘤可使用gp130作為敏感化抗原以使用習知免疫方法施行免疫，將得到之免疫細胞與母細胞以習知細胞融合方法融合，並以習知篩選方法篩選單株抗體產生細胞以製備。
更具體而言，單株抗體可生產如下：例如，可使用揭露於歐洲專利申請案公開號EP411946之gp130基因及/或胺基酸序列得到用於作為一敏感化抗原以得到抗體之gp130。
於經過以插入有gp130基因序列之已知表現載體系轉形一適當的寄主細胞後，使用已知的方法從寄主細胞內或培養上清純化所望gp130蛋白質。該經純化之gp130蛋白質可用於作為一敏感化抗原。或者表現gp130或gp130蛋 白質與其他蛋白質之融合蛋白質的細胞，可用於作為一敏感化抗原。
以敏感化抗原免疫之哺乳動物，不特別限定，較佳為考慮與用於細胞融合之母細胞的相容性而選擇。一般，使用囓齒類，例如小鼠、大鼠及倉鼠。
將動物依照已知方法以敏感化抗原免疫。例如，一般方法，為將動物以腹腔內或皮下注射敏感化抗原進行免疫。具體而言，敏感化抗原較佳地為經稀釋或懸浮於適當量的磷酸鹽緩衝液(PBS)、生理鹽液等，與適當量一般佐劑混合(例如Freund氏完全佐劑)，乳化然後對於一哺乳動物投予數次，間隔為每4至21天。此外，可將適當的擔體與敏感化抗原一起免疫。
此種免疫後，確認抗體在血清中的水平上升，然後從該哺乳動物得到免疫細胞以進行細胞融合。較佳之細胞融合用免疫細胞，包括尤其是脾臟細胞。
作為母細胞之哺乳動物骨髓瘤細胞，即用於和上述免疫細胞融合之搭檔細胞，包括各種已知細胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney,J.F.et al .,J.Immunol(1979)123,1548－1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1－7)、NS－1(Kohler,G.andMilstein,C.,Eur.J.Immunol.(1976)6,511－519)、MPC－11(Margulies,D.H.et al .,Cell (1976)8,405－415)、SP2/0(Shulman,M.et al .,Nature (1978)276,269－270)、F0(de St.Groth,S.F.et al .,J.Immunol.Method(1980)35,1－21)、S194(Trowbridge, I.S.,J.Exp.Med.(1978)148,313－323)、R210(Galfre,G.et al .,Nature(1979)277,131－133)等。
基本上，前述免疫細胞及骨髓瘤細胞之細胞融合，可使用已知的方法實施，例如Milstein等人之方法(Kohler,G.and Milstein,C.,Method Enzymol.(1981)73,3－46)等。
更具體而言，前述細胞融合係於存在細胞融合增進藥劑之下，於一般營養培養基中達成。例如，聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等用作融合增進藥劑。再者，為增進融合效率，可視需要添加輔助藥劑例如二甲基亞碸。
所使用免疫細胞對骨髓瘤細胞之比例，較佳地為例如每個骨髓瘤細胞1至10個免疫細胞。用於前述細胞融合之培養基，例如RPMI1640或MEM培養基，適於前述骨髓瘤細胞增生。一般用於此類型細胞之培養基也可使用。再者，可一併使用血清補充物，例如胎牛血清(FCS)。
為了細胞融合，關注的融合細胞(融合瘤)係藉由將預定量之前述免疫細胞及骨髓瘤細胞於前述培養基中混合，然後添加並混合預熱至約37℃之濃度30%至60%(w/v)PEG溶液(例如平均 分子量約1,000至6,000之PEG溶液)。然後，利用反複添加適當培養基將不適於融合瘤生長之細胞融合藥劑等移除，然後以離心移除上清。
上述融合瘤係藉由將細胞培養在一般選擇培養基中以選擇，例如HAT培養基(含次黃嘌呤、氨基喋呤及胸線嘧啶之培養基)。於HAT培養基培養持續－充分的期間，通常為數天至數週，以殺死關注的融合瘤以外的細胞(未融合細 胞)。然後，實施標準極限稀釋方法以篩選及選殖生產關注抗體之融合瘤。
除了用於以抗原免疫非人類動物來獲取前述融合瘤之方法，具有結合於一所望抗原或抗原表現細胞之活性的所望人類抗體，可藉由在體外以 所望抗原蛋白質或抗原表現細胞敏感化人類淋巴球(例如U266)，並融合此B淋巴球及人類骨髓瘤細胞而得到(參見日本專利申請案公告公開案(JP－B)H01－59878(未審查，已核准日本專利申請案公開持異議中))。再者，所望人類抗體可藉由投予一抗原或抗原表現細胞給一基因轉殖動物，該基因轉殖動物具人類抗體基因全部曲目(repertoire)，再依照前述方法以得到(參見國際專利申請案公開號WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096及WO 96/33735)。
所製備之產生單株抗體之融合瘤，可次培養於習知培養基，並保存在液態氮中一段長時間。
當從前述融合瘤得到單株抗體，可採用以下方法：(1)依照習知方法培養融合瘤，並從培養上清得到抗體；(2)藉由將融合瘤投予給可相容的哺乳動物使增生，並從腹水得到抗體；等。前面的方法於以高純度得到抗體時較佳，後面的方法於大量抗體生產時較佳。
例如，產生抗IL－6受體抗體之融合瘤可由揭露在JP－A(公開)H03－139293之方法製備。此種融合瘤可藉由注射PM－1抗體產生融合瘤進入BALB/c小鼠之腹腔，得到腹水，然後從此腹水純化PM－1抗體；或將此融合瘤培養在適當的培養基(例如，RPM11640培養基，含10%胎牛血清及 5% BM－Condimed H1(Boehringer Mannheim)；融合瘤SFM培養基(GIBCO－BRL)；PFHM－II培養基(GIBCO－BRL)等)，然後從此培養上清得到PM－1抗體。
重組抗體可用為本發明之單株抗體，其中該抗體使用基因重組技術，從融合瘤選殖抗體基因，將此基因插入於適當載體，然後將該載體引入一寄主(參見例如Borrebaeck,C.A.K.and Larrick,J.W.,Therapeutic Monoclonal Antibodies,published in the United Kingdom by Macmillan Publishers Ltd,1990)。
更具體而言，將編碼為抗體可變(V)區域之mRNA從生產關注抗體的細胞例如融合瘤離析，可依照已知方法，例如胍超離心方法(Chirgwin,J.M.et al .,Biochemistry(1979)18,5294－5299)及AGPC方法(Chomczynski,P.et al .,Anal.Biochem.(1987)162,156－159)，製備總RNA來離析mRNA，並使用mRNA純化套組(Pharmacia)等製備mRNA。或者，可使用QuickPrep mRNA純化套組(Pharmacia)直接製備mRNA。
抗體V區域之cDNA係使用反轉錄酶從得到之mRNA合成。cDNA可使用AMV反轉錄酶第1股cDNA合成套組等合成。再者，為合成及放大cDNA，可使用5’－Ampli FINDER RACE套組(Clontech)採用5’－RACE方法(Frohman,M.A.et aｌ .,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,8998－9002；Belyavsky,A.et al .,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919－2932)及PCR。從所得到之PCR產物純化關注的DNA片段，並與載體DNA連接。然後，使用上述DNA 製備重組載體，並導入於Escherichia coli (E.coli )等，然後選擇其菌落以製備所望重組載體。以例如雙去氧(dideoxy)方法確認關注的DNA的核苷酸序列。
當得到編碼為關注抗體的V區域的DNA，將此DNA連接於編碼為所望抗體不變區域(C區域)之DNA，並插入至一表現載體。或者，可將編碼為抗體V區域之DNA插入於包含抗體C區域之DNA的表現載體。
為了生產用於本發明之抗體，如下所述，將抗體基因插入於一表現載體，以使其在表現調節區域，例如增強子及啟動子之控制下表現。然後，可藉由將一寄主細胞以此表現載體轉形以表現此抗體。
於本發明，為了域少對抗人類等之異抗原性(heteroantigenicity)，可使用人工修飾之遺傳重組抗體，例如嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。此等經修飾抗體可使用已知的方法製備。
嵌合抗體可藉由將如上得到之編碼為抗體V區域之DNA與編碼為人類抗體C區域之DNA連接，然後將此DNA插入至表現載體中，並將此表現載體引入寄主來生產得到(參見歐洲專利申請案公開號EP 125023；國際專利申請案公開號WO 92/19759)。此已知方法可用於獲得對本發明有用的嵌合抗體。
人類化抗體亦稱為改造(reshaped)人類抗體，且抗體中，來自於哺乳動物而非為人類(例如 小鼠抗體)之抗體互補決定區域(CDR)，被傳送到人類抗體之CDR。一般用於此基因重組之方法亦為已知(參見歐洲專利申請案公開號EP 125023、國際專利申請案公開號WO 92/19759)。
更具體而言，使小鼠抗體之CDR與入類抗體之框架區域(FR)連接之設計DNA序列，係以PCR從數種生產寡核苷酸合成以在其未端含有重疊部分。將所得之DNA與人類抗體C區域編碼之DNA連接，然後插入表現載體。將此表現載體引入一寄主，以生產該人類化抗體(參見歐洲專利申請案公開號EP 239400、國際專利申請案公開號WO 92/19759)。
與經由CDR連接之人類抗體FR之選擇，係使CDR能形成適當的抗原結合部位。抗體可變區域之FR中的胺基酸可視需要取代，以使得改造人類抗體之CDR形成適當的抗原結合部位(Sato,K.et al .,Cancer Res.(1993)53,851－856)。
人類抗體C區域係用於嵌合抗體及人類化抗體，包括C γ。例如，可使用C γ 1、C γ 2、C γ 3或C γ 4。再者，為改進抗體或其生產安定性，可修飾人類抗體C區域。
嵌合抗體包括：衍生自非人類哺乳動物之抗體可變區域，及衍生自人類之抗體不變區域；人類化抗體包括：衍生自非人類哺乳動物之抗體CDR，及衍生自人類之抗體框架區域及不變區域。兩者於人體均具減小的抗原性，且對於用在本發明之抗體為有用。
用於本發明之人類化抗體較佳具體例，包括人類化PM－1抗體(參見國際專利申請案公開號WO 92/19759)。
再者，除了前述用於得到人類抗體之方法，使用人類抗體庫以淘選(panning)得到人類抗體之技術亦為已知。例 如人類抗體之可變區域，可使用噬菌體表現方法表現在噬菌體表現成為單鏈抗體(scFv)，然後選擇抗原結合之噬菌體。藉由分析所選擇之噬菌體的基因，可決定編碼為結合於該抗原之人類抗體可變區域之DNA序列。一旦找出結合於該抗原之scFv之DNA序列，可以構建包含此序列之適當表現載體以得一人類抗體。此方法為已知，且可使用WO 92/01047、WO 92/20791、WO93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438及WO 95/15388出版物作為參考。
上述構建之抗體基因可依照習知方法表現。當使用哺乳動物細胞，可以表現抗體基因，即，使用一DNA或包含此DNA之載體表現，其中欲表現之抗體基因功能性連接於一有用的普通使用的啟動子及在抗體基因下游之poly A信號。啟動子/增強子之例，包括人類巨細胞病毒迅早期啟動子/增強子。
再者，可使用其他啟動子/增強子來表現本發明使用之抗體，包括來自於反轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猴病毒40(SV40)等之病毒性啟動子/增強子；並包括哺乳動物細胞衍生之啟動子/增強子例如人類延長因子1 α(HEF1 α)。
例如，當使用SV40啟動子/增強子，可依照以下Mulligan等人之方法 (Mulligan,R.C.et al .,Nature(1979)277,108－114)而輕易地實施表現。或者，於該HEF1 α啟動子/增強子之情形，可使用Mizushima等人(Mizushima,S.and Nagata S.,Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)之方法。
當使用E.coli ，可藉由功能性連接習知啟動子、用於抗體分泌之信號序列及欲表現之抗體基因，來表現抗體基因。啟動子之例，包括：lacZ啟動子、araB啟動子等。當使用lacZ啟動子，可依照Ward等人 之方法(Ward,E.S.et al .,Nature(1989)341,544－546；Ward,E.S.et al .,FASEB J.(1992)6,2422－2427)表現基因；且可依照Better等人 之方法(Better,M.et al .,Science(1988)240,1041－1043)表現araB啟動子。
當抗體生產於E.coli 細胞質，可使用pel B信號序列(Lei,S.P.et al .,J.Bacteriol.(1987)169,4379－4383)作為一信號序列以供抗體分泌。將生產進入細胞質之抗體離析，然後適當地重新折疊抗體結構後使用(參見例如WO 96/30394)。
至於複製起點，可使用衍生自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳突瘤病毒(BPV)等者。此外，為了增進寄主細胞系中之基因副本數，該表現載體可包含胺基葡糖苷磷酸轉移酶(aminoglycoside phosphotransferase)(APH)基因、胸腺嘧啶激酶(TK)基因、E.coli 黃嘌呤－鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等，作為選擇標記。
用於本發明之抗體可使用任意生產系以製備。用於抗體製備之生產系，包括體外及體內生產系。體外 生產系包括使用真核細胞或原核細胞。
使用真核細胞之生產系，包括使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞。此種動物細胞包括(1)哺乳類細胞，例如： CHO、COS、骨髓瘤、幼倉鼠腎(BHK)、HeLa、Vero等；(2)兩生類細胞，例如：蟾蜍(Xenopus )卵母細胞；及(3)昆蟲細胞，例如：sf9、sf21、Tn5等。已知植物細胞包括衍生自菸草(Nicotiana tabacum )之細胞，可培養成為癒合組織。已知真菌細胞，包括酵母菌，例如Saccharomyces (例如S.cerevisiae )、黴菌，例如麴菌(Aspergillus )(例如黑麴菌(A.niger ))等。
使用原核細胞之生產系，包括使用細菌細胞。已知之細菌細胞包括E.coli 及枯草芽孢桿菌(Bacillus subti1is )。
抗體可藉由使用轉形引入關注的抗體基因到此等細胞，然後於體外 培養此經轉形細胞以得到。培養依照已知方法實施。例如，可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作為培養基，並可合併使用血清補充物，例如FCS。再者，引入有抗體基因之細胞可傳送進動物之腹腔內等以於體內生產抗體。
另一方面，體內生產系包括使用動物或植物者。使用動物之生產系包括使用哺乳動物或昆蟲者。
可使用之哺乳動物包括山羊、豬、羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications,1993)。再者，可使用之昆蟲，包括蠶。當使用植物，例如可使用菸草。
將一抗體基因引入此等動物或植物，於動物或植物體內生產該抗體，然後回收此抗體。例如，可藉由將抗體基因插入編碼為一蛋白質例如山羊β酪蛋白之基因中，製備 成融合基因，而獨特地於奶汁中生產。包含此融合基因之DNA片段，此融合基因包括此抗體基因，被注射到山羊胚胎中，將此胚胎引入雌山羊。於接受此胚胎之山羊所生下的基因轉殖動物或此等動物之後代生產的奶汁可得所望抗體。可給予該基因轉殖山羊荷爾蒙以增加其生產含所望抗體之乳汁量(Ebert,K.M.et al .,Bio/Technology(1994)12,699－702)。
當使用蠶，將蠶以插入有所望抗體基因之桿狀病毒感染，並從蠶之體液得到所望抗體(Maeda,S.et al .,Nature(1985)315,592－594)。再者，當使用菸草，所望抗體基因被插入於植物表現載體(例如 pMON530)，且將此載體導入於細菌，例如根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens )。此菌被用於感染菸草(例如Nicotiana tabacum )以使能從此菸草之葉片得到所望抗體(Julian,K.－C.Maet al .,Eur.J.Immunol.(1994)24,131－138)。
當使用體外或體內生產系生產抗體，如上所述，可將編碼為抗體重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)之DNA插入分開的表現載體，然後將一寄主以此等載體共同轉形。或者，可將DNA插入單一表現載體以供將寄主轉形(參見國際專利申請案公開號WO 94/11523)。
用於本發明之抗體可為抗體片段或其修飾產物，只要能適用於本發明即可。例如，抗體片段包括Fab、F(ab’)2、Fv及單鏈Fv(scFv)，其中H及L鏈之Fv，經由適當的連接子連接。
具體而言，該抗體片段藉由以酵素處理抗體生產，酵 素例如：木瓜酵素或胰蛋白酶，或者構建編碼為此等片段的基因，導入表現載體中，並於適當的寄主細胞中表現以生產(參見例如，Co,M.S.et al .,J.Immunol.(1994)152,2968－2976；Better,M.& Horwitz,A.H.,Methods in Enzymology(1989)178,476－496；Plueckthun,A.& Skerra,A.,Methods in Enzymology(1989)178,497－515；Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989)121,652－663；Rousseaux,J.et al .,Methods in Enzymology(1989)121,663－666；Bird,R.E.et al .,TIBTECH(1991)9,132－137)。
scFv可藉由將抗體之H鏈V區域及L鏈V區域連接而得到。於該scFv，H鏈V區域及L鏈V區域係經由連接子連接，較佳地為經由胜肽連接子連接(Huston,J.S.et al .,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,5879－5883)。scFv中之H及L鏈之V區域，可衍生自任一上述抗體。用於連接V區域之胜肽連結子，包括例如：任何由12至19個胺基酸殘基所構成之單鏈胜肽。
scFv編碼DNA可使用編碼上述抗體H鏈或V區域之DNA及編碼為L鏈或V區域之DNA作為模板，使用PCR將該模板序列中編碼為所望胺基酸序列之DNA部分放大，並使用定義該部分末端之引子，然後以編碼為一放大胜肽連接子部分之DNA和連接該連接子兩端至H鏈及L鏈之引子配對，將該經放大之DNA部分進一步放大。
一旦得到scFv編碼DNA，可依照習知方法得到包含該DNA之表現載體，及經以該載體轉形之寄主。此外，可使 用該寄主依照習知方法得到scFv。
如上所述，此等抗體片段可從該寄主得到及藉由表現其基因而生產。在此，“抗體”包含此抗體片段。
與各種分子例如聚乙二醇(PEG)結合之抗體，亦可作為經修飾的抗體。在此，‘‘抗體”包含此種經修飾的抗體。此等經修飾的抗體可藉由將所得之抗體以化學性修飾得到。此方法於該技術領域中已經建立。
如上所生產及表現的抗體，可從細胞內或外或寄主離析，並且純化成同質的。用於本發明之抗體可使用親和層析離析及/或純化。用於親和層析之管柱，包括例如：蛋白質A管柱及蛋白質G管柱。用於蛋白質A管柱之擔體，包括例如：HyperD、POPOS、Sepharose FF等。除此以外，可使用其他用於離析及/或純化普通蛋白質之方法，且不限任何形式。
例如，用於本發明之抗體可藉由適當選擇及組合親和層析、過濾、超過濾、鹽析、透析等以外之層析方法而離析及/或純化。層析包括例如：離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾等。此等層析可應用於高效能液體層析(HPLC)。或者，可使用逆相HPLC。
如上得到之抗體的濃度，可利用吸附測量ELISA等決定。具體而言，藉由適當地將抗體溶液以PBS(－)稀釋，測量於280nm之吸光值，並計算濃度(1.35 OD＝1mg/ml)而決定吸光值。或者，當使用ELISA，量測可如下實施：具體而言，將以0.1M重碳酸鹽緩衝液(pH9.6)稀釋成1 μ g/ml之山羊抗人類IgG(TAG)100 μ l，添加至96井盤(Nunc)並 於4℃溫育隔夜以將抗體固定化。阻斷(blocking)之後，添加本發明抗體經適當地稀釋之抗體100 μ l或包含此抗體之適當地經稀釋的樣本，以及人類IgG(CAPPEL)，作為標準，並於室溫溫育1小時。
清洗後，添加5,000倍稀釋之鹼性磷解酶標定之抗人類IgG(BIO SOURCE)100 μ l並於室溫溫育1小時。再清洗之後，添加受質溶液並溫育，使用微平盤讀取儀3550型(Bio－Rad)測量405nm之吸光值，以計算關注抗體之濃度。
用於本發明之IL－6變異體，為具結合至IL－6受體之活性的物質，且不傳達IL－6生物學活性。亦即該IL－6變異體與IL－6競爭結合於IL－6受體，但不傳達IL－6生物學活性，因此其阻斷IL－6－媒介之信號傳遞。
該IL－6變異體係藉由在IL－6胺基酸序列進行取代而引入突變。作為該IL－6變異體主體之IL－6來源不限，但考量抗原性等，較佳為人類IL－6。
更具體而言，胺基酸取代係藉由使用已知的分子模型化程式(例如 WHATIF；Vriendet al .,J.Mol.Graphics (1990)8,52－56)預測IL－6胺基酸序列之2級結構，然後評量經取代之胺基酸殘基在整個分子之影響。於決定欲取代之適當的胺基酸殘基後，使用一編碼為人類IL－6基因之核苷酸序列作為模板實施普通實行的PCR方法，並且引入突變以造成胺基酸取代，以得編碼為IL－6變異體之基因。視需要，將此基因插入於一適當的表現載體，並適用前述方法以表現、生產、純化重組抗體而得該IL－6變異體。
該IL－6變異體之具體例揭露於Brakenhoffet al .,J. Biol.Chem.(1994)269,86－93,Savinoet al ,EMBO J.(1994)13,1357－1367、WO 96/18648及WO 96/17869。
用於本發明之IL－6之部分胜肽及IL－6受體之部分胜肽為具各結合於IL－6受體及IL－6之活性的物質且不傳達IL－6生物學活性之物質。亦即，藉由結合及捕捉IL－6受體或IL－6，該IL－6部分胜肽或IL－6受體部分胜肽能具體而言抑制IL－6結合於IL－6受體。結果，不傳達IL－6之生物學活性，且阻斷IL－6－媒介之信號傳遞。
IL－6或IL－6受體之部分胜肽為包含IL－6或IL－6受體胺基酸序列胜肽之區域之部分或全部胺基酸序列之胜肽，其涉及在IL－6及IL－6受體間的結合。此種胜肽通常包含10至80，較佳為20至50，更佳為20至40個胺基酸殘基。
該IL－6部分胜肽或IL－6受體部分胜肽可依照一般已知的方法生產，例如遺傳工程技術或胜肽合成方法，藉由將涉及IL－6及IL－6受體間結合之IL－6或IL－6受體胺基酸序列區域特定，並使用該經特定區域之部分或完整胺基酸序列以生產。
當使用遺傳工程方法製備IL－6部分胜肽或IL－6受體部分胜肽，係將編碼胜肽之DNA序列插入於一表現載體，然後藉由上述方法表現、生產並純化重組抗體以得該胜肽。
當使用胜肽合成方法生產IL－6部分胜肽或IL－6受體部分胜肽，可使用一般使用的胜肽合成方法，例如固相合成方法或液相合成方法。
具體而言，可依照敘述於“Continuation of Development of Pharmaceuticals,Vol.14,Peptide Synthesis(日文)(ed.Haruaki Yajima,1991,Hirokawa Shoten)”之方法合成該等胜肽。作為一固相合成方法，例如可採以下方法：將對應於欲合成之胜肽C末端胺基酸結合於一不溶於有機溶劑之支持體上，然後藉由交替地重複：(1)以C端－往N－末端方向逐一地進行胺基酸縮合反應，其中該胺基酸之α－胺基及支鏈官能基以適當的保護基保護；及(2)從樹脂結合之胺基酸或胜肽之α－胺基移除保護基之反應。固相胜肽合成，視使用之保護基類型大致分類為Boc方法及Fmoc方法。
以上述方式合成蛋白質後，進行脫保護反應，然後將胜肽股從支持體上切出。針對胜肽股切出反應，一般而言，Boc方法使用氟化氫或二氟甲烷磺酸，且Fmoc方法一般使用TFA。Boc方法，例如於苯甲醚存在下，使上述經保護之胜肽樹脂以氟化氫處理。然後，利用移除該等保護基並從支持體上切出該胜肽以回收胜肽。藉由將回收的胜肽冷凍乾燥；可得粗製胜肽。另一方面，Fmoc方法可使用類似於例如上述方法，於TFA進行脫保護反應及從支持體切出胜肽股之反應。
得到之粗製胜肽可藉由HPLC分離及/或純化。可於最佳化條件下，使用一般用於蛋白質純化之水－乙腈溶劑系進行洗提。收集對應於所得層析譜之峰部的洗提份並冷凍乾燥。將因此純化之胜肽以質譜分析、胺基酸組成分析、胺基酸序列分析等的分子量分析鑑別。
IL－6部分胜肽及IL－6受體部分胜肽之具體例，揭示 於JP－A(公開)H02－188600、JP－A(公開)H07－324097、JP－A(公開)H08－311098，及美國專利公開號US 5210075。
用於本發明之抗體更可為結合於各種分子例如聚乙二醇(PEG)、放射性物質及毒性之結合抗體。此種結合抗體可藉由化學修飾該所得抗體以得到。修飾抗體之方法於該技術領域已建立。本發明之“抗體”包含該等結合抗體。
本發明之用於抑制慢性排斥反應藥劑，包含IL－6抑制劑作為有效成分，可用於治療慢性排斥反應。本發明尚提供用於抑制心臟移植之慢性排斥反應的藥劑，包含IL－6抑制劑作為有效成分。
本發明之抑制藥劑所抑制之排斥反應，較佳為慢性排斥反應，慢性排斥反應在實際移植醫學上為一重要問題。慢性排斥反應之特徵為血管內膜增厚及組織間隙纖維化，而在移植一年後變成問題且影響接受者長期預後。該慢性排斥反應即便在急性排斥反應已於臨床上克服後，仍會逐漸地進展。
本案發明人先前曾發現IL－6抑制劑於心臟移植後急性排斥之小鼠模型的治療效果(WO2007/058194)。急性排斥反應之病理情況的機制，主要由細胞毒性T細胞所媒介，被認為與慢性排斥反應之機制不同。啟示慢性排斥反應不同於急性排斥反應之具體證據如下：(1)慢性排斥反應為與細胞生長有關之特定病理情況，例如組織間隙纖維化，及因為被移植的器官之管腔組織之內膜增厚導致內腔狹窄；(2)慢性排斥反應之開始(onset)無法由抑制急性排斥 反應有效之習知免疫抑制療法所抑制；(3)該慢性排斥反應為即便臨床上已克服急性排斥後仍潛伏進展的免疫反應，以及(4)該慢性排斥反應之發生有風險因子
(1)已知血管內皮受傷所致血管平滑肌細胞生長而伴隨的血管狹窄病變(stenotic lesion)，為慢性排斥反應之組織學病理特徵。此種血管狹窄病變亦稱為移植後血管病變或移植後動脈硬化。此等會減少被移植的器官中的血液流，造成循環病症，而且被移植的器官停止作用。因此，血管狹窄病變於慢性階段為一嚴重併發症而成為問題。被移植器官中之血管損害成因，包括缺血－再灌流病症、氧化性壓迫，及移植手術中之急性排斥反應。因此，由於抑制急性排斥反應及維持於該急性期之器官的技術進展，在慢性排斥反應抑制方面已有一些成功的結果。然而，並沒有明確的預防方法。此外，(2)並沒有對於慢性排斥反應有效之已建立的免疫抑制療法。(3)潛伏性進展的排斥反應，包括延長由同族抗體(isoantibody)所媒介之體液免疫，及延長由巨噬體滲透及各種細胞介素媒介之各種細胞性免疫。(4)已知有許多風險因子涉及該慢性排斥反應，包括免疫抑制劑之副作用、遺傳因子、移植後感染(巨細胞病毒等)，及抗體沉澱於組織中，及接受者之動脈硬化之常見風險因子(糖尿病、高脂血症、高血壓等)。因此被移植的器官之官能障礙被認為係各種因子複雜的參與而發生。
於本發明，“移植後之抑制慢性排斥反應”係指抑制與慢性排斥反應相關連的上述各種症狀，例如組織間隙纖 維化及由於被移植器官中之管腔組織的內膜增厚所導致之內腔狹窄。
本發明之抑制藥劑可適用之器官移植類型不特別限定，於本發明中，器官移植較佳之器官，包括：器質性(parenchymal)器官，例如心臟、肝臟、腎臟、胰臟、肺臟，及小腸。本發明亦可應用於移植組織，例如：心臟瓣膜、血管、皮膚、骨骼及角膜。
於本發明，IL－6抑制劑抑制傳遞IL－6信號之活性可藉由習知方法評估。具體而言，將IL－6添加到IL－6－依存性人類骨髓瘤細胞株(S6B45及KPMM2)、人類Lennert T淋巴瘤細胞株KT3或IL－6－依存性細胞株MH60.BSF2培養物；並於IL－6抑制劑存在下，測定IL－6－依存性細胞所攝取之3 H－胸腺嘧啶。或者，培養IL－6受體表現U266細胞，並且同時將經125 I標定之IL－6及IL－6抑制劑添加至培養物中；然後定量結合於IL－6受體表現細胞之125 I標定之IL－6。除了IL－6抑制劑群組，於上述分析系中包括不含IL－6抑制劑之負對照群組。IL－6抑制劑抑制IL－6之活性，可藉由比較兩群的結果來評估。
再者，對於是否移植後排斥反應受到抑制，可評量如下：於器官移植，當移植物存活結果改善，亦可假定已達成“抑制移植損害”。移植物存活可依據是否移植後器官正常作用來評量。
於以下所述實施例中，證明心臟移植中之慢性排斥反應藉由投予一抗IL－6受體抗體而抑制。此啟示IL－6抑制劑例如抗IL－6受體抗體在作為抑制慢性排斥反應之藥劑 為有用。
被投予本發明抑制藥劑之個體為哺乳動物。該等哺乳動物較佳為人類。
本發明之抑制藥劑可以藥物形式投予，且可經口服或非口服全身性或局部投予。例如可選擇靜脈內注射，例如點滴輸液、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射、栓劑、灌腸劑、口服腸溶錠等。適當的投予方法可視病患年齡及症狀選擇。每次投予的有效劑量擇自範圍0.01至100mg/kg體重。或者，該劑量可從1至1000mg/病患，較佳從5至50mg/病患中選擇。較佳之劑量及投予方法如下：例如，當使用一抗IL－6受體抗體，有效劑量為使游離抗體存在於血液中。具體而言，將劑量0.5至40mg/kg體重/月(4週)，較佳為1至20mg/kg體重/月，以每月1至數次，例如1週2次、1週1次、2週1次或每4週1次，經由靜脈內注射，例如點滴輸液、皮下注射等投予。投予排程可藉由延長投予1週2次或1週1次之間隔為每2週1次、每3週1次或每4週1次來調整，同時監控移植後的情形以及血液測試值。
於本發明，抑制藥劑可包含製藥上可接受的擔體，例如保存劑及安定劑。“製藥上可接受的擔體”意指可與上述藥劑一起投予之材料；且本身會或不會產生上述抑制慢性排斥反應之效果。或者，該等擔體可為不具抑制慢性排斥反應之效果，但當與IL－6抑制劑合併使用，會產生額外或共效之安定效果之材料。
此種製藥上可接受之材料包括例如：無菌水、生理鹽 液、安定劑、賦形劑、緩衝液、保存劑、界面活性劑、螯合藥劑(EDTA等)及黏結劑。
於本發明，界面活性劑包括非離子性界面活性劑，此種界面活性劑之典型例包括山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如山梨糖醇酐單辛酸酯、山梨糖醇酐單月桂酸酯及山梨糖醇酐單棕櫚酸酯；甘油脂肪酸酯例如，甘油單辛酸酯、甘油單肉豆蔻酸酯及甘油單硬脂酯；聚甘油脂肪酸酯，例如十甘油單硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸酯及十甘油單亞麻油酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單棕櫚酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯，及聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，例如聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯及聚氧乙烯山梨醇四油酸酯；聚氧乙烯甘油脂肪酸酯，例如聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯；聚乙二醇脂肪酸酯，例如聚乙二醇二硬脂酸酯；聚氧乙烯烷基醚，例如聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚，例如聚氧乙烯聚氧丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚，及聚氧乙烯聚氧丙烯鯨蠟醚；聚氧乙烯烷基苯醚，例如聚氧乙烯壬基苯醚；聚氧乙烯硬化篦麻油，例如聚氧乙烯篦麻油及聚氧乙烯硬化篦麻油(聚氧乙烯氫化篦麻油)；聚氧乙烯蜂蠟衍生物，例如聚氧乙烯山梨醇蜂蠟；聚氧乙烯羊毛脂衍生物，例如聚氧乙烯羊毛脂；及HLB為6至18之聚氧乙烯脂肪醯胺等，例如聚氧乙烯硬脂醯胺。
界面活性劑尚包括陰離子界面活性劑，此種界面活性 劑之典型例包括例如：具10至18個碳原子之烷基的烷基硫酸鹽，例如鯨蠟基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉，及油基硫酸鈉；聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽，其中該烷基具10至18個碳原子，且加成之氧化乙烯的平均莫耳數為2至4，例如聚氧乙烯月桂基硫酸鈉；具8至18個碳原子之烷基的烷基磺琥珀酸酯鹽，例如月桂基磺琥珀酸酯鈉鹽；天然界面活性劑，例如卵磷脂；甘油磷脂；鞘磷脂(sphingophospholipid)，例如神經鞘磷脂；及蔗糖脂肪酸酯，其中該脂肪酸具12至18個碳原子。
上述界面活性劑中的1或2個以上，可以合併並添加於本發明之藥劑。製備本發明之較佳界面活性劑，包括聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如聚山梨糖醇酯(polysorbate)20、40、60及80。聚山梨糖醇酯20及80尤佳。聚氧乙烯聚氧丙烯二醇，例如poloxamer(Pluronic F－68等)亦為較佳。
添加之界面活性劑量視使用之界面活性劑而不同。當使用聚山梨糖醇酯20或80，一般量為0.001至100mg/ml之範圍，較佳範圍為0.003至50mg/ml，更佳範圍為0.005至2mg/ml。
於本發明，緩衝液包括：磷酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液、乙酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸鉀、葡萄糖酸、癸酸、去氧膽酸、水楊酸、三乙醇胺、富馬酸，及其他有機酸；及碳酸緩衝液、Tris緩衝液、組胺酸緩衝液，及咪唑緩衝液。
液體製備物，可藉由將藥劑溶於該液體製備領域中已 知之水性緩衝液而製備。緩衝液濃度一般範圍為1至500mM，較佳範圍為5至100mM，更佳範圍為10至20mM。
本發明之藥劑更可包含其他低分子量多胜肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠及免疫球蛋白；胺基酸；糖及碳水化合物，如多糖及單糖、糖醇等。
在此，胺基酸包括鹼性胺基酸，例如：精胺酸、離胺酸、組胺酸及鳥胺酸，及此等胺基酸之無機鹽(較佳為盤酸鹽及磷酸鹽，亦即磷酸鹽胺基酸)。當使用游離胺基酸，可將pH藉由適當生理可接受之緩衝物質調整至較佳值，該緩衝物質例如無機酸，尤其是鹽酸、磷酸、乙酸及甲酸及其鹽。於此情形，使用磷酸鹽因為能提供相當穩定的凍乾產物，為特別適當。磷酸鹽當製備物實質上不含有機酸，例蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸及富馬酸時，或不含對應陰離子(蘋果酸根、酒石酸根、檸檬酸根、琥珀酸根及富'馬酸根等)時，尤其有利。較佳之胺基酸為精胺酸、離胺酸、組胺酸及鳥胺酸。亦可使用酸性胺基酸，例如，麩胺酸及天冬胺酸，及其鹽(較佳為鈉鹽)；中性胺基酸，例如異白胺酸、白胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸及丙胺酸；及芳香族胺基酸，例如苯基丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及其衍生物，N－乙醯基色胺酸。
在此，糖及碳水化合物，例如多糖及單糖包括例如；葡聚糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖及棉子糖。
在此，糖醇包括例如：甘露醇、山梨醇及肌醇。
當本發明之藥劑製備成注射用水性溶液，可將藥劑與 例如含葡萄糖或其他輔助藥劑(例，D－山梨醇、D－甘露糖、D－甘露醇及氯化鈉)之生理鹽液及/或等張溶液混合。該水性溶液可與適當的溶解化藥劑例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)或非離子性界面活性劑(聚山梨醇酯80及HCO－50)一起使用。
該藥劑視需要更可包含：稀釋劑、溶解化劑、pH調整劑、鎮靜劑、含硫還原劑、抗氧化劑等。
在此，含硫還原劑。包括例如含巰基之化合物，例如N－乙醯基半胱胺酸、N－乙醯基高半胱胺酸、硫辛酸、硫二乙二醇(thiodiglycol)、硫乙醇胺、硫甘油醇、硫山梨醇、硫甘醇酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽，及具1至7個碳原子之硫烷酸。
再者，本發明中，抗氧化劑包括例如：異抗壞血酸(erythorbic acid)、二丁基羥基甲苯、丁基羥基苯甲醚、α－生育酚、生育酚乙酸酯、L－抗壞血酸及其鹽、L－抗壞血酸棕櫚酸酯、L－抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯，及螯合劑，例如乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉，及偏磷酸鈉。
視需要，可將藥劑膠囊化於微膠囊(羥基甲基纖維素、明膠、聚[甲基甲基丙烯酸]等之微膠囊)或製備成膠體藥物傳遞系(微脂體、白蛋白微球體、微乳化物、奈米粒子、奈米膠囊等)(參見“Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition”,Oslo Ed.,1980等)。再者，用於製備持續釋放藥劑之方法亦為已知，可應用在本發明(Langeret al .,J.Biomed.Mater.Res.(1981)15,167－277；Langer, Chem.Tech.(1982)12,98－105；United States Patent No.3,773,919；European Patent Application No.(EP)58,481；Sidmanet al .,Biopolymers(1983)22,547－556；and EP 133,988)。
所使用之製藥上可接受的擔體，可視劑型，適當地從上述中選擇或合併使用，但不限定於此。
本發明係關於用於抑制慢性排斥反應之方法，包含對於個體投予IL－6抑制劑之步驟。
本發明亦關於用於抑制心臟移植中之慢性排斥反應的方法，包含對於個體投予IL－6抑制劑之步驟。
在此，“個體”係指將被投予本發明IL－6抑制劑之生物或生物部分。該生物包括動物(例如人類、馴養動物及野生動物)，但不特別限定。“生物部分”不特別限定。
在此，“投予”包括口服及非口服投予。口服投予包括例如：投予口服藥劑。此種口服藥劑，包括例如：顆粒、粉末、錠劑、膠囊、溶液、乳液及懸浮液。
非口服投予包括，例如注射投予。此種注射包括例如：靜脈內注射、皮下注射、肌肉內注射，及腹腔內注射。同時，本發明方法之效果可藉由基因療法技術，導入包含欲投予至活體之寡核苷酸的基因以達成。或者，本發明之藥劑可以局部投予在欲處理的區域。例如，可將藥劑藉由手術時局部注射、使用導管或編碼為本發明胜肽之DNA的標靶基因傳遞來投予。
本發明之抑制藥劑可在器官移植前、器官移植當時或器官移植後投予。再者，該抑制藥劑可投予一次或重複投 予。
或者，當投予給一生物之切割或釋放部分，本發明之抑制藥劑可與該生物部分“接觸”。
於本發明，“接觸”係依該生物之情形實施。例子包括將本發明之抑制藥劑噴霧在生物部分上，及將本發明之抑制藥劑添加到壓碎的生物部分，但不限定於此。當該生物部分為培養的細胞，上述‘‘接觸”可藉由將本發明之抑制藥劑添加至此等細胞之培養基，或將包含本發明之寡核苷酸的DNA引入構成該生物部分之細胞以達成。
當實施本發明方法時，本發明之藥劑可以與至少一種已知化療藥劑組合成為醫藥組成物部分而投予。或者，本發明之藥劑可以與至少一種已知免疫抑制劑同時投予。於一實施形態，該已知化療藥劑及本發明之抑制藥劑可以實質上同時投予。
本發明中用於抑制慢性排斥反應之藥劑，較佳為全身性投予，但可於器官已移植後，投予至器官移植部位，或可與該器官同時投予至標靶。或者，該藥劑可於移植前，在體外(ex vivo )對於該器官添加。
在此所提及之任意專利、公開的專利申請案及出版品，納入作為參照。
實施例
以下，將參照實施例具體敘述本發明，本發明不限定於此。
就提供者而言，使用從美國Jackson實驗室(Bar Harbor,ME)經由Charles River Laboratories Japan Inc 購得之B6.C－H2bm12 小鼠。就接受者而言，使用購自Japan SLC,Inc之C57BL/6小鼠。此2種小鼠品系僅有微小的MHC抗原不配合(第II型不配合)，以便使對於經移植心臟之急性排斥反應不會發生，同時移植後約2個月的組織病理學特性觀察結果與人類慢性排斥反應一致。因此，以此建立慢性排斥反應之動物模型。這些小鼠係依照機構的動物實驗步驟，飼養在Shinshu大學的動物實驗機構(官方名稱：實驗動物研究分部，生命科學系，人類及環境科學研究中心，Shinshu大學)。小鼠心臟移植係使用部分修飾之小鼠模型實施，該部分修飾之小鼠模型起源於先前曾報告之針對異位心臟移植之小鼠模型(Corry,R.J.et al .,Transplant(1973)16,343－350)。使用下述程序，以微外科受術對6－8週大的小鼠進行心臟移植。
將提供者及接受者小鼠均以腹腔內注射劑量70mg/kg之戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium)(Nenbutal(商品名))麻醉。將欲移植之心臟在連接用於吻合之升主動脈及肺動脈以外的血管後分離。將分離的心臟移植物於冰上保存在冷的含7.5%肝素的生理鹽液中。將接受者進行中間線開腹，使腸翻出以露出腹主動脈及下腔靜脈。於使用微血管用之微鉗將血流止住後，在吻合部位的各表面造出約1－mm之切口。使用10－0尼龍縫線持續縫合，使該被移植心臟之主動脈及肺動脈各吻合於接受者之腹主動脈及下腔靜脈。將該微鉗逐漸鬆開以回復血流。確認經移植的心臟回復跳動。於確認止血後，將腹壁及皮膚縫合以關閉腹部。每一次受術花費約45分鐘。成功率95%以上。
於處理群組，每週2次以單一劑量0.5mg/隻對於腹膜腔投子MR16－1。對於對照處理群組，以同樣方式投予大鼠IgG(對照Ig)。移植後60天，從接受者切出移植的心臟，並使用以下3種類型的組織病理學指標，評量慢性排斥反應。
(1)以蘇木精－伊紅染色之樣本中之排斥反應程度，使用依據存在細胞滲透及心肌壞死及喪失作為指標之準則，分成0~4級，共5級比較並評量排斥分數(Billingham,M.E.et al .,J.Heart Transplant(1990)9,587－593；Rodriguez,E.R.,J.Heart Lung Transpalnt(2003)22,3－15)。
移植60天後，從經移植的心臟製備組織病理學切片，並以蘇木精－伊紅染色(第1圖)。於該對照處理群組發現有發炎性細胞擴散滲透及心肌壞死(第1a圖)。於該MR16－1處理群組，發炎性細胞滲透輕微，且心肌組織之結構相較之上維持地較完整(第1b圖)。再者，MR16－1投予群組之排斥分數顯著低於對照處理群組(第1c圖：對照處理群組，3.1±0.3；MR16－1投予群組，1.4±0.3；p＝0.0013)。
(2)慢性排斥之'心肌間隙組織纖維化特性，以Masson氏三色染色檢測。使用影像分析軟體(NIH image，版本1.62)估算各可見區域之纖維化面積比例(%)。
結果顯示該MR16－1處理群組(第1e圖)相較於對照處理群組(圖1d)，纖維化區域顯著地域少(第1f圖：對照處理群組，46.5%±4.1%MR16－1投予群組，19.0%±2.1%；p＝0.0001)。
(3)為了分析因為內膜增厚導致血管狹窄為特徵之移植後血管病變，從內彈性膜大致估算原始的血管內腔，並使用與依照Suzuki,J.et al .(Nat.Med.(1997)3,900－903)之方法的相同影像分析軟體，使用以下方程式決定血管狹窄的百分比：
狹窄百分比(%)＝((內彈性膜面積)－(內腔))/(內彈性膜面積)x100
分析該移植心臟中的血管病變得到的結果顯示，內膜增厚被抑制，因此血管內腔狹窄於該MR16－1處理群組(第2b圖)相較於對照處理群組(第2a圖)，顯著地被抑制(第2c圖：對照處理群組，59.6%±6.0%；MR16－1投予群組，23.7%±4.2%；p＝0.0019)。
如上所述，於該小鼠心臟移植模型，投予MR16－1至接受者會抑制對於該移植心臟之慢性排斥反應，且顯著抑制被認為是組織病理學特性之移植心臟纖維化及血管內膜增厚。慢性排斥反應為影響接受者長期預後之併發症，因此期待透過本發明藥劑之臨床應用能開發新穎的免疫抑制療法。
[產業利用性]
本發明提供用於抑制慢性排斥反應之藥劑，包含一IL－6抑制劑作為有效成分，並提供用於抑制慢性排斥反應之方法，包含對於個體投予一IL－6抑制劑之步驟。
即便急性期排斥反應已藉由各種免疫抑制劑克服後，慢性排斥反應仍會逐漸進展。慢性排斥反應之病理學狀況 複雜且與急性排斥反應有許多不同。現有醫藥製劑尚未達成預防及治療慢性排斥反應之效果。本發明提供IL－6抑制劑之新穎治療效用，具抑制慢性排斥之效果。再者，因為該抑制劑選擇性地抑制IL－6這種發炎性細胞介素之活性，因此期符作為相較於現有醫藥製劑，具較少副作用之優良免疫抑制劑。
第1a圖至第1f圖顯示移植60天後之移植心臟的組織病理學切片依據排斥分數的比較及評量結果，及纖維化面積比例的圖形及照片。
第2a圖至第2c圖顯示移植心臟於血管病變的血管狹窄百分比的分析結果圖形及照片。

Claims (6)

  1. 一種辨識一IL-6受體之抗體之用途，其係用於製備用於抑制慢性排斥反應之藥劑。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抗體為一單株抗體。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抗體為一辨識人類IL-6受體之抗體。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抗體為一重組抗體。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該抗體為一嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之用途，其係用於抑制心臟移植中的慢性排斥反應。
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