JPH10324639A - Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する感作ｔ細胞関与疾患の予防・治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 感作Ｔ細胞関与疾患の新規な予防・治療剤の
提供。 【解決手段】 インターロイキン−６（ＩＬ−６）アン
タゴニスト、例えばＩＬ−６受容体に対する抗体、ＩＬ
−６に対する抗体、ｇｐ１３０に対する抗体等を含んで
成る、感作Ｔ細胞関与疾患の予防または治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はインターロイキン-6
（IL-6）アンタゴニストを有効成分として含有する感作
T 細胞関与疾患の予防または治療剤に関する。また、本
発明は、IL-6アンタゴニストを有効成分とする感作T 細
胞抑制剤に関する。さらに、本発明はIL-6受容体に対す
る抗体を有効成分とする感作T 細胞抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】IL-6はB 細胞刺激因子2 （BSF2）あるい
はインターフェロンβ2 とも呼称されたサイトカインで
ある。IL-6は、B リンパ球系細胞の活性化に関与する分
化因子として発見され（Hirano, T. et al., Nature (1
986) 324, 73-76 ）、その後、種々の細胞の機能に影響
を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかになっ
た（Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 5
4, 1-78）。IL-6は、T リンパ球系細胞の成熟化を誘導
することが報告されている（Lotz et al., J. Exp.Immu
nol.18: 1253-1258, 1988）。

【０００３】IL-6は、細胞上で二種の蛋白質を介してそ
の生物学的活性を伝達する。一つは、IL-6が結合する分
子量約80kDのリガンド結合性蛋白質のIL-6受容体であ
る。IL-6受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現す
る膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性
IL-6受容体としても存在する。もう一つは、非リガンド
結合性のシグナル伝達に係わる分子量約130kD の膜蛋白
質gp130 である。IL-6とIL-6受容体はIL-6／IL-6受容体
複合体を形成し、次いでgp130 と結合することにより、
IL-6の生物学的活性が細胞内に伝達される（Taga, T. e
t al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967 ）。

【０００４】IL-6アンタゴニストは、IL-6の生物学的活
性の伝達を阻害する物質であり、これまでに、IL-6に対
する抗体（抗IL-6抗体）、IL-6受容体に対する抗体（抗
IL-6受容体抗体）、gp130 に対する抗体（抗gp130 抗
体）が知られている。また、その他に、国際特許出願公
開番号WO 95-00852 、国際特許出願公開番号WO 95-1130
3 、国際特許出願公開番号WO 96-34104 、国際特許出願
公開番号WO 96-18648 、国際特許出願公開番号WO 96-17
869 、特開平7-324097、特開平8-311098に開示されたIL
-6アンタゴニストが知られている。

【０００５】抗IL-6受容体抗体に関しては、いくつかの
報告がある（Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 1
0, 137-146 、Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993)
12,621-630 、国際特許出願公開番号WO 95-09873 、フ
ランス特許出願公開番号FR 2694767、米国特許番号US 5
21628 ）。その一つであるマウス抗体PM-1（Hirata,et
al., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906 ）の相捕
性決定領域（CDR ）をヒト抗体へ移植することにより得
られたヒト型化PM-1抗体が知られている（国際特許出願
公開番号WO 92-19759 ）。

【０００６】一方、多くの自己免疫疾患やアレルギー疾
患において、特定の抗原を認識するＴ細胞（感作Ｔ細
胞）が存在し、この感作T 細胞が病態に関与しているこ
とが知られている。例えば、多発性硬化症ではミエリン
塩基性タンパク（Zhang, J. etal., J.Exp.Med (1994)
179, 973-984 ）、ぶどう膜炎ではＳ抗原（Nussenblat
t, R.B. et al., Am.J.Ophthalmol ( 1980) 89, 173-17
9 ）、慢性甲状腺炎ではサイログロブリン、アトピー性
皮膚炎では食物、ダニなど（Kubota, Y. et al.,J.Derm
atol (1993) 20, 85-87, Kondo, N. et al., J.Allergy
Clin. Immunol(1993) 91, 658-668）、遅延型過敏症で
は細菌、ウイルス、カビなど、接触性皮膚炎では金属、
漆などを抗原とする感作Ｔ細胞の存在が知られている。

【０００７】さらに、これらの抗原を動物に免疫した
り、抗原特異的感作Ｔ細胞を非免疫動物に移入すること
によりヒトと類似の病態を誘導することも可能である。
このことから、感作Ｔ細胞が上記疾患において重要な役
割を果たしていると考えられている。現在、これら疾患
の治療にはステロイド剤や免疫抑制剤が使用されている
が、対症療法であり、しかも長期間の投与が必要とさ
れ、副作用が問題となっている。これまでに、上記のよ
うなIL-6アンタゴニストが感作Ｔ細胞抑制効果を示し、
感作T 細胞が関与する疾患に対して治療効果を有するこ
とは知られていなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記の欠点
を有さない感作T 細胞関与疾患の治療剤を提供しようと
するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、IL
-6アンタゴニストを有効成分として含有する感作T 細胞
関与疾患の予防または治療剤に関する。本発明はまた、
IL-6受容体に対する抗体を有効成分として含有する感作
T 細胞関与疾患の予防または治療剤に関する。本発明は
また、IL-6受容体に対するモノクローナル抗体を有効成
分として含有する感作T 細胞関与疾患の予防または治療
剤に関する。本発明はまた、ヒトIL-6受容体に対するモ
ノクローナル抗体を有効成分として含有する感作T 細胞
関与疾患の予防または治療剤に関する。本発明はまた、
マウスIL-6受容体に対するモノクローナル抗体を有効成
分として含有する感作T 細胞関与疾患の予防または治療
剤に関する。

【００１０】本発明はまた、PM-1抗体を有効成分として
含有する感作T 細胞関与疾患の予防または治療剤に関す
る。本発明はまた、MR16-1抗体を有効成分として含有す
る感作T 細胞関与疾患の予防または治療剤に関する。本
発明はまた、ヒト抗体定常領域（C 領域）を有するIL-6
受容体に対する抗体を有効成分として含有する感作T 細
胞関与疾患の予防または治療剤に関する。本発明はま
た、IL-6受容体に対するキメラ抗体またはヒト型化抗体
を有効成分として含有する感作T 細胞関与疾患の予防ま
たは治療剤に関する。本発明はまた、ヒト型化PM-1抗体
を有効成分として含有する感作T 細胞関与疾患の予防ま
たは治療剤に関する。本発明はまた、上記IL-6アンタゴ
ニストを有効成分として含有する多発性硬化症、ぶどう
膜炎、慢性甲状腺炎、遅延性過敏症、接触性皮膚炎また
はアトピー性皮膚炎の予防または治療剤に関する。本発
明はまた、IL-6アンタゴニストを有効成分とする感作T
細胞抑制剤に関する。本発明はさらに、IL-6受容体に対
する抗体を有効成分とする感作T 細胞抑制剤に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】

1. IL-6 アンタゴニスト 本発明で使用されるIL-6アンタゴニストは、感作T 細胞
の抑制効果または、感作T 細胞が関与する疾患の予防ま
たは治療効果を示すものであれば、その由来、種類およ
び形状を問わない。IL-6アンタゴニストは、IL-6による
情報伝達を遮断し、IL-6の生物学的活性を阻害する物質
である。IL-6アンタゴニストとしては、抗IL-6抗体、抗
IL-6受容体抗体、抗gp130 抗体、IL-6改変体、あるいは
IL-6またはIL-6受容体の部分ペプチドが挙げられる。

【００１２】1-1. 抗IL-6抗体 本発明で使用される抗IL-6抗体は、公知の手段を用いて
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得るこ
とができる。本発明で使用される抗IL-6抗体として、特
に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳
動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドー
マに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗
体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生
されるものがある。この抗体はIL-6と結合することによ
り、IL-6のIL-6受容体への結合を阻害してIL-6の生物学
的活性の細胞内への伝達を遮断する抗体である。このよ
うな抗体としては、MH166 （Matsuda et al., Eur. J.
Immunol. (1988) 18, 951 -956）やSK2 抗体（Sato, K.
et al., 第21回 日本免疫学会総会、学術記録(1991)
21, 166）等が挙げられる。

【００１３】1-1-1. IL-6 の調製 抗IL-6抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術
を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、IL
-6を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に
したがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合
法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニ
ング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリ
ーニングすることによって作製できる。

【００１４】具体的には、抗IL-6抗体を作製するには次
のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原とし
て使用されるヒトIL-6は、Eur. J. Biochem (1987) 16
8, 543 、J. Immunol. ( 1988) 140, 1534 、あるいはA
rgic. Biol. (1990) 54, 2685に開示されたIL-6遺伝子
／アミノ酸配列を用いることによって得られる。IL-6の
遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿
主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培
養上清中から目的のIL-6蛋白質を公知の方法で精製し、
この精製IL-6蛋白質を感作抗原として用いればよい。ま
た、IL-6蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原
として用いてもよい。

【００１５】1-2. 抗IL-6受容体抗体 本発明で使用される抗IL-6受容体抗体は、公知の手段を
用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として
得ることができる。本発明で使用される抗IL-6受容体抗
体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好
ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、
ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的
手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換し
た宿主に産生されるものがある。この抗体はIL-6受容体
と結合することにより、IL-6のIL-6受容体への結合を阻
害してIL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する
抗体である。

【００１６】このような抗体としては、MR16-1抗体（Sa
ito, et al., J. Immunol. (1993)147, 168-173）、PM-
1抗体（Hirata, et al., J. Immunology (1989) 143, 2
900-2906 ）、AUK12-2 0 抗体、AUK64-7 抗体あるいはA
UK146-15 抗体（国際特許出願公開番号WO 92-19759 ）
などが挙げられる。これらのうちで、特に好ましい抗体
としてPM-1抗体が挙げられる。なお、PM-1抗体産生ハイ
ブリドーマ細胞株は、PM-1として、工業技術院生命工学
工業技術研究所（茨城県つくば市東1 丁目1 番3 号）
に、平成2 年7 月10日に、FERM BP-2998としてブダペス
ト条約に基づき国際寄託された。また、MR16-1抗体産生
ハイブリドーマ細胞株はRat-mouse hybridoma MR16-1と
して、平成9 年3月13日に工業技術院生命工学工業技術
研究所にFERM BP-5875として寄託された。

【００１７】1-2-1. IL-6 受容体の調製 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には
公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すな
わち、IL-6受容体を感作抗原として使用して、これを通
常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を
通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通
常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産
生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。

【００１８】具体的には、抗IL-6受容体抗体を作製する
には次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗
原として使用されるヒトIL-6受容体は、欧州特許出願公
開番号EP 325474 に、マウスIL-6受容体は日本特許出願
公開番号特開平3-155795に開示されたIL-6受容体遺伝子
／アミノ酸配列を用いることによって得られる。IL-6受
容体蛋白質は、細胞膜上に発現しているものと細胞膜よ
り離脱しているもの（可溶性IL-6受容体）（Yasukawa,
et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676 ）との二種
類がある。可溶性IL-6受容体抗体は細胞膜に結合してい
るIL-6受容体の実質的に細胞外領域から構成されてお
り、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領
域が欠損している点で膜結合型IL-6受容体と異なってい
る。

【００１９】IL-6受容体の遺伝子配列を公知の発現ベク
ター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、
その宿主細胞中または、培養上清中から目的のIL-6受容
体蛋白質を公知の方法で精製し、この精製IL-6受容体蛋
白質を感作抗原として用いればよい。また、IL-6受容体
を発現している細胞やIL-6受容体蛋白質と他の蛋白質と
の融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。ヒトIL-6
受容体をコードするcDNAを含むプラスミドpIBIBSF2R を
含有する大腸菌（E.coli）は、平成元年（1989年）1 月
9 日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に、HB101-
pIBIBSF2R として、受託番号FERM BP-2232としてブダペ
スト条約に基づき国際寄託されている。

【００２０】1-3. 抗gp130 抗体 本発明で使用される抗gp130 抗体は、公知の手段を用い
てポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得る
ことができる。本発明で使用される抗gp130 抗体とし
て、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好まし
い。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイ
ブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法
により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿
主に産生されるものがある。この抗体はgp130 と結合す
ることにより、IL-6／IL-6受容体複合体のgp130 への結
合を阻害してIL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮
断する抗体である。このような抗体としては、AM64抗体
（特開平3-219894）、4B11抗体および2H4抗体（US55715
13 ）B-S12 抗体およびB-P8抗体（特開平8-291199）な
どが挙げられる。

【００２１】1-3-1. gp130の調製 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には
公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すな
わち、gp130 を感作抗原として使用して、これを通常の
免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常
の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常の
スクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細
胞をスクリーニングすることによって作製できる。

【００２２】具体的には、モノクローナル抗体を作製す
るには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作
抗原として使用されるgp130 は、欧州特許出願公開番号
EP 411946 に開示されたIL-6受容体遺伝子／アミノ酸配
列を用いることによって得られる。gp130 の遺伝子配列
を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形
質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中か
ら目的のgp130 蛋白質を公知の方法で精製し、この精製
IL-6受容体蛋白質を感作抗原として用いればよい。ま
た、gp130 を発現している細胞やgp130 蛋白質と他の蛋
白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。

【００２３】1-4. 抗体産生ハイブリドーマの作製 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定され
るものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合
性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯
類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使
用される。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法
にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感
作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射すること
により行われる。具体的には、感作抗原をPBS （Phosph
ate-Buffered Saline ）や生理食塩水等で適当量に希
釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例
えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化
後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与するのが好ましい。
また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することがで
きる。

【００２４】このように免疫し、血清中に所望の抗体レ
ベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細
胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付さ
れる好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられ
る。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺
乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞
株、例えば、P3X63Ag8.653（J. Immnol. (1979) 123: 1
548-1550）、P3X63Ag8U.1 （Current Topics in Microb
iology and Immunology (1978) 81: 1-7）、NS- 1 （Ko
hler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976)
6: 511-519）、MPC-11（Mar gulies. D. H. et al., Ce
ll (1976) 8:405-415）、SP2/0 （Shulman, M. et al.,
Nature (1978) 276: 269-270）、FO（de St. Groth,
S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-2
1)、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 14
8: 313-323）、R210（Galfre, G.et al., Nature (197
9) 277: 131-133 ）等が適宜使用される。

【００２５】前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合
は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの
方法（Kohler. G. and Milstein, C. 、Methods Enzymo
l. (1981) 73: 3-46）等に準じて行うことができる。よ
り具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤
の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進
剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG ）、
センダイウィルス（HVJ ）等が使用され、更に所望によ
り融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補
助剤を添加使用することもできる。

【００２６】免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合
は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1 〜10
倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液と
しては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な
RPMI1640培養液、MEM 培養液、その他、この種の細胞培
養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さら
に、牛胎児血清（FCS ）等の血清補液を併用することも
できる。細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞と
の所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度
に加温したPEG 溶液、例えば、平均分子量1000〜6000程
度のPEG 溶液を通常、30〜60％（w/v ）の濃度で添加
し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブ
リドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次
添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことに
よりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等
を除去できる。

【００２７】当該ハイブリドーマは、通常の選択培養
液、例えば、HAT 培養液（ヒポキサンチン、アミノプテ
リンおよびチミジンを含む培養液）で培養することによ
り選択される。当該HAT 培養液での培養は、目的とする
ハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するの
に十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通
常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハ
イブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニング
が行われる。

【００２８】また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上
記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitro
で所望の抗原蛋白質または抗原発現細胞で感作し、感作
Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合さ
せ、所望の抗原または抗原発現細胞への結合活性を有す
る所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878
参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリー
を有するトランスジェニック動物に抗原または抗原発現
細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得
してもよい（国際特許出願公開番号WO 93/12227 、WO 9
2/03918 、WO 94/02602 、WO 94/25585 、WO 96/34096
、WO 96/33735 参照）。

【００２９】このようにして作製されるモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継
代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期
保存することが可能である。当該ハイブリドーマからモ
ノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマ
を通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得
る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある
哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法
などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得る
のに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産
に適している。

【００３０】例えば、抗IL-6受容体抗体産生ハイブリド
ーマの作製は、特開平3-139293に開示された方法により
行うことができる。工業技術院生命工学工業技術研究所
（茨城県つくば市東1 丁目1 番3 号）に、平成2 年7 月
10日に、FERM BP-2998としてブタペスト条約に基づき国
際寄託されたPM-1抗体産生ハイブリドーマをBALB/cマウ
ス（日本クレア製）の腹腔内に注入して腹水を得、この
腹水からPM-1抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマ
を適当な培地、例えば、10％ウシ胎児血清、5％BM-Cond
imed H1（Boehringer Mannheim 製）含有RPMI1640培
地、ハイブリドーマSFM 培地（GIBCO-BRL 製）、PFHM-I
I 培地（GIBCO-BRL 製）等で培養し、その培養上清から
PM-1抗体を精製する方法で行うことができる。

【００３１】1-5. 組換え型抗体 本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子を
ハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに
組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を
用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる
（例えば、Carl,A. K. Borrebaeck, James, W. Larric
k, TERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in
the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 19
90参照）。

【００３２】具体的には、目的とする抗体を産生するハ
イブリドーマから、抗体の可変（V）領域をコードするm
RNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、
グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. ら、Biochemist
ry (1979) 18, 5294-5299 ）、AGPC法（Chmczynski, P.
ら、(1987) 162, 156-159 ）等により全RNA を調製し、
mRNA Purification Kit （Pharmacia 製）等を使用して
mRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification
Kit（Pharmacia 製）を用いることによりmRNAを直接調
製することができる。

【００３３】得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体
V 領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse
Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を
用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅
を行うには5'-Ampli FINDERRACE Kit （Clontech製）お
よびPCR を用いた5'-RACE 法（Frohman, M. A. ら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002 ；Be
lyavsky, A. ら、Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919
-2932 ）を使用することができる。得られたPCR 産物か
ら目的とするDNA 断片を精製し、ベクターDNA と連結す
る。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌
等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクター
を調製する。目的とするDNA の塩基配列を公知の方法、
例えば、デオキシ法により確認する。

【００３４】目的とする抗体のV 領域をコードするDNA
が得られれば、これを所望の抗体定常領域（C 領域）を
コードするDNA と連結し、これを発現ベクターへ組み込
む。または、抗体のV 領域をコードするDNA を、抗体C
領域のDNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。本
発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗
体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロ
モーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組
み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質
転換し、抗体を発現させることができる。

【００３５】1-6. 改変抗体 本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること
等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、
例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト型化（Humanize
d ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方
法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、前記
のようにして得た抗体V 領域をコードするDNA をヒト抗
体C 領域をコードするDNA と連結し、これを発現ベクタ
ーに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ら
れる（欧州特許出願公開番号EP 125023 、国際特許出願
公開番号WO 96/02576 参照）。この既知の方法を用い
て、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。

【００３６】例えば、キメラPM-1抗体のL 鎖およびH 鎖
のV 領域をコードするDNA を含むプラスミドは、各々pP
M-k3およびpPM-h1と命名され、このプラスミドを有する
大腸菌は、National Collections of Industrial and M
arine Bacteria Limitedに、1991年2 月11日に、各々NC
IMB 40366 、NCIMB40362としてブダペスト条約に基づき
国際寄託されている（国際特許出願公開番号WO 92-1975
9 参照）。ヒト型化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗
体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗
体の相補性決定領域（CDR; complementarity determini
ngregion ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したも
のであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られてい
る（欧州特許出願公開番号EP 125023 、国際特許出願公
開番号WO 96/02576 参照）。

【００３７】具体的には、マウス抗体のCDR とヒト抗体
のフレームワーク領域（FR; framework region）を連結
するように設計したDNA 配列を、末端部にオーバーラッ
プする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレ
オチドからPCR 法により合成する。得られたDNA をヒト
抗体C 領域をコードするDNA と連結し、次いで発現ベク
ターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させること
により得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400 、国
際特許出願公開番号WO 92-19759 参照）。CDR を介して
連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗
原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、
再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位
を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域
のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer
Res. (1993) 53, 851-856）。

【００３８】キメラ抗体、ヒト型化抗体には、ヒト抗体
C 領域が使用される。ヒト抗体C 領域としては、C γが
挙げられ、例えば、C γ1 、C γ2 、C γ3 、C γ4 を
使用することができる。また、抗体またはその産生の安
定性を改善するために、ヒト抗体C 領域を修飾してもよ
い。キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領
域とヒト抗体由来のC 領域からなり、ヒト型化抗体はヒ
ト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体
由来のフレームワーク領域（framework region; FR）お
よびC 領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下し
ているため、本発明の治療剤の有効成分として有用であ
る。本発明に使用されるヒト型化抗体の好ましい具体例
としては、ヒト型化PM-1抗体が挙げられる（国際特許出
願公開番号WO 92-19759 参照）。

【００３９】1-7. 発現および産生 前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により
発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、
常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝
子、その3'側下流にポリA シグナルを機能的に結合させ
たDNA あるいはそれを含むベクターにより発現させるこ
とができる。例えばプロモーター／エンハンサーとして
は、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エン
ハンサー（human cytomegalovirus immediate early pr
omoter/enhancer ）を挙げることができる。

【００４０】また、その他に本発明で使用される抗体発
現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レ
トロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、
シミアンウィルス40（SV 40 ）等のウィルスプロモータ
ー／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1
α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エ
ンハンサーを用いればよい。例えば、SV 40 プロモータ
ー／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法
（Nature (1979) 277, 108）、また、HEF1αプロモータ
ー／エンハンサーを使用する場合、Mizushima らの方法
（Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）に従えば容易
に実施することができる。

【００４１】大腸菌の場合、常用される有用なプロモー
ター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体
遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。
例えばプロモーターとしては、laczプロモーター、araB
プロモーターを挙げることができる。laczプロモーター
を使用する場合、Wardらの方法（Nature (1098) 341,54
4-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモ
ーターを使用する場合、Betterらの方法（Science (198
8) 240, 1041-1043 ）に従えばよい。抗体分泌のための
シグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生さ
せる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Ba
cteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。ペリ
プラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を
適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、
WO96/30394を参照）。

【００４２】複製起源としては、SV 40 、ポリオーマウ
ィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BP
V ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主
細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選
択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラー
ゼ（APH ）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大
腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）
遺伝子等を含むことができる。本発明で使用される抗体
の製造のために、任意の産生系を使用することができ
る。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin viv
o の産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細
胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げ
られる。

【００４３】真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物
細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞として
は、(1) 哺乳類細胞、例えば、CHO 、COS 、ミエロー
マ、BHK （baby hamster kidney ）、HeLa、Vero、(2)
両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あ
るいは(3) 昆虫細胞、例えば、sf9 、sf21、Tn5 が知ら
れている。植物細胞としては、Nicotiana tabacum 由
来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよ
い。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス
（Saccharomyces ）属、例えばサッカロミセス・セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばア
スペルギウス属（Aspergillus ）属、例えばアスペルギ
ウス・ニガー（Aspergillus niger ）などが知られてい
る。

【００４４】原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用い
る産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli
）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的と
する抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換され
た細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られ
る。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液と
して、DMEM、MEM 、RPMI1640、IMDMを使用することがで
き、牛胎児血清（FCS ）等の血清補液を併用することも
できる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔
等へ移すことにより、in vivo にて抗体を産生してもよ
い。

【００４５】一方、in vivo の産生系としては、動物を
使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系
がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マ
ウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPEC
TRUM Biotechnology Applications, 1993 ）。また、昆
虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用
する場合、例えばタバコを用いることができる。

【００４６】これらの動物または植物に抗体遺伝子を導
入し、動物または植物の体内で抗体を産生させ、回収す
る。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁
中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中
に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿
入された融合遺伝子を含むDNA 断片をヤギの胚へ注入
し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギか
ら生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産
生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニック
ヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させ
るために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使
用してもよい。（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology
(1994) 12, 699-702 ）。

【００４７】また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺
伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、
このカイコの体液より所望の抗体を得る（Susumu, M. e
t al., Nature (1985) 315, 592-594 ）。さらに、タバ
コを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクタ
ー、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをAgrobact
erium tumefaciens のようなバクテリアに導入する。こ
のバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacum に感
染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian,
K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-1
38）。

【００４８】上述のようにin vitroまたはin vivo の産
生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H 鎖）または
軽鎖（L 鎖）をコードするDNA を別々に発現ベクターに
組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるい
はH 鎖およびL 鎖をコードするDNA を単一の発現ベクタ
ーに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特
許出願公開番号WO 94-11523 参照）。

【００４９】1-8. 抗体修飾物 本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得
るかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよい。例え
ば、抗体の断片としては、Fab 、F(ab')2 、FvまたはH
鎖とL 鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチ
ェインFv（scFv）が挙げられる。具体的には、抗体を酵
素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生
成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝
子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な
宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J.
Immunol. (1994) 152, 2968-2976、Better, M. & Horwi
tz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-49
6, Academic Press, Inc.、Plueckthun, A. & Skerra,
A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496,Acade
mic Press, Inc. 、Lamoyi, E., Methods in Enzymolog
y (1989) 121, 652-663 、Rousseaux, J. et al., Met
hods in Enzymology (1989) 121, 663-669、Bird, R.
E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137 参照）。

【００５０】scFvは、抗体のH 鎖V 領域とL 鎖V 領域を
連結することにより得られる。このscFvにおいて、H 鎖
V 領域とL 鎖V 領域はリンカー、好ましくは、ペプチド
リンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-588
3）。scFvにおけるH 鎖V 領域およびL 鎖V 領域は、上
記抗体として記載されたもののいずれの由来であっても
よい。V 領域を連結するペプチドリンカーとしては、例
えばアミノ酸12〜19残基からなる任意の一本鎖ペプチド
が用いられる。

【００５１】scFvをコードするDNA は、前記抗体のH 鎖
または、H 鎖V 領域をコードするDNA 、およびL 鎖また
は、L 鎖V 領域をコードするDNA を鋳型とし、それらの
配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするDNA 部分
を、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR 法に
より増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコ
ードするDNA およびその両端を各々H 鎖、L 鎖と連結さ
れるように規定するプライマー対を組み合せて増幅する
ことにより得られる。また、一旦scFvをコードするDNA
が作製されれば、それらを含有する発現ベクター、およ
び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従
って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従
って、scFvを得ることができる。

【００５２】これら抗体の断片は、前記と同様にしてそ
の遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させること
ができる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれ
らの抗体の断片も包含される。抗体の修飾物として、ポ
リエチレングリコール（PEG ）等の各種分子と結合した
抗体を使用することもできる。本願特許請求の範囲でい
う「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。この
ような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な
修飾を施すことによって得ることができる。これらの方
法はこの分野においてすでに確立されている。

【００５３】1-9.抗体の分離・精製 1-9-1. 抗体の分離・精製 前記のように発現・産生された抗体は、宿主細胞内外か
ら分離し均一にまで精製することができる。本発明で使
用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグ
ラフィーにより行うことができる。アフィニティークロ
マトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロ
テインA カラム、プロテインG カラムが挙げられる。プ
ロテインA カラムに用いる担体として、例えば、Hyper
D 、POROS 、Sepharose F.F.等が挙げられる。

【００５４】その他、通常のタンパク質で使用されてい
る分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるも
のではない。例えば、上記アフィニティークロマトグラ
フィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾
過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明
で使用される抗体を分離、精製することができる。クロ
マトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマト
グラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙
げられる。これらのクロマトグラフィーはHPLCに適用可
能である。または逆相HPLCを使用することもできる。

【００５５】1-9-2.抗体の濃度測定 上記2-1 で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定また
はELISA 等により行うことができる。すなわち、吸光度
の測定による場合には、をPBS(-)で適当に希釈した後、
280 nmの吸光度を測定し、1 mg/ml を1.35 OD として算
出する。また、ELISA による場合は以下のように測定す
ることができる。すなわち、0.1M 重炭酸緩衝液（pH9.
6 ）で1 μg/ml に希釈したヤギ抗ヒトIgG （TAGO製）
100 μlを96穴プレート（Nunc製）に加え、４℃で一晩
インキュベーションし、抗体を固層化する。

【００５６】ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で
使用される抗体または抗体を含むサンプル、あるいは標
品としてヒトIgG （CAPPEL製）100 μl を添加し、室温
にて１時間インキュベーションする。洗浄後、5000倍希
釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG （BIO
SOURCE製）100 μl を加え、室温にて１時間インキュベ
ートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーション
の後、MICROPLATE READER Model 3550（Bio-Rad 製）を
用いて405nm での吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を
算出する。

【００５７】1-10. 抗体以外のIL-6アンタゴニスト 本発明で使用されるIL-6改変体は、IL-6受容体との結合
活性を有し、且つIL-6の生物学的活性を伝達しない物質
である。即ち、IL-6改変体はIL-6受容体に対しIL-6と競
合的に結合するが、IL-6の生物学的活性を伝達しないた
め、IL-6によるシグナル伝達を遮断する。IL-6改変体
は、IL-6のアミノ酸配列のアミノ酸残基を置換すること
により変異を導入して作製される。IL-6改変体のもとと
なるIL-6はその由来を問わないが、抗原性等を考慮すれ
ば、好ましくはヒトIL-6である。具体的には、IL-6のア
ミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえ
ば、WHATIF（Vriend et al.,J. Mol. Graphics （199
0）8, 52-56）を用いてその二次構造を予測し、さらに
置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価する
ことにより行われる。

【００５８】適切な置換アミノ酸残基を決定した後、ヒ
トIL-6遺伝子をコードする塩基配列を含むベクターを鋳
型として、通常行われるPCR （ポリメレースチェインリ
アクション）法によりアミノ酸が置換されるように変異
を導入することにより、IL-6改変体をコードする遺伝子
が得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに
組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法
に準じてIL-6改変体を得ることができる。IL-6改変体の
具体例としては、Brakenhoff et al., J. Biol. Chem．
（1994）269, 86-93、及びSavino et al., EMBO J.（19
94）13, 1357-1367, WO96-18648,WO96-17869 に開示さ
れている。

【００５９】本発明で使用されるIL-6部分ペプチド又は
IL-6受容体部分ペプチドは、各々IL-6受容体あるいはIL
-6との結合活性を有し、且つIL-6の生物学的活性を伝達
しない物質である。即ち、IL-6部分ペプチド又はIL-6受
容体部分ペプチドはIL-6受容体又はIL-6に結合し、これ
らを捕捉することによりIL-6のIL-6受容体への結合を特
異的に阻害する。その結果、IL-6の生物学的活性を伝達
しないため、IL-6によるシグナル伝達を遮断する。IL-6
部分ペプチド又はIL-6受容体部分ペプチドは、IL-6又は
IL-6受容体のアミノ酸配列においてIL-6とIL-6受容体と
の結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸配列から
なるペプチドである。このようなペプチドは、通常10〜
80、好ましくは20〜50、より好ましくは20〜40個のアミ
ノ酸残基からなる。

【００６０】IL-6部分ペプチド又はIL-6受容体部分ペプ
チドは、IL-6又はIL-6受容体のアミノ酸配列において、
IL-6とIL-6受容体との結合に係わる領域を特定し、その
一部又は全部のアミノ酸配列を通常知られる方法、例え
ば遺伝子工学的手法又はペプチド合成法により作製する
ことができる。IL-6部分ペプチド又はIL-6受容体部分ペ
プチドを遺伝子工学的手法により作製するには、所望の
ペプチドをコードするDNA 配列を発現ベクターに組み込
み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じ
て得ることができる。

【００６１】IL-6部分ペプチド又はIL-6受容体部分ペプ
チドをペプチド合成法により作製するには、ペプチド合
成において通常用いられている方法、例えば固相合成法
又は液相合成法を用いることができる。具体的には、続
医薬品の開発第14巻ペプチド合成 監修矢島治明廣川書
店1991年に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法
としては、例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成
しようとするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を結
合させ、α−アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で
保護したアミノ酸をＣ末端からＮ末端方向の順番に１ア
ミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸
又はペプチドのα−アミノ基の該保護基を脱離させる反
応を交互に繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させ
る方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられ
る保護基の種類によりBoc 法とFmoc法に大別される。

【００６２】このようにして目的とするペプチドを合成
した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支持体から切断す
る。ペプチド鎖との切断反応には、Boc 法ではフッ化水
素又はトリフルオロメタンスルホン酸を、又はFmoc法で
はTFA を通常用いることができる。Boc 法では、例えば
フッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をアニソール存在
下で処理する。次いで、保護基の脱離と支持体から切断
しペプチドを回収する。これを凍結乾燥することによ
り、粗ペプチドが得られる。一方、Fmoc法では、例えば
TFA 中で上記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖
の支持体から切断反応を行うことができる。

【００６３】得られた粗ペプチドは、HPLCに適用するこ
とにより分離、精製することができる。その溶出にあた
り、蛋白質の精製に通常用いられる水−アセトニトリル
系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。得られたク
ロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当する画
分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製
したペプチド画分について、マススペクトル分析による
分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解析
等により同定する。IL-6部分ペプチド及びIL-6受容体部
分ペプチドの具体例は、特開平２−188600、特開平７−
324097、特開平８−311098及び米国特許公報US 5210075
に開示されている。

【００６４】2.IL-6アンタゴニストの活性の確認 本発明で使用されるIL-6アンタゴニストの活性の評価
は、通常知られた方法を使用することができる。例え
ば、IL-6依存性細胞MH60.BSF2 にIL-6を添加し、IL-6ア
ンタゴニストを共存させることによりIL-6依存性細胞の
³Hーチミジン取込みを指標として評価すればよい。ま
た、IL-6受容体発現細胞であるU266に対し¹²⁵I標識IL-6
と過剰量の非標識IL-6を添加し、同時にIL-6アンタゴニ
ストを加え、IL-6受容体発現細胞に結合した¹²⁵I標識IL
-6を測定することにより、評価すればよい。

【００６５】3.治療効果の確認 本発明により達成される効果を確認するには、本発明で
使用されるIL-6アンタゴニストを、抗原投与などでT 細
胞が感作された状態の動物や感作T 細胞を移入した動物
に投与し、感作T 細胞の抑制効果を評価することにより
行うことができる。動物に投与される感作抗原として
は、例えば、結核菌を用いることができる。また、免疫
される動物としては、通常実験に用いられる動物でよ
く、例えば、マウス、ラット、ウサギなどを用いること
ができる。評価する本発明の効果の確認は、抗原免疫し
た動物に同一の抗原をチャレンジすることにより誘導さ
れる遅延型の炎症反応を観察することにより行うことが
できる。

【００６６】後述の実施例に示されるように、抗IL-6受
容体抗体の投与により、マウス遅延型足せき浮腫反応に
おいて、遅延型炎症反応の抑制が認められた。遅延型足
せき浮腫反応には感作T 細胞が関与していることが知ら
れていることから、抗IL-6受容体抗体等のIL-6アンタゴ
ニストは感作T 細胞に対して抑制効果を有することが示
された。

【００６７】4.投与経路および製剤 本発明の感作T 細胞関与疾患の予防または治療剤は、非
経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。
例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注
射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状
により適宜投与方法を選択することができる。有効投与
量は、一回につき体重1 kgあたり0.01 mg から100 mgの
範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり1 〜1000 mg 、
好ましくは5 〜50 mg の投与量を選ぶことができる。

【００６８】本発明の感作T 細胞関与疾患の予防または
治療剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添
加物を共に含むものであってもよい。このような担体お
よび添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶
媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピ
ロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、
アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキ
シメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロ
ース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴ
ム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピ
レングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、
パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒ
ト血清アルブミン（HSA ）、マンニトール、ソルビトー
ル、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性
剤などが挙げられる。

【００６９】使用される添加物は、剤型に応じて上記の
中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限
定されるものではない。本発明の予防または治療対象疾
患は、感作T 細胞が関与する疾患である。具体的には、
遅延性過敏症、慢性甲状腺炎、ぶどう膜炎、アトピー性
皮膚炎、接触性皮膚炎または多発性硬化症等が挙げられ
る。本発明の予防または治療剤は、これら感作T 細胞が
関与する疾患の予防または治療剤として有用である。

【００７０】

【実施例】以下、実施例、参考例および実験例により本
発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。実施例１. 遅延型足せき反応抑制作用 フロイントの不完全アジュバントにミコバクテリウム・
ブチリカム（Mycobacteroium butyricum）の乾燥死菌を
2.5 mg/ml となるように加えて乳剤とした後、C57BL/6
系雌性マウスにその0.2 mlを皮下注射して抗原感作を行
った。14日後に生理的食塩水に懸濁した10 mg のミコバ
クテリウム・ブチリカム（Mycobacteroium butyricum）
の乾燥死菌を、右側フットパッド（foot pad）に皮下注
射して反応を惹起した。24時間後に左右のフットパッド
（foot pad）重量を測定し、重量の差を反応の強さとし
た。

【００７１】MR16-1抗体は抗原感作と同時に１回のみ0.
125 mg、0.5 mgあるいは2 mgを腹腔内投与した。コント
ロール群にはイソタイプが同じであるラットIgG （KH-
5）を、また、感作しなかったマウス群には生理的食塩
水を同様に投与した。その結果は図１に示す通りであ
る。抗原感作日に１回MR16-1を投与することにより、遅
延型足せき浮腫反応は用量依存的に抑制された。

【００７２】参考例1. ヒト可溶性IL-6受容体の調製 Yamasakiらの方法（Science (1988) 241, 825-828 ）に
従い得られたIL-6受容体をコードするcDNAを含むプラス
ミドpBSF2R.236を用いて、PCR 法により可溶性IL-6受容
体を作成した。プラスミドpBSF2R.236を制限酵素Sph I
で消化して、IL-6受容体cDNAを得、これをmp18（Amersh
am製）に挿入した。IL-6受容体cDNAにストップコドンを
導入するようにデザインした合成オリゴプライマーを用
いて、インビトロミュータジェネシスシステム（Amersh
am製）により、PCR 法でIL-6受容体cDNAに変異を導入し
た。この操作によりストップコドンがアミノ酸345 の位
置に導入され、可溶性IL-6受容体をコードするcDNAが得
られた。

【００７３】可溶性IL-6受容体cDNAをCHO 細胞で発現す
るために、プラスミドpSV （Pharmacia 製）と連結さ
せ、プラスミドpSVL344 を得た。dhfrのcDNAを含むプラ
スミドpECEdhfrにHind III-Sal Iで切断した可溶性IL-6
受容体cDNAを挿入し，CHO 細胞発現プラスミドpECEdhfr
344 を得た。10μg のプラスミドpECEdhfr344 をdhfr-C
HO細胞株DXB-11（Urland et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA (1980) 77, 4216-4220）へカルシウムフォスフ
ェイト沈降法（Chen et al., Mol. Cell. Biol. (1987)
7, 2745-2751 ）により、トランスフェクトした。トラ
ンスフェクトしたCHO 細胞を1mM グルタミン、10% 透析
FCS 、100U/ml のペニシリンおよび100 μ/ml のストレ
プトマイシンを含むヌクレオシド不含αMEM 選択培養液
で3 週間培養した。

【００７４】選択されたCHO 細胞を限界希釈法でスクリ
ーニングし、単一のCHO 細胞クローンを得た。このCHO
細胞クローンを20nM-200nMの濃度のメトトレキセート
（MTX）で増幅し、ヒト可溶性IL-6受容体産生CHO 細胞
株5E27を得た。CHO 細胞株5E27を5%FBS を含むイスコー
ブ改変ダルベコ培養液（IMDM、Gibco 製）で培養した。
培養上清を回収し、培養上清中の可溶性IL-6受容体の濃
度をELISA にて測定した。

【００７５】参考例2. ヒト抗IL-6抗体の調製 10μg の組換型IL-6（Hiranoら、Immunol. Lett., 17:4
1, 1988 ）をフロイント完全アジュバントとともにBALB
/cマウス免疫し、血清中に抗IL-6抗体が検出できるまで
一週間毎にこれを続けた。局部のリンパ節から免疫細胞
を摘出し、ポリエチレングリコール1500を用いてミエロ
ーマ細胞株P3U1と融合させた。ハイブリドーマをHAT 培
養液を用いるOiらの方法（Selective Methods in Cellu
lar Immunology, W.H.Freeman and Co., San Francisc
o, 351, 1980 ）に従って選択し、ヒトIL-6抗体を産生
するハイブリドーマを樹立した。

【００７６】ヒト抗IL-6抗体を産生するハイブリドーマ
は下記のようにしてIL-6結合アッセイをおこなった。す
なわち、柔軟なポリビニル製の96穴マイクロプレート
（Dynatech Laboratories, Inc. 製, Alexandria, VA）
を0.1Mのcarbonate-hydrogen carbonate緩衝液（pH 9.
6）中で100 μl のヤギ抗マウスIg（10μl/ml, Cooper
Biomedical, Inc製 Malvern, PA）により4 ℃で一晩コ
ートした。次いで、プレートを100 μl の１％ウシ血清
アルブミン（BSA ）を含むPBS により室温で2 時間処理
した。

【００７７】これをPBS で洗浄した後、100 μl のハイ
ブリドーマ培養上清を各穴へ加え、4 ℃にて一晩インキ
ュベートした。プレートを洗浄して、2000cpm/0.5ng/we
llとなるように¹²⁵I標識組換型IL-6を各穴へ添加し、洗
浄した後各穴の放射活性をガンマカウンター（Beckman
Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA）で
測定した。216 個のハイブリドーマクローンのうち32個
のハイブリドーマクローンがIL-6結合アッセイにより陽
性であった。これらのクローンのなかで最終的に安定な
MH166.BSF2が得られた。該ハイブリドーマが産生する抗
IL-6抗体MH166はIgG1κ型のサブタイプを有する。

【００７８】ついで、IL-6依存性マウスハイブリドーマ
クローンMH166.BSF2を用いてMH166によるハイブリドー
マの増殖に関する中和活性を調べた。MH166.BSF2細胞を
1 ×10⁴/200 μl/穴となるように分注し、これにMH166
抗体を含むサンプルを加え、48時間培養し、15.1Ci/mM
の³Hチミジン（New England Nuclear, Boston, MA ）を
加えた後、更に6 時間培養を続けた。細胞をグラスフィ
ルターペーパー上におき、自動ハーベスター（Labo Mas
h Science Co., Tokyo, Japan ）で処理した。コントロ
ールとしてウサギ抗IL-6抗体を用いた。その結果、MH16
6 抗体はIL-6により誘導されるMH166.BSF2細胞の³Hチミ
ジンの取込みを容量依存的に阻害した。このことより、
MH166 抗体はIL-6の活性を中和することが明らかとなっ
た。

【００７９】参考例3. ヒト抗IL-6受容体抗体の調製 Hirataらの方法（J. Immunol., 143:2900-2906, 1989）
により作成した抗IL-6抗体MT18をCNBrにより活性化させ
たセファロース4B（Pharmacia Fine Chemicals製, Pisc
ataway, NJ）と添付の処方にしたがって結合させ、IL-6
レセプター（Science (1988) 241, 825-828 ）を精製し
た。ヒトミエローマ細胞株U266を1%ジギトニン（Wako C
hemicals製），10mMトリエタノールアミン（pH 7.8）お
よび0.15M NaClを含む1mM p-パラアミノフェニルメタン
スルフォニルフルオライドハイドロクロリド（Wako Che
micals製）（ジギトニン緩衝液）で可溶化し、セファロ
ース4Bビーズと結合させたMT18抗体と混合した。その
後、ビーズをジギトニン緩衝液で6 回洗浄し、免疫する
ための部分精製IL-6受容体とした。

【００８０】BALB/cマウスを3 ×10⁹ 個のU266細胞から
得た上記部分精製IL-6受容体で10日おきに4 回免疫し、
その後常法によりハイブリドーマを作成した。成長陽性
穴からのハイブリドーマ培養上清を下記の方法にてIL-6
受容体への結合活性を調べた。5 ×10⁷ 個のU266細胞を
³⁵S −メチオニン（2.5mCi）で標識し、上記ジギトニン
緩衝液で可溶化した。可溶化したU266細胞を0.04ml容量
のセファロース4Bビーズと結合させたMT18抗体と混合
し、その後、ジギトニン緩衝液で6 回洗浄し、0.25mlの
ジギトニン緩衝液（pH3.4 ）により³⁵S ーメチオニン標
識IL-6受容体を流出させ、0.025ml の1M Tris （pH 7.
4）で中和した。

【００８１】0.05mlのハイブリドーマ培養上清を0.01ml
のProtein G セファロース（Phramacia 製）と混合し
た。洗浄した後、セファロースを上記で調製した0.005m
l の³⁵S 標識IL-6受容体溶液とともにインキュベートし
た。免疫沈降物質をSDS-PAGEで分析し、IL-6受容体と反
応するハイブリドーマ培養上清を調べた。その結果、反
応陽性ハイブリドーマクローンPM-1を樹立した。ハイブ
リドーマPM-1から産生される抗体は、IgG1κ型のサブタ
イプを有する。

【００８２】ハイブリドーマPM-1が産生する抗体のヒト
IL-6受容体に対するIL-6の結合阻害活性をヒトミエロー
マ細胞株U266を用いて調べた。ヒト組換型IL-6を大腸菌
より調製し（Hiranoら，Immunol. Lett., 17:41, 1988
）、ボルトン−ハンター試薬（New England Nuclear,
Boston, MA ）により¹²⁵ Ｉ標識した（Taga, T et al.,
J. Exp. Med. (1987) 166, 967）。4 ×10⁵ 個のU266
細胞を100 倍量の過剰な非標識IL-6の存在下で室温に
て、1 時間、70% （v/v ）のハイブリドーマPM-1の培養
上清を14000cpmの ¹²⁵Ｉ標識IL-6とともに培養した。70
μl のサンプルを400 μl のマイクロフユージポリエチ
レンチューブに300 μl のFCS 上に重層し、遠心の後、
細胞上の放射活性を測定した。その結果、ハイブリドー
マPM-1が産生する抗体は、IL-6のIL-6受容体に対する結
合を阻害することが明らかとなった。

【００８３】参考例4. マウス抗IL-6受容体抗体の調製 Saito, et al., J. Immunol. (1993) 147, 168-173に記
載の方法により、マウスIL-6受容体に対するモノクロー
ナル抗体を調製した。マウス可溶性IL-6受容体を産生す
るCHO 細胞を10%FCSを含むIMDM培養液で培養し、その培
養上清からマウス可溶性IL-6受容体RS12（上記Saito, e
t al参照）とAffigel 10ゲル（Biorad）に固定したアフ
ィニティーカラムを用いてマウス可溶性IL-6受容体を精
製した。

【００８４】得られたマウス可溶性IL-6受容体50μg を
フロイント完全アジュバンドと混合し、ウィスターラッ
ト（日本チャルズリバー）の腹部に注射した。2 週間後
からはフロイント不完全アジュバンドで追加免疫した。
45日目にラットを屠殺し、その脾細胞約2 ×10⁸ 個を1
×10⁷ 個のマウスミエローマ細胞P3U1と50% のPEG1500
（ベーリンガーマンハイム）をもちいて常法により細胞
融合させた後、HAT 培地にてハイブリドーマをスクリー
ニングした。

【００８５】ウサギ抗ラットIgG 抗体（カッペル）をコ
ートしたプレートにハイブリドーマ培養上清を加えた
後、マウス可溶性IL-6受容体を反応させた。次いで、ウ
サギ抗マウスIL-6受容体抗体およびアルカリフォスファ
ターゼ標識ヒツジ抗ウサギIgGによるELISA 方によりマ
ウス可溶性IL-6受容体に対する抗体を産生するハイブリ
ドーマをスクリーニングした。抗体の産生が確認された
ハイブリドーマクローンは2 回のサブスクリーニングを
行い、単一のハイブリドーマクローンを得た。このクロ
ーンをMR16-1と名付けた。

【００８６】このハイブリドーマが産生する抗体のマウ
スIL-6の情報伝達における中和活性をMH60.BSF2 細胞
（Matsuda et al., J. immunol. (1988) 18, 951-956）
を用いた³Hチミジンの取込みで調べた。96ウェルプレー
トにMH60.BSF2 細胞を1 ×10⁴個/200μl/ウェルとなる
ように調製した。このプレートに10pg/ml のマウスIL-6
とMR16-1抗体またはRS12抗体を12.3〜1000ng/ml を加え
て37℃、5% CO₂で44時間培養した後、1 μCi/ ウェルの
³Hチミジンを加えた。4 時間後に³Hチミジンの取込みを
測定した。その結果MR16-1抗体はMH60.BSF2 細胞の³Hチ
ミジン取込みを抑制した。したがって、ハイブリドーマ
MR16-1が産生する抗体は、IL-6のIL-6受容体に対する結
合を阻害することが明らかとなった。

【００８７】

【発明の効果】本発明により、抗IL-6受容体抗体等のIL
-6アンタゴニストが感作Ｔ細胞の抑制効果を有すること
が示された。したがって、IL-6アンタゴニストは多発性
硬化症、ぶどう膜炎、慢性甲状腺炎、遅延性過敏症、接
触性皮膚炎またはアトピー性皮膚炎の治療剤として有用
であることが明らかにされた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、結核菌感作と同時にMR16-1を投与した
際の、MR16-1のマウス遅延型足せき浮腫反応抑制作用を
示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ１２Ｐ 21/08 16/28 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インターロイキン-6（IL-6）アンタゴニ
   ストを有効成分として含有する感作T 細胞関与疾患の予
   防または治療剤。
2. 【請求項２】 IL-6アンタゴニストがIL-6受容体に対す
   る抗体であることを特徴とする請求項1 記載の予防また
   は治療剤。
3. 【請求項３】 IL-6アンタゴニストがIL-6受容体に対す
   るモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項2
   に記載の予防または治療剤。
4. 【請求項４】 IL-6アンタゴニストがヒトIL-6受容体に
   対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求
   項3 に記載の予防または治療剤。
5. 【請求項５】 IL-6アンタゴニストがマウスIL-6受容体
   に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請
   求項3 に記載の予防または治療剤。
6. 【請求項６】 IL-6アンタゴニストがPM-1抗体であるこ
   とを特徴とする請求項4 に記載の予防または治療剤。
7. 【請求項７】 IL-6アンタゴニストがMR16-1抗体である
   ことを特徴とする請求項5 に記載の予防または治療剤。
8. 【請求項８】 IL-6アンタゴニストがヒト抗体定常領域
   を有するIL-6受容体に対する抗体であることを特徴とす
   る請求項4 に記載の予防または治療剤。
9. 【請求項９】 IL-6アンタゴニストがIL-6受容体に対す
   るキメラ抗体またはヒト型化抗体であることを特徴とす
   る請求項4 に記載の予防または治療剤。
10. 【請求項１０】 IL-6アンタゴニストがヒト型化PM-1抗
    体であることを特徴とする請求項9 に記載の予防または
    治療剤。
11. 【請求項１１】 感作T 細胞関与疾患が、多発性硬化
    症、ぶどう膜炎、慢性甲状腺炎、遅延性過敏症、接触性
    皮膚炎またはアトピー性皮膚炎である、請求項1 ないし
    10に記載の予防または治療剤。
12. 【請求項１２】 IL-6アンタゴニストを有効成分として
    含有する感作T 細胞抑制剤。
13. 【請求項１３】 IL-6受容体に対する抗体を有効成分と
    して含有する感作T細胞抑制剤。