TWI523661B - Anti-IL-6 receptor antibody in the manufacture of inhibitors of metastatic inhibition of lung cancer metastasis to the liver - Google Patents

Anti-IL-6 receptor antibody in the manufacture of inhibitors of metastatic inhibition of lung cancer metastasis to the liver Download PDF

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Description

抗IL-6受體抗體在製造抑制肺癌轉移至肝臟之轉移抑制劑的用途
本發明係關於以IL-6抑制劑作為有效成分之癌之轉移抑制劑。再者，本發明係關於利用以IL-6抑制劑作為有效成分之癌之轉移抑制劑而抑制癌的轉移的方法。
介白素6(IL-6)係稱為B細胞刺激因子(BSF2)或干擾素β2的細胞激素(cytokine)。IL-6被發現為與B淋巴球系細胞活性化相關的分化因子(非專利文獻1)，其後，了解其為影響涉及各種細胞機能的多機能細胞激素(非專利文獻2)。已有報告IL-6誘導T淋巴系細胞的成熟化(非專利文獻3)。
IL-6於細胞上經由二種蛋白質傳達其生物學活性。其中一種蛋白質為IL-6結合之分子量約80kD的配體結合性蛋白質的IL-6受體(非專利文獻4、5)。IL-6受體除了貫通細胞膜且於細胞膜上表現的膜結合型以外，主要係以由其細胞外領域所成之可溶性IL-6受體存在。
另一種蛋白質為非配體結合性的信號傳達相關之分子量約130kD的膜蛋白質gp130。IL-6與IL-6受體係形成IL-6/IL-6受體複合體，其次經由與gp130結合，於細胞內傳達IL-6的生物學活性(非專利文獻6)。
繼發器官(secondary organ)中為癌細胞的傳播及增殖之轉移，為因癌症死亡的第一位(非專利文獻7)。例如，肝臟為黑色素瘤以及結腸癌與乳癌的頻繁轉移部位。發生肝轉移時，疾病的自然歷程係與預後不良相關。因此，轉移性肝癌的新穎治療法的開發有急迫性的需要。腫瘤的轉移，係腫瘤細胞由原發器官向遠隔部位移動經由一連串生物學階段而進行。此過程之際，腫瘤的轉移係為各種各樣的遺傳性與後天性的重要因素所支配(非專利文獻8)。
核因子(NF)-κB轉錄引子係與炎症及細胞凋亡的抑制有關係之基因的重要調節物質(非專利文獻9)。靜止細胞中，NF-κB係經由與IκB結合而於細胞質內維持不活性狀態，其會因如腫瘤壞死因子(TNF)-α與細菌的脂多醣(LPS)等方式之刺激而反應，進而急速分解，藉此而產生NF-κB的活性化與流入核內(非專利文獻10)。此過程必須藉由三個次單元IKKα、IKKβ及IKKγ所構成之IκB激酶(Ikk)複合物所致之IκB的磷酸化。IKKβ對於經由IκB分解，以及經由前炎症性刺激以及病原體關連分子形式(PAMP)反應之NF-κB的活性化為重要的。
NF-κB轉錄因子有作為與發癌及癌症關聯之重要要素的功能之可能性(非專利文獻11)。NF-κB顯示於結腸炎關聯癌(CAC)(非專利文獻12)與癌症關聯肝癌(非專利文獻13)中腫瘤形成的促進手段。然而，NF-κB活性化，於明確與炎症無關連之癌中尚有作為重要調節物質之功能的可能性(非專利文獻14)。基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase)以及絲蛋白酶尿激酶型(serine protease urokinase)血漿素原(plasminogen)活性化因子(uPA)，於腫瘤的浸潤以及轉移中擔任重要角色，經由NF-κB而受到調節(非專利文獻15)。經由NF-κB同樣地受到強力調節之環氧合酶(cyclooxygenase)(COX)-2，為對多數的刺激反應、由多種細胞類型所產生的誘導酵素。近來，COX-2的過度表現，已於包含結腸癌、乳癌、前列腺癌以及胰臟癌之幾種類型的人類癌中檢出，顯示調控包含轉移之多種細胞的過程(非專利文獻16)。進一步地，已有報告多數的NF-κB調節基因與腫瘤的轉移有關。由此可知，NF-κB的抑制，提供對於轉移腫瘤發生的治療之替代方案的可能性。
IL-6為調節免疫以及炎症反應、細胞增殖以及細胞生存之多功能細胞激素。然而，IL-6由於具有腫瘤促進以及腫瘤抑制功能兩者，於腫瘤形成中，其功能的關係亦不甚明確。近來，已有報告揭示於腫瘤形成中，支配IL-6產生之有說服力的機制(非專利文獻17至19)。例如，Naugler等人(非專利文獻17)報告雌激素在暴露於化學致癌物質的小鼠中，抑制IL-6分泌。經由該雌激素的抑制，於同一研究中觀察到肝癌發生的雄性特異性增加的原因之可能性。進一步地，經由數個研究，已有報告於患有各種癌之患者中IL-6血清濃度高，此點與預後不良有關(非專利文獻20至21)。
又，與本申請案之發明有關之先前技術文獻資料如下所示。
【先前技術文獻】
【非專利文獻】
【非專利文獻1】 Hirano,T. et al.,Nature(1986)324,73-76
【非專利文獻2】Akira,S. et al.,Adv. In Immunology(1993)54,1-78
【非專利文獻3】 Lotz,M. et al.,J. Exp. Med.(1988)167,1253-1258
【非專利文獻4】Taga,T. et al.,J. Exp. Med.(1987)166,967-981
【非專利文獻5】 Yamasaki,K et al.,Science(1988)241,825-828
【非專利文獻6】 Taga,T. et al.,Cell(1989)58,573-581
【非專利文獻7】 Steeg,P. S. Nat. Med. 12,895-904(2006)
【非專利文獻8】 Steeg,P. S. %Theodrescu,D. Nat Clin Pract Oncol 5,206-219(2008)
【非專利文獻9】 Karin,M. & Lin,A. Nat. Immunol 3,221-227(2002)
【非專利文獻10】 Ghosh,S. & Karin,M. Cell 109 Suppl,S86-96(2002)
【非專利文獻11】 Karin,M. et al.,Nat rev Cancer 2,301-310(2002)
【非專利文獻12】 Greten,F. R. et al.,Cell 118,285-296(2004)
【非專利文獻13】 Pikarsky,E. et al.,Nature 431,461-466(2004)
【非專利文獻14】Maeda,S. et al.,Cell 121,977-990(2005)
【非專利文獻15】 Bond,M. et al.,FEBS Lett. 435,29-34(1998)
【非專利文獻16】 Sarkar,F. H. et al.,Mini Rev Med Chem 7,599-608(2007)
【非專利文獻17】 Naugler,W. E. et al.,Science 317,121-124(2007)
【非專利文獻18】 Gao,S. P. et al.,J. Clin Invest. 117,3846-3856(2007)
【非專利文獻19】 Sansone,P. et al.,J. Clin. Invest. 117,3988-4002(2007)
【非專利文獻20】 Ashizawa,T. et al.,Gastric Cancer 8,124-131(2005)
【非專利文獻21】 Matzaraki,V. et al.,Clin. Biochem. 40,336-342(2007)
因此，本發明之目的係提供新穎的癌之轉移抑制劑。更具體而言，本發明之課題係提供以IL-6抑制劑作為有效成分之癌之轉移抑制劑。
本發明者們，為了決定肝臟的NF-κB活性化是否與轉移腫瘤的發生有關係，使用經脾臟所誘導之肝轉移動物模式。防止肝細胞中NF-κB活性化之IKKβ的肝細胞特異性的缺失，幾乎不影響轉移腫瘤的發生。相對於此，肝細胞以及源自造血之細胞兩者中，IKKβ缺失時，腫瘤的發生顯著減少。腫瘤細胞所鄰接之血球系統細胞(庫氏細胞)活性化，產生介白素(IL)-6等絲裂原，該等促進腫瘤的增殖以及血管新生。該等絲裂原的產生，於血球系統庫氏細胞中，依存於NF-κB。再者，經由抗IL-6受體抗體的治療，轉移腫瘤的發生程度降低，此亦顯示IL-6與肝轉移相關。
亦即，由本發明者們，顯示腫瘤的轉移依存於炎症，顯示於轉移腫瘤的化學性預防中，以庫氏細胞為目標之前炎症的介入為有用的。
本發明更具體提供以下[1]至[28]者。
[1]　一種癌之轉移抑制劑，係以IL-6抑制劑作為有效成分。
[2]　如[1]所述之轉移抑制劑，其係抑制癌對肝臟的轉移。
[3]　如[1]或[2]所述之轉移抑制劑，其中，IL-6抑制劑為IL-6受體抑制劑。
[4]　如[3]所述之轉移抑制劑，其中，IL-6受體抑制劑為人類IL-6受體抑制劑。
[5]　如[3]或[4]所述之轉移抑制劑，其中，IL-6受體抑制劑為抗IL-6受體的抗體。
[6]　如[5]所述之轉移抑制劑，其中，抗IL-6受體的抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
[7]　如[1]至[6]中任一項所述之轉移抑制劑，其係抑制肺癌對肝臟的轉移。
[8]　一種抑制癌之轉移的方法，包含投予對象IL-6抑制劑的步驟。
[9]　如[8]所述之方法，其係抑制癌對肝臟的轉移。
[10]　如[8]或[9]所述之方法，其中，IL-6抑制劑為IL-6受體抑制劑。
[11]　如[10]所述之方法，其中，IL-6受體抑制劑為人類IL-6受體抑制劑。
[12]　如[10]或[11]所述之方法，其中，IL-6受體抑制劑為抗IL-6受體的抗體。
[13]　如[12]所述之方法，其中，抗IL-6受體的抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
[14]　如[8]至[13]中任一項所述之方法，其係抑制肺癌對肝臟的轉移。
[15]　一種IL-6抑制劑的用途，其係用於製造癌之轉移抑制劑。
[16]　如[15]所述之用途，其係抑制癌對肝臟的轉移。
[17]　如[15]或[16]所述之用途，其中，IL-6抑制劑為IL-6受體抑制劑。
[18]　如[17]所述之用途，其中，IL-6受體抑制劑為人類IL-6受體抑制劑。
[19]　如[17]或[18]所述之用途，其中IL-6受體抑制劑為抗IL-6受體的抗體。
[20]　如[19]所述之用途，其中，抗IL-6受體的抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
[21]　如[15]至[20]中任一項所述之用途，其係抑制肺癌對肝臟的轉移。
[22]　一種IL-6抑制劑，其係使用於抑制癌之轉移的方法。
[23]　如[22]所述之IL-6抑制劑，其係抑制癌對肝臟的轉移。
[24]　如[21]或[22]所述之IL-6抑制劑，其係IL-6受體抑制劑。
[25]　如[24]所述之IL-6抑制劑，其中，IL-6受體抑制劑為人類IL-6受體抑制劑。
[26]　如[24]或[25]所述之IL-6抑制劑，其中，IL-6受體抑制劑為抗IL-6受體的抗體。
[27]　如[26]所述之IL-6抑制劑，其中，抗IL-6受體的抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
[28]　如[22]至[27]中任一項之IL-6抑制劑，其係抑制肺癌對肝臟的轉移。
本發明之「IL-6抑制劑」為阻斷源自IL-6之信號傳遞，抑制IL-6生物學活性之物質。IL-6抑制劑之具體例，可列舉結合於IL-6的物質、抑制IL-6表現的物質、結合於IL-6受體的物質、抑制IL-6受體表現的物質、結合於gp130的物質、抑制gp130表現的物質等。IL-6抑制劑並無特別限定，包含抗IL-6抗體、抗IL-6受體抗體、抗gp130抗體、IL-6改質體、可溶性IL-6受體改質體、IL-6部分胜肽、IL-6受體部分胜肽、與前述顯示同樣活性之低分子化合物、反意義(antisense)、siRNA等。
本發明中IL-6抑制劑之較佳態樣，可列舉IL-6受體抑制劑。
本發明中，「IL-6受體抑制劑」為經由IL-6受體而阻斷信號傳遞，抑制I-6生物學活性的物質。IL-6受體抑制劑較佳為具有結合於IL-6受體、抑制IL-6與IL-6受體結合的活性的物質。
本發明之IL-6受體抑制劑，例如可列舉抗IL-6受體抗體、可溶性IL-6受體改質體、IL-6受體的部分胜肽、與前述顯示同樣活性之低分子化合物等，無特別限定。本發明之IL-6受體抑制劑的較佳例，可列舉辨識IL-6受體的抗體。
本發明所使用之抗IL-6受體抗體的來源並無特別限定，可列舉較佳為哺乳動物來源，更較佳為源自人類之抗體。
本發明所使用之抗IL-6受體抗體，可使用習知手段製作多株抗體或單株抗體而獲得。本發明所使用之抗IL-6受體抗體，特別較佳為源自哺乳動物之單株抗體。源自哺乳動物之單株抗體，可為融合瘤所產生者，且亦包含經由遺傳工程方法以含有抗體基因的表現載體轉形至宿主所產生者。
抗IL-6受體抗體係經由與IL-6受體結合，抑制IL-6對IL-6受體的結合而阻斷IL-6生物學活性對細胞內的傳遞。該等抗體，可列舉MR16-1抗體(Tamura,T. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993)90,11924-11928)、PM-1抗體(Hirata,Y. et al.,J. Immunol.(1989)143,2900-2906)、AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體(國際專利申請案公開號WO 92-19759)等。此等之中，對於人類IL-6受體較佳之單株抗體，列舉PM-1抗體，而對小鼠IL-6受體之較佳單株抗體，列舉MR16-1抗體，但不以該等為限定。
抗IL-6受體單株抗體產生的融合瘤，係使用基本的習知技術，可根據以下方式製作。亦即，使用IL-6受體作為敏化抗原，將其以一般免疫方法進行免疫，所得免疫細胞經由一般的細胞融合法與習知的親代細胞融合，經由一般的篩選法，經由篩選而可製作產生單株抗體的細胞。
具體而言，製作抗IL-6受體抗體為如下所述之任一者即可。例如，使用作為抗體取得之敏化抗原的人類IL-6受體，可經由使用揭示於歐洲專利申請案公開號EP325474，小鼠IL-6受體可經由使用揭示於日本專利申請案公開號特開平3-155795之IL-6受體基因/胺基酸序列而獲得。
IL-6受體蛋白質有表現於細胞膜上者與由細胞膜脫離者(可溶性IL-6受體)(Yasukawa,K. et al.,J. Biochem.(1990)108,673-676)之二種類。可溶性IL-6受體係由結合於細胞膜之IL-6受體的實質上細胞外區域所構成，從缺少細胞膜貫穿區域或細胞膜貫穿區域與細胞內區域的點來看，與膜結合型IL-6受體不同。IL-6受體蛋白質只限於以作為本發明所使用之IL-6受體抗體的製作之敏化抗原使用，可使用任一種IL-6受體。
IL-6受體的基因序列插入至習知的表現載體系統而轉形至適當宿主細胞後，從該宿主細胞中或由培養上清液中，以習知方法精製目的之IL-6受體蛋白質，也可將該精製的IL-6受體蛋白質作為敏化抗原使用。再者，表現IL-6受體之細胞或IL-6受體蛋白質與其他蛋白質融合的蛋白質亦可作為敏化抗原使用。
作為以敏化抗原產生免疫之哺乳動物，無特別限定，但較佳為考慮與用於細胞融合之親代細胞的適合性而選擇者，一般而言，使用嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠等。
對於以敏化抗原使動物免疫，可依據習知方法進行。例如，一般的方法為將敏化抗原注射於動物的腹腔內或皮下而進行。具體而言，較佳為將敏化抗原以PBS(磷酸緩衝生理鹽水)或生理鹽水等稀釋、懸浮為適當量者，根據需要與適當的佐劑，例如弗氏完全佐劑，適量混合、乳化後，於4至21日數次投予哺乳動物。再者，以敏化抗原免疫時可使用適當載體。
該等免疫，於確認血清中所期望的抗體濃度上升後，由哺乳動物取出免疫細胞，進行細胞融合。進行細胞融合之較佳免疫細胞，特別可列舉脾細胞。
作為前述與免疫細胞融合之其他親代細胞的哺乳動物骨髓瘤，可適宜使用已知之各種細胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney,J. F. et al.,J. Immunol.(1979)123,1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(Kohler,G. and Milstein,C. Eur. I. Immunol.(1976)6,511-519)、MPC-11(Margulies,D. H. et al.,Cell(1976)8,405-415)、SP2/0(Shulman,M. et al.,Nature(1978)276,269-270)、FO(de St. Groth,S. F. et al.,J. Immunol. Methods(1980)35,1-21)、S194(Trowbridge,I. S. J. Exp. Med.(1978)148,313-323)、R210(Galfre,G. et al.,Nature(1979)277,131-133)等。
前述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合，可根據基本的習知方法，例如Milstein等的方法(Kohler,G. and Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等。
更具體而言，前述細胞融合例如於細胞融合促進劑的存在下於一般營養培養液中實施。作為融合促進劑，例如使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，更可視需要為了提高融合效率，也可添加使用二甲基亞碸等輔助劑。
免疫細胞與骨髓瘤細胞的使用比例，例如相對於骨髓瘤細胞，免疫細胞較佳為1至10倍。作為前述細胞融合所使用之培養液，例如可使用適合於前述骨髓瘤細胞株增殖之RPMI1640培養液、MEM培養液、其他各種細胞培養中所使用之一般培養液，再者，亦可併用胎牛血清(FCS)等血清補充液。
細胞融合係將前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之規定量，於前述培養液中均勻混合，以30至60%(w/v)的濃度添加預先加溫至約37℃左右之PEG溶液，例如通常為平均分子量1000至6000左右的PEG溶液，經由混合而形成目的之融合細胞(融合瘤)。接著，逐次添加適當培養液，經由重複操作離心、去除上清液的操作，可去除對融合瘤生長不佳的細胞融合劑等。
該融合瘤經由以通常的選擇培養液，例如HAT培養液(含有次黃嘌呤(hypoxantine)、胺基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶去氧核苷(thymidine)之培養液)培養而予以選擇。該HAT培養液之培養，係以目的之融合瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡的充分時間，通常持續數日至數週。因此，實施一般的限數稀釋法(limiting dilution)，進行目的之產生抗體的融合瘤的篩選以及選殖。
再者，除了於人類以外的動物以抗原予以免疫可獲得上述融合瘤以外，於活體外以所期望之抗原蛋白質或抗原表現細胞敏化人類淋巴球、使敏化的B淋巴球與例如U266的融合瘤細胞融合，可獲得對所期望之抗原或抗原表現細胞具有結合活性之人類抗體(參照特公平1-59878)。再者，對具有人類抗體基因建構的基因轉殖動物投予抗原或抗原表現細胞，根據前述方法亦可取得所期望的人類抗體(參照國際專利申請案公開號WO 93/1227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
該方式所製作之產生單株抗體的融合瘤，可於通常的培養基中繼代培養，又可於液態氮中長期保存。
由該融合瘤取得單株抗體，可採用將該融合瘤以通常的方法培養，以取得其培養上清液的方法，或將融合瘤投予至與其有適合性的哺乳動物使其增殖，以取得其腹水的方法等。前者的方法，合適於獲得高純度抗體，另一方面，後者的方法適合於抗體的大量生產。
例如，產生抗IL-6受體抗體之融合瘤的製作，可根據特開平3-139293所揭示之方法進行。將產生PM-1抗體的融合瘤注入至BALB/c小鼠的腹腔內而取得腹水，由該腹水精製PM-1抗體的方法，或將本融合瘤以適當的培養基，例如含有10%胎牛血清、5%BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim製造)之RPMI1640培養基、融合瘤SFM培養基(GIBCO-BRL製造)、PFHM-II培養基(GIBCO-BRL製造)等培養，由其培養上清液精製PM-1抗體的方法而可進行。
本發明中，作為單株抗體，可使用由融合瘤選殖抗體基因，組入適當的載體後，將其導入宿主之使用基因重組技術所產生之重組型抗體(例如，參照Borrebaeck,C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODYES,Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD,1990)。
具體而言，從產生目的抗體之細胞，例如融合瘤，分離編碼抗體之可變(V)區域的mRNA。mRNA的分離，係根據習知方法例如經由胍超離心法(Chirgwin,J. M. et al.,Biochemistry(1979)18,5294-5299)、AGPC法(Chromozynski,P. et al.,Anal. Biochem.(1987)162,156-159)等調製全RNA，使用mRNA Purification Kit(Pharmacia製造)等而調製mRNA。再者，可經由使用QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia製造)直接調製mRNA。
所得之mRNA使用反轉錄酵素合成抗體V區域之cDNA。cDNA的合成，可使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Systhesis Kit等進行。再者，進行cDNA的合成以及擴增時，可使用5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製造)以及使用PCR之5’-RACE法(Frohman,M. A. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85,8998-9002;Belyavsky,A. et al.,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919-2932)。從所得之PCR產物精製目的之DNA片段，與載體DNA連結。進一步地，由該等所製成之重組載體，導入大腸桿菌等，選擇菌落，調製所期望的重組載體。目的之DNA的鹼基序列，經由習知方法例如脫氧法確認。
一旦獲得編碼目的抗體之V區域的DNA，將其與編碼所期望抗體的恒定區域(C區域)的DNA連結後，將其組入表現載體。或者，亦可將編碼抗體V區域之DNA組入包含抗體C區域的DNA之表現載體。
製造本發明所使用之抗體時，如後文所述方式將抗體基因組入具有表現調控區域，例如增強子(enhancer)、啟動子(promoter)之調控的表現載體。其次，該表現載體經由將宿主細胞轉形，而可使抗體表現。
本發明中，為了降低對人類之異種抗原性等目的而人為突變之基因重組抗體，可使用例如嵌合(Chimeric)抗體、人源化(Humanized)抗體。該等突變抗體可使用已知方法製造。
嵌合抗體係經由將前文所述方式獲得之編碼抗體V區域之DNA，與編碼人類抗體C區域之DNA連結後，將其組入表現載體，導入宿主後使其產生而獲得(參照歐洲專利申請案公開號EP 125023、國際專利申請案公開號WO 92-19759)。使用該等已知方法，可獲得本發明中有用之嵌合抗體。
人源化抗體，亦稱為改形(reshaped)人類抗體或人類型化抗體，係將人類以外的哺乳動物，例如小鼠抗體的互補性決定區域(CDR)移植至人類抗體之互補性決定區域，其一般的基因重組手法亦為已知(參照歐洲專利申請案公開號EP 125023、國際專利申請案公開號WO 92-19759)。
具體而言，以小鼠抗體的CDR與人類抗體的框架區域(FR；framework region)連結方式所設計之DNA序列，以末端具有重疊(overlap)部分的方式所製作之數個寡核苷酸，由該等寡核苷酸經由PCR法而合成。所製得之DNA，與編碼人類抗體C區域之DNA連結，其次將其組入表現載體，導入宿主使其產生而製得(參照歐洲專利申請案公開號EP 239400、國際專利申請案公開號WO 92-19759)。
經由CDR所連結之人類抗體的FR，選擇互補性決定區域為形成良好抗原結合部位者。必要時，改形人類抗體的互補性決定區域係以形成適當的抗原結合部位之方式，亦可置換抗體可變區域的框架區域的胺基酸(Sato,K. et al.,Cancer Res.(1993)53,851-856)。
嵌合抗體、人源化抗體中使用人類抗體C區域。人類抗體重鏈C區域，可列舉Cγ等，例如Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。人類抗體輕鏈C區域，例如可列舉κ或λ。再者，為了改善抗體或其產生安定性，亦可修飾人類抗體C區域。
嵌合抗體係由源自人類以外的哺乳動物的抗體可變區域，與源自人類抗體之C區域所構成，而人源化抗體係由源自人類以外的哺乳動物的抗體互補性決定區域，與源自人類抗體的框架區域以及C區域所構成，由於該等於人類體內的抗原性降低，有用於作為本發明所使用之抗體。
本發明所使用之人源化抗體之較佳具體例，可列舉人源化PM-1抗體(參照國際專利申請案公開號WO 92-19759)，或於人源化PM-1抗體的胺基酸序列中具有1個或複數個胺基酸序列經置換、缺失、附加及/或插入之胺基酸序列的抗體。更具體例可列舉托珠單抗(tocilizumab)。又，其他具體例可列舉WO2009/041621所揭示之抗體。
再者，人類抗體的取得方法除了前文所述之方法以外，亦已知使用人類抗體資料庫，經由淘選(panning)而取得人類抗體的技術。例如，亦可將人類抗體的可變區域作為單鏈抗體(scFv)經由噬菌體展示(phage display)法表現於噬菌體表面，選擇結合於抗原的噬菌體。只要解析所選擇之噬菌體的基因，就可確認編碼結合於抗原之人類抗體可變區域的DNA序列。結合於抗原之scFv的DNA序列一旦解明後，製作包含該序列之適當表現載體，可取得人類抗體。該等方法為已知者，可參考WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388。
如前文所述方式所構築之抗體基因，可經由習知方法使其表現。使用哺乳類細胞時，可經由常用之有用的啟動子、表現抗體基因，以於其3’側下游功能性結合多A信號(poly A signal)的DNA或經由包含其等之載體而可使其表現。作為啟動子/增強子，例如可列舉人類巨細胞病毒早期立即啟動子/增強子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。
再者，本發明所使用之其他可使用於抗體表現之啟動子/增強子，可使用反轉錄病毒(retrovirus)、多瘤病毒(polyomavirus)、腺病毒(adenovirus)、猴病毒40(simian virus 40(SV40))等病毒啟動子/增強子或人類延長因子1α(HEF1α)等源自哺乳動物類細胞之啟動子/增強子。
例如，使用SV40啟動子/增強子時，可根據Mulligan等人的方法(Mulligan,R. C. et al..Nature(1979)277,108-114)，而使用HEF1α啟動子/增強子時，可根據Mizushima等人的方法(Mizushima,S. and Nagata,S. Nucleic Acid Res.(1990)18,5322)而容易實施。
使用原核細胞作為宿主時，有使用細菌細胞之產生系統。作為細菌細胞，已知有大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌。
大腸桿菌的情況中，可將常用之有用的啟動子、抗體分泌用信號序列、功能性結合已表現的抗體基因而使其表現。例如，作為啟動子可列舉lacZ啟動子、araB啟動子。使用lacZ啟動子時，可根據Ward等人的方法(Ward,E. S. et al.,Nature(1989)341,544-546'Ward,E. S. et al.,FASEB J.(1992)6,2422-2427)，使用araB啟動子時,可使用Better等人的方法(Better,M. et al.,Science(1988)240,1041-1043)即可。
作為抗體分泌用信號序列，產生於大腸桿菌的細胞周質(periplasm)時，可使用pelB信號序列(Lei,S. P. et al.,J. Bacteriol.(1987)169,4379-4383)。將產生於細胞周質之抗體分離後，將抗體構造進行適當的再折疊(refold)而使用(例如參照WO96/30394)。
作為複製起源，可使用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳狀瘤病毒(Bovine Papilloma Virus,BPV)者，進一步地，以宿主細胞用於基因複製數擴增，表現載體可包含作為篩選標記之胺基糖苷酸轉移酶(APH)基因、胸腺嘧啶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(xanthine-guanine phosphoribosyltransferase；Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酵素(dhfr)基因等。
本發明所使用之抗體的製造，可使用任意的產生系統。用於抗體製造的產生系統，有活體外(in vitro)以及活體內(in vivo)的產生系統。作為活體外的產生系統，可列舉使用真核細胞的產生系統或使用原核細胞的產生系統。
使用真核細胞作為宿主時，有使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞的產生系統。動物細胞已知(1)哺乳類細胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(倉鼠胎腎細胞)、HeLa、Vero等，(2)兩棲類細胞，例如非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母細胞，或(3)昆蟲細胞，例如sf9、sf21、Tn5等。植物細胞已知源自菸草(Nicotiana tabacum)的細胞，可將其進行癒傷組織培養。真菌細胞已知酵母，例如釀酒酵母(Saccharomyces)屬，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，絲狀菌，例如黴菌屬(Aspergillus)屬，例如黑黴菌(Aspergillus niger)等。
該等細胞中，目的之抗體基因經由轉形而導入，經由於活體外培養經轉形之細胞可獲得抗體。培養係根據習知方法進行。例如，可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作為培養液，亦可併用胎牛血清(FCS)等血清補充液。再者，導入抗體基因之細胞經由移至動物的腹腔等，亦可進行活體內產生抗體。
另一方面，作為活體內產生系統，可列舉使用動物之產生系統或使用植物之產生系統。使用動物時，有使用哺乳類動物、昆蟲之產生系統等。
作為哺乳類動物，可使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications,1993)。再者，作為昆蟲，可使用蠶。使用植物的情況，例如可使用菸草。
於該等動物或植物導入抗體基因，於動物或植物的體內產生抗體，予以回收。例如，編碼於山羊β酪蛋白等乳汁中固有生產的蛋白質之基因中插入抗體基因，而調製融合基因。包含經抗體基因插入之融合基因的DNA片段，注入至山羊的胚胎，將該胚胎導入至雌山羊。由接受胚胎之山羊所產生之基因轉殖山羊或其子孫所產生之乳汁可獲得所期望之抗體。為了增加由基因轉殖山羊所產生之包含所期望抗體的乳汁量，亦可於基因轉殖山羊使用適合的荷爾蒙(Ebert,K. M. et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702)。
再者，使用蠶的情況中，經插入目的抗體基因之桿狀病毒，使其感染蠶，由該蠶的體液可得所期望的抗體(Maeda,S. et al.,Nature(1985) 315,592-594)。進一步地，使用菸草的情況中，將目的抗體基因，插入例如pMON530的植物表現載體中，將該載體導入如農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens)等細菌中。將該細菌感染菸草，例如Nicotiana tabacum，由該菸草的葉可得所期望的抗體(Julian,K. -C. Ma,et al.,Eur. J. Immunol.(1994)24,131-138)。
如上所述之活體外或活體內的產生系統產生抗體時，亦可將編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA之個別表現載體重組而同時轉形於宿主，或編碼H鏈以及L鏈的DNA之單一表現載體重組，亦可使宿主轉形(參照國際專利申請案公開號WO 94-11523)。
本發明所使用之抗體，只要是適合於本發明所使用者，亦可為抗體的片段或其修飾物。例如，作為抗體的片段，可列舉Fab、F(ab’)2、Fv或H鏈與L鏈的Fv以適當連結子(linker)連結之單鏈Fv(scFv)。
具體而言，抗體以例如木瓜酵素、胰蛋白酶之酵素處理而生成抗體片段，或將編碼該等抗體片段之基因構築，將其導入表現載體後，以適當的宿主細胞表現(例如，參照Co,M. S. et al.,J. Immunol.(1994)152,2968-2976,Better,M. & Horwitz,A. H. Methods in Enzymology(1989)178,476-496,Plueckthun,A. & Skerra,A. Methods in Enzymology(1989)178,497-515,Lamoyi,E. Methods in Enzymology(1989)121,652-663,Rousseaux,J. et al.,Methods in Enzymology(1989)121,663-66,Bird,R. E. et al.,TIBTECH(1991)9,132-137)。
scFv可經由抗體的H鏈V區域與L鏈V區域而獲得。該scFv中，H鏈V區域與L鏈V區域係經由連結子，較佳為胜肽連結子予以連結(Huston,J. S. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988)85,5879-5883)。scFv中之H鏈V區域與L鏈V區域，雖可為上述抗體所揭示者，亦可為源自任一者。連結V區域之胜肽連結子，例如使用由胺基酸12至19殘基所成之任一單鏈胜肽。
編碼scFv的DNA，以編碼前述抗體之H鏈或H鏈V區域之DNA，以及編碼L鏈或L鏈V區域之DNA作為模板(template)，於編碼該等序列中所期望胺基酸序列的DNA部分，使用其兩端規定之引子對經由PCR而擴增，其次，將編碼胜肽連結子之DNA以及其兩端之個別H鏈、L鏈予以連結的方式組合所規定之引子對，經由擴增而可獲得。
再者，一旦製作編碼scFv的DNA，根據常法可製得含有其之表現載體，以及經由該表現載體轉形之宿主。再者，根據常法使用該宿主，可獲得scFv。
該等抗體片段，與前述同樣方式取得該基因而予以表現，可經由宿主使其產生。本發明之「抗體」亦包含該等抗體的片段。
作為抗體的修飾物，可使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合的抗體。本發明之「抗體」亦包含該等抗體修飾物。又此所得之抗體修飾物中，可於所得抗體施行化學性修飾而獲得。該等方法與此項技術領域中予以確立。
如前述方式所產生、表現之抗體，可由細胞內外、宿主予以分離，精製至均一為止。本發明所使用之抗體的分離、精製，可經由親和性層析法而進行。使用於親和性層析法的管柱，例如可列舉Protein A管柱、Protein G管柱。作為使用於Protein A管柱的載體，例如，可列舉HyperD、POROS、Sepharose F.F.等。除此之外，一般蛋白質所使用之分離、精製方法也使用，無任何限定。
例如，適宜地選擇、組合上述親和性層析法以外的層析法、過濾、超過濾、鹽析、透析等，可分離、精製本發明所使用之抗體。層析法例如可列舉離子交換層析法、疏水性層析法、凝膠過濾等。該等層析法可適用於HPLC(高效液相層析(high performance liquid chromatography))。再者，亦可使用逆相HPLC(reverse phase HPLC)。
上述所得抗體的濃度測定，可經由吸光度的測定或ELISA等進行。亦即，經由吸光度的測定時，以PBS(-)適當稀釋後，測定280nm的吸光度，以1mg/ml為1.35OD算出。再者，經由ELISA時可依以下的方式測定。亦即，與0.1M碳酸氫鹽緩衝液(pH9.6)稀釋為1μg/ml的山羊抗人類IgG(TAG製造)100μl添加至96孔盤(Nunc製造)，於4℃培養一夜，將抗體固相化。封阻(blocking)後，添加100μl之經適當稀釋之本發明所使用之抗體或包含抗體之樣品，或標準品之人類IgG(CAPPEL製造)，於室溫進行培養1小時。
洗淨後，添加經5000倍稀釋之鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)標是抗人類IgG(BIO SOURCE製造)100μl，於室溫進行培養1小時。洗淨後，添加基質溶液且培養後，使用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad製造)，測定405nm的吸光度，算出目的抗體的濃度。
IL-6受體部分胜肽為，IL-6受體的胺基酸序列中，IL-6與IL-6受體的結合相關區域的一部分或全部的胺基酸序列所成之胜肽。此胜肽通常由10至80個，較佳由20至50個，更較佳由20至40個胺基酸殘基所成。
IL-6受體部分胜肽可由特定IL-6受體的胺基酸序列中IL-6與IL-6受體結合的相關區域，根據該特定之區域的一部分或全部，經由通常已知方法，例如基因工程或胜肽合成法而製作。
IL-6受體部分胜肽經由基因工程方法製作時，將編碼所期望胜肽的DNA組入表現載體，基於前述重組型抗體的表現、產生以及精製方法而可製得。
IL-6受體部分胜肽經由胜肽合成法製作時，可使用胜肽合成中通常使用之方法，例如固相合成法或液相合成法。
具體而言，亦可根據續醫藥品的開發第14卷胜肽合成，矢島治明監修，廣川書店1991年所揭示的方法為基準而進行。作為固相合成法，例如可使用於有機溶劑中，使對應於不溶性支持體上合成的胜肽C端之胺基酸結合，以適當保護基保護α-胺基及側鏈官能基之胺基酸，由C端至N端的方向，依序每次使1個胺基酸縮合的反應，與結合於樹脂上之胺基酸或胜肽的α-胺基的保護基脫離的反應，交互重複操作，使肽鏈延長的方法。固相肽合成法，根據所使用之保護基種類可大致分為Boc法與Fmoc法。
如此合成目的胜肽後，進行脫保護反應及由肽鏈支持體的切斷反應。與肽鏈的切斷反應，在Boc法通常可使用氟化氫或三氟甲烷磺酸，或在Fmoc法通常可使用TFA。Boc法中，例如於氟化氫中將上述保護胜肽樹脂於苯甲醚存在下處理。其次，從保護基的脫離及支持體的切斷回收胜肽。經由將其冷凍乾燥，可得粗製胜肽。另一方面，於Fmoc法中，例如於TFA中以與上述同樣操作，可進行脫保護反應以及肽鏈由支持體的切斷反應。
所得粗製胜肽，可經由適用於HPLC而分離、精製。其每回溶出時，使用蛋白質精製中常用的水-乙腈系溶劑於最適條件下進行即可。分取所得層析法之分布趨勢峰之該溶離份，將其冷凍乾燥。如此所精製之胜肽溶離份，藉由質譜分析而進行分子量解析、胺基酸組成分析或胺基酸序列解析等予以鑑定。
本發明之癌的轉移抑制劑，可使用於抑制源自某部位、組織或器官的癌(例如癌細胞)轉移至其他部位、組織或器官。
本發明之「癌之轉移」意指源自某部位、組織或器官的癌，到達至其他部位、組織或器官，而於該處產生續發性的腫瘤。本發明之「癌之轉移抑制劑」意指癌轉移至其他部位、組織或器官的抑制，癌轉移至其他部位、組織或器官的比例降低，癌轉移至其他部位、組織或器官的時間延長等。
本發明之癌抑制劑可使用於結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前列腺癌、胰癌、腎癌等轉移性癌的轉移抑制。
本發明中，癌的轉移抑制的較佳態樣，可列舉源自肝臟以外的部位、組織或器官的癌對肝臟的轉移的抑制。本發明中，對肝臟轉移的癌只要為源自任何部位、組織或器官的癌即可，並無特別限定。原發病灶之例，可列舉肺、乳房、皮膚、結腸直腸、腎臟、前列腺、胰臟等。本發明之轉移抑制劑，例如可抑制肺癌、大腸癌等轉移至肝臟。本發明之較佳態樣，可列舉肺癌對肝癌的轉移的抑制。
本發明所使用之IL-6抑制劑的轉移抑制劑的效果，例如可評估作為指標之信號傳遞抑制活性，但不限定於此。IL-6抑制劑的信號傳遞抑制活性，可經由一般所使用的方法予以評估。具體而言，培養IL-6依存性骨髓腫瘤(S6B45,KPMM2)、Lennert’s T淋巴腫瘤細胞株KT3或IL-6依存性細胞MH60.BSF2，對其添加IL-6，藉由與IL-6抑制劑同時地共存而可測定IL-6依存性細胞的3H-胸腺嘧啶的攝入即可。再者，培養IL-6受體表現細胞U266，添加125I標識之IL-6，經由同時添加IL-6抑制劑，測定與IL-6受體表現細胞結合之125I標識之IL-6。上述分析系統中，除了IL-6抑制劑存在之群，亦有不含IL-6抑制劑之陰性對照群，於兩者所得結果相比較而可評估IL-6抑制劑之IL-6抑制活性。
如後文所述實施例所示，由於抗IL-6受體抗體抑制癌細胞對肝臟的轉移，抗IL-6受體抗體等IL-6抑制劑有用於作為肝癌轉移抑制劑。
本發明之轉移抑制劑所投予之對象為哺乳動物。哺乳動物較佳為人類。
本發明之轉移抑制劑，可以醫藥品的形態投予，可為經口或非經口的全身或局部投予。例如，可選擇點滴等靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射、栓劑、浣腸、經口性腸溶液等，可根據患者的年齡、症狀而選擇適宜的投予方法。有效投予量，於1次每1公斤體重由0.01mg至100mg的範圍選擇。或者，可選擇每患者1至1000mg，較佳為5至500mg的投予量。較佳投予量、較佳投予方法，例如於抗IL-6受體抗體的情況，血中游離抗體存在程度的量為有效投予量，具體的例為每體重1kg於1個月(4週)為0.5mg至40mg，較佳為1mg至20mg分為1次至數次，例如每週2次、每週1次、每2週1次、每4週1次等投予排程，且以點滴等靜脈內注射、皮下注射等方法之投予方法等。投予排程可一邊觀察患者狀態的觀察以及血液檢查值的動向，而以每週2次或每週1次至每2週1次、每3週1次、每4週1次的方式之投予間隔延以延長等調整。
本發明之肝癌轉移抑制劑中，亦可添加保存劑或安定劑等製劑上容許之載體。製劑上容許之載體意指可與上述藥劑同時投予之材料。製劑上容許之材料，例如可列舉滅菌水或生理食鹽水、安定劑、賦形劑、緩衝劑、防腐劑、界面活性劑、螯合劑(EDTA等)、結合劑等。
本發明中，界面活性劑可列舉非離子性界面活性，例如可列舉山梨醇酐單辛酸酯、山梨醇酐單月桂酸酯、山梨醇酐單棕櫚酸酯等山梨醇酐脂肪酸酯；甘油單辛酸酯、甘油單肉豆蔻酸酯、甘油單硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；聚甘油單硬脂酸酯、聚甘油二硬脂酸酯、聚甘油單亞油酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧伸乙基山梨醇酐單月桂酸酯、聚氧伸乙基山梨醇酐單油酸酯、聚氧伸乙基山梨醇酐單硬脂酸酯、聚氧伸乙基山梨醇酐單棕櫚酸酯、聚氧伸乙基山梨醇酐三油酸酯、聚氧伸乙基山梨醇酐三硬脂酸酯等聚氧伸乙基山梨醇酐脂肪酸酯；聚氧伸乙基山梨醇四硬脂酸酯、聚氧伸乙基山梨醇四油酸酯等聚氧伸乙基山梨醇脂肪酸酯；聚氧伸乙基甘油單硬脂酸酯等聚氧伸乙基甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧伸乙基月桂醚等聚氧伸乙基烷基醚；聚氧伸乙基聚氧丙二醇，聚氧伸乙基聚氧伸丙基丙基醚、聚氧伸乙基聚氧伸丙基鯨蠟醇醚等聚氧伸乙基聚氧伸丙基烷基醚；聚氧伸乙基壬基苯基醚等聚氧伸乙基烷基苯基醚；聚氧伸乙基蓖麻油、聚氧伸乙基硬化蓖麻油(聚氧伸乙基氫蓖麻油)等聚氧伸乙基硬化蓖麻油；聚氧伸乙基山梨醇蜜蠟等聚氧伸乙基蜜蠟衍生物；聚氧伸乙基羊毛脂等聚氧伸乙基羊毛脂衍生物；聚氧伸乙基硬脂酸醯胺等聚氧伸乙基脂肪酸醯胺等具有HLB6至18者等作為典型例。
再者，作為界面活性劑，亦可列舉陰離子界面活性劑，例如可列舉十六基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、油基硫酸鈉等具有碳原子數10至18之烷基的烷基硫酸鹽；聚氧伸乙基月桂基硫酸鈉等環氧乙烷的平均加成莫耳數為2至4之烷基的碳原子數為10至18的聚氧伸乙基烷基醚硫酸鹽；月桂基磺基琥珀酸酯鈉等烷基的碳原子數為8至18的烷基磺基琥珀酸酯鹽；天然系的界面活性劑，例如卵磷酯、甘油磷酯；鞘髓磷酯等鞘髓蛋白脂質；碳原子數12至18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等作為典型例。
本發明之藥劑中，可添加該等界面活性劑之1種或2種以上組合。本發明之製劑所使用之較佳界面活性劑為聚山梨酯20、40、60或80等聚氧伸乙基山梨醇酐肪酸酯，特別較佳為聚山梨酯20及80。再者，較佳為波洛沙姆(poloxamer)(Pluroinic F-68(註冊商標)等)所代表之聚氧伸乙基聚氧丙二醇。
界面活性劑的添加量係根據所使用之界面活性劑的種類而有所不同，為聚山梨酯20或聚山梨酯80的情況時，一般而言為0.001至100mg/mL，較佳為0.003至50mg/mL，再較佳為0.005至2mg/mL。
作為本發明之緩衝劑，可列舉磷酸、檸檬酸緩衝液、乙酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、磷酸鉀、葡糖酸、癸酸、去氧膽酸、水楊酸、三乙醇胺、富馬酸等其他有機酸等，或碳酸緩衝液、Tris緩衝液、組胺酸緩衝液、咪唑緩衝液等。
再者亦可經由溶解於溶液製劑的領域所習知的水性緩衝液而調製溶液製劑。緩衝液的濃度一般為1至500mM，較佳為5至100mM，更較佳為10至20mM。
本發明的藥劑亦可含有其他低分子量的多肽、血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白質、胺基酸、多糖及單糖等糖類或碳水化合物、糖醇。
本發明之胺基酸，可列舉鹼性胺基酸，例如精胺酸、離胺酸、組胺酸、鳥胺酸等，或該等胺基酸之無機鹽(較佳為鹽酸鹽、磷酸鹽的形式，亦即磷酸胺基酸)。使用游離胺基酸的情況，較佳pH值係經由添加適當之生理上所容許之緩衝物質，例如無機酸，特別是鹽酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸或其等之鹽而予以調整。此時，磷酸鹽的使用，特別是由可獲得安定之凍結乾燥物的點而言特別有利。調製物為實質上不含有有機酸，例如蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸等或對應之陰離子(蘋果酸離子、酒石酸離子、檸檬酸離子、琥珀酸離子、富馬酸離子等)不存在時，為特別有利。較佳胺基酸為精胺酸、離胺酸、組胺酸或鳥胺酸。再者，亦可使用酸性胺基酸，例如麩胺酸以及天冬胺酸，以及其之鹽的形式(較佳為鈉鹽)或中性胺基酸，例如異白胺酸、白胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸或丙胺酸，或芳香族胺基酸，例如苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、或其衍生物之N-乙醯基色胺酸。
本發明中，作為多糖及單糖等糖類或碳水化合物，可列舉例如葡聚醣、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖等。
本發明中，作為糖醇，可列舉例如甘露醇、山梨醇、肌醇等。
本發明之藥劑為注射用水溶液時，亦可與例如生理食鹽水、含有葡萄糖或其他輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D甘露糖醇、氯化鈉)之等張液混合，或該水溶液亦可與適當的溶解輔助劑(例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子性界面活性劑(聚山梨酯80、HCO-50等)併用。
視需要，亦可含有稀釋劑、溶解輔助劑、pH調整劑、無痛化劑、含硫環原劑、抗氧化劑等。
本發明中，作為含硫還原劑，例如可列舉N-乙醯基半胱胺酸/N-乙醯基同半胱胺酸、硫辛酸、硫代乙二醇、硫乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、硫代葡糖酸以及其鹽、硫代硫酸鈉、穀胱甘肽、以及碳原子數1至7之硫代烷酸等具有氫硫基者等。
再者，本發明中之抗氧化劑，例如可列舉異抗壞血酸(Erythorbic acid)、二丁基羥基甲苯、丁基羥基苯甲醚、α-生育醇、乙酸生育醇、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酯、L-抗壞血酸硬脂酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯或伸乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、正磷酸鈉等螯合劑。
再者，必要時，可封入微膠囊(羥基甲基纖維素、明膠、聚[丙烯酸甲酯]等微膠囊)、作成膠體藥物傳送系統(colloid drug delivery system)(微脂體、白蛋白微球體、微乳化物、奈米粒子以及奈米膠囊等)(參照”Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition”,Odlo Ed.,1980等)。進一步地，將藥劑作為緩釋性藥劑的方法亦為習知，本發明可適用該等(Langer et al.,J. Biomed. Mater. Res. 1981,15:167-277;Langer,Chem. Tech. 1982,12:98-105；美國專利第3,773,919號；歐洲專利申請案公開號(EP)第58,481號；Sidman et al.,Biopolymers 1983,22: 547-556;EP第133,988號)。
所使用之製劑上容許之載體，可根據劑型而由上述中適宜或組合選擇，但不以此等為限。
本發明係關於包含將IL-6抑制劑投予至癌發症對象的步驟，於該對象中，抑制癌對其他部位、組織或器官的轉移的方法。
本發明中，「對象」意指投予本發明轉移抑制劑之生物體、該生物體之一部分。生物體並無特別限定，包含動物(例如人類、家畜動物種、野生動物)。
再者，發生轉移的部位、組織或器官並無特別限定，較佳可列舉對肝臟的轉移。特別較佳可列舉肺癌對肝臟的轉移。
本發明中，「投予」包含經口的或非經口的投予。經口的投予，可列舉以經口劑的形式投予，經口劑可選擇顆粒劑、散劑、錠劑、膠囊劑、溶液劑、乳劑或懸浮劑等劑型。
非經口的投予，可列舉以注射劑的形式投予，注射劑可列舉皮下注射劑、肌肉注射寄或腹腔內注射劑等。再者，藉由將包含必須投予之寡核苷酸的基因使用基因治療的手法導入至活體中，可達成本發明方法的效果。再者，本發明之藥劑，亦可於欲施行處置的區域局部性地投予。例如，亦可能經由手術中的局部注入、導管的使用、或將編碼本發明之肽的DNA的標的化基因傳送而投予。
實施本發明之方法時，本發明之藥劑亦可與至少1種已知藥劑一起作為藥學組成物的一部份而投予。或者，本發明之藥劑，亦可與至少1種已知抗癌劑(例如癌的轉移抑制劑)同時投予。於一態樣中，本發明之藥劑以及已知的抗癌劑，亦可實質上地同時投予。
進一步地，本發明亦關於包含以下步驟之抑制癌轉移的物質篩選方法。
(a)　測定受檢物質的IL-6抑制活性的步驟，
(b)　選擇具有IL-6抑制活性之物質的步驟。
IL-6抑制活性的測定可根據此項技術領域中具有通常知識者習知的方法進行，例如可經由上述方法測定受檢物質的IL-6抑制活性。
又，經由本發明之篩選所獲得之物質，可使用於癌的轉移抑制，特別是抑制對肝臟的轉移。
又，本說明書中所引用之全部先前文獻，係作為參考文獻併入本文。
【實施例】
以下，雖揭示實施例及比較例而說明本發明，但本發明不限定為該等實施例。
[材料及方法] <動物>
IkkβF/F小鼠、IkkβF/F:Alb-Cre小鼠(稱為IkkβΔhep)以及IkkβF/F:Mx1-Cre小鼠(多(IC)注射後稱為IkkβL+H)已揭示於文獻(Maeda,S.,et al. Immunity 19,725-737(2003),Hsu,L. C.,et al,Nature 428,341-345(2004))。全部小鼠與C57B/6至少重複交配10次。Ikkβ+/+:Alb-Cre小鼠、IkkβF/F:Mx1-Cre小鼠、IL-6基因剔除(IL-6KO)小鼠、IL-1受體基因剔除(IL-1 RKO)小鼠以及C57/B6野生型(WT)小鼠，由Jackson Laboratory購入。小鼠全部於University of California San Deigo(UCSD)以及Institute for Adult Diseases,Asahi Life Fundation中，根據NIH指導原則，於上部配備有過濾器之籠內，供給經高壓釜滅菌之飼料與水而培育。
<轉移腫瘤的誘導與分析>
LLC以及B16F10細胞(500,000個/動物)懸浮於磷酸緩衝生理食鹽溶液(PBS)100μl中，注入經麻醉之6~8周齡的小鼠脾臟中。數分鐘期間，細胞移動至肝臟後摘取肝臟。小鼠全部為術後良好恢復，監控每日的健康狀態。11日後，幾乎全部的動物顯示不適症狀，立即以CO2窒息犧牲動物。於肝臟外面可見之腫瘤(≧0.5mm)，經由實體顯微鏡計數而測定之。
<抗體以及化學物質>
使用以下抗體：抗IκBα抗體、抗磷酸化IκBα抗體、抗STAT3抗體以及抗磷酸化STAT3抗體(Cell Signalling Biotechnology)；抗-TF2D抗體以及抗-PCNA抗體(Santa Cruz Biotechnology)；抗F4/80抗體(Caltag)；類血友病(von Willebrand disease)因子(vWF;Wako)；以及抗IL-6抗體(R&D Systems)。中和抗體IL-6受體抗體由中外製藥股份有限公司(Becker,C.,et al. Immunity 21,491-501(2004))所提供。NEMO-結合域胜肽已揭示於文獻(Shibata,W.,et al. J. Immunol. 179,2681-2685(2007))。小鼠群以4mg/kg的用量，腹腔內注入NBD以及突變(mut)NBD胜肽予以處理。
<細胞>
小鼠路易士肺癌(LLC)細胞，維持於含有10%胎牛血清(FBS)之Dulbecco’s改質培養基(Dulbecco’s Modified Medium)。小鼠巨噬細胞細胞株J774A.1，維持於含有10%FBS之RPMI培養基。
<初代培養巨噬細胞以及非實質細胞的分離>
源自骨髓之巨噬細胞(BMDM)根據文獻(Hsu,L. C.,et al. Nature 428,341-345(2004))所揭示者予以培養。肝臟的非實質細胞(NP)經由膠原蛋白酶分解以及離心分離溶離分而單離。肝臟根據文獻(Maeda,S.,et al. Immunity 19,725-737(2003))予以原位(in situ)灌流。經由尼龍套組過濾細胞懸浮液，對濾液進行50×g的1分鐘離心分離2次去除肝細胞。NP分液經由緩衝液洗淨之後，細胞接種於塑膠培養皿培養1小時。
<生化學以及免疫組織化學分析>
由組織以及培養巨噬細胞調製蛋白質溶解物，經由SDS-聚丙烯醯胺電泳(PAGE)分離，轉印至Immobilon膜(Millipore)，經由免疫墨點法分析。使用TRIZOL試劑(Invitrogen)萃取總細胞RNA，使用Superscript II(Invitrogen)，合成cDNA，使用即時(real time)聚合酶鏈鎖反應(PCR)定量特異的mRNA的表現，相對於GAPDH mRNA的表現予以標準化。根據需要可利用引子序列。為了陣列(array)分析，根據製造業者的說明書使用小鼠的NF-κB Signaling PCR Array(SABiosciences)。
電泳移動度位移分析(EMSA)，係根據文獻(Maeda,S.,et al. Immunity 19,725-737(2003))的記載而進行。使用酵素結合免疫吸附分析(ELISA)(R&D System)測定細胞激素(cytokine)及可溶性IL-6受體(IL-6sR)的濃度。
肝組織於10%福馬林中固定後，脫水，包埋於石蠟而製作切片(厚度5μm)。去除切片的石蠟後，使其再度水合，經由3%H2O2的PBS予以處理，與適當抗體一起培養。一次抗體的結合後，使用生物素(biotin)標識之二次抗體(1:500稀釋；Vector Laboratories)檢測後，進行鏈酶親合素-辣根過氧化酶(streptavidin-horseradish peroxidase)反應，經由3,3’-二胺基聯苯胺(diaminobenzidine)(DAB；Sigma)予以可視化，以四溴螢光素(Hematoxylin)進行對比染色。
為了免疫螢光染色，將冷凍切片與適當的抗體一起於4℃培養一夜後，以經Alexa Four 488以及555標識之二次抗體(Molecular Probes)予以可視化。
<經由流體細胞術之細胞生存度以及細胞周期的分析>
於450nm使用[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺醯基)-2H-四唑鎓單鈉鹽]，經由Cell Counting Kit-8(Dojindo Molecular Tech)，測定活細胞。
G0-G1、S以及G2-M之細胞集團，經由DNA內容物的流體細胞術分析而判定。對於細胞周期之各數值，為三次測定值的平均值，sub G1期的數值，表示對於細胞周期的全細胞數在sub G1中的細胞比例以及平均值±SE。
<統計分析>
數據標記為平均值±平均值的標準差(SEM)。使用Student t-test檢測顯著差異。P值≦0.05為顯著的。全部的情況中，以統計學上產生清楚結果的方式，選擇群的大小。
[實施例1]腫瘤細胞中NF-κB活性化對腫瘤轉移的影響
為了調查NF-κB活性化對於腫瘤的轉移的作用，本發明者們以具有高轉移能力的路易士肺癌(LLC)細胞，經由脾臟注入小鼠的肝臟。經由電泳移動度偏移分析(EMSA)確認，LLC接種使肝臟中的NF-κB活性化(第1A圖)。關於NF-κB活性化標記Phospho-IκBα的免疫染色，亦同樣地以LLC接種後4小時在肝臟被觀察到(第1B圖)。經由庫氏細胞(Kupffer cells)或巨噬細胞的標記F4/80的染色，抗phosph-IκBα染色(亦即NF-κB活性化)顯示主要發生於庫氏細胞(第1B圖)。PBS注入(偽操作)小鼠中未觀察到NF-κB活性化(第1C圖)。
為了研究肝轉移中NF-κB活性化的角色，本發明者們使Ser32及Ser36被置換為丙胺酸之突變體的非分解性IκBα蛋白質於LLC細胞中安定地表現。該蛋白質已知為IκB的超級抑制蛋白(super-repressor)(s-rIκB)，阻斷典型的NF-κB路徑。經由TNFα所誘導之NF-κB活性，與經空的載體轉染之細胞(LLC/M)作比較，於s-rIκB轉染細胞(LLC/SR)中受到強的抑制(第2A圖)。然而，活體中的腫瘤增殖於LLC/M及LLC/SR細胞之間並無差異(第2B圖)。
LLC細胞的脾臟內投予，於11日後誘導轉移至肝臟，此點的腫瘤數目與腫瘤占有區域可正確地測定(第3B圖)。雄的野生型小鼠(WT)接種LLC/M或LLC/SR。11日後，肝臟中之腫瘤數目，在接種LLC/M之小鼠及接種LLC/SR之小鼠之間無顯著差異(第3A圖)。該結果顯示於LLC細胞中的NF-κB活性化在此動物模式中不影響肝轉移。
[實施例2]非實質細胞中的NF-κB活性化在腫瘤的轉移為重要
為了研究NF-κB活性化於小鼠的肝轉移中的角色，標的基因去除一部分的floxed Ikkβ陣列(IkkβF/F)或IKKβ的肝細胞特異性缺失(IkkβΔhep)之任一者相關之同合子之雄小鼠的脾臟內，注入LLC細胞(Maeda,S.,et al. Immunity 19,725-737(2003))。IkkβΔhep小鼠中，於NF-κB活性化重要之IKKβ雖不存在於肝細胞中，但存在非實質細胞(NPs)中(Maeda S.,et al. Cell 2005；121:977-990)。腫瘤數目與腫瘤占有區域在IkkβF/F小鼠、Ikkβ+/+:Alb-Cre小鼠及IkkβΔhep小鼠之間無顯著差異(第4A及4B圖)，此暗示肝細胞中雖存在IKKβ，但影響不及經由LLC細胞所誘導之腫瘤的轉移。為了研究轉移中NP的角色，本發明者們將IkkβF/F小鼠於活體外誘導型Mx1啟動子下，與表現Cre重組酶之Mx-1-Cre基因轉殖小鼠交配。IkkβF/F:Mx-1-Cre小鼠中，注入誘導干擾素產生之多(IC)，雖使肝臟與脾臟內的IKKβ有效率地缺少，但幾乎其他的組織中不缺少IKKβ。除巨噬細胞以外(Hsu LC.,et al. Nature 2004；428:341-345)，因Mx-1-Cre之缺失於淋巴球、庫氏細胞以及肝細胞中非常有效。全肝IKKβ基因剔除(IkkβΔL+H)，與多(IC)注入IkkβF+F小鼠以及Ikkβ+/+:Mx-1-Cre小鼠相比較，產生顯著地低肝重量、少轉移病灶以及小的腫瘤占有面積(第4C、4D圖，未顯示數據)。IkkβF+F小鼠的肝臟與IkkβΔL+H小鼠的肝臟相比，顯著的肥大(第4E圖)。由IkkβF+F小鼠所採集的肝組織之組織病理分析(第4E圖)可知，伴隨具有異型的核、多數的分裂細胞、甚至壞死與出血的中心區域之腫瘤細胞的廣泛的粘連(adhesion)區域的顯著腫瘤增殖。對照而言，源自IkkβΔL+H小鼠的肝臟顯示，腫瘤浸潤的小的多病灶性區域為於肝實質全體無作為地散布之攻擊性低的腫瘤增殖(第4E圖)。為了決定IkkβΔL+H小鼠中此腫瘤轉移的減少是否有腫瘤細胞類型的特異性，本發明者們使用黑色素腫瘤細胞株B16F10。B16F10注入後，IkkβΔL+H小鼠中之腫瘤的轉移亦受到抑制(第4F圖)，此暗示非肝細胞而是肝NP為肝轉移之重要細胞類型。
[實施例3]　IkkβΔL+H小鼠表現比較低濃度的IL-6，藉由IL-6缺失使腫瘤轉移變得更少
本發明者們，其次，於注入LLC的肝臟以及偽操作的肝臟中，經由NF-κB所調節之基因的表現，藉由即時PCR陣列研究。本發明者們發現，任何基因的mRNA表現，於WT小鼠中經由LLC注入而向上調控(表1以及表2)。本發明者們，以IkkβF/F、IkkβΔhep及IkkβΔL+H小鼠之陣列分析，比較經向上調控之IL-1β、IL-6以及TNFα的表現濃度，發現脾臟內注入腫瘤時，於IkkβF/F小鼠以及IkkβΔhep小鼠中，IL-1β、IL-6的mRNA表現雖受到誘導，但於IkkβΔL+H小鼠中，該等基因的表現較低(第5A圖，未顯示數據)。肝臟的TNFα的mRNA表現，在任一系統中LLC注入前後均無差異(第5A圖，未顯示數據)。本發明者們，分析與轉移有關，經NF-κB調節的COX-2以及MMP-9的mRNA表現，發現IkkβΔL+H小鼠中，該等基因的表現同樣地較低(第5A圖)。IL-1β以及IL-6為炎症反應中的主要原因，判斷有作為腫瘤促進因子的功能(Vidal-Vanaclocha,F.,et al.,J. Natl. Cancer Inst. 88,198-205(1996),Aggarwal,B. B.,et al.,Biochem. Pharmacol. 72,1605-1621(2006))。為了決定IL-1β或IL-6是否與腫瘤的轉移有關聯，本發明者們使用IL-1受體基因剔除(IL-1 RKO)或IL-6基因剔除(IL-6 KO)小鼠。與WT對照相比較，IL-1 RKO小鼠中的轉移腫瘤數目雖然稍微減少，但該差異不顯著，另一方面，IL-6 KO小鼠則顯示腫瘤數目顯著的減少(第5B圖)。IL-6於LLC注入後12小時表現，主要位於抗F4/80陽性庫氏細胞內(第5C圖)。IL-6誘導STAT3磷酸化，調節STAT-依存性的基因表現(Zhong,Z.,et al.,Science 264,95-98(1994))。本實施例中，經由LLC注入，注入後8至12小時引起肝臟內的STAT3磷酸化，之後，磷酸化於注入後24小時減少(第5D圖)。IL-6 KO小鼠中，STAT3磷酸化如預測地顯著降低(第5D圖)。
【表1】
藉由LLC注入而向上調控的基因
【表2】
[實施例4]IL-6經由VEGF表現增強腫瘤的血管新生
本發明者們推定LLC注入後，於常在性的肝巨噬細胞之庫氏細胞中發生IL-6的產生，為了進一步證明庫氏細胞的介入，根據文獻(Maeda S.,et al.,Cell 2005;121:977-990)所揭示者，將GdCl3注入WT小鼠，使庫氏細胞枯竭。48小時後，脾臟內注入LLC細胞，11日後，分析小鼠之腫瘤負荷。注入GdCl3的小鼠，與經溶劑處理的小鼠相比較，顯著地發生伴隨有小轉移病灶的肝轉移(25.1±4.8對11.8±2.5，p<0.05)。此結果暗示庫氏細胞對於腫瘤轉移為決定性的重要者。
其次，本發明者們，使用源自IkkβF/F以及IkkβΔL+H小鼠之初代培養巨噬細胞，分析LLC細胞的直接作用。經由IκBα分解而確認，IkkβF/F巨噬細胞中LLC培養上清液誘導NF-κB活性化。然而，NF-κB活性化於IkkβΔL+H巨噬細胞中未觀察到(第6A圖)。LLC培養上清液以及LPS處理皆於初代培養之巨噬細胞中，以IKKβ依存性地誘導IL-6產生(第6B圖)。此結果顯示，LLC細胞活性化IKK/NF-κB，暗示為分泌誘導IL-6產生之因子者。
第11日出現腫瘤轉移後，血清IL-6濃度增加(第6C圖)。已有報告IL-6於腫瘤形成中與細胞成長以及抗細胞凋亡信號傳達有關係(Wehbe,H.,et al.,Cancer Res. 66,10517-10524(2006))。為了研究此可能性，LLC細胞經由IL-6刺激，提供於細胞周期分析，判定由G2向M期的移動率由23.4±2.5%增加為29.4±2.3%(p<0.05)，sub G1集團(亦即細胞凋亡細胞)由9.9±1.5%±減少為1.7±I.2%(p<0.05)。為了評估因IL-6的細胞成長的影響，本發明者們以任意時點測定細胞數目，顯示LLC細胞成長經由IL-6處理而顯著地增加(第6D圖)。此結果暗示，IL-6藉由促進細胞成長而抑制細胞凋亡，因而促進轉移腫瘤的建立。
本發明者們，於轉移腫瘤中的PCNA染色分析腫瘤細胞增殖，發現IkkβΔL+H及IL-6 KO小鼠，與對照組相比，顯示較少的PCNA陽性細胞(第6E及6F圖)。
本發明者們又分析B16F10細胞內IL-6的效果。B16F10細胞的注入，雖然於WT小鼠中誘導IL-6(以及同樣地IL-1β)產生，但對於LLC細胞的作用以同樣的方式，於IkkβΔL+H小鼠中刺激較低程度的誘導(第7A圖)。此外，B16F10細胞的注入，於WT小鼠的肝臟內，使STAT3活性化(第7B圖)。於活體外，經由IL-6處理，使STAT3活性化，顯著地增加細胞成長(第7C及7D圖)。
[實施例5]IL-6藉由VEGF表現而使腫瘤的血管形成亢進
轉移的處理中使用血管新生抑制劑者，於特定的癌中效果明顯地高。源自LLC注入的腫瘤轉移亦依存於血管新生(Lee HJ,et al.,Carcinogenesis 2006;27:2455-2463)，或者IL-6係經由VEGF的表現而與血管新生有關(Loeffler S,et al.,Int J Cancer 2005;115:202-213)。本實施例中，經由關於血液糖蛋白質之類血友病因子(vWF)之免疫染色而進行檢討，腫瘤的血管新生於轉移性肝腫瘤中增加(第8A圖)。與對照組比較，IkkβΔL+H及IL-6 KO小鼠的轉移腫瘤中，血管形成降低(第8B圖)。
為了決定IL-6是否誘導VEGF產生，將肝NP以及小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)，於可溶性IL-6受體(IL-6sR)的存在下或不存在下，經由IL-6理。由ELISA檢討的結果，與IL-6sR併用之IL-6於NP及MEF中誘導VEGF產生(第8C圖)。於第11日出現轉移腫瘤後，血清VEGF濃度於WT小鼠中增加，另一方面，VEGF於IL-6KO小鼠中未充分地表現(第8D圖)。本發明者們於注入LLC之小鼠與未注入LLC之小鼠的血清中，測定IL-6sR濃度，發現與LLC注入無關，全部動物中IL-6豐富地發現(第8E圖)。
為了調查此發現是否可為臨床上應用，本發明者們於中和抗體IL-6受體抗體的存在下或不存在下，以IL-6處理LLC細胞(Hsu LC,et al.,Nature 2004;428:341-345)。經由與抗體同時處理，LLC細胞中IL-6所致之STAT3磷酸化受到抑制(第8G圖)。其次，本發明者們，將LLC細胞接種至野生型小鼠，LLC注入後第0、3、6及9日投予抗IL-6。LLC注入後第11日，接受抗IL-6處理之小鼠中，轉移腫瘤數目最多減少50%(第8F圖)。
進一步地，本發明者們藉由於IkkβΔL+H中添加IL-6(1mg/小鼠)以及IL6R(1mg/小鼠)，進行補充實驗。腫瘤數目稍微增加[IkkβΔL+H 4.1±1.1(n=9)，IkkβΔL+H+IL-6/IL-6sR 8.4±1.9(n=5)(p=0.045)]。由此結果暗示，IL-6在肝轉移的發生中為重要的，但TNFα、IL-1或MMP等其他因子，與IL-6協同誘導轉移的可能性。換言之，單只IL-6的存在雖不為充分的條件，但其為癌轉移的必要條件。
[實施例6]NEMO-結合區域胜肽抑制腫瘤的轉移
本發明者們調查阻斷NEMO與IKKβ會合而抑制NF-κB活性之NBD胜肽(May,M. J.,et al.,Science 289,1550-1554(2000))是否降低腫瘤的轉移。NBD處理，於J774.1小鼠巨噬細胞中，抑制以LLC上清液或LPS所誘導之NF-κB的活性化(第9A圖)及IL-6誘導(未顯示數據)。LLC注入的第0、3、6及9日後，進行NBD胜肽處理時，本發明者們發現，具有肝轉移之NBD處理小鼠與對照小鼠比較，顯示顯著地低肝重量以及少轉移病灶(第9B及9C圖)，另一方面，突變NBD胜肽亦未顯示任何作用(第9B及9C圖)。
[討論]
本發明證明IL-6為肝轉移中重要的調節因子。再者，本發明顯示，與NF-κB活性化強烈相關的IL-6，亦與腫瘤轉移有關係，具有成為治療肝轉移用之重要的治療標的之可能性。
近來，TLR2-依存性的TNFα表現對於肺轉移雖為必要的，但與TNFα同樣地受到誘導的IL-6並無關係已被報導(Kim,S.,et al.,Nature in press.)，TNFα於肺轉移中為重要的，IL-6於肝轉移中為重要的理由仍不明確。推測是因為用於生成炎症性微環境的機制，於肺與肝臟中並不相同。實際上，IL-6對於肝再生特別重要，同樣地對於肝臟癌的發生亦為重要的(Naugter,W.E.,et al.,Science 317,121-124(2007),Cressman,D.E.,et al.,Science 274,1379-1383(1996))。相對地，有肝再生中TNFα的關係的爭論(Hayashi,H.,et al. Liver Int 25,162-170(2005),Yamada,Y.,et al. Proc Natl Acad Sci USA 94,1441-1446(1997))，對於癌發生不重要(Naugler,W. E.,et al. Science 317,121-124(2007))。本發明者們由於經LLC投予而於IkkβF/F小鼠以及IkkβΔL+H小鼠的肝臟之間TNFα表現並無變化，因此未分析TNFα表現的相關性。
本發明者們的結果又暗示，因NF-κB活性化所誘導之轉移，與IL-6所致之細胞增殖以及血管形成相關聯。除了IL-6，其他要因也被認為與NF-κB活性化腫瘤轉移有關係。例如，經由NF-κB活性化的抑制，發生與腫瘤轉移有強關連性的MMP9表現減弱(Coussens,L.M. & Werb,Z. Nature 420,860-867(2002))。本發明者們發現，MMP9於注入LLC的小鼠肝臟中，有IKKβ依存性的活化(第10圖)。再者，COX-2表現亦為IKKβ依存性，與至今的報告一致(Chen,C.C.,et al. Mol. Pharmacol. 59,493-500(2001))。COX-2相關之血管形成以及細胞增殖被認為與轉移有關。
相反地，對照組小鼠經由腫瘤細胞的注入而向上調控之多數基因的誘導，於IkkβΔL+H小鼠較低，但未完全抑制，此暗示除了NF-κB以外，其他的因子與前述之轉錄的向上調控有關。例如，IL-6的表現不僅經由NF-κB調節，也經由AP-1以及C/EBP而受到調節(Pritts T.,et al. Am J Surg 2002;183:372-83)。預測此等標識可成為對腫瘤轉移之其他治療標的。
炎症促進轉移或是抑制轉移，仍有所爭論。然而，至今與腫瘤關聯的巨噬細胞(TAM)及炎症關聯的發癌模式(Luo,Y.,et al. J. Clin. Invest. 116,2132-2141(2006))相關的研究中，暗示炎症為促進癌的發生者。本發明者們不預期轉移性肝臟腫瘤的發生依存於炎症，但本發明者們的結果顯示，炎症反應的主要活性物質Ikkβ於轉移中扮演重要的角色。另一方面，Ikkβ僅在由庫氏細胞、其他類型的骨髓細胞以及肝細胞消失的情形，得到抗發癌效果。這些結果顯示，庫氏細胞對於有絲分裂原(mitogen)產生為重要。本說明書所揭示之模式中，於轉移腫瘤的周圍以及內部觀察到巨噬細胞的蓄積。IKKβ的缺少使巨噬細胞蓄積減少，因此本發明者們的結果暗示腫瘤轉移同樣地與炎症反應相關。
IkkβΔL+H小鼠中，不僅肝細胞與庫氏細胞，內皮細胞等其他細胞亦剔除Ikkβ(Lee PY.,et al. Arthritis Rheum. 2007;56:3759-69)。實際NF-κB活性化及IL-6表現主要以庫氏細胞觀察，本發明者們發現，注入GdCl3使庫氏細胞枯竭的小鼠呈現較低的肝轉移。此暗示庫氏細胞為轉移發生相關的重要細胞。
本發明者們的模式中，本發明者們顯示於LLC細胞這樣的細胞中NF-κB活性對轉移無貢獻。本發明者們，由抑制IκBα機能的IκBαSR表現之試驗可知，癌細胞中的NF-κB活性化不能排除與轉移有關的可能性。細胞增殖係根據NF-κB而減少或增加(Chen,F.,et al. J. Biol. Chem. 281,37142-37149(2006))。此暗示細胞成長中NF-κB活性化的角色為細胞型特異性。再者，NF-κB的構成活性化於癌細胞中時常觀察到，此種NF-κB活性化細胞顯示強的轉移活性(Fujioka,S.,et al. Oncogene 22,1365-1370(2003),Nakshatri,H. et al.,Mol. Cell. Biol. 17,3629-3639(1997))。如此，NF-κB路徑的抑制，於特異的細胞型中具有有效延緩轉移的可能性。
然而，NF-κB抑制劑於臨床實施上有因免疫系統的調節而引起副作用產生等問題(Karin,M.,et al.,Nat Rev Drug Discov 3,17-26(2004))。NF-κB抑制劑的使用，於罹患免疫缺損的癌患者中特別具有風險變高的可能性。另一方面，IL-6的抑制被考慮對抗癌治療有希望之方案。目前，IL-6的抑制於臨床上用於關於包含類風濕性關節炎以及卡斯托曼病(Castleman’s disease)之各種炎症疾病(Sebba,A. Am. J. Health Syst. Pharm. 65,1413-1418(2008))。基於本發明者們之結果以及目前為止的研究結果，IL-6的抑制於肝臟癌、結腸直腸癌及乳癌等轉移關聯癌中被考慮在將來可臨床上適用。
簡而言之，本發明者們的結果，顯示肝腫瘤轉移為炎症依存性，於轉移腫瘤的化學性預防中以庫氏細胞為標的抗炎症介入的期望性提高。本發明者們的結果，證明IKKβ/NF-κB信號傳遞路徑為抗轉移藥物開發的魅力標的。
【產業上可利用性】
本發明中，藉由投予抗IL-6受體的抗體，顯示可抑制對肝臟的癌轉移。因此，本發明之IL-6抑制劑有用於作為轉移癌的抑制劑。
第1圖為顯示LLC細胞中NF-κB活性化與肝轉移的關係之照片。(A)顯示由注入LLC的小鼠所採集之肝組織中，使用電泳移動度位移分析法(electrophoresis mobility shift assay；EMSA)，決定NF-κB的DNA結合活性。核蛋白質的回收係由抗TF2D抗體的免疫墨點法(immuno blotting)確認。(B)顯示於LLC注入後第4小時，以抗phospho-IκBα抗體以及抗F4/80抗體染色肝組織。(C)顯示偽操作4小時後，以抗phospho-IκBα抗體以及抗F4/80抗體染色肝組織。
第2圖為顯示LLC細胞中NF-κB活性化對肝轉移的關係圖及照片。(A)顯示LLC中，以空載體(IκBα/M)或s-rIκB(LLC/SR)安定地轉染，經由抗IκBα以免疫墨點法而決定內因性之IκBα以及轉染之s-rIκB的表現(上方圖)。LLC/M以及LLC/SR中，以EMSA分析源自TNFα的NF-κB活性化(下方圖)。(B)顯示使用細胞計數套組-8(Dojindo,Kumamoto,Japan)判定細胞成長。各細胞株於0、12及24小時測定OD450/570。
第3圖為顯示LLC細胞中NF-κB活性化對肝轉移的關係圖。(A)顯示在LLC/M(n=5)或LLC/SR(n=5)細胞注入後第11日計數個別肝臟中轉移腫瘤的數目。(B)顯示注入LLC之WT小鼠的大肝葉中腫瘤數(≧0.5mm)以及腫瘤占有區域(%)。
第4圖為顯示IkkβΔL+H小鼠的低濃度腫瘤轉移圖以及照片。(A)顯示在LCC注入後第11日計數由IkkβF/F(n=8)、IkkβΔhep(n=9)或Ikkβ+/+:A1b-Cre(n=6)小鼠採集的肝臟中轉移腫瘤的數目。(B)顯示大肝葉內腫瘤占有區域的劃分(小鼠的數目與處理如上述)。(C)顯示注入多(IC)之IkkβF/F、IkkβF/F:Mx1-Cre或Ikkβ+/+:Mx1-Cre小鼠中注入LLC細胞。注入後第11日計數IkkβF/F(n=7)、IkkβΔL+H(n=10)或Ikkβ+/+:Mx1-Cre(n=6)小鼠的腫瘤轉移數。(D)顯示大肝葉內的腫瘤占有區域的劃分(小鼠的數目與處理如上述)。(E)顯示LLC注入後第11日的IkkβF/F及IkkβΔL+H小鼠的代表性肝臟(上方圖)。IkkβF/F及IkkβΔL+H小鼠之典型的肝組織學(倍率40倍；蘇木紫-依紅染色法(Hematoxilin-Eosin)(下方圖)。(F)顯示在注入後第11日計數IkkβF/F(n=5)或IkkβL+H(n=4)小鼠的肝臟中B16/F10細胞的轉移腫瘤數目(上方圖)。B16/F10的注入後第11日的IkkβF/F及IkkβΔL+H小鼠的肝臟(下方圖)。數值表示平均值±平均值的標準誤差(SEM)。*為Student t-test所確認的p<0.05。
第5圖為IkkβΔL+H小鼠表現低濃度的IL-6，顯示比IL-6基因剔除小鼠更少的腫瘤轉移的圖及照片。(A)標記的基因型小鼠注入LLC或PBS(sh)，4小時後摘取肝臟。分離總mRNA，經由即時PCR(real-time PCR)定量特異性mRNA的表現。數值表示3次實驗的平均值。(B)顯示野生型(WT)(各為n=10)、IL-6基因剔除(IL-6KO)(n=12)及IL-1R基因剔除(IL-1RKO)(n=10)小鼠的肝臟中轉移腫瘤數在LLC注入後第11日確認。數值表示平均值±平均值的標準誤差(SEM)。*由Student t-test確認的p<0.05。(C)顯示LLC注入後第12小時調製冷凍肝切片，進行IL-6及F4/80的表現相關的免疫染色。(D)顯示WT及IL-6KO小鼠的脾臟內注入LLC細胞，於標記的時間犧牲動物。調製細胞溶解物，以免疫墨點法測定phospho-STAT3及STAT3的濃度。
第6圖為顯示經由IL-6的VEGF表現之腫瘤的血管新生增進之圖與照片。(A)顯示將由IkkβF/F及IkkβΔL+H小鼠分離之源自骨髓的骨髓瘤(BMDM)與LLC上清液一起培養。於標記的時間調製細胞溶解物，經由免疫墨點法確認IκBα與微管蛋白質(tubulin)的表現。(B)顯示由IkkβF/F及IkkβΔL+H小鼠的BMDM與LLC培養上清液或LPS(100ng/ml)一起或不包含該等物質(對照組)，進行24小時培養，經由ELISA確認IL-6濃度。(C)顯示由注入LLC的小鼠與偽操作的小鼠於第11日採集血清，經由ELISA確認IL-6濃度。(D)顯示LLC細胞於IL-6(20ng/ml)的存在下或不存在下予以處理。經由細胞計數套組判定細胞成長。於標記的時點測定OD450/570。*表示由Student t-test確認的p<0.05。(E)顯示LLC注入肝臟的最大葉的組織以PCNA抗體經由免疫組織化學染色，推定陽性細胞。*表示Student t-test確認的p<0.05。(F)顯示以抗PCNA經由免疫組織學染色之注入LLC的WT與源自IL-6KO的腫瘤組織的典型例(倍率100倍)。
第7圖為顯示於B16F10細胞中IL-6的效果的圖及照片。(A)顯示於標記的基因型小鼠中注入B16F10，4小時後切除肝臟。分離總mRNA，經由即時PCR定量特異性mRNA的表現。(B)顯示WT小鼠中，脾臟內注入B16F10，於標記的時間犧牲動物。調製細胞溶解物，經由免疫墨點法測定Phospho-STAT3及STAT3的濃度。(C)顯示以IL-6(20ng/ml)處理B16F10細胞，於標記的時間調製細胞溶解物，經由免疫墨點法測定Phospho-STAT3(p-STAT3)及總STAT3的濃度。(D)B16F10細胞經由IL-6(20ng/ml)處理或未經IL-6(20ng/ml)處理。經由細胞計數套組判定細胞成長。於標記的時點測定OD450/570。*表示Student t-test確認的p<0.05。
第8圖為顯示IL-6信號的抑制降低肝轉移的圖與照片。(A)顯示以抗vWF抗體經由免疫組織化學染色腫瘤，推定腫瘤的血管分布(倍率，上方圖100倍，下方圖400倍)。(B)顯示於顯微鏡下判定vWF陽性細胞數/視野(倍率100倍)(n=5，各基因型)。(C)顯示由野生型(WT)小鼠所調製之肝臟的非實質細胞(NP)以及小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)於IL-6受體的存在下或不存在下，經由IL-6處理。經由ELISA確認VEGF的濃度。(D)顯示於第11日，採集由LLC注入的WT(n=5)小鼠與IL-6KO(n=5)小鼠及未注入小鼠血清，經由ELISA確認VEGF的濃度。(E)顯示將LLC注入或未注入具有標記的基因型小鼠(各型，n=5)，於第11日經由ELISA確認IL-6sR濃度。(F)顯示WT小鼠於LLC注入後第0、3、6及9日，以中和抗IL-6抗體(n=9)或對照抗體(n=9)處理。顯示LLC注入後第11日，小鼠中轉移腫瘤的數目。數值表示平均值±平均值的標準誤差(SEM)。*為Student t-test確認的p<0.05。(G)顯示LLC細胞於中和抗IL-6受體抗體(α-IL-6R)的存在下或不存在下以IL-6處理。於標記的時間調製細胞溶解物，經由免疫墨點法測定Phospho-STAT3(p-STAT3)及總STAT3的濃度。
第9圖為顯示NEMO-結合域(NBD)的腫瘤轉移抑制圖及照片。(A)顯示J774.1細胞，於NBM胜肽存在下或不存在下，經LLC細胞培養上清液或LPS(100ng/ml)處理。於標記的時間調製細胞溶解物，經由免疫墨點法確認IκBα以及微管蛋白質的濃度。(B)顯示WT小鼠於LLC注入後第0、3、6及9日，經由NBD胜肽(n=10)、突變(mut)(n=4)NB胜肽或溶劑(PBS；n=9)處理。顯示LLC注入後第11日的腫瘤轉移的數目。數值表示平均值±平均值的標準誤差(SEM)。*表示Student t-test確認的p<0.05。(C)顯示LLC注入後第11日的PBS處理或NBD處理的小鼠肝臟。
第10圖係顯示注入LLC的小鼠肝臟中MMP9依存IKKβ的活性化之照片。(A)顯示標記的基因型小鼠注入LLC，4小時或24小時後摘取肝臟。萃取總蛋白質且進行對MMP9的酵素電泳(zymography)。(B)顯示於LLC注入的12小時後製備肝臟冷凍切片，藉由免疫染色檢測MMP9的表現。(C)顯示標記的基因型小鼠注入LLC，11日後摘取肝臟。萃取總蛋白質且進行對MMP9的酵素電泳。

Claims (3)

  1. 一種抗IL-6受體抗體在製造抑制肺癌轉移至肝臟之轉移抑制劑的用途。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該抗IL-6受體抗體為抗人類IL-6受體抗體。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，抗IL-6受體的抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10324639A (ja) 1997-03-21 1998-12-08 Chugai Pharmaceut Co Ltd Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する感作ｔ細胞関与疾患の予防・治療剤
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
AU2003211991B2 (en) * 2002-02-14 2008-08-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody-containing solution formulations
GB2401040A (en) * 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
US8398980B2 (en) * 2004-03-24 2013-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleuken-6 receptor
EP1941907B1 (en) * 2005-10-14 2016-03-23 Fukuoka University Inhibitor of transplanted islet dysfunction in islet transplantation
US8945558B2 (en) * 2005-10-21 2015-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for treating myocardial infarction comprising administering an IL-6 inhibitor
AR057582A1 (es) * 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
WO2007086490A1 (ja) * 2006-01-27 2007-08-02 Keio University 脈絡膜血管新生を伴う疾患の治療剤
CN101495146B (zh) * 2006-04-07 2012-10-17 国立大学法人大阪大学 肌肉再生促进剂
BRPI0806812B8 (pt) * 2007-01-23 2021-09-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente para suprimir reação de rejeição crônica e uso de um inibidor de il-6
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
KR101665729B1 (ko) 2008-06-05 2016-10-12 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터 신경침윤 억제제
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
KR102071834B1 (ko) 2009-10-26 2020-01-30 에프. 호프만-라 로슈 아게 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법
SI2578231T1 (sl) * 2010-05-28 2023-01-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Okrepljen protitumorski T celični odzivnik
JP2013541594A (ja) 2010-11-08 2013-11-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 皮下投与される抗ｉｌ−６受容体抗体
WO2012118813A2 (en) * 2011-03-03 2012-09-07 Apexigen, Inc. Anti-il-6 receptor antibodies and methods of use
US11491154B2 (en) * 2013-04-08 2022-11-08 Dennis M. Brown Therapeutic benefit of suboptimally administered chemical compounds
US10782290B2 (en) 2013-06-11 2020-09-22 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS) patient, and method for determining applicability of novel therapy
BR112015032960B1 (pt) 2013-07-04 2021-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag imunoensaio suprimido por interferência para detectar anticorpos anti-fármaco em amostras de soro
US9550828B2 (en) 2013-09-05 2017-01-24 Boise State University Oncostatin M (OSM) antagonists for preventing cancer metastasis and IL-6 related disorders
BR112017014067B1 (pt) 2015-02-27 2021-01-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6
WO2017147169A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 Ohio State Innovation Foundation Chemoprevention using controlled-release formulations of anti-interleukin 6 agents, synthetic vitamin a analogues or metabolites, and estradiol metabolites
AU2018234844B2 (en) 2017-03-17 2024-01-25 Ohio State Innovation Foundation Nanoparticles for delivery of chemopreventive agents
JP7185884B2 (ja) 2017-05-02 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
WO2019078344A1 (ja) 2017-10-20 2019-04-25 学校法人兵庫医科大学 抗ｉｌ－６受容体抗体を含有する術後の癒着を抑制するための医薬組成物
JP2022527972A (ja) 2019-04-02 2022-06-07 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 前悪性病変を有する患者において癌を予測及び予防する方法
US11633457B2 (en) 2019-04-11 2023-04-25 Boise State University Pharmaceutical compositions comprising oncostatin m (OSM) antagonist derivatives and methods of use

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
JPS58201994A (ja) 1982-05-21 1983-11-25 Hideaki Hagiwara 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5171840A (en) 1988-01-22 1992-12-15 Tadamitsu Kishimoto Receptor protein for human B cell stimulatory factor-2
DE122009000023I2 (de) 1989-07-20 2010-12-16 Kishimoto Antikörper gegen menschlichen Interleukin-6-Rezeptor
JPH03155795A (ja) 1989-11-13 1991-07-03 Chuzo Kishimoto マウス・インターロイキン―６レセプター蛋白質
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5795965A (en) * 1991-04-25 1998-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human to human interleukin-6 receptor
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
EP0656941B1 (en) 1992-03-24 2005-06-01 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
JP3525221B2 (ja) * 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
AU690171B2 (en) 1993-12-03 1998-04-23 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
WO1996030394A1 (en) 1995-03-31 1996-10-03 Jakob Bohr Method for protein folding
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU2000279625A1 (en) * 2000-10-27 2002-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Blood mmp-3 level-lowering agent containing il-6 antgonist as the active ingredient
FR2833011B1 (fr) * 2001-12-04 2004-10-29 Univ Claude Bernard Lyon Nouvelle proteine a activite inhibitrice de l'il-6
EP1572103A4 (en) * 2002-11-15 2008-02-13 Centocor Inc ANTI-ANGIOGENIC USES OF IL-6 ANTAGONISTS
US7210209B2 (en) * 2003-01-21 2007-05-01 Seagate Technology Llc System and method for ballizing and measuring a workpiece bore hole
ES2392824T3 (es) * 2003-10-17 2012-12-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agente terapéutico contra el mesotelioma
PE20061324A1 (es) * 2005-04-29 2007-01-15 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos
EP1967209B1 (en) * 2005-11-25 2012-06-06 Keio University Therapeutic agent for prostate cancer
AR057227A1 (es) * 2005-12-09 2007-11-21 Centocor Inc Metodo para usar antagonistas de il6 con inhibidores del proteasoma
ES2382164T3 (es) * 2005-12-30 2012-06-05 Merck Patent Gmbh Anticuerpos anti-IL-6 que impiden la unión de la IL-6 en complejo con el IL-6R( ) a la GP130
EP2206775B1 (en) * 2007-09-26 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-il-6 receptor antibody

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