WO2011013786A1 - 癌の転移抑制剤 - Google Patents

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WO2011013786A1
WO2011013786A1 PCT/JP2010/062874 JP2010062874W WO2011013786A1 WO 2011013786 A1 WO2011013786 A1 WO 2011013786A1 JP 2010062874 W JP2010062874 W JP 2010062874W WO 2011013786 A1 WO2011013786 A1 WO 2011013786A1
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愼 前田
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Maeda Shin
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to a cancer metastasis inhibitor comprising an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a method for suppressing cancer metastasis using a cancer metastasis inhibitor comprising an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • Interleukin 6 is a cytokine also called B cell stimulating factor 2 (BSF2) or interferon ⁇ 2.
  • BSF2 B cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B lymphocyte cells (Non-patent Document 1), and subsequently became a multifunctional cytokine that affects the functions of various cells. (Non-patent document 2).
  • IL-6 has been reported to induce maturation of T lymphocyte cells (Non-patent Document 3).
  • IL-6 transmits its biological activity through two kinds of proteins on cells.
  • One is IL-6 receptor, a ligand-binding protein having a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds (Non-patent Documents 4 and 5).
  • IL-6 receptor exists as a soluble IL-6 receptor mainly composed of the extracellular region in addition to the membrane-bound type that penetrates the cell membrane and is expressed on the cell membrane.
  • the other is a membrane protein gp130 with a molecular weight of about 130 kD involved in non-ligand binding signaling.
  • IL-6 and IL-6 receptor form an IL-6 / IL-6 receptor complex, and then bind to gp130, thereby transmitting the biological activity of IL-6 into the cell (non- Patent Document 6).
  • Non-patent Document 7 Metastasis, which is the propagation and proliferation of cancer cells in secondary organs, is the leading cause of cancer death (Non-patent Document 7).
  • the liver is a site where melanoma and colon and breast cancer frequently metastasize.
  • liver metastasis occurs, the natural course of the disease is associated with poor prognosis. Therefore, there is an urgent need to develop new treatments for metastatic liver cancer.
  • Tumor metastasis proceeds by a series of biological stages in which tumor cells migrate from the primary organ to a distant site. During this process, tumor metastasis is governed by a variety of genetic and epigenetic factors (8).
  • Nuclear factor (NF) - ⁇ B transcription factor is an important regulator of genes involved in suppression of inflammation and apoptosis (Non-patent Document 9).
  • NF- ⁇ B is maintained in an inactive state in the cytoplasm by binding to I ⁇ B, which responds to stimuli such as tumor necrosis factor (TNF) - ⁇ and bacterial lipopolysaccharide (LPS)
  • TNF tumor necrosis factor
  • LPS bacterial lipopolysaccharide
  • This process requires phosphorylation of I ⁇ B by an I ⁇ B kinase (IKK) complex composed of three subunits IKK ⁇ , IKK ⁇ , and IKK ⁇ .
  • IKK ⁇ is important for I ⁇ B degradation and for activation of NF- ⁇ B in response to pro-inflammatory stimuli and pathogen-associated molecular patterns (PAMPs).
  • NF- ⁇ B transcription factor may function as an important element that links carcinogenesis and inflammation (Non-patent Document 11).
  • NF- ⁇ B has been shown to be a means of promoting tumor formation in colitis-related cancer (CAC) (Non-patent document 12) and inflammation-related liver cancer (Non-patent document 13).
  • CAC colitis-related cancer
  • Non-patent document 13 inflammation-related liver cancer
  • NF- ⁇ B activation may also function as an important regulator in cancers that are not associated with overt inflammation
  • Matrix metalloproteinases and serine protease urokinase-type plasminogen activator (uPA) play an important role in tumor invasion and metastasis and are regulated by NF- ⁇ B (Non-patent Document 15).
  • Cyclooxygenase (COX) -2 which is similarly strongly regulated by NF- ⁇ B, is an inducible enzyme produced by many cell types in response to numerous stimuli. Recently, overexpression of COX-2 has been detected in several types of human cancers, including colon cancer, breast cancer, prostate cancer, and pancreatic cancer, and has been shown to control many cellular processes, including metastasis ( Non-patent document 16). In addition, a number of NF- ⁇ B regulatory genes have been reported to be involved in tumor metastasis. Thus, inhibition of NF- ⁇ B may provide an alternative approach to the treatment of metastatic tumor development.
  • IL-6 is a multifunctional cytokine that regulates immune and inflammatory responses, cell proliferation, and cell survival.
  • IL-6 has both tumor promoting and tumor suppressor functions, its functional relationship in tumorigenesis is still unclear.
  • Naugler et al (17) reported that estrogen inhibits IL-6 secretion in mice exposed to chemical carcinogens. This estrogen inhibition may be responsible for the male-specific increase in hepatocarcinogenesis observed in the same study.
  • Non-Patent Documents 20-21 Prior art document information related to the invention of the present application is shown below.
  • an object of the present invention is to provide a novel cancer metastasis inhibitor. More specifically, an object of the present invention is to provide a cancer metastasis inhibitor comprising an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • the inventors used a liver metastasis model induced through the spleen to determine whether liver NF- ⁇ B activation is associated with the development of metastatic tumors.
  • Hepatocyte-specific deletion of IKK ⁇ which prevents NF- ⁇ B activation in hepatocytes, did not affect the development of metastatic tumors.
  • deletion of IKK ⁇ in both hepatocytes and hematopoietic derived cells significantly reduced tumor development.
  • Tumor cells activated adjacent hematopoietic cells (Kupffer cells) to produce mitogens such as interleukin (IL) -6, which promoted tumor growth and angiogenesis. The production of these mitogens was dependent on NF- ⁇ B in hematopoietic Kupffer cells.
  • treatment with anti-IL-6 receptor antibody decreased the extent of metastatic tumors, indicating that IL-6 is associated with liver metastasis.
  • the present inventor has shown that tumor metastasis is dependent on inflammation, and that proinflammatory intervention targeting Kupffer cells is useful in the chemoprevention of metastatic tumors.
  • the present invention provides the following [1] to [28].
  • [1] A cancer metastasis inhibitor comprising an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • [2] The metastasis inhibitor according to [1], which suppresses metastasis of cancer to the liver.
  • [3] The metastasis inhibitor according to [1] or [2], wherein the IL-6 inhibitor is an IL-6 receptor inhibitor.
  • [4] The metastasis inhibitor according to [3], wherein the IL-6 receptor inhibitor is a human IL-6 receptor inhibitor.
  • [5] The metastasis inhibitor according to [3] or [4], wherein the IL-6 receptor inhibitor is an anti-IL-6 receptor antibody.
  • the method according to [8], wherein cancer metastasis to the liver is suppressed.
  • the method according to [8] or [9], wherein the IL-6 inhibitor is an IL-6 receptor inhibitor.
  • the IL-6 receptor inhibitor is a human IL-6 receptor inhibitor.
  • FIG. 2 is a diagram and a photograph showing the relationship of NF- ⁇ B activation to hepatic metastasis in LLC cells.
  • LLC cells are stably transfected with empty vector (I ⁇ B ⁇ / M) or s-rI ⁇ B (LLC / SR), and the expression of endogenous I ⁇ B ⁇ and transfected s-rI ⁇ B is immunoblotted with anti-I ⁇ B ⁇ .
  • Upper panel NF- ⁇ B activation by TNF ⁇ in LLC / M and LLC / SR was analyzed by EMSA (lower panel).
  • FIG. 2 is a diagram and a photograph showing low level tumor metastasis of Ikk ⁇ ⁇ L + H mice.
  • D Fractionation of tumor-occupied area within the large liver lobe (number of mice and treatment are as above).
  • FIG. 4 is a diagram and photograph showing that Ikk ⁇ ⁇ L + H mice express IL-6 at low levels and less tumor metastasis of IL-6 knockout mice.
  • A LLC or PBS (sh) was injected into a mouse with the indicated genotype, and the liver was removed 4 hours later. Total mRNA was isolated and specific mRNA expression was quantified by real-time PCR. The value represents the average of 3 experiments.
  • FIG. 2 is a diagram and a photograph showing angiogenesis enhancement of tumor via VEGF expression of IL-6.
  • BMDM Bone marrow derived macrophages isolated from Ikk ⁇ F / F and Ikk ⁇ ⁇ L + H mice were incubated with LLC culture supernatant. Cell lysates were prepared at the indicated times and I ⁇ B ⁇ and tubulin protein expression was determined by immunoblotting.
  • B BMDM from Ikk ⁇ F / F and Ikk ⁇ ⁇ L + H mice was incubated with or without LLC culture supernatant or LPS (100 ng / ml) (control) for 24 hours to determine IL-6 levels. Determined by.
  • B16F10 was injected into a mouse of the indicated genotype, and the liver was excised 4 hours later. Total mRNA was isolated and specific mRNA expression was quantified by real-time PCR.
  • B16F10 cells were injected intraspleen into WT mice and sacrificed at the indicated times. Cell lysates were prepared and phospho-STAT3 and STAT3 levels were measured by immunoblotting.
  • C B16F10 cells were treated with IL-6 (20 ng / ml). Cell lysates were prepared at the indicated times and phospho-STAT3 (p-STAT3) and total STAT3 levels were determined by immunoblotting.
  • B16F10 cells were treated with IL-6 (20 ng / ml) or without IL-6 (20 ng / ml). Cell growth was determined by a cell counting kit. OD450 / 570 was measured at the indicated time. * P ⁇ 0.05 determined by Student's t test. It is a figure and a photograph which show that inhibition of IL-6 signal reduces liver metastasis.
  • A Tumors were stained by immunohistochemistry with anti-vWF antibody to estimate tumor vascularity (magnification, upper panel 100 ⁇ , lower panel 400 ⁇ ).
  • C Liver nonparenchymal cells (NP) and mouse embryonic fibroblasts (MEF) prepared from wild type (WT) mice were treated with IL-6 in the presence or absence of IL-6 receptor. VEGF levels were determined by ELISA.
  • (A) LLC was injected into a mouse of the indicated genotype, and the liver was removed after 4 or 24 hours. Total protein was extracted and subjected to enzyme electrophoresis (zymography) on MMP9.
  • an “IL-6 inhibitor” is a substance that blocks IL-6 signaling and inhibits IL-6 biological activity.
  • Specific examples of IL-6 inhibitors include substances that bind to IL-6, substances that inhibit IL-6 expression, substances that bind to IL-6 receptor, and that inhibit expression of IL-6 receptor Examples include substances, substances that bind to gp130, substances that inhibit the expression of gp130, and the like.
  • IL-6 inhibitor is not particularly limited, but anti-IL-6 antibody, anti-IL-6 receptor antibody, anti-gp130 antibody, IL-6 variant, soluble IL-6 receptor variant, IL-6 moiety Peptides, IL-6 receptor partial peptides, low molecular weight compounds exhibiting the same activity as these, antisense, siRNA and the like are included.
  • IL-6 receptor inhibitors can be mentioned as preferred embodiments of IL-6 inhibitors.
  • an “IL-6 receptor inhibitor” is a substance that blocks IL-6 receptor signal transduction and inhibits IL-6 biological activity.
  • the IL-6 receptor inhibitor is preferably a substance that binds to the IL-6 receptor and has an activity of inhibiting the binding between IL-6 and the IL-6 receptor.
  • Examples of the IL-6 receptor inhibitor of the present invention include an anti-IL-6 receptor antibody, a soluble IL-6 receptor variant, a partial peptide of IL-6 receptor, and a small molecule having the same activity as these. Although a substance etc. are mentioned, it does not specifically limit.
  • Preferred examples of the IL-6 receptor inhibitor of the present invention include an antibody that recognizes the IL-6 receptor.
  • the origin of the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention is not particularly limited, but is preferably derived from a mammal, more preferably a human-derived antibody.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using a known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • the anti-IL-6 receptor antibody binds to the IL-6 receptor, thereby inhibiting the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and transmitting the biological activity of IL-6 into the cell. Cut off. Examples of such antibodies include MR16-1 antibody (Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
  • PM-1 antibody Hirata, Y. et al. al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 antibody, AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody (International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • PM-1 antibody is exemplified as a preferred monoclonal antibody against human IL-6 receptor
  • MR16-1 antibody is exemplified as a preferred monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor.
  • An anti-IL-6 receptor monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, IL-6 receptor is used as a sensitizing antigen, immunized according to a normal immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. Can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • an anti-IL-6 receptor antibody can be produced as follows.
  • a human IL-6 receptor used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody was disclosed in European Patent Application Publication No. EP 325474, and a mouse IL-6 receptor was disclosed in Japanese Patent Application Publication No. JP-A-3-155795. It is obtained by using IL-6 receptor gene / amino acid sequence.
  • IL-6 receptor protein is expressed on the cell membrane and separated from the cell membrane (soluble IL-6 receptor) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676).
  • Soluble IL-6 receptor consists essentially of the extracellular region of IL-6 receptor bound to the cell membrane, and the membrane is characterized in that the transmembrane region or the transmembrane region and the intracellular region are defective. Different from the bound IL-6 receptor. Any IL-6 receptor may be used as the IL-6 receptor protein as long as it can be used as a sensitizing antigen for producing the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention.
  • the target IL-6 receptor protein After inserting the gene sequence of IL-6 receptor into a known expression vector system and transforming an appropriate host cell, the target IL-6 receptor protein is known from the host cell or culture supernatant.
  • the purified IL-6 receptor protein may be used as a sensitizing antigen. Further, cells expressing IL-6 receptor or fusion proteins of IL-6 receptor protein and other proteins may be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Animals such as mice, rats, hamsters and the like are used.
  • Immunization of animals with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline ⁇ ⁇ ) or physiological saline, etc., and then mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary.
  • an ordinary adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • it is administered to mammals several times every 4-21 days.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Spleen cells are particularly preferred as preferable immune cells to be subjected to cell fusion.
  • Mammalian myeloma cells as other parental cells to be fused with the immune cells have already been known in various known cell lines such as P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. J. Immnol. (1979 ) (123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics, Microinology, and Microbiology, and Immunology (1978), 81, -71-7), NS-1 (Kohler., G., and Milstein, C., Eur., J., Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H.
  • the cell fusion between the immunocytes and myeloma cells is basically performed by a known method such as the method of Milstein et al. (Kohler. Ler G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). It can be done according to this.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), or the like is used as the fusion accelerator, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency as desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells is preferably 1 to 10 times the number of immune cells relative to myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this type of cell culture can be used. Serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution pre-warmed to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is usually used.
  • the target fused cell is formed by adding and mixing at a concentration of 30 to 60% (w / v). Subsequently, cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of the hybridoma can be removed by adding an appropriate culture solution successively and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a time sufficient for the cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die, usually several days to several weeks. Subsequently, a normal limiting dilution method is performed, and screening and cloning of the hybridoma producing the target antibody are performed.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a time sufficient for the cells other than the target hybridoma (non-fused cells) to die, usually several days to several weeks.
  • a normal limiting dilution method is performed, and screening and cloning of the hybridoma producing the target
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen protein or antigen-expressing cells, and sensitized B lymphocytes are human myeloma cells such as U266.
  • a desired human antibody having a binding activity to a desired antigen or antigen-expressing cell can be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • antigens or antigen-expressing cells may be administered to a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes, and a desired human antibody may be obtained according to the method described above (International Patent Application Publication No. WO 93/12227, WO 92 / 03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a usual method and obtained as a culture supernatant thereof, or the hybridoma is administered to a mammal compatible therewith to proliferate, and its ascites
  • the method obtained as follows is adopted.
  • the former method is suitable for obtaining highly pure antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • an anti-IL-6 receptor antibody-producing hybridoma can be performed by the method disclosed in JP-A-3-139293.
  • a PM-1 antibody-producing hybridoma is injected into the peritoneal cavity of BALB / c mice to obtain ascites, and a method for purifying PM-1 antibody from this ascites, or the hybridoma is treated with an appropriate medium such as 10% fetal bovine serum, Culture in 5% BM-CondimedBMH1 (Boehringer Mannheim) -containing RPMI1640 medium, hybridoma SFM medium (GIBCO-BRL), PFHM-II medium (GIBCO-BRL), etc. It can be performed by a purification method.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique can be used.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique.
  • mRNA encoding the variable (V) region of the antibody is isolated from cells producing the antibody of interest, such as a hybridoma. Isolation of mRNA is performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, winJ. M. et al., .Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., .Anal. Total RNA is prepared according to Biochem. (1987) 162, (156-159), etc., and mRNA is prepared using mRNA (Purification) Kit (Pharmacia) or the like. Alternatively, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • the antibody V region cDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis can be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit.
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit for cDNA synthesis and amplification, 5'-Ampli mpl FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932).
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with vector DNA.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method such as the deoxy method.
  • DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the antibody C region.
  • an antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • an expression control region for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity to humans for example, a chimeric antibody or a humanized antibody can be used.
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody can be obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with DNA encoding the human antibody C region, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it (Europe). (See Patent Application Publication Number EP 125023, International Patent Application Publication Number WO 92-19759). Using this known method, a chimeric antibody useful in the present invention can be obtained.
  • a humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody or a humanized antibody, and is a non-human mammal such as a mouse antibody complementarity determining region (CDR) grafted to a human antibody complementarity determining region.
  • CDR complementarity determining region
  • the general genetic recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • oligos were prepared so that the DNA sequence designed to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR; framework ⁇ region) of the human antibody had a portion that overlapped the terminal part. It is synthesized from nucleotides by PCR. The obtained DNA is obtained by ligating with the DNA encoding the human antibody C region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent Application Publication) No. WO 92-19759).
  • the FR of the human antibody to be linked via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a favorable antigen binding site. If necessary, the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • the human antibody C region is used for chimeric antibodies and humanized antibodies.
  • Examples of the human antibody heavy chain C region include C ⁇ , and for example, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, or C ⁇ 4 can be used.
  • Examples of the human antibody light chain C region include ⁇ or ⁇ .
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • the chimeric antibody is composed of a variable region of a non-human mammal-derived antibody and a C region derived from a human antibody, and the humanized antibody is a complementarity determining region of a non-human mammal-derived antibody, a framework region derived from a human antibody, and C These regions are useful as antibodies used in the present invention because of their reduced antigenicity in the human body.
  • Preferred specific examples of the humanized antibody used in the present invention include a humanized PM-1 antibody (see International Patent Application Publication No. WO 92-19759), or one or more amino acid sequences of the humanized PM-1 antibody. Mention may be made of antibodies having an amino acid sequence in which the amino acid sequence is substituted, deleted, added and / or inserted. A more specific example is tocilizumab. Other specific examples include the antibodies described in WO2009 / 041621.
  • variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, a suitable expression vector containing the sequence can be prepared and a human antibody can be obtained.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed by a known method.
  • a mammalian cell When a mammalian cell is used, it can be expressed by a commonly used useful promoter, an antibody gene to be expressed, a DNA having a poly A signal operably linked to the 3 ′ downstream thereof, or a vector containing the same.
  • the promoter / enhancer includes human cytomegalovirus early promoter / enhancer (human cytomegalovirus immediate-promoter / enhancer).
  • prokaryotic cells When prokaryotic cells are used as hosts, there are production systems that use bacterial cells.
  • Known bacterial cells include E. coli and Bacillus subtilis.
  • Escherichia coli it can be expressed by functionally combining a commonly used useful promoter, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoter include lacZ promoter and araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422)
  • the araB promoter the method of Better et al. (Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043) may be used.
  • the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) may be used when the periplasm of E. coli is produced. After separating the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is appropriately refolded and used (see, for example, WO96 / 30394).
  • the origin of replication those derived from SV40, polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV), etc. can be used. Furthermore, for amplification of gene copy number in the host cell system, the expression vector is used as a selection marker.
  • An aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, a thymidine kinase (TK) gene, an E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, a dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like can be included.
  • Production systems for antibody production include in vitro and in vivo production systems.
  • in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • Animal cells include: (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc., (2) amphibian cells such as Xenopus oocytes, or (3) insects Cells such as sf9, sf21, Tn5, etc. are known.
  • mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc.
  • amphibian cells such as Xenopus oocytes
  • insects Cells such as sf9, sf21, Tn5, etc.
  • plant cells cells derived from Nicotiana tabacum are known, and these may be cultured in callus.
  • yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger, are known.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as the culture medium, and serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination. Alternatively, antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced to the abdominal cavity of animals.
  • FCS fetal calf serum
  • examples of production systems for in vivo include production systems that use animals and production systems that use plants. When animals are used, there are production systems using mammals and insects.
  • an antibody gene is introduced into these animals or plants, and antibodies are produced and collected in the animals or plants.
  • an antibody gene is inserted into the middle of a gene encoding a protein inherently produced in milk such as goat ⁇ casein to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing a fusion gene into which an antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic goat born from the goat that received the embryo or its progeny.
  • hormones may be used in the transgenic goat as appropriate (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699- 702).
  • silkworms When silkworms are used, silkworms are infected with baculovirus into which the antibody gene of interest is inserted, and desired antibodies are obtained from body fluids of these silkworms (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). ). Furthermore, when tobacco is used, the target antibody gene is inserted into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. This bacterium is infected with tobacco, for example Nicotiana tabacum, and the desired antibody is obtained from the leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138) .
  • a plant expression vector for example, pMON530
  • Agrobacterium tumefaciens This bacterium is infected with tobacco, for example Nicotiana tabacum, and the desired antibody is obtained
  • DNAs encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) are separately incorporated into an expression vector to simultaneously transform the host.
  • the host may be transformed by incorporating DNAs encoding the H and L chains into a single expression vector (see International Patent Application Publication No. WO 94-11523).
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it can be suitably used in the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2, Fv, or single chain Fv (scFv) in which Fv of H chain and L chain are linked by an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host cell.
  • an enzyme such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host cell.
  • ScFv can be obtained by linking antibody H chain V region and L chain V region.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and the L chain V region in scFv may be derived from any of those described as the above antibody.
  • the peptide linker that links the V regions for example, any single chain peptide consisting of amino acid residues 12-19 is used.
  • the DNA encoding scFv is a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody and a DNA encoding the L chain or L chain V region as a template, and a desired amino acid sequence of those sequences
  • a DNA portion encoding the DNA is amplified by PCR using a primer pair that defines both ends thereof, and then further specified so that the DNA encoding the peptide linker portion and both ends thereof are linked to the H chain and L chain, respectively. Obtained by combining and amplifying primer pairs.
  • an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method, and the host can be used according to a conventional method.
  • ScFv can be obtained.
  • antibody fragments can be produced by the host by obtaining and expressing the gene in the same manner as described above.
  • antibody as used in the present invention encompasses these antibody fragments.
  • the modified antibody an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” referred to in the present invention includes these modified antibodies. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the antibody produced and expressed as described above can be isolated from the inside and outside of the cell and from the host and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed by affinity chromatography.
  • Examples of the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • Examples of the carrier used for the protein A column include HyperD, POROS, Sepharose F.F. and the like.
  • the antibodies used in the present invention can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis and the like other than the affinity chromatography.
  • chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and the like. These chromatographies can be applied to HPLC (High-performance liquid-chromatography). Further, reverse phase HPLC (reverse phase HPLC) may be used.
  • the antibody concentration obtained above can be measured by measuring absorbance, ELISA, or the like. That is, in the case of measuring the absorbance, after appropriately diluting with PBS ( ⁇ ), the absorbance at 280 nm is measured, and 1 mg / ml is calculated as 1.35 OD.
  • the measurement can be performed as follows. That is, 100 ⁇ l of goat anti-human IgG (manufactured by TAG) diluted to 1 ⁇ g / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well plate (manufactured by Nunc) and incubated overnight at 4 ° C. Solidify. After blocking, 100 ⁇ l of appropriately diluted antibody used in the present invention or a sample containing the antibody, or human IgG (manufactured by CAPPEL) as a standard is added, and incubated at room temperature for 1 hour.
  • the IL-6 receptor partial peptide is a peptide consisting of part or all of the amino acid sequence of the region related to the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 receptor.
  • Such peptides usually consist of 10 to 80, preferably 20 to 50, more preferably 20 to 40 amino acid residues.
  • the IL-6 receptor partial peptide specifies a region related to the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 receptor, and a part or all of the amino acid sequence of the specified region It can be prepared by a generally known method such as a genetic engineering method or a peptide synthesis method.
  • a DNA sequence encoding a desired peptide can be incorporated into an expression vector and obtained in accordance with the expression, production and purification methods of the recombinant antibody. it can.
  • a method usually used in peptide synthesis for example, a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method can be used.
  • the solid phase synthesis method for example, an amino acid corresponding to the C-terminus of the peptide to be synthesized is bound to a support that is insoluble in an organic solvent, and the ⁇ -amino group and the side chain functional group are protected with an appropriate protecting group.
  • the reaction of condensing amino acids one by one in the order from the C-terminal to the N-terminal and the reaction of removing the protecting group of the ⁇ -amino group of the amino acid or peptide bound on the resin.
  • a method of stretching is used.
  • Solid phase peptide synthesis methods are roughly classified into Boc method and Fmoc method depending on the type of protecting group used.
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction from the peptide chain support are performed.
  • hydrogen fluoride or trifluoromethanesulfonic acid can be usually used in the Boc method
  • TFA can be usually used in the Fmoc method.
  • Boc method for example, the protected peptide resin is treated in hydrogen fluoride in the presence of anisole.
  • the peptide is recovered by removing the protecting group and cleaving from the support. This is freeze-dried to obtain a crude peptide.
  • the deprotection reaction and the cleavage reaction from the support of the peptide chain can be performed by the same operation as described above in TFA.
  • the obtained crude peptide can be separated and purified by application to HPLC.
  • a water-acetonitrile solvent usually used for protein purification may be used under optimum conditions.
  • the fraction corresponding to the peak of the obtained chromatographic profile is collected and lyophilized.
  • the peptide fraction thus purified is identified by molecular weight analysis by mass spectrum analysis, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis or the like.
  • the cancer metastasis inhibitor of the present invention can be used to suppress the metastasis of cancer derived from a certain site, tissue or organ (for example, cancer cells) to another site, tissue or organ.
  • cancer metastasis means that a cancer derived from a certain site, tissue, or organ reaches another site, tissue, or organ and grows there to produce a secondary tumor.
  • suppression of cancer metastasis means inhibition of cancer metastasis to other sites, tissues or organs, reduction of the rate of cancer metastasis to other sites, tissues or organs, cancer other sites, It means the extension of time to metastasize to a tissue or organ.
  • the cancer metastasis inhibitor of the present invention can be used to suppress metastasis of metastatic cancers such as colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, pancreatic cancer and renal cancer.
  • cancer that metastasizes to the liver may be cancer derived from any site, tissue or organ, and is not particularly limited.
  • the primary lesion include lung, breast, skin, colorectal, kidney, prostate, pancreas and the like.
  • the metastasis inhibitor of the present invention can inhibit, for example, lung cancer, colon cancer and the like from metastasizing to the liver.
  • suppression of lung cancer metastasis to the liver can be mentioned.
  • the effect of the IL-6 inhibitor used in the present invention as a metastasis inhibitor can be evaluated using, for example, signal transduction inhibitory activity as an index, but is not limited thereto.
  • the signal transduction inhibitory activity of an IL-6 inhibitor can be evaluated by a commonly used method. Specifically, an IL-6-dependent human myeloma line (S6B45, KPMM2), a human Rennelt T lymphoma cell line KT3, or an IL-6-dependent cell MH60.BSF2 is cultured, and IL-6 is added thereto. At the same time, the incorporation of 3 H-thymidine in IL-6-dependent cells may be measured in the presence of an IL-6 inhibitor.
  • IL-6 inhibition of the IL-6 inhibitor Activity can be evaluated.
  • an IL-6 inhibitor such as an anti-IL-6 receptor antibody is a liver cancer metastasis inhibitor. As useful.
  • the subject to which the metastasis inhibitor of the present invention is administered is a mammal.
  • the mammal is preferably a human.
  • the metastasis inhibitor of the present invention can be administered in the form of a pharmaceutical, and can be administered systemically or locally orally or parenterally.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, enema, oral enteric solvent, etc.
  • the effective dose is selected in the range of 0.01 mg to 100 mg per kg body weight.
  • a dose of 1-1000 mg, preferably 5-50 mg per patient can be selected.
  • a preferable dose and administration method are effective doses in such an amount that free antibodies are present in the blood.
  • 0.5 mg to 40 mg preferably 1 mg to 20 mg in 1 month (4 weeks) divided into 1 to several times, for example, 2 times / week, 1 time / week, 1 time / 2 weeks, 1 time / 4 weeks, etc.
  • intravenous administration such as infusion or subcutaneous injection is used.
  • the dosing schedule is administered twice / week or once / week to once / 2 weeks, once / 3 weeks, once / 4 weeks, while observing the patient's condition and observing blood test values. It is also possible to adjust by increasing the interval.
  • pharmaceutically acceptable carriers such as preservatives and stabilizers may be added.
  • the pharmaceutically acceptable carrier means a material that can be administered together with the above-mentioned drug. Examples of materials that are acceptable for formulation include sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binders, and the like. .
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, glycerin monomyristate.
  • nonionic surfactants such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, glycerin monomyristate.
  • Glycerin fatty acid esters such as glyceryl monostearate; polyglycerin fatty acid esters such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate, decaglyceryl monolinoleate; polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate , Polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, polyoxyethylene Polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as sorbitan tristearate; Polyoxyethylene sorbite fatty acid esters such as polyoxyethylene sorbit tetrastearate and polyoxyethylene sorbit tetraoleate; Polyoxyethylene glycerin such as polyoxyethylene glyceryl monostearate Fatty acid ester; polyethylene glycol fatty acid ester such as polyethylene glycol distearate; polyoxyethylene alkyl ether such as polyoxy
  • surfactant examples include anionic surfactants such as alkyl sulfates having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium cetyl sulfate, sodium lauryl sulfate, and sodium oleyl sulfate; polyoxyethylene Polyoxyethylene alkyl ether sulfates having an average addition mole number of ethylene oxide of 2 to 4 and an alkyl group of 10 to 18 carbon atoms such as sodium lauryl sulfate; Carbon atoms of the alkyl group such as sodium lauryl sulfosuccinate Typical examples include alkylsulfosuccinic acid ester salts having 8 to 18 numbers; natural surfactants such as lecithin, glycerophospholipid; fingophospholipids such as sphingomyelin; and sucrose fatty acid esters of fatty acids having 12 to 18 carbon atoms. Can be mentioned.
  • anionic surfactants such as alkyl sulfates having an
  • Preferred surfactants for use in the formulations of the present invention are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20, 40, 60 or 80, with polysorbates 20 and 80 being particularly preferred.
  • Polyoxyethylene polyoxypropylene glycol represented by poloxamer such as Pluronic F-68 (registered trademark) is also preferable.
  • the amount of surfactant to be added varies depending on the type of surfactant to be used, but in the case of polysorbate 20 or polysorbate 80, it is generally 0.001 to 100 mg / mL, preferably 0.003 to 50 mg / mL. More preferably, it is 0.005 to 2 mg / mL.
  • buffering agent phosphoric acid, citric acid buffer, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, gluconic acid, caprylic acid, deoxycholic acid, salicylic acid, triethanolamine, fumaric acid Other organic acids, etc., or carbonate buffer, Tris buffer, histidine buffer, imidazole buffer, etc. can be mentioned.
  • a solution formulation may be prepared by dissolving in an aqueous buffer known in the field of solution formulation.
  • concentration of the buffer is generally 1 to 500 mM, preferably 5 to 100 mM, and more preferably 10 to 20 mM.
  • the drug of the present invention may contain other low molecular weight polypeptides, proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, saccharides such as amino acids, polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols.
  • proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin
  • saccharides such as amino acids, polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols.
  • amino acids in the present invention include basic amino acids such as arginine, lysine, histidine, ornithine and the like, or inorganic salts of these amino acids (preferably in the form of hydrochloride or phosphate, that is, phosphate amino acids). I can do it.
  • free amino acids are used, the preferred pH value is adjusted by the addition of suitable physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, especially hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts.
  • suitable physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, especially hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts.
  • phosphate is particularly advantageous in that a particularly stable lyophilizate is obtained.
  • the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, citric acid, succinic acid, fumaric acid or the like or the corresponding anion (malate ion, tartaric acid ion, citrate ion, succinic acid ion, fumaric acid This is particularly advantageous when no acid ions or the like are present.
  • organic acids such as malic acid, tartaric acid, citric acid, succinic acid, fumaric acid or the like or the corresponding anion (malate ion, tartaric acid ion, citrate ion, succinic acid ion, fumaric acid
  • Preferred amino acids are arginine, lysine, histidine, or ornithine.
  • acidic amino acids such as glutamic acid and aspartic acid, and their salt forms (preferably sodium salts) or neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, valine, methionine, cysteine, or alanine, or aromatic Amino acids such as phenylalanine, tyrosine, tryptophan, or the derivative N-acetyltryptophan can also be used.
  • saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include dextran, glucose, fructose, lactose, xylose, mannose, maltose, sucrose, trehalose, and raffinose.
  • examples of the sugar alcohol include mannitol, sorbitol, inositol and the like.
  • an isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride
  • the aqueous solution can be mixed with an appropriate solubilizing agent (eg, alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50), etc.) You may use together.
  • an appropriate solubilizing agent eg, alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50), etc.
  • it may further contain a diluent, a solubilizer, a pH adjuster, a soothing agent, a sulfur-containing reducing agent, an antioxidant and the like.
  • examples of the sulfur-containing reducing agent include N-acetylcysteine, N-acetylhomocysteine, thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and salts thereof, and thiosulfuric acid.
  • examples thereof include sodium, glutathione, and those having a sulfhydryl group such as thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms.
  • antioxidant in the present invention examples include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbyl palmitate, L-ascorbic acid steer.
  • examples thereof include chelating agents such as rate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate, disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, and sodium metaphosphate.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]
  • colloid drug delivery systems liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles, nanocapsules, etc.
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech 1982, 12: 98-105; US Pat. No. 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP 133,988).
  • the pharmaceutically acceptable carrier to be used is selected appropriately or in combination from the above depending on the dosage form, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a method for suppressing metastasis of cancer to other sites, tissues or organs in a subject, comprising the step of administering an IL-6 inhibitor to the subject who has developed cancer.
  • the “subject” refers to an organism to which the metastasis inhibitor of the present invention is administered, and a part of the organism.
  • Organisms include, but are not limited to, animals (eg, humans, domestic animal species, wild animals).
  • the site, tissue or organ where metastasis occurs is not particularly limited, but preferably, metastasis to the liver can be mentioned. Particularly preferred is a metastasis of lung cancer to the liver.
  • administering includes administering orally or parenterally.
  • Oral administration can include administration in the form of an oral agent, and as the oral agent, a dosage form such as a granule, powder, tablet, capsule, solvent, emulsion, or suspension is selected. be able to.
  • parenteral administration examples include administration in the form of injections, and examples of injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, and the like.
  • the effect of the method of the present invention can be achieved by introducing a gene containing an oligonucleotide to be administered into a living body using a gene therapy technique.
  • the agent of the present invention can be locally administered to an area where treatment is desired. For example, it can be administered by local injection during surgery, the use of a catheter, or targeted gene delivery of DNA encoding a peptide of the invention.
  • the agent of the present invention may be administered together with at least one known agent as part of a pharmaceutical composition.
  • the agent of the present invention may be administered simultaneously with at least one known anticancer agent (eg, cancer metastasis inhibitor).
  • the agent of the present invention and the known anticancer agent may be administered substantially simultaneously.
  • the present invention relates to a method for screening a substance that suppresses cancer metastasis, which comprises the following steps of the present invention.
  • A a step of measuring the IL-6 inhibitory activity of the test substance
  • B A step of selecting a substance having IL-6 inhibitory activity.
  • IL-6 inhibitory activity can be measured by methods known to those skilled in the art.
  • the IL-6 inhibitory activity of a test substance can be measured by the method described above.
  • the substance obtained by the screening of the present invention can be used for suppressing cancer metastasis, particularly for metastasis to the liver. It should be noted that all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • Ikk ⁇ F / F mice Ikk ⁇ F / F : Alb-Cre mice (referred to as Ikk ⁇ ⁇ hep ), and Ikk ⁇ F / F : Mx1-Cre mice (referred to as Ikk ⁇ L + H after poly (IC) injection) have been described in the literature (Maeda, S., et al. Immunity 19, 725-737 (2003), Hsu, LC, et al. Nature 428, 341-345 (2004)). All mice were backcrossed to C57BL / 6 at least 10 times.
  • Ikk ⁇ + / + Alb-Cre mice, Ikk ⁇ + / + : Mx1-Cre mice, IL-6 knockout (IL-6 KO) mice, IL-1 receptor knockout (IL-1 RKO) mice, and C57BL / 6 Wild type (WT) mice were purchased from Jackson Laboratory. All mice were fed at the University of California San Diego (UCSD) and the Institute for Adult Diseases, Asahi Life Foundation, fed autoclaved food and water in cages with filters on top according to NIH guidelines. .
  • UCSD University of California San Diego
  • IL-1 RKO IL-1 receptor knockout mice
  • ⁇ Induction and analysis of metastatic tumor> LLC and B16F10 cells (500,000 cells / animal) were suspended in 100 ⁇ l of phosphate buffered saline (PBS) and injected into the spleen of anesthetized 6-8 week old mice. After moving the cells to the liver for several minutes, the spleen was removed. All mice recovered well after surgery and their health status was monitored daily. After 11 days, most animals showed discomfort and were immediately sacrificed by CO 2 asphyxiation. Tumors visible on the outer surface of the liver ( ⁇ 0.5 mm) were counted and measured with a stereomicroscope.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Antibodies and chemicals The following antibodies were used: anti-I ⁇ B ⁇ antibody, anti-phosphorylated I ⁇ B ⁇ antibody, anti-STAT3 antibody, and anti-phosphorylated STAT3 antibody (Cell Signaling Biotechnology); anti-TF2D antibody and anti-PCNA antibody (Santa Cruz Biotechnology); anti-F4 / 80 antibody (Caltag); von Willebrand factor (vWF; Wako); and anti-IL-6 antibody (R & D Systems).
  • Neutralizing anti-IL-6 receptor antibody was provided by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. (Becker, C., et al. Immunity 21, 491-501 (2004)). NEMO-binding domain peptides are as reported (Shibata, W., et al. J. Immunol. 179, 2681-2685 (2007)). Groups of mice were treated with NBD and mut NBD peptide at a dose of 4 mg / kg via intraperitoneal injection.
  • LLC Mouse Lewis Lung Cancer
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • J774A.1 The mouse macrophage cell line J774A.1 was maintained in RPMI medium containing 10% FBS.
  • Bone marrow derived macrophages were cultured as described (Hsu, LC, et al. Nature 428, 341-345 (2004)).
  • Liver non-parenchymal cells were isolated by collagenase digestion and differential centrifugation. The liver was perfused in situ as described (Maeda, S., et al. Immunity 19, 725-737 (2003)). The cell suspension was filtered through nylon gauze, and the filtrate was centrifuged twice at 50 ⁇ g for 1 minute to remove hepatocytes. The NP fraction was washed with buffer, and then the cells were seeded in plastic culture dishes and cultured for 1 hour.
  • Protein lysates were prepared from tissues and cultured macrophages, separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), transferred to an Immobilon membrane (Millipore) and analyzed by immunoblotting.
  • Total cellular RNA was extracted using TRIZOL reagent (Invitrogen), cDNA was synthesized using Superscript II (Invitrogen), specific mRNA expression was quantified using real-time polymerase chain reaction (PCR), and GAPDH mRNA expression Standardized against. Primer sequences can be used as needed.
  • a mouse NF- ⁇ B Signaling Pathway PCR Array (SABiosciences) was used according to the manufacturer's instructions.
  • Electrophoretic mobility shift assay was performed as described in the literature (Maeda, S., et al. Immunity 19, 725-737 (2003)). The levels of cytokines and soluble IL-6 receptor (IL-6sR) were measured using an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) (R & D® System).
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • the liver tissue was fixed in 10% formaldehyde, dehydrated, and embedded in paraffin to prepare a section (thickness 5 ⁇ m).
  • the paraffin of the sections was removed, rehydrated, treated with 3% H 2 O 2 in PBS and incubated with the appropriate antibody.
  • Primary antibody binding was detected using a biotin-labeled secondary antibody (1: 500 dilution; Vector Laboratories), followed by a streptavidin-horseradish peroxidase reaction to produce 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma) And counterstained with hematoxylin.
  • DAB 3,3′-diaminobenzidine
  • Example 1 Activation of NF- ⁇ B in tumor cells does not affect tumor metastasis
  • Lung cancer (LLC) cells were injected through the spleen into the mouse liver. LLC inoculation activated NF- ⁇ B in the liver as determined by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) (FIG. 1A). Similarly, immunostaining for phospho-I ⁇ B ⁇ , a marker of NF- ⁇ B activation, was also observed in the liver 4 hours after LLC inoculation (FIG. 1B).
  • F4 / 80 staining a marker of Kupffer cells or macrophages, revealed that anti-phospho-IkB ⁇ staining (ie, NF- ⁇ B activation) occurs primarily in Kupffer cells (FIG. 1B). No NF- ⁇ B activation was found in PBS-injected (sham-operated) mice (FIG. 1C).
  • Male wild type mice (WT) were inoculated with LLC / M or LLC / SR. After 11 days, the number of tumors in the liver was not significantly different between mice inoculated with LLC / M and mice inoculated with LLC / SR (FIG. 3A). These results indicate that NF- ⁇ B activation in LLC cells did not affect liver metastasis in this model.
  • NF- ⁇ B activation in non-parenchymal cells is essential for tumor metastasis
  • floxed Ikk ⁇ from which a part of the target gene was removed LLC cells were injected into the spleen of male mice homozygous for either the allele (Ikk ⁇ F / F ) or hepatocyte-specific deletion of IKK ⁇ (Ikk ⁇ ⁇ hep ) (Maeda, S., et al. Immunity 19, 725-737 (2003)).
  • IKK ⁇ which is essential for NF- ⁇ B activation, was absent from hepatocytes but present in nonparenchymal cells (NPs) (Maeda S., et al. Cell 2005; 121: 977 -990).
  • NPs nonparenchymal cells
  • the number of tumors and tumor occupancy area were not significantly different between Ikk ⁇ F / F mice, Ikk ⁇ + / + : Alb-cre mice, and Ikk ⁇ ⁇ hep mice (FIGS. 4A and B). The presence suggests that it did not affect tumor metastasis induced by LLC cells.
  • Ikk ⁇ F / F mice Infusion of poly (IC) that induces interferon production in Mx-1-Cre mice efficiently deletes IKK ⁇ in the liver and spleen, but lacks IKK ⁇ in most other tissues Not.
  • IC poly
  • deletion with Mx-1-Cre is very effective in lymphocytes, Kupffer cells, and hepatocytes.
  • liver tissue collected from Ikk ⁇ F / F mice revealed significant tumors with atypical nuclei, numerous dividing cells, and extensive adhesion areas of tumor cells with central areas of necrosis and hemorrhage The growth of was revealed.
  • livers from Ikk ⁇ ⁇ L + H mice showed less aggressive tumor growth with multifocal areas with small tumor invasion randomly scattered throughout the liver parenchyma (FIG. 4E).
  • melanoma cell line B16F10 To determine if this reduction in tumor metastasis in Ikk ⁇ ⁇ L + H mice is tumor cell type specific, we also used the melanoma cell line B16F10. After B16F10 injection, tumor metastasis was also inhibited in Ikk ⁇ ⁇ L + H mice (FIG. 4F), suggesting that hepatic NP, but not hepatocytes, is an essential cell type for liver metastasis.
  • the present inventors have, Ikk ⁇ F / F, Ikk ⁇ ⁇ hep, and Ikk ⁇ ⁇ L + H mice upregulated in array analysis in the IL-l [beta], comparing IL-6, and TNF ⁇ the expression levels, tumors spleen
  • IL-1 ⁇ and IL-6 mRNA expression was induced in Ikk ⁇ F / F mice and Ikk ⁇ ⁇ hep mice, but the expression of these genes is relatively low in Ikk ⁇ ⁇ L + H mice.
  • Figure 5A and data not shown Liver TNF ⁇ mRNA expression was not different before and after LLC injection in either strain (FIG. 5A and data not shown).
  • IL-1 ⁇ and IL-6 are major factors in the inflammatory response and are thought to function as tumor promoters (Vidal-Vanaclocha, F., et al., J. Natl. Cancer Inst. 88, 198- 205 (1996), Aggarwal, BB, et al., Biochem. Pharmacol. 72, 1605-1621 (2006)).
  • IL-1 receptor knockout IL-1 RKO
  • IL-6 knockout IL-6 knockout mice
  • the number of metastatic tumors was slightly decreased in IL-1 RKO mice compared to WT controls, but this difference was not significant, while IL-6 KO mice showed a significant decrease in tumor number (FIG. 5B).
  • IL-6 was expressed 12 hours after LLC injection and appeared to be mainly localized in anti-F4 / 80 positive Kupffer cells (FIG. 5C).
  • IL-6 induces STAT3 phosphorylation and regulates STAT-dependent gene expression (Zhong, Z., et al., Science 264, 95-98 (1994)).
  • IL-6 enhances tumor angiogenesis by VEGF expression
  • Kupffer cells which are resident hepatic macrophages after LLC injection
  • WT mice were injected with GdCl 3 to deplete Kupffer cells as described in the literature (Maeda S., et al. Cell 2005; 121: 977-990).
  • LLC cells were injected into the spleen and after 11 days the mice were analyzed for tumor burden.
  • Mice injected with GdCl 3 developed liver metastases with significantly smaller metastatic lesions compared to vehicle-treated mice (25.1 ⁇ 4.8 vs 11.8 ⁇ 2.5, P ⁇ 0.05).
  • the inventors analyzed the direct action of LLC cells using primary cultured macrophages derived from Ikk ⁇ F / F and Ikk ⁇ ⁇ L + H mice. As determined by I ⁇ B ⁇ degradation, LLC culture supernatants induced NF- ⁇ B activation in Ikk ⁇ F / F macrophages. However, NF- ⁇ B activation was not observed in Ikk ⁇ ⁇ L + H macrophages (FIG. 6A). Both LLC culture supernatant and LPS treatment induced IL-6 production in primary cultured macrophages in an IKK ⁇ -dependent manner (FIG. 6B). These results suggest that LLC cells activate IKK / NF- ⁇ B and secrete factors that induce IL-6 production.
  • IL-6 enhances tumor angiogenesis through VEGF expression
  • Metastatic tumors derived from LLC injection also depend on angiogenesis (Lee HJ, et al., Carcinogenesis 2006; 27: 2455-2463), and IL-6 is involved in angiogenesis through the expression of VEGF (Loeffler S , et al., Int J Cancer 2005; 115: 202-213).
  • vWF von Willebrand factor
  • IL-6 soluble IL-6 receptor
  • IL-6sR soluble IL-6 receptor
  • the inventors performed supplementary experiments by adding IL-6 (1 mg / mouse) and IL6R (1 mg / mouse) in Ikk ⁇ ⁇ L + H.
  • IL-6 is important for the development of liver metastases, but other factors such as TNF ⁇ , IL-1, or MMP may cooperate with IL-6 to induce metastasis. Is done. In other words, the presence of IL-6 alone is not a sufficient condition, but it is a necessary condition for cancer metastasis.
  • NEMO-binding domain peptide inhibits tumor metastasis
  • NBD treatment inhibited NF- ⁇ B activation induced by LLC supernatant or LPS (FIG. 9A) and IL-6 induction (data not shown) in J774.1 mouse macrophage cells.
  • the present invention demonstrates that IL-6 is a critical regulator of liver metastasis. Furthermore, the present invention shows that IL-6, which is strongly associated with NF- ⁇ B activation, is also involved in tumor metastasis and may be an important therapeutic target for treating liver metastasis. Show.
  • IL-6 expression is regulated not only by NF- ⁇ B but also by AP-1 and C / EBP (Pritts T., et al. Am J Surg 2002; 183: 372-83). These markers are expected to be other therapeutic targets for tumor metastasis.
  • IKK ⁇ was removed not only by hepatocytes and Kupffer cells but also by other cells such as endothelial cells (Lee PY., Et al. Arthritis Rheum. 2007; 56: 3759-69).
  • endothelial cells Lee PY., Et al. Arthritis Rheum. 2007; 56: 3759-69.
  • NF- ⁇ B activation and IL-6 expression were observed mainly in Kupffer cells, and we found that mice injected with GdCl 3 depleted Kupffer cells showed relatively low liver metastases. I found it. This suggested that Kupffer cells are vital for the development of metastases.
  • NF- ⁇ B activity in LLC cells themselves does not contribute to metastasis. Since the present inventors are a test based on the expression of I ⁇ B ⁇ SR that inhibits the function of I ⁇ B ⁇ , the possibility that NF- ⁇ B activation in cancer cells is related to metastasis cannot be excluded. Cell proliferation decreases or increases according to NF- ⁇ B (Chen, F., et al. J. Biol. Chem. 281, 37142-37149 (2006)). This suggests that the role of NF- ⁇ B activation in cell growth is cell type specific.
  • NF- ⁇ B constitutive activation of NF- ⁇ B was sometimes observed in cancer cells, and such NF- ⁇ B activated cells showed strong metastatic activity (Fujioka, S., et al. Oncogene 22, 1365-1370 ( 2003), Nakshatri, H., et al. Mol. Cell. Biol. 17, 3629-3639 (1997)).
  • inhibition of the NF- ⁇ B pathway may be effective in delaying metastasis in specific cell types.
  • NF- ⁇ B inhibitors have problems such as side effects caused by immune system regulation in clinical practice (Karin, M., et. Al., Nat Rev Drug Discov 3, 17-26 (2004) ).
  • the use of NF- ⁇ B inhibitors can be particularly at risk in cancer patients suffering from immune deficiencies.
  • IL-6 inhibition is considered a promising approach to anticancer treatment.
  • IL-6 inhibition has been used clinically for several inflammatory diseases including rheumatoid arthritis and Castleman disease (Sebba, A. Am. J. Health Syst. Pharm. 65, 1413-1418). (2008)).
  • IL-6 inhibition may be applied clinically in the future in metastasis-related cancers such as liver cancer, colorectal cancer, and breast cancer.
  • liver tumor metastasis is dependent on inflammation, enhancing the promise of anti-inflammatory intervention targeting Kupffer cells in the chemoprevention of metastatic tumors.
  • Our results demonstrate that the IKK ⁇ / NF- ⁇ B signaling pathway is an attractive target for the development of antimetastatic drugs.
  • the IL-6 inhibitor of the present invention is useful as an inhibitor of metastatic cancer.

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Abstract

　本発明者らは、肝臓のNF-κBの活性化が転移腫瘍の発生に関係しているか否かを決定するために、脾臓内で誘導された肝転移モデルを用いた。肝細胞および造血由来細胞の双方においてIKKβを欠失すると、腫瘍の発生は顕著に減少した。腫瘍細胞は隣接する骨髄細胞（クッパー細胞）を活性化して、インターロイキン（IL）-6のようなマイトゲンを産生し、これが腫瘍の増殖および血管新生を促進した。これらのマイトゲンの産生は、造血由来クッパー細胞においてNF-κBに依存していた。また、抗IL-6受容体抗体による処置により、転移腫瘍の発生程度は低下した。すなわち、本発明者により、腫瘍の転移が炎症に依存することを示しており、転移腫瘍の化学的予防においてクッパー細胞を標的とする前炎症的介入が有用であることが示された。また、IKKβ/NF-κBシグナル伝達経路、特にIL-6の阻害が抗転移薬として使用できることが示された。

Description

癌の転移抑制剤
　本発明は、IL-6阻害剤を有効成分とする癌の転移抑制剤に関する。また、IL-6阻害剤を有効成分とする癌の転移抑制剤を利用した癌の転移を抑制する方法に関する。
　インターロイキン６（IL-6）はB細胞刺激因子2(BSF2)あるいはインターフェロンβ2とも呼称されたサイトカインである。IL-6は、Bリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（非特許文献１）、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかになった（非特許文献２）。IL-6は、Tリンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている（非特許文献３）。
　IL-6は、細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、IL-6が結合する分子量約80kDのリガンド結合性蛋白質のIL-6受容体である(非特許文献４、５)。IL-6受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性IL-6受容体としても存在する。
　もう一つは、非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約130kDの膜蛋白質gp130である。IL-6とIL-6受容体はIL-6／IL-6受容体複合体を形成し、次いでgp130と結合することにより、IL-6の生物学的活性が細胞内に伝達される（非特許文献６)。
　二次臓器における癌細胞の伝播および増殖である転移は、癌による死因の第一位である（非特許文献７）。たとえば、肝臓は、黒色腫ならびに結腸癌および乳癌が頻繁に転移する部位である。肝転移が発生すると、疾患の自然経過は予後不良に関連する。したがって、転移性肝癌の新しい治療法の開発が緊急に必要である。腫瘍の転移は、原発臓器から遠隔部位へと腫瘍細胞が移動する一連の生物学的段階によって進行する。このプロセスの際に、腫瘍の転移は多様な遺伝的および後成的要因によって支配される（非特許文献８）。
　核因子（NF）-κB転写因子は、炎症およびアポトーシスの抑制に関係する遺伝子の重要な調節物質である（非特許文献９）。静止細胞において、NF-κBは、IκBと結合することによって細胞質内で不活性状態で維持され、これは腫瘍壊死因子（TNF）-αおよび細菌のリポ多糖類（LPS）のような刺激に反応して急速に分解され、それによってNF-κBの活性化および核内流入が起こる（非特許文献１０）。このプロセスは、三つのサブユニットIKKα、IKKβ、およびIKKγで構成されるIκBキナーゼ（IKK）複合体によるIκBのリン酸化を必要とする。IKKβは、IκB分解にとって、ならびに前炎症性刺激および病原体関連分子パターン（PAMP）に反応したNF-κBの活性化にとって重要である。
　NF-κB転写因子は発癌と炎症とを関連づける重要な要素として機能する可能性がある（非特許文献１１）。NF-κBは、結腸炎関連癌（CAC）（非特許文献１２）と炎症関連肝癌（非特許文献１３）における腫瘍形成の促進手段となることが示された。しかし、NF-κB活性化はまた、明白な炎症に関連しない癌においても重要な調節物質として機能する可能性がある（非特許文献１４）。マトリクスメタロプロテナーゼおよびセリンプロテアーゼウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（uPA）は、腫瘍の浸潤および転移において重要な役割を果たし、NF-κBによって調節される（非特許文献１５）。NF-κBによって同様に強く調節されるシクロオキシゲナーゼ（COX）-2は、多数の刺激に反応して多くの細胞タイプにより産生される誘導酵素である。最近、COX-2の過剰発現が、結腸癌、乳癌、前立腺癌、および膵臓癌を含むいくつかのタイプのヒト癌において検出され、転移を含む多くの細胞プロセスを制御することが示された（非特許文献１６）。さらに、多数のNF-κB調節遺伝子が腫瘍の転移に関係していると報告されている。このように、NF-κBの阻害は、転移腫瘍発生の処置に対する代替アプローチを提供する可能性がある。
　IL-6は免疫および炎症反応、細胞増殖、ならびに細胞生存を調節する多機能サイトカインである。しかし、IL-6は、腫瘍促進および腫瘍抑制機能の双方を有することから、腫瘍形成におけるその機能的関係はなおも不明である。最近、腫瘍形成におけるIL-6産生を支配する説得力のある機構について記載している報告がいくつかある（非特許文献１７－１９）。たとえば、Nauglerら（非特許文献１７）は、エストロゲンが、化学発癌物質に曝露したマウスにおいてIL-6分泌を阻害することを報告した。このエストロゲンによる阻害は同じ研究で観察された肝癌発生の雄性特異的増加の原因である可能性がある。さらに、いくつかの研究により、様々な癌を有する患者においてIL-6血清レベルが高いことが報告され、これは予後不良に関連していた（非特許文献２０－２１）。
　なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76 Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78 Lotz, M. et al., J. Exp. Med. （1988）167, 1253-1258 Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981 Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828 Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581 Steeg, P.S. Nat. Med. 12, 895-904 (2006) Steeg, P.S. & Theodorescu, D. Nat Clin Pract Oncol 5, 206-219 (2008) Karin, M. & Lin, A. Nat Immunol 3, 221-227 (2002) Ghosh, S. & Karin, M. Cell 109 Suppl, S81-96 (2002) Karin, M., et al., Nat Rev Cancer 2, 301-310 (2002) Greten, F.R., et al. Cell 118, 285-296 (2004) Pikarsky, E., et al. Nature 431, 461-466 (2004) Maeda, S., et al. Cell 121, 977-990 (2005) Bond, M., et al. FEBS Lett. 435, 29-34 (1998) Sarkar, F.H., et al. Mini Rev Med Chem 7, 599-608 (2007) Naugler, W.E., et al. Science 317, 121-124 (2007) Gao, S.P., et al. J. Clin. Invest. 117, 3846-3856 (2007) Sansone, P., et al. J. Clin. Invest. 117, 3988-4002 (2007) Ashizawa, T., et al. Gastric Cancer 8, 124-131 (2005) Matzaraki, V., et al. Clin. Biochem. 40, 336-342 (2007)
　従って、本発明の目的は、新規な癌の転移抑制剤を提供することにある。より具体的には、IL-6阻害剤を有効成分とする癌の転移抑制剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは、肝臓のNF-κBの活性化が転移腫瘍の発生に関係しているか否かを決定するために、脾臓を通して誘導された肝転移モデルを用いた。肝細胞におけるNF-κB活性化を防止するIKKβの肝細胞特異的欠失は、転移腫瘍の発生に影響を及ぼさなかった。対照的に、肝細胞および造血由来細胞の双方においてIKKβを欠失すると、腫瘍の発生は顕著に減少した。腫瘍細胞は隣接する血球系細胞（クッパー細胞）を活性化して、インターロイキン（IL）-6のようなマイトゲンを産生し、これが腫瘍の増殖および血管新生を促進した。これらのマイトゲンの産生は、血球系クッパー細胞においてNF-κBに依存していた。また、抗IL-6受容体抗体による処置により、転移腫瘍の発生程度は低下し、このことはIL-6が肝転移に関連していることを示している。
　すなわち、本発明者により、腫瘍の転移が炎症に依存することが示され、転移腫瘍の化学的予防においてクッパー細胞を標的とする前炎症的介入が有用であることが示された。
　本発明は、より具体的には以下の〔１〕～〔２８〕を提供するものである。
〔１〕　IL-6阻害剤を有効成分とする癌の転移抑制剤。
〔２〕　癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする〔１〕に記載の転移抑制剤。
〔３〕　IL-6阻害剤がIL-6受容体阻害剤である〔１〕又は〔２〕に記載の転移抑制剤。
〔４〕　IL-6受容体阻害剤がヒトIL-6受容体阻害剤である〔３〕に記載の転移抑制剤。
〔５〕　IL-6受容体阻害剤が抗IL-6受容体抗体である〔３〕又は〔４〕に記載の転移抑制剤。
〔６〕　抗IL-6受容体抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である〔５〕に記載の転移抑制剤。
〔７〕　肺癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の転移抑制剤。
〔８〕　IL-6阻害剤を対象に投与する工程を含む癌の転移を抑制する方法。
〔９〕　癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする〔８〕に記載の方法。
〔１０〕　IL-6阻害剤がIL-6受容体阻害剤である〔８〕又は〔９〕に記載の方法。
〔１１〕　IL-6受容体阻害剤がヒトIL-6受容体阻害剤である〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕　IL-6受容体阻害剤が抗IL-6受容体抗体である〔１０〕又は〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕　抗IL-6受容体抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕　肺癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする〔８〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕　癌の転移抑制剤を製造するためのIL-6阻害剤の使用。
〔１６〕　癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする〔１５〕に記載の使用。
〔１７〕　IL-6阻害剤がIL-6受容体阻害剤である〔１５〕又は〔１６〕に記載の使用。
〔１８〕　IL-6受容体阻害剤がヒトIL-6受容体阻害剤である〔１７〕に記載の使用。
〔１９〕　IL-6受容体阻害剤が抗IL-6受容体抗体である〔１７〕又は〔１８〕に記載の使用。
〔２０〕　抗IL-6受容体抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である〔１９〕に記載の使用。
〔２１〕　肺癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする〔１５〕～〔２０〕のいずれかに記載の使用。
〔２２〕　癌の転移を抑制する方法に使用するためのIL-6阻害剤。
〔２３〕　癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする〔２２〕に記載のIL-6阻害剤。
〔２４〕　IL-6受容体阻害剤である〔２１〕又は〔２２〕に記載のIL-6阻害剤。
〔２５〕　IL-6受容体阻害剤がヒトIL-6受容体阻害剤である〔２４〕に記載のIL-6阻害剤。
〔２６〕　IL-6受容体阻害剤が抗IL-6受容体抗体である〔２４〕又は〔２５〕に記載のIL-6阻害剤。
〔２７〕　抗IL-6受容体抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である〔２６〕に記載のIL-6阻害剤。
〔２８〕　肺癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする〔２２〕～〔２７〕のいずれかに記載のIL-6阻害剤。
LLC細胞におけるNF-κB活性化と肝転移との関係を示す写真である。（A）LLC注入マウスから採取した肝組織において、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いて、NF-κB DNA結合活性を決定した。核タンパク質の回収は抗TF2D抗体によるイムノブロッティングによって決定した。（B）LLC注入後4時間目に、肝組織を抗ホスホ-IκBα抗体および抗F4/80抗体によって染色した。（C）偽操作の4時間後、抗ホスホ-IκBα抗体および抗F4/80抗体で、肝臓組織を染色した。 LLC細胞におけるNF-κB活性化の肝転移への関係を示す図および写真である。（A）LLC細胞に空のベクター（IκBα/M）またはs-rIκB（LLC/SR）を安定にトランスフェクトし、内因性のIκBαおよびトランスフェクトしたs-rIκBの発現を、抗IκBαによるイムノブロッティングによって決定した（上のパネル）。LLC/MおよびLLC/SRにおけるTNFαによるNF-κB活性化をEMSAによって分析した（下のパネル）。（B）細胞計数キット-8（Dojindo, Kumamoto, Japan）を用いて細胞成長を判定した。各細胞株において0、12、および24時間でOD450/570を測定した。 LLC細胞におけるNF-κB活性化の肝転移への関係を示す図である。（A）それぞれの肝臓における転移腫瘍の数をLLC/M（n＝5）またはLLC/SR（n＝5）細胞の注入後11日目に計数した。（B）LLCを注入したWTマウスの大きな肝葉における腫瘍数（>0.5 mm）および腫瘍占有領域（％）である。 IkkβΔL+Hマウスの低いレベルの腫瘍転移を示す図および写真である。（A）IkkβF/F（n＝8）、Ikkβ△hep（n＝9）、またはIkkβ+/+:Alb-Cre（n＝6）マウスから採取した肝臓における転移腫瘍の数をLLC注入後11日目に計数した。（B）大きい肝葉内の腫瘍占有領域の分画（マウスの数と処理は上記）。（C）ポリ(IC)を注入したIkkβF/F、IkkβF/F：Mx1-Cre、またはIkkβ+/+：Mx1-CreマウスにLLC細胞を注入した。IkkβF/F（n＝7）、Ikkβ△L+H（n＝10）、またはIkkβ+/+:Mx1-Cre（n＝6）マウスの転移腫瘍の数をLLC注入後11日目に計数した。（D）大きい肝葉内の腫瘍占有領域の分画（マウスの数と処理は上記）。（E）LLC注入後11日目のIkkβF/FおよびIkkβ△L+Hマウスの代表的な肝臓（上のパネル）。IkkβF/FおよびIkkβ△L+Hマウスにおける典型的な肝組織学（倍率40倍；ヘマトキシリン・エオジン染色）（下のパネル）。（F）IkkβF/F（n＝5）またはIkkβL+H（n＝4）マウスの肝臓における転移腫瘍の数をB16/F10細胞の注入後11日目に計数した（上のパネル）。B16/F10の注入後11日目でのIkkβF/FおよびIkkβ△L+Hマウスの肝臓（下のパネル）。値は平均値±平均値の標準誤差（SEM）を表す。＊スチューデントt-検定によって決定したP<0.05。 IkkβΔL+Hマウスが低レベルでIL-6を発現し、IL-6ノックアウトマウスのより少ない腫瘍転移を示す図および写真である。（A）表記の遺伝子型のマウスにLLCまたはPBS（sh）を注入して、4時間後に肝臓を摘出した。総mRNAを単離して、特異的mRNAの発現をリアルタイムPCRによって定量した。値は3回の実験の平均値を表す。（B）野生型（WT）（各々、n＝10）、IL-6ノックアウト（IL-6KO）（n＝12）、およびIL-1Rノックアウト（IL-1RKO）（n＝10）マウスの肝臓における転移腫瘍数を、LLC注入後11日目に決定した。値は、平均値±平均値の標準誤差（SEM）を表す。＊スチューデントt-検定によって決定したP<0.05。（C）凍結肝切片をLLC注入後12時間目に調製して、IL-6およびF4/80の発現に関して免疫染色した。（D）WTおよびIL-6KOマウスの脾臓内にLLC細胞を注入して、表記の時間に屠殺した。細胞溶解物を調製して、ホスホ-STAT3およびSTAT3レベルをイムノブロッティングによって測定した。 IL-6のVEGF発現を介した腫瘍の血管新生増進を示す図および写真である。（A）IkkβF/FおよびIkkβ△L+Hマウスから単離した骨髄由来マクロファージ（BMDM）を、LLC培養上清と共にインキュベートした。細胞溶解物を表記の時間に調製して、IκBαおよびチューブリンタンパク質発現をイムノブロッティングによって決定した。（B）IkkβF/FおよびIkkβ△L+HマウスからのBMDMをLLC培養上清もしくはLPS（100 ng/ml）と共にまたは伴わず（対照）、24時間インキュベートして、IL-6レベルをELISAによって決定した。（C）LLC注入および偽操作マウスから11日目に血清を採取して、IL-6レベルをELISAによって決定した。（D）LLC細胞をIL-6（20 ng/ml）の存在下または非存在下で処理した。細胞計数キットによって細胞成長を判定した。OD450/570を表記の時点で測定した。＊スチューデントt検定によって決定したP<0.05。（E）LLC注入肝臓の最も大きな葉の組織を抗PCNA抗体で免疫組織化学によって染色し、陽性細胞を推定した。＊スチューデントt検定によって決定したP<0.05。（F）抗PCNAで免疫組織化学によって染色された、LLCを注入したWTおよびIL-6KO由来の腫瘍組織の典型的な例（倍率100倍）。 B16F10細胞でのIL-6の効果を示す図及び写真である。（A）表記の遺伝子型のマウスにB16F10を注入し、4時間後に肝臓を切除した。総mRNAを単離して、特異的mRNAの発現をリアルタイムPCRによって定量化した。（B）WTマウスにB16F10細胞を脾臓内注入し、表記の時間に屠殺した。細胞溶解物を調製して、ホスホ-STAT3およびSTAT3のレベルをイムノブロッティングによって測定した。（C）B16F10細胞をIL-6（20 ng/ml）で処理した。表記の時間に細胞溶解物を調製して、ホスホ-STAT3（p-STAT3）および総STAT3のレベルをイムノブロッティングによって決定した。（D）B16F10細胞を、IL-6（20 ng/ml）によりまたはIL-6（20 ng/ml）なしで処理した。細胞成長を細胞計数キットにより判定した。表記の時点でOD450/570を測定した。＊スチューデントt検定によって決定したP<0.05。 IL-6シグナルの阻害が肝転移を低減することを示す図及び写真である。（A）腫瘍を抗vWF抗体によって免疫組織化学によって染色して、腫瘍の血管分布を推定した（倍率、上のパネル100倍、下のパネル400倍）。（B）vWF陽性細胞数／視野を、顕微鏡下で判定した（倍率100倍）（n＝5、各遺伝型）。（C）野生型（WT）マウスから調製した肝臓の非実質細胞（NP）およびマウス胚線維芽細胞（MEF）をIL-6受容体の存在下または非存在下でIL-6によって処理した。VEGFレベルをELISAによって決定した。（D）LLC注入WT（n＝5）およびIL-6KO（n＝5）マウスと非注入マウスとから血清を11日目に採取して、VEGFレベルをELISAによって決定した。（E）表記の遺伝型を持つマウス（各々、n＝5）にLLCを注入、または注入せず、IL-6sRレベルを11日目にELISAによって決定した。（F）WTマウスを、LLC注入後0、3、6、および9日目に中和抗IL-6抗体（n＝9）または対照抗体（n＝9）によって処理した。LLC注入後11日目でのマウスにおける転移腫瘍の数を示す。値は平均値±平均値の標準誤差（SEM）を表す。＊スチューデントt-検定によって決定したP<0.05。（G）LLC細胞を、中和抗IL-6受容体抗体（α-IL-6R）の存在下または非存在下でIL-6により処理した。表記の時間に細胞溶解物を調製して、ホスホ-STAT3（p-STAT3）および総STAT3のレベルをイムノブロッティングによって決定した。 NEMO-結合ドメイン（NBD）の腫瘍転移阻害を示す図および写真である。（A）J774.1細胞を、NBDペプチドの存在下または非存在下でLLC細胞培養上清またはLPS（100 ng/ml）によって処理した。細胞溶解物を表記の時間に調製して、IκBαおよびチューブリンのレベルをイムノブロッティングによって決定した。（B）野生型（WT）マウスを、LLC注入後0、3、6、および9日目にNBDペプチド（n＝10）、変異（mut）(n＝4）NBDペプチド、または媒体（PBS；n＝9）によって処理した。LLC注入後11日目での転移腫瘍の数を示す。値は平均値±平均値の標準誤差（SEM）を表す。＊スチューデントt-検定によって決定したP<0.05。（C）LLC注入後11日目でのPBS処理またはNBD処理マウスの肝臓。 MMP9がLLC注入マウスの肝臓においてIKKβ依存的に活性化されることを示す写真である。（A）表記の遺伝子型のマウスにLLCを注入し、4時間または24時間後に肝臓を摘出した。総タンパク質を抽出しMMP9に対する酵素電気泳動（zymography）を行なった。（B）肝臓の凍結切片をLLC注入の12時間後に調製し、免疫染色によりMMP9発現を検出した。（C）表記の遺伝子型のマウスにLLCを注入し、11日後に肝臓を摘出した。総タンパク質を抽出しMMP9に対する酵素電気泳動を行なった。
　本発明において「IL-6阻害剤」とは、IL-6によるシグナル伝達を遮断し、IL-6の生物学的活性を阻害する物質である。IL-6阻害剤の具体的な例として、IL-6に結合する物質、IL-6の発現を阻害する物質、IL-6受容体に結合する物質、IL-6受容体の発現を阻害する物質、gp130に結合する物質、gp130の発現を阻害する物質などを挙げることができる。IL-6阻害剤には、特に限定されないが、抗IL-6抗体、抗IL-6受容体抗体、抗gp130抗体、IL-6改変体、可溶性IL-6受容体改変体、IL-6部分ペプチド、IL-6受容体部分ペプチド、これらと同様の活性を示す低分子化合物、アンチセンス、siRNAなどが含まれる。
　本発明においてIL-6阻害剤の好ましい態様として、IL-6受容体阻害剤を挙げることができる。
　本発明において、「IL-6受容体阻害剤」とは、IL-6受容体を介したシグナル伝達を遮断し、IL-6の生物学的活性を阻害する物質である。IL-6受容体阻害剤は、好ましくはIL-6受容体に結合し、IL-6とIL-6受容体との結合を阻害する活性を有する物質である。
　本発明のIL-6受容体阻害剤としては、例えば、抗IL-6受容体抗体、可溶性IL-6受容体改変体、IL-6受容体の部分ペプチド、これらと同様の活性を示す低分子物質などが挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明のIL-6受容体阻害剤の好ましい例として、IL-6受容体を認識する抗体を挙げることが出来る。
　本発明で用いられる抗IL-6受容体抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。
　本発明で使用される抗IL-6受容体抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗IL-6受容体抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。
抗IL-6受容体抗体はIL-6受容体と結合することにより、IL-6のIL-6受容体への結合を阻害してIL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。このような抗体の例としては、MR16-1抗体（Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928)、PM-1抗体 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906）、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体あるいはAUK146-15抗体（国際特許出願公開番号WO 92-19759)などが挙げられる。これらのうちで、ヒトIL-6受容体に対する好ましいモノクローナル抗体としてはPM-1抗体が例示され、またマウスIL-6受容体に対する好ましいモノクローナル抗体としてはMR16-1抗体が挙げられるが、これに限定されない。
　抗IL-6受容体モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、IL-6受容体を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
　具体的には、抗IL-6受容体抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトIL-6受容体は、欧州特許出願公開番号EP 325474に、マウスIL-6受容体は日本特許出願公開番号特開平3-155795に開示されたIL-6受容体遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
　IL-6受容体蛋白質は、細胞膜上に発現しているものと細胞膜より離脱しているもの（可溶性IL-6受容体）（Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676）との二種類がある。可溶性IL-6受容体は細胞膜に結合しているIL-6受容体の実質的に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型IL-6受容体と異なっている。IL-6受容体蛋白質は、本発明で用いられる抗IL-6受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、いずれのIL-6受容体を使用してもよい。
　IL-6受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のIL-6受容体蛋白質を公知の方法で精製し、この精製IL-6受容体蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、IL-6受容体を発現している細胞やIL-6受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
　感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
　感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
　このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
　前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（Kearney, J. F. et al. J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550）、P3X63Ag8U.1 （Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7) 、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519 ）、MPC-11（Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415 ）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133 ）等が適宜使用される。
　前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。
　より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1～10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加温したPEG溶液、例えば、平均分子量1000～6000程度のPEG溶液を通常、30～60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
　当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日～数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作Bリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735参照）。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
　当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
　例えば、抗IL-6受容体抗体産生ハイブリドーマの作製は、特開平3-139293に開示された方法により行うことができる。PM-1抗体産生ハイブリドーマをBALB/cマウスの腹腔内に注入して腹水を得、この腹水からPM-1抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマを適当な培地、例えば、10％ウシ胎児血清、5％BM-Condimed H1（Boehringer Mannheim製）含有RPMI1640培地、ハイブリドーマSFM培地（GIBCO-BRL製）、PFHM-II培地（GIBCO-BRL製）等で培養し、その培養上清からPM-1抗体を精製する方法で行うことができる。
　本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
　具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ）、AGPC法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156-159)等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用してmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。
　得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002；Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932）を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
　目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
　本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
　本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
　キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
　ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
　具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（FR; framework region）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAを、ヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
　CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
　キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体C領域が使用される。ヒト抗体重鎖C領域としては、Cγなどが挙げられ、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4を使用することができる。ヒト抗体軽鎖C領域としては、例えば、κまたはλを挙げることができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。
　キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のC領域からなり、またヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域からなり、これらはヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
　本発明に使用されるヒト化抗体の好ましい具体例としては、ヒト化PM-1抗体（国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）、若しくはヒト化PM-1抗体のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸配列が置換、欠失、付加および／又は挿入されたアミノ酸配列を有する抗体を挙げることができる。より具体的な例として、トシリズマブ(tocilizumab)を挙げることができる。又、他の具体的な例としては、WO2009/041621に記載の抗体を挙げることができる。
　また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
　前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させることができる。哺乳類細胞を用いた場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
　また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV40)等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
　例えば、SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114) 、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322 ）に従えば容易に実施することができる。
　宿主として原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。
　大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合、Wardらの方法（Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546；Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 ）、araBプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 ）に従えばよい。
　抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、WO96/30394を参照）。
　複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
　本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
　宿主として真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、(1)哺乳類細胞、例えば、CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Veroなど、(2)両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3)昆虫細胞、例えば、sf9、sf21、Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
　これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにて抗体を産生してもよい。
　一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
　哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
　これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702 ）。
　また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばpMON530に挿入し、このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994)24, 131-138）。
　上述のようにin vitro又はin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H鎖）又は軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号WO 94-11523参照）。
　本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Fab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）が挙げられる。
　具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496 、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515 、Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663 、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66、Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137参照）。
　scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域を連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
　scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖又は、H鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖又は、L鎖V領域をコードするDNAを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNAおよびその両端を各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
　また、一旦scFvをコードするDNAが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、scFvを得ることができる。
　これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
　抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG)等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
　前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。プロテインAカラムに用いる担体として、例えば、HyperD、POROS、SepharoseF.F.等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
　例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはHPLC（High performance liquid chromatography）に適用し得る。また、逆相HPLC（reverse phase HPLC）を用いてもよい。
　上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はELISA等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、PBS(-)で適当に希釈した後、280nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.35ODとして算出する。また、ELISAによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、0.1M重炭酸緩衝液（pH9.6）で1μｇ/mlに希釈したヤギ抗ヒトIgG(TAG製）100μｌを96穴プレート（Nunc製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトIgG（CAPPEL製)100μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
　洗浄後、5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG（BIO SOURCE製）100μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READER Model 3550（Bio-Rad製）を用いて405nmでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
　IL-6受容体部分ペプチドはIL-6受容体のアミノ酸配列においてIL-6とIL-6受容体との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、通常１０～８０、好ましくは２０～５０、より好ましくは２０～４０個のアミノ酸残基からなる。
　IL-6受容体部分ペプチドはIL-6受容体のアミノ酸配列において、IL-6とIL-6受容体との結合に係わる領域を特定し、その特定した領域の一部又は全部のアミノ酸配列に基づいて通常知られる方法、例えば遺伝子工学的手法又はペプチド合成法により作製することができる。
　IL-6受容体部分ペプチドを遺伝子工学的手法により作製するには、所望のペプチドをコードするDNA配列を発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じて得ることができる。
　IL-6受容体部分ペプチドをペプチド合成法により作製するには、ペプチド合成において通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができる。
　具体的には、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成　監修矢島治明廣川書店1991年に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法としては、例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しようとするペプチドのC末端に対応するアミノ酸を結合させ、α-アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸をC末端からN末端方向の順番に１アミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸又はペプチドのα-アミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させる方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種類によりBoc法とFmoc法に大別される。
　このようにして目的とするペプチドを合成した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応をする。ペプチド鎖との切断反応には、Boc法ではフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を、又Fmoc法ではTFAを通常用いることができる。Boc法では、例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をアニソール存在下で処理する。次いで、保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチドを回収する。これを凍結乾燥することにより、粗ペプチドが得られる。一方、Fmoc法では、例えばTFA中で上記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応を行うことができる。
　得られた粗ペプチドは、HPLCに適用することにより分離、精製することができる。その溶出にあたり、蛋白質の精製に通常用いられる水-アセトニトリル系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当する画分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製したペプチド画分について、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解析等により同定する。
　本発明の癌の転移抑制剤は、ある部位、組織又は臓器由来の癌（例えば癌細胞）が他の部位、組織又は臓器に転移することを抑制する為に用いることが可能である。
　本発明において「癌の転移」とは、ある部位、組織又は臓器由来の癌が、他の部位、組織又は臓器に到達し、そこで増殖して二次的な腫瘍を生じることをいう。本発明において「癌の転移抑制」とは、癌が他の部位、組織又は臓器に転移することの阻害、癌が他の部位、組織又は臓器に転移する割合の低下、癌が他の部位、組織又は臓器に転移するまでの時間の延長などを意味する。
　本発明の癌の転移抑制剤は結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵癌、腎癌のような転移性癌の転移の抑制に用いることが可能である。
　本発明において癌の転移抑制の好ましい態様として、肝臓以外の部位、組織又は臓器由来の癌の肝臓への転移の抑制を挙げることができる。本発明において、肝臓へ転移する癌は如何なる部位、組織又は臓器由来の癌であってもよく、特に限定されない。原発巣の例としては、肺、乳房、皮膚、結腸直腸、腎臓、前立腺、膵臓などを挙げることができる。本発明の転移抑制剤は、例えば、肺癌、大腸癌などが肝臓に転移することを抑制することが可能である。本発明において好ましい態様として、肺癌の肝臓への転移の抑制を挙げることができる。
　本発明で使用されるIL-6阻害剤の転移抑制剤としての効果は、例えばシグナル伝達阻害活性を指標として評価することができるがこれに限定されない。IL-6阻害剤のシグナル伝達阻害活性は、通常用いられる方法により評価することができる。具体的には、IL-6依存性ヒト骨髄腫株（S6B45,KPMM2）、ヒトレンネルトＴリンパ腫細胞株KT3、あるいはIL-6依存性細胞MH60.BSF2を培養し、これにIL-6を添加し、同時にIL-6阻害剤を共存させることによりIL-6依存性細胞の3H-チミジン取込みを測定すればよい。また、IL-6受容体発現細胞であるU266を培養し、125I標識IL-6を添加し、同時にIL-6阻害剤を加えることにより、IL-6受容体発現細胞に結合した125I標識IL-6を測定する。上記アッセイ系において、IL-6阻害剤を存在させる群に加えIL-6阻害剤を含まない陰性コントロール群をおき、両者で得られた結果を比較すればIL-6阻害剤のIL-6阻害活性を評価することができる。
　後述の実施例に示されるように、抗IL-6受容体抗体が癌細胞の肝臓への転移を抑制することから、抗IL-6受容体抗体等のIL-6阻害剤が肝癌転移抑制剤として有用であることが示された。
　本発明の転移抑制剤が投与される対象は哺乳動物である。哺乳動物は、好ましくはヒトである。
　本発明の転移抑制剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.01mgから100mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり1～1000mg、好ましくは5～50mgの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗IL-6受容体抗体の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重1kgあたり１ヶ月（４週間）に0.5mgから40mg、好ましくは1mgから20mgを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、患者の状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。
　本発明の肝癌転移抑制剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体が添加されていてもよい。製剤上許容しうる担体とは、上記の薬剤とともに投与可能な材料を意味する。製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤(EDTA等)、結合剤等を挙げることができる。
　本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６～１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
　また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０～１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２～４でアルキル基の炭素原子数が１０～１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８～１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２～１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。
　本発明の薬剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ－６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
　界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なるが、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０の場合では、一般には０．００１～１００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．００３～５０ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．００５～２ｍｇ／ｍＬである。
　本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸等　他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
　また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には１～５００ｍＭであり、好ましくは５～１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０～２０ｍＭである。
　また、本発明の薬剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
　本発明においてアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩（好ましくは、塩酸塩、リン酸塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場合、好ましいpH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添加により調整される。この場合、リン酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有しない場合あるいは対応する陰イオン（リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましいアミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオルニチンである。さらに、酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸、及びその塩の形（好ましくはナトリウム塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、メチオニン、システイン、またはアラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体のN-アセチルトリプトファンを使用することもできる。
　本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース，トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
　本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
　本発明の薬剤を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液と混合することができる、また該水溶液は、適当な溶解補助剤（例えばアルコール(エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、PEG等)、非イオン性界面活性剤(ポリソルベート80、HCO-50)等）と併用してもよい。
　所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
　本発明において、含硫還元剤としては、例えば、Ｎ－アセチルシステイン、Ｎ－アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１～７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等を挙げることができる。
　また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α－トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ－アスコルビン酸及びその塩、Ｌ－アスコルビン酸パルミテート、Ｌ－アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
　また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。
　使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
　本発明は、IL-6阻害剤を、癌を発症した対象に投与する工程を含む、対象において癌が他の部位、組織又は臓器へ転移することを抑制する方法に関する。
　本発明において、「対象」とは、本発明の転移抑制剤を投与する生物体、該生物体の体内の一部分をいう。生物体は、特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）を含む。
　また、転移が起こる部位、組織または臓器については特に限定されないが、好ましくは肝臓への転移を挙げることができる。特に好ましくは、肺癌の肝臓への転移を挙げることができる。
　本発明において、「投与する」とは、経口的、あるいは非経口的に投与することが含まれる。経口的な投与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。
　非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。また、投与すべきオリゴヌクレオチドを含む遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、本発明の方法の効果を達成することができる。また、本発明の薬剤を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用、または本発明のペプチドをコードするDNAの標的化遺伝子送達により投与することも可能である。
　本発明の方法を実践する際に、本発明の薬剤は、少なくとも1つの既知の薬剤と共に薬学的組成物の一部として投与されてもよい。または、本発明の薬剤は、少なくとも1つの既知の抗癌剤（例えば癌の転移抑制剤）と同時に投与されてもよい。一つの態様において、本発明の薬剤および既知の抗癌剤は、実質的に同時に投与されてもよい。
　さらに、本発明の以下の工程を含む、癌の転移を抑制する物質のスクリーニング方法に関する。
（ａ）被検物質のIL-6阻害活性を測定する工程、
（ｂ）IL-6阻害活性を有する物質を選択する工程。
　IL-6阻害活性の測定は当業者に公知の方法で行うことができ、例えば上述の方法により被検物質のIL-6阻害活性を測定することが可能である。
又、本発明のスクリーニングにより得られる物質は癌の転移の抑制、特に肝臓への転移を抑制する為に用いることができる。
　なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔材料および方法〕
<動物>
　IkkβF/Fマウス、IkkβF/F：Alb-Creマウス（IkkβΔhepという）、およびIkkβF/F：Mx1-Creマウス（ポリ(IC)注射後にIkkβL+Hという）は文献に記載されたとおりである（Maeda, S., et al. Immunity 19, 725-737 (2003)、Hsu, L.C., et al. Nature 428, 341-345 (2004)）。マウスを全て、C57BL/6に少なくとも10回戻し交配した。Ikkβ+/+:Alb-Creマウス、Ikkβ+/+:Mx1-Creマウス、IL-6ノックアウト（IL-6 KO）マウス、IL-1受容体ノックアウト（IL-1 RKO）マウス、およびC57BL/6野生型（WT）マウスを、Jackson Laboratoryから購入した。マウスは全て、University of California San Diego（UCSD）およびInstitute for Adult Diseases, Asahi Life Foundationにおいて、NIHガイドラインに従って、上部にフィルターを備えたケージ内で、オートクレーヴ滅菌した飼料と水とを与えて飼育した。
<転移腫瘍の誘導と分析>
　LLCおよびB16F10細胞（500,000個/動物）をリン酸緩衝生理食塩液（PBS）100μlに懸濁し、麻酔した6～8週齢のマウスの脾臓に注入した。数分間、細胞を肝臓まで移動させた後に脾臓を摘出した。マウスは全て術後良好に回復し、健康状態を毎日モニターした。11日後、ほとんどの動物が不快症状を示し、直ちにCO2窒息によって屠殺した。肝臓外面に見える腫瘍（≧0.5 mm）を、実体顕微鏡によって計数し測定した。
<抗体および化学物質>
　以下の抗体を使用した：抗IκBα抗体、抗リン酸化IκBα抗体、抗STAT3抗体、および抗リン酸化STAT3抗体（Cell Signaling Biotechnology）；抗-TF2D抗体および抗-PCNA抗体（Santa Cruz Biotechnology）；抗F4/80抗体（Caltag）；フォン・ヴィレブランド因子（vWF；Wako）；および抗IL-6抗体（R&D Systems）。中和抗IL-6受容体抗体は中外製薬株式会社（Becker, C., et al. Immunity 21, 491-501 (2004)）から供与された。NEMO-結合ドメインペプチドは文献のとおりである（Shibata, W., et al. J. Immunol. 179, 2681-2685 (2007)）。マウスの群は、腹腔内注入を介して、4 mg/kgの用量でNBDおよび変異（mut）NBDペプチドにより処理した。
<細胞>
　マウスルイス肺癌（LLC）細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において維持した。マウスマクロファージ細胞株J774A.1は、10％FBSを含有するRPMI培地において維持した。
<初代培養マクロファージおよび非実質細胞の単離>
　骨髄由来マクロファージ（BMDM）を文献（Hsu, L.C., et al. Nature 428, 341-345 (2004)）のとおりに培養した。肝臓の非実質細胞（NP）をコラゲナーゼ消化および分画遠心分離によって単離した。肝臓を文献（Maeda, S., et al. Immunity 19, 725-737 (2003)）のとおりにインサイチューで灌流した。ナイロンガーゼを通して細胞懸濁液を濾過し、濾液に対して50×gで1分間の遠心分離を2回行って肝細胞を除去した。NP分画を緩衝液によって洗浄し、その後、細胞をプラスチック培養皿に播種して1時間培養した。
<生化学および免疫組織化学分析>
　タンパク質溶解物を組織および培養マクロファージから調製して、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって分離し、Immobilonメンブレン（Millipore）に転写して、イムノブロッティングによって分析した。TRIZOL試薬（Invitrogen）を用いて総細胞RNAを抽出して、Superscript II（Invitrogen）を用いてcDNAを合成し、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて特異的mRNA発現を定量し、GAPDH mRNA発現に対して標準化した。プライマー配列は必要に応じて利用可能である。アレイ分析のために、マウスのNF-κB Signaling Pathway PCR Array（SABiosciences）を、製造業者の説明書に従って使用した。
　電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を、文献（Maeda, S., et al. Immunity 19, 725-737 (2003)）に記載の通りに行った。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（R&D System）を用いてサイトカインおよび可溶性IL-6受容体（IL-6sR）のレベルを測定した。
　肝組織を10％ホルムアルデヒド中で固定した後、脱水し、パラフィンに包埋して切片を作製した（厚さ5μm）。切片のパラフィンを除去し、再度水和させ、3％H2O2のPBS溶液によって処理して、適切な抗体と共にインキュベートした。一次抗体の結合を、ビオチン標識二次抗体（1：500希釈；Vector Laboratories）を用いて検出した後、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ反応を行って、3,3’-ジアミノベンジジン（DAB；Sigma）によって可視化して、ヘマトキシリンで対比染色した。
　免疫蛍光染色のために、凍結切片を適当な抗体と共に4℃で一晩インキュベートした後、Alexa Fluor 488および555で標識した二次抗体（Molecular Probes）で可視化した。
<フローサイトメトリーによる細胞生存度および細胞周期の分析>
　450 nmで[2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、モノナトリウム塩]を用いるCell Counting Kit-8（Dojindo Molecular Tech）により、生細胞を測定した。
　G0-G1、S、およびG2-Mにおける細胞集団を、DNA内容物のフローサイトメトリー分析によって判定した。細胞周期に対する各値は、三回の測定値の平均であり、サブG1期の値は、細胞周期の全細胞数に対するサブG1における細胞の割合および平均値±SEとして表した。
<統計分析>
　データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表記する。スチューデントt-検定を用いて有意差を検出した。P値≦0.05を有意であるとみなす。全ての場合において、統計学的に明白な結果を生じるように、群の大きさを選択した。
〔実施例１〕腫瘍細胞におけるNF-κB活性化は腫瘍の転移に影響を及ぼさない
　腫瘍の転移に対するNF-κB活性化の作用を調べるために、本発明者らは、高い転移能を有するルイス肺癌（LLC）細胞を、脾臓を通してマウスの肝臓に注入した。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）によって決定したところ、LLC接種は肝臓におけるNF-κBを活性化した（図1A）。NF-κB活性化のマーカーであるホスホ-IκBαに関する免疫染色も同様に、LLC接種後4時間目の肝臓で観察された（図1B）。クッパー細胞またはマクロファージのマーカーであるF4/80染色により、抗ホスホ-IkBα染色（すなわち、NF-κB活性化）が、クッパー細胞において主に起こることが判明した（図1B）。PBS注入（偽操作）マウスではNF-κB活性化を見出さなかった（図1C）。
　肝転移におけるNF-κB活性化の役割を調べるために、本発明者らは、Ser32およびSer36がアラニンによって置換されている変異体の非分解性IκBαタンパク質をLLC細胞において安定に発現させた。このタンパク質は、IκBスーパーリプレッサー（s-rIκB）として知られており、古典的なNF-κB経路を遮断する。TNFαにより誘導されたNF-κB活性は、空のベクターをトランスフェクトした細胞（LLC/M）と比較してs-rIκBトランスフェクト細胞（LLC/SR）において強く阻害された（図2A）。しかし、インビトロでの腫瘍増殖はLLC/MおよびLLC/SR細胞の間で差はなかった（図2B）。
　LLC細胞の脾臓内投与は、11日後に肝臓で転移を誘導し、この時腫瘍数と腫瘍占有領域は正確に測定可能であった（図3B）。雄の野生型マウス（WT）にLLC/MまたはLLC/SRを接種した。11日後、肝臓における腫瘍数はLLC/Mを接種したマウスとLLC/SRを接種したマウスの間で有意差がなかった（図3A）。これらの結果は、LLC細胞におけるNF-κB活性化がこのモデルにおいて肝転移に影響を及ぼさなかったことを示している。
〔実施例２〕非実質細胞におけるNF-κB活性化は腫瘍の転移にとって肝要である
　マウスの肝転移におけるNF-κB活性化の役割を調べるために、標的遺伝子の一部が除去されたfloxed Ikkβアレル（IkkβF/F）またはIKKβの肝細胞特異的欠失（IkkβΔhep）のいずれかに関してホモ接合である雄マウスの脾臓内に、LLC細胞を注入した（Maeda, S., et al. Immunity 19, 725-737 (2003)）。IkkβΔhepマウスにおいて、NF-κB活性化にとって肝要であるIKKβは肝細胞には存在しなかったが、非実質細胞（NPs）には存在した（Maeda S., et al. Cell 2005;121:977-990）。腫瘍数と腫瘍占有領域は、IkkβF/Fマウス、Ikkβ+/+:Alb-creマウス、およびIkkβ△hepマウスの間で有意差はなく（図4A、B）、これは肝細胞にIKKβが存在することが、LLC細胞によって誘導された腫瘍の転移に影響を及ぼさなかったことを示唆している。転移におけるNPの役割を調べるために、本発明者らは、IkkβF/Fマウスを、インターフェロン誘導型Mx1プロモーター下でCreリコンビナーゼを発現するMx-1-Creトランスジェニックマウスと交配させた。IkkβF/F：Mx-1-Creマウスに、インターフェロン産生を誘導するポリ（IC）を注入すると、肝臓および脾臓内でIKKβを効率よく欠失させるが、他のほとんどの組織ではIKKβは欠失されない。マクロファージのほかに（Hsu LC., et al. Nature 2004;428:341-345）、Mx-1-Creによる欠失は、リンパ球、クッパー細胞、および肝細胞において非常に有効である。全肝IKKβノックアウトマウス（Ikkβ△L+H）は、ポリ（IC）注入IkkβF/FマウスおよびIkkβ+/+：Mx-1-Creマウスと比較して有意に低い肝重量、少ない転移病巣、および小さい腫瘍占有面積で肝転移を生じた（図4C、D、およびデータは示していない）。IkkβF/Fマウスの肝臓はIkkβ△L+Hマウスの肝臓と比較して著しく肥大していた（図4E）。IkkβF/Fマウスから採取した肝組織の組織病理分析により（図4E）、異型の核、多数の分裂細胞、ならびに壊死および出血の中心領域を有する腫瘍細胞の広範な癒着領域を伴う有意な腫瘍の増殖が明らかとなった。対照的に、Ikkβ△L+Hマウス由来の肝臓は、腫瘍浸潤の小さい多病巣性領域が肝実質全体に無作為に散在する攻撃性の低い腫瘍増殖を示した（図4E）。Ikkβ△L+Hマウスにおけるこの腫瘍転移の減少が腫瘍細胞のタイプ特異的であるか否かを決定するために、本発明者らはまた、黒色腫細胞株B16F10を用いた。B16F10注入後、Ikkβ△L+Hマウスにおいても腫瘍の転移は阻害され（図4F）、これは肝細胞ではなく肝NPが肝転移にとって肝要な細胞タイプであることを示唆した。
〔実施例３〕Ikkβ△L+Hマウスは比較的低レベルのIL-6を発現し、IL-6欠失によって転移腫瘍はより少なくなる
　本発明者らは次に、LLCを注入した肝臓および偽操作した肝臓において、NF-κBによって調節される遺伝子の発現を、リアルタイムPCRアレイによって調べた。本発明者らは、いくつかの遺伝子のmRNA発現が、WTマウスでLLC注入によって上方制御されたことを見出した（表1および2）。本発明者らは、IkkβF/F、Ikkβ△hep、およびIkkβ△L+Hマウスにおけるアレイ分析で上方制御されたIL-1β、IL-6、およびTNFαの発現レベルを比較し、腫瘍を脾臓内に注入すると、IkkβF/FマウスおよびIkkβ△hepマウスにおいてIL-1β、IL-6のmRNA発現が誘導されたが、Ikkβ△L+Hマウスでは、これらの遺伝子の発現は比較的低いことを見出した（図5Aおよびデータを示していない）。肝臓のTNFαmRNA発現は、いずれの系統においてもLLC注入の前後で差がなかった（図5Aおよびデータを示していない）。本発明者らはまた、転移に関連しNF-κBによって調節されるCOX-2とMMP-9のmRNA発現を分析し、Ikkβ△L+Hマウスでは、これらの遺伝子の発現が同様に比較的低いことを見出した（図5A）。IL-1βおよびIL-6は炎症反応における主要な要因であり、腫瘍促進因子として機能すると考えられている（Vidal-Vanaclocha, F., et al., J. Natl. Cancer Inst. 88, 198-205 (1996)、Aggarwal, B.B., et al., Biochem. Pharmacol. 72, 1605-1621 (2006)）。IL-1βまたはIL-6が腫瘍の転移に関連しているか否かを決定するために、本発明者らはIL-1受容体ノックアウト（IL-1 RKO）またはIL-6ノックアウト（IL-6 KO）マウスを用いた。転移腫瘍数は、WT対照と比較してIL-1 RKOマウスではわずかに減少したが、この差は有意ではなく、一方IL-6 KOマウスは、腫瘍数の有意な減少を示した（図5B）。IL-6はLLC注入後12時間で発現され、抗F4/80陽性クッパー細胞内に主に局在するようであった（図5C）。IL-6はSTAT3リン酸化を誘導して、STAT-依存的遺伝子の発現を調節する（Zhong, Z., et al., Science 264, 95-98 (1994)）。本実施例では、LLC注入によって、注入後8～12時間で肝臓内のSTAT3リン酸化が起こり、その後リン酸化は注入後24時間で減少した（図5D）IL-6 KOマウスにおいて、STAT3リン酸化は予想通り顕著に低下した（図5D）。
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〔実施例４〕IL-6はVEGF発現により腫瘍の血管新生を増強する
　本発明者らは、LLC注入後、常在性の肝マクロファージであるクッパー細胞においてIL-6産生が起こると推定し、クッパー細胞の介入をさらに証明するために、文献（Maeda S., et al. Cell 2005;121:977-990）に記載のとおり、WTマウスにGdCl3を注入し、クッパー細胞を枯渇させた。48時間後、LLC細胞を脾臓内に注入し、11日後、腫瘍負荷についてマウスを分析した。GdCl3を注入したマウスは、溶媒処理したマウスと比較して、有意に小さい転移病巣を伴う肝転移を生じた（25.1±4.8対11.8±2.5、P<0.05）。これらの結果は、クッパー細胞が腫瘍転移に決定的に重要であることを示唆するものである。
　次に、本発明者らは、IkkβF/FおよびIkkβΔL+Hマウスに由来する初代培養マクロファージを用いて、LLC細胞の直接的な作用を分析した。IκBα分解によって決定したところ、IkkβF/Fマクロファージにおいて、LLC培養上清はNF-κB活性化を誘導した。しかし、NF-κB活性化はIkkβ△L+Hマクロファージでは観察されなかった（図6A）。LLC培養上清およびLPS処置はいずれも、初代培養マクロファージにおいてIKKβ依存的にIL-6産生を誘導した（図6B）。これらの結果は、LLC細胞がIKK/NF-κBを活性化して、IL-6産生を誘導する因子を分泌することを示唆している。
　11日目に転移腫瘍が出現した後、血清IL-6濃度は増加した（図6C）。IL-6は、腫瘍形成における、細胞成長および抗アポトーシスシグナル伝達に関係すると報告されている（Wehbe, H., et al., Cancer Res. 66, 10517-10524 (2006)）。この可能性を調べるために、LLC細胞をIL-6によって刺激して、細胞周期分析に供したところ、G2からM期への移行率が23.4±2.5％から29.4±2.3％（p<0.05）に増加して、サブG1集団（すなわち、アポトーシス細胞）が9.9±1.5％から1.7±1.2％（p<0.05）に減少することが判明した。Il-6による細胞成長の影響を評価するために、本発明者らは、いくつかの時点で細胞数を測定し、LLC細胞成長がIL-6処理によって有意に増加したことを示した（図6D）。これらの結果は、IL-6が、細胞成長を促進しアポトーシスを阻害することにより、転移腫瘍の樹立を促進することを示唆する。
　本発明者らは、転移腫瘍におけるPCNA染色によって腫瘍細胞増殖を分析し、Ikkβ△L+HおよびIL-6KOマウスが、対照と比較して少ないPCNA陽性細胞を示すことを見出した（図6E、F）。
　本発明者らはまた、B16F10細胞内でのIL-6の効果を分析した。B16F10細胞の注入は、WTマウスでIL-6（および同様にIL-1β）産生を誘導したが、LLC細胞に対する作用と同様の様式でIkkβ△L+Hマウスではより低い程度の誘導を刺激した（図7A）。加えて、B16F10細胞の注入は、WTマウスの肝臓内で、STAT3を活性化した（図7B）。インビトロで、IL-6処理によって、STAT3は活性化され、細胞成長は有意に増加した（図7C、D）。
〔実施例５〕IL-6はVEGF発現を介して腫瘍の血管形成を亢進する
　転移の処置に血管新生阻害剤を使用することは、特定の癌には明らかに効果が高い。LLC注入由来の転移腫瘍も血管新生に依存し（Lee HJ, et al., Carcinogenesis 2006;27:2455-2463）、また、IL-6はVEGFの発現を通して血管新生に関係している（Loeffler S, et al., Int J Cancer 2005;115:202-213）。本実施例において、血液糖タンパク質であるフォン・ヴィレブランド因子（vWF）に関する免疫染色によって検討したところ、腫瘍の血管新生は転移性肝腫瘍において増加した（図8A）。対照と比較して、Ikkβ△L+HおよびIL-6KOマウスの転移腫瘍では、血管形成が低下した（図8B）。
　IL-6がVEGF産生を誘導するか否かを決定するために、肝NPおよびマウス胚線維芽細胞（MEF）を、可溶性のIL-6受容体（IL-6sR）の存在下または非存在下でIL-6によって処理した。ELISAによる検討の結果、IL-6sRと併用したIL-6はNPおよびMEFにおいてVEGF産生を誘導した（図8C）。11日目に転移腫瘍が出現した後、血清VEGF濃度はWTマウスで増加し、一方VEGFはIL-6KOマウスでは十分に発現しなかった（図8D）。本発明者らは、LLCを注入したマウスと注入しなかったマウスの血清中でIL-6sR濃度を測定し、LLC注入に関わらず全ての動物でIL-6Rが豊富に発現することを見出した（図8E）。
　この知見が臨床的に応用可能であるか否かを調べるために、本発明者らは中和抗IL-6受容体抗体の存在下または非存在下でLLC細胞をIL-6で処理した（Hsu LC, et al., Nature 2004;428:341-345）。抗体との同時処理により、LLC細胞におけるIL-6によるSTAT3リン酸化は阻害された（図8G）。次に、本発明者らは、野生型マウスにLLC細胞を接種して、LLC注入後0、3、6、および9日目に抗IL-6を投与した。LLC注入後11日目に、抗IL-6処理を受けたマウスでは転移腫瘍数が最大50％減少した（図8F）。
　さらに、本発明者らは、Ikkβ△L+HにおいてIL-6（1 mg/マウス）およびIL6R（1 mg/マウス）を添加することにより、補足実験を行った。腫瘍数はわずかに増加した[Ikkβ△L+H 4.1±1.1 (n=9) 、Ikkβ△L+H +IL-6/IL-6R 8.4±1.9 (n=5) (P=0.045)]。この結果より、IL-6は肝転移の発生に重要であるが、TNFα、IL-1、またはMMPなど他の因子が、IL-6と協同して転移を誘導する可能性があることが示唆される。換言すると、IL-6の存在のみが十分な条件ではないが、それは癌の転移に必要な条件である。
〔実施例６〕NEMO-結合ドメインペプチドは腫瘍の転移を阻害する
　本発明者らは、NEMOとIKKβとの会合を遮断してNF-κB活性を阻害するNBDペプチドが（May, M.J., et al. Science 289, 1550-1554 (2000)）、腫瘍の転移を低減させるか否かを調べた。NBD処理は、J774.1マウスマクロファージ細胞において、LLC上清またはLPSで誘導したNF-κBの活性化（図9A）と、IL-6誘導（データを示していない）とを阻害した。LLC注入の0、3、6、および9日後にNBDペプチドによる処理を行った場合、本発明者らは、肝転移を有するNBD処理マウスが対照マウスと比較して有意に低い肝重量および少ない転移病巣を示すことを見出し（図9B、C）、一方変異NBDペプチドはどのような作用も示さなかった（図9B、C）。
〔考察〕
　本発明は、IL-6が肝転移における肝要な調節因子であることを証明する。さらに本発明は、NF-κB活性化に強く関連しているIL-6が、腫瘍の転移にも関係しており、肝転移を処置するための重要な治療標的となる可能性があることを示している。
　最近、TLR2-依存的TNFα発現が肺転移にとって必要であるが、TNFαと同様に誘導されたIL-6は関係しなかったことが報告されたが（Kim, S., et al. Nature in press.）、TNFαが肺転移において重要であって、IL-6が肝転移において重要である理由は不明である。炎症性の微小環境を生成するための機構が肺と肝臓では異なると推測されている。実際に、IL-6は肝再生にとって特に重要であり、同様に肝臓癌の発生にとっても肝要である（Naugler, W.E., et al. Science 317, 121-124 (2007)、Cressman, D.E., et al. Science 274, 1379-1383 (1996)）。対照的に、肝再生におけるTNFαの関係については論争があり（Hayashi, H., et al. Liver Int 25, 162-170 (2005)、 Yamada, Y., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 1441-1446 (1997)）、癌発生にとっては肝要ではない（Naugler, W.E., et al. Science 317, 121-124 (2007)）。本発明者らは、LLC投与によってTNFα発現がIkkβF/FマウスとIkkβ△L+Hマウスの肝臓間で変化しなかったことから、TNFα発現の関与を分析しなかった。
　本発明者らの結果はまた、NF-κB活性化によって誘導された転移が、IL-6による細胞増殖および血管形成に関連したことを示唆する。IL-6を除く他の要因も、NF-κB活性化腫瘍転移に関係していると考えられる。たとえば、NF-κB活性化の阻害によって、腫瘍の転移に強く関連しているMMP9発現の減弱が起こる（Coussens, L.M. & Werb, Z. Nature 420, 860-867 (2002)）。本発明者らは、MMP9がLLC注入マウスの肝臓においてIKKβ依存的に活性化されることを見出した（図１０）。さらに、COX-2発現もまたIKKβ依存的であり、これまでの報告と一致する（Chen, C.C., et al. Mol. Pharmacol. 59, 493-500 (2001)）。COX-2関連血管形成および細胞増殖は、転移に関与すると考えられる。
　逆に、対照マウスにおける腫瘍細胞注入によって上方制御された多くの遺伝子の誘導は、Ikkβ△L+Hマウスでは比較的低かったが、完全には阻害されず、これは、NF-κBに加えて他の因子がこれらの転写の上方制御に関与しているであろうことを示唆した。たとえば、IL-6発現は、NF-κBだけではなくAP-1およびC/EBPによっても調節される（Pritts T., et al. Am J Surg 2002;183:372-83）。これらのマーカーは、腫瘍転移に対する他の治療標的となり得ることが予測される。
　炎症が転移を促進するか、または阻害するかは、なおも議論が分かれている。しかし、腫瘍関連マクロファージ（TAM）および炎症関連発癌モデル（Luo, Y., et al. J. Clin. Invest. 116, 2132-2141 (2006)、Lewis, C.E. & Pollard, Cancer Res. 66, 605-612 (2006)）に関するこれまでの研究は、炎症が癌の発生を促進することを示唆している。本発明者らは転移性の肝臓腫瘍の発生が炎症に依存すると予想しなかったが、本発明者らの結果は、炎症反応の主要な活性物質であるIKKβが転移において重要な役割を果たすことを示している。一方、IKKβがクッパー細胞、他のタイプの骨髄細胞、および肝細胞から消失した場合に限って抗発癌効果が得られた。これらの結果は、クッパー細胞がマイトゲン産生にとって肝要であることを示している。本明細書に記載したモデルにおいて、転移腫瘍の周囲および内部にマクロファージの蓄積が観察された。IKKβの欠損はマクロファージ蓄積を減少させたことから、本発明者らの結果は、腫瘍の転移が同様に炎症反応にも関連することを示唆している。
　Ikkβ△L+Hマウスでは、肝細胞とクッパー細胞だけでなく、内皮細胞など他の細胞でもIKKβを除去した（Lee PY., et al. Arthritis Rheum. 2007;56:3759-69）。実際NF-κB活性化とIL-6発現は主にクッパー細胞で観察され、本発明者らは、GdCl3を注入してクッパー細胞を枯渇させたマウスが比較的低い肝転移を示したことを見出した。このことは、クッパー細胞が転移の発生に関して肝要な細胞であることを示唆した。
　本発明者らのモデルにおいて、本発明者らはLLC細胞そのものにおけるNF-κB活性が転移に寄与しないことを示した。本発明者らは、IκBαの機能を阻害するIκBαSRの発現による試験であることから、癌細胞におけるNF-κB活性化が転移に関係する可能性を除外することができない。細胞増殖はNF-κBに従って減少または増加する（Chen, F., et al. J. Biol. Chem. 281, 37142-37149 (2006)）。このことは細胞の成長におけるNF-κB活性化の役割が細胞型特異的であることを示唆している。さらに、NF-κBの構成的活性化が癌細胞において時に観察され、そのようなNF-κB活性化細胞は強い転移活性を示した（Fujioka, S., et al. Oncogene 22, 1365-1370 (2003)、Nakshatri, H., et al. Mol. Cell. Biol. 17, 3629-3639 (1997)）。このように、NF-κB経路の阻害は、特異的細胞型において転移を遅らせるのに有効である可能性がある。
　しかし、NF-κB阻害剤は、臨床実践において免疫系の調節によって引き起こされる副作用が起こるなどの問題がある（Karin, M., et. Al., Nat Rev Drug Discov 3, 17-26 (2004)）。NF-κB阻害剤の使用は、免疫欠損に罹っている癌患者において特にリスクが高くなる可能性がある。一方で、IL-6阻害は、抗癌治療に対する有望なアプローチと考えられる。現在のところ、IL-6阻害はリウマチ性関節炎およびキャッスルマン病を含むいくつかの炎症疾患に関して臨床的に用いられている（Sebba, A. Am. J. Health Syst. Pharm. 65, 1413-1418 (2008)）。本発明者らの結果およびこれまでの研究の結果に基づいて、IL-6阻害は、肝臓癌、結腸直腸癌、および乳癌のような転移関連癌において将来、臨床的に適用できると考えられる。
　要約すると、本発明者らの結果は、肝腫瘍転移が炎症に依存することを示しており、転移腫瘍の化学的予防においてクッパー細胞を標的とする抗炎症介入の有望性を高める。本発明者らの結果は、IKKβ/NF-κBシグナル伝達経路が抗転移薬の開発にとって魅力的な標的であることを証明している。
　本発明において、抗IL-6受容体抗体を投与することにより、癌の肝臓への転移を抑制することが可能であることが示された。したがって、本発明のIL-6阻害剤は転移癌の抑制剤として有用である。

Claims (28)

  1. 　インターロイキン６（IL-6）阻害剤を有効成分とする癌の転移抑制剤。
  2. 　癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする請求項１に記載の転移抑制剤。
  3. 　IL-6阻害剤がIL-6受容体阻害剤である請求項１又は２いずれかに記載の転移抑制剤。
  4. 　IL-6受容体阻害剤がヒトIL-6受容体阻害剤である請求項３に記載の転移抑制剤。
  5. 　IL-6受容体阻害剤が抗IL-6受容体抗体である請求項３又は４いずれかに記載の転移抑制剤。
  6. 　抗IL-6受容体抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である請求項５に記載の転移抑制剤。
  7. 　肺癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする請求項１～６いずれかに記載の転移抑制剤。
  8. 　IL-6阻害剤を対象に投与する工程を含む癌の転移を抑制する方法。
  9. 　癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 　IL-6阻害剤がIL-6受容体阻害剤である請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　IL-6受容体阻害剤がヒトIL-6受容体阻害剤である請求項１０に記載の方法。
  12. 　IL-6受容体阻害剤が抗IL-6受容体抗体である請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 　抗IL-6受容体抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である請求項１２に記載の方法。
  14. 　肺癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする請求項８～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 　癌の転移抑制剤を製造するためのIL-6阻害剤の使用。
  16. 　癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする請求項１５に記載の使用。
  17. 　IL-6阻害剤がIL-6受容体阻害剤である請求項１５又は１６に記載の使用。
  18. 　IL-6受容体阻害剤がヒトIL-6受容体阻害剤である請求項１７に記載の使用。
  19. 　IL-6受容体阻害剤が抗IL-6受容体抗体である請求項１７又は１８に記載の使用。
  20. 　抗IL-6受容体抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である請求項１９に記載の使用。
  21. 　肺癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする請求項１５～２０のいずれかに記載の使用。
  22. 　癌の転移を抑制する方法に使用するためのIL-6阻害剤。
  23. 　癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする請求項２２に記載のIL-6阻害剤。
  24. 　IL-6受容体阻害剤である請求項２１又は２２に記載のIL-6阻害剤。
  25. 　IL-6受容体阻害剤がヒトIL-6受容体阻害剤である請求項２４に記載のIL-6阻害剤。
  26. 　IL-6受容体阻害剤が抗IL-6受容体抗体である請求項２４又は２５に記載のIL-6阻害剤。
  27. 　抗IL-6受容体抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である請求項２６に記載のIL-6阻害剤。
  28. 　肺癌の肝臓への転移を抑制することを特徴とする請求項２２～２７のいずれかに記載のIL-6阻害剤。
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