WO2007061029A1 - 前立腺癌治療剤 - Google Patents

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WO2007061029A1
WO2007061029A1 PCT/JP2006/323392 JP2006323392W WO2007061029A1 WO 2007061029 A1 WO2007061029 A1 WO 2007061029A1 JP 2006323392 W JP2006323392 W JP 2006323392W WO 2007061029 A1 WO2007061029 A1 WO 2007061029A1
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antibody
prostate cancer
receptor
inhibitor
human
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PCT/JP2006/323392
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Jun Nakashima
Kent Kanao
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Keio University
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a prostate cancer therapeutic agent containing an IL-6 inhibitor as an active ingredient, and use thereof.
  • the present invention also relates to a method for treating prostate cancer, comprising a step of administering an IL-6 inhibitor to a subject who has developed prostate cancer.
  • Hormone therapy is performed by suppressing the action and ability to suppress the production of androgens related to the growth of prostate cancer.
  • Hormonal therapy is performed by removing male testes that produce male hormones, administering LH-RH analogs and estrogens that act on the pituitary gland to lower androgens, and administering antiandrogens.
  • Hormonal therapy is the only treatment for the treatment of advanced prostate cancer. Many advanced prostate cancer patients who have started hormone therapy have acquired hormone resistance several years later and are struggling to treat. There is a need for an effective treatment for prostate cancer that has acquired resistance to cancer.
  • IL-6 is a cytodynamic force also called B cell stimulating factor 2 (BSF2) or interferon ⁇ 2.
  • BSF2 B cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of vaginal lymphoid cells (Non-patent Document 1), and it was later revealed that it is a multifunctional site force-in that affects the functions of various cells. (Non-Patent Document 2).
  • IL-6 has been reported to induce maturation of vaginal lymphoid cells (Non-patent Document 3).
  • IL-6 transmits its biological activity via two proteins on cells.
  • One is IL-6 receptor, a ligand-binding protein with a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds (Non-patent Documents 4 and 5).
  • IL-6 receptor exists as a soluble IL-6 receptor mainly composed of an extracellular region in addition to a membrane-bound type that penetrates the cell membrane and is expressed on the cell membrane.
  • Non-patent Document 6 The other is a membrane protein gpl30 with a molecular weight of about 130 kD involved in non-ligand binding signaling.
  • IL-6 and IL-6 receptor form the IL-6ZIL-6 receptor complex, followed by gpl30 By binding with IL-6, the biological activity of IL-6 is transmitted into the cell (Non-patent Document 6).
  • IL-6 inhibitors are substances that inhibit the transmission of biological activities of IL-6. So far, antibodies against IL-6 (anti-IL-6 antibody), antibodies against IL-6 receptor (anti-IL-6 receptor antibody), antibodies against gpl 30 (anti-gpl30 antibody), IL-6 variants, IL-6 or IL-6 receptor partial peptides are known.
  • Non-patent Documents 7 and 8, Patent Documents 1 to 3 There are several reports on anti-IL-6 receptor antibodies (Non-patent Documents 7 and 8, Patent Documents 1 to 3).
  • One such antibody is the human ⁇ PM-1 antibody obtained by transplanting the complementarity determining region (CDR) of mouse antibody PM-1 (Non-patent Document 9) into human f ⁇ . (Patent Document 4).
  • Non-patent Document 10 IL-6 is known to act on autocrine or paracrine in prostate cancer to grow tumors.
  • IL-6 produced in excess of tumor power is the main cause of cachexia in patients with advanced prostate cancer.
  • Non-patent literature l Hirano, T. et al, Nature (1986) 324, 73-76
  • Non-Patent Document 2 Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78
  • Non-Patent Document 3 Lotz, M. et al "J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258
  • Non-Patent Document 4 Taga, T. et al "J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
  • Non-Patent Document 5 Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828
  • Non-Patent Document 6 Taga, T. et al "Cell (1989) 58, 573-581
  • Non-Patent Document 7 Novick, D. et al, Hybridoma (1991) 10, 137-146
  • Non-Patent Document 8 Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630
  • Non-Patent Document 9 Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906
  • Non-Patent Document 10 Okamoto et al, Cancer Res. 57 (1), 141-6, 1997
  • Patent Document 1 International Patent Application Publication Number WO 95-09873
  • Patent Document 2 French Patent Application Publication Number FR 2694767
  • Patent Document 3 US Patent No.US 5216128
  • Patent Document 4 International Patent Application Publication Number WO 92-19759
  • the present inventors have studied the antitumor effect of anti-IL-6 receptor antibody on prostate cancer.
  • the present inventors confirmed whether or not IL-6 receptor was expressed in human prostate cancer cell lines PC3, DU145, and JCA-1 by Western plot analysis. As a result, it became clear that the IL-6 receptor was expressed in the above three cell lines (Fig. 1). Moreover, IL-6 in the culture supernatant of the above cells was measured by ELISA, and it became clear that these cells produced IL-6 (FIG. 2).
  • the present inventors have found for the first time that the growth of prostate cancer can be suppressed by administering an anti-IL-6 receptor antibody, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides the following [1] to [22].
  • a prostate cancer therapeutic agent comprising an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • a method for treating prostate cancer in a subject comprising a step of administering an IL-6 inhibitor to the subject who has developed prostate cancer.
  • FIG. 1 is a photograph showing that IL-6 receptor is expressed in human prostate cancer cell lines JCA-1, PC3, and DU145 by Western blot analysis.
  • FIG. 3 shows that humanized PM-1 antibody (hP Ml) has an antitumor effect in vitro against human prostate cancer cell lines JCA-1, PC3, and DU145.
  • the numerical value on the horizontal axis indicates the concentration of hPM 1.
  • FIG. 4 A photograph showing that when DU145 cells were stimulated with IL-6 for 60 minutes, the expression of pSTAT3 was enhanced, and by using hPMl, the enhanced expression of PSTAT3 was suppressed.
  • FIG. 5 shows the in vivo antitumor effect of human PM-1 antibody (hPMl) in a subcutaneous tumor-bearing mouse model obtained by transplanting the human prostate cancer cell line DU145 into SCID mice.
  • Upper panel A graph showing changes in tumor size over time when humanized PM-1 antibody or control antibody (IgG) was administered to tumor-bearing mice.
  • the figure below shows the change in body weight over time when a human mouse PM-1 antibody or a control antibody (IgG) is administered to a tumor-bearing mouse.
  • the present inventors have found that the growth of prostate cancer can be suppressed by administering an anti-IL-6 receptor antibody.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention relates to a prostate cancer therapeutic agent containing an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • an “IL-6 inhibitor” is a substance that blocks IL-6 signal transduction and inhibits IL-6 biological activity.
  • the IL-6 inhibitor is preferably a substance having an inhibitory action on binding of any of IL-6, IL-6 receptor and gpl30.
  • Examples of the IL-6 inhibitor of the present invention include anti-IL-6 antibody, anti-IL-6 receptor antibody, anti-gpl30 antibody, IL-6 variant, soluble IL-6 receptor variant or IL-6 or Examples thereof include partial peptides of IL-6 receptor and low molecular weight substances exhibiting the same activity as these, but are not particularly limited.
  • the IL-6 inhibitor of the present invention is preferably an antibody that recognizes IL-6 receptor.
  • the origin of the antibody in the present invention is not particularly limited, but is preferably derived from a mammal, more preferably a human-derived antibody.
  • the anti-IL-6 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using a known means.
  • a mammal-derived monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hyperpridoma and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody binds to IL-6, thereby inhibiting the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocking the intracellular transmission of IL-6 biological activity.
  • Such antibodies include MH166 (Matsuda, T. et al "Eur. J. Immunol. (1988) 18, 95 1-956) and SK2 antibody (Sato, K. et al, 21st Annual Meeting of the Immunological Society of Japan). And academic records (1991) 21, 166).
  • the anti-IL-6 antibody-producing hyperpridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, using IL-6 as a sensitizing antigen and immunizing it according to the usual immunization method, the obtained immune cells are fused with known parental cells by the usual cell fusion method, and by the usual screening method, It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • the anti-IL-6 antibody can be prepared as follows.
  • HI-6 used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Im munol. (1988) 140, 1534-1541, or Agr. Biol It is obtained by using the IL-6 gene Z amino acid sequence disclosed in Chem. (1990) 54, 2685-2688.
  • the target IL-6 protein is known from the host cell or culture supernatant.
  • the purified IL-6 protein can be used as a sensitizing antigen.
  • a fusion protein of IL-6 protein and other proteins may be used as a sensitizing antigen!
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hyperpridoma and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody binds to the IL-6 receptor, thereby blocking the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocking the transmission of IL-6 biological activity into the cell.
  • MR16-1 antibody Tropura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928
  • PM-1 antibody Hirata, Y. et al J. Immunol. (1989) 143, 2 900-2906)
  • AUK12-20 antibody AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody
  • HL-6 receptor PM-1 antibody is exemplified as a monoclonal antibody
  • the mouse IL-6 receptor is exemplified.
  • a preferred monoclonal antibody against is MR16-1 antibody.
  • the anti-IL-6 receptor monoclonal antibody-producing hybridoma ibridoma
  • IL-6 receptor is used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method.
  • a monoclonal antibody-producing cell can be screened.
  • an anti-IL-6 receptor antibody can be prepared as follows.
  • the human HL-6 receptor used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is disclosed in European Patent Application Publication No. EP 3 25474, and the mouse IL-6 receptor is disclosed in Japanese Patent Application Publication No. JP-A 3-155795.
  • the obtained IL-6 receptor gene Z amino acid sequence is used.
  • IL-6 receptor protein is expressed on the cell membrane and separated from the cell membrane
  • Soluble IL-6 receptor (Soluble IL-6 receptor) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Soluble IL-6 receptor binds to the cell membrane and is composed essentially of the extracellular region of IL-6 receptor, lacking the transmembrane region or the transmembrane region and the intracellular region. It differs from membrane-bound IL-6 receptor in that respect. As long as the IL-6 receptor protein can be used as a sensitizing antigen for the production of the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention, V, a misaligned IL-6 receptor may be used.
  • the target IL-6 receptor protein After inserting the IL-6 receptor gene sequence into a known expression vector system and transforming an appropriate host cell, the target IL-6 receptor protein is transferred from the host cell or culture supernatant.
  • the purified IL-6 receptor protein may be used as a sensitizing antigen after purification by a known method. Further, cells expressing IL-6 receptor or a fusion protein of IL-6 receptor protein and other proteins may be used as the sensitizing antigen.
  • the anti-gpl30 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hyperpridoma and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody inhibits the binding of IL-6ZIL-6 receptor complex to gpl30 by binding to gpl30. It blocks the transmission of IL-6 biological activity into the cell.
  • Examples of such antibodies include the ⁇ 164 antibody (Japanese Patent Laid-open No. 3-219894), 4811 antibody chobi 21 "[4 antibody (US 5571513) B-S12 antibody and B-P8 antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 8-291199). Can be mentioned.
  • Anti-gpl30 monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared basically using known techniques as follows. That is, gpl30 is used as a sensitizing antigen and immunized according to the usual immunization method. The obtained immune cells are fused with known parental cells by the usual cell fusion method, and then monoclonal by the usual screening method. It can be produced by screening antibody-producing cells.
  • the monoclonal antibody can be produced as follows.
  • gpl30 used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody can be obtained by using the gpl30 gene Z amino acid sequence disclosed in European Patent Application Publication No. EP 411946.
  • the target gpl30 protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method, This purified gpl30 protein may be used as a sensitizing antigen.
  • cells expressing gpl30 or a fusion protein of gpl30 protein and other proteins may be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but it is generally preferable to select in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • Rodent animals such as mice, rats, hamsters and the like are used.
  • a known method is performed.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitized antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, etc., and suspended, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline physiological saline
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells that are subjected to cell fusion include spleen cells.
  • Mammalian myeloma cells as other parental cells to be fused with the immune cells have already been known in various cell lines such as P3X63Ag8.653 (Kearney, JF et al. J. Imm unol. 1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J.
  • the cell fusion between the immunocytes and myeloma cells is basically performed by a known method such as the method of Milsteine et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). It can be done according to this.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used as a fusion promoter, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be added and used to increase the fusion efficiency as desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells is preferably, for example, 1 to 10 times as many immune cells as that of myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this type of cell culture can be used.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution and pre-warmed to about 37 ° C, for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000.
  • PEG solution is usually added at a concentration of 30 to 60% (w / v) and mixed to form the desired fused cell (hybridoma).
  • cell fusion agents and the like unfavorable for the growth of hypridoma can be removed by repeating the operation of adding an appropriate culture solution successively, centrifuging and removing the supernatant.
  • the Hypridoma is a normal selective culture solution such as HAT culture solution (hypoxanthine, Culture medium containing aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT medium is continued for a period of time, usually several days to several weeks, sufficient for the cells (non-fusion cells) other than the target hyperpridoma to die. Then, the usual limiting dilution method is performed, and the screening and cloning of the hyperidoma producing the target antibody is performed.
  • HAT culture solution hypoxanthine, Culture medium containing aminopterin and thymidine
  • human lymphocytes are sensitized with a desired antigen protein or antigen-expressing cell in vitro, and sensitized B lymphocytes are human myeloma cells, for example, It can also be fused with U266 to obtain a desired human antibody having a binding activity to a desired antigen or antigen-expressing cell (see Japanese Patent Publication No. 59878).
  • an antigen or an antigen-expressing cell may be administered to a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes, and a desired human antibody may be obtained according to the method described above. (International Patent Application Publication Number) WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • the thus-produced monoclonal antibody-producing hybridoma can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hyperpridoma can be cultured according to the usual method and obtained as a culture supernatant, or the hyperidoma can be administered to a mammal compatible therewith to proliferate.
  • the method of obtaining it as ascites is adopted.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • an anti-IL-6 receptor antibody-producing hybridoma can be performed by the method disclosed in JP-A-3-139293.
  • PM-1 antibody-producing hybridoma is injected into the peritoneal cavity of BALB / c mice to obtain ascites, and PM-1 antibody is purified from this ascites, or this hybridoma is treated with an appropriate medium, for example, 10% Culture with serum, RPMI1640 medium containing 5% BM-Condimed HI (Boehringer Mannheim), Hypridoma SFM medium (GIBCO-BRL), PF ⁇ - ⁇ medium (GIBCO-BRL), etc. It can be performed by a method of purifying PM-1 antibody.
  • the antibody gene is cloned into a hybridoma, cloned into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using a gene recombination technique.
  • Antibodies can be used (see, for example, Borrebaeck CAK and Larrick JW THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • mRNA encoding the variable (V) region of an antibody is isolated from cells producing the antibody of interest, for example, hyperidoma. Isolation of mRNA is performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Prepare total RNA using Biochem. (1987) 162, 156-159), etc., and prepare mRNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Alternatively, mRNA can be directly prepared using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA of the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis can be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, MA et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al "Nucleic Acids Res. (1989) l 7, 2919-2932).
  • the desired DNA fragment can be obtained from the obtained PCR product.
  • DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • C region constant region
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or promoter, as described below.
  • an expression control region for example, an enhancer or promoter, as described below.
  • a host cell is transformed with this expression vector to express the antibody. be able to.
  • a genetically engineered antibody such as a chimeric antibody, a humanized antibody, a human (human) antibodies can be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody can be obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (See European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. W 0 92-19759). Using this known method, a chimeric antibody useful in the present invention can be obtained.
  • a humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody or a humanized antibody, and a complementarity determining region (CDR) of a mammal other than a human, for example, a mouse antibody, is transferred to a complementarity determining region of a human antibody. It is transplanted, and its general gene recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • the obtained DNA is obtained by ligating with the DNA encoding the human antibody C region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication Number EP 239400, International Patent Application Publication Number). WO 92-19759).
  • the complementarity determining region forms a favorable antigen binding site is selected. If necessary, the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • the human antibody C region is used for the chimeric antibody and the humanized antibody.
  • the human antibody C region include Cy, and for example, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, or Cy4 can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody consists of a variable region of a non-human mammal-derived antibody and a C region derived from a human antibody.
  • humanized antibodies are complementarity-determining regions of antibodies derived from mammals other than humans, framework regions and C regions derived from human antibodies, and both have reduced antigenicity in the human body. It is useful as an antibody used in the present invention.
  • a preferred specific example of the humanized antibody used in the present invention is the human PM-1 antibody (see International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • a technique for obtaining human antibodies by panning using a human antibody library is also known.
  • a variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector containing the sequence can be prepared, and a human antibody can be obtained.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed by a known method. When mammalian cells are used, they can be expressed by commonly used useful promoters, expressed antibody genes, DNA 3 functionally linked to the 3 'downstream, or vectors containing them. it can.
  • the promoter Zenhansa can be a human cytomegalovirus immediate promoter / enhancer.
  • promoters that can be used for the expression of the antibodies used in the present invention, such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, and simian virus 40 (SV40), are also included.
  • a mammalian cell-derived promoter such as human longon factor 1 ⁇ (HEFla) may be used.
  • HEF1 ⁇ promoter / enhancer the method of Mulligan et al. (Mulligan, RC et al., Nature (1979) 277, 108-114), and when the HEF1 ⁇ promoter / enhancer is used, Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res.
  • promoters include lacZ promoter and & 8 promoter.
  • Ward et al. Ward, ES et al., Nature (1989) 341, 5 44-546; Ward, ES et al. FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427
  • araB promoter When using the araB promoter, the method of Better et al. (Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043) may be followed.
  • a pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) may be used in the case of production in the periplasm of E. coli. After separating the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is appropriately refolded and used (see, for example, WO96 / 30394).
  • the origin of replication can be derived from SV40, poliovirus, adenovirus, ushipapilloma virus (BPV), etc., and the expression vector is selected for gene copy number amplification in the host cell system.
  • Markers can include aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, and the like.
  • any production system can be used.
  • Production systems for antibody production include in vitro and in vivo production systems.
  • in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • eukaryotic cells When eukaryotic cells are used, there are production systems that use animal cells, plant cells, or fungal cells.
  • Animal cells include (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc., (2) amphibian cells such as Xenopus oocytes, or ( 3) Insect cells such as s! 9, s! 21, and Tn5 are known.
  • plant cells cells derived from Nicotiana tabacum are known, and these may be cultured in callus.
  • fungal cells examples include yeasts such as Saccharomyces birds, f row Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi.
  • yeasts such as Saccharomyces birds, f row Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi.
  • Aspergillus such as Aspergill us niger, is known.
  • prokaryotic cells When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells.
  • bacterial cells include E. coli and Bacillus subtilis.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as the culture medium, and serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination. Alternatively, antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced to the abdominal cavity of animals.
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants.
  • animals When animals are used, there are production systems using mammals and insects.
  • mammals As mammals, goats, pigs, hidges, mice, mice, etc. can be used (Vic ki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • silkworms can be used as insects.
  • tobacco When using a plant, for example, tobacco can be used.
  • An antibody gene is introduced into these animals or plants, and the antibodies are produced and collected in the animals or plants.
  • an antibody gene is inserted in the middle of a gene encoding a protein produced specifically in milk such as goat j8 casein to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene is inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat. Milk power produced by a transgene goat born from a goat that received the embryo or its offspring. To increase the amount of milk containing the desired antibody produced, hormones may be used as appropriate in the transgenic dog. (Ebert, K.M. et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702;).
  • a silkworm When silkworms are used, a silkworm is infected with a baculovirus into which the antibody gene of interest is inserted, and a desired antibody is obtained from the body fluid of the silkworm (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594) o Further, when tobacco is used, the target antibody gene is inserted into a plant expression vector such as pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. This bacterium is infected with tobacco, for example Nicotiana tabacum, and the desired antibody is obtained from the leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994 ) 24, 131-138).
  • DNAs encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) are separately incorporated into an expression vector. May be transformed simultaneously, or the host may be transformed by incorporating DNA encoding the H and L chains into a single expression vector (see International Patent Application Publication No. WO 94-11523). ).
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it can be suitably used in the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2, Fv, or single chain Fv (scFv) in which H chain and L chain Fv are linked by an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to produce antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • scFv is obtained by linking the H chain V region and L chain V region of an antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988). ) 85, 5879—5883).
  • a linker preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988). ) 85, 5879—5883).
  • the H chain V region and the L chain V region in scFv are described as the above-mentioned antibody, they may be derived from a deviation.
  • the peptide linker that links the V regions for example, any single chain peptide consisting of amino acid residues 12-19 is used.
  • the scFv-encoding DNA is a DNA that encodes the H chain or H chain V region of the antibody, and a DNA that encodes the L chain or L chain V region.
  • a portion of the DNA encoding the amino acid sequence was amplified by PCR using a primer pair defining both ends, and then the DNA encoding a portion of the peptide linker and both ends thereof were combined with the H chain and L chain, respectively. Amplify by combining primer pairs that are specified to be ligated. And obtained.
  • a DNA encoding scFv is prepared, an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained in accordance with a conventional method. According to a conventional method, scFv can be obtained.
  • antibody fragments can be produced by a host by obtaining and expressing the gene in the same manner as described above.
  • the term “antibody” as used in the present invention encompasses these antibody fragments.
  • As a modified antibody an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” referred to in the present invention includes these modified antibodies. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the antibody produced and expressed as described above can be isolated from the inside and outside of the cell and from the host and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be carried out by affinity chromatography.
  • Examples of the column used for the affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • Examples of the carrier used for the protein A column include HyperD, POROS, Sepharose F.F.
  • the separation and purification methods used for ordinary proteins are not limited in any way.
  • the antibody used in the present invention can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography other than the above affinity chromatography, filter, ultrafiltration, salting out, dialysis and the like.
  • chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and the like. These chromatograms ⁇ are applied to HPL (High performance liquid chromatography) and protected. You can also use reverse phase HPLC!
  • the antibody concentration obtained above can be measured by absorbance measurement or ELISA.
  • absorbance measurement or ELISA it can be measured as follows. That is, 100 ⁇ l of goat anti-HgG (manufactured by TAG) diluted to 1 g / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was placed in a 96-well plate (manufactured by Nunc) and placed at 4 ° C ⁇ ⁇ In Incubate and immobilize antibody. After blocking, add appropriately diluted antibody to be used in the present invention or a sample containing the antibody, or 100 ⁇ l of HgG (manufactured by CAPPEL) as a sample, and incubate at room temperature for 1 hour.
  • the IL-6 variant used in the present invention is a substance that has a binding activity to the IL-6 receptor and does not transmit the biological activity of IL-6. That is, the IL-6 variant does not transmit IL-6 biological activity to the IL-6 receptor competitively with IL-6, and therefore blocks signal transmission by IL-6.
  • IL-6 variants are produced by introducing mutations by substituting amino acid residues in the amino acid sequence of IL-6.
  • the origin of IL-6, which is a variant of IL-6, is not limited, but human IL-6 is preferable in consideration of antigenicity.
  • the secondary structure of the amino acid sequence of IL-6 can be determined using a known molecular modeling program such as W HATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56). This is done by predicting and evaluating the effect on the total number of amino acid residues to be substituted. After determining the appropriate replacement amino acid residue, by introducing a mutation that replaces the amino acid by the usual PCR method, using a vector containing the base sequence encoding the HL-6 gene as a saddle type, A gene encoding the IL-6 variant is obtained. This can be incorporated into an appropriate expression vector as necessary, and an IL-6 variant can be obtained according to the expression, production and purification methods of the recombinant antibody.
  • W HATIF Wide et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56.
  • IL-6 variants include Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, and Savino et al, EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96 -18648, W096-17869.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide used in the present invention has an IL-6 receptor or IL-6 binding activity, respectively, and the biological activity of IL-6 It is a substance that does not transmit activity. That is, IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide is IL-6 receptor or I By binding to and capturing L-6, it specifically inhibits the binding of IL-6 to the IL-6 receptor. As a result, IL-6 does not transmit the biological activity of IL-6, thus blocking IL-6 signaling.
  • IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide is a part or all of the region related to the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor.
  • Such peptides usually consist of 10 to 80, preferably 20 to 50, more preferably 20 to 40 amino acid residues.
  • IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide specifies the region involved in the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor Based on the amino acid sequence of a part or all of the specified region, it can be prepared by a generally known method such as a genetic engineering method or a peptide synthesis method.
  • a DNA sequence encoding the desired peptide is incorporated into an expression vector, and expression, production and purification of the recombinant antibody are performed. It can be obtained according to the method.
  • IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide by peptide synthesis, methods commonly used in peptide synthesis, such as solid phase synthesis or liquid phase synthesis, can be used.
  • an amino acid corresponding to the C-terminus of the peptide to be synthesized is bound to a support that is insoluble in an organic solvent, and the ⁇ -amino group and the side chain functional group are protected with an appropriate protecting group.
  • the reaction of condensing the amino acids one amino acid at a time in the order of the C-terminal and N-terminal and the reaction of eliminating the protecting group of the ⁇ -amino group of the amino acid or peptide bound on the resin are alternately repeated.
  • Solid phase peptide synthesis methods are roughly classified into Boc method and Fmoc method, depending on the type of protecting group used.
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction from the peptide chain support are performed.
  • hydrogen fluoride or trifluoromethanesulfonic acid can usually be used for the Boc method
  • TFA can be used for the Fmoc method.
  • Boc In the method, for example, the above-mentioned protected peptide resin is treated with hydrogen fluoride in hydrogen fluoride. The peptide is then recovered by removing the protecting group and cleaving the support force. This is freeze-dried to obtain a crude peptide.
  • the deprotection reaction and the cleavage reaction from the peptide chain support can be performed in TFA by the same operation as described above.
  • the obtained crude peptide can be separated and purified by application to HPLC. For elution, use water-acetonitrile solvent usually used for protein purification under optimal conditions. The fraction corresponding to the peak of the obtained chromatographic profile is collected and lyophilized. The peptide fraction thus purified is identified by molecular weight analysis by mass spectrum analysis, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis, or the like.
  • IL-6 partial peptide and IL-6 receptor partial peptide are disclosed in JP-A-2-188600, JP-A-7-324097, JP-A-8-311098 and US Patent Publication US5210075.
  • the antibody used in the present invention may be a conjugated antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substance, and toxin. Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
  • the “antibody” in the present invention includes these conjugated antibodies.
  • the therapeutic agent for prostate cancer of the present invention can be used in the treatment of prostate cancer.
  • prostate cancer means that prostate gland cells become cancerous.
  • prostate cancer treatment means suppression of prostate cancer growth, suppression or prevention of metastasis to other sites, or suppression of cachexia associated with the progression of prostate cancer. Suppressing recurrence of prostate cancer after surgery is also included in the above meaning.
  • PSA prostate specific antigen
  • Confirmation of whether the growth of prostate cancer has been suppressed can also be made by evaluating the size (or volume) of the primary or metastatic lesion of prostate cancer by diagnostic imaging. .
  • the agent of the present invention By administering the agent of the present invention, it can be considered that the growth of prostate cancer is suppressed when the volume of prostate cancer is reduced.
  • the volume of prostate cancer can be measured by a known method, and can also be performed by the method described in the examples.
  • the confirmation of whether or not the prostate cancer growth is suppressed can also be confirmed by taking a tissue sample and conducting a histopathological examination (biopsy).
  • biopsy The most commonly used classification to indicate the malignancy of prostate cancer is a classification based on the Gleason score. Based on the results of histopathological examination of tissues collected by biopsy, cancers are classified with a score of 2 to 10, and the larger the number, the higher the probability that cancer with higher malignancy will metastasize. In general, the prognosis is good for cancers that remain in a narrow area within the prostate and have a low Gleason score of 5 or less, and this trend is independent of the patient's age.
  • cancers with a Gleason score of 7 or higher are considered to have a poor prognosis. That is, when the Gleason score is decreased by administering the drug of the present invention, it can be considered that the growth of prostate cancer is suppressed.
  • the IL-6 signaling inhibitory activity of the IL-6 inhibitor used in the present invention can be evaluated by a commonly used method. Specifically, an IL-6-dependent human myeloma line (S6B45, KPM M2), a human Rennelt T lymphoma cell line KT3, or an IL-6-dependent cell MH60.BSF2 is cultivated and IL-6 is added thereto. At the same time, IL-6-dependent cells can be measured for 3H-thymidine incorporation by coexisting with an IL-6 inhibitor.
  • the 1251-labeled cell bound to the IL-6 receptor-expressing cell Measure IL-6.
  • a negative control group that does not contain an IL-6 inhibitor is placed.
  • the IL-6 inhibitory activity of the IL-6 inhibitor can be evaluated.
  • the IL-6 inhibitory activity of IL-6 inhibitors in prostate cancer cell lines was also evaluated by measuring STAT3 phosphate downstream of IL-6 receptor signaling. can do.
  • the IL-6 inhibitor inhibits IL-6 signaling and suppresses prostate cancer growth.
  • the measurement of STAT3 phosphate can be performed by a known method, and can also be performed by the method described in the Examples.
  • IL-6 receptor antibody As shown in the examples described below, administration of an anti-IL-6 receptor antibody was confirmed to suppress the growth of prostate cancer. Therefore, IL such as an anti-IL-6 receptor antibody It was suggested that -6 inhibitors are useful as therapeutic agents for prostate cancer.
  • the subject to which the therapeutic agent for prostate cancer of the present invention is administered is a mammal.
  • the mammal is preferably a human.
  • the therapeutic agent for prostate cancer of the present invention can be administered in the form of a pharmaceutical, and can be administered systemically or locally orally or parenterally.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, enema, oral enteric solvent, etc. can be selected, and the administration method should be selected appropriately depending on the age and symptoms of the patient.
  • Effective doses are selected in the range of O.Olmg to lOOmg per kg body weight.
  • a dose of 1-1000 mg, preferably 5-50 mg per patient can be selected.
  • an effective dose is an amount that is sufficient for the presence of a free antibody in the blood.
  • Per month (4 weeks) 0.5mg to 40mg, preferably lmg to 20mg divided into several times, eg 2 times Z week, 1 time Z week, 1 time Z2 week, 1 time Z4 week, etc.
  • Intravenous injection such as infusion, subcutaneous injection, etc., etc.
  • Dosing schedules are as follows: 2 times Z week or 1 time Z week to 1 time Z 2 weeks, 1 time Z 3 weeks, 1 time Z 4 weeks while observing the post-dose condition and observing blood test values. It is also possible to make adjustments by extending the length.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as a preservative or a stabilizer may be added to the prostate cancer therapeutic agent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is itself a prostate cancer as described above. It may be a material that has an inhibitory effect on the growth of the substance, or may be a material that does not have the inhibitory effect, and means a material that can be administered together with the inhibitor. In addition, even a material that does not have an effect of suppressing the growth of prostate cancer may be a material that has a synergistic or additive stability effect when used in combination with an IL-6 inhibitor. ,.
  • examples of materials that are acceptable for formulation include sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binders, and the like.
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, Glycerin fatty acid esters such as glyceryl monomyristate and glycerin monostearate; polyglycerin fatty acid esters such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate and decaglyceryl monolinoleate; polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene Sorbitan monooleate, Polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, poly
  • the surfactant examples include an anionic surfactant, for example, an alkyl sulfate having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as cetyl sodium sulfate, sodium lauryl sulfate, sodium oleyl sulfate; Polyoxyethylene alkyl ether sulfates such as sodium polyoxyethylene lauryl sulfate having an average addition mole number of ethylene oxide of 2 to 4 and an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms; such as ester sodium lauryl sulfosuccinate Alkyl sulfosuccinic acid ester salts having 8 to 18 carbon atoms in the alkyl group; natural surfactants such as lecithin and glycine phospholipids; sphingophospholipids such as sphingomyelin; fatty acid having 12 to 18 carbon atoms Typical examples include sucrose fatty acid esters.
  • Preferred surfactants for use in the formulations of the present invention are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20, 40, 60 or 80, with polysonolates 20 and 80 being particularly preferred.
  • polyoxyethylene polyoxypropylene glycol represented by poloxamer such as Pull Knick F-68 (registered trademark) is also preferable.
  • the amount of surfactant added varies depending on the type of surfactant used.
  • polysorbate 20 or polysorbate 80 it is generally 0.001 to 100 mgZmL, preferably 0.003 to 50 mg / mL. Preferably it is 0.005 to 2 mg / mL.
  • the buffering agent phosphoric acid, citrate buffer, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, darconic acid, strong prillic acid, deoxycholic acid, salicylate
  • examples thereof include other organic acids such as acid, triethanolamine, and fumaric acid, or carbonate buffer, tris buffer, histidine buffer, and imidazole buffer.
  • a solution formulation may be prepared by dissolving in an aqueous buffer known in the field of solution formulation.
  • concentration of the buffer is generally 1 to 500 mM, preferably 5 to 100 mM, and more preferably 10 to 20 mM.
  • the inhibitor of the present invention includes other low molecular weight polypeptides, serum albumin, and zera. It may contain proteins such as tin and immunoglobulin, saccharides such as amino acids, polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols.
  • amino acids include basic amino acids such as arginine, lysine, histidine, ortin, or inorganic salts of these amino acids (preferably in the form of hydrochlorides or phosphates, That is, phosphoric acid amino acid).
  • the preferred pH value is determined by appropriate physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, especially hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts. Adjusted.
  • the use of phosphate is particularly advantageous in that a stable lyophilizate is obtained. If the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, succinic acid, succinic acid, fumaric acid, etc.
  • amino acids are arginine, lysine, histidine or ortin.
  • acidic amino acids such as glutamic acid and aspartic acid, and their salt forms (preferably sodium salts) or neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, parin, methionine, cysteine, or alanine, or Aromatic amino acids such as ferulalanin, tyrosine, tryptophan, or the derivative N-acetyl tryptophan can be used.
  • saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include dextran, gnolecose, fructose, ratatose, xylose, mannose, manolethose, sucrose, trehalose, and raffinose.
  • examples of the sugar alcohol include mannitol, sorbitol, inositol and the like.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannose, D-manntol, sodium chloride)
  • physiological saline, glucose and other adjuvants for example, D-sorbitol, D-mannose, D-manntol, sodium chloride
  • an isotonic solution containing The aqueous solution may be used in combination with an appropriate solubilizing agent (eg, alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50, etc.).
  • solubilizing agent eg, alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50, etc.
  • examples of the sulfur-containing reducing agent include N-acetyl cysteine, N-acetyl homocystine, thiotate, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycol.
  • examples thereof include acids and salts thereof, sodium thiosulfate, glutathione, and those having a sulfhydryl group such as thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms.
  • examples of the antioxidative agent include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyl-sol, -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L- Chelating agents such as ascorbyl palmitate, L-ascorbyl stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediammine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate Can be mentioned.
  • L- Chelating agents such as ascorbyl palmitate, L-ascorbyl stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediammine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate Can be mentioned.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, and poly (methacrylic acid)
  • colloid drug delivery systems ribosomes, albumin microspheres, microemulsions, nano Particle and nano force psenore etc.
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; U.S. Patent 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP ⁇ 133,988 ⁇ -) 0
  • the pharmaceutically acceptable carrier to be used is appropriately or in combination selected from the above depending on the dosage form, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a method of treating prostate cancer in a subject comprising administering an IL-6 inhibitor to the subject who has developed prostate cancer.
  • the “subject” refers to an organism to which the therapeutic agent for prostate cancer of the present invention is administered and a part of the organism.
  • Organisms include, but are not limited to, animals (eg, humans, domestic animal species, wild animals).
  • the “part of the organism” is not particularly limited, but is preferably The peripheral part of a gland or a prostate, or a metastatic site can be mentioned.
  • administering includes administering orally or parenterally.
  • Oral administration can include administration in the form of oral agents, and as oral agents, the dosage form such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions is selected. be able to.
  • Parenteral administration can include administration in the form of injections.
  • injections include intravenous injection such as infusion, subcutaneous injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection. Can do.
  • the effect of the method of the present invention can be achieved by introducing a gene containing an oligonucleotide to be administered into a living body using a gene therapy technique.
  • the agent of the present invention can be locally administered to an area where treatment is desired.
  • administration can be by local injection during surgery, use of a catheter, or targeted gene delivery of DNA encoding the peptides of the invention.
  • the agent of the present invention may be administered at the same time or after a known treatment for prostate cancer, for example, prostatectomy, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and the like.
  • a human prostate cancer cell line expresses IL-6 receptor was confirmed by Western plot analysis as described below.
  • PC3, DU145, and JCA-1 were used as human prostate cancer cell lines.
  • the above cell lines were cultured in RPMI 1640 medium (Invitrogen, Groningen, The Netherlands) with 10% urchin fetal serum (FBS) and streptomycin, ice-cooled, and phosphate-buffered saline (PBS). ) washed twice.
  • the obtained protein was transferred to a nitrocellulose membrane (BioRad Laboratories) using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nonspecific adsorption was suppressed with Tris-buffered saline containing 5% nonfat dry milk and reacted with a rabbit anti-human IL-6 receptor antibody (Santa Cruz Biotechnology) diluted 500-fold. Immunoreactive notes are protected by the amplified alkaline phosphatase systerm according to manufacture instructions (BioRad LaDoratones).
  • IL-6 was produced in a human prostate cancer cell line was confirmed by the method described below.
  • Example 1 the cell line described in Example 1 was cultured on a 24-well plate using the medium described in Example 1 for 4 hours at 5 xlO per well for 48 hours.
  • the concentration of -6 was measured by the ELI SA method.
  • hPMl humanized PM-1 antibody
  • DU145 cells (10 7 cells / body) were transplanted subcutaneously into SCID mice to create a subcutaneous tumor model. 5 days after tumor engraftment was confirmed, hPMl was administered (200 ⁇ g / body once every 3 days), and the tumor volume and mouse body weight were measured over time. The antitumor effect of was examined.
  • IL-6 inhibitor of the present invention is effective for the treatment of cachexia associated with prostate cancer.
  • the therapeutic agent for prostate cancer comprising the IL-6 inhibitor of the present invention as an active ingredient is an effective treatment alternative to hormonal therapy, and exhibits an effective therapeutic effect even for prostate cancer that has acquired resistance to hormonal therapy it is conceivable that.
  • the therapeutic agent for prostate cancer of the present invention is considered to also show the effect of suppressing recurrence of prostate cancer after surgery.
  • the therapeutic agent for prostate cancer of the present invention is also considered effective for the treatment of cachexia associated with prostate cancer.

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Abstract

　本発明者らは抗IL-6受容体抗体の前立腺癌に対する抗腫瘍効果について検討を行った。その結果、抗IL-6受容体抗体がin vivoおよびin vitroいずれにおいても前立腺癌に対する抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。またhPM1は、IL-6受容体を介して抗腫瘍効果を示すことも明らかとなった。

Description

明 細 書
前立腺癌治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、 IL-6阻害剤を有効成分として含有する前立腺癌治療剤、およびその利 用に関する。また、 IL-6阻害剤を、前立腺癌を発症した対象に投与する工程を含む 、前立腺癌を治療する方法に関する。
背景技術
[0002] 現在、前立腺癌の治療法としてはホルモン療法、外科療法、放射線療法、化学療 法、及びこれらの併用が用いられている。ホルモン療法は、前立腺癌の増殖に関係 するアンドロゲンの産生を抑える力、その作用を抑制することにより行われる。ホルモ ン療法は、男性ホルモンを産生する精巣の除去、下垂体に作用してアンドロゲンを低 下させる LH-RHアナログやエストロゲン製剤の投与、抗アンドロゲン剤の投与などに より行われる。進行前立腺癌の治療法としてはホルモン療法が唯一の治療法である 力、ホルモン療法を開始した多くの進行前立腺癌患者は数年後にはホルモン耐性を 獲得し、治療に苦慮しており、ホルモン療法に対し耐性を獲得した前立腺癌に対して 有効な治療法が望まれて 、る。
[0003] IL- 6は B細胞刺激因子 2(BSF2)あるいはインターフェロン β 2とも呼称されたサイト力 インである。 IL-6は、 Βリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（ 非特許文献 1)、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイト力インであ ることが明らかになった (非特許文献 2)。 IL-6は、 Τリンパ球系細胞の成熟化を誘導 することが報告されて 、る (非特許文献 3)。
[0004] IL-6は、細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、 I L-6が結合する分子量約 80kDのリガンド結合性蛋白質の IL-6受容体である (非特許 文献 4、 5)。 IL-6受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に 、主にその細胞外領域からなる可溶性 IL-6受容体としても存在する。
もう一つは、非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約 130kDの膜蛋白質 gpl30である。 IL-6と IL-6受容体は IL-6ZIL-6受容体複合体を形成し、次いで gpl30 と結合することにより、 IL-6の生物学的活性が細胞内に伝達される（非特許文献 6)。
[0005] IL-6阻害剤は、 IL-6の生物学的活性の伝達を阻害する物質である。これまでに、 IL -6に対する抗体 (抗 IL-6抗体)、 IL-6受容体に対する抗体 (抗 IL-6受容体抗体)、 gpl 30に対する抗体 (抗 gpl30抗体）、 IL-6改変体、 IL-6又は IL-6受容体部分ペプチド等 が知られている。
抗 IL- 6受容体抗体に関しては、いくつかの報告がある (非特許文献 7、 8、特許文 献 1〜3)。その一つであるマウス抗体 PM-1 (非特許文献 9)の相捕性決定領域 (CDR ； complementarity determining region )をヒト f几体へ移植することにより得られたヒトイ匕 PM-1抗体が知られて 、る（特許文献 4)。
最近の報告では、 IL-6は前立腺癌に autocrine又は paracrineに作用して腫瘍を増 殖させることが知られている (非特許文献 10)。また、進行前立腺癌患者の悪液質 (c achexia)において、腫瘍力も過剰に産生された IL-6がその主たる原因となっているこ とが示唆されている。
[0006] これまで、 in vitroの実験では、抗 IL-6抗体が一定の条件下でヒト前立腺癌細胞（L NCaP、 DU145、 PC3)の増殖を抑制したことが報告されている（非特許文献 10)。しか しながら、現在までのところ、 in vivoにおいて、 IL-6を特異的に阻害することにより前 立腺癌の増殖を抑制できるとの報告はない。 IL-6などのサイト力インが関与する疾患 では、あるサイト力インが他のサイト力インと複雑なネットワークを形成して 、ることはよ く知られており、また、複数のサイト力インが同一の細胞に同じような作用を示すこと が知られているため、 IL-6阻害剤が前立腺癌の治療に有効である力否かは不明であ つた o
[0007] なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
非特許文献 l : Hirano, T. et al, Nature (1986) 324, 73-76
非特許文献 2 :Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78
非特許文献 3 : Lotz, M. et al" J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258
非特許文献 4 : Taga, T. et al" J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
非特許文献 5 :Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828
非特許文献 6 : Taga, T. et al" Cell (1989) 58, 573—581 非特許文献 7 :Novick, D. et al, Hybridoma (1991) 10, 137-146
非特許文献 8 : Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630
非特許文献 9 : Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906
非特許文献 10 : Okamoto et al, Cancer Res. 57(1), 141-6, 1997
特許文献 1：国際特許出願公開番号 WO 95-09873
特許文献 2：フランス特許出願公開番号 FR 2694767
特許文献 3 :米国特許番号 US 5216128
特許文献 4:国際特許出願公開番号 WO 92-19759
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、 IL-6阻害剤を 有効成分として含有する前立腺癌治療剤を提供することにある。さらに本発明は、 IL -6阻害剤を、前立腺癌を発症した対象に投与する工程を含む、前立腺癌を治療す る方法の提供も課題とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、抗 IL-6受容体抗体の前立腺癌に対 する抗腫瘍効果につ!ヽて検討を行った。
まず、本発明者らはヒト前立腺癌細胞株 PC3、 DU145、および JCA-1において、 IL- 6受容体が発現して!/ヽるカゝ否かをウェスタンプロット解析により確認した。その結果、 上記 3つの細胞株においては IL-6受容体が発現していることが明ら力となった（図 1) 。また、上記細胞の培養上清中の IL-6を ELISAで測定することにより、これらの細胞が IL-6を産生して 、ることが明らカとなった（図 2)。
[0010] 次に、上記の細胞を各種濃度のヒトイ匕 PM-1抗体 (hPMl)の存在下に in vitroで培養 し、 24時間後ならびに 48時間後に抗腫瘍効果を検討したところ、 hPMlが濃度依存的 ならびに時間依存的に細胞増殖抑制効果を示すことが明らかとなった（図 3)。また、 hPMlが IL-6受容体を介して抗腫瘍効果を示すか否かを、 STAT3のリン酸ィ匕をウェス タンプロット解析によって比較することにより確認した。その結果、 hPMl投与 60分後 において前立腺癌細胞株の STAT3のリン酸ィ匕は抑制されていることが明ら力となった 。また、 hPMlは IL-6の刺激により増強される STAT3のリン酸ィ匕を抑制することが明ら 力となった（図 4)。
[0011] さらに、マウスを用いた皮下腫瘍担癌モデルにヒト化 PM-1抗体 (hPMl)を投与する ことにより、 in vivoにおける抗 IL-6受容体抗体の抗腫瘍効果を確認したところ、 hPMl を投与することにより腫瘍増殖と体重減少が有意に抑制されることが明らかとなった（ 図 5)。
即ち、本発明者らは、抗 IL-6受容体抗体を投与することにより、前立腺癌の増殖を 抑制することが可能であることを初めて見出し、これにより本発明を完成するに至った
[0012] 本発明は、より具体的には以下の〔1〕〜〔22〕を提供するものである。
〔1〕 IL-6阻害剤を有効成分として含有する、前立腺癌治療剤。
〔2〕 IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする〔1〕に記載の前立腺癌 治療剤。
〔3〕 IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔1〕に記載の前 立腺癌治療剤。
〔4〕抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔2〕または〔3〕に記載の前立腺 癌治療剤。
〔5〕抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔2〕 または〔3〕に記載の前立腺癌治療剤。
〔6〕抗体が組換え型抗体であることを特徴とする〔2〕または〔3〕に記載の前立腺癌 治療剤。
〔7〕抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする〔6〕に記載の 前立腺癌治療剤。
〔8〕前立腺癌がホルモン抵抗性前立腺癌である〔1〕から〔7〕の 、ずれかに記載の前 立腺癌治療剤。
〔9〕IL-6阻害剤を、前立腺癌を発症した対象に投与する工程を含む、対象において 前立腺癌を治療する方法。
〔10〕 IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする〔9〕に記載の方法。 〔l l〕IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔9〕に記載の 方法。
〔 12〕抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔 10〕または〔 11〕に記載の方 法。
〔 13〕抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔 10 〕または〔11〕に記載の方法。
〔14〕抗体が組換え型抗体であることを特徴とする〔10〕または〔11〕に記載の方法。 〔15〕抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする〔14〕に記 載の方法。
〔16〕前立腺癌治療剤を製造するための、 IL-6阻害剤の使用。
〔17〕 IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする〔16〕に記載の使用。 〔18〕 IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔16〕に記載 の使用。
〔19〕抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔 17〕または〔 18〕に記載の使 用。
〔20〕抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔17 〕または〔18〕に記載の使用。
〔21〕抗体が組換え型抗体であることを特徴とする〔17〕または〔18〕に記載の使用。 〔22〕抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする〔21〕に記 載の使用。
図面の簡単な説明
[図 1]ウェスタンブロット解析によりヒト前立腺癌細胞株 JCA-1、 PC3、および DU145に お!、て、 IL-6受容体が発現して 、ることを示す写真である。
[図 2]ヒト前立腺癌細胞株 JCA-1、 PC3、および DU145の培養上清の IL-6濃度が上昇 して！/、ることを示す図である。
[図 3]ヒト前立腺癌細胞株 JCA-1、 PC3、および DU145に対して、ヒト化 PM-1抗体 (hP Ml)が in vitroにおいて抗腫瘍効果を有することを示す図である。横軸の数値は hPM 1の濃度を示す。 [図 4]DU145細胞を IL-6で 60分間刺激したところ pSTAT3の発現が増強し、 hPMlを使 用することにより、その PSTAT3の発現増強が抑制されたことを示す写真である。
[図 5]SCIDマウスにヒト前立腺癌細胞株 DU145を移植した皮下腫瘍担癌マウスモデ ル〖こおける、ヒトイ匕 PM-1抗体 (hPMl)の in vivoにおける抗腫瘍効果を示す図である 。上図：ヒト化 PM-1抗体またはコントロール抗体 (IgG)を担癌マウスに投与した際の、 腫瘍サイズの経時変化を示す図である。下図：ヒトイ匕 PM-1抗体またはコントロール抗 体 (IgG)を担癌マウスに投与した際の、体重の経時変化を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明者らは、抗 IL-6受容体抗体を投与することにより、前立腺癌の増殖を抑制す ることが可能であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。 本発明は、 IL-6阻害剤を有効成分として含有する、前立腺癌治療剤に関する。 本発明において「IL-6阻害剤」とは、 IL-6によるシグナル伝達を遮断し、 IL-6の生物 学的活性を阻害する物質である。 IL-6阻害剤は、好ましくは IL-6、 IL-6受容体及び g pl30のいずれかの結合に対する阻害作用を有する物質である。
本発明の IL-6阻害剤としては、例えば抗 IL-6抗体、抗 IL-6受容体抗体、抗 gpl30抗 体、 IL-6改変体、可溶性 IL-6受容体改変体あるいは IL-6又は IL-6受容体の部分べ プチドおよび、これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられるが、特に限定され るものではない。本発明の IL-6阻害剤としては、好ましくは IL-6受容体を認識する抗 体を挙げることが出来る。
[0015] 本発明における抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動 物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。
本発明で使用される抗 IL-6抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノク ローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗 IL-6抗体として、特に哺 乳動物由来のモノクローナル抗体が好まし 、。哺乳動物由来のモノクローナル抗体 としては、ハイプリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺 伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体は I L-6と結合することにより、 IL-6の IL-6受容体への結合を阻害して IL-6の生物学的活 性の細胞内への伝達を遮断する。 このような抗体としては、 MH166(Matsuda, T. et al" Eur. J. Immunol. (1988) 18, 95 1-956)や SK2抗体 (Sato, K. et al, 第 21回 日本免疫学会総会、学術記録 (1991)21 , 166)等が挙げられる。
[0016] 抗 IL-6抗体産生ハイプリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにし て作製できる。すなわち、 IL-6を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に したがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と 融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリー ユングすることによって作製できる。
具体的には、抗 IL-6抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得 の感作抗原として使用されるヒ HL- 6は、 Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550、 J. Im munol.(1988)140, 1534-1541、あるいは Agr. Biol. Chem.(1990)54, 2685- 2688に開 示された IL-6遺伝子 Zアミノ酸配列を用いることによって得られる。
[0017] IL-6の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転 換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の IL-6蛋白質を公知の方 法で精製し、この精製 IL-6蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、 IL-6蛋白質 と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよ!、。
[0018] 本発明で使用される抗 IL-6受容体抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又 はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗 IL-6受容体抗 体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノ クローナル抗体としては、ハイプリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手 法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがあ る。この抗体は IL-6受容体と結合することにより、 IL-6の IL-6受容体への結合を阻害 して IL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、 MR16- 1抗体（Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. US A (1993) 90, 11924—11928)、 PM— 1抗体 (Hirata, Y. et al" J. Immunol. (1989) 143, 2 900-2906)、 AUK12-20抗体、 AUK64-7抗体あるいは AUK146-15抗体（国際特許出 願公開番号 WO 92-19759)などが挙げられる。これらのうちで、ヒ HL-6受容体に対す る好まし!/、モノクローナル抗体としては PM-1抗体が例示され、またマウス IL-6受容体 に対する好ましいモノクローナル抗体としては MR16-1抗体が挙げられる。
[0019] 抗 IL-6受容体モノクローナル抗体産生ノ、イブリドーマは、基本的には公知技術を 使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、 IL-6受容体を感作抗原として使用し て、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融 合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナ ルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、抗 IL-6受容体抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗 体取得の感作抗原として使用されるヒ HL-6受容体は、欧州特許出願公開番号 EP 3 25474に、マウス IL-6受容体は日本特許出願公開番号特開平 3-155795に開示され た IL-6受容体遺伝子 Zアミノ酸配列を用いることによって得られる。
[0020] IL-6受容体蛋白質は、細胞膜上に発現しているものと細胞膜より離脱しているもの
(可溶性 IL- 6受容体） (Yasukawa, K. et al.， J. Biochem. (1990) 108, 673- 676)との二 種類がある。可溶性 IL-6受容体は細胞膜に結合して 、る IL-6受容体の実質的に細 胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領 域が欠損している点で膜結合型 IL-6受容体と異なっている。 IL-6受容体蛋白質は、 本発明で用いられる抗 IL-6受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、 V、ずれの IL-6受容体を使用してもょ 、。
IL-6受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を 形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の IL-6受容体蛋白 質を公知の方法で精製し、この精製 IL-6受容体蛋白質を感作抗原として用いればよ い。また、 IL-6受容体を発現している細胞や IL-6受容体蛋白質と他の蛋白質との融 合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
[0021] 本発明で使用される抗 gpl30抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノ クローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗 gP130抗体として、特 に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好まし 、。哺乳動物由来のモノクローナル 抗体としては、ハイプリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗 体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗 体は gpl30と結合することにより、 IL-6ZIL-6受容体複合体の gpl30への結合を阻害 して IL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、 \164抗体（特開平3-219894)、4811抗体ぉょび21"[4抗体（ US 5571513) B-S12抗体および B-P8抗体（特開平 8-291199)などが挙げられる。
[0022] 抗 gpl30モノクローナル抗体産生ノ、イブリドーマは、基本的には公知技術を使用し 、以下のようにして作製できる。すなわち、 gpl30を感作抗原として使用して、これを通 常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって 公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生 細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、 抗体取得の感作抗原として使用される gpl30は、欧州特許出願公開番号 EP 411946 に開示された gpl30遺伝子 Zアミノ酸配列を用いることによって得られる。
gpl30の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転 換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の gpl30蛋白質を公知の方 法で精製し、この精製 gpl30蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、 gpl30を発 現している細胞や gpl30蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用い てもよい。
[0023] 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融 合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的にはげつ 歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一 般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行 われる。具体的には、感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline )や生理食塩水等 で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント 完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に 4-21日毎に数回投与するのが 好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳 動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい 免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。 [0024] 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、 すでに、公知の種々の細胞株、例えば、 P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. J. Imm unol. (1979) 123, 1548- 1550)、 P3X63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7) 、 NS- 1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (19 76) 6, 511-519 )、 MPC-11 (Margulies. D. H. et al" Cell (1976) 8, 405-415 )、 SP2/ 0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269—270 )、 FO (de St. Groth, S. F. et al ., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1—21 )、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (197 8) 148, 313- 323)、 R210 (Galfre, G. et al" Nature (1979) 277, 131-133 )等が適宜 使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミ ルシユタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C. 、 Methods Enzymol. (1981) 73, 3 -46)等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール (PEG )、センダイウィルス (HVJ)等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジ メチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
[0025] 免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫 細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば 、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI1640培養液、 MEM培養液、その他、こ の種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。
[0026] 細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混 合し、予め、 37°C程度に加温した PEG溶液、例えば、平均分子量 1000〜6000程度の PEG溶液を通常、 30〜60% (w/v)の濃度で添加し、混合することによって目的とする 融合細胞 (ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心 して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましくない細 胞融合剤等を除去できる。
[0027] 当該ハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば、 HAT培養液 (ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選択される。当該 H AT培養液での培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞 (非融合細胞）が死滅 するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を 実施し、目的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングおよびクローニン グが行われる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球 を in vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作 Bリンパ球をヒトミエ ローマ細胞、例えば U266と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性 を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平ト 59878参照)。さらに、ヒト抗体遺 伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与 し、前述の方法に従!ヽ所望のヒト抗体を取得してもよ!、（国際特許出願公開番号 WO 93/12227、 WO 92/03918、 WO 94/02602、 WO 94/25585、 WO 96/34096、 WO 96/ 33735参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマは、通常の 培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが 可能である。
当該ノ、イブリドーマ力もモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイプリドーマを 通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイプリドー マをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法など が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方 法は、抗体の大量生産に適している。
例えば、抗 IL-6受容体抗体産生ハイブリドーマの作製は、特開平 3-139293に開示 された方法により行うことができる。 PM-1抗体産生ハイブリドーマを BALB/cマウスの 腹腔内に注入して腹水を得、この腹水から PM-1抗体を精製する方法や、本ハイプリ ドーマを適当な培地、例えば、 10%ゥシ胎児血清、 5%BM-Condimed HI (Boehringe r Mannheim製）含有 RPMI1640培地、ハイプリドーマ SFM培地（GIBCO- BRL製）、 PF ΗΜ-Π培地 (GIBCO-BRL製)等で培養し、その培養上清から PM-1抗体を精製する 方法で行うことができる。 [0029] 本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をノヽイブリドーマ力 クロー- ングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用 いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、 Borrebaeck C. A. K. an d Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the U nited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイプリドーマから、抗体の 可変（V)領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば 、グァ-ジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ) 、 AGPC法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156- 159)等により全 R NAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用して mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製）を用いることにより mRNAを直 接調製することができる。
[0030] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの 合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行 うことができる。また、 cDNAの合成および増幅を行うには 5'-Ampli FINDER RACE Ki t (Clontech製）および PCRを用いた 5'- RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al" Nucleic Acids Res.(1989)l 7, 2919-2932)を使用することができる。得られた PCR産物から目的とする DNA断片を 精製し、ベクター DNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌 等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、例えば、デォキシ法により確認する。
目的とする抗体の V領域をコードする DNAが得られれば、これを所望の抗体定常領 域 (C領域)をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体 の V領域をコードする DNAを、抗体 C領域の DNAを含む発現ベクターへ組み込んで ちょい。
[0031] 本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領 域、例えば、ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに 組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる ことができる。
[0032] 本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改 変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ (Chimeric)抗体、ヒトイ匕 (Humanized)抗 体、ヒト (human)抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造 することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領域 をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させ ることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 125023、国際特許出願公開番号 W 0 92-19759参照)。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ること ができる。
[0033] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の 哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域 (CDR)をヒト抗体の相補性決定領域 へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出 願公開番号 EP 125023、国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照)。
具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（FR; framework reg ion)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有す るように作製した数個のオリゴヌクレオチド力も PCR法により合成する。得られた DNA をヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これ を宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 239400、 国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照)。
[0034] CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位 を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適 切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のァミノ 酸を置換してもよい（Sato, K.et al.， Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。
[0035] キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体 C領域が使用される。ヒト抗体 C領域としては、 C yが挙げられ、例えば、 C γ 1、 C γ 2、 C γ 3又は C y 4を使用することができる。また 、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を修飾してもよい。 キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の C領域から なり、またヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由 来のフレームワーク領域および C領域力 なり、両者はヒト体内における抗原性が低 下して 、るため、本発明に使用される抗体として有用である。
本発明に使用されるヒト化抗体の好ましい具体例としては、ヒトイ匕 PM-1抗体が挙げ られる（国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照)。
[0036] また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用 いて、パンユングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可 変領域を一本鎖抗体 (scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発 現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝 子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定 することができる。抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を 含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は 既に周知であり、 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
[0037] 前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させることができる。哺 乳類細胞を用いた場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させた DNAあるいはそれを含むベクタ 一により発現させることができる。例えばプロモーター Zェンハンサ一としては、ヒトサ イトメガロウイノレス前期プロモーター Zェンノヽンサ一 (human cytomegalovirus immedia te early promoter/ enhancer) 举げ こと力できる。
[0038] また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター Zェンノヽン サ一として、レトロウイルス、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、シミアンウィルス 40 (S V40)等のウイノレスプロモーター Zェンハンサーゃヒトェロンゲーシヨンファクター 1 α ( HEFl a )などの哺乳類細胞由来のプロモーター Ζェンハンサーを用いればよい。 例えば、 SV40プロモーター Zェンハンサーを使用する場合、 Mulliganらの方法（Mu lligan, R. C. et al.， Nature (1979) 277, 108-114)、また、 HEF1 αプロモーター/ェ ンハンサーを使用する場合、 Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucl eic Acids Res. (1990) 18, 5322 )に従えば容易に実施することができる。 [0039] 大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列 、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロ モーターとしては、 lacZプロモーター、 &8プロモーターを挙げることができる。 lacZプ 口モーターを使用する場合、 Wardらの方法（Ward, E. S. et al.， Nature (1989) 341, 5 44-546 ; Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427 )、 araBプロモーターを使 用する場合、 Betterらの方法（Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 )に 従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合 、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379- 4383)を使用す ればよい。ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォ 一ルド (refold)して使用する（例えば、 WO96/30394を参照）。
複製起源としては、 SV40、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウイ ルス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー 数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフ エラーゼ (APH)遺伝子、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝 子等を含むことができる。
[0040] 本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。
抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの産生 系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる 真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系が ある。動物細胞としては、（1)哺乳類細胞、例えば、 CHO、 COS,ミエローマ、 BHK(bab y hamster kidney), HeLa、 Veroなど、（2)両生類細胞、例えば、アフリカッメガエル卵 母細胞、あるいは (3)昆虫細胞、例えば、 s!9、 s!21、 Tn5などが知られている。植物細 胞としては、ニコチアナ 'タパクム (Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、こ れをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Sacch aromyces)鳥、 f列 ばサッカロミセス'セレビシェ (Saccharomvces cerevisiaeリ、糸状菌 、例えばァスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばァスペルギルス' -ガー（Aspergill us niger)などが知られている。
[0041] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大 腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された 細胞を in vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う 。例えば、培養液として、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDMを使用することができ、牛 胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した 細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、 in vivoにて抗体を産生してもよい。
[0042] 一方、 in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系 が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。 哺乳類動物としては、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシなどを用いることができる (Vic ki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、昆虫としては、カイ コを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。 これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産 生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をャギ j8カゼインのような乳汁中に固有に産 生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚 を雌のャギへ導入する。胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はそ の子孫が産生する乳汁力 所望の抗体を得る。トランスジエニックャギカ 産生される 所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャ ギに使用してもよい。 (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702；)。
[0043] また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコ に感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594) oさらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用べク ター、例えば pMON530に挿入し、このベクターを Agrobacterium tumefaciensのような バクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば Nicotiana tabacumに感染させ 、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994 )24, 131—138)。
[0044] 上述のように in vitro又は in vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H 鎖)又は軽鎖 (L鎖）をコードする DNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同 時形質転換させてもよいし、あるいは H鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現 ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号 WO 94-11523参照）。
[0045] 本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片や その修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、 Fab、 F(ab')2、 Fv又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv (scFv)が挙げられる。 具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成さ せるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに 導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、 Co, M.S. et al, J. Immunol. (19 94) 152, 2968-2976、 Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 17 8, 476-496、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497- 515、 Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663、 Rousseaux, J. et al ., Methods in Enzymology (1989) 121, 663—66、 Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137参照）。
[0046] scFvは、抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域を連結することにより得られる。この scFvにお いて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域はリンカ一、好ましくは、ペプチドリンカ一を介して連結 される（Huston, J. S. et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879—5883)。 s cFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、上記抗体として記載されたものの 、ずれ の由来であってもよい。 V領域を連結するペプチドリンカ一としては、例えばアミノ酸 1 2-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
scFvをコードする DNAは、前記抗体の H鎖又は、 H鎖 V領域をコードする DNA、およ び L鎖又は、 L鎖 V領域をコードする DNAを铸型とし、それらの配列のうちの所望のァ ミノ酸配列をコードする DNA部分を、その両端を規定するプライマー対を用いて PCR 法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカ一部分をコードする DNAおよびその両 端を各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅するこ とにより得られる。
また、ー且 scFvをコードする DNAが作製されれば、それらを含有する発現ベクター 、および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、 また、その宿主を用いて常法に従って、 scFvを得ることができる。
[0047] これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により 産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。 抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合した抗体を 使用することもできる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。こ のような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得 ることができる。これらの方法はこの分野にぉ 、てすでに確立されて 、る。
[0048] 前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製 することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はァフィユティークロマトグ ラフィ一により行うことができる。ァフィユティークロマトグラフィーに用いるカラムとして は、例えば、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙げられる。プロテイン Aカラム に用いる担体として、例えば、 HyperD、 POROS、 SepharoseF.F.等が挙げられる。そ の他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限 定されるものではない。
例えば、上記ァフィ二ティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター 、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体 を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマ トグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトダラ フィ ~~は HPLし (High performance liquid chromatography)に適用しネ守る。ま 7こ、；ι ^ネ目 HPLC (reverse phase HPLC)を用いてもよ!ヽ。
[0049] 上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は ELISA等により行うことができ る。すなわち、吸光度の測定による場合には、 PBS (-)で適当に希釈した後、 280nmの 吸光度を測定し、 lmg/mlを 1.350Dとして算出する。また、 ELISAによる場合は以下の ように測定することができる。すなわち、 0.1M重炭酸緩衝液 (pH9.6)で 1 g/mlに希 釈したャギ抗ヒ HgG(TAG製） 100 μ 1を 96穴プレート（Nunc製）にカロえ、 4°Cでー晚イン キュベーシヨンし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使 用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒ HgG (CAPPEL製) 100 μ 1を添カ卩し、室温にて 1時間インキュベーションする。
洗浄後、 5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒ HgG (BIO SOURCE製） 100 /z lをカ卩え、室温にて 1時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液をカ卩ぇインキュ ベーシヨンの後、 MICROPLATE READER Model 3550 (Bio- Rad製）を用いて 405nm での吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
[0050] 本発明で使用される IL-6改変体は、 IL-6受容体との結合活性を有し、且つ IL-6の 生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、 IL-6改変体は IL-6受容体に対し IL-6 と競合的に結合する力 IL-6の生物学的活性を伝達しないため、 IL-6によるシグナ ル伝達を遮断する。
IL-6改変体は、 IL-6のアミノ酸配列のアミノ酸残基を置換することにより変異を導入 して作製される。 IL-6改変体のもととなる IL-6はその由来を問わないが、抗原性等を 考慮すれば、好ましくはヒト IL-6である。
具体的には、 IL-6のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、 W HATIF (Vriend et al.， J. Mol. Graphics (1990) 8, 52- 56 )を用いてその二次構造を 予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行わ れる。適切な置換アミノ酸残基を決定した後、ヒ HL-6遺伝子をコードする塩基配列を 含むベクターを铸型として、通常行われる PCR法によりアミノ酸が置換されるように変 異を導入することにより、 IL-6改変体をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応 じて適当な発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方 法に準じて IL-6改変体を得ることができる。
IL-6改変体の具体例としては、 Brakenhoff et al.， J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93 、及び Savino et al, EMBO J. (1994) 13, 1357-1367、 WO 96-18648、 W096- 1786 9に開示されている。
[0051] 本発明で使用される IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは、各々 IL-6 受容体あるいは IL-6との結合活性を有し、且つ IL-6の生物学的活性を伝達しな 、物 質である。即ち、 IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは IL-6受容体又は I L-6に結合し、これらを捕捉することにより IL-6の IL-6受容体への結合を特異的に阻 害する。その結果、 IL-6の生物学的活性を伝達しないため、 IL-6によるシグナル伝達 を遮断する。
IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは、 IL-6又は IL-6受容体のアミノ 酸配列において IL-6と IL-6受容体との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸 配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、通常 10〜80、好ましくは 20〜5 0、より好ましくは 20〜40個のアミノ酸残基からなる。
[0052] IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは、 IL-6又は IL-6受容体のアミノ 酸配列において、 IL-6と IL-6受容体との結合に係わる領域を特定し、その特定した 領域の一部又は全部のアミノ酸配列に基づ 、て通常知られる方法、例えば遺伝子 工学的手法又はペプチド合成法により作製することができる。
IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドを遺伝子工学的手法により作製す るには、所望のペプチドをコードする DNA配列を発現ベクターに組み込み、前記組 換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じて得ることができる。
IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドをペプチド合成法により作製する には、ペプチド合成において通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相 合成法を用いることができる。
具体的には、続医薬品の開発第 14卷ペプチド合成 監修矢島治明廣川書店 1991 年に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法としては、例えば有機溶媒に不溶 性である支持体に合成しょうとするペプチドの C末端に対応するアミノ酸を結合させ、 α -アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸を C末端カゝら N末端 方向の順番に 1アミノ酸ずつ縮合させる反応と榭脂上に結合したアミノ酸又はぺプチ ドの α -アミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、ペプチド 鎖を伸長させる方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種 類により Boc法と Fmoc法に大別される。
[0053] このようにして目的とするペプチドを合成した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支 持体からの切断反応をする。ペプチド鎖との切断反応には、 Boc法ではフッ化水素又 はトリフルォロメタンスルホン酸を、又 Fmoc法では TFAを通常用いることができる。 Boc 法では、例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド榭脂をァ-ソール存在下で処理す る。次いで、保護基の脱離と支持体力 の切断をしペプチドを回収する。これを凍結 乾燥することにより、粗ペプチドが得られる。一方、 Fmoc法では、例えば TFA中で上 記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応を行うことが できる。
得られた粗ペプチドは、 HPLCに適用することにより分離、精製することができる。そ の溶出にあたり、蛋白質の精製に通常用いられる水-ァセトニトリル系溶媒を使用して 最適条件下で行えばょ 、。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当 する画分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製したペプチド画分につ いて、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解 析等により同定する。
[0054] IL-6部分ペプチド及び IL-6受容体部分ペプチドの具体例は、特開平 2-188600、特 開平 7-324097、特開平 8-311098及び米国特許公報 US5210075に開示されている。 本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール (PEG)、放射性物質、トキシン等 の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよ 、。このようなコンジュゲート抗体は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修 飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれ らのコンジュゲート抗体も包含される。
[0055] 本発明の前立腺癌治療剤は、前立腺癌の治療において使用することが可能である 。本発明において、前立腺癌とは前立腺の腺細胞ががん化することを示す。
本発明において「前立腺癌治療」とは、前立腺癌の増殖の抑制、または他部位へ の転移の抑制または予防、あるいは前立腺癌の進行に伴う悪液質などを抑制するこ とを意味する。外科手術後の前立腺癌再発を抑制することも、上記の意味に含まれ るちのとする。
[0056] 本発明にお 、て、前立腺癌の増殖が抑制された力否かの確認は、前立腺の形状 および状態の確認 (直腸診）、画像診断による原発巣や転移巣の評価または PSA (前 立腺特異抗原)の値を測定 (PSA検査)することにより行うことが出来る。前立腺癌が進 行すると PSA値が上昇することが知られている。すなわち、本発明の薬剤を投与する ことにより PSA値が減少した場合に、前立腺癌の増殖が抑制されたとみなすことが出 来る。
また、前立腺癌の増殖が抑制されたカゝ否かの確認は、画像診断等により前立腺癌 の原発巣や転移巣の大きさ（あるいは体積)を評価することによつても行うことが出来 る。本発明の薬剤を投与することにより、前立腺癌の体積が減少している場合に、前 立腺癌の増殖が抑制されたとみなすことが出来る。前立腺癌の体積の測定は公知の 方法により行うことができ、実施例に記載の方法によっても行うことができる。
[0057] また、前立腺癌の増殖が抑制された力否かの確認は、前立腺力も組織サンプルを 採取し病理組織学的検査 (生検)をすることによつても行うことが出来る。前立腺癌の 悪性度を示すのに最もよく用いられるの力 グリーソンスコアによる分類である。生検 で採取した組織の病理組織学的検査の結果から、 2〜10のスコアで癌を分類し、数 字が大きいほど悪性度が高ぐ癌が転移する確率も高くなる。一般に前立腺内の狭 い範囲にとどまつていて、グリーソンスコアが 5以下と悪性度が低い癌では、予後は良 好とされ、この傾向は患者の年齢に左右されない。対照的に、グリーソンスコアが 7以 上の癌では、予後が不良と考えられている。すなわち、本発明の薬剤を投与すること によりグリーソンスコアが減少した場合に、前立腺癌の増殖が抑制されたとみなすこと が出来る。
[0058] また、前立腺癌が進行するに伴い体重減少や貧血などの悪液質を呈し全身状態 が悪化するが、本発明の薬剤を投与することによりこれら全身状態の改善が得られた 場合には、前立腺癌患者に対して有用であると見なすことができる。
[0059] 本発明で使用される IL-6阻害剤の IL-6シグナル伝達阻害活性は、通常用いられる 方法により評価することができる。具体的には、 IL-6依存性ヒト骨髄腫株 (S6B45,KPM M2)、ヒトレンネルト Tリンパ腫細胞株 KT3、あるいは IL-6依存性細胞 MH60.BSF2を培 養し、これに IL-6を添加し、同時に IL-6阻害剤を共存させることにより IL-6依存性細 胞の 3H-チミジン取込みを測定すればよい。また、 IL-6受容体発現細胞である U266 を培養し、 1251標識 IL-6を添カ卩し、同時に IL-6阻害剤を加えることにより、 IL-6受容 体発現細胞に結合した 1251標識 IL-6を測定する。上記アツセィ系において、 IL-6阻 害剤を存在させる群に加え IL-6阻害剤を含まな 、陰性コントロール群をおき、両者で 得られた結果を比較すれば IL-6阻害剤の IL-6阻害活性を評価することができる。ま た、前立腺癌細胞株における IL-6阻害剤の IL-6シグナル伝達阻害活性は、 IL-6受 容体のシグナル伝達の下流にある STAT3のリン酸ィ匕を測定することによつても評価す ることができる。 IL-6阻害剤を添加することにより STAT3のリン酸ィ匕が抑制された場合 に、 IL-6阻害剤は IL-6シグナル伝達を阻害し、かつ前立腺癌の増殖を抑制するもの であるとみなすことが出来る。 STAT3のリン酸ィ匕の測定は公知の方法により行うことが でき、実施例に記載の方法によっても行うことができる。
[0060] 後述の実施例に示されるように、抗 IL-6受容体抗体の投与により、前立腺癌の増殖 が抑制されることが認められたことから、抗 IL-6受容体抗体等の IL-6阻害剤は前立 腺癌治療剤として有用であることが示唆された。
[0061] 本発明の前立腺癌治療剤が投与される対象は哺乳動物である。哺乳動物は、好ま しくはヒトである。
本発明の前立腺癌治療剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的 または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの 静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤など を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができ る。有効投与量は、一回につき体重 lkgあたり O.Olmgから lOOmgの範囲で選ばれる。 あるいは、患者あたり l〜1000mg、好ましくは 5〜50mgの投与量を選ぶことができる。 好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗 IL-6受容体抗体の場合には、血中にフリ 一の抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重 lkg あたり 1ヶ月（4週間）に 0.5mgから 40mg、好ましくは lmgから 20mgを 1回力も数回に分 けて、例えば 2回 Z週、 1回 Z週、 1回 Z2週、 1回 Z4週などの投与スケジュールで 点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与ス ケジュールは、投与後状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら 2回 Z週 あるいは 1回 Z週から 1回 Z2週、 1回 Z3週、 1回 Z4週のように投与間隔を延ばして いくなど調整することも可能である。
[0062] 本発明において前立腺癌治療剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担 体が添加されていてもよい。製剤上許容しうる担体とは、それ自体は上記の前立腺癌 の増殖抑制効果を有する材料であってもよ 、し、当該抑制効果を有さな 、材料であ つてもよく、上記の抑制剤とともに投与可能な材料を意味する。また、前立腺癌の増 殖抑制効果を有さない材料であっても、 IL-6阻害剤と併用することによって相乗的も しくは相加的な安定ィ匕効果を有する材料であってもよ 、。
製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、 緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤 (EDTA等)、結合剤等を挙げることができる 本発明にお 、て、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例 えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート 等のソルビタン脂肪酸エステル;グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート 、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステア レート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン 脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソ ルビタンモノォレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシェ チレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリ ォキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸ェ ステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビット テトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシェチレ ングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエ チレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキ シエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシェ チレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロ ピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキ シエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフエ二 ルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル；ポリオキシエチレンヒ マシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリ ォキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシェ チレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導 体;ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等の H LB6〜18を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
[0064] また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル 硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ォレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数 10〜 18のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム 等の、エチレンォキシドの平均付加モル数が 2〜4でアルキル基の炭素原子数が 10 〜 18であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エス テルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が 8〜18のアルキルスルホコハク酸ェ ステル塩;天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセ口リン脂質;スフインゴミエリ ン等のスフインゴリン脂質;炭素原子数 12〜18の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等 を典型的例として挙げることができる。
[0065] 本発明の抑制剤には、これらの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合わせて 添加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルべ ート 20, 40, 60又は 80などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、 ポリソノレべート 20及び 80力特に好ましい。また、ポロキサマー（プル口ニック F— 68 ( 登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好 ましい。
界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なる力 ポリソルベート 20又はポリソルベート 80の場合では、一般には 0. 001〜100mgZmLであり、好ま しくは 0. 003〜50mg/mLであり、さらに好ましくは 0. 005〜2mg/mLである。
[0066] 本発明にお 、て緩衝剤としては、リン酸、クェン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸 、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、ダルコン酸、力プリル酸、デォキシコール酸、サリチ ル酸、トリエタノールァミン、フマル酸等 他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリ ス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製 してもよい。緩衝液の濃度は一般には l〜500mMであり、好ましくは 5〜100mMで あり、さらに好ましくは 10〜20mMである。
また、本発明の抑制剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラ チンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、 糖アルコールを含んで 、てもよ 、。
[0067] 本発明にお 、てアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒス チジン、オル-チン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩 (好ましくは、塩酸塩、リン酸 塩の形、すなわちリン酸アミノ酸)を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場 合、好ましい pH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩 酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添カ卩により調整される。この場合、リン 酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が 有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クェン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有し ない場合あるいは対応する陰イオン (リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クェン酸イオン、 コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましい アミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオル-チンである。さらに、酸性アミ ノ酸、例えばグルタミン酸及びァスパラギン酸、及びその塩の形 (好ましくはナトリウム 塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン 、パリン、メチォニン、システィン、またはァラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフ ェ-ルァラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体の N-ァセチルトリプトファンを 使用することちできる。
[0068] 本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン 、グノレコース、フラクトース、ラタトース、キシロース、マンノース、マノレトース、スクロー ス，トレハロース、ラフイノース等を挙げることができる。
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマン-トール、ソルビトール、イノシ トール等を挙げることができる。
[0069] 本発明の薬剤を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖や その他の補助薬（例えば、 D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-トール、塩化ナト リウム)を含む等張液と混合することができる。また該水溶液は適当な溶解補助剤 (例 えばアルコール (エタノール等)、ポリアルコール (プロピレングリコール、 PEG等)、非ィ オン性界面活性剤 (ポリソルベート 80、 HCO- 50)等）と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、 pH調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸ィ匕 防止剤等を含有してもよい。
[0070] 本発明において、含硫還元剤としては、例えば、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセ チルホモシスティン、チォタト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリ セロール、チォソルビトール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリウム、グ ルタチオン、並びに炭素原子数 1〜7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有す るもの等を挙げることができる。
[0071] また、本発明にお 、て酸ィ匕防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒド ロキシトルエン、ブチルヒドロキシァ-ソール、 —トコフエロール、酢酸トコフエロール 、 L—ァスコルビン酸及びその塩、 L—ァスコルビン酸パルミテート、 L—ァスコルビン 酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリァミル、没食 子酸プロピルあるいはエチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（EDTA)、ピロリン酸ナトリ ゥム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
[0072] また、必要に応じ、マイクロカプセル (ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ^ チルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシス テム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ粒子及びナノ力 プセノレ等)とすることもできる ( Remington s Pharmaceutical Science 1り edition , Osl o Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明 に適用し得る (Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167—277; Langer, Chem . Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第 3,773,919号;欧州特許出願公開 (EP)第 58,481 号； Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP^133,988^-)0
[0073] 使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合 せて選択されるが、これらに限定されるものではな 、。
本発明は、 IL-6阻害剤を、前立腺癌を発症した対象に投与する工程を含む、対象 において前立腺癌を治療する方法に関する。
本発明において、「対象」とは、本発明の前立腺癌治療剤を投与する生物体、該生 物体の体内の一部分をいう。生物体は、特に限定されるものではないが、動物（例え ば、ヒト、家畜動物種、野生動物）を含む。
また、「生物体の体内の一部分」については特に限定されないが、好ましくは前立 腺または前立腺の周辺部位あるいは転移部位を挙げることが出来る。
[0074] 本発明において、「投与する」とは、経口的、あるいは非経口的に投与することが含 まれる。経口的な投与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤 としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型 を選択することができる。
非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤とし ては、点滴などの静脈注射、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を 挙げることができる。また、投与すべきオリゴヌクレオチドを含む遺伝子を遺伝子治療 の手法を用いて生体に導入することにより、本発明の方法の効果を達成することがで きる。また、本発明の薬剤を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。 例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用、または本発明のペプチドをコード する DNAの標的化遺伝子送達により投与することも可能である。前立腺癌の公知の 治療法、例えば、前立腺摘除術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法等と同時に 又は時間を隔てて本発明の薬剤が投与されてもよい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0075] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
〔実施例 1〕ヒト前立腺癌細胞株における IL-6受容体の発現確認
ヒト前立腺癌細胞株が、 IL-6受容体を発現しているかを、以下に記載の通りウェス タンプロット解析により確認した。ヒト前立腺癌細胞株として PC3、 DU145、 JCA-1を用 いた。
上記の細胞株を RPMI 1640培地（Invitrogen, Groningen, The Netherlands)に 10% のゥシ胎仔血清 (FBS)とストレプトマイシンを加えた培地で培養後、氷冷し、リン酸緩 衝生理食塩水（PBS)を用い 2回洗浄した。 細胞を回収後、 200 μ 1の RIPAバッファ 一 (20 mM tris HC1, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mMエチレンジァミン四酢酸， 1% NP- 4 0, 1% Naデォキシコール酸塩， 0.1%ドデシル硫酸ナトリウム [SDS], 50mM NaF, ImMォ ルトバナジウム酸ナトリウム， 1 mMフエ-ルメチルスルフォ-ルフッ化物， 10 μ g/mlァ プロチュン、および 10 g/mlロイぺプチン)を用いて溶解した。上清中のタンパク濃 度は manufacture instructions ( BioRad Laboratories, Hercules し alifornia)によ the d ye binding methodによって測定した。得られたタンパクは SDS-ポリアクリルアミドゲル 電気泳動を用いて、ニトロセルロース膜 (BioRad Laboratories)に転写した。非特異吸 着を、 5%脱脂粉乳を含むトリス緩衝生理食塩水を用いて抑制し、 500倍に希釈したゥ サギ抗ヒト IL-6受容体抗体（Santa Cruz Biotechnology)と反応させた。免疫反応性 ノ ントは manufacture instructions (BioRad LaDoratones)による the amplified alkaline phosphatase systermによってネ守に。
その結果、ヒト前立腺癌細胞である JCA-1、 PC3、 DU145において IL-6受容体が 発現して!/、ることが明ら力となった（図 1)。
[0076] 〔実施例 2〕ヒト前立腺癌細胞株における IL-6の産生の確認
ヒト前立腺癌細胞株にぉ 、て IL-6が産生されて 、る力否かを以下に記載の方法に より確認した。
具体的には、 24ゥエルプレートに、実施例 1に記載の細胞株を、実施例 1に記載 の培地を用いて、 1ゥエルあたり 5 xlO4個、 48時間培養し、上清中の IL-6の濃度を ELI SA法により測定した。
その結果、ヒト前立腺癌細胞である JCA-1、 PC3、 DU145において、 IL-6が産生さ れていることが明ら力となった（図 2)。
[0077] 〔実施例 3〕 hPMlの in vitroにおける抗腫瘍効果の確認
hPMlが、 in vitroにおいて抗腫瘍効果を持つ力否かを、以下に記載の方法により 確認した。
実施例 1に記載の細胞株を 5%のゥシ胎仔血清 (FBS)とストレプトマイシンを加えた RPMI1640培地（Invitrogen, Groningen, The Netherlands)で 96ゥエルプレートを用い て、 1ゥエルあたり 5 xlO3個で 24時間培養した後、ヒト化 PM-1抗体（hPMl)を 30, 100, 300 1/mlの濃度で投与した。その 24時間後、 48時間後の抗腫瘍効果を、 MTTアツ セィによって検討した。 hPMl (Hirata T et al, Leuk Res. 2003; 27(4):343- 9、 Sato K et al., Cancer Res. 1993; 53(4):851- 6)は中外製薬株式会社から提供を受けた。 その結果、 hPMlが濃度依存的ならびに時間依存的に細胞増殖抑制効果を示すこ とが明らかとなった（図 3)。
[0078] 〔実施例 4〕hPMlの in vitroにおける IL-6受容体を介する効果の確認
hPMlの効果が IL-6受容体を介する力否かを、以下に記載の方法で確認した。 IL-6受容体のシグナル伝達の下流にある STAT3に着目した。 DU145を上記の培 地で 24時間培養後、 100 8/½1の1^\11を投与した。その 60分後の STAT3のリン酸化 を上述のウェスタンプロット解析によって、コントロールと比較した。次に 24時間培養 後の細胞を 100 μ g/mlの hPMlの存在下と非存在下で lOng/mlの IL-6で刺激し、その 後 30分、 60分後の STAT3のリン酸化をウェスタンブロット解析によって比較した。一次 抗体としてはゥサギ抗-ヒト PSTAT3抗体（Cell Signaling Technology)を 1000倍に希釈 して使用した。
その結果、 hPMl投与 60分後にお 、て前立腺癌細胞株の STAT3のリン酸ィ匕は抑制 されていることが明らかとなった。また、 hPMlは IL-6の刺激により増強される STAT3の リン酸ィ匕を抑制することが明らかとなった（図 4)。
[0079] 〔実施例 5〕hPMlの in vivoにおける抗腫瘍効果の確認
hPMlが、 in vivoにおいて抗腫瘍効果を持つカゝ否かを、以下に記載の方法で確認 した。
SCIDマウスの皮下に、 DU145細胞（107個/ body)を移植し、皮下腫瘍モデルを作成 した。腫瘍生着が確認できた 5日後から hPMlを投与し（ 200 μ g/body 3日に 1回）、経 時的に腫瘍の体積や、マウスの体重を計測することにより、 in vivoでの hPMlの抗腫 瘍効果を検討した。
その結果、 DU145が移植された SCIDマウスに hPMlを投与すると、腫瘍増殖と体重 減少が有意に抑制されることが明らかとなった（図 5)。腫瘍モデルにおいて体重減少 が抑制されたことから、本発明の IL-6阻害剤が前立腺癌に伴う悪液質の治療にも有 効であることが示唆された。
産業上の利用可能性
[0080] 進行前立腺癌の治療法としてはホルモン療法が唯一の治療法であるが、ホルモン 療法を開始した多くの進行前立腺癌患者は数年後にはホルモン耐性を獲得し、治 療に苦慮している現状がある。本発明の IL-6阻害剤を有効成分とする前立腺癌治療 剤は、ホルモン療法に代わる有効な治療法であり、ホルモン療法に耐性を獲得した 前立腺癌に対しても有効な治療効果を示すものと考えられる。本発明の前立腺癌治 療剤は、外科手術後の前立腺癌再発を抑える効果も示すものと考えられる。また、本 発明の前立腺癌治療剤は、前立腺癌に伴う悪液質の治療にも有効であると考えられ る。

Claims

請求の範囲
[I] IL-6阻害剤を有効成分として含有する、前立腺癌治療剤。
[2] IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1に記載の前立腺 癌治療剤。
[3] IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1に記載の 前立腺癌治療剤。
[4] 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 2または 3に記載の前立腺 癌治療剤。
[5] 抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 2 または 3に記載の前立腺癌治療剤。
[6] 抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項 2または 3に記載の前立腺癌治 療剤。
[7] 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項 6に記載 の前立腺癌治療剤。
[8] 前立腺癌がホルモン抵抗性前立腺癌である請求項 1から 7の 、ずれかに記載の前立 腺癌治療剤。
[9] IL-6阻害剤を、前立腺癌を発症した対象に投与する工程を含む、対象において前 立腺癌を治療する方法。
[10] IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする請求項 9に記載の方法。
[II] IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 9に記載の 方法。
[12] 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 10または 11に記載の方法
[13] 抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1
0または 11に記載の方法。
[14] 抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項 10または 11に記載の方法。
[15] 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項 14に記載 の方法。
[16] 前立腺癌治療剤を製造するための、 IL-6阻害剤の使用。
[17] IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする請求項 16に記載の使用。
[18] IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 16に記載の 使用。
[19] 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 17または 18に記載の使用
[20] 抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1
7または 18に記載の使用。
[21] 抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項 17または 18に記載の使用。
[22] 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項 21に記載 の使用。
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