EA019512B1 - Il-6-опосредованная иммунотерапия - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к полипептиду связывающего домена и содержащим его гибридным белкам, распознающим комплекс IL-6/рецептор IL-6, а также композициям и способам их применения.

Description

Интерлейкин-6 (Ш-6) представляет собой плейотропный цитокин, регулирующий иммунные ответы хозяина, воспалительные процессы, гемопоэз (кроветворение) и онкогенез в организме хозяина. Биология 1Ь-6 опосредуется многокомпонентной молекулярной системой с двумя различными типами передачи сигналов, действующими на частично совпадающие, но не идентичные популяции клеток. Эти типы принято обозначать как передача сигналов по типу цис (цис-сигналинг, также известный как классическая передача сигнала) и передача сигналов по типу транс (транс-сигналинг).

При передаче сигналов по типу цис 1Ь-6 связывается с рецепторами 1Ь-6 (1Б-6К) на поверхности клетки, а именно с лигандсвязывающим участком Ш-6В. обозначаемым как 1Ь-6Ка или СЭ126 (ранее обозначаемый как др80). Связанный с клеткой комплекс 1Ь-6/1Ь-6Ка, в свою очередь, связывается с лиганд-несвязывающим мембранным белком др130, который участвует в передаче сигнала (также известным как 1Б-6БТ. Ш-6В|< или СЭ130). что приводит к димеризации др130 и инициации сигнального пути. Таким образом, передача сигналов по типу цис ограничивается подгруппой типов клеток, экспрессирующих Ш-6В</.. которая, как правило, включает митоген-активируемые В-клетки, различные Т-клетки, моноциты периферической крови и определённые опухоли. Полученный трёхкомпонентный комплекс на поверхности клетки собирается в устойчивый гексамер, характеризующийся соотношением 1Т-6:1Ь-6Ва:др130 как 2:2:2 (Вои1апдег с1 а1. (2003), Басисе. 300:2101).

При передаче сигналов по типу транс растворимые комплексы 1Ь-6Яа (81Ь-6К.а) с 1Ь-6 и образующиеся комплексы 81Ь-6хК могут связываться с любой клеткой, экспрессирующей др130 (но не с клетками, которые также экспрессируют 1Ь-6К.а, Тада с1 а1. (1989), Се11. 58:573), и активировать её. Множество, возможно все или почти все клетки в теле человека экспрессируют др130. Поскольку др130 присутствует повсеместно, передача сигналов по типу транс может оказывать воздействие на множество типов клеток и, таким образом, иногда быть причиной заболеваний.

Мембранный белок др130 также присутствует в растворимой форме (кдр130), которая может связываться с комплексом к1Ь-6хК в системе кровообращения. Тем не менее, комплекс 81Ь-6хК одинаково хорошо связывается с мембранным и растворимым др130 (см. 1опс5 с1 а1. (2005), 1. 1п1сгГсгоп Су!окте Век. 25:241). Поэтому молярный избыток кдр130 может ингибировать передачу сигналов по типу транс (посредством уменьшения количества доступных комплексов к1Ь-6хК в системе кровообращения), что, однако, не повлияет в значительной степени на передачу сигналов по типу цис, так как сродство кдр130 к связанному с клеткой комплексу 1Ь-6/1Е-6Яа на порядки ниже по величине, чем сродство к таким комплексам белка др130, расположенного на поверхности клетки (см., например, 1ок!оск с1 а1. (2001), Еиг. 1. Вюскеш. 268:160). Таким образом, предположили, что кдр130 можно применять для ингибирования активности 1Ь-6 (см., например, 1ок!оск с1 а1. (2001), Еиг. 1. Вюскеш. 268:160). Однако, помимо 1Ь-6, др130 является общим белком переноса сигнала для семейства др130-цитокинов. Последние включают фактор ингибирования лейкемии (Ь1Е), цилиарный нейротрофический фактор (СИТЕ), нейропоэтин (ΝΡ), кардиотрофин-подобный цитокин (СЬС), онкостатин Μ (ОБМ), Ш-27. 1Б-31 и кардиотрофин-1 (СТ-1). Таким образом, несмотря на то, что кдр130 может ингибировать передачу сигналов по типу транс, введение такого соединения пациентам может привести к возникновению некоторых нежелательных побочных эффектов.

Повышенная продукция 1Ь-6 вовлечена в процессы различных болезней, включая болезнь Альцгеймера, аутоиммунные заболевания (как, например, ревматоидный артрит, красная волчанка), воспалительные процессы, инфаркт миокарда, болезнь Педжета, остеопороз, твёрдые опухоли (как, например, рак толстой кишки, почечно-клеточная карцинома (ЯСС), рак простаты и рак мочевого пузыря), определённые злокачественные опухоли нервной ткани, В-клеточные злокачественные опухоли, как синдром Каслмана, некоторые подтипы лимфомы, хроническую лимфоцитарную лейкемию (СБЬ) и, в частности, множественную миелому. В некоторых случаях 1Ь-6 вовлечён в пролиферативные пути, так как этот цитокин действует наряду с другими факторами, такими как гепарин-связывающий эпителиальный фактор роста (ГС-ЭФР) и фактор роста гепатоцитов.

Известны различные антитела-антагонисты 1Ь-6 и 1Ь-6Яа. Например, у ^ау с1 а1. (заявка на патент США № 2007/0178098) описаны антитела, специфичные к 1Ь-6, которые стерически блокируют присоединение 1Ь-6 или комплекса к1Ь-6хК к др130 (см. также патент США № 7291721). Например, в отношении 1Ь-6Яа К1кк1шо!о (патент США № 5670373) описывает антитела против 1Ь-6Яа, ингибирующие активность Ш-6.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А-1С показано, что мультиспецифичные гибридные белки (Хсер!ог™, Эксцептор), содержащие один из нескольких различных Нурег-Ш-6-связывающих доменов, соединённых с эктодоменом рецептора фактора некроза опухолей (ТИЕЯ), специфично связываются с Нурег-Ш-6, при измерении способом ИФА, причём указанные мультиспецифичные гибридные белки связываются предпочтительно с Нурег-Ш-6, а не с Ш-6 или Ш-6В по отдельности. Лишь два тестированных гибридных белка связываются с Ш-6 и ни один не связывается с кШ-6В.

На фиг. 2 показано, что мультиспецифичные гибридные белки, которые содержат эктодомен ТИЕЯ, соединённый с одним из нескольких различных Нурег-Ш-6-связывающих доменов, связываются с ТИЕ-α

- 1 019512 (ФНО-α), при измерении способом ИФА.

На фиг. 3 показано, что мультиспецифичные гибридные белки, которые содержат один из нескольких различных Нурег-1Ь-6-связывающих доменов, соединённый с эктодоменом ΤΝΡΕ, могут одновременно связываться с Нурег-1Ь-6 и ΤΝΡ-α, при измерении способом ИФА.

На фиг. 4 показано, что мультиспецифичные гибридные белки, которые содержат один из нескольких различных Нурег-1Ь-6-связывающих доменов, соединённый с эктодоменом ΤΝΡΕ, блокируют связывание §р130 с Нурет-1Ь-6, при измерении способом ИФА.

На фиг. 5А и 5В показано, что мультиспецифичные гибридные белки, которые содержат один из нескольких различных Нурет-1Ь-6-связывающих доменов, соединённый с эктодоменом ΤΝΡΕ, блокируют индуцированную (А) 1Ь-6 или (В) Нурет-1Ь-6 пролиферацию клеток линии ΤΡ-1.

На фиг. 6 показано, что мультиспецифичные гибридные белки, которые содержат один из нескольких различных Гипер-1Ь-6-связывающих доменов, соединённый с эктодоменом ΤΝΡΕ, блокируют связывание ΤΝΡ-α с ΤΝΡΕ, при измерении способом ИФА.

На фиг. 7 показано, что мультиспецифичные гибридные белки, которые содержат эктодомен ΤΝΡΕ, соединённый с одним из нескольких различных Гипер-1Ь-6-связывающих доменов, блокируют индуцированную ΤΝΡ-α гибель клеток Ь929.

На фиг. 8 показано, что малые модульные иммунофармацевтические гибридные белки (8ΜΙΡ™), которые содержат один из нескольких различных Гипер-1Ь-6-связывающих доменов (обозначаемых как ΤΕυ(86)-1004, 1007, 1008, 1013, 1018, 1019, 1029 и 1038), связываются с Нурет-1Ь-6, при измерении способом ИФА.

На фиг. 9 показано, что гибридные белки 8ΜΙΡ ΤΚυ(86)-1063-ΤΚυ(86)-1066 связываются с Нурег1Ь-6, при измерении способом ИФА.

На фиг. 10 показано, что гибридный белок 8ΜΙΡ ΤΚυ(86)-1002 связывается с комплексом 1Ь-6:81Ь-6В, при измерении способом В1асоге®.

На фиг. 11А и В показаны результаты исследований сайта связывания связывающих доменов, направленных против 1Ь-6, описанных в настоящем описании.

На фиг. 12 показано, что мультиспецифичные гибридные белки, которые содержат эктодомен ΤΝΡΡ. соединённый с 1Ь-6-связывающим доменом, не связывался с клетками линии НсрС2.

На фиг. 13 показано, что мультиспецифичные гибридные белки, которые содержат эктодомен ΤΝΡΡ, соединённый с 1Ь-6-связывающим доменом, блокируют индуцированный Н1Ь-6 8АА-ответ (ответ на сывороточный амилоид А) у мышей.

На фиг. 14 показано, что мультиспецифичные гибридные белки, которые содержат эктодомен ΤΝΡΡ, соединённый с 1Ь-6-связывающим доменом, блокируют индуцированный Н1Ь-6 §р130-ответ у мышей.

На фиг 15А и В показаны результаты исследований способности мультиспецифичных гибридных белков, которые содержат эктодомен ΤΝΡΕ, соединённый с 1Ь-6-связывающим доменом, блокировать индуцированный ΤΝΡ-α 8АА-ответ у мышей, через 2 и 24 ч после введения соответственно.

Подробное описание

Настоящее изобретение в целом относится к полипептидам, которые содержат связывающий участок или домен, специфичный к комплексу 1Ь-6 с мембранной или растворимой формой рецептора 1Ь-6 (1Ь-6Еа) (в настоящем описании комплекс обозначен как 1Ь-6хЕ, в случае когда он относится к мембранному 1Ь-6Еа или растворимому 1Ь-6Еа (81Ь-6Ва) комплексу, и обозначен как 81Ь-6хВ, когда он относится только к комплексу 1Ь-6 с 81Ь-6Ва), который предпочтительно ингибирует опосредуемую 1Ь-6 передачу сигналов по типу транс, по сравнению с опосредованной 1Ь-6 передачей сигналов по типу цис, например, путём конкуренции с мембранным §р130 за связывание с 81Ь-6хВ, усиления способности растворимого §р130 связываться с 81Ь-6хВ, обладания большим сродством к комплексу 1Ь-6хЕ, по сравнению с 1Ь-6 или 1Ь-6Еа по отдельности, либо присутствию любой комбинацией указанных характеристик. Связывающий домен, специфичный к 1Ь-6хЕ, согласно некоторым вариантам реализации, также не ингибирует передачу сигналов цитокинами семейства §р130, отличными от 1Ь-6. Согласно другим вариантам реализации такой полипептидный связывающий домен, специфичный к комплексу 1Ь-6хЕ, также может быть частью гибридного белка, в составе которого он соединён с амино- или карбоксильным концом домена димеризации (например, константной области иммуноглобулина или участка в составе этой области, такого как домены С_Н2 и С_Н3 1§С), как у малых модульных иммунофармацевтических белках (8ΜΙΡ™) или развёрнутых в противоположном направлении молекулах 8ΜΙΡ (обозначенных в настоящем описании как ΡΙΜ8) и т.п. Настоящее описание также обеспечивает гибридные белки, которые содержат множественные связывающие домены, являющиеся моноспецифичными (и мультивалентными) или мультиспецифичными. Например, моноспецифичные мультивалентные гибридные белки могут содержать по меньшей мере два связывающих домена, специфичных к одной и той же мишени, такой как комплекс 1Ь-6хЕ, указанный в настоящем описании. Мультиспецифичные гибридные белки, являющиеся примерами белков, содержащих связывающий домен, специфичный к 1Ь-6хЕ, как описано в настоящем изобретении, могут содержать по меньшей мере один дополнительный связывающий участок

- 2 019512 или домен, специфичный к мишени, отличной от 1Ь-6хК, такой как ΤΝΡ-α или ТСР-β.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют такие связывающие полипептиды или гибридные белки, а также векторы и клетки-хозяева для рекомбинантной продукции указанных молекул, композиции и способы применения указанных связывающих полипептидов или гибридных белков согласно настоящему изобретению в различных диагностических и терапевтических областях, включая лечение по меньшей мере одного симптома заболевания или нарушения, такого как гиперпролиферативные (например, миелома), аутоиммунные или воспалительные (например, ревматоидный артрит) заболевания и улучшение состояния больного. Соединения и композиции согласно настоящему описанию также можно применять в качестве инструментов для научноисследовательской работы в экспериментах ш νίίτο и клеточных экспериментах по изучению биологической активности 1Ь-6 и связанных с ним молекул.

Прежде чем продолжить более детальное изложение настоящего описания, может быть полезным для его понимания предоставление определений некоторых использованных в настоящем описании терминов. Дополнительные определения изложены в описании ниже.

В рамках настоящего описания следует понимать, что любой диапазон концентрации, процентного количества, соотношения или целой величины включает значение любой целой величины в пределах данного диапазона и, когда уместно, её дробь (такую как 1/10 и 1/100 целого числа), если не оговорено иначе. Также считается, что любой числовой диапазон, указанный в данном описании и относящийся к любой физической характеристике, такой как количество полимерных субъединиц, размер или толщина, включает любое целое значение величины в пределах данного диапазона, если не оговорено иначе. В настоящем описании приблизительно или состоящий практически из означает ±20% от указанного диапазона, величины или структуры, если не оговорено иначе. В настоящем описании термины включает и содержит в настоящем описании используются как синонимы. Также следует считать, что употребляемые в единственном числе термины относятся к одному или нескольким перечисляемым компонентам. Использование альтернативы (например, или) означает одну из указанных альтернатив, обе альтернативы или любую их комбинацию. Кроме того, следует считать, что отдельные соединения или группы соединений, представляющие собой производные различных комбинаций структур и заместителей, указанных в настоящем изобретении, описаны в той же мере, как если бы каждое соединение или группа соединений были описаны индивидуально. Таким образом, выбранные специфичные варианты структур или заместителей входит в рамки настоящего изобретения.

Связывающий домен или связывающий участок согласно настоящему описанию может представлять собой, например, любой белок, полипептид, олигопептид или пептид, обладающий способностью специфично распознавать и связываться с биологической молекулой (например, 1Ь-6, 1Ь-6В), или комплексу из нескольких одинаковых или различных молекул, или совокупности молекул, или молекулярному агрегату, независимо от того, является он устойчивым образованием или нет (например, комплекс 1Ь-6хК). Такие биологические молекулы включают белки, полипептиды, олигопептиды, пептиды, аминокислоты или их производные; липиды, жирные кислоты или их производные; углеводы, сахариды или их производные; нуклеотиды, нуклеозиды, нуклеопептиды, молекулы нуклеиновых кислот или их производные; гликопротеины, гликопептиды, гликолипиды, липопротеины, протеолипиды или их производные; другие биологические молекулы, которые могут присутствовать, например, в биологическом образце; а также любые комбинации вышеуказанных соединений. Связывающие участки включают любые природные, синтетические, полусинтетические или рекомбинантным образом полученные партнёры для присоединения к биологической молекуле или другой мишени, представляющей интерес. Известны различные процедуры для идентификации связывающих доменов согласно настоящему описанию, которые специфично связываются с определённой мишенью, включая Вестерн блоттинг, ИФА или анализ В1асоте®.

Каждый из терминов, известных специалисту в данной области и относящихся к технологиям, использующим антитела, имеет значение, принятое в данной области, если в настоящем описании не оговорено иначе. Например, обозначения У_ъ и Ун относятся к вариабельным связывающим областям лёгких и тяжёлых цепей антител соответственно. Вариабельные связывающие области состоят из отдельных, строго определённых участков, известных как гипервариабельные участки (участки, определяющие комплементарность) (СОВ) и каркасные участки (ТВ). Обозначения С_ь и С_н относятся к константным областям иммуноглобулинов, т.е. константным областям, полученным из соответственно лёгких или тяжёлых цепей антител, притом, что далее область может быть далее разделена на домены С_Н1, С_Н2, С_нз и С_Н4 константных областей, в зависимости от изотипа антитела (1дА, Ι§Ό, 1дЕ, 1дС, 1дМ), из которого данный участок получен. Часть доменов константных областей составляет участок Ре (участок кристаллизуемого фрагмента), который содержит домены, ответственные за эффекторные функции иммуноглобулинов, такие как АЭСС (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность), АЭСР (антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз), СЭС (комплементзависимая цитотоксичность) и фиксация комплемента, связывание с рецепторами Рс, большее время полужизни ίη νίνο относительно полипептидов, не содержащих участок Рс, связывание с белком А и, возможно, даже транс

- 3 019512 плацентарный перенос (см. Сароп с1 а1. (1989), №|1игс, 337:525). Кроме того, полипептиды, содержащие участок Ес, обладают способностью к димеризации или мультимеризации. Шарнирный участок, также обозначаемый в настоящем описании как линкер, представляет собой последовательность аминокислот, вставленную между вариабельными и константными областями одной и той же цепи антитела и соединяющую их друг с другом, про которую известно в данной области, что она обеспечивает гибкость антител и антитело-подобных молекул, играя роль шарнира.

Доменная структура иммуноглобулинов может быть модифицирована таким образом, что антигенсвязывающие домены и домены, ответственные за эффекторные функции, могут быть поменяны между классами и подклассами иммуноглобулинов. Структура и функции иммуноглобулинов описаны, например, у Наг1о\у с1 а1., Е6§., АпНЬоФек: А ЬаЬогаТогу Мапиа1, СЬарТег 14 (Со16 8ргт§ НагЬог ЬаЬогаТогу, Со16 8ргт§ НагЬог, 1988). Более развёрнутое введение и подробная информация в отношении всех аспектов рекомбинантных технологий антител доступны в научном пособии КесотЫпап! АпБЬоФек (1оЬп 411еу & 8оп8, ΝΥ, 1999). Исчерпывающие материалы о подробных лабораторных протоколах инженерии антител доступны у К. КопТегтапп апб 8. ΌϋΒθΙ, Е6§., ТНс АпНЬобу Епщпссгпщ ЬаЬ Мапиа1 (8ргт§ег Уег1а§, НсИс1Ьсг§/№\\· Υогк, 2000).

Производное согласно данному описанию относится к химически или биологически модифицированным формам соединений, структурно схожих с исходным соединением, которые (фактически или теоретически) могут быть получены из исходного соединения. Как правило, производное отличается от аналога тем, что исходное соединение может являться начальным материалом для получения производного, в то время как необязательно, чтобы исходное соединение являлось начальным материалом для получении аналога. Производное может обладать химическими или физическими характеристиками, отличными от таковых, присущих первичному соединению. Например, производное может быть более гидрофильным либо обладать изменённой реакционной способностью (например, СЭК, содержащий замену аминокислоты, приводящую к изменению сродства к мишени) в сравнении с исходным соединением.

Термин биологический образец включает образцы крови, биоптаты, эксплантаты тканей, культуры органов, биологических жидкостей или любых других тканей, клетки и другие препараты, взятые у субъекта или из другого биологического источника. Субъект или биологический источник может представлять собой человека или другое животное, первичную клеточную культуру или культивированную линию клеток, включая генетически модифицированные клеточные линии, которые могут содержать интегрированные в хромосомы или эписомальные рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, линии гибридных соматических клеток, иммортализированные линии клеток или линии клеток, которые могут быть иммортализированы, дифференцированные линии клеток или линии клеток, которые могут дифференцировать, трансформированные клеточные линии и т.п. Согласно последующим вариантам реализации настоящего изобретения субъектом или биологическим источником может быть субъект или биологический источник с заболеванием, нарушением или патологическим состоянием, включая злокачественные заболевания, нарушения или патологические состояния, нарушения, связанные с В-клетками, либо субъект или биологический источник, подверженный риску такого заболевания, нарушения или состояния. Согласно определённым вариантам реализации субъект или биологический источник может быть подвергнут риску гиперпролиферативного, воспалительного или аутоиммунного заболевания, в то время как согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения субъект или биологический источник может быть не подверженным риску указанных заболеваний, нарушений или патологических состояний.

Антагонисты 1Ь-6.

Как указано выше, настоящее описание обеспечивает полипептиды, содержащие связывающий участок или домен, специфичный к комплексу 1Ь-6хК и обладающий следующими характеристиками: (1) большее сродство к комплексу 1Ь-6хК, чем к 1Ь-6 или 1Ь-6Ка по отдельности, (2) конкурирование с мембранным или растворённым §р130 за связывание с комплексом а 81Ь-6хК, (3) предпочтительное ингибирование передачи сигналов 1Ь-6 типа транс в сравнении с цис и (4) отсутствие ингибирования передачи сигналов цитокинами семейства §р130, отличными от 1Ь-6. Согласно определённым вариантам реализации специфичный к комплексу 1Ь-6хК связывающий домен согласно настоящему описанию обладает следующими характеристиками: (1) большее сродство к комплексу 1Ь-6хК, чем к 1Ь-6 или 1Ь-6Ка по отдельности, (2) конкурирование с мембранным §р130 за связывание с комплексом а 81Ь-6хК, (3) предпочтительное ингибирование передачи сигналов 1Ь-6 типа транс в сравнении с цис и (4) отсутствие ингибирования передачи сигналов цитокинами семейства §р130, отличными от 1Ь-6. Например, связывающий участок или домен, специфичный к 1Ь-6хК, может представлять собой вариабельный связывающий домен иммуноглобулина или его производное, такое как антитело, ЕаЬ, ксЕу и т.п. В контексте настоящего описания следует считать, что связывающий участок или домен, специфичный к 1Ь-6хК, не является белком §р130, описанным в данном изобретении.

- 4 019512

В настоящем описании комплекс Ш-бхЕ или 'ТЬ-бхЕ относится к комплексу 1Ь-б с рецептором 1Ь-6, где рецептор 1Ь-6 (также известный как, например, 1Ь-6Еа, 1Ь-6ЕА, 1Ь-6Е1 и СЭ 126) представляет собой мембранный белок (обозначенный в данном описании как ш1Ь-6Е или ш1Ь-6Ка) или белок в растворимой форме (обозначенный в данном описании как 51Б-6Е или ЛЬ-бЕа). Термин 'ТЬ-бЕ охватывает как ш1Ь-6Еа, так и ЛЬ-бЕа. Согласно одному из вариантов реализации 1Ь-бхЕ включает комплекс 1Ь-6 и ЛЬ-бЕа. Согласно определённым вариантам реализации компоненты комплекса 1Ь-бхЕ связаны посредством одной или нескольких ковалентных связей. Например, карбоксильный конец 1Ь-6Е может быть соединён с аминоконцом 1Ь-6 посредством пептидного линкера с получением комплекса, известного как Нурет-1Ь-6 (Нурет-1Ь-6, см., например, Р18сйег с1 а1. (1997), Ν;·ιΙ. Вю1сс1то1. 15:142). Линкер Нурет-1Ь-6 может состоять из соединения, образующего поперечные связи, длиной от 1 до 50 аминокислот или из комбинации таких соединений. Кроме того, линкер Нурет-1Ь-6 может включать домен димеризации, такой как домен Рс или участок константной области иммуноглобулина. Согласно определённым вариантам реализации компоненты комплекса 1Ь-бхЕ связаны нековалентно, например, водородными связями, электростатическими взаимодействиями, силами Ван-дер-Ваальса, солевыми мостиками, гидрофобными взаимодействиями и т.п. или посредством любых комбинаций вышеуказанного. Например, 1Ь-6 и 1Ь-6Е могут быть естественным образом связаны нековалентно (например, как это происходит в природе, либо в случае с синтетическими или рекомбинантными белками) или каждый из них может быть соединён с доменом димеризации, таким как домен Рс иммуноглобулина, для увеличения стабильности комплекса.

В настоящем описании §р130 относится к белку передачи сигнала, который связывается комплексом 1Ь-бхЕ. Белок §р130 может быть присоединён к мембране (ш§р130), может быть в растворимой (§§р130) или любой другой функциональной форме. Типичные белки §р130 включают последовательность, описанную в СеиВаик Асеевой Νο. ΝΡ 002175.2, либо могут быть в растворимой форме, либо в форме его производного (см., например, ΝαγαζαΙΑ с1 а1. (1993), Βίοοά, 82:1120 или ΩιαμαπΙ с1 а1. (1997), РЕВЗ Ьей. 412:379). В качестве иллюстрации и не желая ограничиваться существующей теорией, белок ш§р130 может связываться с комплексом 1Ь-6/т1ЬК или Ш-б/ЛЬЕ, в то время как 8§р130 главным образом связывается с комплексом 1Е-6/З1ЬЕ (см. Зсйе11ег с1 а1. (2006), Зсаиб. 1. 1ттиио1. 63:321). Таким образом, определённые варианты реализации связывающих доменов или содержащих их гибридных белков согласно настоящему описанию могут ингибировать передачу сигналов по типу транс комплексом 1Ь-бхЕ посредством связывания с 1Ь-бхЕ со сродством, большим, нежели таковое в отношении 1Ь-6 или 1Ь-6Еа по отдельности, и посредством конкурирования с комплексом ЛЬ-бхЕ за связывание с §р130, предпочтительно ш§р130, либо посредством усиления связывания 8§р130 к комплексу ЛЬ-бхЕ. Связывающий домен согласно настоящему описанию конкурирует с §р130 за связывание с ЛЬ-бхЕ, когда (1) связывающий домен или содержащий его гибридный белок не допускает связывания §р130 с ЛЬ-бхЕ и связывающий домен связывается с ЛЬ-бхЕ со сродством, равным или превышающим сродство §р130 к ЛЬ-бхЕ, или (2) связывающий домен или содержащий его гибридный белок усиливает или стимулирует связывание 8§р130 с комплексом ЛЬ-бхЕ, таким образом сокращая время, в течение которого комплекс ЛЬ-бхЕ доступен для соединения с ш§р130.

Связывающие домены и содержащие их гибридные белки согласно настоящему описанию могут быть иммуноспецифичными, т.е. способными к связыванию в желаемой степени эффективности, включая специфичное или селективное связывание, с мишенью, не связываясь в то же время в значительной степени с другими компонентами, присутствующими в тестовом образце, когда они связываются с молекулой-мишенью со сродством или К_а (т.е. равновесной константой связывания определённого взаимодействия присоединения, с единицей измерения М^-1), например, превышающим или равным приблизительно 10⁵, 10⁶, 10⁷, ΙΟ⁸, ΙΟ⁹, ΙΟ¹⁰, 10¹¹, 10¹² или 10¹³ М^-1. К связывающим доменам с высоким сродством относятся связывающие домены, значение К_а которых не ниже 10⁷ М^-1, не ниже 10⁸ М^-1, не ниже 10⁹ М^-1, не ниже 10¹⁰ М^-1, не ниже 10¹¹ М^-1, не ниже 10¹² М^-1, не ниже 10¹³ М^-1 или выше указанных значений. В качестве альтернативы сродство может характеризоваться равновесной константой диссоциации (К,|) определённого взаимодействия связывания, с единицей измерения М (например, от 10^-5 до 10^-13 М). Степени сродства полипептидов связывающих доменов и гибридных белков согласно настоящему описанию могут быть легко определены с помощью стандартных способов (см., например, Зса1с11аг6 с1 а1. (1949), Αηη. Ν.Υ. Асаб. Зск 51:660 аиб и.З. Ра1еи1 Νο. 5283173, 5468614, анализ В1асоге® или его эквиваленты).

Согласно одному аспекту связывающий домен-антагонист 1Ь-6 согласно настоящему описанию обладает сродством к комплексу ЛЬ-бхЕ, в 2-1000 раз превышающим его сродство к 1Ь-6 или 1Ь-6Еа по отдельности. Присоединяясь к комплексу ЛЬ-бхЕ, связывающий домен согласно настоящему описанию предпочтительно ингибирует передачу сигналов по типу транс 1Ь-6. Согласно определённым вариантам реализации сродство связывающего домена к комплексу ЛЬ-бхЕ приблизительно соответствует сродству §р130 к комплексу ЛЬ-бхЕ, где фраза приблизительно соответствует означает, что указанное сродство равно сродству §р130 либо превышает его не более чем вдвое. Согласно определённым вариантам реализации сродство связывающего домена к комплексу ЛЬ-бхЕ выше сродства §р130 к ЛЬ-бхЕ по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 1000 или более раз. Например, если сродство

- 5 019512 др130 к комплексу НЬ-бхК. приблизительно равно 2 нМ (см., например, СаШагб с1 а1. (1999), Бит. Су1ок1пе Νεί^. 10:337), то связывающий домен, обладающий сродством, по меньшей мере в 10 раз превышающим сродство §р130 к комплексу 81Ь-бхК, будет характеризоваться константой диссоциации (КД приблизительно равной 0.2 нМ или ниже.

Согласно другим вариантам реализации связывающий домен-антагонист 1Ь-б в настоящем описании содержит полипептидную последовательность, которая (а) связывается с комплексом НЬ-бхК со сродством, превышающим сродство к 1Ь-б или 1Ь-бКа по отдельности по меньшей мере в 2-1000 раз и (В) конкурирует с др130 за связывание с комплексом НЬ-бхК или усиливает связывание др130 с комплексом йБ-б.хБ. Согласно другим вариантам реализации полипептидный связывающий доменантагонист 1Ь-б согласно настоящему описанию, который связывается с комплексом НЬ-бхВ со сродством, превышающим его сродство к 1Ь-б или 1Ь-бКа по отдельности по меньшей мере в 2-1000 раз, также может (1) в более существенной степени либо предпочтительно ингибировать передачу сигналов по типу транс 1Ь-б в сравнении с передачей сигналов по типу цис, (и) не ингибировать передачу сигналов цитокинами семейства др130, отличными от 1Ь-б, (ш) предпочтительно ингибировать передачу сигналов по типу транс, нежели сигналов по типу цис и не ингибировать в значительной степени передачу сигналов цитокинами семейства др130, отличными от 1Ь-б, (ιν) может обладать двумя или несколькими вышеуказанными характеристиками или (ν) может обладать всеми вышеуказанными характеристиками.

Согласно определённым вариантам реализации полипептидный связывающий домен-антагонист 1Ь-б согласно настоящему описанию связывается с комплексом НЬ-бхК со сродством, по меньшей мере в 2-1000 раз превышающим его сродство к 1Ь-б или 1Ь-бКа по отдельности, и предпочтительно ингибирует передачу сигналов 1Ь-б по типу транс в сравнении с сигналами по типу цис. Фраза предпочтительно ингибировать передачу сигналов 1Ь-б по типу транс в сравнении с сигналами по типу цис значит воздействовать на передачу сигналов по типу транс до такой степени, что активность йЕ-бхК явно понижается, в то время как передача сигналов 1Ь-б по типу цис не меняется в значительной мере (т.е. ингибирование минимально отсутствует либо его невозможно измерить). Например, биологический маркер активности НЬ-бхК (например, экспрессия антихимотрипсина (АСТ) в острой фазе клетками НерС2) может быть количественно определён для обнаружения ингибирования передачи сигналов по типу транс. Показательный эксперимент описывается у 1ойоек с1 а1. (Еит. 1. Вюейеш., 2001) - вкратце, клетки НерС2 могут быть стимулированы для сверхэкспрессии АСТ в присутствии НЬ-бхВ (передача сигнала по типу транс) или 1Ь-б (передача сигнала по типу цис), но добавление 5§р130 будет ингибировать сверхэкспрессию АСТ, вызванную НЬ-бхК, не влияя существенно на экспрессию, вызванную 1Ь-б. Таким же образом, полипептидный связывающий домен согласно настоящему описанию, который предпочтительно ингибирует передачу сигналов 1Ь-б по типу транс в сравнении с передачей сигналов по типу цис, будет ингибировать сверхэкспрессию АСТ, вызванную НЬ-бхК (т.е. ингибировать передачу сигналов по типу транс), не влияя существенно на экспрессию, вызванную 1Ь-б (т.е. не снижая передачу сигналов по типу цис так, что это выявляется). Этот и другие известные в данной области способы можно применять для определения предпочтительного ингибирования передачи сигналов по типу транс 1Ь-б в сравнении с передачей сигналов по типу цис (см., например, другие биологические маркеры, описанные у 8рот с1 а1. (1999), Ιηΐ. 1шшиио1. 11:1053; МШата с1 а1. (1995), Вт. 1. Вйеиш. 34:321; СНеп с1 а1. (2004), 1шшии. 20:59).

Согласно другим вариантам реализации передача сигналов, опосредованная цитокинами семейства др130, отличными от 1Ь-б, не ингибируется в существенной степени связыванием с полипептидными связывающими доменами и содержащими их гибридными белками согласно настоящему описанию. Например, передача сигналов по типу транс комплексом 1Ь-бхК посредством др130 будет ингибироваться, но передача сигналов одним или несколькими другими цитокинами семейства др130 будет ингибироваться в минимальной степени или не будет ингибироваться вообще. Примерами этого может послужить передача сигналов факторами ингибирования лейкемии (ЫЕ), цилиарным нейротрофическим фактором (СЫТЕ), нейропоэтином (ΝΡ), кардиотрофин-подобным цитокином (СЬС), онкостатином Μ (О8М), 1Ь27, 1Б-31, кардиотрофином-1 (СТ-1) или любой их комбинацией.

Кроме того, взаимодействие связывающего домена с молекулой-мишенью может служить мерой кинетической ассоциации или диссоциации указанного взаимодействия. Кинетическая ассоциация (к_а), также обозначаемая согласно данному описанию как Κο_Ν, применяется для измерения скорости, с которой будет происходить взаимодействие и связывание. Согласно одному из вариантов реализации с помощью к,\ можно определить вероятность того, что свободный связывающий домен свяжется с молекулой-мишенью, в зависимости от среднего периода времени, в течение которого свободная молекула находится на поверхности клетки, к которой она может присоединиться, и от концентрации свободных молекул в данной области поверхности клетки. к_а (к₀,) измеряется в 1/М-с. Согласно определённым вариантам реализации значение 1<_οΝ может превышать приблизительно 10³/М-с, приблизительно 10⁴/М-с, приблизительно 10⁵/М-с, приблизительно 10^б/М-с, приблизительно 10⁷/М-с, приблизительно 10⁸/М-с, приблизительно 10⁹/М-с, приблизительно 10¹⁰/М-с или выше. В случае, когда связывающий домен представляет собой κεΕν, значение к_о·,,· может меняться от менее чем 10⁴ до приблизительно 10⁷/М-с (И1т1к с1 а1. (2000),

Сапсег Кек. 60:6434; Х;птсг апй \УИ1коп (1998), ВюрЬук. 1. 74:2036). Значение кон связывающего домена может быть определено с помощью способов, известных в данной области, таких как поверхностный плазмонный резонанс (Ьеопагй с1 а1. (2007), 1. 1штипо1. МеШойк, 323:172).

Кинетическая диссоциация (Κι)· также обозначаемая согласно данному описанию как к_0ЕЕ, применяется для измерения скорости диссоциации комплекса, и, таким образом, время удерживания молекулы-мишени, связанной с полипептидным связывающим доменом согласно настоящему описанию, Κι (к_0ЕЕ) измеряется в 1/с. Специалистам в данной области будет очевидно, что предпочтительный период полужизни ίη νίνο связывающих доменов согласно настоящему описанию будет в пределах нескольких дней или недель, однако, в то время как концентрация связывающих доменов может быть низкой, количество молекул-мишеней может быть весьма высоким, так как продуцирование 1Ь-6 и к1Ь-6 во время патологических состояний может быть усиленным (см., например, Ьи с1 а1. (1993), Су1ок1пе, 5:578). Таким образом, согласно определённым вариантам реализации значение к_ОЕЕ связывающих доменов согласно настоящему описанию может составлять приблизительно 10^-5/с (например, приблизительно 1 день) и менее. Согласно определённым вариантам реализации к_ОЕЕ может быть равным приблизительно 10^-1/с, приблизительно 10^-2/с, приблизительно 10^-3/с, приблизительно 10^-4/с, приблизительно 10^-5/с, приблизительно 10^-6/с, приблизительно 10^-7/с, приблизительно 10^-8/с, приблизительно 10^-9/с, приблизительно 10^-10/с и менее (см. 6гаГГ с1 а1. (2004), Рго!еш Епд. Иек. 8е1. 17:293).

Связывающие домены согласно настоящему описанию могут быть получены способами согласно настоящему описанию или различными способами, известными в данной области техники (см., например, патенты США № 6291161; 6291158). Источники включают генные последовательности антител различных видов (которые могут быть в форме собственно антител и фрагментов κΕν, ксБу или ЕаЬ, в виде библиотек фагов), включая человека, верблюдовых (верблюдов, дромадеров или лам; Нашегк-Сак!егшап с1 а1. (1993), Ыа1иге, 363:446 апй Ыдиуеп с1 а1. (1998), 1. Мо1. Вю1., 275:413), акул (Коих с1 а1. (1998), Ргос. Ν;Π1. Асай. 8с1. (И8А), 95:11804), рыб (Ыдиуеп с1 а1. (2002), 1ттиподепе11ск, 54:39), грызунов, птиц, овец; последовательности, кодирующие библиотеки пептидов случайного состава, или последовательности, кодирующие заранее заданное разнообразие аминокислот в петлевых доменах альтернативных, не относящихся к антителам каркасов, таких как домены фибриногена (см., например, \Ус1кс1 с1 а1. (1985), 8с1епсе, 230:1388), домены Кунитца (см., например, патент США № 6423498), домены липокалинов (см., например, \¥О 2006/095164), ν-подобные домены (см., например, заявку на патент США № 2007/0065431), лектиновые домены С-типа (ΖοΙοηκΚν апй 6геайу (2005), ЕЕВ8 1. 272:6179), тАЬ² или ЕсаЬ™ (см., например, патентные заявки РСТ № \¥О 2007/098934; \УО 2006/072620) и т.п. Кроме того, традиционные стратегии получения гибридом с применением одноцепочечных синтетических комплексов 1Ь-6хК, таких как комплекс 1Ь-6хК человека или Нурег-1Ь-6, как иммуногенов в подходящих системах (например, мышах, НиМАЬ тоике®, ТС тоике™, КМ-тоике®, ламах, курицах, крысах, хомяках, кроликах и т.п.) могут применяться для получения доменов согласно настоящему описанию.

В иллюстративном примере связывающие домены согласно настоящему описанию, специфичные к комплексу 1Ь-6хК, идентифицировали в фаговой библиотеке фрагментов ЕаЬ (см. Ное! с1 а1. (2005), №11игс Вю!есйпо1. 23:344) путём отбора по связыванию с синтетическим комплексом 1Ь-6хК. Синтетический комплекс 1Ь-6хК, использованный в этом способе, характеризуется структурой Н-1Е-6Ка(Ггад)-Ь11Е-6(Ггад)-Е2-ГО-С, где N - аминоконец, С - карбоксильный конец, 1ЬвКа(Ггад) - полноразмерный фрагмент 1Ь-6Ка, 1Ь-6(Ггад) - фрагмент 1Ь-6, Ь1 и Ь2 - линкеры, а ГО - промежуточный или домен димеризации, такой как домен Ес иммуноглобулинов.

Более конкретно, 1Ь-6хК (представляющий собой форму Нурег-1Ь-6), использованный для идентификации связывающих доменов, специфичных к комплексу 1Ь-6хК, обладает следующей структурой, в направлении от аминоконца к карбоксильному концу: (а) центральный фрагмент, состоящий из 212 аминокислот 1Ь-6Ка, исключающий первые 110 аминокислот полноразмерного белка, и участок карбоксильного конца, который зависит от используемой изоформы (см. СепВапк Ассеккюп Но. ΝΡ 000556.1, изоформа 1 или ΝΡ 852004.1, изоформа 2), соединённый с (2) линкером 6₃8, в свою очередь соединённым с (3) фрагментом карбоксильного конца 1Ь-6 длиной 175 аминокислот (т.е. исключающим первые 27 аминокислот полноразмерного белка; СепВапк Ассеккюп Но. ΝΡ 000591.1), который также соединён с (4) линкером, представляющим собой шарнирный домен 1д6₂А, как указано в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 589, который, в завершение, соединён с доменом димеризации, содержащим домен Ес иммуноглобулина 6_| (1§6_|). Согласно определённым вариантам реализации домен димеризации, включающий домен Ес иммуноглобулина 61, содержит одну или несколько мутированных аминокислот, указанных ниже (т.е. аминокислоты по указанным позициям заменены на другие): лейцин в позиции 234 (Ь234), лейцин в позиции 235 (Ь235), глицин в позиции 237 (6237), глютамат в позиции 318 (Е318), лизин в позиции 320 (К320), лизин в позиции 322 (К322), либо любой из комбинаций из вышеуказанного (согласно нумерации ЕС). Например, любая из вышеуказанных аминокислот может быть заменена (мутирована) на аланин. Согласно другим вариантам реализации домен Ес 1§6_| характеризуется тем, что каждый из остатков Ь234, Ь235, 6237, Е318, К320 и К322 (согласно нумерации ЕС) замещён остатком аланина (т.е. Б234А, Б235А, 6237А, Е318А, К320А и К322А соответственно).

- 7 019512

Согласно одному из вариантов реализации комплекс 1Ь-бхК, использованный для идентификации связывающих доменов-антагонистов 1Ь-б согласно настоящему описанию, характеризуется последовательностью аминокислот, соответствующей 8ЕС ΙΌ N0: 606. Согласно определённым вариантам реализации обеспечиваются полипептиды, которые содержат связывающие домены, специфичные к комплексу 1Ь-бхК, где 1Ь-бхК представляет собой к1Ь-бхК и характеризуется последовательностью аминокислот, соответствующей 8ЕС ΙΌ N0: бОб. Согласно другим вариантам реализации полипептиды, которые содержат связывающие домены, специфичные к комплексу 1Ь-бхК, (1) обладают большим сродством к комплексу к1Ь-бхК, чем к 1Ь-б или 1Ь-бКа по отдельности, где кШ-бхК характеризуется последовательностью аминокислот, соответствующей 8ЕС ΙΌ N0: бОб, (2) конкурируют с мембранным или растворимым др 130 за связывание с комплексом к1Ь-бхК, который характеризуется последовательностью аминокислот, соответствующей 8ЕС ΙΌ N0: бОб, (3) предпочтительно ингибируют прередачу сигналов по типу транс 1Ь-б, но не сигналов по типу цис, (4) не ингибируют передачу сигналов цитокинами семейства др130, отличными от 1Ь-б, (5) характеризуются любой комбинацией свойств по пунктам (1)-(4) или (б) характеризуются всеми свойствами по пунктам (1)-(4). Другие типичные комплексы 1Ь-бхК, которые могут применяться для идентификации связывающих доменов согласно настоящему описанию или применяться в качестве стандартных комплексов для количественного определения вышеуказанных характеристик присоединения, описаны, например, в заявках на патент США № 2007/0172458; 2007/003137б и патентах США № 7198781, 59197б3.

Согласно некоторым вариантам реализации связывающие домены-антагонисты 1Ь-б согласно настоящему описанию содержат домены ν_Η и У_ь, специфичные к 1Ь-б, 1Ь-бК или комплексу Ш-бхК, как описано в настоящем изобретении, предпочтительно к 1Ь-б человека, 1Ь-бК человека или комплексу 1Ь-бхК человека. Согласно определённым вариантам реализации домены ν_Η и У₂ являются доменами ν_Η и V грызуна (например, мыши или крысы), гуманизироваными доменами или доменами человека. Примеры связывающих доменов, содержащих такие домены ν_Η и У_ь, описаны в 8ЕС ΙΌ N0: 435-49б и 805810 и в 373-434 и 799-804 соответственно. Согласно другим вариантам реализации обеспечиваются полипептидные связывающие домены, специфичные к комплексу 1Ь-бхК, которые связываются с 1Ь-бхК с большим сродством, чем с 1Ь-б или Ш-бКа по отдельности, и конкурируют с мдр130 за связывание с комплексом к1Ь-бхК либо усиливают связывание кдр130 с к1Ь-бхК, причём связывающий домен характеризуется последовательностью по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 9б, 97, 98, 99, 99.5 или на 100% идентичной последовательности аминокислот одного или нескольких вариабельных участков лёгкой цепи (У_ь, или одного или нескольких вариабельных участков тяжёлой цепи (ν_Η), или обоим участкам, описанным в 8ЕС ΙΌ N0: 373-434, 799-804 и 435-49б и 805-810 соответственно, причём каждый из участков, определяющих комплементарность (СЭК), содержит до трёх замен аминокислот (т.е. многие из замен находятся в области каркасного участка).

Согласно другим вариантам реализации связывающие домены согласно настоящему описанию содержат домены ν_Η и У_ь, специфичные к Ш-б, 1Ь-бК или комплексу 1Ь-бхК, как описано в 8ЕС ΙΌ N0: 435-49б и 805-810, 373-434, 799-804 соответственно, последовательность которых по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8б, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 9б, 97, 98, 99 или 99.5% идентична последовательности аминокислот таких доменов ν_Η, V или обоих, причём каждый СЭК содержит от О до 3 замен аминокислот. Например, последовательность аминокислот доменов ν_Η, V или обоих согласно настоящему описанию может быть по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8б, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 9б, 97, 98, 99 или на 99.5% идентичной последовательности аминокислот домена ν_Η (например, аминокислоты 512-б31), домена V (например, аминокислоты б49-759) или обоих доменов соответственно, взятых из типичного связывающего домена, присущего ТКИ(ХТо)-1002 (см. 8ЕС ΙΌ N0: б08), причём каждый СОК содержит от 0 до 3 замен аминокислот.

Термины идентичный или идентичен на ... %, применённые в контексте двух или более последовательностей полипептидов или нуклеиновых кислот, относятся к двум или более последовательностям или фрагментам последовательностей, являющимся идентичными либо характеризующимся определённым процентом идентичных остатков аминокислот или нуклеотидов в пределах определённого участка (например, бО, б5, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 9б, 97, 98, 99 или 100% идентичности), при сравнении и выравнивании для получения максимального соответствия в окне сравнения, либо в пределах обозначенного участка, осуществляемом с помощью способов, известных в данной области техники, таких как алгоритм сравнения последовательностей, выравнивание вручную или визуальное исследование. Например, предпочтительные алгоритмы, которые применяются для определения степени идентичности последовательностей в процентах, включают алгоритмы ВЬА8Т и ВЬА8Т 2.0, описанные у А118с1ш1 е! а1. (1977), №с1ек Ас1йк Кек. 25:3389 и А11ксйц1 е! а1. (1990), 1. Μοί. Βΐοΐ. 215:403 соответственно.

Согласно любому из указанных вариантов или каким-либо другим вариантам реализации в данном описании домены V и ν_Η могут быть расположены и в обратном порядке, а также могут разделяться аминокислотным линкером длиной до 30 аминокислот, как описано в данном изобретении, либо любой иной последовательностью аминокислот, способной выполнять функцию промежуточной последова

- 8 019512 тельности, не препятствующей взаимодействию двух связывающих фрагментов. Согласно определённым вариантам реализации линкер, связывающий домены Ун и У_ь, содержит последовательность аминокислот, описанную в 8ЕО ΙΌ N0: 497-604 и 823-828, такой как Ьшкег 47 (8Е0 ΙΌ N0: 543) или Ыпкег 80 (8Е0 ΙΌ N0: 576). Мультиспецифичные связывающие домены должны содержать по меньшей мере два специфичных связывающих фрагмента, по аналогии с более известной организацией антител у верблюдовых, либо по меньшей мере четыре специфичных связывающих фрагмента, по аналогии с более известной организацией парных цепей У_ъ и У_н антител у млекопитающих.

Согласно другим вариантам реализации связывающие домены-антагонисты 1Ь-6 согласно настоящему описанию могут содержать один (предпочтительно СЭК.3) или несколько участков, определяющих комплементарность (СЭЕ), либо множественные копии одного или нескольких таких СЭЕ, полученных, произведённых или синтезированных путём модификации из вариабельных областей антител против 1Ь-6, 1Ь-6Е или фрагментов 5сЕу и ЕаЬ антител против комплекса 1Ь-6хК либо из вариабельных участков их тяжёлой или лёгкой цепи.

В данной области техники существуют различные описания СЭЕ, например КаЬа1, Сйо1Ыа, АЬМ и контактные описания. Описание КаЬа! основывается на вариабельности последовательности и является наиболее часто используемым описанием, позволяющим предсказать участки СЭЕ (1ойп8оп с1 а1. (2000), М.1с1с1с Ас1б§ Ее§. 28:214). Описание Сйо1Ыа основывается на месторасположении структурных участков петель (Сйо1Ыа с1 а1. (1986), 1. Мо1. Вю1. 196:901; СйоТЫа с1 а1. (1989), №1Шгс 342:877). Описание АЬМ, представляющее собой нечто среднее между способами КаЬа! и Сйо1Ыа, - это интегрированный набор программ для моделирования структуры антител, производимый компанией 0хГогб Мо1еси1аг Огоир (Майш с1 а1. (1989), Ргос. №11. Асаб. 8с1. (И8А), 86:9268; Ееек с1 а1., АВМТМ, компьютерная программа для моделирования вариабельных областей антител, Оксфорд, Великобритания; ОхГогб Мо1еси1аг, Ыб.). Недавно было разработано ещё одно описание, известное как контактное описание (см. МасСаПиш с1 а1. (1996), 1. Мо1. Вю1. 5:732), которое основано на анализе доступных комплексных кристаллических структур.

Домены СЭЕ тяжёлой цепи традиционно обозначаются как Н1, Н2 и Н3, где нумерация идёт поочерёдно, в направлении от аминоконца к карбоксильному концу. СЭЕ-Н1 состоит из 10-12 остатков и начинается через четыре остатка после цистеина согласно описаниям С1ю11на и АВМ или через пять остатков согласно описанию КаЬа1. За Н1 может располагаться триптофан, триптофан-валин, триптофанизолейцин или триптофан-аланин. Согласно описанию АЬМ длина Н1 составляет приблизительно 10-12 остатков, в то время как описание С1ю11на исключает четыре последних остатка. СЭЕ-Н2 начинается через 15 остатков после Н1 согласно описаниям КаЬа! и АЬМ, непосредственно за последовательностью лейцин-глутамат-триптофан-изолейцин-глицин (известны также некоторые вариации этой последовательности), за Н2, как правило, следует последовательность лизин/аргининлейцин/изолейцин/валин/фенилаланин/треонин/аланин-треонин/серин/изолейцин/аланин. Согласно описанию КаЬа! длина Н2 составляет 16-19 остатков, в то время как описание АЬМ предполагает длину Н2, равную 12 остаткам. СЭЕ-Н3, как правило, начинается через 33 остатка после конца Н2, домену Н3 обычно предшествует последовательность аминокислот цистеин-аланин-аргинин, а непосредственно за Н3 расположен глицин. Длина Н3 составляет 3-25 остатков.

Домены СЭЕ лёгкой цепи традиционно обозначаются как Ь1, Ь2 и Ь3, где нумерация идёт поочерёдно, в направлении от аминоконца к карбоксильному концу. СЭЕ-Ы, как правило, начинается в районе 24-го остатка и обычно следует за цистеином. За СЭЕ-Ы всегда находится триптофан, являющийся первым остатком одной из следующих последовательностей: триптофан-тирозин-глютамин, триптофанлейцин-глютамин, триптофан-фенилаланин-глютамин или триптофан-тирозин-лейцин. Длина СЭЕ-Ы составляет приблизительно 10-17 остатков. СЭЕ-Е2 начинается приблизительно через 16 остатков после конца Ь1, как правило, следуя за остатками изолейцин-тирозин, валин-тирозин, изолейцин-лизин или изолейцин-фенилаланин. Длина СЭЕ-Е2 составляет приблизительно 7 остатков. СЭЕ-Е3, как правило, начинается через 33 остатка после конца Ь2 непосредственно за цистеином, а после конца Ь3, как правило, находится последовательность фенилаланин-глицин-ХХХ-глицин. Длина Ь3, как правило, составляет 7-11 остатков.

Таким образом, связывающий домен согласно настоящему описанию может содержать один домен СЭЕ3 вариабельной области антител против 1Ь-6, 1Ь-6Е, против 1Ь-6хВ либо он может содержать множество идентичных или различных СЭЕ. Согласно определённым вариантам реализации связывающие домены-антагонисты 1Ь-6 согласно настоящему описанию содержат домены У_н и У_ъ, содержащие каркасный участок и участки СЭЕ1, СЭЕ2 и СЭЕ3, где (а) домен У_н содержит последовательность аминокислот СЭЕ3 тяжёлой цепи, соответствующую одной из следующих 8Е0 ΙΌ N0: 435-496 и 805-810; или (Ь) домен У_ъ содержит последовательность аминокислот СЭЕ3 лёгкой цепи, соответствующую одной из следующих 8Е0 ΙΌ N0: 373-434 и 799-804; или (с) связывающий домен содержит последовательность аминокислот У_н согласно (а) и последовательность аминокислот У_ъ согласно (Ь); либо связывающий домен содержит последовательность аминокислот У_н согласно (а) и последовательность аминокислот У_ъ согласно (Ь), при этом У_н и У_ъ принадлежат одной и той же упомянутой последовательности. Согласно другим вариантам реализации связывающие домены согласно настоящему описанию содержат домены

- 9 019512

Ун и У_ъ, специфичные к 1Ь-6, 1Ь-6Я или комплексу 1Ь-6хЯ, включающие каркасные участки и участки СЭРЕ 0ΌΒ2 и 0ΌΒ3. где (а) домен У_н содержит последовательность аминокислот СЭРЕ СЭЯ2 и 0ΌΒ3 тяжёлой цепи, соответствующую одной из следующих 8ЕО ΙΌ N0: 435-496 и 805-810; или (В) домен У_ъ содержит последовательность аминокислот СЭРЕ СЭЯ2 и СЭЯ3 лёгкой цепи, соответствующую одной из следующих 8Е0 ΙΌ N0: 373-434 и 799-804; или (с) связывающий домен содержит последовательность аминокислот У_н согласно (а) и последовательность аминокислот У_ъ согласно (Ь); либо связывающий домен содержит последовательность аминокислот У_н согласно (а) и последовательность аминокислот У_ъ согласно (Ь), при этом У_н и У_ъ принадлежат одной и той же упомянутой последовательности. Типичные участки СЭЯ вариабельных областей лёгкой и тяжёлой цепей антагонистов 1Ь-6 приведены в 8Е0 ΙΌ N0: 1-186 и 787-792, 187-372, 793-798 соответственно. Последовательности аминокислот вариабельных участков лёгкой и тяжёлой цепей антагонистов 1Ь-6 приведены в 8Е0 ΙΌ N0: 373-434 и 799-804, 435-496, 805-810 соответственно.

Согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем изобретении и включающих определённые СЭЯ, связывающий домен антигониста 1Ь-6 может содержать (1) домен У_н, характеризующийся последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности домена У_н, описанного в 8Е0 ΙΌ N0: 435-496 и 805810, причём в каждом СЭЯ присутствует 0-3 замен аминокислот; или (й) домен У_ъ, характеризующийся последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности домена У_ь, описанного в 8Е0 ΙΌ N0: 373-434 и 799-804, причём в каждом СЭЯ присутствует 0-3 замен аминокислот; или (ш) домен У_н согласно (1) и домен У_ъ согласно (й); или домен У_н согласно (1) и домен У_ь согласно (й), причём У_н и У_ь принадлежат одной и той же упомянутой последовательности.

Согласно определённым вариантам реализации связывающий домен-антагонист 1Ь-6 согласно настоящему описанию может представлять собой иммуноглобулинподобный домен, такой как каркас иммуноглобулина. Рассматриваемые в настоящем описании каркасы иммуноглобулинов включают 5сЕу, ЕаЬ, антитела или антитела, состоящие лишь из тяжёлых цепей. Согласно другим вариантам реализации обеспечиваются анти-1Ь-6 или анти-1Ь-6хЯ антитела (например, не человеческие, такие как мышиные или крысиные, а также химерные, гуманизированные, человеческие), либо фрагменты ЕаЬ, либо фрагменты 5сЕу, характеризующиеся последовательностью аминокислот, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности аминокислот доменов У_н и У_ь, описанных в 8Е0 ΙΌ N0: 435-496 и 805-810, а также 373-434 и 799-804 соответственно. Указанная последовательность может также обладать одной или несколькими из следующих характеристик: (1) большее сродство к комплексу 1Ь-6хЯ, чем к 1Ь-6 или 1Ь-6Яа по отдельности, (2) конкурирует с мембранным или растворимым §р130 за связывание с комплексом 51Ь-6хЯ либо усиливает связывание §р130 с комплексом 51ЬВхЯ, (3) предпочтительно ингибирует передачу сигналов 1Ь-6 по типу транс, но не сигналов по типу цис и (4) не ингибирует передачу сигналов цитокинами семейства §р130, отличными от 1Ь-6. Такого рода антитела, фрагменты ЕаЬ или 5сЕу5 могут применяться в рамках любого из способов, описанных в данном изобретении. Согласно определённым вариантам реализации настоящее описание обеспечивает полипептиды, которые содержат связывающий домен, представляющий собой антагонист 1Ь-6 (т.е. который может ингибировать передачу сигналов 1Ь-6 по типу цис и транс). Согласно другим вариантам реализации антагонист 1Ь-6 согласно настоящему описанию не ингибирует передачу сигналов цитокинами семейства §р130, отличными от 1Ь-6. Типичные антагонисты 1Ь-6 включают связывающие домены, специфичные к 1Ь-6, 1Ь-6Я или 1Ь-6хЯ, такие как связывающие домены вариабельных областей иммуноглобулинов или их производные (например, антитела, фрагменты ЕаЬ, 5сЕу и т.п.)

В качестве альтернативы связывающие домены согласно настоящему описанию могут представлять собой часть каркаса, отличного от иммуноглобулинового. Другие рассматриваемые каркасы включают молекулу домена А, домен фибронектина III, антикалин, синтетическую связывающую молекулу, состоящую из повторов анкирина, аднектин, домены типа ингибитора Кунитца или аффитело к домену белка ΑΖ.

Как описано в настоящем изобретении, данное изобретение рассматривает варианты и производные связывающих доменов, такие как вариабельные участки лёгкой и тяжёлой цепей и участки СЭЯ. В одном из примеров обеспечиваются варианты вставок, в которых один или несколько остатков аминокислот дополняют последовательность аминокислот специфичного связывающего агента. Вставки могут быть расположены на любом из концов или на обоих концах белка либо во внутренних участках последовательности аминокислот сецифического связывающего агента. Различные продукты согласно данному описанию также включают зрелые специфичные связывающие агенты, т.е. специфичные связывающие агенты, лидирующие или сигнальные последовательности которых удалены таким образом, что полученные белки несут дополнительные остатки на аминоконце. Дополнительные остатки на аминоконце могут быть получены из других белков либо могут включать один или несколько остатков, происхождение которых невозможно выявить. Рассматриваются полипептиды, содержащие дополнительный остаток метионина в позиции -1, как и полипептиды согласно настоящему описанию, содержащие остатки метионина или лизина в позициях -2 и -1. Варианты с дополнительными остатками метионина, метионина

- 10 019512 лизина или лизина (либо одним или несколькими основными остатками) особенно пригодны для интенсивной продукции рекомбинантных белков в бактериальных клетках-хозяевах.

В настоящем описании аминокислоты относятся к природным (существующим в природе) аминокислотам, замещённым природным аминокислотам, неприродным аминокислотам, замещённым неприродным аминокислотам или любым их комбинациям. Обозначения природных аминокислот в настоящем описании указаны полностью либо посредством стандартного одно- или трёхбуквенного кода. Природные полярные аминокислоты включают аспарагин (Азр или Ν) и глютамин (О1п или О); основные аминокислоты включают аргинин (Аг§ или К), лизин (Ьуз или К), гистидин (Н1з или Н) и их производные; кислотные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту (Азр или Ό) и глютаминовую кислоту (О1и или Е) и их производные. Природные гидрофобные аминокислоты включают триптофан (Тгр или Ш), фенилаланин (РНе или Т), изолейцин (Не или I), лейцин (Ееи или Е), метионин (Ме! или М), валин (Уа1 или V) и их производные; к другим неполярным аминокислотам относят глицин (О1у или О), аланин (А1а или А), пролин (Рго или Р) и их производные. Природные аминокислоты средней степени полярности включают серин (8ег или 8), треонин (ТНг или Т), тирозин (Туг или Υ), цистеин (Суз или С) и их производные. Если не оговорено иначе, любая указанная в настоящем описании аминокислота может быть в Ό- или Е-конфигурации.

Замещённые варианты включают такие гибридные белки, в которых один или несколько остатков аминокислот в последовательности удалены и замещены альтернативными остатками. Согласно некоторым вариантам реализации такие замены консервативны по природе, тем не менее, к данному описанию относятся также неконсервативные замены. Аминокислоты могут быть классифицированы по физическим характеристикам и влиянию на вторичную и третичную структуру белка. В данной области техники замена классифицируется как консервативная, если замещающая аминокислота обладает характеристиками, сходными с заменяемой аминокислотой. Стандартные консервативные замены указаны в табл. 1 (см. ШО 97/09433, с. 10, опубликованной 13 марта 1997 г.).

Таблица 1

Консервативные замены I

В качестве альтернативы консервативные аминокислоты могут быть сгруппированы, как описано у кеКшпцег (В1осйеш1з1гу, 8есоп4 Εάΐίΐοη; Шог111 РиЪНзйегз, 1пс. ΝΥ:ΝΥ (1975), р. 71-77), см. табл. 2.

Таблица 2

Консервативные замены II

Боковая цепь	Характеристика	Аминокислота
		алифатические	А, 1, 1, V, Р
Неполярные (гидрофобные)	ароматические	г, νν
серосодержащие	М
		промежуточные	О
		гидроксильные	δ, т, γ
Незаряженные (полярные)	амидные	Ν, О
сульфгидрильные	с
		промежуточные	с
Положительно (основные)	заряженные		К, Р, н
Отрицательно (кислотные)	заряженные		ϋ, Е

Варианты или производные могут также содержать дополнительные остатки аминокислот, полученные в процессе применения специфических систем экспрессии. Например, применение коммерчески доступных векторов, экспрессирующих желаемый полипептид как компонент гибридного продукта с глутатион-8-трансферазой (О8Т), обеспечивает желаемый продукт, несущий дополнительный остаток глицина в позиции -1 после удаления компонента О8Т. Варианты, получаемые в результате экспрессии в других векторных системах, также рассматриваются в данном описании, включая варианты с гистидиновыми концами, внедрёнными в последовательность аминокислот, как правило, в области амино- или карбоксильного конца.

Варианты с делециями, где один или несколько остатков аминокислот в связывающем домене согласно настоящему описанию удалены, также рассматриваются в данном изобретении. Делеции могут быть осуществлены в области одного или обоих концов гибридного белка либо в центральной части последовательности аминокислот.

- 11 019512

Гибридные белки, содержащие связывающие домены-антагонисты 1Ь-6.

Как далее описано, полипептидный связывающий домен согласно настоящему изобретению может также быть частью гибридного белка, в составе которого он соединён с амино- или карбоксильным концом либо с обоими концами в качестве промежуточного домена (например, константного участка иммуноглобулина или его части). Типичные гибридные белки согласно настоящему описанию включают малые модульные иммунофармацевтические гибридные белки 8ΜΙΡ, обратнонаправленные им белки ΡΙΜ8, гибридные белки, содержащие моноспецифичные, мультивалентные связывающие домены и т.п. Один или несколько связывающих доменов могут быть внедрены в промежуточный домен посредством линкера, известного в данной области техники или описанного в данном изобретении.

В настоящем описании промежуточный домен относится к последовательности аминокислот, которая непосредственно служит как каркас для одного или нескольких связывающих доменов таким образом, что гибридные белки будут существовать главным образом (например, 50% или более в популяции гибридных белков) или в значительной степени (например, 90% или более в популяции гибридных белков) как одноцепочечные полипептиды в составе композиции. Например, определённые промежуточные домены могут обладать структурной функцией (например, функцией линкера для повышения эластичности или жёсткости) либо биологической функцией (например, повышенным периодом полужизни в плазме, например в крови человека). Типичные промежуточные домены, которые могут повысить период полужизни гибридных белков в плазме, включают альбумин, трансферрин, каркасный домен, присоединяющийся к белкам сыворотки, или подобный им белок, или их фрагменты.

Согласно предпочтительным вариантам реализации промежуточный домен мультиспецифичного гибридного белка согласно данному описанию представляет собой домен димеризации, относящийся к последовательности аминокислот, которая может способствовать ассоциации по меньшей мере двух одноцепочечных полипептидов или белков посредством нековалентных или ковалентных взаимодействий, таких как водородные связи, электростатические взаимодействия, Ван-дер-Ваальсовы силы, дисульфидные мостики, солевые мостики, гидрофобные взаимодействия и т.п., либо посредством любой их комбинации. Типичные домены димеризации включают константные области тяжёлых цепей иммуноглобулинов или их фрагменты (например, С_Н2С_Н3). Следует считать, что домены димеризации также могут способствовать формированию мультимерных комплексов более высокого уровня, включая тримеры, тетрамеры, пентамеры, гексамеры, гептамеры, октамеры и т.п.

Константный фрагмент согласно настоящему описанию относится к предпочтительной пептидной, полипептидной или белковой последовательности, соответствующей части или целой молекуле одного или нескольких константных участков иммуноглобулинов или их производным, в то время как не все домены константных участков присущи исходному антителу. Согласно некоторым вариантам реализации у доменов константных участков гибридных белков согласно настоящему описанию отсутствуют функции антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АБСС), антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза (АБСР), активации системы комплемента и комплементзависимой цитотоксичности (СБС) или такие функции присущи им в минимальной степени, в то время как такие домены не теряют способность к связыванию с некоторыми рецепторами Те (таким как ТсКп) и сохраняют относительно долгое времени полужизни ΐη νίνο. Согласно определённым вариантам реализации связывающий домен согласно данному описанию соединён с константным участком человеческого 1§С| или с его фрагментом, причём константный участок человеческого 1§С_| или его фрагмент содержит одну или несколько мутированных аминокислот: лейцин в позиции 234 (Ь234), лейцин в позиции 235 (Ь235), глицин в позиции 237 (С237), глютамат в позиции 318 (Е318), лизин в позиции 320 (К320), лизин в позиции 322 (К322) либо любой из комбинаций из вышеуказанного (согласно нумерации ЕС).

В данной области техники известны способы получения мутаций внутри домена Тс или вне его, которые могут изменить характер взаимодействия Тс с его рецепторами (СБ16, СБ32, СБ64, СБ89, ТсеКГ, ТсКп) или с компонентом системы комплемента С1с| (см., например, патент США № 5624821; Рге81а (2002), Сшт. Рйатша. Вю1есйпо1. 3:237). Определённые варианты реализации согласно настоящему описанию включают композиции, содержащие иммуноглобулины или гибридные белки, которые содержат константный участок или фрагмент человеческого 1§С. у которых способность связываться с ТсКп и белку А сохранена, а домен Тс более не взаимодействует с другими рецепторами Тс или с С1с| или взаимодействует с ними в минимальной степени. Например, связывающий домен согласно настоящему описанию может быть соединён с константным участком человеческого 1§С_| или его фрагментом, притом что аспарагин в позиции 297 (N297 согласно нумерации ЕС) заменён на другую аминокислоту для понижения вероятности гликозилирования в данном сайте или исключения такой вероятности и, таким образом, предотвращает эффективное связывание Тс с ТсуК и С1с.|. Другой типичной мутацией является Р3318, исключающая связывание с ί.Έ|, но не влияющая на связывание с Тс.

Согласно другим вариантам реализации домен Тс иммуноглобулина может характеризоваться изменённой схемой гликозилирования в сравнении со стандартной последовательностью иммуноглобулинов. Например, любая из множества генетических техник может применяться для изменения одного или нескольких определённых остатков аминокислот, формирующих сайт гликозилирования (см. Со с1 а1.

- 12 019512 (1993), Мо1. 1ттипо1, 30:1361; 1асдиетои с1 а1. (2006), 1, ТйготЬ. Наето®!, 4:1047; 8с1и.151сг с1 а1. (2005), Сапсег Кек. 65:7934; Уатоск с1 а1. (2005), Вю1сс1то1. Вюеид 92:831). В качестве альтернативы клеткихозяева, в которых продуцируются гибридные белки согласно настоящему описанию, могут быть модифицированы таким образом, чтобони продуцируют белки с изменённой моделью гликозилирования. Например, один из известных в данной области способов обеспечивает гликозилирование в виде разделённых пополам, не фукозилированных вариантов, усиливающих АЭСС. Такие варианты получают в результате экспрессии в клектах-хозяевах, содержащих ферменты, модифицирующие олигосахариды. В качестве альтернативы для уменьшения содержания фукозы в гликозилированных молекулах согласно настоящему изобретению рассматривается технология Ро1е11щеи1 компании Вю\Уа/Куо\уа Накко. Согласно одному из известных способов для продуцирования рекомбинантных иммуноглобулинов обеспечиваются клетки-хозяева линии СНО, в результате чего посредством продуцирования ГДФ-фукозы модифицируется схема гликозилирования иммуноглобулиновых фрагментов Рс.

В качестве альтернативы для изменения схемы гликозилирования гибридных белков согласно данному описанию применяются химические способы. Например, различные ингибиторы гликозидазы и/или маннозидазы обеспечивают один или несколько желаемых эффектов увеличения активности АЭСС. усиления связывания рецепторов Рс и изменения схемы гликозилирования. Согласно определённым вариантам реализации клетки, экспрессирующие гибридные белки согласно настоящему описанию, культивируются в питательной среде, содержащей модификатор углеводов в концентрации, которая повышает уровень АЭСС молекул иммуногликопротеинов, продуцируемых указанными клеткамихозяевами, притом что концентрация указанного модификатора углеводов не превышает 800 мкМ. Согласно предпочтительному варианту реализации экспрессирующие такие мультиспецифичные гибридные белки клетки культивируются в среде, содержащей кастаноспермин или кифуненсин, предпочтительно кастаноспермин в концентрации, равной 100-800 мкМ, такой как 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 или 800 мкМ. Способы изменения гликозилирования модификатором углеводов, таким как кастаноспермин, обеспечиваются в патенте США № 2009/0041756 или в заявке РСТ № УО 2008/052030.

Согласно другому варианту реализации участки Рс иммуноглобулина могут содержать модификации аминокислот, влияющие на связывание с эффекторным клеточным рецептором Рс. Такие модификации могут быть осуществлены посредством любого известного в данной области техники способа, такого как описанный у Ргейа с1 а1. (2001), Вюсйеш. 8ос. Тгапк. 50:487. Согласно другой методике для создания фрагментов константных областей, соответствующих участкам Рс, для усиления эффекторной функции уничтожения клеток доступна технология Хепсог ХшАЬ (см. Ьа/аг с1 а1. (2006), Ргос. Να11 Асаб. 8ск (И8А), 705:4005). Применяя эту технологию, например, можно получить фрагменты константных областей с улучшенными характеристиками специфичности и связывания с РСуР и, таким образом, усиленной эффекторной функцией уничтожения клеток.

Согласно другим вариантам реализации константный участок или фрагмент может дополнительно повысить время полужизни в плазме или плацентарный перенос в сравнении с соответствующим гибридным белком, лишённым указанного промежуточного домена. Согласно определённым вариантам реализации повышенное время полужизни гибридного белка в организме человека согласно настоящему описанию составляет по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 10, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48 ч, по меньшей мере несколько дней, по меньшей мере одну, две, несколько недель, по меньшей мере один, два, несколько месяцев или более.

Константный фрагмент может включать некоторые или все нижеуказанные домены: С_Н2, С_Н3 (1§А, Ι§Ό, 1§С, 1§Е или 1§М) и С_Н4 (1§Е или 1§М). Поэтому константный фрагмент, как определено в настоящем описании, относится к полипептиду, который соответствует части константного участка иммуноглобулина. Фрагмент константной области может содержать домен С_Н2 и домен С_Н3, полученные из одного и того же иммуноглобулина либо из разных иммуноглобулинов, изотипов антител или аллельных вариантов (например, оба могут представлять собой 1§С1 либо один может быть 1§6₁, а другой 1§С₂). Согласно некоторым вариантам реализации домен СН3 укорочен и содержит одну из последовательностей карбоксильного конца, описанных в заявке РСТ № УО 2007/146968 как 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 366-371 и включённых в настоящее описание посредством ссылки. Согласно определённым вариантам реализации константный фрагмент содержит домен С_Н2 и домен С_Н3, которые могут содержать линкер на аминоконце, на карбоксильном конце либо на обоих концах либо не содержать его.

Линкер представляет собой пептид, соединяющий или связывающий другие пептиды или полипептиды, такой как линкер длиной приблизительно 2-150 аминокислот. В гибридных белках согласно данному описанию линкер может соединять промежуточный домен (например, константный домен иммуноглобулина) со связывающем доменом либо линкер может соединять два вариабельных фрагмента связывающего домена. Например, линкер может представлять собой последовательность аминокислот, полученную производную или смоделированную из шарнирного участка антитела, последовательности, присоединяющей связывающий домен к рецептору, или последовательности, присоединяющей связывающий домен к трансмембранной области клеточной мембраны или к мембранному якорю. Согласно некоторым вариантам реализации линкер может содержать по меньшей мере один остаток цистеина, способный входить по меньшей мере в один из дисульфидных мостиков в физиологических условиях или

- 13 019512 других стандартных условиях для белка (например, условиях для очистки белка или для хранения белка). Согласно определённым вариантам реализации линкер, соответствующий пептиду шарнирного участка иммуногобулина или подобный ему, сохраняет цистеин, который соответствует цистеину шарнирного участка, расположенному по направлению к аминоконцу указанного шарнирного участка. Согласно другим вариантам реализации линкер получают из шарнирного участка Ι§Οι, при этом он содержит один или два остатка цистеина, соответствующих остаткам цистеина шарнирного участка. Согласно определённым вариантам реализации один или несколько дисульфидных мостиков формируются как межцепочечные дисульфидные мостики, связывающие взаимодействующие домены. Согласно другим вариантам реализации гибридные белки согласно настоящему описанию могут содержать промежуточный домен, соединённый непосредственно со связывающим доменом (т.е. в отсутствие линкера или шарнирного участка). Согласно некоторым вариантам реализации промежуточный домен представляет собой домен димеризации.

Кроме того, связывающий домен может содержать домены ν_Η и У_ь, и эти домены вариабельной области могут быть соединены линкером. Типичные домены вариабельной области включают домены, принадлежащие к семейству (С1у_п8ег), такие как (С1у₃8ег)_п(С1у₄8ег)₁, (С1у₃8ег)₁(С1у₄8ег)_п, (С1у₃8ег)_п(С1у₄8ег)_п или (С1у₄8ег)_п, где η представляет собой целое число от 1 до 5 (см., например, Линкеры 22, 29, 46, 89, 90 и 116, соответствующие 8Ер ΙΌ N0: 518, 525, 542, 585, 586 и 603 соответственно). Согласно предпочтительным вариантам реализации основанные на (С1у_п8ег) линкеры применяются для связывания вариабельных областей, но не для присоединения связывающего домена с промежуточным доменом.

Промежуточный домен или домен димеризации гибридных белков согласно настоящему описанию может быть связан с одним или несколькими дистальными или концевыми связывающими доменами посредством пептидного линкера. Помимо обеспечения функции разделения, линкер может обеспечить эластичность или жёсткость, удовлетворяющую требованиям правильного ориентирования одного или нескольких связывающих доменов гибридного белка как в составе гибридного белка, так и между гибридными белками и их мишенями. Кроме того, линкер может поддерживать экспрессию полноразмерного гибридного белка и устойчивость очищенного белка ίη νίίτο и ίη νίνο после введения нуждающемуся в этом субъекту, такому как человек, а также предпочтительно не обладает иммуногенностью или обладает слабой иммуногенностью в организме указанного субъекта. Согласно определённым вариантам реализации линкер домена димеризации гибридных белков согласно настоящему описанию может содержать часть шарнирного участка иммуноглобулина человека или целый шарнирный участок.

Типичные линкеры, применяемые для присоединения промежуточного домена (например, константная область иммуноглобулина) к связывающему домену или для связывания двух вариабельных областей связывающего домена, описаны в 8Еф ΙΌ N0: 497-604 и 823-828.

Линкеры, рассматриваемые в настоящем описании, включают, например, производные любого участка, располагающегося между доменами члена суперсемейства иммуноглобулинов (например, шарнирный участок антитела) или в стержневом участке лектинов типа С, семейства мембранных белков типа II. Указанные линкеры характеризуются длиной, приблизительно равной 2-150 аминокислотам, или приблизительно равной 2-40 аминокислотам, или приблизительно равной 8-20 аминокислотам, предпочтительно приблизительно равной 10-60 аминокислотам, более предпочтительно приблизительно равной 1030 аминокислотам и наиболее предпочтительно приблизительно равной 15-25 аминокислотам. Например, линкер 1 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 497) характеризуется длиной, равной 2 аминокислотам, а линкер 116 (8ЕС ΙΌ N0: 603) характеризуется длиной, равной 36 аминокислотам.

Оставляя в стороне общие соображения относительно длины, линкер, пригодный для использования в гибридных белках согласно настоящему описанию, включает шарнирный участок антитела, выбранный из шарнирных участков 1§С, Ι§Ά, Ι§Ό, 1§Е или их вариантов. Согласно определённым вариантам реализации линкер может представлять собой шарнирный участок антитела (верхний и коровый домены), полученный из человеческого Ι§Οι, Ι§0₂, Ι§0₃, Ι§0₄ или из их фрагментов и вариантов. В настоящем описании линкер, представляющий собой шарнирный участок иммуноглобулина, относится к аминокислотам, располагающимся между карбоксильным концом С_н и аминоконцом С_Н2 (для Ι§0, Ι§Α и Ι§Ό) или аминоконцом С_Н3 (для Ι§Ε и Ι§Μ). Шарнирный участок иммуноглобулина дикого типа согласно настоящему описанию относится к природной последовательности аминокислот, вставленной между участками С_н и С_Н2 (для Ι§0, Ι§Α и Ι§0) и соединяющей их или вставленной между участками С_Н2 и С_Н3 (для Ι§Ε и Ι§Μ) и соединяющей их, расположенной в тяжёлых цепях антител. Согласно предпочтительным вариантам реализации шарнирные участки иммуноглобулиновых последовательностей дикого типа получены из организма человека.

Согласно кристаллографическим исследованиям шарнирный участок Ι§0 может быть функционально и структурно подразделён на 3 области: верхний шарнирный домен, коровый или центральный шарнирный домен и нижний шарнирный домен (δΗίη εί а1. (1992), Ιιηιητιποί. Κεν. 130:87). Типичные верхние шарнирные домены включают ЕРК8СОКТНТ (8Е0 ΙΌ N0: 830) из Ι§Οι, ЕККССУЕ (δΕΟ ΙΌ N0: 831) из Ι§0₂, ЕРКТРРСЮТТ НТ (8ЕЕ) ΙΌ N0: 832) или ЕРК8С1)ТРРР (8ЕЕ) ΙΌ N0: 833) из Ι§0₃ и ΞδΚΥΟΡΡ АЕО ΙΌ N0: 834) из Ι§0₄. Типичные центральные шарнирные домены включают

- 14 019512

СРРСР (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 835) из 1§6ι и Ι§0₂, СРКСР (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 836) из Ι§0₃ и СР8СР (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 837) из Ι§0₄. В то время как антитела 1дО|. 1§С₂ и 1дС₄ характеризуются единственным верхним и центральным шарнирным доменом, 1д6₃ характеризуется тандемом из четырёх-одного ЕЕКТРЬСОТТ НТСРКСР (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 838) и трёх ЕРК8СЦТРРР СРКСР (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 839)·

Антитела 1дА и 1дЭ, по-видимому, лишены корового домена, подобного коровому домену 1дС, а 1дЭ, по-видимому, характеризуется тандемом из двух верхних шарнирных доменов (см. 8Εβ ΙΌ ΝΟ: 840 и 841)· Типичные верхние шарнирные домены дикого типа, присущие 1§А_| и 1дА₂, описаны в 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 842 и 843·

Антитела ΙβΕ и 1дМ, напротив, вместо типичного шарнирного участка содержат участок С_Н2, обладающий схожими с шарнирным участком свойствами. Типичные последовательности участка С_Н2 дикого типа антител ΙβΕ и 1дМ, подобные верхнему шарнирному домену, описаны в 8Εβ ΙΌ ΝΟ: 844 (УС8КЭЕТРРТ νκπ.οδδδίκ,,ι ССНЕРРТЮЕ ЕСЕХАСУТРС Ί'ΙΝΕΊΑΕΕΝΟ Ο\Λ1Ι)\Ί)Ε8ΤΑ δΤΊΌΕΟΕΕΑδ ΊΌδΕΕΊΈδΟΝ НАЬЗИКТУТС Ο\ΤΥΟ(.ι1ΕΊΕΕ И8ТККСА) и 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 845 (νΐΑΕΡΕΕΚΥδ УЕУРРКЭСЕЕ 6№КК8КЬ1С ОАТСЕ8Р1Ю1 ΟνδΑΕΚΕΟΝΟ ΥΟδΟΑΊΊΌΟν 0ΑΕΑΚΕ8ΟΕΤ ТУК\Т8ТЕТ1 ΝΕδΝΑΕΟΟδΜ ЕТСКХИНКСЕ ΤΕΌΟΝΑδδΜΕ ν₽) соответственно.

Изменённый шарнирный участок иммуноглобулина дикого типа или изменённый шарнирный участок иммуноглобулина относится к (а) шарнирному участку иммуноглобулина дикого типа, не более 30% аминокислот которого замещены (например, до 25, 20, 15, 10 или 5% аминокислот замещены или удалены), (В) части шарнирного участка иммуноглобулина дикого типа длиной по меньшей мере 10 аминокислот (например, по меньшей мере 12, 13, 14 или 15 аминокислот), не более 30% аминокислот которого замещены (например, до 25, 20, 15, 10 или 5% аминокислот замещены или удалены), или (с) части шарнирного участка иммуноглобулина дикого типа, содержащей коровый шарнирный домен (состоящей из 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот). Согласно определённым вариантам реализации один или несколько остатков цистеина шарнирного участка иммуноглобулина дикого типа, такого как шарнирный участок 1дС1, содержащего верхний и коровый шарнирные домены, могут быть замещены одним или несколькими другими остатками аминокислот (например, одним или несколькими остатками серина). Изменённый шарнирный участок иммуноглобулина может в качестве альтернативы или дополнительно содержать остаток пролина шарнирного участка иммуноглобулина дикого типа, такого как шарнирный участок 1дС_ь содержащий верхний и коровый шарнирные домены, замещённый остатком другой аминокислоты (например, остатком серина).

Альтернативные последовательности шарнирных участков и линкеров, которые могут использоваться в качестве связывающих доменов, можно также получать из частей рецепторов поверхности клеток, соединяющих Ι^ν-подобные или 1дС-подобные домены. Области между Ι^ν-подобными доменами, в случае когда рецептор поверхности клетки содержит множественные Ι^ν-подобные домены в тандеме, и 1дС-подобными доменами, когда рецептор поверхности клетки содержит множественные 1дС-подобные домены в тандеме, также могут применяться в качестве связующих участков или пептидных линкеров. Согласно определённым вариантам реализации последовательности шарнирного участка и линкера характеризуются длиной от 5 до 60 аминокислот и могут быть изначально эластичными, но также могут обеспечивать характеристики большей жёсткости, могут обладать изначально структурой αспирали с минимальной β-складчатой составляющей. Предпочтительно последовательности обладают устойчивостью в плазме и сыворотке и не чувствительны к протеолизу. Согласно некоторым вариантам реализации последовательности могут содержать природный или добавленный мотив, такой как СРРС, обладающий способностью формировать один или несколько дисульфидных мостиков для стабилизации С-конца молекулы. Согласно другим вариантам реализации последовательности могут содержать одно или несколько мест гликозилирования. Примеры шарнирных последовательностей и линкеров включают промежуточные доменные участки между 1дУ-подобными и 1дС-подобными или между 1дС-подобными и ^-подобными доменами СИ2, СИ4, СИ22, СИ33, СИ48, СИ58, СИ66, СИ80, СИ86, СИ96, СИ150, СИ166 и ΟΌ244. Альтернативные шарнирные участки также могут быть получены из содержащих дисульфиды участков рецепторов II типа, не принадлежащих к суперсемейству иммуноглобулинов, таких как СИ69, СИ72 и СИ161.

Согласно некоторым вариантам реализации линкер шарнирного участка содержит один остаток цистеина для формирования межцепочечного дисульфидного мостика. Согласно другим вариантам реализации линкер содержит два остатка цистеина для формирования межцепочечных дисульфидных мостиков. Согласно другим вариантам реализации линкер шарнирного участка получают из области иммуноглобулина, располагающейся между доменами (например, шарнирного участка антитела), или стержневого участка лектина II типа (полученного из мембранного белка II типа; см., например, последовательности типичных стержневых участков, описанные в заявке РСТ № ΑΟ 2007/146968, такие как 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 287, 289, 297, 305, 307, 309-311, 313-331, 346, 373-377, 380 или 381

- 15 019512 указанного описания), последовательности которых включены в настоящее описание посредством ссылки.

Согласно одному из аспектов гибридные белки согласно настоящему описанию содержат связывающий домен, специфичный к 1Ь-6, 1Ь-6В или 1Ь-6хВ, в форме белка 8ΜΙΡ. Способы получения белков 8ΜΙΡ описаны в настоящем описании и известны в данной области техники (см. патенты США № 2003/0133939, 2003/0118592 и 2005/0136049). Согласно определённым вариантам реализации гибридный белок содержит полипептидный связывающий домен, специфичный к комплексу 1Ь-6хВ и обладающий к нему большим сродством, чем к 1Ь-6 или 1Ь-6Ва по отдельности, и конкурирует с др130 за связывание с комплексом §1Ь-6хВ либо усиливает связывание др130 с §1Ь-6хВ, притом что в направлении от амино- к карбоксильному концу (а) полипептидный связывающий домен соединён с первым линкером, (Ь) полипептид С_Н2-домена константной области тяжёлой цепи иммуноглобулина или его фрагмент соединён со вторым линкером и (с) полипептид С_Н3-домена константной области тяжёлой цепи иммуноглобулина или его фрагмент соединён с полипептидом С_Н2-домена константной области или его фрагментом. В качестве альтернативы, структура белка 8ΜΙΡ может быть описана так: №ВП-Ь1-С_Н2С_Н3С, где N - аминоконец гибридного белка, ΒΌ - связывающий домен анти-1Ь-6хВ комплекса или 5сРу. Ь1 - линкер, С_Н2 и С_Н3 - константные участки 2 и 3 тяжёлой цепи иммуноглобулина, а С - карбоксильный конец гибридного белка. Согласно некоторым вариантам реализации линкер представляет собой (61у₄8ет)_п, где η - целое число от 1 до 6, такой как 46 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 542), или указанный линкер представляет собой шарнирный участок 1§С_|, 1дА или 1дЕ, мутированный шарнирный участок 1§С_|, содержащий 0, 1 или 2 остатка цистеина, такой как линкер 47 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 543) или линкер 80 (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 576). Согласно некоторым вариантам реализации гибридный белок соединяют посредством линкера или без него с доменом, отличным от константного участка или иммуноглобулина или его фрагмента, таким образом, что гибридный белок остаётся в композиции в большей степени или в основном в форме одноцепочечного полипептида.

Согласно другим вариантам реализации гибридный белок 8ΜΙΡ согласно данному описанию включает связывающий домен, содержащий вариабельную область лёгкой цепи, включающую последовательности ί,ΌΚΙ. СЭВ2 и СЭВ3. каждая из которых по меньшей мере на 80-100% идентична СЭВ1. ί.ΌΒ2 и СЭВ3 по меньшей мере одной вариабельной области лёгкой цепи, описанной в одной из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 373-434 и 799-804 соответственно, причём каждый СОВ содержит 0-3 замен аминокислот, и несущий вариабельную область тяжёлой цепи, включающую последовательности ί,ΌΒΙ. СЭВ2 и СЭВ3. каждая из которых по меньшей мере на 80-100% идентична ί,ΌΒΙ. СЭВ2 и СЭВ3 по меньшей мере одной вариабельной области тяжёлой цепи, описанной в одной из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 435-496 и 805-810 соответственно, причём каждый СОВ содержит 0-3 замены аминокислот. Согласно другим вариантам реализации гибридный белок 8ΜΙΡ согласно данному описанию содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную последовательности аминокислот, соответствующей одной из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 671-694, включающую лидерную пептидную последовательность или не включающую её.

Согласно другим вариантам реализации полипептиды 8ΜΙΡ могут содержать связывающий участок или домен, представляющий собой антагонист 1Ь-6, притом что передача сигналов по типу цис или транс заметно ингибируется. Согласно определённым вариантам реализации антагонист 1Ь-6 согласно настоящему описанию не ингибирует передачу сигналов цитокинами семейства др130, отличными от 1Ь-6.

Согласно другим вариантам реализации гибридные белки согласно данному описанию содержат связывающие домены-антагонисты 1Ь-6 в форме белка ΡΙΜ8, где связывающий домен расположен на карбоксильном конце гибридного белка. Концепция и способы получения белков ΡΙΜ8 описаны в заявке РСТ № \νΟ 2009/023386. Как правило, молекула ΡΙΜ8 представляет собой одноцепочечный полипептид, несущий, в направлении от амино- к карбоксильному концу, промежуточный домен (например, константная область иммуноглобулина, полученная из вышеуказанного, включает домены С_Н2 и С_Н3 одного и того же (предпочтительно) или разных видов животных, изотипов иммуноглобулинов и/или подклассов иммуноглобулинов), пептидный линкер (например, шарнирный участок иммуноглобулина) и специфический связывающий домен. Согласно некоторым вариантам реализации молекула ΡΙΜ8 также содержит расположенный на аминоконце шарнирный участок иммуноглобулина, притом что указанный шарнирный участок на аминоконце может быть идентичным или отличным от линкера, расположенного между доменом димеризации и связывающим доменом. Согласно некоторым вариантам реализации линкер на аминоконце содержит природный или добавленный мотив (такой как СРРС) для активации формирования по меньшей мере одного дисульфидного мостика для стабилизации аминоконца мультимеризованной молекулы. Таким образом, типичная схематическая организация некоторых молекул ΡΙΜ8 включает Ν-домен димеризации-линкер-связывающий домен-С или Ν-шарнирный линкер-домен димеризации-линкер-связывающий домен-С. Согласно некоторым вариантам реализации гибридный белок содержит промежуточный домен, притом что гибридный белок остаётся в большей степени или в значительной степени в форме одноцепочечного полипептида в составе композиции либо в форме димера в составе композиции.

Согласно определённым вариантам реализации гибридный белок содержит полипептидный связы

- 16 019512 вающий домен-антагонист 1Ь-6, который связывается с комплексом 1Ь-6хЕ с большим сродством, нежели с 1Ь-6 или 1Ь-6Еа по отдельности, и конкурирует с цр!3О за связывание с комплексом 81Ь-6хЕ, притом что в направлении от карбоксильного конца к аминоконцу (а) полипептидный связывающий домен соединён с первым линкером, (В) первый линкер соединён с полипептидом С_Н3-домена константной области тяжёлой цепи иммуноглобулина или его фрагментом, (с) полипептид С_Н3-домена константной области или его фрагмент соединён с полипептидом С_Н2-домена константной области или его фрагментом и (ά) полипептид С_Н2-домена константной области или его фрагмент соединён со вторым линкером. Согласно другим вариантам реализации гибридный белок ΡΙΜ8 согласно данному описанию содержит связывающий домен, несущий вариабельную область лёгкой цепи, включающую последовательности СБЕ1, СБЕ2 и СБЕ3, каждая из которых по меньшей мере на 80-100% идентична СБЕ1, СБЕ2 и СБЕ3 по меньшей мере одной вариабельной области лёгкой цепи, соответствующей одной из 8ЕО 1Б N0: 373434 и 799-804 соответственно, причём каждый СБЕ содержит 0-3 замен аминокислот, и несущий вариабельную область тяжёлой цепи, включающую последовательности СБЕ1, СБЕ2 и СБЕ3, каждая из которых по меньшей мере на 80-100% идентична СБЕ1, СБЕ2 и СБЕ3 по меньшей мере одной вариабельной области тяжёлой цепи, соответствующей одной из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 435-496 и 805-810 соответственно, причём каждый СБЕ содержит 0-3 замен аминокислот.

Согласно другим аспектам гибридные белки согласно данному описанию содержат связывающие домены, специфичные к 1Ь-6 или 1Ь-6хЕ в форме многофункциональных связывающих белков, таких как белок 8ί.ΌΡΡΙΟΝ™. Способы получения белков 8ΡΟΡΡΙΟΝ'™ описаны в настоящем изобретении и известны в данной области техники (см. заявку РСТ №. \¥О 2007/146968). Другие типичные многофункциональные гибридные белки описаны, например, в заявке на патент США № 2006/0051844 и патенте США № 7166707. Согласно определённым вариантам реализации моноспецифичный мультивалентный гибридный белок содержит первый и второй связывающие домены, первый и второй линкеры домена и димеризации, причём каждый конец домена димеризации соединён посредством линкера со связывающим доменом вариабельной области иммуноглобулина или его производного, каждый из которых специфичен к 1Ь-6хЕ, как описано в данном патенте. В качестве альтернативы структура белка 8ί.ΌΡΡΙΟΝ™ может быть описана нижеследующим образом: АВБ1-1Б-ВБ2-С, где ВБ1 - первый связывающий домен, 1Б - промежуточный домен и ВБ2 - второй связывающий домен. В некоторых таких конструкциях 1Б содержит константную область иммуноглобулина или её фрагмент, расположенный между первым и вторым связывающим доменами. Согласно другим вариантам реализации гибридный белок содержит промежуточный домен, притом что гибридный белок остаётся в большей или в значительной степени в форме одноцепочечного полипептида в составе композиции. В некоторых конструкциях 1Б представляет собой домен димеризации.

Согласно определённым вариантам реализации гибридный белок содержит по меньшей мере два полипептидных связывающих домена, специфичных к комплексу 1Ь-6хЕ, которые связываются с комплексом 1Ь-6хЕ с большим сродством, нежели с 1Ь-6 или 1Ь-6Еа по отдельности, и конкурируют с §р130 за связывание с комплексом 81Ь-6хЕ, притом что в направлении от амино- к карбоксильному концу (а) первый полипептидный связывающий домен соединён с первым линкером, (Ь) первый линкер соединён с полипептидом СН2-домена константной области тяжёлой цепи иммуноглобулина или его фрагментом, (с) полипептид СН2-домена константной области тяжёлой цепи иммуноглобулина или его фрагмент соединены с полипептидом СН3-домена константной области тяжёлой цепи иммуноглобулина или его фрагментом, (ά) полипептид С_Н3-домена константной области или его фрагмент соединены со вторым линкером и (е) второй линкер соединён со вторым полипептидным связывающим доменом. Согласно другим вариантам реализации гибридный белок 8ί.ΌΡΡΙΟΝ™ согласно данному описанию включает по меньшей мере два связывающих домена, которые независимо друг от друга содержат вариабельную область лёгкой цепи, включающую последовательности СБЕ1, СБЕ2 и СБЕ3, каждая из которых по меньшей мере на 80-100% идентична СБЕ1, СБЕ2 и СБЕ3 по меньшей мере одной вариабельной области лёгкой цепи, соответствующей одной из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 373-434 и 799-804 соответственно, где каждый СБЕ содержит 0-3 замены аминокислот, и вариабельную область тяжёлой цепи, включающую последовательности СБЕ1, СБЕ2 и СБЕ3, каждая из которых по меньшей мере на 80-100% идентична СБЕ1, СБЕ2 и СБЕ3 по меньшей мере одной вариабельной области тяжёлой цепи, соответствующей одной из 8ЕО 1Б ΝΟ: 435-496 и 805-810 соответственно, причём каждый СБЕ содержит 0-3 замен аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации линкер представляет собой (С1у₄8ег)_п, где η - целое число от 1 до 5, такой как 46 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 542). Согласно другим вариантам реализации первый или второй линкер представляет собой 1§С1, 1§А или 1§Е или мутированный шарнирный участок 1§С₁, содержащий 0, 1 или 2 остатка цистеина, такой как любой из линкеров, соответствующих 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 497-604 и 823-828.

Согласно другому аспекту стандартные мультиспецифичные гибридные белки, содержащие связывающий домен-антагонист 1Ь-6, как описано в данном патенте, могут включать по меньшей мере один связывающий участок или домен, не являющийся антагонистом 1Ь-6. Согласно определённым вариантам реализации мультиспецифичный гибридный белок содержит первый и второй связывающие домены, первый и второй линкеры и промежуточный домен, притом что один конец промежуточного домена по

- 17 019512 средством линкера соединён с первым связывающим доменом вариабельной области иммуноглобулина, специфичной к 1Ь-бхК, а другой конец посредством линкера соединён со вторым связывающим доменом, представляющим собой лигандсвязывающий эктодомен рецептора, такой как эктодомен рецептора интерлейкина, эктодомен рецептора фактора роста (например, ТСЕК) или эктодомен рецептора суперсемейства факторов некроза опухолей (Т№8ЕК). Согласно некоторым вариантам реализации используется лишь часть эктодомена. В частности, используются участвующие в связывании лиганда участки эктодомена. Подразумевается, например, что домен-антагонист ФНО-α (ΤΝΕ-α) может находиться на аминоконце, а связывающий домен-антагонист 1Ь-б может находиться на карбоксильном конце гибридного белка либо связывающий домен-антагонист 1Ь-б может находиться на аминоконце, а домен-антагонист ΦΗΟ-α (ΪΝΕ-а) может находиться на карбоксильном конце. Как описано в данном патенте, связывающие домены согласно настоящему описанию могут быть соединены с каждым концом промежуточным доменом (например, константной области иммуноглобулина или её фрагмента, такого как С_Н2С_Н3 Ι§Οι). Более того, каждый их двух или более связывающих доменов может быть присоединён к промежуточному домену посредством одного и того же или различных линкеров, известных в данной области техники или описанных в настоящем изобретении.

Типичные структуры таких мультиспецифичных гибридных белков, обозначаемых в данном описании как молекулы ХсерТог, включают Ν-ΒΌ-ΙΌ-ΕΌ-С, Ν-ΕΌ-ΙΌ-ΒΌ-С, Ν-ΕΌ1-ΙΌ-ΕΌ2-0 где ΒΌ - иммуноглобулиновый или иммуноглобулиноподобный связывающий домен вариабельной области, ΙΌ - промежуточный домен, ΕΌ - лигандсвязывающий домен, такой как рецептор эктодомена, семафориновый домен и т.п. В некоторых конструкциях ΙΌ представляет собой домен димеризации. В некоторых конструкциях ΙΌ может содержать константную область иммуноглобулина или её фрагмент, расположенный между первым и вторым связывающими доменами. Согласно другим вариантам реализации гибридный белок содержит промежуточный домен, притом что гибридный белок остаётся в большей степени или в значительной степени в форме одноцепочечного полипептида в составе композиции.

Согласно некоторым вариантам реализации мультиспецифичный гибридный белок согласно данному описанию содержит антагонист ΦΗΟ-α, который включает эктодомен Т№К8Е или его фрагмент, такой как цистеин-богатый домен СКЭ1, СКЭ2, СКЭ3, 50' ФНО-связывающий петельный домен, 90' ФНО-связывающий петельный домен или любую их комбинацию. Например, антагонист ΦΗΟ-α может содержать эктодомен Т№К8Е1А, как описано в 8ЕЦ ΙΌ N0: 696 (включая или исключая нативную лидерную пептидную последовательность, содержащуюся в указанной последовательности), либо эктодомен ΕΝΕΚ8Ε1Β, как описано в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 695 (включая или исключая нативную лидерную пептидную последовательность, содержащуюся в указанной последовательности).

Согласно определённым вариантам реализации гибридный белок содержит (а) полипептидный связывающий домен, специфичный к комплксу ГБ-бхВ, который связывается с ГБ-бхВ с большим сродством, чем с ГЪ-б или ББ-бКа по отдельности, и конкурирует с §р130 за связывание с комплексом зГБ-бхК либо усиливает связывание §р130 с комплексом зВБ-бхК и (В) полипептидный связывающий домен, содержащий эктодомен ΕΝΕΚ8Ε1Β, притом что в направлении от амино- к карбоксильному концу (а) анти-ВБ-бхК связывающий домен или эктодомен ΕΝΕΚ8Ε1Β соединены с первым линкером, (В) первый линкер соединён с полипептидом С_Н2-домена константной области тяжёлой цепи иммуноглобулина или его фрагментом, (с) полипептид С_Н2-домена константной области или его фрагмент соединены с полипептид С_нз-домена константной области тяжёлой цепи иммуноглобулина или его фрагментом, (ά) полипептид С_Н3-домена константной области или его фрагмент соединены со вторым линкером, (е) второй линкер соединён с анти-Ш-бхВ связывающим доменом или эктодоменом ΕΝΕΚ8Ε1Β. Согласно определённым вариантам реализации мультиспецифичный гибридный белок ХсерТог согласно данному описанию содержит ΙΕ-бхК-связывающий домен, включающий вариабельную область лёгкой цепи, включающую последовательности СОК1, СЭВ2 и СОК3, каждая из которых по меньшей мере на 80-100% идентична СОК1, СЭВ2 и СЭВ3 по меньшей мере одной вариабельной области лёгкой цепи, соответствующей одной из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 373-434 и 799-804 соответственно, причём каждый СОК содержит 0-3 замен аминокислот, и вариабельную область тяжёлой цепи, включающую последовательности СОК1, СЭВ2 и СОК3, каждая из которых по меньшей мере на 80-100% идентична СОК1, СЭВ2 и СЭВ3 по меньшей мере одной вариабельной области тяжёлой цепи, соответствующей одной из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 435-496 и 805810 соответственно, причём каждый СОК содержит 0-3 замен аминокислот. Согласно сходному варианту реализации эктодомен ΕΝΕΚ8Ε1Β содержит последовательность аминокислот, соответствующую 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 695, при условии, что лидерная пептидная последовательность не включена. Согласно другим вариантам реализации гибридный белок ХсерТог согласно данному описанию характеризуется последовательностью аминокислот по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной одной из последовательностей, соответствующих 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 607-668, включая или исключая лидерную пептидную последовательность, притом что каждый СОК содержит 0-3 замен аминокислот.

- 18 019512

В целом, такие конструкции содержат эктодомен рецептора I типа на аминоконце либо эктодомен рецептора II типа на карбоксильном конце мультиспецифичного гибридного белка согласно настоящему изобретению. Примером конструкции, содержащей эктодомен рецептора I типа, является конструкция, содержащая эктодомен рецептора суперсемейства фактора некроза опухолей (ΤΝΕΚ8Ε) на аминоконце и эктодомен связывающего домена комплекса 1Ь-6хК на карбоксильном конце. Неожиданно, конструкция с эктодоменом рецептора I типа, содержащая эктодомен ΤΝΕΚ8Ε на карбоксильном конце, также оказалась функциональной (см. 8ЕЭ ΙΌ N0: 669 и 670).

В случае с полипептидом согласно настоящему изобретению, содержащим множественные связывающие домены, например связывающий домен-1 (ΒΌ1) и связывающий домен-2 (ΒΌ2), один из которых, например, представляет собой анти-1Ь-6хК, низкое значение к_ОЕЕ максимально увеличивает ингибиторную активность и концентрацию полипептида или гибридного белка согласно настоящему изобретению, присоединяющихся по всем валентным положениям, таким образом, что диапазон концентрации в отношении форм полипептида или гибридного белка, в которых взаимодействует лишь ΒΌ1 или ΒΌ2, расширяется (см. Регейоп (1980), Ма111. Вюкст 49:87). Также определённый интерес может представлять отбор связывающих доменов с высоким значением к_ОЕЕ. Например, высокий к_ОЕЕ может быть желателен для рецептора, у которого короткое время нахождения в комплексе предпочтительно для получения желаемого фенотипа передачи сигнала (см. Майш с1 а1. (1994), Ргос. ΝαΙΙ. Асаб. 8с1. (И8А), 91:12862; Ьуопк с1 а1. (1996), Ιιηιηιιηίΐν. 5:53). Специалист в данной области техники понимает, что для композиции, содержащей два связывающих домена, например молекулы 80ΌΚΡΙΟΝ™. как описано в данном патенте, возможно независимо контролировать к_ОЕЕ доменов ΒΌ1 и ΒΌ2. В качестве другого, не ограничивающего настоящее изобретение примера, желательно, чтобы значение к_0ЕЕ для одного связывающего домена было очень низким, а для другого связывающего домена относительно высоким. Это может позволить мультиспецифичному связывающему полипептиду, присоединившемуся к молекуле-мишени, долгое время находиться на клеточной поверхности, соответственно характеризующемуся низким к_ОЕЕ связывающемуся домену, в то же время последовательно взаимодействуя с молекулами-мишенями, соответствующими связывающему домену с высоким к_ОЕЕ. Это может усиливать передачу сигналов при низких концентрациях белка 8СОКРЮ№™ (см. Ка1ег§й с1 а1. (2001), №Ш1гс Iшюиηо1. 2:229). Специалист в данной области техники понимает, что к_ОЕЕ может быть изменён посредством модификации связывающих доменов или посредством отбора связывающих доменов, обладающих желаемыми кинетическими характеристиками (см. 8и с1 а1. (2007), 1. Iшюиηо1. Мс11юб5. 322:94; 81еикег§ с1 а1. (2006), 1. Iшюиηо1. Мс11юб5. 310:126; ктпшип е1 а1. (2001), Ргос. ΝαϊΙ. Асаб. 8ск (И8А), 98:75).

Для эффективной продукции любого из полипептидных связывающих доменов или гибридных белков согласно настоящему изобретению лидерная пептидная последовательность используется для улучшения секреции экспрессируемых полипептидов или гибридных белков. Предполагается, что применение любой из стандартных лидерных пептидных последовательностей (сигнальных последовательностей) будет направлять вновь экспрессируемые полипептиды или гибридные белки в секреторный путь, в результате чего лидерная пептидная последовательность отщепляется от зрелого полипептида или гибридного белка в точке соединения лидирующей пептидной последовательности и полипептида или гибридного белк, либо непосредственно вблизи неё. Конкретные лидерные пептидные последовательности отбираются, основываясь на критериях, известных в данной области техники, таких как применение последовательностей, кодируемых полинуклеотидами, которые позволяют беспрепятственно добавить сайт расщепления рестрикционных эндонуклеаз в начале или в конце кодирующих последовательностей для того, чтобы лидерные пептидные последовательности могли облегчить молекулярную модификацию, при условии, что указанные внедрённые последовательности характеризуются аминокислотами, которые не оказывают нежелательного влияния на ожидаемое отщепление лидирующих пептидных последовательностей от вновь экспрессируемых белков и не оказывают нежелательного влияния на любую из ожидаемых функций полипептидов или гибридных белков, в случае если лидирующая пептидная последовательность не отщепляется в процессе созревания полипептидов или гибридных белков. Типичные лидерные пептидные последовательности согласно настоящему изобретению включают природные и иные лидерные последовательности, такие как НзN-М^Е^V^IЕ8Е^^I8А8VIМ8К6(X)_η-СΟ₂Н, где X - любая аминокислота и п - целое число от 0 до 3 (8ЕЭ Ю NΟ: 785) либо Нз^МЕАРАрЬЬЕЬЬЬЬ4ЬРПТТ6-СО₂Н (8ЕО II) ^: 786).

Согласно определённым иллюстративным вариантам реализации указанный белок подвергается гликозилированию, при том что схема гликозилирования зависит от различных факторов, включая клетку-хозяина, в которой данный белок экспрессируется (если белок получают в рекомбинантных клеткаххозяевах), и условия культивирования.

Настоящее описание также обеспечивает производные связывающих доменов согласно настоящему изобретению, а также гибридных белков, содержащих указанные связывающие домены. Производные включают специфические полипептидные связывающие агенты, характеризующиеся модификациями, отличными от вставок, делеций и замещений аминокислотных остатков. Предпочтительно модификации являются ковалентными по природе и включают, например, химические связи с полимерами, липидами,

- 19 019512 другими органическими и неорганическими агентами. Производные согласно настоящему изобретению могут быть получены для увеличения времени полужизни циркулирования специфических пептидных связывающих агентов или для улучшения характеристик направленности полипептидов на желаемые клетки, ткани или органы.

Согласно определённым вариантам реализации время полужизни ίη у1уо полипептидных связывающих доменов или гибридных белков согласно данному описанию может быть увеличено известными в данной области техники способами увеличения времени полужизни больших молекул. Например, данное описание подразумевает, что ковалентно модифицированные или являющиеся производными гибридные белки включают одну или несколько водорастворимых составляющих, таких как полиэтиленгликоль, полиоксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль (см., например, патенты США № 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192; 4179337). Другие полимеры, которые могут использоваться и известны в данной области техники, включают монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу и другие полимеры на основе углеводов, поли(И-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры оксида полипропилена/оксида полиэтилена, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) и поливиниловые спирты, а также смеси указанных полимеров. Особенно предпочтительны белки-производные полиэтиленгликоля (РЕС). Водорастворимые полимеры могут быть присоединены по специфическим позициям, например, на аминоконцах белков и полипептидов согласно настоящему описанию либо произвольно присоединены к одной или нескольким боковым цепям полипептидов. Применение РЕС для улучшения терапевтических характеристик описано в патенте США № 6133426.

Указанные способы также включают создание гибридных белков, в которых связывающие домены соединены с белками, обеспечивающими более длительное время полужизни гибридным белкам, чем связывающие домены сами по себе. Такие гибридные белки могут включать белки, которые сами присоединяются к белкам, обладающим длительным временем полужизни, например иммуноглобулину, домену Ес иммуноглобулинов, трансферрину, С-белку стрептококка или альбумину. Указанные гибридные продукты связывающих доменов с устойчивыми белками плазмы описаны, например, в патентах США № 5428130, 5116964.

Конкретный вариант реализации настоящего изобретения представляет собой гибридный белок, содержащий иммуноглобулин или Ес. Такой гибридный белок может обладать длительным временем полужизни, например в пределах нескольких часов, суток и более или даже недели и более, особенно если домен Ес способен взаимодействовать с ЕсЯп, неонатальным рецептором Ес. Сайт связывания ЕсЯп домена Ес также является сайтом связывания бактериальных белков А и С. Прочная связь между этими белками может использоваться в способе выделения антител или гибридных белков согласно настоящему изобретению посредством, например, аффинной хроматографии с белком А или белком С в процессе очистки белка.

Способы очистки белка хорошо известны специалисту в данной области техники. Эти способы включают, на одном из этапов, грубое разделение полипептидных и неполипептидных фракций. Часто желательна дальнейшая очистка с применением хроматографии и электрофореза для достижения частичной или полной очистки (либо очистки до получения однородного продукта). К аналитическим способам, особенно применимым для получения чистого гибридного белка, относят ионообменную хроматографию, вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию), электрофорез в полиакриламидном геле и изоэлектрическое фокусирование. К особо эффективным способам очистки пептидов относят скоростную белковую жидкостную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию (НРЬС).

Определённые аспекты настоящего изобретения относятся к очистке и согласно отдельным вариантам реализации существенной очистке полипептидов согласно данному описанию. Термин очищенный согласно данному описанию относится к композиции, которую можно отделить от других компонентов, где гибридный белок очищен в любой степени в сравнении с его образцами, полученными естественным путём. Поэтому очищенный белок также относится к указанному белку, изолированному от компонентов среды, в которой он находится в естественных условиях.

Как правило, очищенный относится к полипептидной композиции, подвергшейся фракционированию для удаления различных иных компонентов, притом что указанная композиция в существенной степени сохраняет присущую ей биологическую активность, представляющую интерес. Термин очищенный в существенной степени относится к белковой композиции связывающего домена, в которой белок составляет основной компонент композиции, например составляя приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 99% композиции по массе.

Различные способы количественного определения степени очистки известны специалисту в данной области техники в свете настоящего описания. Указанные способы включают, например, определение специфической связывающей активности активной фракции или определение количества белка в фракции посредством электрофореза на полиакриловом геле в присутствии додецилсульфата натрия (БЭБ/РАСЕ). Предпочтительный способ определения степени очистки белковой фракции заключается в вычислении связывающей активности фракции для сравнения со связывающей активностью первичного

- 20 019512 экстракта и, таким образом, вычисления степени очистки, согласно данному описанию обозначаемой как очистка Ν-й степени. Фактические единицы, применяемые для выражения степени связывающей активности, безусловно, будут зависеть от конкретной выбранной методики, осуществляемой после очистки, и от того, проявляет ли экспрессируемый белок заметную связывающую активность.

Различные способы, применимые при очистке белков, хорошо известны специалисту в данной области техники. К ним относят, например, осаждение с сульфатом аммония, РЕС, антителами и т.п. либо посредством денатурирования при нагревании и последующего центрифугирования; хроматографические стадии, такие как ионный обмен, гель-фильтрация, хроматография с обращенной фазой, хроматография с гидроксиапатитом, аффинная хроматография; изоэлектрическое фокусирование; гельэлектрофорез; а также комбинации этих и других способов. Как, в целом, известно в данной области, порядок осуществления различных стадий очистки может меняться либо некоторые стадии могут пропускаться, тем не менее, результатом окажется применимый способ получения существенно очищенного белка.

Полинуклеотиды, векторы экспрессии и клетки-хозяева.

Данное описание обеспечивает полинуклеотиды (изолированные, очищенные или чистые полинуклеотиды), кодирующие гибридные белки согласно настоящему изобретению, векторы (включая векторы клонирования и экспрессии), содержащие указанные полинуклеотиды, и клетки (например, клеткихозяева), трансформированные или трансфицированные полинуклеотидами или векторами согласно настоящему изобретению.

Согласно определённым вариантам реализации подразумевается полинуклеотид (ДНК или РНК), кодирующий связывающий домен согласно настоящему изобретению или гибридный белок, содержащий один или несколько таких связывающих доменов. Кассеты экспрессии, кодирующие конструкции 8М1Р и ХсерТот, обеспечиваются в примерах, приведённых в данном описании.

Настоящее изобретение также относится к векторам, которые включают полинуклеотид согласно настоящему описанию, и, в частности, к рекомбинантным экспрессируемым конструкциям. Согласно одному из вариантов реализации настоящее описание подразумевает вектор, содержащий полинуклеотид, который кодирует связывающий домен согласно настоящему изобретению или полипептид, который содержит указанный связывающий домен, например 8М1Р, Р1М8, 8СОКР1ОН ХссрЮт или другой моно-, би- или многофункциональный гибридный белок наряду с другими полинуклеотидными последовательностями, которые активируют или способствуют транскрипции, трансляции и процессингу указанных кодирующих связывающие домены последовательностей.

Подходящие векторы клонирования и экспрессии для использования в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны, например, у 8атЬтоок εΐ а1., Мо1еси1ат С1ошпд: А ЬаЬотаТоту Мапиа1, 8есоп6 Ебйюп, Со16 8ртшд НатЬот, ΝΥ (1989). Типичные векторы клонирования/экспрессии включают векторы клонирования, челночные векторы и экспрессионные конструкции, которые могут быть производными плазмид, фагмид, фазмид, космид, вирусов, искусственных хромосом или любых переносчиков нуклеиновых кислот, известных в данной области техники и применимых для амплификации, переноса и/или экспрессии полинуклеотидов согласно настоящему описанию.

В настоящем описании вектор означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Типичные векторы включают плазмиды, дрожжевые искусственные хромосомы и вирусные геномы. Определённые векторы могут автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в то время как другие могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, определённые векторы обозначаются согласно данному описанию как рекомбинантные векторы экспрессии (или просто векторы экспрессии), которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанные с последовательностью контроля экспрессии и поэтому способны управлять экспрессией указанных последовательностей.

Согласно определённым вариантам реализации экспрессионные конструкции представляют собой производные плазмидных векторов. Иллюстративные конструкции включают модифицированный вектор ρΝΑδδ (С1оп1сс11, Ра1о А11о, СА), последовательности нуклеиновых кислот которого кодируют ген устойчивости к ампициллину, полиаденилирующий сигнал и сайт промотора Т7; рБЕТ38 и ρNЕТ38 (СМС 1СО8 Вю1ощс5, 1пс.), содержащие промотор СНЕТ1; и рБ18 (Бонха), содержащий промотор цитомегаловируса (СМУ). Другие подходящие векторы экспрессии хорошо известны (см., например, Ан5нЬс1 εΐ а1., 1995; 8ашЬтоок εΐ а1., кирта; см. также, например, каталоги 1пуЦто§сп, 8ап Б1едо, СА; №уа§сп, МабЦоп, ^1; Рйатшаша, РЦсаТатау, N1). Кроме того, можно синтезировать подходящие конструкции, которые включают последовательность, кодирующую дигидрофолатредуктазу (БНТК) под соответствующим регуляторным контролем, для способствования увеличению уровня продукции гибридных белков, где уровень продукции повышается вследствие амплификации генов после введения соответствующего селективного агента (например, метотрексата).

Как правило, рекомбинантные векторы экспрессии включают точки начала репликации и маркеры селекции, позволяющие трансформировать клетку-хозяина, а также промотор сильно экспрессируемого гена для управления транскрипцией структурной последовательности, расположенной по ходу транс

- 21 019512 крипции, как описано выше. Вектор, функционально связанный с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению, представляет собой клонируемую или экспрессируемую конструкцию.

Типичные клонируемые/экспрессируемые конструкции содержат по меньшей мере один элемент контроля экспрессии, например промотор, функционально связанный с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению. В данном описании подразумевается, что дополнительные элементы контроля экспрессии, такие как энхансеры, фактор-специфичные сайты присоединения, терминаторы и сайты связывания рибосом, также включены в векторы и клонируемые/экспрессируемые конструкции. Гетерологичные структурные последовательности полинуклеотидов согласно настоящему изобретению скомбинированы надлежащим образом с последовательностями инициации и терминации трансляции. Таким образом, например, кодирующие гибридные белки нуклеиновые кислоты согласно данному описанию могут быть включены в любую из различных экспрессируемых векторных конструкций как рекомбинантные экспрессируемые конструкции для экспрессии указанных белков в клетке-хозяине.

Соответствующие последовательности ДНК могут быть интегрированы в вектор различными способами. Как правило, последовательность ДНК вставляется в соответствующий распознаваемый рестрикционной эндонуклеазой сайт посредством известных в данной области техники процедур. Настоящее изобретение подразумевает стандартные способы клонирования, выделения, амплификации и очистки ДНК для ферментативных реакций, в которых участвуют ДНК-лигазы, ДНК-полимеразы, рестрикционные эндонуклеазы и т.п., а также стандартно применяемые способы разделения. Некоторые стандартные способы описаны, например, у АикиЬс! εΐ а1. (1993), Сштей РгоЮсо1к ш Мо1еси1аг В1о1оду, Сгеепе РиЫ. Аккос. 1пс. & Йо1т \Уйсу & 8оп§, 1пс., ВокЮп, МА; ЗатЬгоок εΐ а1. (1989), Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопй Ей., Со1й 8рппд ИагЬог ЬаЬогаЮгу, ΡΙ;·ιίηνίε\ν. N4; МашаПк εΐ а1. (1982), Мо1еси1аг С1ошпд, Со1й 8рппд ИагЬог ЬаЬогаТогу, ΡΐΑΐηνίεν, N4; С1оуег (Ей.) (1985), ЭНА С1оп1пд. Уо1. I апй II, 1КЬ Ргекк, 0х£огй, ИК; Иатск апй Шддтк (Ейк.) (1985), ШсШс Ас1й ΗγΜ^/ΑΐΜη, 1КЬ Ргекк, 0х£огй, ИК и т.п.

Последовательность ДНК в векторе экспрессии функционально связана по меньшей мере с одной соответствующей последовательностью контроля экспрессии (например, конститутивным или регулируемым промотором) для управления синтезом мРНК. Характерные примеры указанных последовательностей контроля экспрессии включают промоторы эукариотических клеток или их вирусов, как описано выше. Промоторные участки могут быть взяты из любого желаемого гена с помощью векторов с САТ (хлорамфениколтрансферазой) или других векторов с маркерами селекции. Эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор цитомегаловируса, промотор тимидинкиназы вируса герпеса, ранний и поздний промоторы вируса 8У40, промоторы длинных концевых повторов ретровирусов и промотор мышиного металлотионеина-1. Выбор соответствующего вектора и промотора полностью определяется специалистом в данной области техники, а синтез определённых особенно предпочтительных рекомбинантных экспрессируемых конструкций, содержащих по меньшей мере один промотор или регулируемый промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, которая кодирует белок или полипептид согласно настоящему изобретению, описан в данном патенте.

Также данным описанием подразумеваются варианты полинуклеотидов. Варианты полинуклеотидов по меньшей мере на 90% и предпочтительно на 95, 99 или 99,9% идентичны одному из полинуклеотидов с определённой последовательностью, описанной в данном патенте, либо полинуклеотиду, который гибридизируется с одним из указанных полинуклеотидов с определённой последовательностью в жёстких условиях гибридизации: 0.015 М хлорида натрия, 0.0015М цитрата натрия приблизительно при 65-68^оС либо 0.015 М хлорида натрия, 0.0015 М цитрата натрия и 50% формамида приблизительно при 42°С. Указанные варианты полинуклеотидов сохраняют способность кодировать связывающий домен или соответствующий гибридный белок и обладающий функциями, описанными в данном изобретении.

Термин жёсткие относится к условиям, как правило, определённым в данной области техники как жёсткие. Жёсткость гибридизации в первую очередь определяется температурой, концентрацией ионов и концентрацией денатурирующих агентов, таких как формамид. Примеры жёстких условий гибридизации и отмывки включают: 0.015 М хлорида натрия, 0.0015 М цитрата натрия приблизительно при 65-68°С, либо 0.015 М хлорида натрия, 0.0015 М цитрата натрия и 50% формамида приблизительно при 42°С (см. ЗашЬгоок εΐ а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаТогу Мапиа1, 2'¹ Ей., Со1й 8рппд ИагЬог ЬаЬогаТогу, Со1й 8рппд ШЛос N.4. 1989).

Также могут применяться более жёсткие условия (такие как более высокая температура, пониженная концентрация ионов, повышенная концентрация формамида или другого денатурирующего агента); однако в таком случае скорость гибридизации изменится. В случаях, когда рассматривается гибридизация дезоксиолигонуклеотидов, дополнительные типичные жёсткие условия гибридизации включают отмывку буфером 6х88С, 0.05% пирофосфата натрия при 37°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 14 оснований), 48°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 17 оснований), 55°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 20 оснований) и 60°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 23 оснований).

Другой аспект согласно данному описанию обеспечивает клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные (либо содержащие каким-либо другим образом) любой из полинуклеотидов или векторов/экспрессируемых конструктов согласно настоящему изобретению. Полинуклеотиды или клонируемые/экспрессируемые конструкции согласно настоящему изобретению вводятся в соответствующие

- 22 019512 клетки любым из способов, известных в данной области, включая трансформацию, трансфекцию или трансдукцию. Клетки-хозяева включают клетки субъекта, подвергшиеся клеточной терапии ех νίνο, например генной терапии ех νίνο. Эукариотические клетки-хозяева, подразумеваемые как один из аспектов данного описания в случае, если они содержат полинуклеотид, вектор или белок согласно настоящему изобретению, включают, помимо собственных клеток субъекта (например, собственные клетки пациента-человека), клетки УЕЯ0, неЬа, клеточные линии яичников китайских хомячков (СНО) (включая модифицированные клетки СНО, способные к модификации схемы гликозилирования экспрессируемых мультивалентных связывающих молекул, см. заявку на патент США № 2003/0115614), клетки С08 (такие как С08-7), №138, ВнК, нер62, 3Т3, ЯШ, МЭСК, А549, РС12, К562, нЕК293, нер62, ^клетки, клетки 3Т3, клетки 8ро6ор1сга Ггищрсгба (например, 8£9), 8ассйаготусе5 ссгсуыас и любые другие эукариотические клетки, известные в данной области техники как применимые для экспрессии и, возможно, выделения белков или пептидов согласно настоящему изобретению. Кроме того, данное описание подразумевает прокариотические клетки, включая ЕксйепсШа сой, ВасШиз зиЫШз, 8а1тоие11а ТурШтигшт, стрептомицеты или любые другие прокариотические клетки, известные в данной области техники как применимые для экспрессии и, возможно, выделения белков или пептидов согласно настоящему изобретению. В процессе выделения белка или пептида из прокариотических клеток, в частности, подразумевается, что могут применяться способы выделения белка из телец включения, известные в данной области техники. Выбор соответствующего хозяина находится в пределах уровня знаний специалиста в данной области техники в соответствии с рекомендациями, описанными в настоящем описании. В частности, подразумеваются клетки-хозяева, гликозилирующие гибридные белки согласно настоящему изобретению.

Термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) относится к клеткам, содержащим рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что такого рода термины должны относиться не только к определённым клеткам субъекта, но и к потомству таких клеток. Так как определённые модификации могут появиться в последующих поколениях ввиду мутаций или влияния среды, такого рода потомство может не быть фактически идентичным материнской клетке, но тем не менее включено в рамки значения термина клетка-хозяин, применяемого в данном описании.

Рекомбинантные клетки-хозяева могут культивироваться в стандартной питательной среде, соответственно модифицированной для активации промоторов, отбора трансформированных клеток или амплификации определённых генов. Условия культивирования определённых клеток-хозяев, отобранных для экспрессии, такие как температура, рН и т.п., очевидны для специалиста в данной области техники. Различные системы культур клеток млекопитающих могут также применяться для экспрессии рекомбинантных белков. Примеры систем культур клеток млекопитающих включают линии С08-7 фибробластов почек обезьян, описанные у С1ихтап (1981), Се11. 23:175, и другие клеточные линии, способные экспрессировать совместимый вектор, например клеточные линии С127, 3Т3, СНО, неЬа и ВнК. Векторы экспрессии в млекопитающих содержат точку начала репликации, соответствующий промотор и, возможно, энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сайты полиаденилирования, донорские и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, например, подобные описанным в данном описании в отношении синтеза экспрессируемых конструкций мультивалентных связывающих белков. Последовательности ДНК, полученные из сайтов сплайсинга 8У40, и последовательности полиаденилирования могут применяться для обеспечения необходимых нетранскрибируемых генетических элементов. Введение конструкций в клетки-хозяева может осуществляться различными способами, известными специалистам в данной области техники, включая трансфекцию с фосфатом кальция, диэтиламиноэтилдекстран-опосредованную трансфекцию или электропорацию (Όηνίδ с1 а1. (1986), Ваис МеШобз ίη Мо1еси1аг Вю1о§у).

Согласно одному из вариантов реализации клетка-хозяин трансдуцируется рекомбинированной вирусной конструкцией, управляющей экспрессией белка или полипептида согласно данному описанию. Трансдуцированные клетки-хозяева продуцируют вирусные частицы, которые содержат экспрессированный белок или полипептид, полученный из частей мембраны клетки-хозяина и внедрённый вирусными частицами в процессе размножения вируса.

Применяемые композиции и способы.

При лечении человека или другого животного, страдающего от ассоциированного с передачей сигналов Ш-6 по типу транс патологического состояния, связывающий домен согласно настоящему изобретению, как правило, внедряют в более крупный белок, как описано выше, и затем вводят субъекту в количестве, эффективном для улучшения симптомов патологического состояния, с последующим курсом из одного или нескольких введений. Являясь полипептидами, белки согласно настоящему изобретению могут быть ресуспендированы или растворены в фармацевтически приемлемом растворителе, возможно, содержащем стабилизирующий агент или другое фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, которое может применяться при внутривенном введении путём инъекции или инфузии, как более подробно описано ниже.

- 23 019512

Фармацевтически эффективная доза представляет собой дозу, необходимую для предотвращения, ингибирования появления или лечения (улучшения какого-либо симптома в определённой степени, предпочтительно всех симптомов) патологического состояния. Фармацевтически эффективная доза зависит от типа заболевания, применяемой композиции, пути введения, типа субъекта, подвергающегося лечению, физического состояния данного субъекта, подлежащего лечению, сопутствующего лечения и других факторов, определяемых специалистами в области медицины. Например, количество от 0.1 до 100 мг/кг веса тела (которое может вводиться одной дозой, ежедневно, еженедельно, ежемесячно или через любой соответствующий временной интервал) активного ингредиента может вводиться в зависимости от эффективности полипептидного связывающего домена или гибридного белка согласно настоящему изобретению.

Согласно определённым вариантам реализации передача сигналов 1Ь-6 по типу цис ингибируется в минимальной степени или не ингибируется вообще, т.е. любое ингибирование передачи сигналов по типу цис несущественно, что означает, что указанное ингибирование отсутствует, не изменяет симптомы или не выявляется. Степень ингибирования передачи сигналов 1Ь-6 по типу транс может меняться, но, как правило, передача сигналов по типу транс меняется в такой мере, что оказывает положительное влияние на симптомы патологического состояния, опосредованного или ассоциированного с указанной передачей сигналов. Согласно определённым вариантам реализации ингибирование передачи сигналов 1Ь-6 по типу транс посредством полипептидных связывающих доменов или гибридных белков согласно настоящему изобретению может замедлить, остановить или обратить прогрессирование заболевания.

Композиции согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения патологических состояний человека и других животных, опосредуемых передачей сигналов 1Ь-6. Считается, что усиленное продуцирование 1Ь-6 и, таким образом, усиленная передача сигналов 1Ь-6 вовлечены в различные патологические процессы, включая болезнь Альцгеймера, аутоиммунные заболевания (как, например, ревматоидный артрит, красная волчанка), воспалительные реакции, инфаркт миокарда, болезнь Педжета, остеопороз, твёрдые опухоли (как, например, рак толстой кишки, почечно-клеточная карцинома (ЕСС), рак простаты и рак мочевого пузыря), определённые злокачественные опухоли нервной ткани, В-клеточные злокачественные опухоли (например, синдром Каслмана, некоторые подтипы лимфомы, хроническую лимфоцитарную лейкемию (СЬЬ) и, в частности, множественную миелому). В некоторых случаях 1Ь-6 вовлечён в пролиферативные пути, так как этот цитокин действует наряду с другими факторами, такими как гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (ГС-ЭФР) и фактор роста гепатоцитов (см., например, Сгап1 εΐ а1. (2002), 0псодепе, 21:460; ВабасЬе апб нупек (2001), Сапсег Еек. 61:383; ^апд с1 а1. (2002), 0псодепе, 21:2584). Блокирование передачи сигналов 1Ь-6 может, таким образом, оказать положительный эффект во многих патологических ситуациях. Считается, что передача сигналов 1Ь6 по типу транс играет роль в развитии многих злокачественных опухолей, а также аутоиммунных и воспалительных состояний, включая рак толстой кишки, воспалительные заболевания кишечника и ревматоидный артрит. Считается, что передача сигналов 1Ь-6 по типу цис играет роль в развитии как злокачественных опухолей, так и аутоиммунных состояний, включая, помимо указанных ниже, рак молочной железы. В целом, считается, что передача сигналов по типу транс может быть в большей степени ассоциирована с аутоиммунными и воспалительными процессами, а передача сигналов по типу цис - со злокачественными опухолями (см., например, ЕаЬе с1 а1. (2008), В1ооб, 111:1021); Запкопе с1 а1. (2007), 1. С11П Ιηνεκΐ. 117:3988).

Таким образом, агенты, содержащие связывающие домены согласно настоящему изобретению, применимы для лечения аутоиммунных заболеваний, включая ревматоидный артрит, синдром Сьёгрена, рассеянный склероз, системную красную волчанку, болезнь Гравеса, болезнь Хашимото и синдром Каслмана, острые и хронические воспаления, остеопороз и другие нарушения, включающие потерю костной массы, а также злокачественные опухоли, включая гормон-независимый рак простаты, нарушения пролиферации В-клеток, такие как неходжкинская лимфома, и злокачественные опухоли почек, молочной железы, толстой кишки, лёгких, мозга и других тканей.

Согласно другому аспекту данным описанием обеспечиваются композиции, включающие гибридные белки. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, как правило, содержат один или несколько типов связывающих доменов или гибридных белков в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или растворителем. Указанные носители должны быть нетоксичны в отношении реципиентов в применяемых дозах и концентрациях. Фармацевтически приемлемые носители для терапевтического применения известны специалистам в фармацевтике и описаны, например, в ЕештдГоп'к Рйатасеибса1 Заепсек, Маск РиЫщЫпд Со. (А.Е. Сепнаго (Еб.), 1985). Например, можно применять стерильный солевой раствор и солевой раствор в фосфатном буфере с физиологическим значением рН. Консерванты, стабилизирующие вещества, красители и т.п. могут добавляться в состав фармацевтической композиции. Например, бензоат натрия, сорбиновая кислота или сложные эфиры р-гидроксибензойной кислоты могут добавляться в качестве консервантов. 16. в 1449. Кроме того, могут применяться антиоксиданты и суспендирующие агенты. 16. Соединения согласно настоящему изобретению могут применяться в форме свободных оснований или солей, притом что обе указанные формы находятся в рамках настоящего изобретения.

- 24 019512

Фармацевтические композиции могут также содержать растворители, такие как буферы, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды, белки, аминокислоты, углеводы (например, глюкозу, сахарозу или декстрины), хелатирующие агенты (например, этилендиаминтетрауксусную кислоту), глутатион и другие стабилизирующие агенты и вспомогательные вещества. Нейтральные буферные солевые растворы или солевые растворы, смешанные с неспецифическим сывороточным альбумином, являются обычно применяемыми растворителями. Предпочтительно продукт предоставляется в форме лиофилизата с использованием раствора подходящего вспомогательного вещества (например, сахарозы), служащего растворителем.

Также подразумевается введение специфичных композиций мультиспецифичных гибридных белков согласно настоящему изобретению в комбинации с дополнительными агентами. Дополнительным агентом может быть агент, применяющийся в данной области техники в качестве стандартного препарата при лечении определённого патологического состояния, такого как воспалительный, аутоиммунный процесс или злокачественная опухоль. Типичные дополнительные агенты включают цитокины, факторы роста, стероиды, нестероидные противовоспалительные средства, базисные препараты для лечения ревматоидного артрита, химиотерапевтические, радиотерапевтические либо другие активные и вспомогательные агенты, а также любые их комбинации.

Фармацевтически приемлемая соль относится к соли полипептидного связывающего домена или гибридного белка согласно настоящему изобретению, являющейся фармацевтически приемлемой и обладающей желаемым фармацевтическим действием первичного соединения. Указанные соли включают (1) соли, образованные при добавлении кислот, полученные при взаимодействии с минеральными кислотами, такими как соляная, бромисто-водородная, серная, азотная, фосфорная и т.п.; либо с органическими кислотами, такими как уксусная, пропионовая, капроновая, циклопентанпропионовая, гликолевая, пировиноградная, молочная, малоновая, янтарная, яблочная, малеиновая, фумаровая, тартаровая, лимонная, бензойная, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная, коричная, миндальная, метансульфоновая, этансульфоновая, 1,2-этандисульфоновая, 2-гидроксиэтансульфоновая, бензолсульфоновая, 4-хлорбензолсульфоновая, 2-нафталинсульфоновая, 4-толуолсульфоновая, камфорсульфоновая, 4-метилбицикло[2.2.2]окт-2-ен-1-карбоновая, глюкогептоновая, 3-фенилпропионовая, триметилуксусная, трет-бутилуксусная, лаурилсерная, глюконовая, глютаминовая, гидроксинафтойная, салициловая, стеариновая, муконовая кислоты и т.п.; либо (2) соли, где кислый протон исходного соединения замещается либо ионом металла, например щелочного металла, щелочно-земельного металла или ионом алюминия; либо скоординирован с органическим основанием, таким как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, Ν-метилглюкамин и т.п.

Согласно определённым иллюстративным вариантам реализации полипептид или гибридный белок согласно данному описанию вводится внутривенно, например инъекцией болюса или в процессе инфузии. Пути введения, помимо внутривенного, включают оральное, локальное, парентеральное (например, подъязычно или в щёчный карман), подъязычное, ректальное, вагинальное и интраназальное. Термин парентеральное согласно данному описанию включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутригрудинные, внутрипазуховые, интратекальные, интрамеатальные, интрауретральные инъекции и инфузии.

Фармацевтическая композиция изготавливается в форме, которая позволяет содержащимся в ней активным компонентам оставаться биологически доступными после введения указанной композиции пациенту. Композиции, вводимые пациенту, могут быть в форме единичной дозы или нескольких доз, где, например, таблетка может быть формой единичной дозы, а ёмкость, содержащая одно или несколько соединений согласно настоящему изобретению, в форме аэрозоля может содержать множество доз.

При пероральном введении может применяться вспомогательное или связывающее вещество, такое как сахароза, каолин, глицерин, декстраны из крахмала, циклодекстрины, алгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза и этилцеллюлоза. Также могут применяться подсластители, консерванты, красители, ароматизаторы или любые их комбинации. Кроме того, может применяться оболочка.

Также композиции для введения инъекцией могут включать один или несколько сурфактантов, консервантов, увлажняющих агентов, диспегрирующих агентов, суспендирующих агентов, буферов, стабилизирующих веществ, изотонических агентов или любых их комбинаций.

Формы, произведённые на основе нуклеиновых кислот или содержащие продукты экспрессии согласно настоящему изобретению, вводятся в дозах, составляющих приблизительно от 0.01 мкг/кг до 100 мг/кг веса тела, например, внутрикожно, подкожно, внутримышечно или внутривенно либо любым другим подходящим путём, известным в данной области техники, в соответствии с конкретными обстоятельствами. Например, предпочтительная дозировка может составлять приблизительно от 1 мкг/кг до 20 мг/кг, особенно предпочтительно приблизительно от 5 мкг/кг до 10 мг/кг. Специалистам в данной области техники, безусловно, очевидно, что количество и частота введения будут зависеть от реакции пациента.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены в любой форме, применимой для введения пациенту, например в твёрдой, жидкой или газообразной форме (аэрозоль). Композиция может быть в жидкой форме, например в форме эликсира, сиропа, раствора,

- 25 019512 эмульсии или суспензии. В качестве двух примеров жидкость может вводиться перорально или посредством инъекции.

Жидкая фармацевтическая композиция, как описано в данном патенте, в форме раствора, суспензии или в любой другой подобной форме может включать один или несколько нижеуказанных компонентов: стерильные растворители, такие как вода для инъекций, солевые растворы, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотоничный хлорид натрия, нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить в качестве растворителей или среды для суспензии, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; и агенты для контроля тоничности, такие как натрий, хлорид или декстроза. Парентеральные препараты могут быть в ампулах, одноразовых шприцах или пластиковых или стеклянных ёмкостях, содержащих несколько доз. Физиологический солевой раствор является предпочтительным добавочным компонентом. Вводимые посредством инъекций композиции предпочтительно стерильны.

Также предпочтительно включение в лекарство других компонентов, таких как средства доставки, включая соли алюминия, водномасляные эмульсии, биорасщепляемые масляные средства доставки, масляноводные эмульсии, биорасщепляемые микрокапсулы и липосомы. Примеры адъювантов для применения в такого рода средствах доставки включают Ν-ацетилмурамил-Ь-аланил-О-изоглютамин (МЭР), липополисахариды (ЬРЗ), глюкан, 1Ь-12, гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (СМ-СЗР), γ-интерферон и 1Ь-15.

В то время как любое приемлемое средство доставки, известное специалисту в данной области техники, может применяться в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, тип средства доставки будет меняться в зависимости от способа введения и от того, желательно ли замедленное высвобождение. При парентеральном введении, средство доставки может содержать воду, солевой раствор, спирт, жир, воск, буфер или любую их комбинацию. При пероральном введении могут применяться любые из вышеуказанных средств доставки либо твёрдые средства доставки, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахаринат натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза, карбонат магния или любая их комбинация.

Данное описание подразумевает единицу дозировки, содержащую фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению. Такие единицы дозировки включают, например, ампулы или шприцы для введения одной или нескольких доз, включая двухъёмкостные ампулы или шприцы, первая из ёмкостей которых содержит фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению в лиофилизированной форме, а вторая содержит растворитель для их объединения. Содержащие множество доз ёмкости могут представлять собой, например, пакет или трубку, присоединяемую к устройству для внутривенной инфузии.

Настоящее описание также подразумевает набор, содержащий фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению в единичных или множественных дозах, ёмкость, например ампулу, и инструкцию к применению указанной композиции в отношении пациентов, страдающих нарушением, например одним из нарушений, описанных выше.

Все патенты США, опубликованные заявки на патенты США, заявки на патенты США, патенты других стран, заявки на патенты других стран, не относящиеся к патентам публикации, таблицы, последовательности, интернет-ресурсы и т.п., упомянутые в настоящем описании, полностью включены в данное описание посредством ссылки. Нижеследующие примеры не ограничивают настоящее изобретение в какой-либо мере и являются исключительно иллюстративными.

Примеры

Последовательности ЗМ1Р и Хсср1ог.

Последовательности аминокислот типичных молекул ЗМ1Р и Хсср1ог (ЗЕО ΙΌ N0: 231-292), содержащих связывающий домен анти-Ш-бхЕ, приведены в ЗЕО ΙΌ N0: 671-694 и 607-668 соответственно, а соответствующие нуклеотидные кассеты экспрессии гибридных белков приведены в ЗЕО ΙΌ N0: 761-784 и 697-758 соответственно (необходимо отметить, что зрелые белки не содержат сигнальную пептидную последовательность, обнаруживаемую в ЗЕО ΙΌ N0: 671-694 и 607-668). В настоящем описании молекулы Хсср1ог. содержащие эктодомен Т№ЕЗР1В на аминоконце и связывающий домен анти-Ш-бхЕ на карбоксиконце, называются ТЕИ(ХТ6)-1001 - ТЕИ(ХТб)-1062. В настоящем описании молекулы Хсср1ог в обратной ориентации, т.е. содержащие связывающий домен анти-Ш-бхЕ на аминоконце и эктодомен Т№ЕЗР1В на карбоксиконце, называются ТЕИ(Х6Т)-1008 и ТЕИ(Х6Т)-1019.

В настоящем описании конструкции ЗМ1Р, содержащие связывающий домен анти-Ш-бхЕ, называются ТЕИ(З6)-1002, ТЕИ(З6)-1004, ТЕИ(З6)-1007, ТЕИ(З6)-1008, ТЕИ(З6)-1011, ТЕИ(З6)-1013, ТЕИ(З6)-1014, ТЕИ(З6)-1018, ТЕИ(З6)-1019, ТЕИ(З6)-1022, ТЕИ(З6)-1024 - ТЕи(З6)-1026,

ТЕИ(З6)-1029, ТЕИ(З6)-1038, ТЕИ(З6)-1040, ТЕИ(З6)-1047, ТЕИ(З6)-1051, ТЕИ(З6)-1052,

ТЕИ(З6)-1054, ТЕи(З6)-1056 и ТЕИ(З6)-1059 - ТЕИ(Зб)-1061.

- 26 019512

Фаговую библиотеку связывающих доменов ЕаЬ подвергали скринингу для выявления связывающих доменов, обладающих специфичностью к комплексу 1Ь-6хК, по существу, как описано Ное! е! а1. (2005), №11игс Вю!есЬпо1. 23:344. Связывающие домены клонировали путём амплификации методом ПЦР, вкратце, области ν₂ и из клонов библиотеки ЕаЬ амплифицировали с использованием РСК 8ирегМ1х (ΙηνίύΌ^εη, 8ап О1едо, СА) и подходящих праймеров, образующих линкер 6₄8 за счёт перекрывания, с предварительным отжигом при 56°С на протяжении 9 циклов, затем 62°С на протяжении еще 20 циклов. Продукты ПЦР разделяли на агарозном геле и очищали с использованием колонки РСК Рштйса!юп О1адеп (СйаТктоойй, СА). Сшивающая реакция второго этапа включала смешивание молярного эквивалента продуктов ν_Ε и с буфером Ехрапй и водой, денатурированных при 95°С в течение 5 с, затем медленно охлаждённых до комнатной температуры. Для амплификации добавляли смесь йНТРк с ферментом Ехрапй и инкубировали при 72°С в течение 10 с. Добавляли внешние праймеры (5' и 3' ν^ и цикл повторяли 35 раз с отжигом при 62°С и 45-минутной реакцией удлинения цепи. Полученный продукт, состоящий из 750 пар оснований, очищали в геле, расщепляли с помощью ЕсоК1 и Ной и клонировали в плазмиду рЭ28 (подробнее см. публикацию заявки на патент США № 2005/0136049 и публикацию заявки РСТ № \¥О 2007/146968). Активность связывания исследовали методом ЕБ18А (твердофазного иммуноферментного анализа), как описано в Ное! е! а1. (2005).

Различные гибридные белки 8М1Р и ХсерТог, указанные в настоящем описании, тестировали на предмет активности анти-1Ь-6хК, активности анти-ΤΝΕ или обоих видов активности, как описано ниже. Используемые в следующих примерах аббревиатуры включают следующие термины: ФСБ-Т: ФСБ, рН 7.2-7.4 и 0.1% Т\уссп®20; рабочий буфер: ФСБ-Т с 1% В8А; блокирующий буфер: ФСБ-Т с 3% В8А.

Пример 1. Экспрессия гибридных белков.

Экспрессию некоторых гибридных белков, указанных в настоящем описании, в 293 клетках осуществляли с использованием системы экспрессии Егее8!у1е™ 293 (ΙηνίύΌ^εη, Саг1кЬай, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Для каждой трансфекции 30 мл использовали 3х10⁷ клеток в 28 мл среды для экспрессии Егее8!у1е™ 293. В день трансфекции небольшую аликвоту суспензии клеток переносили в микроцентрифужную пробирку и определяли выживаемость и степень агрегации клеток с использованием метода невключения красителя трипанового синего. Суспензию энергично встряхивали в течение 45 с с разрушением агрегатов клеток и определяли общее количество клеток с использованием счётчика СоиЙег СоипТег или гемоцитометра. Выживаемость клеток составляла более 90%. Колбу для качалки, содержащую необходимые клетки, помещали в инкубатор с температурой 37°С на орбитальную качалку.

Для каждого образца для трансфекции получали комплексы липид-ДНК следующим образом. 30 мкг плазмидной ДНК разводили в Орй-МЕМ® I до общего объема, равного 1 мл, и осторожно перемешивали. 60 мкл 293Гес!т™ разводили в Орй-МЕМ® I до общего объема, равного 1 мл, осторожно перемешивали и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. После инкубации в течение 5 мин разведенную ДНК добавляли к разведенному 293Гесйп™ с получением общего объема, равного 2 мл, и осторожно смешивали. Полученный раствор инкубировали в течение 20-30 мин при комнатной температуре для образования комплексов ДНК-293Гесйп™.

В то время как происходила инкубация комплексов ДНК-293Гес!ш™, суспензию клеток извлекали из инкубатора и подходящий объем указанной суспензии клеток помещали в стерильные одноразовые 125 мл колбы Эрленмейера для качалки. Добавляли свежую, предварительно нагретую среду для экспрессии Егее8!у1е™ 293 до общего объема, равного 28 мл, для трансфекции 30 мл.

По завершении инкубации комплекса ДНК-293Гесйп™ добавляли 2 мл комплекса ДНК-293Гесйп™ в колбы для качалки. В колбу отрицательного контроля добавляли 2 мл Орй-МЕМ® I вместо комплекса ДНК-293Гесйп™. Каждая колба содержала общий объем, равный 30 мл, с конечной плотностью клеток, равной приблизительно 1 х 10⁶ жизнеспособных клеток/мл. Клетки инкубировали в инкубаторе с температурой 37°С с увлажненной атмосферой 8% СО₂ в воздухе на орбитальной качалке с вращением при 125 об/мин. Клетки собирали приблизительно через 7 дней после трансфекции и анализировали на предмет экспрессии рекомбинантного белка.

Гибридные белки, содержащие связывающий домен - антагонист 1Ь-6, экспрессировали в клетках 293, как описано выше.

Пример 2. Связывание ХсерТог с 1Ь-6 и Нурег-1Ь-6 по данным ЕБ18А.

Активность в отношении связывания с Нурег-1Ь-6 (Н1Ь-6 или 1Ь-6хК), с рекомбинантным 1Ь-6 человека (гЫЬ-6) и растворимым 1Й-6К человека исследовали для молекул ХсерТог ТКИ(ХТ6)-1002, 1019, 1025, 1042, 1058 и ТКИ(Х6Т)-1019 (8ЕО ΙΌ НО: 608, 625, 631, 648, 664 и 670 соответственно), по существу, следующим образом.

Связывание Н1Й-6 и 1Ь-6.

В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 100 мкл раствора козьего 1д6-Ес против сыворотки человека в ФСБ Цасккоп IштиηοКеκеатсй, \Уск1 6гονе, РА) концентрации 2 мкг/мл, рН 7.2-7.4. Планшет закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. После четырёхкратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 250 мкл блокирующего буфера (ФСБ-Т с 3% В8А или 10% нормальной сыво

- 27 019512 роткой козы), планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (или при 4°С в течение ночи). После трёхкратной промывки планшета ФСБ-Т в парные лунки планшета, на который нанесён античеловеческий 1§С-Рс, добавляли 100 мкл/лунку образцов ХсерТог Т№К5Р1В::анти-Н1Ь6 и химерного белка §р130-Рс человека (Κ&Ό 8ук1сшк, М1ииеаро11к, ΜΝ), трёхкратно разведённую сериями в рабочем буфере, начиная с 300 нг/мл, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 1-2 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т в парные лунки добавляли 100 мкл/лунку 150 пМ раствора Нурег-1Ь-6 человека или рекомбинантного 1Ь-6 человека в рабочем буфере, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 1-2 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора 150 нг/мл античеловеческого 1Ь-6-биотина (Κ&Ό 8ук1стк) в рабочем буфере, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 1-2 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена (2утеб, 8аи Ргапаксо, СА), разведённого в рабочем буфере в соотношении 1:4,000, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. После шестикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора субстрата 3,3,5,5-тетраметилбензидина (ТМБ) (Р1егсе, КоскГогб, 1Ь) в течение 3-5 мин, а затем реакцию останавливали добавлением по 50 мкл стоп-буфера (1н. Н₂8О₄) на лунку. Поглощение в каждой лунке измеряли при 450 нм.

Связывание к1Ь-6К

В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 100 мкл раствора козьего 1§С-Рс против сыворотки человека (Ιί,’Ν Рйагтасеибса1к, Сок1а Мека, СА) концентрации 2 мкг/мл в ФСБ, рН 7.2-7.4. Планшеты закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. После четырёхкратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 250 мкл блокирующего буфера (ФСБ-Т с 3% В8А или 10% нормальной сывороткой козы), планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (или при 4°С в течение ночи). После трёхкратной промывки планшета ФСБ-Т в парные лунки планшета, на который нанесён античеловеческий 1§С-Рс, добавляли 100 мкл/лунку образцов ХсерТог ТМЕК8Р1В::анти-Н1Ь-6, античеловеческого 1Б-6К, (Κ&Ό 8ук1етк, М1ппеаро11к, ΜΝ) в качестве положительного контроля и 1§С человека или гибридного белка §р130-Рс человека (Κ&Ό 8ук1етк) в качестве отрицательных контролей, каждый трёхкратно серийно разведённый в рабочем буфере, начиная с 300 нг/мл, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 1-2 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т в парные лунки добавляли 100 мкл/лунку 75 пМ раствора рекомбинантного к1Ь-6К человека (Κ&Ό 8ук1етк) в рабочем буфере, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 1-2 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора античеловеческого 1Ь-6К-биотина (Κ&Ό 8ук1етк) концентрации 100 нг/мл в рабочем буфере, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 1-2 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена футсб, 8ап РгапсЕсо, СА), разведённого в рабочем буфере в соотношении 1:4,000, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. После шестикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора субстрата 3,3,5,5-тетраметилбензидина (ТМБ) (Р1егсе, КоскГогб, 1Ь) в течение 3-5 мин, а затем реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп-буфера (1н. Н₂8О₄). Поглощение в каждой лунке измеряли при 450 нм.

Данные на фиг. 1А и 1В демонстрируют, что все гибридные белки Хсср1ог, независимо от того, находится ли эктодомен ТИЕЯ8Р1В на амино- или карбоксиконце молекул указанного гибридного белка, могут связываться с Н1Б-6. Кроме того, данные исследования показывают, что белки ХссрЮг обладают специфичностью к комплексу 1Ь-6хК, поскольку только два белка ХссрЮг связываются с гЫЬ-6 (фиг. 1В) и ни один не связывается с к1Ь-6К (фиг. 1С). В родственных исследованиях было обнаружено, что ТКи(ХТ6)-1002 и 8М1Р ТКИ(86)-1002 перекрестно реагируют с 1Ь-6 низшего примата, макаки-резуса.

Пример 3. Связывание ХссрЮг с Т№-а по данным ЕБ18А.

Активность в отношении связывания с ΪΝΤ-α исследовали для молекул ХссрЮг ТКи(ХТ6)-1002, 1042, 1058, 1019 и ТЯИ(Х6Т)-1019 (8ЕЦ ΙΌ NΟ: 608, 648, 664, 625 и 670 соответственно), по существу, следующим образом.

В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 100 мкл раствора козьего 1§С-Рс против сыворотки человека (Ιί,’Ν Рйагтасеибса1к, Сок1а Мека, СА) концентрации 2 мкг/мл в ФСБ, рН 7.2-7.4. Планшет закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. После четырёхкратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 250 мкл блокирующего буфера планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (или при 4°С в течение ночи). После трёхкратной промывки планшета ФСБ-Т в парные лунки планшета, на который нанесён античеловеческий 1§С-Рс, добавляли 100 мкл/лунку образцов ХссрЮг ТЫРЯ8Р1 В::анти-Н1Ь-6, Энбрела® (этанерцепта) и рекомбинантного гибридного белка ТЫРЯ2 (Т№К,8Р1В)-Рс человека (Κ&Ό 8ук1етк, М1ппеаро11к, ΜΝ) в качестве положительных контролей и 1§С человека или гибридного белка §р130-Рс человека (Κ&Ό 8ук1стк) в качестве отрицательных контролей, каждый трёхкратно серийно разведённый в рабочем буфере, начиная с 300 нг/мл, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 1-2 ч. После пятикратной про

- 28 019512 мывки планшета ФСБ-Т в парные лунки добавляли 100 мкл/лунку раствора рекомбинантного ТИЕ-а человека (Β&Ό БукЮтк) концентрации 2 нг/мл в рабочем буфере, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 1-2 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора античеловеческого ТИЕ-а-биотина (Β&Ό БукЮтк) концентрации 200 нг/мл в рабочем буфере, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 1-2 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена Дасккоп 1тншпоВсксагс11. \Уск1 Сгоуе, РА), разведенного в рабочем буфере в соотношении 1:1,000, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. После шестикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора субстрата 3,3,5,5-тетраметилбензидина (ТМБ) (Р1егсе, ВоскГогй, 1Ь) в течение 3-5 мин, а затем реакцию останавливали добавлением по 50 мкл стоп-буфера (1н. Н₂БО₄) на лунку. Поглощение в каждой лунке измеряли при 450 нм.

Данные на фиг. 2 показывают, что все тестируемые гибридные белки ХссрЮг могут связываться с ТИЕ-α. независимо от того, находится ли эктодомен ТИЕВБЕ1В на амино- или карбоксиконце указанного гибридного белка.

Пример 4. Связывание двойного лиганда ХссрЮг по данным ЕБ1БА.

Параллельное связывание с ΊΝΕ-α и комплексом 1Ь-6хК исследовали для ТВи(ХТ6)-1006 (БЕф ΙΌ ΝΟ: 612) гибридного белка ХссрЮг. по существу, следующим образом.

В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 100 мкл раствора Н1Б-6 человека (5 мкг/мл в ФСБ, рН 7.2-7.4). Планшет закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. После четырёхкратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 250 мкл блокирующего буфера планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (или при 4°С в течение ночи). После трёхкратной промывки планшета ФСБ-Т в парные лунки планшета, на который нанесен Н1Б-6, добавляли 100 мкл/лунку образцов ХссрЮг ТИЕВБЕ1В::Н1Ь-6, трёхкратно серийно разведённых в рабочем буфере, начиная с 300 нг/мл. Отрицательные контроли включали только гибридный белок др130-Ес человека (Β&Ό БукЮтк. М1ппеаро118, МИ), Энбрел® (этанерцепт) и рабочий буфер. Планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1.5 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора рекомбинантного ТИЕ-α человека (Β&Ό БукЮтк. МтпсароНк. МИ) концентрации 2 нг/мл в рабочем буфере планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1.5 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора античеловеческого ТИЕ-а-биотина (Β&Ό БукЮтк) концентрации 200 нг/мл в рабочем буфере, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1.5 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена Дасккоп 1тншпоВсксагс11. \Уск1 Сгоуе, РА), разведенного в рабочем буфере в соотношении 1:1000, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. После шестикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора субстрата 3,3,5,5-тетраметилбензидина (ТМБ) (Р1егсе, ЯоскГогй, 1Ь) в течение 3-5 мин, а затем реакцию останавливали добавлением по 50 мкл стопбуфера (1н. Н₂БО₄) на лунку. Поглощение в каждой лунке измеряли при 450 нм. Данные на фиг. 3 демонстрируют, что белки ХссрЮг могут связываться с двумя лигандами одновременно (в данном случае ТИЕ-α и Гипер 1Ь-6).

Пример 5. Блокирование ХссрЮг связывания Нурег-1Ь-6 с СР130 по данным ЕБ1БА.

Блокирование связывания Нурег-1Ь-6 (1Ь-6хВ) с растворимым рецептором др130 гибридными белками ХссрЮг ТВи(ХТ6)-1004, 1006, 1007, 1008, 1013 и 1019 (БЕС) ΙΌ ΝΟ: 610, 612, 613, 614, 619 и 625 соответственно) исследовали, по существу, следующим образом.

В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 100 мкл раствора гибридного белка др130-Ес человека (Β&Ό БукЮтк. М1ппеаро11к, МИ) концентрации 0.25-0.5 мкг/мл в ФСБ, рН 7.2-7.4. Планшеты закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. После четырёхкратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 250 мкл блокирующего буфера (ФСБ-Т с 3% ВБА или 10% нормальной сывороткой козы), планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (или при 4°С в течение ночи). Осуществляли пятикратные серийные разведения следующих образцов: образцы ХссрЮг ТИЕВБЕ1В::анти-Н1Ь-6, гибридный белок др130-Ес человека (Β&Ό БукЮтк). античеловеческий 1Б-6В (Κ.&Ό БукЮтк) в качестве положительных контролей и античеловеческий 1Ь-6 (Β&Ό БукЮтк). 1дС человека или Энбрел® (этанерцепт) в качестве отрицательных контролей, в рабочем буфере, начиная с 50 мкг/мл. Равные объемы серийно разведённых образцов ХссрЮг смешивали с Нурег-1Ь-6 (конечная концентрация Нурег-1Ь-6 равна 2.5 нг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После трёхкратной промывки планшета ФСБ-Т в парные лунки планшета, на который нанесён др130-Ес человека, добавляли 100 мкл/лунку серийных разведений смесей Хсер!ог/Н1Ь-6, гибридного белка др130Ес человека, античеловеческого 1Б-6В. античеловеческого 1Ь-6, 1дС человека и Энбрела® (этанерцепта), планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 1.5 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку конъюгата антитела против 1дС-Ес мыши с пероксидазой хрена (Р1егсе, ВоскГогй, 1Ь), разведённого в рабочем буфере в соотношении 1:10,000,

- 29 019512 планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После шестикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора субстрата 3,3,5,5-тетраметилбензидина (ТМБ) (Р1егсе) в течение 5-15 мин, а реакцию затем останавливали добавлением по 50 мкл стоп-буфера (1н. Н^0₄) на лунку. Поглощение в каждой лунке измеряли при 450 нм.

Данные на фиг. 4 демонстрируют, что белки ХссрЮг, содержащие связывающий домен ακιη-ΙΕ-6χΚ, могут блокировать связывание растворимого §р130 с НГЕ-6.

Пример 6. Блокирование ХссрЮг индуцируемой ГБ-6 и Нурег-ГЕ-6 пролиферации клеток.

Блокирование индуцируемой ΙΕ-6 или Нурег-[Е-6 (ΙΕ-6χΚ) пролиферации клеток ТЕ-1 исследовали для гибридных белков ХсерЮг ТКИ(ХТ6)-1011, 1014, 1025, 1026, 1002 и ТКИ(Х6Т)-1019 (ЪЕО ΙΌ N0: 617, 620, 631, 632, 608 и 670 соответственно), по существу, следующим образом.

В каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета добавляли 0.3х10⁶ клеток ТЕ-Ι (эритролейкозные клетки человека) в свежей среде для роста (10% ФБС-ΚΡΜΙ 1640; 2 мМ Ь-глютамин; 100 ед/мл пенициллина; 100 мкг/мл стрептомицина; 10 мМ НΕΡΕδ; 1 мМ пируват натрия и 2 нг/мл СМ-С'.ЪБ человека) за один день до использования в исследовании пролиферации. Затем клетки собирали и дважды промывали средой для анализа (такой же, как среда для роста, только без СМ-С'.ЪБ и не содержащей цитокины), затем ресуспендировали в количестве 1х10⁵ клеток/мл в среде для анализа. Для блокирования активности ΙΕ-6 представляющий интерес ТNЕδЕВ1Β::анти-НI^-6 ХссрЮг или антитело в серийных разведениях предварительно инкубировали с фиксированной концентрацией рекомбинантного ΙΕ-6 человека (гЫЬ-6) (Β&Ό δνδίαηδ, М1ииеаро118, МЩ или 43'130^-6 (ШЬ-6) в 96-луночных планшетах в течение 1 ч при 37°С, 5% С02. Используемые контроли включали Ι§0 человека; гибридный белок §р130-Ес человека (Β&Ό δνδίαηδ); антитело анти-ЫЬ-6 (Β&Ό δνδίαηδ) и антитело анти-ЫЬ-6В (Β&Ό δνδίαηδ). По завершении периода предварительной инкубации в каждую лунку добавляли 1 х 10⁴ клеток (в 100 мкл). Конечную смесь для анализа в общем объёме, равном 200 мкл/лунку, содержащую ТNЕδЕΚ,1Β::НI^-6, гЫЬ-6 или ШЬ-6 и клетки, инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 72 ч. В течение последних 4-6 ч культивации добавляли ³Н-тимидин (20 мкКи/мл в среде для анализа, 25 мкл/лунку). Клетки собирали на планшеты ишЕ1Дег-96 СЕ/с и количество включённого ³Н-тимидин определяли с использованием счётчика ТорСошЛ (Раскагб). Данные представлены в виде среднего значения имп/мин ± СО тройных повторов. Процент блокирования = 100 - (тестируемый имп/мин - контрольный имп/мин/максимальный имп/мин -контрольный имп/мин)х 100.

Данные на фиг. 5А и 5В демонстрируют, что все белки ХссрЮг, независимо от того, находится ли эктодомен ТNБΚδБ1Β на амино- или карбоксиконце молекул гибридного белка, могут блокировать пролиферацию клеток, индуцируемую ΙΕ-6 и Нурег-[Е-6 соответственно.

Пример 7. Блокирование ХссрЮг связывания Т>-а с ТОТК, по данным ЕБ-ΙδΑ.

Блокирование связывания Т>-а с рецептором Т№ гибридными белками ХссрЮг ТКи(ХТ6)-1004, 1006, 1007, 1008, 1013 и 1019 (δΒρ ΙΌ N0: 610, 612, 613, 614, 619 и 625 соответственно) исследовали, по существу, следующим образом.

В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 100 мкл раствора рекомбинантного гибридного белка ТОТИЗ-Ес человека (Β&Ό δνδίαηδ, М1пиеаро118, МК) концентрации 0.25-0.5 мкг/мл в ФСБ, рН 7.27.4. Планшеты закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. После четырёхкратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 250 мкл блокирующего буфера (ФСБ-Т с 3% ΒδΑ или 10% нормальной сывороткой козы), планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч (или при 4°С в течение ночи). Осуществляли пятикратные серийные разведения в рабочем буфере, начиная с 50-250 мкМ, следующих образцов: образцы ХссрЮг ТNЕΒδЕ1Β::анти-НI^-6, Энбрел® (этанерцепт) и анти-ТОТ-а (Κ,&Ό δνδίαηδ) в качестве положительных контролей и гибридный белок §р130-Ес человека (Κ,&Ό δνδίαηδ) и ^С человека в качестве отрицательных контролей. Равные объёмы серийно разведённых образцов ХссрЮг смешивали с Т№-а (конечная концентрация Т№-а равна 2.5 нг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После трёхкратной промывки планшета ФСБ-Т в парные лунки планшета, на который нанесён рекомбинантный ТОТИЗ-Ес человека, добавляли 100 мкл/лунку серийных разведений смеси Хсвр^НТ^-а, Энбрела® (этанерцепта), анти-ТNЕ-α, гибридного белка §р130-Ес человека и ^С человека, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 1.5 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора античеловеческого Т№-а-биотина (Κ&Ό δνδίαηδ) концентрации 200 нг/мл в рабочем буфере, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1-2 ч. После пятикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена (ЗасАоп ИптипоКсхсагск, \Ус51 Сгоус, РА), разведённого в рабочем буфере в соотношении 1:1,000, планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. После шестикратной промывки планшета ФСБ-Т добавляли 100 мкл/лунку раствора субстрата 3,3,5,5-тетраметилбензидина (ТМБ) (Р1егсе, КоскГогб, ΙΌ) в течение 3-5 мин, а затем реакцию останавливали добавлением по 50 мкл стоп-буфера (1н. Н^0₄) на лунку. Поглощение в каждой лунке измеряли при 450 нм.

- 30 019512

Данные на фиг. 6 показывают, что белки ХссрЮг блокировали связывание ΤΝΡ-α с рецептором ΤΝΡ, при этом указанное блокирование было приблизительно эквивалентно блокированию ΤNΡЕ-Ρс.

Пример 8. Блокирование ХссрЮг индуцируемой ΤΝΡ-α гибели клеток.

Блокирование индуцируемой ΤΝΡ-α гибели клеток Ь929 исследовали для гибридных белков Хсерϊογ ΤΕυ(ΧΤ6)-1011, 1014, 1025, 1026, 1002 и ΤЕυ(Х6Τ)-1019 (8Ер ΙΌ ΝΟ: 617, 620, 631, 632, 608 и 670 соответственно), по существу, следующим образом.

Получали суспензию фибробластных клеток Ь929 мыши (АТСС, ΜηηηδδΑδ, УА) с плотностью 2х10⁵ клеток на 1 мл в среде для культивирования (10% ФБС-ΕΡΜΙ 1640; 2 мМ Ь-глютамина; 100 ед/мл пенициллина; 100 мкг/мл стрептомицина и 10 мМ НЕБЕЗ), затем 100 мкл добавляли в каждую лунку 96-луночного плоскодонного черного планшета и инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂ в увлажнённом инкубаторе. Образцы ХссрЮг ΤNΡЕ8Ρ1В::анти-НI^-6, серийно разведённые в среде для анализа (такой же как среда для культивирования, но с добавлением 2% ФБС), смешивали с равным объёмом рекомбинантного ΤΝΡ-α человека (ΛΤΝΡ-α; Е&Б Зуйетк, Μ^ηηеаро1^8, ΜΝ) и инкубировали при 37°С, 5% СΟ₂ в увлажнённом инкубаторе в течение 1 ч. Положительные контроли (т.е. агенты, блокирующие индуцируемую ΤΝΡ-α гибель клеток Ь929) включали Энбрел® (этанерцепт), гибридный белок γ1ιΤΝΡΡ2^ (Е&Б Зуйетк, Μ^ηηеаро1^8, ΜΝ) и антитело анти-ΤΝΡ-α (Е&Б Зуйетк, Μ^ηηеаро1^8, ΜΝ). Отрицательные контроли включали только среду для анализа (без добавления ΤΝΡ-α) и антитело Ы§С (с добавлением ΤΝΡ-α). Для анализа активности ΤΝΡ-α среду для культивирования отделяли от клеток Ь929, а затем в каждую лунку добавляли 50 мкл ΤΝΡ-α/ХссрЮг или контрольной смеси и 50 мкл актиномицина Ό (81§та- А10г1сН, 8ΐ. Ьошк, МО) (из свежеприготовленного рабочего раствора 4 мкг/мл). Затем клетки инкубировали в течение 24 ч при 37°С, 5% СΟ₂ в увлажнённом инкубаторе. Для измерения выживаемости клеток в каждую лунку добавляли 100 мкл реагента ΛΤΡΙίΙο 1 81ср Ееа§еи! (ΡεΓΚίηΒίΜεΓ, \Уа1111ат, ΜА) в соответствии с инструкциями изготовителя, встряхивали в течение 2 мин, а затем измеряли люминесценцию с использованием счётчика ΤорСоиηΐ (Ρаскагά).

Данные на фиг. 7 демонстрируют, что все белки ХссрЮг, независимо от того, находится ли эктодомен ΤNΡЕ8Ρ1В на амино- или карбоксиконце молекул указанного гибридного белка, могут блокировать индуцируемую ΤΝΡ-α гибель клеток в данном анализе.

Пример 9. Связывание 8ΜΙΡ с 1Ь-6 и Нурег-1Ь-6 по данным ЕЬ18А.

Активность в отношении связывания с Нурег-1Ь-6 (Н1Ь-6 или 1Ь-6хЕ), с рекомбинантным 1Ь-6 человека (гЫЬ-6) и растворимым 1Ь-6Е человека исследовали для гибридных белков 8ΜΙΡ ΤЕυ(86)-1004, 1007, 1008, 1013, 1018, 1019, 1029 и 1038 (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 672, 673, 674, 676, 678, 679, 684 и 685 соответственно) с использованием, по существу, того же анализа, что и в примере 1, за исключением того, что тестировали белки 8ΜΙΡ вместо белков ХссрЮг.

Данные на фиг. 8 демонстрируют, что все белки 8ΜΙΡ могут связываться с Н1Ь-6.

Пример 10. Специфичность связывания с Нурег-1Ь-6, а не с другими цитокинами §р130.

Влияние гибридных белков ХссрЮг на индукцию пролиферации клеток ΤΡ-1 под действием цитокинов 1Ь-6 и §р130 1Ь-1 I, лейкоз-ингибирующего фактора (ΜΡ), онкостатина (Ο8Μ) и кардиотрофина-1 (СТ-1) исследовали, по существу, следующим образом.

В каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета добавляли 0.3х 10⁶ клеток ΤΡ-1 (эритролейкозные клетки человека) в свежей среде для роста (10% ФБС-ΕΡΜΙ 1640; 2 мМ Ь-глютамина; 100 ед/мл пенициллина; 100 мкг/мл стрептомицина; 10 мМ НЕΡЕ8; 1 мМ пируват натрия и 2 нг/мл 6Μ-ί.'8Ρ человека) за один день до использования в анализе пролиферации. Клетки собирали и дважды промывали средой для анализа (такой же как среда для роста, только без 6Μ-ί’8Ρ и не содержащей цитокинов), затем ресуспендировали в количестве 1х10⁵ клеток/мл в среде для анализа. Для исследования блокирования активности ЫЕ, Ο8Μ и СТ-1 серийные разведения ΤNΡ8ΡЕ1В::анти-НI^-6 Хсср1ог5 ΤЕυ(ХΤ6)-1002 (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 608), ΤЕυ(ХΤ6)-1019 (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 625), ΤЕυ(ХΤ6)-1022 (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 628) и ΤЕυ(ХΤ6)1025 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 631) предварительно инкубировали с фиксированной концентрацией каждого цитокина §р130 индивидуально или Нурег-1Ь-6 (Н1Ь-6) в 96-луночных планшетах в течение 1 ч при 37°С, 5% СΟ2. По завершении периода предварительной инкубации в каждую лунку добавляли 1х10⁴ клеток (в 100 мкл). Конечную смесь для анализа в общем объёме, равном 200 мкл/лунку, содержащую ΤNΡ8ΡЕ1В::НI^-6, цитокин §р130 или Н1Ь-6 и клетки, инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 72 ч. В течение последних 4-6 ч культивации добавляли ³Н-тимидин (20 мкКи/мл в среде для анализа, 25 мкл/лунку). Клетки собирали на планшеты υηίΡί1ΐεΓ-96 ΟΡ/с и количество включённого ³Н-тимидина определяли с использованием счётчика ΤорСоиηΐ (Ρаскагά). Процент блокирования = 100 - (тестируемый имп/мин - контрольный имп/мин/максимальный имп/мин -контрольный имп/мин)х 100.

Результаты показали, что Хсср1ог5 блокировал активность 1Ь-6, но не блокировал активность 1Ь-11, ΟΡ, Ο8Μ или СТ-1 (данные не представлены) и, следовательно, связывался с Нурег-1Ь-6, а не с другими протестированными цитокинами §р130.

- 31 019512

Пример 11. Связывание 8ΜΙΡ с Нурет-1Ь-6 по данным ЕЫ8А.

Активность в отношении связывания с Нурет-1Ь-6 (Н1Б-6) исследовали для гуманизированных гибридных белков 8ΜΙΡ под названием ТВИ(86)-1063 - ТВИ(86)-1066 (вариабельные области лёгкой цепи приведены в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 801-804, а вариабельные области тяжёлой цепи приведены в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 807810 соответственно), по существу, следующим образом.

В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 100 мкл раствора Нурет-1Ь-6 человека (1Ь-6В-1Ь-6-т1д6) концентрации 1 мкг/мл в ФСБ, рН 7.2-7.4. Планшет закрывали и инкубировали при 4°С в течение ночи. После пятикратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 250 мкл блокирующего буфера (ФСБ-Т с 3% В8А), планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Осуществляли трехкратные серийные разведения в 100 мкл рабочего буфера (1% В8А в ФСБ-Т), начиная с 300 нг/мл, гибридных белков 8ΜΙΡ и ΤΝΡΒ-Рс, использованного в качестве отрицательного контроля. Планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После пятикратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 100 мкл конъюгата пероксидазы хрена с антителом козы к Рс человека (Гютсс. ВоскГотб, 1Ь), разведённого в соотношении 1:1000. Планшет закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После пятикратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата Оиап1-В1и™ (Гютсс. ВоскГотб, 1Ь). Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10-30 мин и измеряли флуоресценцию при 325/420 нм.

Данные, представленные на фиг. 9, демонстрируют, что все тестируемые гибридные белки 8ΜΙΡ могут связываться с Н1Б-6.

Пример 12 Аффинность к связыванию с различными гибридными белками-антагонистами 1Ь-6.

Значения аффинности к связыванию и кинетические константы скорости взаимодействия Нурет-1Ь-6 (Н1Б-6; мономер или димер) и его компонентов 1Ь-6 и §1Ь-6В с разными доменами связывания анти-Н1Ь-6 в формах 5сРу. 8ΜΙΡ, ХсерТот и ХсерТот в обратной ориентации определяли с использованием устройства В1асоте® Т100 (СЕ НеаИЬсате, Ρί^ηΙηχνίΐγ.. ΝΓ).

Белки 8ΜΙΡ, ХсерТот и ХсерТот в обратной ориентации анти-Н1Ь-6 фиксировали моноклональными мышиными антителами против Рс человека, которые были ковалентно конъюгированы с поверхностью карбоксиметилдекстрана (СМ4) посредством аминов с использованием гидрохлорида №этил-№-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и Ν-гидроксисукцинимида. Свободные участки активированной поверхности блокировали этаноламином. Фиксирующее антитело (называемое анти-НРс) связывалось с доменом С_Н2 1§С Рс для всех подклассов и не демонстрировало видимого отделения от фиксированных связывающих Н1Б-6 агентов во время анализа. В каждом цикле три разных связывающих Н1Б-6 агента фиксировали в проточных кюветах 2, 3 и 4, тогда как проточную кювету 1 использовали в качестве эталонной кюветы. Для каждого цикла одну концентрацию одной родственной Н1Б-6 молекулы вводили в течение 150 с со скоростью 35 мкл/мин, а затем оставляли диссоциировать в течение 300 с. В конце цикла поверхность осторожно регенерировали с использованием 3 Μ Μ§ί.'Ι₂. который отделяет белок, связанный с фиксирующим антителом анти-НРс. Осуществляли множественные циклы для исследования связывания мономерного или димерного Н1Б-6 в разных концентрациях, в диапазоне 0-100 нМ, для каждой группы трёх фиксированных связывающих Н1Б-6 агентов. Связывающие Н1Б-6 агенты воспроизводимо фиксировали в каждом цикле с СУ, не превышающем 2%. Данный эксперимент проводили при 25°С. Сигнал, связанный со связыванием с эталонной кюветой, использовали для вычитания больших изменений преломления, а холостые (только буфер) инъекции использовали с учетом поправок смещения и шума системы. Кинетические параметры и значения аффинности определяли с использованием программного обеспечения В1Асуа1иа1юп. Молекулы 5сРу анти-НГЬ-б анализировали в обратной ориентации с использованием димерного гибридного белка Н1Б-6 человека/1д6 Рс мыши, фиксированного иммобилизированным поликлональным антителом кролика к 1д6 Рс мыши на поверхности и путём введения разных концентраций 5сРу на поверхность. Для компонентов Н1Б-6 1Ь-6 (еВюкшеисе, номер по каталогу 14-8069) и &1Ь-6В осуществляли одно 100 нМ введение с получением качественной оценки связывания. Гибридный белок др130 человека-1д6 Рс человека (Β&Ό 8у51сш5) также фиксировали и детально исследовали в качестве связывающего Н1Б-6 агента для сравнения. В табл. 3 показаны результаты, полученные для связывающих агентов анти-НГЬ-б в формах 8ΜΙΡ и 5сРу.

- 32 019512

Т аблица 3

На чипе	ви ши Ге <№пег	в» ши АРН ПИН1ПШ1.Ч	В растворе	ш АРИ топот ег	АШ 6Н ин пкнинт-г !
ю ПШ1ИМП«Г	чин Ес «Нтег	дник Ес Онпег
	МП	0,68	-	-	-	-	-
тктм-нис		э
>5ГО ?
Ηι,Τν 1	1 04	мп	МП	МО	МП	МП	МП
τκυιδω-ίικικ /81-Ц :ι> Μ	110	310		-		-
ПИ 1.ЧЮ-ПН1 .8ВД !Γ>	2по	31	-	-	-	-	-
ТК1.1ЯЩ-ИНЧ <810 :π м >;6	2.7	7	0.44
81.0 ’Π Μ >*><) ι.·>ο % 1	1.4»	МИ	ΝΟ	МО	МО	N0	МО
ΤΚΙ'ΐν.,-.'Α!	14	14
(ЗЕрЮМичн
ТКЕщм Έ5 (δΕΟΪΡΚοοΌ	4.4	2.6	-	4-		-	+
| >а Т* ΐ	21.7		N0	N0	МО	МП	N0
ТЩ о.ч	230 180 - - - - -

Цифры означают К_с (нМ);

ΝΏ - не выполнено;

+ связывание наблюдали;

- связывание не наблюдали.

В табл. 4 показаны результаты, полученные для связывающих Н1Б-6 агентов в форме ХсерТот с эктодоменом ΤΝΓΚ8Γ1Β на аминоконце и связывающим доменом анти-Н1Ь-6хК на карбоксиконце (ТКи(ХТ6)) или в обратной ориентации (ТКИ(Х6Т)).

Таблица 4

На чипе	Ви ши Ес (Ншег	Ви ши ЛЕИ ПИНМИЖТ	II.» топот	В растворе	дци Н Гс Општ	Л ЕС. К АГН топотсг	днин ЛЕН пюмтсг
т	чин Ес 41т«*г
РНмс к	МП	МП	МП	В.Ю17	МП	МП	МП	МП
	«V 1	49		0.003!	-	-		-
X ГМ 08 ι5£Ο Τ)Μι А		440	-	Х!Э	-	-	-	-
Χήτ-ο 108151.0 ΙΙΙΜι 6о9)	м>	МП	МП	МП	КП	мп	МП	МП
ΧΙΜΟ.3 181-0 |РМ		1ЭД	...	мп	-			-
ΧΓο-Ιυ’9 15110 ЮМ	5,7	п	го	мп	-	-	-	-
ΧήΤ (о 9(5’0 :ι>μη>’ί!	ш>	1.9	<157	ΝΠ
.χΐΜ0Χ(8=_ςι Ю М >:62М	17	29	12	мп		-
ΧΙΜΟ25151Χ) Т>\< >;МЦ	25	63	-	МП		-	4-	4
ХТ6-Щ?9 (5ГО >11 МО6-8)	49	МЮ()		мп				...

Цифры означают К_с (нМ);

ΝΏ - не выполнено;

+ связывание наблюдали;

- связывание не наблюдали.

Эти данные показывают, что связывающие домены анти-Нурет-1Ь-6 в различных формах связывались с мономером и димером Нурет-1Ь-6 с диапазоном значений аффинности (от примерно 2 до примерно 3000 нМ), и связывающие агенты с наибольшей аффинностью приближаются к аффинности §р130 в отношении Нурет-1Ь-6. Большинство связывающих доменов селективны в отношении Нурет-1Ь-6 и в измеримой степени не связываются с 1Ь-6 или 81Б-6К. Однако связывающие домены ТКИ(Х6Т)-1019 и ТКи(ХТ6)-1022 способны прочно связываться с 1Б-6 (со значением аффинности, равным от примерно 0.44 до примерно 12 нМ), тогда как связывающий домен ТКИ(ХТ6)-1025 связывается с рецептором (только качественные данные).

- 33 019512

Пример 13. Связывание антагониста 1Ь-6 с комплексом 1Ь-6:81Ь-6Е.

1Ь-6 человека (еВюзс1епсе, номер по каталогу 14-8069) и растворимый 1Ь-6Е (Е&Э БузУетз, номер по каталогу 227-8К/СР) смешивали в концентрации 50 нМ (каждый) в забуференном нЕРЕБ физиологическом растворе. Авторы настоящего изобретения считают, что в данных условиях образуется комплекс 1Р-6:з1Р-6Е концентрации приблизительно 30 нМ. Указанный комплекс вводили на поверхность ТЕи(Б6)-1002 (8ЕР ΙΌ N0: 671) БМ1Р. (ТЕи(Б6)-1002 фиксировали, как описано в примере 12 выше). II.-6 и з1Ь-6Е также вводили отдельно в концентрации 50 нМ для оценки индивидуального связывания. На фиг. 10 показана сенсограмма за вычетом эталона и контроля.

Данные демонстрируют, что ТЕи(Б6)-1002 прочно связывается с комплексом 1Ь-6:81Ь-6Е, а также слабо связывается с рецептором в очень высоких концентрациях, но детектируемо не связывается с II .-6 в данных условиях.

Пример 14. Различные связывающие антагонист ΙΙ.-6 домены в различных формах.

Связывание связывающих анти-1Ь-6 доменов в антителе, БМ1Р, ХсерУог и форме гуманизированного антитела с 1Ь-6 и нурег-1Ь-6 (ЮЬ-6) исследовали с использованием В1асоге®, как описано ниже. Используемые в данных исследованиях моноклональные антитела мыши получали из гибридом АН64, АН65, В8Р2-77, СЬВ-8, СЬВ-12, СЬВ-16, нн61-08 и НН61-10, все из которых представляют собой связывающие антагонист II.-6 домены.

Связывающие домены анти-П.-6 фиксировали с использованием иммобилизированного поликлонального антитела к Рс мыши в случае антител анти-1Ь-6 или моноклонального антитела к Рс человека в случае белков БМ1Р, ХсерУог и гуманизированных 8М1Р. Связывание ΙΙ.-6 со связывающими анти-1Ь-6 доменами исследовали с использованием кинетики одного цикла. Осуществляли пять последовательных инъекций II.-6 на цикл, начиная с самой низкой концентрации ΙΡ-6 (6.4 пМ) и двигаясь до самой высокой концентрации (4,000 пМ). Скорость потока составляла 45 мкл/мин и каждая инъекция ΙΙ.-6 длилась 7 мин. По завершении инъекции самой высокой концентрации ΙΡ-6 ΙΡ-6 оставляли диссоциировать в течение 30 мин. Данные подгоняли к модели кинетики одного цикла связывания один к одному. Связывание IΙΙΙ.-6 исследовали путём введения одной концентрации IΙΙΙ.-6 (от 6.4 до 4.0 пМ) на цикл в течение 7 мин, а затем оставляли связанный н1Ь-6 диссоциировать в течение либо 30 с (0-800 пМ) либо 1 ч (0 и 4,000 пМ). Эти данные подгоняли к модели связывания один к одному. Весь анализ осуществляли с использованием программного обеспечения Β^να^ί^η. Кинетические константы скорости и значения аффинности приведены в табл. 5.

Таблица 5

На чипе ϊρ	В оаствоое т	Ка (191%1) ')	к, (с1) *)	Ко(пМ) I)
АН-65 тАЬ	1Е6	3.2 х 10й	2.2 х 10'	7
Тки(86)-1О67	1Ь6	4.0 х 10й	4.5 х 10'5	И
тки(8б)-юбз	1Б6	3.9x106	1.9х104	51
ТКи(86)-1064	1Б6	4.2 х 106	2.0 х НУ4	48
АН-65 тАЬ	ЬурсгИ.6	2.0 х 10б	2.4 х 10’5	12
таи(8б)-юб7	ЬурегИ.6	4.4 х 10й	1.2 х НУ4	27
тки(8б)-ЮбЗ	ЬурсНЬб	3.6 х 10й	1.8 х 10'4	50
ТКи(86)-1064	ЬуреНЬб	4.1 х 10й	1.9 х НУ4	46
В8Р2-77 тАЬ	1Ь6	4.8 х 10й	2.0 х 10’3	410
ТКи(86)-1068	ΙΕ6	5.9 х 10й	7.9 х НУ3	1,350
ΤΕϋ(ΧΤ6)-1068	1Ь6	Е2 х 10й	4.6 х 10'3	3,734
В8Р2-77 тАЬ	Ьурег1Ь6	2.2 х 10й	9.6 х ПУ4	444
ТКи(86)-1068	ЬурсгИ-6	3.4 х 10й	3.2 х Ι0’3	977
тк.и(хтб)-юб8	ЬурсНЬб	6.6.x 10й	4.3 х 10’3	645
АН-64 тАЬ	1Ь6	2.9 х 10й	7.0 х 10'5	24
СЬВ-8 тАЬ	1Ь6	2.3 х 10й	5.0 х 10’5	22
СЬВ-14тАЬ	1Ь6	Е1 х 10й	3.4 х 10-4	315
СЕВ-12 тАЬ	1Б6	1.3 х 10й	7.7Х104	577
СЬВ-16тАЬ	ΙΕ6	2.1 х 10й	2.4 х К)-4	112
НН61-08 тАЬ	1Б6	2.6 х 10й	6.8 х ИГ4	268
ННбЕЮтАЬ	1Ь6	1.4 х 10й	7.0 х 10’5	49

Все связывающие анти-1Ь-6 домены в различных формах связывали ΙΡ-6 с диапазоном значений аффинности (от примерно 7 до примерно 3,734 пМ). Некоторые из связывающих доменов также могли связывать нурег-1Ь-6. Из них подробно исследовали связывающие домены моноклональных антител

- 34 019512

АН65 и Β8Е2-77, и значение аффинности данных связывающих доменов в различных формах в отношении Нурег-Ш-6 варьировало от примерно 12 до примерно 977 пМ. В целом, белок 8МШ и биспецифические формы ХсерТогк обладают аффинностью к связыванию, которая в 10 раз больше аффинности исходных моноклональных антител.

Пример 15. Определение сайта связывания связывающих 34^1-^-6 доменов.

ГЕ-6 связывается с рецептором §р130 по трём консервативным эпитопам, обозначаемых сайтами I, II и III. Для того чтобы происходила передача сигнала посредством §р130 должен образоваться гексамерный комплекс передачи сигнала. Ш-6 сначала образует комплекс с ЕЬ-6Ка путем связывания с сайтом

I. Сайт II представляет собой составной эпитоп, образуемый бинарным комплексом Ш-6 с ЕЬ-6Ка, который реагирует с §р130. Наконец, гексамерный комплекс передачи сигнала образуется при взаимодействии сайта III с §р130 (Βои1аη§ег с1 а1. (2003), 8с1епсе, 300:2101). Было показано, что антитела анти-Ш-6: АН65 и СЬ-16 выступают в качестве агентов, связывающихся с сайтом III, тогда как антитело анти-Ш-6 СЬ-12 взаимодействует с сайтом II (Ка1а1 с1 а1. (1997), Еиг. 1. ΒώΑεΜ. 249:690). Сайт связывания связывающего домена ТКИ-1002, указанного в настоящем описании, определяли следующим образом.

В каждую лунку 96-луночных планшетов добавляли 100 мкл растовра античеловеческого ΤΝΕ-ΚΠ (Κ&Ό 8уЫст5. М1ппеаро1й М^ концентрации 1 мкг/мл в ФСБ, рН 7.2-7.4. Планшеты закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. После пятикратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 250 мкл блокирующего буфера (ФСБ-Т с 3% Β8А), планшеты закрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч.

После пятикратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку одного планшета добавляли 100 мкл раствора ТКи(ХТ6)-1002 концентрации 0.5 мкг/мл в рабочем буфере (4Β; ФСБ-Т с 3% Β8А). В каждую лунку второго планшета добавляли 100 мкл раствора ТКИ(ХТ6)-1019 концентрации 0.5 мг/мл. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч.

Одновременно два новых планшета блокировали 250 мкл 8ирег Β^1< (Р1егсе, КоскГогб Ш) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После пятикратной промывки ФСБ-Т в оба планшета добавляли следующие молекулы, двукратно серийно разведённые в рабочем буфере, начиная с 20 мкг/мл (100 мкл/лунку): МР2-13А5 (ЬМ-Е13), АН65 (ЬМ-А02), СЬ-16 (ЬМ-806), СЬ-12 (ЬМ-802), СЬ-14 (ЬМ-804) и 86-А2 (ТКИ(86)-1002). В качестве отрицательного контроля использовали только рабочий буфер. Затем в каждую лунку добавляли равный объем (100 мкл) Нурег-ЕЬ-6 человека концентрации 200 нг/мл в рабочем буфере и 200 мкл смешивали путём трёхкратного пипетирования. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч.

После инкубации 200 мкл смеси из каждой лунки одного планшета переносили в планшет ТКи(ХТ6)-1002, который был промыт пять раз. То же самое проделывали для второго планшета: переносили в планшет ТКИ(ХТ6)-1019. Указанные планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После пятикратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 100 мкл биотинилированного анти-Ш-6К (150 нг/мл) (Κ&Ό 8уЫст5. Мшпеаро1й М^ и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывки в каждую лунку добавляли 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена (Р1егсе, КоскГогб Ш), разведенного в соотношении 1:20000 в рабочем буфере. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. После пятикратной промывки ФСБ-Т в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата Οι.ι;·ιηΙ-Β1ι.ι (Р1егсе, КоскГогб, Ш). Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10-30 мин и флуоресценцию измеряли при 325/420 нм.

Результаты, показанные на фиг. 11А и 11В, указывают на то, что ТКИ(ХТ6)-1002 связывается с сайтом III, тогда как ТКИ(ХТ6)-1019 связывается с сайтом II.

Пример 16. Связывание 8МШ и ХсерТог с Ш-6К в клетках печени.

Способность ТКИ(86)-1002, ТКИ(ХТ6)-1019 и антитела анти-Ш-6 1ш-РМ1 связываться с Ш-6К в полученных из печени клетках НерО2 исследовали следующим образом.

Клетки НерО2 промывали в буфере ЕАС8 и доводили до количества 2х10⁶ клеток на 1 мл в буфере ЕАС8 (ФСБ + 3% ФБС). В лунки 96-луночного планшета добавляли 50 мкл указанного раствора (10⁵ клеток на лунку). Планшеты выдерживали при 37°С до готовности к добавлению разведённых тестируемых молекул. Серийные разведения тестируемых молекул осуществляли в буфере ЕАС8 с получением 2х рабочего раствора, который разводили до 1х при добавлении к клеткам. Разведённые тестируемые молекулы добавляли к клеткам (50 мкл/лунку) и клетки инкубировали в течение 20 мин на льду. В качестве контроля использовали полноразмерный ^С. Затем клетки два раза промывали буфером ЕАС8 и ресуспендировали в конъюгате козьего ^С-Ес против сыворотки человека с фикоэритрином Оаскюп ЬаЬ§; разведённый в соотношении 1:200 в буфере ЕАС8). После инкубации в течение 20 мин на льду в темноте клетки два раза промывали буфером ЕАС8, ресуспендировали в 200 мкл ФСБ и измеряли на проточном цитометре Ь8КП™ (ΒΌ Β^о5с^сηсс5. 8ап 1о5С. СА).

Как показано на фиг. 12, ТКИ(86)-1002 и ТКИ(ХТ6)-1019 не демонстрировали существенное связывание с клетками НерС2 (печени).

- 35 019512

Пример 17. Блокирование белками 8ΜΙΡ и ХссрЮг активности Ш-б и ΨΝΕ у мышей.

Способность гибридных белков 8ΜΙΡ и ХсерТог, раскрытых в настоящем описании, блокировать индуцируемое Ш-б или ΨΝΕ образование белка сывороточного амилоида А (8АА) у мышей исследовали, как описано ниже. 8АА представляет собой один из основных белков острой фазы у людей и мышей. Длительное повышение уровней 8АА в плазме крови обнаруживают при хроническом воспалении, что приводит к амилоидозу, поражающему печень, почки и селезёнку (МспНоГГ с1 а1. (1990), Мо1. ΒώΒ Мей. 7:287). Было показано, что как Ш-б, так и ΨΝΕ индуцируют 8АА при введении отдельно (Βεηί§ηί с1 а1. (1996), Β^ά, 87:1851; Кашайоп е1 а1. (1988), Еиг. I. ]ттипо1. 18:1259).

а) Блокирование активности Нурег-ББ-б.

Самкам мышей линии ΒΆΕΒ/С ретроорбитально вводили путём инъекции 0.2 мл ФСБ или Энбрела® (200 мкг), ТКи(8б)-1002 (200 мкг) или ТКи(ХТ6)-1002 (300 или 500 мкг) в ФСБ. Через 1 ч мышам интраперитонеально вводили путем инъекции 0.2 мл ФСБ или 2 мкг Нурст-Ш-б человека в ФСБ. Через 2 и 24 ч после интраперитонеальной инъекции отбирали сыворотку крови мышей. Концентрацию 8АА в сыворотке определяли методом ЕБКА, а концентрацию з§р130 определяли путём анализа растворимого рецептора мыши на основе Бишшех.

Как показано на фиг. 13 и 14, ТКи(8б)-1002 и ТКи(ХТ6)-1002 блокировали индуцируемую НурегΙΕ-6 экспрессию как з§р130, так и 8АА.

(В) Блокирование активности ΨΝΡ.

Самкам мышей линии ΒΆ^Β/С ретроорбитально вводили путём инъекции 0.2 мл ФСБ или Энбрела® (200 мкг), ТКи(8б)-1002 (200 мкг) или ТКи(ХТ6)-1002 (300 мкг) в ФСБ. Через 1 ч мышам интраперитонеально вводили путем инъекции 0.2 мл ФСБ или 0.5 мкг/мышь ΪΝΕ-α в ФСБ. Через 2 и 24 ч после интраперитонеальной инъекции отбирали сыворотку крови мышей. Концентрацию 8АА в сыворотке определяли методом ЕБКА, а концентрацию з§р130 определяли путём анализа растворимого рецептора мыши на основе Битшех.

Как показано на фиг. 15А и 15В, ТКи(ХТ6)-1002 блокировал индуцируемую ΪΝΕ-α экспрессию 8АА, при этом уровень 8АА, наблюдаемый через 2 ч после инъекции, был аналогичен уровню, наблюдаемому в случае Энбрела®.

Пример 18. Активность ХсерЕог ш у1уо.

Терапевтическую эффективность гибридных белков, указанных в настоящем описании, исследовали в моделях заболевания у животных, как описано ниже.

(а) Множественная миелома.

Активность гибридных белков исследуют по меньшей мере в одной из двух хорошо изученных моделей множественной миеломы у мыши, а именно в модели множественной миеломы 5Т2 (5Т2ММ) и в модели множественной миеломы 5Т33 (5Т33ММ). В случае модели 5Т33 мышей лечат гибридными белками с момента инъекции клеток опухоли (профилактический режим). В случае модели 5Т2ММ мышей лечат гибридными белками с начала заболевания (терапевтический режим). Влияние лечения на развитие опухоли и ангиогенез оценивают в обеих моделях, а также проводят исследования костей в модели 5Т2ММ.

Модель миеломы у мыши 5ТММ была изначально разработана Кай1 с1 а1. (Ϊ. ^шипоЕ (1979), 122:609; см. также Кай1 εΐ а1., Ат. Б РаШоБ (1988), 132:593; Кай1 Ϊ. IттиηοБ Тойау (1990), 11:234). Её клинические признаки очень сходны с заболеванием человека: клетки опухоли расположены в костном мозге, концентрация парапротеина в сыворотке является мерой развития заболевания, неоваскуляризация повышена как в модели 5Т2ММ, так и 5Т33ММ (νηη Vа1скеηВοг§й с1 а1., Βγ I Сапсег (2002), 86:796), и в некоторых линиях развивается отчетливое остеолитическое заболевание костей. Модель 5Т2ММ включает умеренный рост опухоли и развитие остеолитических поражений костей. Данные поражения связаны с уменьшением объёма губчатого вещества кости, уменьшенной минеральной плотностью костей и повышенным количеством остеокластов (Сгоисйег с1 а1. Β1οοй (2001), 98:3534). Модель 5Т33ММ характеризуется более быстрым развитием опухоли, и, помимо костного мозга, клетки опухоли также растут в печени (Хапйсгксгксп с1 а1. Βγ Ϊ. Сапсег (1997), 76:451).

Модели 5Т2 и 5Т33ММ изучены в значительной степени. Выращивали конкретные моноклональные антитела к идиотипу как 5Т2, так и 5Т33ММ, что позволило с большой чувствительностью детектировать парапротеин в сыворотке методом ЕБ48А и специфически окрашивать клетки опухоли как в ходе анализа РАС8, так и путём иммуноокрашивания гистологических срезов (Хапйсгксгксп с1 а1., 1997). Секвенирование гена позволяет детектировать клетки методом ОТ-ПЦР и нозерн-блоттинга (ΖΙπ.ι с1 а1. Iттиηο1. (1998), 93:162). В моделях 5ТММ, которые могут быть использованы как для экспериментов ш уйго, так и ίη у1уо, развивается типичное заболевание ММ и доступны разные способы для оценки массы опухоли в костном мозге, концентраций парапротеина в сыворотке, ангиогенеза костного мозга (пути измерения плотности микрососудов) и остеолитических поражений костей (путём комбинирования рентгенографии, денситометрии и гистоморфометрии). Исследование указанных последних параметров позволяет использовать модели 5ТММ в доклинических условиях и исследовать рост и биологию клеток миеломы в полном сингенном микроокружении. Могут быть исследованы как молекулы, прицельно воз

- 36 019512 действующие на сами клетки ММ, так и молекулы, прицельно воздействующие на микроокружение костного мозга. В частности, тогда как модель 5Т33ММ может быть использована для исследования как микроокружения, так и самих клеток ММ, модель 5Т2ММ также может быть использована для исследования связанного с миеломой заболевания костей.

Для исследования профилактической эффективности гибридных белков, указанных в настоящем описании, мышам линии С57ВЬ/КаОЕу вводят путём инъекции 2х10⁶ клеток 5Т33 ММ и гибридный белок на 0 день. На 28 день мышей умерщвляют и развитие опухоли оценивают путём определения концентрации парапротеина в сыворотке и процента клеток опухоли в выделенных клетках костного мозга (определяют путём проточной цитометрии с антиидиотипическими антителами или с помощью мазков для цитологического исследования). Определяют массу селезенки и печени и данные органы фиксируют в 4% формальдегиде для дальнейшего анализа. Фиксируют образцы костей для последующей обработки, включая иммуноокрашивание 031 на парафиновых срезах и количественное определение плотности микрососудов.

Для исследования терапевтической эффективности гибридных белков, указанных в настоящем описании, мышам вводят путём инъекции клетки 5Т2ММ на 0 день, а гибридный белок вводят после начала заболевания, которое определяют наличием детектируемых уровней парапротеина в сыворотке. Мышей умерщвляют приблизительно через пять недель после введения гибридного белка и развитие опухоли оценивают, как описано выше для профилактического исследования. Кроме того, осуществляют анализ костей с использованием рентгенографии с определением числа поражений костей и области губчатых костей и окрашивания ТЕАР с оценкой количества остеокластов.

(В) Ревматоидный артрит.

Терапевтическую эффективность гибридных белков, указанных в настоящем описании, исследуют по меньшей мере в одной из двух моделей ревматоидного артрита (РА) у мышей, т.е. модель индуцируемого коллагеном артрита (С1А) и модель глюкоза-6-фосфатизомеразы (С6Р1). Другими авторами было показано, что каждая из этих моделей подходит для прогнозирования эффективности некоторых классов терапевтических лекарственных средств при РА (см. Но1нЛа111 (2000), Агйпйк Еек. 2:169; Но1тйаЫ (2006), 1ттиио1. Ьей. 103:86; Но1тйаЫ (2007), Ме!» Мо1. Мей. 136:185; ΜοΌβνΐίί, Н. (2000), АйЬгШз Еек. 2:85; КатгаШ аий ЗсйнЬсг! (2005), Апйгйъ Еек. ТНсг. 7:20).

(1) Модель С1А.

Модель С1А представляет собой лучше всего изученную модель артрита у мышей с точки зрения патогенеза и иммунологического базиса. Кроме того, это наиболее широко используемая модель РА и, несмотря на то, что она не является идеальной для прогнозирования способности лекарственных средств ингибировать заболевание у пациентов, многие считают её предпочтительной моделью при исследовании потенциальных новых лекарственных средств для лечения РА (ЛгйоИ с! а1. (2001), Απίιπίίδ Еек. 3:87; Уап άεη Вег§ (2002), Сигг. Е11сита1о1. Еер. 4:232; ЕоДошес (2003), Со11а§еп-1пйисе0 АгШпЩ. Ιη Сиггеи! РгоЮсоР ιη 1ттиио1о§у, с> Сой^аи с! а1., Ло1т \УПсу & Зопк, 1пс, НоЬокеп, N1).

В модели С1А артрит индуцируют иммунизацией самцов мышей линии ЭВА/1 коллагеном II (С11) в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ). В частности, на 21 день мышам внутрикожно/подкожно вводят путём инъекции С11 в ПАФ и на 0 день повторно инфицируют С11 в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ). Мыши проявляют клинические признаки артрита в пределах нескольких дней после повторного инфицирования С11/НАФ. Подгруппа мышей (от 0 до 10%), иммунизированных С11/ПАФ, проявляет признаки артрита на 0 день или приблизительно 0 день без повторного инфицирования и их исключают из экспериментов. В некоторых экспериментах С1А пропускают стадию усиления и вместо этого мышей лечат ХсерТог или контролем, начиная через 21 день после иммунизации С11/ПАФ (т.е. день первого лечения представляет собой 0 день).

Мышей лечат гибридным белком, инертным веществом (ФСБ) или отрицательным или положительным контролем в режиме профилактики и/или лечения. Профилактическое лечение начинается на 0 день и продолжается через пик заболевания у контрольных (не получающих лечение) мышей. Терапевтическое лечение начинается, когда большинство мышей демонстрируют умеренные признаки артрита. Энбрел®, который, как было показано, обладает хорошей эффективностью в моделях артрита как С1А, так и индуцируемого С6Р1, используют в качестве положительного контроля. Данные, полученные в каждом эксперименте, включают клинические показатели и кумулятивную частоту возникновения артрита. Клинические признаки артрита в модели С1А оценивают по баллам с использованием шкалы от 0 до 4, как показано в табл. 6.

- 37 019512

Таблица 6

Баллы	Наблюдения
0	Отсутствие видимой припухлости или покраснения
1	Припухлость/покраснение одноготрех пальцев
2	Покраснение и/или припухлость более трех пальцев, легкая припухлость, распространяющаяся на лапу, распухший или покрасневший голеностопный сустав или легкая припухлость/покраснение передней лапы
3	Распухшая лапа с покраснением от легкого до умеренного
4	Сильное покраснение и распухание всей лапы

(й) Модель С6РГ

В модели 0614 артрит индуцируют иммунизацией мышей линии ΌΒΑ/1 с помощью С61Ч в адъюванте (КатгабТ апб 8скиЪегТ (2005), ΑϊίΗτΐίΐδ Вез. Тйег. 7:20; 8скиЪегТ еТ а1. (2004), I. ΙιηιηιιηοΙ. 172:4503; Воскегтапп еТ а1. (2005), ΑΓΐΗπΐϊδ Кез. Ткег. 7:К1316; ΙχνΑΠΑΐηί еТ а1. (2008), ΑΓΐΗπΐίδ КНеит. 58:754; МаТзитоТо еТ а1. (2008), ΑΓΗπΤΐδ Кез. Ткег. 10:К66). О6И представляет собой фермент, присутствующий практически во всех клетках организма и не известно, почему иммунизация индуцирует специфическое заболевание суставов. Было показано, что ряд агентов, таких как СТ1 .Α4-Ι^ антагонисты ΤΝΕ (например, Энбрел®) и моноклональное антитело к рецептору ακιή-ΙΒ-6, ингибируют развитие артрита в модели О6РГ

Самцов мышей линии ΌΒΑ/1 иммунизируют О6И в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) для индуцирования артрита. В частности, на 0 день мышам внутрикожно/подкожно вводят путём инъекции О6И в ПАФ, и клинические признаки артрита появляются в течение нескольких дней после иммунизации. Как и в случае модели ΟΙΑ, описанной выше, мышей лечат гибридным белком, инертным веществом (ФСБ) или отрицательным или положительным контролем в режиме предупреждения и/или лечения. Предупредительное лечение начинается на 0 день и продолжается через пик заболевания у контрольных мышей. Терапевтическое лечение начинается, когда большинство мышей демонстрируют умеренные признаки артрита. Энбрел®, который, как было показано, обладает хорошей эффективностью в моделях артрита как ΟΑ, так и индуцируемого О6И, используют в качестве положительного контроля. Данные, полученные в каждом эксперименте, включают клинические показатели и кумулятивную частоту возникновения артрита. Клинические признаки артрита в модели О6И оценивают по баллам с использованием шкалы, схожей со шкалой, используемой для модели ίΊΑ.

(с) Поликистозная болезнь почек.

Эффективность гибридных белков, указанных в настоящем описании, в лечении поликистозной болезни почек тестируют в моделях у мышей, как описано в ОаТТопе еТ а1., ΝαΤ. Меб. (2003), 9:1323; Тоггез еТ а1. ΝαΤ. Меб. (2004), 10:363; Аапц еТ а1. I. Αμ. 8ос. №рйго1. (2005), 16:846 апб АПзоп (2008), Сигг. Тор. Όεν. Вю1. 84:311.

Хотя настоящее изобретение описано в связи с конкретными вариантами реализации настоящего изобретения, приведенными выше, очевидно, что многие альтернативные варианты, модификации и вариации будут понятны специалистам в данной области техники. Соответственно, варианты реализации настоящего изобретения, приведенные выше, являются иллюстративными, а не ограничивающими настоящее изобретение. Могут быть осуществлены различные изменения, не изменяющие суть настоящего изобретения и не выходящие за его рамки, определяемые следующей формулой изобретения. Все цитируемые в настоящем описании публикации включены в настоящее описание путём ссылки как его неотделимая часть.

8Ε6) ΙΌ ΝΟ: 1-845 приведены в прилагаемом перечне последовательностей. Коды нуклеотидных последовательностей, используемые в прилагаемом перечне последовательностей, включая символ п соответствуют стандарту ВОИС 8Т.25 (1998), приложение 2, табл. 1.

Claims (29)

1. Изолированный полипептид, содержащий связывающий домен, специфичный к комплексу 1Ь6/1Б-6Я (1Ь-6хЯ), который:

(a) связывается с комплексом 1Ь-6хЯ с большим сродством, чем с 1Ь-6 или 1Ь-6Яа по отдельности, или связывается с комплексом 1Ь-6хЯ или с 1Ь-6Яа по отдельности с большим сродством, чем только с 1Ь-6; и (b) конкурирует с мембранным §р130 за связывание с растворимым комплексом 1Ь-6хЯ (комплексом з1Ь-6хЯ), при этом указанный связывающий домен предпочтительно ингибирует транс-сигналинг 1Ь-6 по отношению к цис-сигналингу 1Ь-6, причём указанный связывающий домен включает вариабельную область лёгкой цепи, содержащую последовательности участков СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3, определяющих комплементарность, каждый из которых по меньшей мере на 80% идентичен СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3 вариабельной области лёгкой цепи, соответствующей 8ЕО ΙΌ N0: 373-434 или 799-804; вариабельную область тяжёлой цепи, содержащую последовательности участков СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3, определяющих комплементарность, каждый из которых по меньшей мере на 80% идентичен СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3 вариабельной области тяжёлой цепи, соответствующей 8Е0 ΙΌ N0: 435-496 и 805-810; или вариабельные области как указанной лёгкой, так и указанной тяжёлой цепей или причём указанный связывающий домен содержит последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную вариабельной области лёгкой цепи, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 373-434 или 799-804, вариабельной области тяжёлой цепи, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 435-496 или 805-810, или вариабельным областям как указанной лёгкой, так и указанной тяжёлой цепей.

2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный связывающий домен связывается с комплексом 1Ь-6хЯ и с 1Ь-6Яа по отдельности с большим сродством, чем только с 1Ь-6.

3. Полипептид по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный связывающий домен не ингибирует передачу сигналов цитокинами семейства §р130, отличными от 1Ь-6.

4. Полипептид по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный связывающий домен включает антигенсвязывающий домен одноцепочечного антитела.

5. Полипептид по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанный связывающий домен включает вариабельную область лёгкой цепи, содержащую последовательности участков СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3, определяющих комплементарность, каждый из которых по меньшей мере на 80% идентичен СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3 по меньшей мере одной вариабельной области лёгкой цепи, соответствующей 8Е0 ΙΌ N0: 373-434 и 799-804; и вариабельную область тяжёлой цепи, содержащую последовательности участков СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3, определяющих комплементарность, каждый из которых по меньшей мере на 80% идентичен СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3 по меньшей мере одной вариабельной области тяжёлой цепи, соответствующей 8Е0 ΙΌ N0: 435-496 и 805-810.

6. Полипептид по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что комплекс 1Ь-6хЯ содержит последовательность аминокислот, состоящую из последовательности зрелого полипептида, соответствующей 8ЕО ΙΌ N0: 606.

7. Полипептид по п.1, дополнительно включающий первый линкер и участок константной области иммуноглобулина.

8. Полипептид по п.7, содержащий в направлении от аминоконца к карбоксильному концу (а) полипептидный связывающий домен, специфичный к 1Ь-6хЯ комплексу, (Ь) первый линкер и (с) участок константной области иммуноглобулина.

9. Полипептид по п.7 или 8, отличающийся тем, что у указанного участка константной области отсутствуют эффекторные функции антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЭСС), антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза (АЭСР), активации системы комплемента и комплементзависимой цитотоксичности (СЭС) или их комбинация или такие функции присущи ему в минимальной степени.

10. Полипептид по п.9, отличающийся тем, что дополнительно сохраняет способность к связыванию с рецептором Ес.

11. Полипептид по п.10, отличающийся тем, что рецептор Ес представляет собой рецептор ЕсЯп.

12. Полипептид по п.7 или 8, отличающийся тем, что указанный участок константной области содержит домен Ес иммуноглобулина или один или более доменов С_Н Ес-домена иммуноглобулина.

13. Полипептид по п.12, отличающийся тем, что один или более доменов С_Н Ес-домена иммуноглобулина содержат С_н2 константную область и С_н3 константную область.

14. Полипептид по п.13, отличающийся тем, что Ес-домен иммуноглобулина представляет собой Ес-домен 1§6_Ь содержащий мутации Б234А, Б235А, 6237А, Е318А, К320А и К322А.

15. Полипептид по п.7 или 8, отличающийся тем, что указанный линкер представляет собой поли

- 39 019512 пептид шарнирной области иммуноглобулина.

16. Полипептид по п.7 или 8, отличающийся тем, что указанный линкер выбран из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0: 497-б04 и 823-828.

17. Мультиспецифичный одноцепочечный связывающий гибридный белок, содержащий первый связывающий домен, ковалентно связанный со вторым связывающим доменом посредством промежуточного домена, причём указанный первый связывающий домен включает связывающий домен, специфичный к комплексу 1Ь-б/1Ь-бВ (1Ь-бхВ), который:

(а) связывается с комплексом 1Ь-бхВ с большим сродством, чем с 1Ь-б или 1Ь-бКа по отдельности, или связывается с комплексом 1Ь-бхВ или с 1Ь-бКа по отдельности с большим сродством, чем только с 1Ь-б; и (В) конкурирует с мембранным др130 за связывание с растворимым комплексом 1Ь-бхВ (комплексом йЪ-бхК), причём указанный первый связывающий домен включает вариабельную область лёгкой цепи, содержащую последовательности участков СГОЕ1, СЭР2 и СГОЕ3, определяющих комплементарность, каждый из которых по меньшей мере на 80% идентичен СГОЕ1, СЭР2 и СЭР3 вариабельной области лёгкой цепи, соответствующей 8Е0 ГО Ν0: 373-434 или 799-804; вариабельную область тяжёлой цепи, содержащую последовательности участков СГОЕ1, СЭР2 и СГОЕ3, определяющих комплементарность, каждый из которых по меньшей мере на 80% идентичен СГОЕ1, СЭР2 и СЭР3 вариабельной области тяжёлой цепи, соответствующей 8Е0 ГО ΝΟ: 435-49б и 805-810; или вариабельные области как указанной лёгкой, так и указанной тяжёлой цепей или причём указанный первый связывающий домен содержит последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную вариабельной области лёгкой цепи, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 373-434 или 799-804, вариабельной области тяжёлой цепи, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО ΝΟ: 435-49б или 805-810, или вариабельным областям как указанной лёгкой, так и указанной тяжёлой цепей.

18. Мультиспецифичный одноцепочечный связывающий гибридный белок по п.17, отличающийся тем, что указанный второй связывающий домен представляет собой эктодомен рецептора, который не является антагонистом 1Ь-б.

19. Мультиспецифичный одноцепочечный связывающий гибридный белок по п.17 или 18, отличающийся тем, что указанный промежуточный домен содержит константную область иммуноглобулина или её часть, расположенную между первым и вторым связывающими доменами.

20. Мультиспецифичный одноцепочечный связывающий гибридный белок по п.19, отличающийся тем, что указанная константная область иммуноглобулина расположена между первым и вторым линкерами.

21. Мультиспецифичный одноцепочечный связывающий гибридный белок по любому из пп.17-20, отличающийся тем, что указанный промежуточный домен представляет собой домен димеризации.

22. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп.1-17 или гибридный белок по любому из пп.18-21.

23. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.22, функционально связанный с последовательностью контроля экспрессии.

24. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п.23.

25. Композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-17, гибридный белок по любому из пп.18-21, полинуклеотид по п.22, вектор по п.23 или клетку-хозяина по п.24 и фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или вспомогательное вещество.

26. Применение полипептида по любому из пп.1-17, гибридного белка по любому из пп.18-21, полинуклеотида по п.22, вектора по п.23, клетки-хозяина по п.24 или композиции по п.25 для получения лекарственного средства для лечения 1Ь-б-ассоциированного заболевания у субъекта.

27. Применение по п.2б, отличающееся тем, что указанное заболевание представляет собой воспалительное заболевание или рак.

28. Применение полипептида по любому из пп.1-17, гибридного белка по любому из пп.18-21, полинуклеотида по п.22, вектора по п.23, клетки-хозяина по п.24 или композиции по п.25 для получения лекарственного средства для ингибирования у субъекта транс-сигналинга 1Ь-б.

29. Применение полипептида по любому из пп.1-17, гибридного белка по любому из пп.18-21, полинуклеотида по п.22, вектора по п.23, или клетки-хозяина по п.24, или композиции по п.25 для приготовления лекарственного средства для обеспечения конкурирования с мембранным др130 за связывание с комплексом йЪ-бхК у субъекта.