MX2011000071A - Inmunoterapeuticos de interleucina-6 (il6). - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de dominio de unión, y proteínas de fusión del mismo, que reconocen un complejo de IL6/receptor de IL6, así como composiciones y métodos de uso de los mismos.

Description

I MUNOTERAPEUTICOS DE INTERLEUCINA- 6 (IL6) Antecedentes de la Invención La interleucina 6 ("IL6") es una citosina pleiotrópica que regula las respuestas inmunitarias, inflamación, hematopoyesis y oncogénesis del hospedador. La biología de IL6 se medía por un sistema molecular muíticomponente con dos distintos modos de señalización, operativos en poblaciones celulares traslapadas pero no idénticas. Estas se refieren como cis-señalización (también conocida como señalización "clásica") y trans-señalización .

En la cis-señalización, la IL6 se une al receptor de IL6 de superficie celular, la parte de unión a ligando de IL6R que se refiere como IL6ROÍ o CD126 (anteriormente llamada gp80) . El complejo IL6/IL6Ra unido a la célula se une a su vez a la proteínas gpl30 de membrana (también conocida como IL6ST, IL6Rp o CD130) , de no unión a ligando, pero transducción de señal) que induce la dimerización de gpl30 y el inicio de la señalización. De esta manera, se restringe la cis-señalización al subconjunto de tipos celulares que expresan IL6Ra de superficie celular, que en general está limitado a, por ejemplo, células B activadas por mitógeno, subconjuntos de células T, monocitos periféricos y ciertos tumores. El complejo ternario resultante en la superficie celular se monta en un hexámero muy estable con una relación Ref. 216689 2:2:2 de IL6 : IL6ROÍ : gpl30 (Boulanger et al. (2003) Science 300 :2101) .

En la trans-señalización, el complejo IL6ROÍ soluble ("sIL6Ra") con IL6 y el complejo sIL6xR resultante en circulación pueden unirse a y activar cualquier célula que exprese gpl30 (pero no células que también expresen IL6ROÍ, Taga et al. (1989) Cell 58:573). Muchas, quizá todas o casi todas, las células en el cuerpo humano expresan gpl30. Debido a que gpl30 es ubicua, la trans-señalización puede afectar muchos tipos de células y de este modo algunas veces puede provocar enfermedad.

La proteína gpl30 de membrana también existe en forma soluble ("sgpl30"), que puede unirse al complejo sIL6xR, en circulación. Pero, el complejo sIL6xR se une igualmente bien a gpl30 soluble y de membrana (ver Jones et al, (2005) J. Interferon Cytokyne Res. 25:241). Por lo tanto, un exceso molar de sgpl30 puede inhibir la trans-señalización (al reducir la cantidad de complejo sIL6xR disponible en circulación) , que no afectará de forma significativa la cis-señalización debido a que la afinidad de sgpl30 es de órdenes de magnitud menores en comparación a gpl30 de superficie celular, para el complejo IL6/lL6IRoc unido a célula (ver, por ejemplo, Jostock et al. (2001) Eur. J. Biochem 268:160). De esta manera, se ha sugerido que spgl30 puede ser útil en la inhibición de la actividad de IL6 (ver, por ejemplo, Jostock et al. (2001) Eur. J. Biochem 268:160). Pero, además de IL6, gpl30 es una proteína común de transducción de señales para una familia de citosinas gpl30. Estas incluyen el factor inhibidor de leucemia (LIF) , factor neurotrófico ciliar (CNTF) , neuropoyetina (NP) , citosina tipo cardiotropina (CLC) , oncostatina M (OSM) , IL-27, IL-31 y cardiotrofina-1 (CT-1) . Por lo tanto, aunque sgpl30 puede inhibir la trans-señalización, la administración de este compuesto a pacientes puede tener algunos efectos adversos no buscados .

Se ha implicado la producción incrementada de IL6 en varios procesos de enfermedad, incluyendo enfermedad de Alzheimer, autoinmunidad (por ejemplo, artritis reumatoide SLE, inflamación, infarto de miocardio, enfermedad de Paget, osteoporosis , tumores sólidos (por ejemplo, cáncer de colon, cánceres de vejiga y prostático de RCC) , ciertos cánceres neurológicos , malignidades de células B, tal como enfermedad de Castleman, algunos subtipos de linfornas, CLL, y, en particular, mieloma múltiple. En algunos casos, la IL-ß está implicada en las rutas de proliferación debido a que actúa con otros factores, tal como factor de crecimiento epitelial de unión a heparina y factor de crecimiento de hepatocitos.

Se conocen varios antagonistas de anticuerpo de IL6 e IL6Ra. Por ejemplo, para IL6, Way et al. (Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2007/0178098) describen anticuerpos contra IL6 para bloquear de manera estérica IL6 o complejo sIL6xR de la unión a gpl30 (ver también Patente de los Estados Unidos No. 7,291,721). Por ejemplo, para IL6R , Kishimoto (Patente de los Estados Unidos No. 5,670,373) describe anticuerpos contra IL6ROÍ que inhiben la actividad de IL6.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1C muestra que las proteínas de fusión multi-específicas (XceptorMR) que contienen uno de varios dominios diferentes de unión de Hiper-IL6 fusionados a un ectodominio de TNFR se unen a Hiper-IL6 específicamente como se mide por ELISA, y que estas proteínas de fusión multi-específicas se unen de manera preferencial a Hiper-IL6 con respecto a IL6 e IL6R solos. Sólo dos proteínas de fusión probadas se unieron a IL6 y ninguna se unió a sIL6R.

La Figura 2 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR fusionadas a uno de varios dominios diferentes de unión a Hiper-I.L6 se unen a TNF-a, como se mide por ELISA.

La Figura 3 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen uno de varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6 fusionados a un ectodominio de TNFR pueden unirse de forma simultánea a Hiper-IL6 como a TNF-OÍ como se mide por ELISA.

La Figura 4 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen uno de los varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6, fusionados a un ectodominio de TNFR, bloquean a gpl30 de la unión a Hiper-IL6 como se mide por ELISA.

Las Figuras 5A y 5B muestran que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen uno de los varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6, fusionados a un ectodominio de TNFR, bloquean (Fig. 5A) la proliferación de células TF-1 inducida por IL6 o (Fig. 5B) inducida por Hiper-IL6.

La Figura 6 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen uno de los varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6, fusionados a un ectodominio de TNFR bloquean TNF-a de la unión a TNFR como se mide por ELISA.

La Figura 7 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR, fusionadas a uno de los varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6 bloquean la aniquilación inducida por TNF-OÍ de células L929.

La Figura 8 muestra que las proteínas de fusión inmunofarmacéuticas modulares pequeñas (SMIPMR) que . contienen uno de varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6 (referidos como, TRU ( S6 ) -1004, 1007, 1008, 1013, 1018, 1019, 1029 y 1038) se unen a Hiper-IL6, como se mide por ELISA.

La Figura 9 muestra que las proteínas de fusión SMIP referidas como TRU (S6 )- 1063 -TRU (S6 ) -1066 se unen a hiper-IL6, como se mide por ELISA.

La Figura 10 muestra que la proteína de fusión SMIP TRU(S6)-1002 se une al complejo IL6:sIL6R como se mide por BiacoreMR.

Las Figuras 11A y 11B muestran los resultados de estudios en el sitio de unión de los dominios de unión anti-IL6 descritos en la presente.

La Figura 12 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR fusionado a un dominio de unión de IL6 no se unen a células HepG2.

La Figura 13 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR fusionadas a un dominio de unión a IL6, bloquearon la respuesta de SAA inducida por HIL6 en ratones.

La Figura 14 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR fusionadas a un dominio de unión a IL6 bloquearon la respuesta de sgpl30 inducida por HIL6 en ratones.

Las Figuras 15A y 15B muestran los resultados de estudios de la capacidad de las proteínas de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR fusionado a un dominio de unión a IL6 para bloquear la respuesta de SAA inducida por TNFa en ratones, a 2 horas y 24 horas después de la administración, respectivamente.

Descripción Detallada de la Invención La presente descripción proporciona en general polipéptidos que contienen una región o dominio de unión específico para un complejo de IL6 con receptor de IL6 soluble o de membrana (IL6Ro¡) (el complejo se refiere en la presente como IL6xR cuando se refiere a ya sea IL6Ra de membrana o IL6Ra soluble (SIL6ROÍ) , y se usa sIL6xR cuando se refiere sólo al complejo de IL6 con sIL6Ra) que inhibe de manera preferencial la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6, por ejemplo, al competir con gpl30 de membrana para la unión con sIL6xR, incrementando la unión de gpl30 soluble con sIL6xR, que tiene mayor afinidad para un complejo de IL6xR que para, ya sea IL6 o IL6ROÍ solos, o que tiene cualquier combinación de estas propiedades. Un dominio de unión específico para IL6xR tampoco inhibirá, en ciertas modalidades, la señalización de las citosinas de la familia de gpl30 diferentes de IL-6. En otras modalidades, este dominio de unión de polipéptido específico para el complejo IL6xR puede además ser parte de una proteína de fusión en la cual se fusione al amino- o carboxi-terminal de un dominio de dimerización (por ejemplo, una región o sub-región constante de inmunoglobulina del mismo, tal como los dominios CH2 y CH3 de IgG) , como se encuentra en una proteína inmunofarmacéutica modular pequeña (SMIPMR) o una molécula SMIP inversa (referida en la presente como una molécula PIMS) , o similares. La presente descripción también proporciona proteínas de fusión que tienen múltiples dominios de unión que son mono-específicos (y multivalentes) o multi-específicos . Por ejemplo, las proteínas de fusión, multivalentes, mono-específicas pueden tener al menos dos dominios de unión que son específicos para el mismo objetivo, tal como un complejo IL6xR como se describe en la presente. Las proteínas de fusión, multi -específicas , de ejemplo que tienen un dominio de unión específico para un IL6xR como se describe en la presente pueden contener al menos una región o dominio adicional de unión que es específico para un objetivo o diana diferente de IL6xR, tal como TNFa o TGF .

Adicionalmente , esta descripción proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican para estos polipéptidos de unión o proteínas de fusión, así como vectores y células hospedadoras para producir de manera recombinante estas moléculas, y composiciones y métodos para usar los polipéptidos de unión o proteínas de fusión de esta descripción en un variedad de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, incluyendo el tratamiento, así como la mejora de al menos un síntoma de una enfermedad o trastorno, tal como enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, mieloma) , autoinmunitaria o inflamatoria (por ejemplo, artritis reumatoide) . Los compuestos y composiciones de esta descripción también son útiles como herramientas de investigación para ensayos in vi tro y basados en células para estudiar las actividades biológicas de IL6 y moléculas relacionadas .

Antes de exponer esta descripción en más detalle, puede ser útil un entendimiento de la misma para proporcionar definiciones de ciertos términos que se van a usar en la presente. A todo lo largo de esta descripción se exponen definiciones adicionales.

En la presente descripción, cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación, o intervalo de números enteros se va a entender que incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado, y cuando es apropiado, las fracciones de los mismos (tal como, un décimo y un céntimo de un entero) , a menos que se indique de otro modo. También, cualquier intervalo de número citado en la presente que se relacione a cualquier característica física, tal como subunidades poliméricas, tamaño o espesor, se va a entender que incluye cualquier número entero dentro del intervalo citado, a menos que se indique de otro modo. Como se usa en la presente, "aproximadamente" o "que consiste esencialmente de" significa ± 20 % del intervalo, valor o estructura indicada, a menos que se indique de otro modo. Como se usa en la presente, los términos "incluye" y "comprende" se usan de manera indistinta. Se debe entender que los términos "un" y "una" como se usa en la presente se refieren a "uno o más" de los componentes enumerados. El uso de la alternativa (por ejemplo, "o") se debe entender que significa ya sea uno, ambos, o cualquier combinación de los mismos de las alternativas. Además, se debe entender que los compuestos individuales, o grupos de compuestos, derivados de las varias combinaciones de las estructuras y sustituyentes descritos en la presente, se describen por la presente solicitud al mismo grado como si cada compuesto o grupo de compuestos se expusiera de forma individual. De esta manera, la selección de estructuras particulares o sustituyentes particulares, está dentro del alcance de la presente invención.

Un "dominio de unión" o "región de unión" , de acuerdo a la presente descripción puede ser, por ejemplo, cualquier proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido que posee la capacidad para reconocer y unirse de forma específica a una molécula biológica (por ejemplo, IL6, IL6R) o complejo de más de una de la misma o diferentes moléculas o montajes o agregados, ya sea estable o transiente {por ejemplo, complejo IL6xR) . Estas moléculas biológicas incluyen proteínas, polipéptidos , oligopéptidos , péptidos, aminoácidos o derivados de los mismos, lípidos, ácidos grasos o derivados de los mismos; carbohidratos, sacáridos o derivados de los mismos; nucleótidos, nucleósidos, ácidos nucleicos peptídicos, moléculas de ácido nucleico o derivado de los mismos; glicoproteínas , glicopéptidos, glicolípidos , lipoproteínas, proteolípidos o derivados de los mismos; otras moléculas biológicas que pueden estar presentes en, por ejemplo, una muestra biológica; o cualquier combinación de los mismos. Una región de unión incluye cualquier compañero de unión que se presente de manera natural, sintético, semi-sintético o producido de manera recombinante , para una molécula biológica u otro objetivo o diana de interés. Se conocen una variedad de ensayos para identificar dominios de unión de la presente descripción que se unen de manera específica con un objetivo o diana particular, que incluyen transferencia Western, ELISA, o análisis BiacoreMR.

Los términos entendidos por aquellos expertos en la técnica como se refiere a tecnología de anticuerpos se dan cada uno con el significado adquirido en la técnica, a menos que se defina expresamente en la presente. Por ejemplo, los términos "VL" y "VH" se refieren a la región de unión variable derivada de una cadena ligera y pesada de anticuerpo, respectivamente. Las regiones de unión, variables están constituidas de sub-regiones discretas bien definidas conocidas como "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) y "regiones menos variables" (FR) . Los términos "CL" y "CH" se refieren a una "región constante de inmunoglobulina" , es decir, una región constante derivada de una cadena ligera o pesada de anticuerpo, respectivamente, con esta última región que se entiende que es además divisible en dominios de región constante CHi, CH2/ CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) del cual se derivó la región. Una porción del dominio de región constante constituye la región Fe (la región "cristalizable de fragmento")/ que contiene dominios responsables de las funciones efectoras de una inmunoglobulina, tal como ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo) , ADCP (fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo) , CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) y fijación de complemento, que se une a receptores de Fe, mayor vida media in vivo con relación a un polipéptido que carece de una región Fe, unión a proteína A, y quizá aún transferencia placentaria (ver Capón et al. (1989) Nature, 337:525). Adicionalmente , un polipéptido que contiene una región Fe permite la dimerización o multimerización del polipéptido. Una "región de charnela", también referida en la presente como un "ligador", es una secuencia de aminoácidos interpuesta entre y que conectan las regiones constantes y de unión, variables de una cadena individual de un anticuerpo, que se conoce en la técnica como que proporciona flexibilidad en la forma de una charnela a los anticuerpos o moléculas de tipo anticuerpo.

La estructura de dominio de las inmunoglobulinas es tratable por ingeniería, ya que los dominios de unión al antígeno y los dominios que confieren funciones efectoras se pueden intercambiar entre clases y subclases de inmunoglobulina . La estructura y función de la inmunoglobulina se revisa, por ejemplo, en Harlow et al, Eds, Antibodies : A Laboratory Manual, Capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988) . Una introducción extensa, así como la información detallada a cerca de todos los aspectos de tecnología de anticuerpos recombinantes se puede encontrar en el libro de texto Recombinant Antibodies (John Wiley & Sons, NY, 1999) . Una colección comprensiva de protocolos de laboratorio detallados de manejo de anticuerpos se puede encontrar en R. Kontermann y S. Dübel, Eds., The Antibody Engineering Lab Manual (Springer Verlag, Heidelberg/New York, 2000) .

"Derivado" como se usa en la presente, se refiere a una versión química o biológicamente modificada de un compuesto que es estructuralmente similar a un compuesto progenitor y (real o teóricamente) derivable de ese compuesto progenitor. En general, un "derivado" difiere de un "análogo" ya que un compuesto progenitor puede ser el material de inicio para generar un "derivado" , en tanto que el compuesto progenitor no puede ser usado necesariamente como el material de inicio para generar un "análogo" . Un derivado puede tener diferentes propiedades químicas o físicas al compuesto progenitor. Por ejemplo, un derivado puede ser más hidrófilo o puede tener reactividad alterada (por ejemplo, una CDR que tiene un cambio de aminoácido que altera su afinidad para un objetivo o diana) en comparación al compuesto progenitor.

El término "muestra biológica" incluye muestra de sangre, espécimen de biopsia, explante de tejido, cultivo de órgano, fluido biológico o cualquier otro tejido o célula u otra preparación de un sujeto o de una fuente biológica. Un sujeto o fuente biológica puede ser, por ejemplo, un humano o animal no humano, un cultivo de células primarias o una línea celular adaptada a cultivo, que incluye líneas celulares genéticamente manejadas que contienen secuencias recombinantes de ácido nucleico, episomales o cromosómicamente integradas, líneas de células híbridas de células somáticas, líneas de células inmortalizadas o inmortalizables , líneas de células diferenciadas o diferenciables , líneas de células transformadas, o similares. En modalidades adicionales de esta descripción, se puede sospechar que una fuente biológica o sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad, trastorno o condición, que incluye una enfermedad, trastorno o condición maligna o trastorno de células B. En ciertas modalidades, se puede sospechar que un sujeto o fuente biológica tiene o está en riesgo de tener una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria o autoinmunitaria, y en ciertas modalidades diferentes de esta descripción, el sujeto o fuente biológica se puede conocer como que está libre de un riesgo o presencia de esta enfermedad, trastorno o condición.

Antagonistas de IL6 Como se señala anteriormente, la presente descripción proporciona polipéptidos que contiene una región o dominio de unión específico para un complejo IL6x que tiene una o más de las siguientes propiedades: (1) mayor afinidad para un complejo IL6xR que ya sea para IL6 o IL6R solos, (2) compite con gpl30 soluble o de membrana para la unión con un complejo sIL6xR, (3) inhibe de manera preferencial la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6, o (4) no inhibe la señalización de las citosinas de la familia de gpl30 diferentes de IL6. En ciertas modalidades, un dominio de unión específico para un complejo IL6xR de acuerdo a esta descripción tiene las siguientes propiedades: (1) mayor afinidad para un complejo IL6xR que ya sea para IL6 o IL6Ra solos, (2) compite con gpl30 de membrana para la unión con un complejo sIL6xR, (3) inhibe de manera preferencial la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6, y (4) no inhibe la señalización de las citosinas de la familia de gpl30 diferentes de IL6. Por ejemplo, una región o dominio de unión específico para un IL6xR puede ser un dominio de unión, variable de inmunoglobulina o derivado del mismo, tal como un anticuerpo, Fab, scFv, o similares. En el contexto de esta descripción, se debe entender que una región o dominio de unión específico para un IL6xR no es gpl30 como se describe en la presente.

Como se usa en la presente, "complejo de IL6xR" o "IL6xR" se refiere a un complejo de IL6 con un receptor de IL6, en donde el receptor de IL6 (también conocido como, por ejemplo, IL6Ra, IL6RA, IL6R1, y CD126) es ya sea una proteína de membrana (referida en la presente como mIL6R o mIL6R ) o una forma soluble (referida en la presente como SIL6R o sIL6R ) . El término "IL6R" abarca tanto mIL6R y sIL6Ro¡. En una modalidad, IL6xR comprende un complejo de IL6 y mIL6Ra. En ciertas modalidades, el complejo de IL6xR se mantiene conjuntamente mediante uno o más enlaces covalentes . Por ejemplo, el carboxi -terminal de un IL6R se puede fusionar al amino-terminal de una IL6 mediante un ligador peptídico, que se conoce en la técnica como Hiper-IL6 (ver, por ejemplo, Fischer et al. (1997) Nat . Biotechnol . 15:142). Un ligador de Hiper-IL6 puede estar comprendido de un compuesto reticulador, una secuencia de uno a 50 aminoácidos, o una combinación de los mismos. Un Hiper-IL6 puede incluir además un dominio de dimerización, tal como un dominio de inmunoglobulina Fe o una sub-región de dominio constante de inmunoglobulina . En ciertas modalidades, el complejo de IL6xR se mantiene conjuntamente mediante interacciones no covalentes, tal como por unión de hidrógeno, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der Waal, puentes de sal, interacciones hidrófobas, o similares, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, una IL6 y el IL6R pueden asociarse de manera natural de forma no covalente (por ejemplo, como se encuentra en la naturaleza, o como proteínas sintéticas o recombinantes) o cada uno se puede fusionar a un dominio de dimerización, tal como un dominio Fe de inmunoglobulina, para mejorar adicionalmente la estabilidad del complejo.

Como se usa en la presente, "gpl30" se refiere a una proteína de transducción de señal que se une a un complejo de IL6xR. La proteína gpl30 puede estar en una membrana (mgpl30) , ser soluble (sgpl30) o cualquier otra forma funcional de la misma. Las proteínas gpl30 de ejemplo tienen una secuencia como se expone en el Acceso al GenBank No. NP_002175.2 o cualquier forma soluble o derivada de la misma (ver, por ejemplo Narazaki et al. (1993) Blood 82:1120 o Diamant et al. (1997) FEBS Lett . 412:379). A manera de ilustración y no deseando que se una por teoría, una proteína mgpl30 puede unirse ya sea a un IL6/mILR o un complejo de IL6/sILR, en tanto que sgpl30 se une principalmente con el complejo de IL6/sILR (ver Scheller et al. (2006) Scand. J.

Imraunol . 63:321). De esta manera, ciertas modalidades de los dominios de unión, o proteínas de fusión de los mismos, de la presente descripción, pueden inhibir la trans-señalización del complejo IL6xR por la unión con mayor afinidad a IL6xR que ya sea IL6 o IL6Ra solos y de manera preferente al competir con el complejo de sIL6xR que se une a gpl30, de manera preferente mgpl30 o al aumentar o incrementar la unión de sgpl30 con el complejo de sIL6xR. Un dominio de unión de la presente descripción "compite" con gpl30 que se une a sIL6xR cuando (1) un dominio de unión o proteína de fusión del mismo impide que gpl30 se una a sIL6xR y el dominio de unión se une a sIL6xR con igual o mayor afinidad en comparación a la unión de gpl30 con sIL6xR, o (2) un dominio de unión o proteína de fusión del mismo mejora, incrementa o promueve la unión de sgpl30 al complejo sIL6xR, reduciendo de este modo la cantidad de tiempo en que está disponible el complejo sIL6xR para la unión con mgpl30.

Los dominios de unión y proteínas de fusión de los mismos, de esta descripción, pueden ser "inmunoespecíficos" o capaces de unirse a un grado deseado, incluyendo "unión de manera específica o selectiva" a un objetivo o diana, en tanto que no se unen de manera, significativa a otros componentes presentes en una muestra de prueba, si se unen a una molécula objetivo con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) de, por ejemplo, mayor que o igual a aproximadamente 105 M"1, 106 M"1, 107 M"1, 108 M"1, 109 M"1, 1010 M"1, 1011 M"1, 1012 M"1 o 1013 M"1. Los dominios de unión "alta afinidad" se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de al menos 107 M"1, al menos 108 M"1, al menos 109 M"1, al menos 1010 M"1, al menos 1011 M"1, al menos 1012 M"1, al menos 1013 M"1, o mayor. De manera alternativa, la afinidad se puede definir como una constante de disociación en equilibrio (¾) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, 10"5 M a 10"13 M) . Las afinidades de los polipéptidos de dominio de unión y proteínas de fusión de acuerdo a la presente descripción, se pueden determinar fácilmente usando técnicas convencionales (ver, por ejemplo, Scatchard et al (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci . 51:660, y Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,283,173; 5,468,614; análisis BiacoreM ; o equivalente) .

En un aspecto, un dominio de unión, antagonista de IL6 de esta descripción, tiene una afinidad para el complejo sIL6xR que es al menos 2 veces a 1000 veces mayor que ya sea para IL6 o IL6Ro¡ solos. Mediante la unión al complejo sIL6xR, un dominio de unión de esta descripción inhibe de manera preferencial la trans-señalización de IL6. En ciertas modalidades, la afinidad de un dominio de unión para el complejo sIL6xR es aproximadamente la misma como la afinidad de gpl30 para el complejo sIL6xR con "aproximadamente el mismo", que significa igual o hasta aproximadamente 2 veces mayor afinidad. En ciertas modalidades, la afinidad del dominio de unión para el complejo sIL6xR es mayor que al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces, o mayor que la afinidad de gpl30 para el complejo sIL6xR. Por ejemplo, si la afinidad de gpl30 para un complejo sIL6xR es aproximadamente 2 nm (ver, por ejemplo, Gaillard et al. (1999) Eur. Cytokine Netw. 10:337), entonces un dominio de unión que tiene al menos una afinidad 10 veces mayor para el complejo sIL6xR tendrá una constante de disociación (Ka) de aproximadamente 0.2 nM o menos .

En modalidades adicionales, un dominio de unión, antagonista de IL6, de esta descripción comprende una secuencia de polipéptido que (a) se une a un complejo sIL6xR con una afinidad al menos 2 veces a 1000 veces mayor que ya sea IL6 o IL6Ra, solos y (b) compite con gpl30 para la unión al complejo sIL6xR o mejora la unión de gpl30 con el complejo sIL6xR. En modalidades adicionales, un dominio de unión de polipéptido de esta descripción que se une a un complejo sIL6xR con una afinidad al menos 2 veces a 1000 veces mayor que ya sea para IL6 o IL6ROÍ solos también puede (i) inhibir de manera más preferencial o significativa la transseñalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6, (ii) no inhibir la señalización de los miembros de la familia de citosinas de gpl30 diferentes de IL6, (iii) inhibir de manera preferencial la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6 y no inhibir de manera detectable la señalización de las citosinas de la familia de gpl30 diferentes de IL6, (iv) puede tener dos o más de estas propiedades, o (v) puede tener todas estas propiedades.

En ciertas modalidades, un dominio de unión, antagonista de IL6 de polipéptido, de esta descripción se une a un complejo sIL6xR con una afinidad al menos 2 veces a 1000 veces mayor que para ya sea IL6 o IL6Ro¡, solos, y de manera más significativa o preferencial inhibe la transseñalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6. Para "inhibir de manera preferencial la transseñalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6" se refiere a alterar la trans-señalización a un grado que la actividad de sIL6xR se disminuye de manera medible en tanto que no se altere de manera sustancial la disminución en la cis-señalización de IL6 (es decir, que significa que la inhibición es mínima, no existente o no medible) . Por ejemplo, un biomarcador para la actividad de sILGxR (por ejemplo, expresión de fase aguda de antiquimiotripsina (ACT) en células HepG2) se puede medir para detectar la inhibición de la trans-señalización. Un ensayo representativo se describe por Jostock et al. (Eur. J. Biochem, 2001), de forma breve, las células HepG2 se pueden estimular para sobreexpresar ACT en la presencia de sIL6xR (transseñalización) o IL-6 (cis-señalización) , pero la adición de spgl30 inhibirá la sobreexpresión de ACT inducida por sIL6xR en tanto que no afecta de forma sustancial la expresión inducida por IL6. De manera similar, un dominio unión de polipéptido de esta descripción que inhibe de manera preferencial la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6 inhibirá la sobreexpresión de ACT inducida por sIL6xR (es decir, inhiben la transseñalización) , en tanto que no afecta de manera sustancial la expresión inducida por IL-6 (es decir, no disminuye de manera medible la cis-señalización) . Este y otros ensayos conocidos en la técnica se puede usar para medir la inhibición preferencial de la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6 (ver, por ejemplo, otros biomarcadores descritos en Sporri et al. (1999) Int. Immunol 11:1053; Mihara et al. (1995) Br . J. Rheum 34:321; Chen et al. (2004) Immun 20:59).

En modalidades adicionales, la señalización por las citosinas de la familia de gpl30 diferentes de IL6 no se inhibe de manera sustancial por los polipéptidos del dominio de unión o proteínas de fusión de los mismos de esta descripción. Por ejemplo, la trans-señalización por un complejo IL6xR mediante gpl30 se inhibirá, pero será mínima o no se afectará la señalización por una o más de las citosinas diferentes de la familia de gpl30 tal como la señalización mediante el factor inhibitorio de leucemia (LIF) , factor neurotrófico ciliar (CNTF) , neuropoyetina (NP) , citosina tipo cardiotropina (CLC) , oncostatina M (OSM) , IL-27, IL-31, cardiotrofina- 1 (CT-1) , o cualquier combinación de los mismos .

Adicionalmente , se puede proporcionar la interacción de un dominio de unión con una molécula objetivo como una medida de la asociación o disociación cinética de esa interacción. La asociación cinética (ka) , también referida en la presente como KASOCIACIÓN/ es una medida de la velocidad a la cual se presenta la interacción de unión. En una modalidad, la KASOCIACIÓN puede ser una medida de la probabilidad de un dominio de unión no unida a una molécula objetivo, dado el tiempo promedio en que una molécula no unida está en un área de superficie celular en la cual se puede unir y da la concentración de moléculas no unidas en la superficie celular en esta área. La ka (KDISOCIACIÓN) tiene unidades de l/M- segundo. En ciertas modalidades, un valor de ¾ISOCIACIÓN puede ser mayor de aproximadamente 103/M-segundo, aproximadamente 104/M-segundo, aproximadamente 105/M- segundo, aproximadamente 105/M-segundo, aproximadamente 107/M-segundo, aproximadamente 108/M-segundo, aproximadamente 109/M- segundo, aproximadamente 1010/M- segundo, o mayor. En el caso donde el dominio de unión sea scFv, la KASOCIACIÓN puede variar desde menos de aproximadamente 104/M- segundo a aproximadamente 107/M- segundo (Ulrik et al. (2000) Cáncer Res. 60:6434; Xavier y Willson (1998) Biophys. J. 74:2036). La kASOciAcióN para un dominio de unión se puede medir usando métodos conocidos en la técnica, tal como resonancia en plasmón superficial (Leonard et al. (2007) J. Immunol. Methods 323:172).

La disociación cinética (kd) , también referida en la presente como kDisociAcióN/ es una medida de la velocidad de disociación compleja, y de esta manera, el "tiempo de residencia" de la molécula objetivo unida por un dominio de unión de polipéptido de esta descripción. La kd (kDISOciAcióN) tiene unidades de 1/segundo. Se apreciará por los expertos en la técnica que la vida media in vivo preferida de un dominio de unión de esta descripción está en el orden de días o semanas, pero en tanto que puede ser baja la concentración del dominio de unión, el objetivo puede ser abundante puesto que tanto la producción de IL como de sIL6 puede ser bastante elevada en estados de enfermedad (ver, por ejemplo, Lu et al. (1993) Cytokine 5:578). De esta manera, en ciertas modalidades, un dominio de unión de esta descripción tiene una kDISOciAcióN de aproximadamente 10"5/segundo (por ejemplo, aproximadamente un día) o menos. En ciertas modalidades, la ^DISOCIACIÓN puede variar desde aproximadamente 10"1/segundo, aproximadamente 10"2/segundo, aproximadamente 10"3/segundo, aproximadamente 10"Vsegundo, aproximadamente 10"5/segundo, aproximadamente 10"6/segundo, aproximadamente 10"7/segundo, aproximadamente 10"Vsegundo, aproximadamente 10"9/segundo, aproximadamente I0"10/segundo, o menos (ver Graff et al. (2004) Protein Eng. Des. Sel. 17:293).

Los dominios de unión de esta descripción se pueden generar como se describe en la presente o por una variedad de métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,291,161; 6,291,158). Las fuentes incluyen secuencias génicas de anticuerpo de varias especies (que se pueden formatear como anticuerpos, sFv, scFv o Fab, tal como en una biblioteca de fagos) , incluyendo humano, camélido (de camellos, dromedarios, o llamas; Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363:446 y Nguyen et al. (1998) 1. Mol. Biol., 275:413), tiburón (Roux et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804), pez (Nguyen et al. (2002) Immunogenetics, 54:39), roedor, aviar, ovino, secuencias que codifican para bibliotecas de péptidos aleatorios o secuencias que codifican para una diversidad manejada de aminoácidos en regiones asa de núcleos alternativos no de anticuerpo, tal como dominios de fibrinógeno (ver, por ejemplo, Weisel et al. (1985) Science 230:1388), dominios Kunitz (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 6,423,498), dominios lipocalina (ver, por ejemplo, WO 2006/095164), dominios tipo V (ver, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de los estados unidos No. 2007/0065431) , dominios de lectina tipo C (Zelensky y Gready (2005) FEBS 1. 272:6179), mAb2 o FcabMR (ver, por ejemplo, Publicaciones de Solicitud de Patente PCT Nos. WO 2007/098934; WO 2006/072620), o similares. Adicionalmente , las estrategias tradicionales para el desarrollo de hibridomas usando un complejo IL6xR de cadena individual sintético, tal como un complejo IL6xR humano o Hiper-IL6, como un inmunógeno en sistemas convenientes (por ejemplo, ratones, ratón HuMAbMR, ratón TCMR, ratón KMMR, llamas, pollos, ratas, hámsteres, conejos, etc.), se pueden usar para desarrollar dominios de unión de esta descripción.

En un ejemplo ilustrativo, los dominios de unión de esta descripción específicos para, un complejo IL6xR se identificaron en una biblioteca de fagos de Fab de fragmentos (ver Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol . 23:344) al examinar para la unión a un complejo IL6xR sintético. El complejo IL6xR sintético usando para esta selección comprende una estructura de . N-IL6Ra (frag) -L1-IL6 (frag) -L2-ID-C, en donde N es el amino-terminal y C es el carboxi -terminal , IL6Ra(frag) es un fragmento de IL6Ra de longitud completa, IL6(frag) es un fragmento de IL6, Ll y L2 son ligadores, e ID es un dominio interpuesto o de dimerización, tal como un dominio de Fe de inmunoglobulina .

De manera más específica un IL6xR (que es una forma de Hiper-IL6) usado para identificar los dominios de unión, específicos para el complejo IL6xR, tiene una estructura, desde el amino-terminal al carboxi-terminal como sigue; (a) un fragmento central de 212 aminoácidos de IL6Ra que le faltan los primeros 110 aminoácidos de la proteína de longitud completa y una porción carboxi -terminal que dependerá de la isoforma usada (ver Acceso al GenBank No. NP_000556.1, isoforma 1 o NP_852004.1, isoforma 2) fusionado a (2) un ligador de G3S que a su vez está fusionado a (3) un fragmento carboxi-terminal de 175 aminoácidos de IL6 (es decir, que carece de los primeros 27 aminoácidos de la proteína de longitud completa; Acceso al GenBank No. NP_000591.1) que a su vez está fusionado a (4) un ligador que es una charnela de IgG2A como se expone en SEQ ID NO: 589, que finalmente está fusionado a un dominio de dimerización comprendido de un dominio Fe de inmunoglobulina Gl (IgGl) . En ciertas modalidades, el dominio de dimerización comprendido de un dominio Fe de IgGl tiene uno o más de los siguientes aminoácidos mutados (es decir, tiene un diferente aminoácido en esa posición) : leucina en la posición 234 (L234) , leucina en la posición 235 (L235) , glicina en la posición 237 (G237) , glutamato en la posición 318 (E318) , lisina en la posición 320 (K320) , lisina en la posición 322 (K322) , o cualquier combinación de los mismos (numeración EU) . Por ejemplo, cualquiera de estos aminoácidos se puede cambiar a alanina. En una modalidad adicional, un dominio Fe de IgGl tiene cada uno de L234, L235, G237, E318, K320, y K322 (de acuerdo a la numeración de Kabat) mutado a alanina (es decir, L234A, L235A, G237A, E318A, K320A, y K322A, respectivamente) .

En una modalidad, un complejo IL6xR usado para identificar los dominios, de unión, antagonistas de IL6, de esta descripción, tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 606. En ciertas modalidades, se proporcionan polipéptidos que contienen un dominio de unión específico para un complejo IL6xR, en donde el IL6xR es un sIL6xR y tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SE IQ NO: 606. En modalidades adicionales, los polipéptidos que contienen un dominio de unión específico para un complejo IL6xR (1) tienen una mayor o igual afinidad para un complejo IL6xR que para IL6 o IL6Ra solos, o tiene mayor afinidad para IL6Ra solos o un complejo IL6xR que para IL6 sola, (2) compiten con gpl30 de membrana para la unión con un complejo sIL6xR o incrementan la unión de gpl30 soluble al complejo sIL6xR, (3) inhiben de manera preferencial la transseñalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6, o (4) no inhiben la señalización de las citosinas de la familia gpl30 diferentes de IL6 , (5) tienen cualquier combinación de los mismos de las propiedades (l)-(4), o (6) tienen todas las propiedades de (l)-(4). Otros complejos IL6xR de ejemplo que se pueden usar para identificar dominios de unión de la presente descripción o usar como complejos de referencia para medir cualquiera de las propiedades de unión, mencionadas anteriormente, se describen, por ejemplo, en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Números 2007/0172458; 2007/0031376; y patentes de los Estados Unidos Números 7,198,781; 5,919,763.

En algunas modalidades, los dominios, de unión, antagonistas de IL6 de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para IL6, IL6R o - complejo IL6xR como se describe en la presente, de manera preferente IL6 humana, IL6R humano, o complejo IL6xR humano. En ciertas modalidades, los dominios VH y VL son de roedor (por ejemplo, ratón, rata), humanizados o de humano. Los ejemplos de dominios de unión que contienen estos dominios VH y VL específicos para IL6, IL6R, o IL6xR se exponen en SEQ ID NOS:435-496 y 805-810 y 373-434 y 799-804, respectivamente. En modalidades adicionales, se proporcionan dominios de unión de polipéptido, específicos para IL6xR en donde el dominio de unión comprende una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 %, o al menos 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una o más regiones variables de cadena ligera (VL) o una o más regiones variables de cadena pesada (VH) , o ambas, como se expone en SEQ ID NOS:373-434 y 799-804, y 435-496 y 805-810, respectivamente, en donde cada CDR tiene hasta tres cambios de aminoácido (es decir, muchos de los cambios se encuentran en una o más de las regiones menos variables) .

En modalidades adicionales, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para IL6xR como se expone en SEQ ID NOS:435-496 y 805-810, y 373-434 y 799-804, respectivamente, que son al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 % , al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o al menos 99.5 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de este dominio VH, dominio VL, o ambos, en donde cada CDR tiene cero, uno, dos, o tres cambios de aminoácido. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de un dominio VH, dominio VL( o ambos de esta descripción puede ser al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 % , al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o al menos 99.5 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH (por ejemplo, aminoácidos 512 a 631), dominio VL (por ejemplo, aminoácidos - 649 a 759), o ambos, respectivamente, de un dominió de unión de ejemplo encontrado en TRU(XT6) -1002 de unión (ver SEQ ID NO:608), en donde cada CDR tiene cero, uno, dos o tres cambios de aminoácido.

Los términos "idéntico" o "por ciento de identidad" , en el contexto de dos o más secuencias de molécula de ácido nucleico o polipéptido, significa dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos sobre una región especificada (por ejemplo 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % de identidad) , en comparación y alineadas para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada, como se mide usando los métodos conocidos en la técnica, tal como un algoritmo de comparación de secuencia, por alineación manual, o por inspección visual. Por ejemplo, los algoritmos preferidos adecuados para determinar el por ciento de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389 y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol . 215:403, respectivamente.

En cualquiera de estas u otras modalidades descritas en la presente, los dominios VL y VH se pueden arreglar en cualquier orientación y pueden estar separados por aproximadamente un ligador de cinco a aproximadamente treinta aminoácidos como se describe en a presente o cualquier otra secuencia de aminoácidos capaz de proporcionar una función separadora compatible con la interacción de los dos dominios de sub-unión. En ciertas modalidades, un ligador que une los dominios VL y VH comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:497-604 y 823-828, tal como el Ligador 47 (SEQ ID NO: 543) o Ligador 80 (SEQ ID NO:576). Los dominios de unión, multiespecíficos , tendrán al menos dos dominios específicos de sub-unión, por analogía a la organización de anticuerpos de camélidos, o al menos cuatro dominios específicos de sub-unión, por analogía a la organización más convencional de anticuerpos mamíferos de cadenas apareadas VH y VL.

En modalidades adicionales, los dominios de unión específicos para antagonistas de IL6 de esta descripción pueden comprender una (preferentemente CDR3) o más regiones determinantes de complementariedad ("CDR"), o múltiples copias de una o más de estas CDR, que se han obtenido, derivado, o diseñado de regiones variables de un fragmento scFv o Fab anti-IL6, anti-IL6R, o anti-IL6xR o de regiones variables de cadena pesada o ligera de los mismos.

Las CDR se definen de varias maneras en la técnica, incluyendo las definiciones de Kabat , Chothia, AbM y de contacto. La definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia y es la definición más comúnmente usada para predecir regiones CDR (Johnson et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:214). La definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones asa estructurales (Chothia et al. (1986) J. Mol. Biol. 196:901; Chothia et al. (1989) Nature 342:877). La definición AbM, un compromiso entre las definiciones de Kabat y Chothia, es una suite integral de programas para modelado de estructuras de anticuerpo, producida por el Oxford Molecular Group (Martin et al. (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 86:9268; Rees et al., ABMTM, un programa de computadora para modelar regiones variables de anticuerpos, Oxford, RU; Oxford Molecular, Ltd.). Recientemente, se ha introducido (ver MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 5:732), una definición adicional, conocida como la definición de contacto que se basa en un análisis de las estructuras cristalinas, complejas, disponibles.

Por convención, los dominios de CDR en la cadena pesada se refieren como Hl, H2 y H3 , que se numeran de manera secuencial en el orden que se mueve desde el amino-terminal al carboxi-terminal . La CDR-H1 es de aproximadamente diez a 12 residuos de longitud e inicia cuatro residuos después de Cys de acuerdo a las definiciones de Chothia y de AbM, o cinco residuos después de acuerdo a la definición de Kabat . El Hl se puede seguir por un Trp, Trp-Val, Trp-Ile, o Trp-Ala. La longitud de Hl es aproximadamente de diez a 12 residuos de acuerdo a la definición de AbM, en tanto que la definición de Chothia excluye los últimos cuatro residuos. La CDR-H2 inicia 15 residuos después del extremo de Hl de acuerdo a las definiciones de Kabat y de AbM, que en general se precede por la secuencia Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (pero se conocen varias variaciones) y en general se sigue por la secuencia Lys/Arg-Leu/lle/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala . De acuerdo a la definición de Kabat, la longitud de H2 es de aproximadamente 16 a 19 residuos, en tanto que la definición de AbM predice que la longitud es de nueve a 12 residuos. La CDR-H3 inicia usualmente 33 residuos después del extremo de H2 , en general se precede por la secuencia de aminoácidos Cys-Ala-Arg y se sigue por el aminoácido Gly, y tiene una longitud que varía desde tres a aproximadamente 25 residuos.

Por convención, las regiones CDR en la cadena ligera se refieren como Ll, L2, y L3 , que se numeran de manera secuencial en el orden que se mueve desde el amino-terminal al carboxi-terminal . La CDR-L1 inicia en general en aproximadamente el residuo 24 y sigue en general una Cys . El residuo después de la CDR-L1 es si'empre Trp, que empieza una de las siguientes secuencias: Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, o Trp-Tyr-Leu. La longitud de CDR-L1 es aproximadamente de diez a 17 residuos. La CDR-L2 inicia aproximadamente 16 residuos después del extreme de Ll y seguirá en general los residuos Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys, o Ile-Phe. La CDR-L2 es de aproximadamente siete residuos de longitud. La CDR-L3 usualmente inicia 33 residuos después del extremo L2 y en general sigue una Cys, que en general se sigue por la secuencia Phe-Gly-XXX-Gly y tiene una longitud de aproximadamente siete a 11 residuos.

De esta manera, un dominio de unión de esta descripción puede comprender una CDR3 individual de una región variable de un anti-IL6, anti-IL6R, anti-IL6xR, o puede comprender múltiples CDR que pueden ser las mismas o diferentes. En ciertas modalidades, los dominios de unión, antagonistas de IL6, de esta descripción, comprenden dominios H y VL que comprenden regiones menos variables y regiones CDR1, CR2 y CDR3 , en donde (a) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de una CDR3 de cadena pesada encontrada en cualquiera de SEQ ID NOS:435-496 y 805-810; o (b) el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de una CDR3 de cadena pesada encontrada en cualquiera de SEQ ID NOS: 373-434 y 799-804; o (c) el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) ; o el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) y en donde la VH y VL se encuentran en la misma secuencia de referencia. En modalidades adicionales, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para una IL6, IL6R, o complejo IL6xR que comprende regiones menos variables y regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 , en donde (a) el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, encontradas en cualquiera de SEQ ID NOS: 435-496 y 805-810 o (b) el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera encontrada en cualquiera de SEQ ID NOS: 373-434 y 799-804; o (c) el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) ; o el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) , en donde las secuencias de aminoácidos de VH y VL son de la misma secuencia de referencia. Las CDR del dominio variable de cadena ligera y pesada, antagonista de IL6 de ejemplo se proporcionan en SEQ ID NOS:l-186 y 787-792, y 187-372 y 793-798, respectivamente. Las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada, antagonistas de IL6 se proporcionan en SEQ ID NOS:373-434 y 799-804, y 435-496 y 805-810, respectivamente.

En cualquiera de las modalidades descritas en la presente que comprenden CDR específicas, un dominio de unión, antagonista de IL6, puede comprender (i) un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH encontrado en cualquiera de SEQ ID NOS: 435-496 y 805-810, en donde cada CDR tiene desde cero a tres cambios de aminoácido; o (ii) un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de un dominio VL encontrado en cualquiera de SEQ ID NOS: 373-434 y 799-804, en donde cada CDR tiene desde cero a tres cambios de aminoácido; o (iii) tanto un dominio VH de (i) como un dominio VL de (ii) ; o tanto un dominio VH de (i) como un dominio VL de (ii) , en donde la VH y VL son de la misma secuencia de referencia.

En ciertas modalidades, un dominio, de unión, antagonista IL6 de esta descripción puede ser un dominio tipo inmunoglobulina, tal como un núcleo de inmunoglobulina . Los núcleos de inmunoglobulina contemplados en esta descripción incluyen scFv, Fab, un anticuerpo de dominio, o un anticuerpo solo de cadena pesada. En modalidades adicionales, se proporcionan anticuerpos anti-IL6 o anti-IL6xR (por ejemplo, no humanos tal como de ratón o rata, quiméricos, humanizados, humanos) o fragmentos Fab o fragmentos scFv que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, %, o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH y VL expuesto en cualquiera de SEQ ID NOS: 435-496 y 805-810, y 373-434 y 799-804, respectivamente, que también tienen una o más de las siguientes propiedades: (1) tienen mayor o igual afinidad para un complejo IL6xR que para IL6 o IL6ROÍ solos, (2) compiten con gpl30 soluble o de membrana para la unión con un complejo sIL6xR o incrementa la unión de gpl30 soluble al complejo sIL6xR, (3) inhibe de manera preferencial la trans-señalización de IL con respecto a la cis-señalización de IL-6, o (4) no inhiben la señalización de las citosinas de la familia gpl30 diferentes de IL6. Estos anticuerpos, Fab y scFv se pueden usar en cualquiera de los métodos descritos en la presente. En ciertas modalidades, la presente descripción proporciona polipéptidos que contiene un dominio de unión que es un antagonista de IL6 (es decir, puede inhibir la cis- trans-señalización de IL6) . En modalidades adicionales, un antagonista de IL6 de acuerdo a esta descripción no inhibe la señalización de las citosinas de la familia de gpl30 diferentes de IL6. Los antagonistas de IL6 de ejemplo incluyen dominios de unión específicos para IL6, IL6R, o IL6xR, tal como un dominio de unión variable de inmunoglobulina, o derivado del mismo (por ejemplo, un anticuerpo, Fab, scFv, o similares) .

De manera alternativa, los dominios de unión de esta descripción pueden ser parte de un núcleo diferente de una inmunoglobulina . Otros núcleos contemplados incluyen una molécula de dominio A, un dominio de fibronectina III, una anticalina, una molécula de unión, manejada, de repetición de anquirina, una adnectina, o un dominio de Kunitz, o un aficuerpo de dominio de proteína AZ.

Como se señala en la presente, se contemplan variantes y derivados de dominios de unión tal como, regiones variables ligeras y pesadas y las CDR descritas en la presente. En un ejemplo, se proporcionan variantes de inserción en donde uno o más residuos de aminoácidos complementan una secuencia específica de aminoácidos del agente de unión. Las sensaciones pueden estar localizadas en cualquiera o ambos términos de la proteína, o pueden estar colocadas dentro de regiones internas de la secuencia específica de aminoácidos del agente de unión. Los productos variantes de esta descripción también incluyen productos específicos maduros del agente de unión, es decir, productos específicos del agente de unión en donde se remueve una secuencia guío o secuencia de señal, y la proteína resultante tiene residuos amino-terminales adicionales. Los residuos amino-terminales adicionales se pueden derivar de otra proteína, o pueden incluir uno o más residuos que no se pueden identificar como que se derivan de una proteína específica. Se contemplan polipéptidos con resido adicional de metionina en la posición menos -1, como que son los polipéptidos de esta descripción con residuos adicionales de metionina y lisina en las posiciones -2 y -1. Son particularmente útiles las variantes que tienen residuos adicionales de Met, Met-Lys, o Lys (o uno o más residuos básicos en general) para la producción mejorada de proteínas recombinantes en células hospedadoras bacterianas .

Como se usa en la presente, "aminoácidos" se refiere a un aminoácido natural (aquellos que se presentan en la naturaleza) , un aminoácido natural sustituido, un aminoácido no natural, un aminoácido no natural sustituido, o cualquiera combinación de los mismos. Las designaciones para aminoácidos naturales se exponen en la presente ya sea como el código normal de una o de tres letras. Los aminoácidos polares naturales incluyen asparagina (Asp o N) y glutamina (Gln o Q) ; así como aminoácidos básicos tal como arginina (Arg o R) , lisina (Lys o K) , histidina (His o H) , y derivados de los mismos; y aminoácido ácidos tal como ácido aspártico (Asp o D) ácido glutámico (Glu o E) , y derivados de los mismos. Los aminoácidos hidrófobos naturales incluyen triptófano (Trp o W) , fenilalanina (Phe o F) , isoleucina (lie o I) , leucina (Leu o L) , metionina (Met o M) , valina (Val o V) , y derivados de los mismos; así como otros aminoácidos no polares tal como glicina (Gly o G) , alanina (Ala o A) , prolina (Pro o P) , y derivados de los mismos. Los aminoácidos naturales de polaridad intermedia incluyen serina (Ser o S) , treonina (Thr o T) , tirosina (Tyr o Y) , cisteína (Cys o C) , y derivados de los mismos. Al menos que se especifique de otro modo, cualquier aminoácido descrito en la presente puede estar ya sea en la conFiguración D o L.

Las variantes de sustitución incluyen aquellas proteínas de fusión en donde se remueven uno o más residuos de aminoácido en una secuencia de aminoácidos y se reemplazan con residuos alternativos. En algunas modalidades, las sustituciones son de naturaleza conservadora; sin embargo, esta descripción abarca sustituciones que también no son conservadoras. Los aminoácido se pueden clasificar de acuerdo a propiedades físicas y a la contribución a la estructura secundaria y terciaria de la proteína. En la técnica se reconoce una sustitución conservadora como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. Las sustituciones conservadoras de ejemplo se exponen en la Tabla 1 (ver WO 97/09433, página 10, publicada el 13 de Marzo de 1997), inmediatamente a continuación.

Tabla 1. Sustituciones conservadoras I Cadena lateral Característica aminoácidos Alifática No polar G, A, P, I, L, V Polar - no cargada S, T, M, N, Q Polar - cargada D, E, K, R Aromática H, F, W,Y Cadena lateral Característica aminoácidos Otra N, Q, E, D manera alternativa, los aminoácidos conservadores se pueden agrupar como se describe en Lehninger (Biochemistry, Second Edition; orth Publishers, Inc. NY.-NY (1975), páginas 71-77) como se expone en la tabla 2, inmediatamente a continuación.

Tabla 2. Sustituciones Conservadoras II Las variantes o derivados también pueden tener residuos adicionales de aminoácido que surgen del uso de sistemas específicos de expresión. Por ejemplo, el uso de vectores comercialmente disponibles que expresan un polipéptido deseado como parte de un producto de fusión de glutationa-S-transferasa (GST) proporciona el polipéptido deseado que tiene un residuo adicional de lisina en la posición -1 después de la escisión del componente de GST del polipéptido deseado. Las variantes que resultan de la expresión en otros sistemas de vector también se contempla, incluyendo aquellas en donde se incorporan marcas de histidina en la secuencia de aminoácidos en general en el carboxi-terminal y/o amino de la secuencia.

También se contemplan variantes de supresión, en donde se remueven uno o más residuos de aminoácidos en un dominio de unión de esta descripción. Se pueden efectuar supresiones en uno o ambos términos de la proteína de fusión, o de la remoción de uno o más residuos dentro de la secuencia de aminoácidos.

Proteínas de Fusión de Dominio, de Unión, antagonista de IL6 Como se expone en la presente, un dominio de unión de polipéptido de esta descripción puede además ser parte de una proteína de fusión en la cual se fusiona al amino-terminal, carboxi-terminal , o ambos extremos de un dominio interpuesto (por ejemplo, una región o sub-región constante de inmunoglobulina del mismo) . Las proteínas de fusión de ejemplo de esta descripción incluyen proteínas SMIP, proteínas PIMS, proteínas de fusión de dominio de unión, monoespecíficas , multivalentes , proteínas de fusión de dominio de unión, multi-específicas , o similares. El uno o más dominios de unión se pueden unir a un dominio interpuesto mediante un ligador conocido en la técnica o como se describe en la presente.

Como se usa en la presente, un "dominio interpuesto" se refiere a una secuencia de aminoácidos que funciona simplemente como un núcleo para uno o más dominios de unión de modo que la proteína de fusión existirá principalmente (por ejemplo, 50 % o más de una población de proteínas de fusión) o sustancialmente (por ejemplo, 90 % o más de una población de proteínas de fusión) como un polipéptido de cadena individual en una composición. Por ejemplo, ciertos dominios interpuestos pueden tener una función estructural (por ejemplo, separación, flexibilidad, rigidez) o función biológica (por ejemplo, una vida media incrementada en plasma, tal como en sangre humana) . Los dominios interpuestos de ejemplo que pueden incrementar la vida media de las proteínas de fusión de esta descripción en plasma incluyen albúmina, transíerrina, un dominio de núcleo que se une a una proteína de suero, o similar, o fragmentos de la misma.

En modalidades preferidas, un dominio interpuesto de una proteína de fusión multi-específica de esta descripción es un "dominio de dimerización" que se refiere a una secuencia de aminoácidos capaz de promover la asociación de al menos dos polipéptidos o proteínas de cadena individual mediante interacciones no covalentes o covalentes, tal como por unión por hidrógeno, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der aal, enlaces de disulfuro, puentes de sal, interacciones hidrófobas, o similares, o cualquier combinación de las mismas. Los dominios de dimerización de ejemplo incluyen regiones o sub-regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, CH2CH3) . Se va a entender que un dominio de dimerización también puede promover la formación de complejos de multímero de mayor orden, incluyendo trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, septámeros, octámeros, etc.

Una "sub-región constante" es un término definido en la presente para referirse a un péptido, polipéptido, o secuencia de proteína que corresponde a, o se deriva de, parte o todo de uno o más dominios de región constante de inmunoglobulina, pero no contiene todos los dominios de región constante encontrados en un anticuerpo fuente. En algunas modalidades, los dominios de región constante de una proteína de fusión de esta descripción carecen o tienen funciones efectoras mínimas de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) , fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCP) , o activación de complemento y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) , en tanto que retiene la capacidad para unirse a algunos receptores Fc (tal como unión a FcRn) y de retener una vida media relativamente prolongada in vivo. En ciertas modalidades, un dominio de unión de esta descripción se fusiona a una región o sub-región constante de IgGl humana, en donde la región o sub-región constante de IgGl tiene uno o más de los siguientes aminoácidos mutados : leucina en la posición 234 (L234), leucina en la posición 235 (L235), glicina en la posición 237 (G237) , glutamato en la posición 318 (E318) , lisina en la posición 320 (K320) , lisina en la posición 322 (K322), o cualquier combinación de los mismos (numeración EU) .

Se conocen métodos, en la técnica, para producir mutaciones dentro o fuera de un dominio Fc que puedan alterar las interacciones de Fc con los receptores de Fc (CD16, CD32, CD64, CD89, FceRl, FcRn) o con el componente de complemento Clq (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,624,821; Presta (2002) Curr. Pharma. Biotechnol . 3:237). Las modalidades particulares de esta descripción incluyen composiciones que comprenden inmunoglobulina o proteínas de fusión que tienen una región o sub-región constante de IgG humana en donde se conserva la unión a FcRn y proteína A y en donde el dominio de Fc no interactúa por más tiempo o interactúa de manera mínima con otros receptores de Fc o con Clq. Por ejemplo, se puede fusionar un dominio de unión de esta descripción a una región o sub-región constante de IgGl humana en donde la asparagina en la posición 297 (N297 según numeración EU) se ha mutado a otro aminoácido para reducir o eliminar la glicosilación en el sitio, y por lo tanto, anular la unión eficiente de Fe a FcyR y Clq. Otra mutación de ejemplo es un P331S, que suprime la unión de Clq pero no afecta la unión de Fe.

En modalidades adicionales, una región Fe de inmunoglobulina puede tener un patrón alterado de glicosilación con relación a una secuencia de referencia de inmunoglobulina. Por ejemplo, se puede emplear cualquiera de una variedad de técnicas genéticas para alterar uno o más residuos particulares de aminoácido que forman un sitio de glicosilación (ver Co et al. (1993) Mol. Immunol . 30:1361; Jacquemon et al. (2006) J. Thromb. Haemost . 4:1047; Schuster et al. (2005) Cáncer Res. 65:7934; Warnock et al. (2005) Biotechnol . Bioeng. 92:831). De manera alternativa, las células hospedadoras en las cuales se producen las proteínas de fusión de esta descripción, se pueden manejar para producir un patrón alterado de glicosilación. Un método conocido en la técnica, proporciona, por ejemplo, glicosilación alterada en la forma de variantes divididas, no fucosiladas que incrementan la ADCC. Las variantes resultan de la expresión en una célula hospederaa que contiene una enzima modificadora de oligosacárido . De manera alternativa, la tecnología Potelligent de Bio a/Kyowa Hakko se contempla para reducir el contenido de fucosa de moléculas glicosiladas de acuerdo a esta descripción. En un método conocido, se proporciona una célula hospederaa CHO para producción recombinante de inmunoglobulina que modifica el patrón de glicosilación de la región Fe de inmunoglobulina, a través de la producción de GDP-fucosa.

De manera alternativa, se usan técnicas químicas para alterar el patrón de glicosilación de proteínas de fusión de esta descripción. Por ejemplo, una variedad de inhibidores de glucosidasa y/o manosidasa proporcionan uno o más de los efectos deseados para incrementar la actividad de ADCC, incrementar la unión del receptor de Fe, y alterar el patrón de glicosilación. En ciertas modalidades, las células que expresan una proteína de fusión, de la presente descripción se cultivan en un medio de cultivo que comprende un modificador de carbohidrato a una concentración que incrementa la ADCC de las moléculas de inmunoglicoproteína producidas por esta célula hospederaa, en donde el modificador de carbohidrato está a una concentración de menos de 800 µ?. En una modalidad preferida, las células que expresan estas proteínas de fusión, multi -específicas , se cultivan en un medio de cultivo que comprende castanospermina o cifunensina, de manera más preferente castanospermina a una concentración de 100-800 µ?, tal como 100 µ?, 200 µ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ , 700 µ?, o 800 µ?. Se proporcionan métodos para alterar la glicosilación con un modificador de carbohidrato tal como castanorpermina en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2009/0041756 o Publicación PCT No. WO 2008/052030.

En otra modalidad, la región Fe de inmunoglobulina puede tener modificaciones de aminoácido que afectan la unión a los receptores Fe de células efectoras . Estas modificaciones se pueden hacer usando cualquier técnica conocida, tal como el planteamiento descrito en Presta et al. (2001) Biochem. Soc. Trans . 30:487. En otro planteamiento, está disponible la tecnología Xencor XmAb para manejar sub-regiones constantes que corresponden a dominios Fe para mejorar la función efectora de aniquilación celular (ver Lazar et al. (2006) Proc. Nat ? . Acad. Sci. (USA) 103:4005). Usando este planteamiento, por ejemplo, se pueden generar sub-regiones constantes con especificidad y unión mejoradas para FcR, mejorando de este modo la función efectora de aniquilación celular.

En aún modalidades adicionales, una región o sub-región constante puede incrementar de manera opcional la vida media en plasma o la transferencia placentaria en comparación a una proteína de fusión correspondiente que carece de este dominio interpuesto. En ciertas modalidades, la vida media en plasma, prolongada, de una proteína de fusión de esta descripción, es al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos diez, al menos 12, al menos 18, al menos 20, al menos 24, al menos 30, al menos 36, al menos 40, al menos 48 horas, al menos varios días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos varas semanas, al menos un mes, al menos dos meses, al menos varios meses, o más en un humano .

Una sub- región constante puede incluir parte o todo de cualquiera de los siguientes dominios: un dominio 0?2, un dominio CH3 (IgA, IgD, IgG, IgE, o IgM) , y un dominio CH4 (IgE o IgM) . Un sub-región constante como se define en la presente, por lo tanto, puede referirse a un polipéptido que corresponde a una porción de una región constante de inmunoglobulina . La sub- región constante puede comprender un dominio CH2 y un dominio CH3 derivado de la misma o diferente inmunoglobulina, isotipos de anticuerpo, o variantes alélicas (por ejemplo, ambos son IgGl o uno es IgGl y el otro es IgG2) . En algunas modalidades, el dominio CH3 está truncado y comprende una secuencia carboxi-terminal listada en la Publicación PCT No. WO 2007/146968 como SEQ ID NO:366-371, secuencias que se incorporan de este modo como referencia. En ciertas modalidades, una sub-región constante de un polipéptido de esta descripción tiene un dominio CH2 y domino CH3, que pueden tener opcionalmente un ligador amino-terminal , un ligador carboxi-terminal , o un ligador en ambos extremos.

Un "ligador" es un péptido que une o enlaza a otros péptidos o polipéptidos , tal como un ligador de aproximadamente 2 a aproximadamente 150 aminoácidos. En las proteínas de fusión de esta descripción, un ligador puede unirse a un dominio interpuesto (por ejemplo, una sub-región constante derivada de inmunoglobulina) a un dominio de unión o un ligador puede unirse a dos regiones variables de un dominio de unión. Por ejemplo, en ligador puede ser una secuencia de aminoácidos obtenida, derivada o diseñada de una secuencia de región de charnela de anticuerpo, una secuencia que enlaza un dominio de unión a un receptor, o una secuencia que enlaza un dominio de unión a una región transmembrana de superficies celular o ancla de membrana. En algunas modalidades, un ligador puede tener al menos una cisteína capaz de participar en al menos un enlace de disulfuro bajo condiciones fisiológicas u otras condiciones peptídicas normales (por ejemplo, condiciones de purificación de péptidos, condiciones para almacenamiento de péptidos) . En ciertas modalidades, un ligador que corresponde o es similar a un péptido de charnela de inmunoglobulina retiene una cisteína que corresponde a la cisteína de charnela colocada hacia el amino-terminal de esa charnela. En modalidades adicionales, un ligador es de una charnela de IgGl y tiene una cisteína o dos cisteínas que corresponden a cisteínas de charnela. En ciertas modalidades, uno o más enlaces de disulfuro se forman como enlaces de disulfuro inter-cadena entre dominios interpuestos. En otras modalidades, las proteínas de fusión de esta descripción pueden tener un dominio interpuesto fusionado directamente a un dominio de unión (es decir, ausente de un ligador o charnela) . En algunas modalidades, el dominio interpuesto es un dominio de dimerización .

Adicionalmente , un dominio de unión puede comprender un dominio VH y VL y estos dominios de región variable se pueden combinar por un ligador. Los ligadores de dominio de unión de región variable de ejemplo incluyen aquellos que corresponden a la familia (GlynSer) , tal como (Gly3Ser) n (Gly4Ser) 1# (Gly3Ser) 1 (Gly4Ser) n, (Gly3Ser) n (Gly4Ser) n, o (Gly4Ser)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 (ver, por ejemplo, Ligadores 22, 29, 46, 89, 90, y 116 que corresponden a SEQ ID NOS:518, 525, 542, 585, 586 y 603, respectivamente). En modalidades preferidas, estos ligadores basados en (GlynSer) se usan para enlazar dominios variables y no se usan para enlazar un dominio de unión a un dominio interpuesto .

El dominio interpuesto o de dimerización de las proteínas de fusión, de esta descripción, se puede conectar a uno o más dominios terminales de unión por un ligador peptídico. Además de proporcionar una función de separación, un ligador puede proporcionar flexibilidad o rigidez adecuada para orientar apropiadamente el uno o más dominios de unión de una proteína de fusión, ambos dentro de la proteína de fusión y entre o en medio de las proteínas de fusión y sus objetivos o dianas. Adicionalmente, un ligador puede soportar la expresión de una proteína de fusión de longitud completa y la estabilidad de la proteína purificada tanto in vitro como in vivo después de la administración a un sujeto en necesidad del mismo, tal como un humano, y de manera preferente es no inmunogénico o pobremente inmunogénico en estos mismos sujetos. En ciertas modalidades, un ligador de un dominio dimerización de la proteína de fusión, dé esta descripción, pueden comprender parte o toda la charnela de inmunoglobulina humana .

Los ligadores de ejemplo que se pueden usar para unir un dominio interpuesto (por ejemplo, una sub-región constante derivada de inmunoglobulina) a un dominio de unión o para unir dos regiones variables de un dominio de unión se proporcionan en SEQ ID NO:497-604 y 823-828.

Los ligadores contemplados en esta descripción incluyen, por ejemplo, péptidos derivados de cualquier región inter-dominio de un miembro de la familia de inmunoglobulinas (por ejemplo, una región de charnela de anticuerpo) o una región de tallo de lectinas tipo C, una familia de proteínas de membranas tipo II. Estos ligadores varían de longitud desde aproximadamente dos a aproximadamente 150 aminoácidos, o de aproximadamente dos a aproximadamente 40 aminoácidos, o de aproximadamente ocho a aproximadamente 20 aminoácidos, de manera preferente de aproximadamente diez a aproximadamente 60 aminoácidos, de manera más preferente de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 aminoácidos, y de manera más preferente de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos. Por ejemplo, el Ligador 1 (SEQ ID NO:497) es de dos aminoácidos de longitud y el Ligador 116 (SEQ ID NO: 603) es de 36 aminoácidos de longitud.

Más allá de las consideraciones generales de longitud, un ligador adecuado para el uso en las proteínas de fusión de esta descripción incluye una región de charnela de anticuerpo seleccionada de una charnela de IgG, una charnela de IgA, una charnela de IgD, una charnela de IgE, o variantes de las mismas. En ciertas modalidades, un ligador puede ser una región de charnela de anticuerpos (región superior y de núcleo) seleccionada de IgGl humana, IgG2 humana, IgG3 humana, IgG4 humana, o fragmentos o variantes de las mismas. Como se usa en la presente, un ligador que es una "región de charnela de inmunoglobulina" se refiere a los aminoácidos encontrados entre el extremo carboxilo de CH1 y el extremo amino-terminal de CH2 (para IgG, IgA, y IgD) o el extremo amino-terminal de CH3 (para IgE e IgM) . Una "región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre", como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de aminoácidos que se presenta de forma natural interpuesta entre y que conecta las regiones CH1 y CH2 (para IgG, IgA, y IgD) o interpuesta entre y que conecta las regiones CH2 y CH3 (para IgE e IgM) encontradas en la cadena pesada de un anticuerpo. En modalidades preferidas, las secuencias de región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre son humanas.

De acuerdo a estudios cristalográficos, un dominio de charnela de IgG se puede subdividir de manera funcional y estructural en tres regiones: la región superior de charnela, la región núcleo o intermedia de charnela y la región inferior de charnela (Shin et al. (1992) Immunol . Rev. 130:87). Las regiones superiores de charnela de ejemplo incluyen EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 830) como se encuentra en IgGl, ERKCCVE (SEQ ID NO: 831) como se encuentra en IgG2, ELKTPLGDTT HT (SEQ ID NO: 832) o EPKSCDTPPP (SEQ ID NO: 833) como se encuentra en IgG3, y ESKYGPP (SEQ ID NO: 834) como se encuentra en IgG . Las regiones intermedias de charnela de ejemplo incluyen CPPCP (SEQ ID NO: 835) como se encuentra en IgGl y IgG2, CPRCP (SEQ ID NO: 836) como se encuentra en IgG3, y CPSCP (SEQ ID NO: 837) como se encuentra en IgG4. En tanto que los anticuerpos IgGl, IgG2 , e IgG4 parecen cada uno tener una región superior e intermedia individual, IgG3 tiene cuatro en tándem - una de ELKTPLGDTT HTCPRCP (SEQ ID NO: 838) y tres de EPKSCDTPPP CPRCP (SEQ ID NO: 839) .

Los anticuerpos IgA e IgD parecen carecer de una región tipo IgG y la IgD parece tener dos regiones superiores de charnela en tándem (ver SEQ ID NOS -.840 y 841) . Las regiones superiores de charnela tipo Silvestre de ejemplo encontradas en los anticuerpos IgAl e IgA2 se exponen en SEQ ID NOS: 842 y 843.

Los anticuerpos igE e IgM, en contraste, en lugar de una región típica de charnela tienen una región CH2 con propiedades tipo charnela. Las secuencias tipo charnela, superior, de CH2 , tipo silvestre de ejemplo de IgE e IgM se exponen en SEQ ID NO: 844 (VCSRDFTPPT VKILQSSSDG GGHFPPTIQL LCLVSGYTPG TINITWLEDG QVMDVDLSTA STTQEGELAS TQSELTLSQK HWLSDRTYTC QVTYQGHTFE DSTKKCA) y SEQ ID NO: 1255 (VIAELPPKVS VFVPPRDGFF GNPRKSKLIC QATGFSPRQI QVSWLREGKQ VGSGVTTDQV QAEAKESGPT TYKVTSTLTI KESD LGQSM FTCRVDHRGL TFQQNASSMC VP) , respectivamente .

Una "región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre, alterada" o "región alterada de charnela de inmunoglobulina" se refiere a (a) una región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre con hasta 30 % de cambios de aminoácido (por ejemplo, hasta 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de sustituciones o supresiones de aminoácido) , (b) una porción de una región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre que es al menos de 10 aminoácidos (por ejemplo, al menos 12, 13, 14 o 15 aminoácidos) de longitud con hasta 30 % de cambios de aminoácido (por ejemplo, hasta 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 ¾ de sustituciones o supresiones de aminoácido) , o (c) una porción de una región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre que comprende la región de charnela de núcleo (porción que puede ser 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 aminoácidos de longitud) . En ciertas modalidades, uno o más residuos de cisteína en una región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre, tal como una charnela de IgGl que comprende las regiones superiores y de núcleo pueden estar sustituidos por uno o más residuos diferentes de aminoácido (por ejemplo, uno o más residuos de serina) . Una región alterada de charnela de inmunoglobulina puede tener de manera alternativa o adicionalmente un residuo de prolina de una región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre, tal como una charnela de IgGl que comprende las regiones superior y de núcleo, sustituido por otro residuo de aminoácido (por ejemplo, un residuo de serina) .

Las secuencias alternativas de charnela y de ligador que se pueden usar como regiones conectadoras se pueden elaborar de porciones de receptores de superficie celular que conectan dominios tipos IgV o tipo IgC. Las regiones entre los dominios tipo IgV donde el receptor de superficie celular contiene múltiples dominios tipo IgV en tándem y entre dominios tipo IgC donde el receptor de superficie celular contiene múltiples regiones tipo IgC en tándem también se pueden usar como regiones conectadoras o péptidos ligadores. En ciertas modalidades, las secuencias de charnela y ligadoras son de 5 a 60 aminoácidos de largo, y pueden ser principalmente flexibles, pero también pueden proporcionar características más rígidas, y pueden contener principalmente una estructura alfa-helicoidal con mínima estructura de ß-hoja. De manera preferente, las secuencias son estables en plasma y suero y son resistentes a escisión proteolítica . En algunas modalidades, las secuencias pueden contener un motivo adicionado o que se presenta de forma natural tal como CPPC que confiere la capacidad de formar un enlace de disulfuro o múltiples enlaces de disulfuro para estabilizar el C-término de la molécula. En otras modalidades, las secuencias pueden contener uno o más sitos de glicosilación. Los ejemplos de secuencias ligadoras y de charnela incluyen regiones interdominio donde los dominios tipo IgV y tipo IgC o entre los dominios tipo IgC o IgV de CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86 , CD96,-CD150, CD166, y CD244. Las charnelas alternativas también se pueden elaborar de regiones que contienen disulfuro de los receptores Tipo II de los miembros de la superfamilia no de inmunoglobulinas tal como CD69, CD72, y CD161.

En algunas modalidades, un ligador de charnela tiene un residuo individual de cisteína para la formación de un enlace intercadena de disulfuro. En otras modalidades, un ligador tiene dos residuos de cisteína para la formación de enlaces intercadena de disulfuro. En modalidades adicionales, un ligador de charnela se deriva de una región interdominio de inmunoglobulina (derivada de una proteína de membrana Tipo II; ver, por ejemplo, secuencias de regiones de tallo de lectina de ejemplo expuestas en la Publicación se Solicitud PCT No. WO 2007/146968, tal como SEQ ID NOS :111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273 , 275, 277, 279, 281, 287, 289, 297, 305, 307, 309 -311, 313-¦331, 346, 373-377, 380, o 381 de esa publicación) , secuencias que se incorporan en la presente como referencia.

En un aspecto, las proteínas de fusión de esta descripción comprenden un dominio de unión específico para IL6, IL6R, o IL6xR en la forma de una proteína SMIP. Los métodos para producir proteínas SMIP se describen en la presente y se conocen en la técnica (ver, Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. 2003/0133939, 2003/0118592, y 2005/0136049) . En ciertas modalidades, una proteína de fusión tiene un dominio de unión de polipéptido específico para un complejo IL6xR que se une al IL6xR con una mayor afinidad que ya sea IL6 o IL6R solos, y compite con gpl30 para la unión al complejo sIL6xR o mejora la unión de gpl30 con sIL6xR, en donde, desde el amino-terminal o el carboxi-terminal , (a) el dominio de unión de polipéptido se fusiona a un primer ligador, (b) un polipéptido de región o sub-región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina se fusiona a un segundo ligador, y (c) un polipéptido de región o sub-región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina se fusiona al polipéptido de región o sub-región constante CH2. De manera alternativa, una estructura de proteína SMIP se puede ilustrar como sigue: N-BD-L1-CH2CH3-C, en donde N es el amino-terminal de la proteína de fusión, BD es el dominio de unión anti-complejo IL6xR o scFv, Ll es un ligador, CH2 y CH3 son las regiones 2 y 3 pesadas constantes de inmunoglobulina, y c es el carboxi-terminal de la proteína de fusión. En algunas modalidades, el ligador es un (Gly4Ser)n en donde n es un número entero de 1 a 6 , tal como 46 (SEQ ID N0:542), o el ligador es una región de charnela de IgGl, IgA o IgE, una región de charnela de IgGl mutante que tiene cero, uno o dos residuos de cisteína, tal como el Ligador 47 (SEQ ID NO:543), o el Ligador 80 (SEQ ID NO:576). En algunas modalidades, la proteína de fusión se fusionará mediante el ligador o no, a un dominio diferente de una región o sub-región constante de inmunoglobulina de modo que la proteína de fusión permanece principalmente o de forma sustancial un polipéptido de cadena individual en una composición .

En modalidades adicionales, una proteína de fusión SMIP de esta descripción tiene un dominio de unión que comprende una región variable de cadena ligera que contiene secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que son cada una al menos 80 % a 100 % idénticas a al menos una región CDR1, CDR2 y CDR3 variable de cadena ligera como se expone en cualquiera de SEQ ID NO:373-434 y 799-804, respectivamente, en donde cada CDR tiene desde cero a tres cambios de aminoácido, y comprende una región variable de cadena pesada que contiene secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que son cada una al menos 80 % a 100 % idénticas a al menos una región variable de cadena pesada, CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 435-496 y 805-810, respectivamente, en donde cada CDR tiene desde cero a tres cambios de aminoácido. En modalidades aún adicionales, una proteína de fusión SMIP de esta descripción tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 671-694, con o sin una secuencia peptídica guía.

En aún otras modalidades, los polipéptidos de SMIP pueden tener una región o dominio de unión que es un antagonista de IL6, en donde se inhibe de manera medible la cis- y trans-señalización de IL6. En ciertas modalidades, u antagonista de IL6 de acuerdo a esta descripción inhibe la señalización de citosinas de la familia de gp30 diferentes de IL6.

En modalidades adicionales, las proteínas de fusión de esta descripción comprenden un dominio de unión, antagonista de IL6, en la forma de una proteína PIMS en donde el dominio de unión está colocado en el carboxi-terminal de la proteína de fusión. Las construcciones y métodos para producir proteínas PIMS se describen en la Publicación PCT No. O 2009/023386. En general, una molécula de PIMS es un polipéptido de cadena individual que comprende, en la orientación amino-terminal a carboxi-terminal , un dominio interpuesto (por ejemplo, una sub-región constante de inmunoglobulina derivada de lo que incluye un dominio CH2 y CH3 de la misma (preferida) o diferente especie animal, isotipo de inmunoglobulina y/o sub-clase de inmunoglobulina), un péptido ligador (por ejemplo, una región de charnela de inmunoglobulina), y un dominio de unión, específico. En algunas modalidades, una molécula de PIMS contiene además una región de charnela de inmunoglobulina, colocada de forma amino-terminal, y la región de charnela, amino-terminal puede ser la misma como, o diferente que, el ligador encontrado entre el dominio de dimerización y el dominio de unión. En algunas modalidades, un ligador colocado de manera amino-terminal contiene un motivo adicionado o que se presenta de manera natural (tal como CPPC) para promover la formación de al menos un enlace de disulfuro para estabilizar el amino-terminal de una molécula multimerizada . De esta manera, las organizaciones esquemáticas de ejemplo de algunas moléculas de PIMS incluyen (N-dominio de dimerización) -ligador- (dominio de unión) -C o N- (ligador de charnela) - (dominio de dimerización) -ligador- (dominio de unión) -C. En algunas modalidades, la proteína de fusión tendrá un dominio interpuesto en donde la proteína de fusión permanece principal o sustancialmente como un polipéptido de cadena individual en una composición o se encuentra principal o sustancialmente como un dímero en una composición.

En ciertas modalidades, una proteína de fusión tiene un dominio, de unión de polipéptido, antagonista de IL6 que se une a un complejo IL6xR con una mayor afinidad que ya sea IL o IL6Ra solos, y compite con gpl30 para la unión al complejo sIL6xR o mejora la unión de gpl30 al complejo sIL6xR, en donde, desde el carboxi-terminal al amino-terminal, (a) el dominio de unión de polipéptido se fusiona a un primer ligador, (b) el primer ligador se fusiona a un polipéptido de región o sub-región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina, y (c) el polipéptido de región o sub-región constante CH3 se fusiona a un polipéptido de región o sub-región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina, y (d) el polipéptido de región o sub-región constante CH2 se fusiona a un segundo ligador. En modalidades adicionales, una proteína de fusión PIMS de esta descripción tiene un dominio de unión que comprende una región variable de cadena ligera que contiene secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que son cada una al menos 80 % a 100 % idénticas a al menos una región variable de cadena ligera, CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en cualquiera de SEQ ID NO:373-434 y 799-804, respectivamente, en donde cada CDR tiene desde cero a tres cambios de aminoácido, y comprende una región variable de cadena pesada que contiene secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que son cada una al menos 80 % a 100 % idénticas a al menos una región variable de cadena pesada, CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS:435-496 y 805-810, respectivamente, en donde cada CDR tiene desde cero a tres cambios de aminoácido.

En otros aspectos, las proteínas de fusión de esta descripción comprenden un dominio de unión específico para IL6 o IL6xR en la forma de una proteína de fusión, multifuncional , tal como una proteína SCORPIONMR. Los métodos para producir proteínas SC0RPI0NMR se describen en la presente y se conocen en la técnica (ver, Publicación de Solicitud PCT NO. WO 2007/146968) . Para otras proteínas de fusión, multifuncionales , de ejemplo, ver, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2006/0051844 y Patente de los Estados Unidos No. 7,166,707.

En ciertas modalidades, una proteína de fusión, multivalente, monoespecífica comprende una primero y segundo dominio de unión, un primero y segundo ligador, y un dominio de dimerización, en donde el dominio de dimerización se fusiona a cada extremo mediante un ligador a un domino de unión de región variable de inmunoglobulina, o derivado del mismo, que son cada uno específicos para un IL6xR como se describe en la presente. De manera alternativa, una estructura de proteína SCORPIONMR se puede ilustrar como sigue: N-BD1- ID-BD2 -C, en donde BD1 es el primer dominio de unión, ID es un dominio interpuesto y BD2 es el segundo dominio de unión. En algunas construcciones, el ID comprende una región o sub-región constante de inmunoglobulina colocada entre el primero y segundo dominios de unión. En modalidades adicionales, la proteína de fusión tendrá un dominio interpuesto en donde la proteína de fusión permanece principal o sustancialmente como un polipéptido de cadena individual en una composición. En algunas construcciones, el ID es el dominio de dimerización.

En modalidades particulares, una proteína de fusión tiene al menos dos dominios de unión de polipéptido específicos para un complejo IL6xR que se unen al IL6xR con una mayor afinidad que ya sea IL o IL6R solos, y compite con gpl30 para la unión al complejo sIL6xR o mejora la unión de gpl30 al complejo sIL6xR, en donde, desde el amino-terminal al carboxi-terminal, (a) un primer dominio de unión de polipéptido se fusiona a un primer ligador, (b) el primer ligador se fusiona a un polipéptido de región o sub-región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina , (c) el polipéptido de región o sub-región constante CH2 se fusiona a un polipéptido de región o sub-región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina, (d) el polipéptido de región o sub-región constante CH3 se fusiona a un segundo ligador, y (e) el segundo ligador se fusiona a un segundo dominio de unión de polipéptido. En aún modalidades adicionales, una proteína de fusión SCORPIONMR de esta descripción tiene al menos dos dominios de unión que comprenden independientemente una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que son al menos cada una 80 % a 100 % idénticas a al menos una región variable de cadena ligera, CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en cualquiera de SEQ ID NO:373-434 y 799-804, respectivamente, en donde cada CDR tiene desde cero a tres cambios de aminoácido, y comprende una región variable de cadena pesada que contiene secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que son cada una al menos 80 % a 100 % idénticas a al menos una región variable de cadena pesada, CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en cualquiera de SEQ ID NO:435-496 y 805-810, respectivamente, en donde cada CDR tiene desde cero a tres cambios de aminoácido. En algunas modalidades, el primer ligador es un ligador (Gly4Ser)n en donde n es un número entero de 1 a 5 , tal como el Ligador 46 (SEQ ID N0:542). En otras modalidades, el primero o segundo ligador es una región de charnela de IgGl, IgA o IgE, o una región de charnela de IgGl .mutante que tiene cero, uno o dos residuos de cisteína, tal como cualquier ligador encontrado en SEQ ID NO:497-604 y 823-828.

En aún otro aspecto, las proteínas de fusión, multi -específicas, de ejemplo que tienen un dominio de unión, antagonista de IL6 como se describe en la presente pueden contener al menos una región o dominio de unión, adicional, que no es un antagonista de IL6. En ciertas modalidades una proteína de fusión multi-específica comprende un primero y segundo dominio de unión, un primero y segundo ligador, y un dominio interpuesto, en donde un extremo del dominio interpuesto se fusiona mediante un ligador a un primer dominio de unión de una región variable de inmunoglobulina que se específica para un IL6xR y el otro extremo se fusiona mediante un ligador a un segundo dominio de unión que es un ectodominio de unión de ligando de un receptor, tal como un ectodominio de receptor de interleucina , un ectodominio de receptor de factor de crecimiento (por ejemplo, TGFR) , o un ectodominio de receptor de la superfamilia de factores de necrosis tumoral (TNFSFR) . En algunas modalidades, se emplea menos del ectodominio completo. De manera específica, se emplean dominios dentro del ectodominio que confieren unión a ligando. Se contempla, por ejemplo, que un dominio antagonista de TNF-a puede estar en el amino-terminal y el dominio de unión, antagonista de IL6 en el carboxi -terminal de una proteína de fusión o el dominio de unión, antagonista de IL6, puede estar en el amino-terminal y el antagonista de TNF-OÍ puede estar en el carboxi -terminal . Como se expone en la presente, los dominios de unión de esta descripción se pueden fusionar a cada extremo de un dominio interpuesto (por ejemplo, una región o sub-región constante de inmunoglobulina de mismo, tal como una CH2CH3 de IgGl) . Adicionalmente , los dos o más dominios de unión se pueden unir cada uno a un dominio interpuesto mediante el mismo o diferente ligador conocido en la técnica como se describe en la presente.

Las estructuras de ejemplo de estas proteínas de fusión multi-específicas, referidas en la presente como moléculas Xceptor, incluyen N-BD-ID-ED-C, N-LD-ID-BD-C, N-ED1-ID-LD2-C, en donde BD es un dominio de unión de región variable tipo inmunoglobulina o de inmunoglobulina, ID es un dominio interpuesto y ED es un dominio de unión de ligando, tal como un ectodominio de receptor, dominio de semaforina, o similares. En algunas construcciones, el ID es el dominio de dimerización . En algunas construcciones, el ID puede comprender una región o sub-región constante de inmunoglobulina colocada entre el primero y segundo dominios de unión. En modalidades aún adicionales, la proteína de fusión tendrá un dominio interpuesto en donde la proteína de fusión permanece principal o sustancialmente como un polipéptido de cadena individual en una composición.

En algunas modalidades, una proteína de fusión multi -específica de esta descripción tiene un antagonista de TNF - OÍ que comprende un ectodominio de TNFRSF o un sub-dominio de un ectodominio de TNFRSF , tal como un dominio de alto contenido de cisteína (CRD) 1, CRD2 , CRD3 , una asa de unión de TNF de 50, una asa de unión de TNF de 90, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, un antagonista de TNF - OÍ puede comprender un ectodominio de TNFRSF1A como se expone en SEQ ID NO: 696 (con o sin la secuencia peptídica guía nativa incluida en esta secuencia) o un ectodominio de TNFRSF1B como se expone en SEQ ID NO: 695 (con o sin la secuencia peptídica guía nativa incluida en esta secuencia) .

En modalidades particulares, una proteína de fusión tiene (a) un dominio de unión de polipéptido específico para un complejo IL6xR que se une al IL6xR con una mayor afinidad que ya sea IL6 o IL6Ra solos, y compite con gpl30 para la unión al complejo sIL6xR o mejora la unión de gpl30 al complejo sIL6xR, y (b) un dominio de unión de polipéptido que comprende un ectodominio de TNFRSF1B, en donde, desde el amino-terminal al carboxi-terminal o desde el carboxi-terminal al amino-terminal , (a) un dominio de unión anti-IL6xR o ectodominio de TNFRSF1B se fusiona a un primer ligador, (b) el primer ligador se fusiona a un polipéptido de región o sub-región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina, (c) el polipéptido de región o sub-región constante CH2 se fusiona a un polipéptido de región o sub-región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina, (d) el polipéptido de región o sub-región constante CH3 se fusiona a un segundo ligador, y (e) el segundo ligador se fusiona a un dominio de unión anti-IL6xR o ectodominio de TNFRSF1B. En ciertas modalidades, la proteína de fusión Xceptor multi-específica de esta descripción tiene un dominio de unión de IL6xR que comprende una región variable de cadena ligera que contiene secuencias de CDR1 CDR2 , y CDR3 que son al menos cada una 80 % a 100 % idénticas a al menos una región variable de cadena ligera, CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 373-434 y 799-804, respectivamente, en donde cada CDR tiene desde cero a tres cambios de aminoácido, y comprende una región variable de cadena pesada que contiene secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 que son cada una al menos 80 % a 100 % idénticas a al menos una región variable de cadena pesada, CDR1, CDR2 y CDR3 como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS : 435-496 y 805-810, respectivamente, en donde, cada CDR tiene desde cero a tres cambios de aminoácido. En una modalidad relacionada, el ectodominio de TNFRSF1B comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NOS: 695 con la condición que no se incluya la secuencia peptídica, guía, nativa. En aún modalidades adicionales, un proteína de fusión Xceptor de esta descripción tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntica a una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 607-668, con o sin una secuencia peptídica guía, en donde cada CDR tiene desde cero a tres cambios de aminoácido.

En general, estas construcciones tendrán un ectodominio de receptor tipo I en el amino-termino o un ectodominio de receptor tipo II en el carboxi-terminal de una proteína de fusión multi -específica de esta descripción. Un ejemplo de una construcción que tiene un ectodominio de receptor tipo I es una construcción que tiene un ectodominio de la superfamilia de receptores de TNF (TNFRSF) en el amino-terminal y el domino de unión del complejo IR6xR en el carboxi-terminal . De manera inesperada, una construcción de ectodominio de receptor tipo I que tiene un ectodominio de TNFRSF en el carboxi-terminal también trabaja (ver SEQ ID NOS: 669 y 670) .

En el caso de un polipéptido de esta descripción que tiene múltiples dominios de unión, por ejemplo, dominio-1 de unión (BD1) y dominio-2 de unión (BD2) , uno de los cuales es por ejemplo, anti-IL6xR, un bajo valor de kDISociAcióN aumentará al máximo la actividad inhibitoria y la concentración de un polipéptido o proteína de fusión de esta descripción unida a valencia completa, de modo que el intervalo de dosis se ampliará sobre forma del polipéptido o proteína de fusión que tienen BD1 o BD2 interactuando solos (ver Perelson (1980) Math. Biosci. 49:87) . También puede ser de interés seleccionar dominios de unión con altos valores de k-DisociAcióN . Por ejemplo, una kDisociAcióN alta puede ser deseable para un receptor en el cual se prefiera un corto tiempo de residencia en el complejo para llamar al fenotipo deseado de señalización (ver Matsui et al., (1994) Proc . Nat ' 1. Acad. Sci. (USA) 91:12862; Lyons et al., (1996) Immunity 5:53). Se apreciará por los expertos en la técnica que kDISOciAcióN se puede controlar de manera independiente para BD1 y BD2 para una composición que comprende dos dominios de unión, por ejemplo, una molécula SCORPIONMR, como se describe en la presente. Para un ejemplo no limitante adicional, puede ser deseable que un dominio de unión tenga una muy baja kDiSociAcióN y el otro dominio de unión tenga una kDISociAcióN relativamente alta. Esto puede permitir que un polipéptido de unión multiespecífico tenga un prolongado tiempo de residencia en la superficie celular unida a moléculas objetivo o diana que corresponden al BD de baja kDISociAcióN en tanto que acopla en serie moléculas objetivo que corresponden al BD de alta kDisociAcióN · Esto puede tener el efecto de aumentar la señalización cuando son bajas las concentraciones de la proteína SC0RPI0NMR (ver Kalergis et al., (2001) Nature Immunol . 2:229). Se apreciará por los expertos en la técnica que se puede modificar ^-DISOCIACIÓN al manejar dominios de unión o al examinar dominios de unión con las propiedades cinéticas deseadas (Ver Su et al. (2007) J. Immunol . Methods 322:94; Steukers et al. (2006) J. Immunol. Methods 310:126; Jermutus ¦ et al. (2001) Proc . Nat ' 1. Acad. Sci . (USA) 98:75).

Para producir de manera eficiente cualquiera de los polipéptidos de dominio de unión o proteínas de fusión descritas en la presente, se usa un péptido guía para facilitar la secreción de los polipéptidos expresados y de las proteínas de fusión. Usando cualquiera de los péptidos guía, convencionales (secuencias de señal) se espera dirigir los polipéptidos o proteínas de fusión, recién expresados en una ruta secretoria y dar por resultado la escisión del péptido guía del polipéptido maduro o proteína de fusión en o cerca de la unió entre el péptido guía y el polipéptido o proteína de fusión. Se elegirá un péptido guía particular en base a consideraciones conocidas en la técnica, tal como usando secuencias codificadas por polinucleótidos que permite la fácil inclusión de sitios de escisión de endonucleasa de restricción al comienzo final de la secuencia codificadora para el péptido guía para facilitar el manejo molecular, con la condición que estas secuencias introducidas especifiquen aminoácidos que ya sea no interfieren de manera aceptable con algún procesamiento deseado del péptido guía de la proteína recién expresada o no interfieran de manera inaceptable con alguna función deseada de una molécula de polipéptido o de proteína de fusión si el péptido guía no se escinde durante la maduración de los polipéptidos o proteínas de fusión. Los péptidos guía de ejemplo de esta descripción incluyen secuencias guía naturales u otras, tal como H3N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG (X) n-C02H, en donde X es cualquier aminoácido n es cero a tres (SEQ ID NO: 785) o H3N-MEAPAQLLFLLLL LPDTTG-C02H (SEQ ID NO: 786).

En ciertas modalidades ilustrativas, esta proteína está glicosilada, el patrón de glicosilación que es dependiente de una variedad de factores que incluyen la célula hospederaa en la cual se expresa la proteína (si se prepara en células hospedadoras recombinantes) , y las condiciones de cultivo.

Esta descripción también proporciona derivados del dominio de unión de esta descripción o de proteínas de fusión que comprende este dominio de unión. Los derivados incluyen polipéptidos de agentes específicos de unión que tienen modificaciones diferentes de inserción, supresión o sustitución de residuos de aminoácido. De manera preferente, las modificaciones son de naturalezas covalente, e incluyen, por ejemplo, unión química con polímeros, lípidos, porciones orgánicas e inorgánicas diferentes . Los derivados de esta descripción se pueden preparar para incrementar la vida media en circulación de un polipéptido de agente de unión específica o se pueden diseñar para mejorar la capacidad de selección de objetivos o dianas para el polipéptido hacia las células, tejidos u órganos deseados.

En ciertas modalidades, la vida media in vivo del polipéptido de dominio de unión, o proteína de fusión del mismo, de esta descripción, se puede incrementar usando métodos conocidos en la técnica para incrementar la vida media de moléculas grandes. Por ejemplo, esta descripción abarca proteínas de fusión que se modifican o derivatizan de manera covalente para incluir uno o más anexos de polímeros solubles en agua, tal como polietilenglicol, polioxietilenglicol , o polipropilenglicol (ver, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 4,179,337). Aún otros polímeros útiles conocidos en la técnica incluyen monometóxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa, y otros polímeros basados en carbohidrato, poli- (N-vinil -pirrolidona) -polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol , un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de estos polímeros. Particularmente preferidas son las proteínas derivatizadas con polietilenglicol (PEG) . Se pueden unir polímeros solubles en agua en posiciones específicas, por ejemplo en el amino-terminal de las proteínas y polipéptidos de acuerdo a esta descripción, o unir de manera aleatoria a una o más cadenas laterales del polipéptido. El uso de PEG para mejorar las capacidades terapéuticas se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,133,426.

Estos métodos también incluyen la creación de proteínas de fusión en donde el dominio de unión se fusiona a una proteína que lleva una vida media más prolongada a la proteína de fusión de dominio de unión que aquella del dominio de unión solo. Estas proteínas de fusión pueden incluir proteínas que por sí mismas se unen a proteínas que tienen una vida media prolongada, por ejemplo, inmunoglobulina, dominios de Fe de inmunoglobulina, transíerrina, proteína G estreptocócica, o albúmina. Estas fusiones de los dominios de unión a proteínas estables de plasma se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,428,130; 5,116,964.

Una modalidad particular de esta descripción es una inmunoglobulina o una proteína de fusión de Fe. Esta proteína de fusión puede tener una vida media prolongada, por ejemplo, varias horas, un día o más, o aún una semana o más, especialmente si el dominio de Fe es capaz de interactuar con FcRn, el receptor de Fe neonatal. El sitio de unión para FcRn en un dominio de Fe también es el sitio en el cual se unen las proteínas A y G bacterianas . La unión estrecha entre estas proteínas se puede usar como un medio para purificar anticuerpos o proteínas de fusión de esta descripción, por ejemplo, al empelar cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G durante la purificación de la proteína.

Son bien conocidas por los expertos las técnicas de purificación de proteínas. Estas técnicas comprenden, a un nivel, el fraccionamiento crudo de las fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas . Frecuentemente se desea la purificación adicional usando técnicas cromatográficas o electroforéticas para lograr purificación parcial o completa (o purificación a homogeneidad) . Los métodos analíticos particularmente adecuados a la preparación de una proteína de fusión pura son cromatografía de intercambio iónico; cromatografía de exclusión; electroforesis en gel de poliacrilamida ; y enfoque isoeléctrico. Los métodos particularmente eficientes para purificar péptidos son cromatografía líquida rápida de proteínas y HPLC.

Ciertos aspectos de la presente invención se refieren a la purificación, y en modalidades particulares, a la purificación sustancial, de un polipéptido de esta descripción. El término "purificado" como se usa en la presente se propone para referirse a una composición, aislable de otros componentes, en donde la proteína de fusión se purifica a cualquier grado con relación a su estado obtenible en la naturaleza. Por lo tanto, una proteína de fusión purificada también se refiere a una proteína de fusión, libre del ambiente en el cual se presenta en la forma natural .

En general, "purificada" se referirá a una composición de polipéptido de fusión que se ha sometido a fraccionamiento para remover varios componentes diferentes, y la composición que retiene sustancialmente su actividad biológica expresada. Donde se usa el término "sustancialmente purificada" esta designación se refiere a una composición de proteína de unión de fusión en la cual la proteína de fusión forma el componente principal de la composición, tal como que constituye aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 % o más de la proteína, en peso, en la composición.

En vista de la presente descripción los expertos en la técnica conocen varios métodos para cuantificar el grado de puri icación. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de unión de una fracción activa o valorar la cantidad de proteína en una fracción por análisis de SDS/PAGE. Un método preferido para valorar la pureza de una fracción de proteína es calcular la actividad de unión de la fracción, para compararla a la actividad de unión del extracto inicial, y de este modo calcular el grado de purificación, valorado en la presente por un "-veces el número de purificación" . Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad de unión serán dependientes, por supuesto, en la técnica particular de ensayo elegida para seguir la purificación y de sí o no la proteína de fusión expresada exhibe una actividad detectable de unión.

Los expertos en la técnica conocen varias técnicas adecuadas para el uso en la purificación de proteínas. Estas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio PEG, anticuerpos y similares, o por desnaturalización térmica seguido por centrifugación; pasos de cromatografía tal como cromatografía de intercambio iónico, de filtración en gel, de fase inversa, de hidroxilapatita y de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de estas y otras técnicas. Como se conoce en general en la técnica, se cree que el orden de llevar a cabo los varios pasos de purificación, se puede cambiar, o que se pueden omitir ciertos pasos, o aún dan por resultado un método adecuado para la preparación de una proteína sustancialmente purificada .

Polinucleótidos, Vectores de Expresión, y Células Hospedadoras Esta descripción proporciona polinucleótidos (polinucleótidos aislados o purificados o puros) que codifican para las proteínas de fusión de esta descripción, vectores (incluyendo vectores de clonación y vectores de expresión) que comprenden estos polinucleótidos , y células (por ejemplo, células hospedadoras) transformadas o transfectadas con un polinucleótido o vector de acuerdo a esta descripción.

En ciertas modalidades, se contempla un polinucleótido (ADN o ARN) de acuerdo a un dominio de unión de esta descripción, o una proteína de fusión que contiene uno o más de estos dominios de unión. En los ejemplos anexos a la presente se proporcionan casetes de expresión que codifican para construcciones de SMIP y Xceptor.

La presente invención también se refiere a vectores que incluyen un polinucleótido de esta descripción, y en particular, a construcciones de expresión recombinante . En una modalidad, esta descripción contempla un vector que comprende un polinucleótido que codifica para un dominio de unión de esta descripción o un polipéptido que comprende este dominio de unión, por ejemplo, un SMIP, PIMS, SCORPION, Xceptor u otra proteína de fusión mono-, bi- o multi-funcional, junto con otras secuencias de polinucleótido que provocan o facilitan la transcripción, traducción, y procesamiento de estas secuencias codificadoras de dominios de unión.

Se describen vectores apropiados de clonación y expresión para el uso con hospedadores procarióticos y eucarióticos , en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989) . Los vectores de clonación/expresión de ejemplo incluyen vectores de clonación, vectores de transposición, y construcciones de expresión, que se pueden basar en plásmidos, fagómidos, fasmidos, cosmidos, virus, cromosomas artificiales o cualquier vehículo de ácido nucleico conocido en la técnica adecuado para purificación, transferencia y/o expresión de un polinucleótido contenido en el mismo.

Como se usa en al presente, "vector" significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Los vectores de ejemplo incluyen plásmidos, cromosomas artificiales de levadura y genomas virales. Ciertos vectores pueden replicarse de manera autónoma en una célula hospederaa, en tanto que otros vectores se pueden integrar en el genoma de una célula hospederaa y de este modo se replican con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores se refieren en la presente como "vectores recombinantes de expresión" (o simplemente "vectores de expresión"), que contienen secuencias de ácido nucleico que están operativamente enlazadas a una secuencia de control de expresión y por lo tanto son capaces de dirigir la expresión de estas secuencias .

En ciertas modalidades, las construcciones de expresión se derivan de vectores de plásmidos. Las construcciones ilustrativas incluyen vector pNASS (Clontech, Palo Alto, CA) , que tienen secuencias de ácido nucleico que codifican para un gen de resistencia a arapicilina, una señal de poliadenilación y un sitio del promotor T7 ; pDEF38 y pNEF38 (CMC ICOS Biologies, Inc.), que tiene un promotor CHEF1; y pD18 (Lonza) , que tiene un promotor CMV. Otros vectores adecuados de expresión de mamífero son bien conocidos (ver, por ejemplo, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al., supra; ver también por ejemplo, catálogos de Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, I ; Pharmacia, Piscataway, NJ) . Se pueden preparar construcciones útiles que incluyen una secuencia que codifica para dihidrofoliato-reductasa (DHFR) bajo control regulador adecuado para promover niveles mejorados de producción de las proteínas e fusión, niveles que resultan de la amplificación génica después de la aplicación de un agente apropiado de selección (por ejemplo, metotrexato) .

En general, los vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospederaa, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural de etapa posterior, como se describe anteriormente. Un vector en enlace operable con un polipéptido de acuerdo a esta descripción produce una construcción de clonación o expresión. Las construcciones de clonación/expresión de ejemplo contienen un elemento de control de expresión, por ejemplo un promotor, operablemente enlazado a un polinucleótido de esta descripción. Los elementos de control de expresión, adicionales, tal como intensificadores, sitios de unión específicos del factor, terminadores , y sitios de unión a ribosoma también se contemplan en los vectores y construcciones de clonación/expresión de acuerdo a esta descripción. La secuencia estructural heteróloga del polinucleótido de acuerdo a esta descripción se monta en fase apropiada con secuencias de inicio y terminación de traducción. De esta manera, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican para la proteína de fusión, como se proporciona en la presente, se pueden incluir en cualquiera de una variedad de construcciones de vector de expresión como una construcción recombinante de expresión para expresar esta proteína en una célula hospederaa.

Las secuencias apropiadas de ADN se pueden insertar en un vector, por ejemplo, por una variedad de procedimientos. En general, se inserta una secuencia de ADN en sitios apropiados de escisión de endonucleasa de restricción por procedimientos conocidos en la técnica. Se contemplan técnicas normales para clonación, aislamiento de ADN amplificación purificación para reacciones enzimáticas que comprendan ADN-ligasa, ADN-polimerasa, endonucleasas de restricción y similares, y varias técnicas de separación. Se describen varias técnicas normales, por ejemplo, en Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ . Assoc. Inc. & John iley & Sons, Inc., Boston, MA, 1993); Sambrook et al. (Molecular Cloning, Second Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1989); Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1982); Glover (Ed. ) (ADN Cloning Vol . I y II, IRL Press, Oxford, UK, 1985); Hames y Higgins (Eds.) (Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK, 1985) ; y en otro sitio.

La secuencia de ADN en el vector de expresión se enlaza de manera operativa a al menos una secuencia apropiada de control de expresión (por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor regulado) para dirigir la síntesis de mARN. Los ejemplos representativos de estas secuencias de control de expresión incluyen promotores de células eucarióticas o sus virus, como se describe anteriormente. Se pueden seleccionar regiones promotoras de cualquier gen deseado usando vectores de CAT (cloranfenicol-transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables . Los promotores eucarióticos incluyen CMV inmediatamente temprano, timidina-cinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus, metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados está bien dentro del nivel de experiencia del experto en la técnica, y la preparación de ciertas construcciones particularmente preferidas recombinantes de expresión que comprenden un promotor o promotor regulado operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica para una proteína o polipéptido de acuerdo a esta descripción, se describe en la presente.

También se contemplan variantes de los polinucleótidos de esta descripción. Los polinucleótidos variantes son al menos 90 %, y de manera preferente 95 %, 99 %, o 99.9 % idénticos a uno de los polinucleótidos de la secuencia definida como se describe en la presente, o que hibridiza a uno de estos polinucleótidos de secuencia definida bajo condiciones de hibridación severa de cloruro de sodio 0.015M, citrato de sodio 0.0015M a aproximadamente 65-68°C o cloruro de sodio 0.015M, citrato de sodio 0.0015M, y formamida al 50 % a aproximadamente 42°C. Las variantes de polinucleótidos retiene la capacidad para codificar para un dominio de unión o proteína de fusión del mismo que tiene la funcionalidad descrita en la presente.

El término "severo" se usa para referirse a condiciones que están comúnmente entendidas en la técnica como severas. La severidad de hibridación se determina principalmente por la temperatura, concentración iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes tal como formamida. Los ejemplos y condiciones severas para hibridación y lavados son cloruro de sodio 0.015M, citrato de sodio 0.0015M a aproximadamente 65-68°C o cloruro de sodio 0.015M, citrato de sodio 0.0015M, y formamida 50 % a aproximadamente 42°C (ver Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Lab.oratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Las condiciones más severas (tal como mayor temperatura, menor concentración iónica, más formamida u otro agente desnaturalizante) también se pueden usar; sin embargo, se afectará la velocidad de hibridación. En casos donde sea de interés la hibridación de desoxioligonucleótidos, las condiciones adicionales de ejemplo de hibridación severa incluyen lavado en 6x SSC, pirofosfato de sodio al 0.05 % a 37°C (para oligonucleótidos de 14 bases) , 48°C (para oligonucleótidos de 17 bases) , 55°C (para oligonucleótidos de 20 bases) , y 60°C (para oligonucleótidos de 23 bases) .

Un aspecto adicional de esta descripción proporciona una célula hospederaa transformado o transfectada con, o que contiene de otro modo, cualquiera de los polinucleótidos o vector/construcciones de expresión de esta descripción. Los polinucleótidos o construcciones de clonación/expresión de esta descripción se introducen en células adecuadas usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo transformación, transfección y traducción. Las células hospedadoras incluyen las células de un sujeto que se somete a terapia celular ex vivo que incluyen por ejemplo, terapia génica ex vivo. Las células hospedadoras eucarióticas contempladas como un aspecto de esta descripción cando tienen un polinucleótido, vector o proteína de acuerdo a esta descripción, incluye, además de las células propias del sujeto (por ejemplo, las células apropiadas de un paciente humano) , células VERO, células HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO) (incluyendo células CHO modificadas capaces de modificar el patrón de glicosilación de moléculas de unión, multivalentes , expresadas, ver, Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0115614) , células COS (tal como COS-7), células W138, BHK, HepG2 , 3T3 , RIN, MDCK, A549, PC12, K562, HEK293, células HepG2 , células N, células 3T3, células Spodoptera frugiperda (por ejemplo, células Sf9) , células Saccharomyces cerevisiae, y cualquier otra célula eucariótica que se conoce en la técnica por ser útil en la expresión, y opcionalmente en el aislamiento, de un péptido o proteína de acuerdo a esta descripción. También se contemplan células procarióticas , incluyendo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, un Streptomyceto, o cualquier célula procariótica conocida en la técnica por ser adecuada para expresar y opcionalmente para aislar, una proteína o péptido de acuerdo a esta descripción. Al aislar la proteína o péptido de células procarióticas, en particular, se contempla que se pueden usar técnicas conocidas para extraer la proteína de los cuerpos de inclusión. La selección de un hospedador apropiado está dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica de las enseñanzas de la presente. Se contemplan células hospedadoras que glicolizan las proteínas de fusión de esta descripción.

El término "célula hospederaa recombinante" (o simplemente "célula hospederaa") se refiere a una célula que contiene un vector recombinante de expresión. Se debe entender que estos términos se proponen solo para referirse a una célula particular del sujeto pero a la progenie de esta célula. Debido a que pueden presentarse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a ya sea mutación o influencias ambientales, esta progenie puede no ser en realidad, idéntica la célula progenitora, pero aún se incluyen dentro del alcance del término "célula hospederaa" como se usa en la presente.

Se pueden cultivar las células hospedadoras recombinantes en un medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para activar promotores, para seleccionar transformantes o para amplificar particulares. Las condiciones de cultivo para células hospedadoras particulares seleccionadas para la expresión tal como temperatura, pH y similares, serán fácilmente evidentes a un experto en la técnica. También se contemplan varios sistemas de cultivo celular de mamífero para expresar proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, descritas pro Gluzman (1981) Cell 23:175, y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas de células C127, 3T3 , CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión, mamíferos, comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado, y opcionalmente , un intensificador, y también cualquier sitio necesario de unión de ribosoma, sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de empalme, secuencias de terminación transcripcional , y secuencias no transcriptas de 5' -flanqueo, por ejemplo, como se describe en la presente con respecto a la preparación de construcciones de expresión de proteína de unión, multivalente . Las secuencias de ADN derivadas del empalme de SV40, y sitios de poliadenilación, se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos, no transcriptos, requeridos. La introducción de la construcción en la célula hospederaa se puede efectuar por una variedad de métodos con los cuales estarán familiarizados los expertos en la técnica, que incluyen transfección con sulfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano, o electroporación (Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology) .

En una modalidad, una célula hospederaa se transduce por una construcción viral recombinante que dirige la expresión de una proteína o polipéptido de acuerdo con esta descripción. La célula hospederaa transducida produce partículas virales que contienen la proteína o polipéptido expresado, derivado de porciones de una membrana de célula hospederaa incorporada por las partículas virales durante la germinación viral.

Composiciones y Métodos de Uso Para tratar un humano o mamíferos no humanos que padecen de un estado de enfermedad asociado con transseñalización de IL6, un dominio de unión de esta descripción se hace típicamente parte de una proteína más grande, como se analiza anteriormente, y luego se administra al sujeto una cantidad que es efectiva para mejorar los síntomas del estado de enfermedad después de un transcurso de una o más administraciones. Siendo polipéptidos , las proteínas de esta descripción se pueden suspender o disolver en un diluyente farmacéuticamente aceptable, incluyendo opcionalmente un estabilizador de otros excipientes farmacéuticamente estables, que se pueden usar para administración intravenosa por inyección o infusión, como se analiza más completamente más adelante.

Una dosis terapéuticamente efectiva es aquella dosis requerida para prevenir, inhibir la ocurrencia de, o para tratar (aliviar un síntoma en algún grado, de manera preferente todos los síntomas de) un estado de enfermedad. La dosis farmacéuticamente efectiva depende del tipo de enfermedad, de la composición usada, de la ruta de administración, del tipo de sujeto que se trate, de las características físicas del sujeto específico bajo consideración para tratamiento, medicación concurrente, y otros factores que reconocerán los expertos en las técnicas médicas. Por ejemplo, se puede administrar una cantidad entre 0.1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal (que se puede administrar como una dosis individual, diariamente, semanalmente , mensualmente o a cualquier intervalo apropiado) de un ingrediente activo, dependiendo de la potencia del polipéptido del dominio de unión o proteína de fusión multi-específica de esta descripción.

En ciertas modalidades, se reduce al mínimo o no se inhibe la cis-señalización de IL6, es decir, cualquier inhibición de la cis-señalización o es sustancial, queriendo decir que la inhibición no es existente, asintomática o no detectable. El grado de inhibición de la trans-señalización de IL6 puede variar, pero en general la trans-señalización se altera a un grado que tiene un efecto positivo en los síntomas de un estado de enfermedad mediado por o asociado con esta señalización. En ciertas modalidades, la inhibición de la tran-señalización de IL6 por polipéptidos de dominio de unión o proteínas de fusión de los mismos, de esta descripción, puede retrasar, de tener o invertir el progreso de la enfermedad.

Las composiciones de esta descripción se pueden usar para tratar estados de enfermedad en humanos y mamíferos no humanos que se medían por la señalización de IL6. Se ha implicado la producción incrementada de IL-6, y de esta manera la señalización de IL6, en varios procesos de enfermedad, que incluyen enfermedad de Alzheimer (por ejemplo, artritis reumatoide, SLE) , inflamación, infarto al miocardio, enfermedad de Paget , . osteoporosis , tumores sólidos (por ejemplo, cáncer de colon, cánceres de vejiga y prostáticos RCC) , ciertos cánceres neurológicos , malignidades de células B (por ejemplo, enfermedad de Castleman, algunos subtipos de linfoma, leucemia linfocítica crónica, y en particular, melanoma maligno) . En algunos casos, IL-6 está implicada en las rutas de proliferación debido a que actúa con otros factores, tal como el factor de crecimiento epitelial de unión a heparina y el factor de crecimiento de hepatocitos (ver, por ejemplo, Grant et al. (2002) Oncogene 21:460; Badache y Hynes (2001) Cáncer Res. 61:383; Wang et al. (2002) Oncogene 21:2584). El bloqueo de la señalización de IL-6 de esta manera puede ser de beneficio en muchas situaciones patológicas. Se ha implicado la transseñalización de IL-6 en malignidades, así como condiciones autoinmunitarias o inflamatorias, incluyendo cáncer de colon, enfermedad inflamatoria del intestino, y artritis reumatoide. Se ha implicado la cis-señalización de IL6 tanto en malignidades como en condiciones autoinmunitarias que incluyen, además de lo anterior, cáncer de mama, en general, se piensa que la trans-señalización puede estar más asociada con condiciones autoinmunitarias o inflamatorias, y la cis-señalización con condiciones malignas (ver, por ejemplo, Rabe et al. (2008) Blood 111:1021); Sansone et al. (2007) J. Clin Invest. 117:3988).

De esta manera, los agentes que comprenden el dominio de unión de esta descripción son útiles al tratar enfermedades autoinmunitarias que incluyen artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Graves, enfermedad de Hashimoto, y enfermedad de Castleman, inflamación aguda y crónica, y osteoporosis y otros trastornos que comprenden pérdida de masa ósea, y cánceres, incluyendo cáncer de próstata independiente de hormonas, trastornos proliferativos de células B tal como linfoma no de Hodgkin de células B, y cánceres del riñon, mama, colon, pulmón, cerebro u otros tej idos .

En otro aspecto, las composiciones de las proteínas de fusión se proporcionan por esta descripción. Las composiciones farmacéuticas de esta descripción comprenden en general uno o más tipos de dominios de unión o proteínas de fusión en combinación con un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Estos portadores serán no tóxicos a los receptores a las dosis de concentraciones em leadas. Los portadores f rmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en" la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro (Ed.) 1985). Por ejemplo, se puede usar solución salina estéril y solución salina amortiguada con fosfato a pH fisiológico. Se pueden proporcionar conservadores, estabilizadores, tintes y similares en la composición farmacéutica. Por ejemplo, se puede adicionar benzoato de sodio, ácido sórbico, o ésteres de ácido p-hidroxibenzoico como conservadores. Id. en 1449. Además, se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión. Id. Los compuestos de la presente invención se pueden usar ya sea en las formas de sal o de base libre, con ambas formas que se consideran como que están dentro del alcance de la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas también pueden contener diluyentes tal como amortiguadores, antioxidantes tal como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) , proteínas, aminoácidos, carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacaros o dextrina) , agentes queladores (por ejemplo EDTA) , glutationa y otros estabilizadores y excipientes. La solución salina amortiguada neutral o la solución salina mezclada con albúmina sérica no específica son diluyentes apropiados de ejemplo. De manera preferente, el producto se formula como un liofilizado usando soluciones excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes.

También se contempla la administración de composiciones de proteínas de fusión multi-específicas , de la descripción, en combinación con un segundo agente. Un segundo agente puede ser uno aceptado ' en *- 3ra ^-téonica-^corno un tratamiento normal para un estado particular de enfermedad, tal como inflamación, autoinmunidad, y cáncer. Los segundos agentes de ejemplo contemplados incluyen citosinas, factores de crecimiento, esteroides, NSAID, D ARD, quimioterapéuticos , radioterapéuticos , u otros agentes activos y auxiliares, y cualquier combinación de los mismos.

"Sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal de un polipéptido de dominio de unión, o proteína de fusión, de esta descripción, es farmacéuticamente aceptable que posee la actividad farmacológica deseada del compuesto progenitor. Estas sales incluyen las siguientes: (1) sales de adición de ácido, formadas con ácidos inorgánicos tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares; formadas con ácidos orgánicos tal como ácido acético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclo pentapropiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, áciod láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico. ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido 3- (4-hidroxibenzoil ) benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 1,2-etano-disulfónico, ácido 2 -hidroxietanesulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 4 -clorobencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4 -toluensulfónico, ácido canforsulfónico, ácido 4-metilbiciclo [2.2.2] -oct-2-eno-l-carboxílico, ácido glucoheptónico, ácido 3 -fenilpropionico, ácido trimetilacético, ácido terciario butilacético, ácido laurílico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido hidroxinaftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico, y similares; o (2) sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto progenitor ya sea se reemplaza por un ión metálico, por ejemplo, un ión de metal alcalino, un ión de metal alcalino térreo o un ión de aluminio; o coordinados con una base orgánica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina , N-metilglucamina, o similares.

En modalidades ilustrativas particulares, se administra de manera intravenosa un polipéptido o proteína de fusión de esta descripción, por ejemplo, por inyección de bolo o infusión. Las rutas de administración además de la intravenosa incluyen oral, tópica, parenteral (por ejemplo, sublingual o bucal), sublingual, rectal, vaginal, e intranasal. El término parenteral como se usa en la presente incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraesternal , intracabernosa, intratecal, intrameatal, intrauretral , periespinal o técnicas de infusión. La composición farmacéutica se formula para permitir que los ingredientes activos contenidos en la misma estén biodisponibles en la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se administrarán a un paciente toman la forma de una o más unidades de dosis, donde por ejemplo, una tableta puede ser una dosis unitaria individual, y un recipiente de uno o más compuestos de esta descripción en forma de aerosol puede detener una pluralidad de dosis unitarias.

Para administración oral, puede estar presente un excipiente y/o aglutinante, tal como sacarosa, caolín, glicerina, almidón-dextrano, ciclodextrinas , alginato de sodio, carboxi-etilcelulosa y etil-celulosa . Opcionalmente pueden estar presentes agentes edulcorantes, conservadores, tintes/colorantes, intensificadores de sabor, o cualquier combinación de los mismos. También, opcionalmente, se pueden, se puede usar un revestimiento.

En una composición propuesta para ser administrada por inyección, se pueden incluir de manera opcional uno o más de un agente tensioactivo, conservador, agente humectante, agente ' dispersante, agente de suspensión, amortiguador, estabilizador, agente isotónico o cualquier combinación de los mismos.

Para formulaciones basadas en ácido nucleico, o para formulaciones que comprenden productos de expresión de acuerdo a esta descripción, se administrarán, por ejemplo, de aproximadamente 0.01 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, por la ruta intradérmica, subcutánea, intramuscular, o intravenosa, o por cualquier ruta conocida en la técnica como que es adecuada bajo un conjunto dado de circunstancias. Una dosis preferida, por ejemplo, es de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, con aproximadamente 5 µg/kg a aproximadamente 10 mg/kg que es particularmente preferido. Será evidente para los expertos en la técnica que el número y frecuencia de administración dependerá de la respuesta del hospedador.

Las composiciones farmacéuticas de esta descripción pueden estar en cualquier forma que permita la administración a un paciente, tal como por ejemplo, en la forma de un sólido, líquido o gas (aerosol) . La composición puede estar en la forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para administración oral o para administración por inyección, como dos ejemplos.

Una composición farmacéutica líquida como se usa en la presente, ya sea en la forma de una solución, suspensión u otra forma similar puede incluir uno o más de los siguientes componentes: diluentes estériles tal como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tal como mono- o di-glicéridos sintéticos que sirven como solvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes tal como acido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilendiaminotetrácetico; y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como sodio, cloruro o dextrosa. La preparación parenteral se puede encerrar en ampolletas, jeringas desechables o frascos de múltiples dosis producidos de vidrio o plástico. La solución salina fisiológica es un aditivo preferido. Una composición farmacéutica inyectable esta preferentemente estéril.

También, puede ser deseable incluir otros componentes en la preparación, tal como vehículos de distribución o administración que incluyen sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, vehículos de aceite biodegradable , emulsiones de aceite en agua, micro capsulas biodegradables y liposomas. Los ejemplos de adyuvantes para el uso de estos vehículos incluyen N-acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP) , lipopolisacáridos (LPS) , glucano, IL-12, GM-CSF, ?-interferón, y IL-15.

En tanto que se puede emplear cualquier portador adecuado conocidos por los expertos en la técnica, en las composiciones farmacéuticas de esta descripción, el tipo de portador variedad dependiendo del modo de administración y de si se desea una liberación sostenida. Para la administración Parenteral, el portador puede comprender agua, solución salina, alcohol, o una grasa, una cera, un amortiguador, o cualquier combinación de los mismos. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio o cualquier combinación de los mismos.

Esta descripción contempla una dosis unitaria que comprende una composición farmacéutica de esta descripción. Estas dosis unitarias incluyen, por ejemplo, un frasco o jeringa de dosis individual o de múltiples dosis, incluyendo un frasco o jeringa de dos compartimientos, uno que comprende la composición farmacéutica de esta descripción en forma liofilizada y el otro un diluyente para reconstitución. Una unidad de dosis de múltiples dosis también puede ser, por ejemplo, una bolsa o tubo para conexión a un dispositivo de infusión intravenosa.

Esta descripción también contempla un equipo que comprende una composición farmacéutica de esta descripción en un recipiente de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, un frasco, y un conjunto de instrucciones para administrar la composición a pacientes que padecen un trastorno tal como un trastorno descrito anteriormente.

Todas las patentes de los Estados Unidos, publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos, solicitudes de patente de los Estados Unidos, patentes extranjeras, solicitudes de patentes extrajeras, publicaciones no de patente, tablas, secuencias, páginas web, o similares, referidas en esta especificación se incorporan en la presente como referencia, en su totalidad. Los siguientes ejemplos se proponen para ilustrar, pero no para limitar, la in invención Ej emplos Secuencias SIMP y Xceptor Las secuencias de aminoácidos de las moléculas SMIP y Xceptor (SEQ ID NOS: 231-292) de ejemplo que tienen un dominio de unión anti-IL6xR se proporcionan en (SEQ ID NOS:671-694 y 607-668, respectivamente, con los correspondientes casetes de expresión de nucleótidos de las proteínas de fusión que se proporcionan en SEQ ID NOS: 761-784 y 697-758, respectivamente (se señala que las proteínas maduras carecerán de la secuencia de péptido de señal encontrada en SEQ ID NOS:671-694 y 607-668).

Los Xceptores que tienen un ectodominio de TNFRSF1B en el amino-terminal y un dominio de unión anti-IL6xR en el carboxi -terminal se refieren en la presente como TRU(XT6)-1001 a TRU(XT6) -1062. Los Xceptores en la orientación inversa, es decir, que tienen un dominio de unión anti-IL6xR en el amino-terminal y un ectodominio de TNFRSF1B en el carboxi -terminal , se refieren en la presente como TRU(X6T)-1008 y TRU(X6T) -1019. Las construcciones SMIP que tiene un dominio de unión anti-IL6xR se refieren en la presente como TRU(S6) -1002, TRU(S6) -1004, TRU ( S6 ) - 1007 , TRU ( S6 ) - 1008 , TRU(S6) -1011, TRU(S6) -1013, TRU(S6)1014, TRU (S6 )- 1018 , TRU(S6) -1019, TRU ( S6 )- 1022 , TRU(S6)-1024 a TRU (S6 )- 1026 , TRU(S6) -1029, TRU(S6) -1038, TRU ( S6 ) - 1040 , TRU ( S6 )- 1047 , TRU(S6) -1051, TRU(S6)1052, TRU (S6 )- 1054 , TRU (S6 ) -1056 , y TRU(S6)-1059 a TRU(S6) -1061.

Se examinó una biblioteca de fagos de dominios de unión de Fab para dominios de unión específicos para un complejo IL6xR esencialmente como se describe por Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol . 23:344. Los dominios de unión se clonaron por amplificación por PCR, brevemente, las regiones VL y VH de los clones de la biblioteca de Fab se amplificaron usando PCR SuperMix (Invitrogen, San Diego, CA) y los cebadores apropiados que crean el ligador G4S mediante traslape, con una fijación inicial a 56°C durante 9 ciclos, luego 62°C durante 20 ciclos adicionales. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa y se purificaron usando una columna de Purificación de PCR Qiagen (Chatsworth, CA) .

La reacción de costura de segunda ronda comprendió mezclado de un equivalente molar de los productos de VL y VH con amortiguador Expand, y agua, desnaturalizar a 95°C durante 5 segundos, luego enfriar lentamente a temperatura ambiente. Para amplificar, se adicionó una mezcla de d TP con la enzima Expand y se incubó a 72°C durante 10 segundos. Los cebadores exteriores se adicionaron (5' VH y 3' VL) y la mezcla se sometió a ciclo 35 veces con una fijación a 62 °C y una reacción de extensión de 45 minutos. El producto resultante de 750 pares de base se purificó en gel, se dirigió con EcoRI y Notl, y se clonó en el plásmido pD28 (para más detalles, ver Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2005/0136049 y Publicación de Solicitud PCT No. 2007/146968) . Se examinó la actividad de unión por ELISA como se describe en Hoet et al. (2005) .

Se probaron varias proteínas de fusión SMIP y Xceptor descritas en la presente para la actividad anti-IL6xR, actividad anti-TNF, o ambas actividades, como se describe más adelante. Las abreviaciones usadas en los siguientes ejemplos incluyen los siguientes términos: PBS-T: PBS, pH 7.2-7.4 y TweenMR20 al 0.1 % ; amortiguador de Trabajo: PBS-T con 1 % de BSA, amortiguador de Bloqueo: PBS-T con 3 % de BSA.

Ejemplo 1 Expresión de Proteínas de Fusión Se realizó la expresión de ciertas proteínas de fusión Xceptor descritas en la presente en células 293 usando el sistema de expresión FreeStyleMR 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Por cada 30 mi de transíección, se usaron 3 x 107 células en 28 mi del medio de expresión FreeStyleMR 293. En el día de la transíección, se transfirió una alícuota pequeña de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga , y se determinó la viabilidad y la cantidad de aglomeración celular usando el método de exclusión de tinte de azul de tripano. La suspensión se sometió vigorosamente a vórtice durante 45 segundos para romper los aglomerados y se determinaron las cuentas celulares totales usando un contador Coulter o un hemacitómetro . La viabilidad de las células fue de más de 90 %. Un matraz agitador ue contiene la célula requerida se colocó en una incubadora a 37°C en un agitador orbital.

Para cada muestra de transíección, se prepararon complejos de lípido-ADN como sigue. Se diluyeron 30 µg del ADN de plásmido en Opti-MEM® I a un volumen total de de 1 mi y se mezclaron suavemente. Se diluyeron 60 µ? de 293fectinMR en Opti-MEMMR I a un volumen total de 1 mi, se mezclaron suavemente y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación de 5 minutos, el ADN diluido se adicionó al 293fectinMR diluido para obtener un volumen total de 2 mi y se mezcló suavemente. La solución resultante se incubó durante 20-30 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formaran los complejos de DNA- 293fectinMR.

En tanto que se estaban incubando los complejos de ADN- 293 fectinMR, se removió la suspensión celular de la incubadora y se colocó el volumen apropiado de la suspensión celular en un matraz agitador Erlenmeyer de 125 mi desechable, estéril. Se adicionó medio de expresión FreeStyleMR 293 pre - calentado , fresco hasta un volumen total de 28 mi para una transfección de 30 mi.

Después de que se terminó la incubación del complejo de ADN-293fectinMR, se adicionaron 2 mi del complejo ADN-293fectinMR a los matraces agitadores. Se adicionaron 2 mi de Opti-MEM® I al matraz de control negativo, en lugar del complejo ADN-293 fectinMR . Cada matraz contuvo un volumen total de 30 mi, con una densidad celular final de aproximadamente 1 x 106 células viables/ml. Las células se incubaron en una incubadora a 37°C con una atmósfera humidificada de C02 al 8 % en aire en un agitador orbital que gira a 125 rpm . Las células se recolectaron en aproximadamente 7 días después de la transfección y se valoraron para la expresión de proteína recombinante .

Las proteínas de fusión que tienen un dominio, de unión, antagonista de IL6 se expresaron en células 293 como se describe anteriormente.

Ejemplo 2 Unión de Xceptor a IL6 e Hiper-IL6 por ELISA Se examinó la actividad de unión de Hiper-IL6 (HIL6 o IL6xR) , recombinante IL6 (rhIL6) , e IL6R humano, soluble para los Xceptores de ejemplo, TRU (XT6 ) -1002 , 1019, 1025, 1042, 1058, y TRU(X6T) -1019 (SEQ ID NO:608, 625, 631, 648, 664 y 670, respectivamente), sustancialmente como sigue.

Unión a HIL6 e IL6 Se adicionaron, a cada concavidad de una placa de 96 cavidades, 100 µ? de IgG-Fc anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a partir de una solución de 2 g/ml en PBS, pH 7.2-7.4. La placa se cubrió, y se incubó durante la noche durante 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, se adicionaron 250 µ? de amortiguador de bloqueo (PBS-T con 3 % de BSA o 10 % de suero normal de cabra) a cada concavidad, la placa se cubrió, se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionaron concavidades duplicadas a la placa revestida con IgG-Fc antihumano 100 µ? / concavidad de muestras de Xceptor TNFRSF IB : : anti-HIL6 y quimera de gpl30-Fc humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) diluida en serie tres veces en amortiguador de trabajo iniciando a 300 ng/ml, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionó en duplicado 100 µ?/concavidad de Hyper-IL-6 de humano o IL-6 humana recombinante a partir de una solución 150 pM en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ?/concavidad de IL-6-biotina anti-humano (R&D Systems) a partir de una solución de 150 ng/ml en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas . Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (Zymed, San Francisco, CA) diluida 1:4,000 en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió y se incubó a temperatura durante 30 minutos. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de solución de substrato de 3,3,5,5-tetramentilbenzidina (TMB) (Pierce, Rockford, IL) durante aproximadamente 3 a 5 minutos y luego la reacción se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (H2S04 1N) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm.

Unión a SIL6R Se adicionaron a cada concavidad de una placa de 96 concavidades 100 µ? de IgG-Fc anti-humano de cabra (ICN Pharmaceuticals , Costa Mesa, CA) de 2 pg/ml en PBS, pH 7.2-7.4. Las placas se cubrieron, y se incubaron durante la noche a 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, se adicionaron 250 µ? De amortiguador de bloqueo (PBS-T con 3 % de BSA o 10 % suero normal de cabra) a cada concavidad, la placa se cubrió, y se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionó en concavidades duplicadas a una placa revestida con IgG-Fc anti-humano 100 µ?/concavidad de muestras de Xceptor TNFRSF IB : : anti -HIL6 , IL-6R antihumano de control, positiva (R&D Systems, Minneapolis , MN) y los controles negativos, IgG humana o quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems), cada una se diluyó en serie tres veces en amortiguador de trabajo iniciando a 300 ng/ml, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionó en concavidades duplicadas 100 µ? /concavidad de SIL-6R humano recombinante (R&D Systems) a partir de una solución 75 pM en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ?/concavidad de IL- 6R-biot ina anti-humano (R&D Systems) a partir de una solución de 100 ng/ml en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de estreptavidina conjugada peroxidasa de rábano picante (Zymed, San Francisco, CA) diluida 1:4,000 en Amortiguador de trabajo, la placa se cubrió y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de solución de substrato de 3 , 3 , 5 , 5-tetramentilbenzidina (TMB) (Pierce, Rockford, IL) durante aproximadamente 3 a 5 minutos y luego la reacción se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (IN H2S04) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm .

Los datos en las Figuras 1A-1C demuestran que todas las proteínas de fusión Xceptor, si el ectodominio de TNFRSF1B estuvo en el amino- o carboxi - terminal de las moléculas de proteína de fusión, pueden unirse a HIL6. Adic ionalmente , estos ensayos muestran que las proteínas Xceptor tienen especificidad para el complejo IL6xR debido a que solo dos de los Xceptores se unen a rhIL6 (Figura IB) y ninguno se une a sIL6R (Figura 1C) . En estudios relacionados, el xceptor TRU (XT6 ) - 1002 y el SMIP TRU(S6)-1002 se encontraron que reaccionan de forma cruzada con IL6 del primate no humano Mucaca mulatta.

Ejemplo 3 Unión de Xceptor a TNF-ot por ELISA Se examinó la actividad de unión de TNF-a para los Xceptores TRU (XT6) -1002 , 1042, 1058, 1019, y TRU (X6T) - 1019 (SEQ ID NO:608, 648, 664, 625 y 670, respectivamente), sustancialmente como sigue.

Se adicionaron a cada concavidad de una placa de 96 concavidades 100 µ? de IgG-Fc anti-humano de cabra (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) a partir de una solución de 2 pg/ml en PBS, pH 7.2-7.4. La placa se cubrió, y se incubó durante la noche durante 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, se adicionaron 250 µ? de amortiguador de bloqueo a cada concavidad, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionaron en concavidades duplicadas a la placa revestida con IgG-Fc anti-humano 100 µ?/concavidad de muestras de Xceptor TNFRSF IB : : anti -HIL6 , los controles positivos EnbrelMR (etanercept) y la quimera TNFR2 (TNFRSF IB) -Fe recombinante de humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) , los controles negativos IgG o quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems) , cada uno diluido en serie tres veces en amortiguador de trabajo iniciando a 300 ng / mi, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron en concavidades duplicadas 100 µ?/concavidad de TNF- humano recombinante (R&D Systems) a partir de una solución de 2 ng/ml en Amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ?/concavidad de TNF-a-biotina anti-humano (R&D Systems) a partir de una solución de 200 ng/ml en Amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluida 1:1,000 en Amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de solución de substrato de 3 , 3 , 5 , 5-tetramentilbenzidina (TMB) (Pierce, Rockford, IL) durante aproximadamente 3 a 5 minutos la reacción entonces se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (IN H2S04) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm .

Los datos en la Figura 2 muestran que todas las proteínas de fusión Xceptor probadas pueden unirse a TNF-a, ya sea que el ectodominio de TNFRSF1B este en el amino- o carboxi-terminal de la proteína de fusión.

Ejemplo 4 Unión de Ligando Dual de Xceptor por ELISA Se examinó la unión concurrente a TNF-OÍ al complejo IL6xR para la proteína de fusión Xceptor TRU (XT6 ) - 1006 (SEQ ID NO:612), sustancialmente como sigue.

Se adicionaron a cada concavidad de una placa de 96 concavidades 100 µ? de solución de HIL-6 humana (5 g/ml en PBS, pH 7.2-7.4) . La placa se cubrió, y se incubó durante la noche a 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, entonces se adicionaron 250 µ? de amortiguador de bloqueo a cada concavidad, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionaron en concavidades duplicadas una placa revestida con HIL-6 100 µ?/concavidad de muestras de Xceptor TNFRSF1B : :HIL6 diluidas en serie tres veces en amortiguador de trabajo iniciando a 300 ng / mi. Los controles negativos incluyeron quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) , EnbrelMR (etanercept) , y solo amortiguador de trabajo. La placa se cubrió y se incubó at temperatura ambiente durante 1.5 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de TNF-OÍ humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN) a 2 ng / mi en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 1.5 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de TNF-a-biotina anti-humano (R&D Systems) a 200 ng/ml en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 1.5 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluida 1:1000 en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de solución de substrato de 3,3,5,5-tetramentilbenzidina (TMB) (Pierce, Rockford, IL) durante 3-5 minutos y luego la reacción se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (H2S04 1N) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm.

Los datos en la Figura 3 demuestran que las proteínas Xceptor pueden unirse a dos ligando de forma simultánea (en este caso TNF-a e Hiper-IL6) .

Ejemplo 5 Bloqueo de Xceptor de Unión de Hiper-IL6 a GP130 por ELISA Se examinó el bloqueo de la unión de Hiper-IL6 (IL6xR) al receptor gpl30 soluble por las proteínas de fusión Xceptor T U (XTO) - 1004 , 1006, 1007, 1008, 1013, y 1019 (SEQ ID NO:610, 612, 613, 614, 619 y 625, respectivamente), sustancialmente como sigue.

Se adicionaron a cada concavidad una placa de 96 concavidades 100 µ? de quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) de una solución de 0.25 - 0.5 pg/ml en PBS, pH 7.2-7.4. Las placas se cubrieron, y se incubaron durante la noche a 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, se adicionaron 250 µ? de amortiguador de bloqueo (PBS-T con 3 % de BSA o 10 % de suero normal de cabra) a cada concavidad, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Se hicieron diluciones en serie cinco veces en amortiguador de trabajo iniciando a 50 µg ml de las siguientes muestras: muestras de Xceptor TNFRSF1B : : anti-HIL6 , los controles positivos, quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems) e IL-6R anti-humano (R&D Systems) , y los controles negativos IL-6 anti-humano (R&D Systems) , IgG humana o EnbrelMR (etanercept) . Se mezclaron volúmenes iguales de las muestras de Xceptor diluidas en serie con Hiper-IL-6 (concentración final de Hiper-IL-6 de 2.5 ng/ml) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionaron en concavidades duplicadas a la placa revestida con gpl30-Fc de humano 100 µ?/concavidad de las diluciones en serie de las mezclas de Xceptor / HIL6, quimera de gpl30-Fc de humano, IL-6R anti-humano, IL-6 antihumano, IgG humano, y EnbrelMR (etanercept) , la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1.5 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de IgG-Fc anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano (Pierce, Rockford, IL) diluida 1:10,000 en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de la solución de substrato de 3 , 3 , 5 , 5-tetramentilbenzidine (TMB) (Pierce) durante aproximadamente 5 a 15 minutos y luego la reacción se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (H2S04 1N) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm .

Los datos en la Figura 4 demuestran que las proteínas Xceptor que comprenden el dominio de unión anti-IL6xR pueden bloquear gpl30 soluble de la unión a HIL6.

Ejemplo 6 Bloqueo de Xceptor de la Proliferación Celular Inducida por IL6 e Hiper-IL6 Se examinó el bloqueo de la proliferación celular inducida por IL6 o Hiper-IL6 (IL6xR) de células TF-1 para las proteínas de fusión Xceptor TRU (XT6 ) -1011 , 1014, 1025, 1026, 1002, y TRU(X6T) -1019 (SEQ ID NO:617, 620, 631, 632, 608 y 670, respectivamente), sustancialmente como sigue.

Se adicionaron a cada concavidad de una placa de fondo plano de 96 concavidades, 0.3 x 106 células TF-1 (células humanas de eritroleucemia) en medio fresco de crecimiento (10 % de FBS-RPMI 1640; L-glutamina 2mM; 100 unidades/ml de penicilina; 100 µg/ml de estreptomicina; HEPES 10 mM; piruvato de sodio 1 mM; y 2 ng/ml de Hu GM-CSF) un día antes del uso en el ensayo de proliferación. Las células entonces se recolectaron y lavaron dos veces con el medio de ensayo (mismo como el medio de crecimiento excepto sin GM-CSF, libre de citosina) , luego se resuspendieron a 1 x 105 células/ml en medio de ensayo. Para bloquear la actividad IL-6, las diluciones en serie de un Xceptor TNFSFR1B : : anti-HIL-6de interés o anticuerpo de pre- incubaron con una concentración fija de IL-6 humana recombinante (rhIL-6) (R&D Systems, Minneapolis, MN) o hiper-IL-6 (HIL-6) en placas de 96 concavidades durante 1 hora a 37°C, 5 % de C02. Los controles usado incluyeron IgG humana; quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems) ; anticuerpo anti-hIL-6 (R&D Systems) ; y anticuerpo anti-hIL-6R (R&D Systems) . Después del período de pre- incubación, se adicionaron lxlO4 células (en 100 µ?) a cada concavidad. La mezcla de ensayo final, en un volumen total de 200 yL/concavidad, que contiene TNFSFR1B : :HIL-6, rhIL-6, o HIL-6 y células se incubó a 37°C, 5 % de C02 durante 72 horas. Durante las últimas 4-6 horas de cultivo, se adicionó 3H-timidina (20 pCi/ml en medio de ensayo, 25 L/concavidad) . Las células se recolectaron en placas UniFilter- 96 GF/c y se determinó la 3H-Timidina incorporada usando un lector TopCount (Packard) . Los datos se presentan como la media de cpm ± SD de triplicados. El porcentaje de bloqueo = 100 - (cpm de prueba- cpm de control/cpm máximo -cpm de control)* 100.

Los datos en la Figura 5A en la Figura 5B demuestran que todas las proteínas Xceptor, si el ectodominio de TNFRSF1B estuvo en el amino- o carboxi-terminal de las moléculas de proteína de fusión, pueden bloquear la proliferación celular inducida por IL6 o Hiper-IL6, respectivamente .

Ejemplo 7 Bloqueo de Xceptor de Unión de TNF-a a TNFR por ELISA Se examinó el bloqueo de la unión de TNF-OÍ al receptor de TNF por las proteínas de fusión Xceptor TRU(XTo)-1004, 1006, 1007, 1008, 1013, 1019 (SEQ ID NO:610, 612, 613, 614, 619 y 625, respectivamente) sustancialmente como sigue.

Se adicionaron a cada concavidad de una placa de 96 concavidades 100 L de quimera de TNFR2-FC recombinante5 humana (R&D Systems, Minneapolis, MN) a partir de una solución de 0.25 - 0.5 ug/ml en PBS, pH 7.2-7.4. Las placas se cubrieron, se incubaron durante la noche a 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, se adicionaron 250 L de amortiguador de bloqueo (PBS-T con 3 % de BSA o 10 % de suero normal de cabra) a cada concavidad, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Las diluciones en serie de cinco veces en amortiguador de lavado iniciando a 50 a 250 µ? se hicieron de las siguientes muestras: muestras de Xceptor TNFRSF IB::anti-HIL6, controles positivos EnbrelMR (etanercept) y anti-TNF-a (R&D Systems) , y controles negativos quimera de gpl30-Fc humana (R&D Systems) e igG humana. Se mezclaron volúmenes iguales del as muestras diluidas en serie de Xceptor con TNF-a (concentración final de TNF-a de 2.5 ng/ml) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionaron en concavidades duplicadas a la placa revestida con TNFR2 -Fe humana recombinante 100 µ?/concavidad de las diluciones en serie de la mezcla de Xceptor / TNF- , EnbrelMR (etanercept) , anti-TNF- , quimera de gpl30-Fc humana, e IgG humana, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1.5 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ?. por concavidad de TNF-oí-biotina anti -humano (R&D Systems) a partir de una solución de 200 ng/ml en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 por concavidad de estreptavidina conjugadas con peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluida 1:1,000 en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ?. por concavidad de solución de substrato de 3 , 3 , 5 , 5-tetramentilbenzidina (TMB) (Pierce, Rockford, IL) durante aproximadamente 3 a 5 minutos y la reacción entonces se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (H2S04 1N) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm.

Los datos en la Figura 6 muestras que las proteínas Xceptor bloquearon la unión de TNF-a al receptor de TNF, que fue aproximadamente equivalente al bloqueo por TNFR-Fc.

Ejemplo 8 Bloqueo de Xceptor de Aniquilación Celular Inducida por TNF- ot Se examinó el bloqueo de la aniquilación de células L929 inducida por TNF-a para las proteínas de fusión Xceptor TRU(XT6) -1011, 1014, 1025, 1026, 1002, y TRU (X6T) -1019 (SEQ ID NO:617, 620, 631, 632, 608 y 670, respectivamente), sustancialmente como sigue.

Se preparó una suspensión de células de fibroblasto de ratón, L929 (ATCC, Manassas, VA) a una densidad de 2 x 105 células/ml en medio de cultivo (FBS-RPMI 1640 al 10 %; L-glutamina 2 mM; 100 unidades/ml de penicilina; 100 g/ml de estreptomicina; y HEPES 10 mM) , luego se adicionaron 100 µ? a cada concavidad de una placa negra de fondo plano de 96 concavidades se incubó a 37 °C durante la noche, 5 % de C02 en una incubadora humidificada . Las muestras de Xceptor TNFRSF1B : : anti-HIL6 diluidas en serie en medio de ensayo (mismo como medio de cultivo pero complementado con FBS al 2 %) se mezclaron con un volumen igual de TNF-a humano recombinante (rhTNF-a; R&D Systems, Minneapolis, MN) , y se incubaron a 37°C, 5 % de C02 en una incubadora humidificada durante 1 hora. Los controles positivos (es decir, aquellos agentes que bloquean la aniquilación de células L929 inducida por TNF-OÍ) incluyeron EnbrelMR (etanercept) , quimera rhTNFR2-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN) , y anticuerpo anti-TNF- (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Los controles negativos incluyeron medio de ensayo solo (sin TNF- adicionados) y el anticuerpo hlgG (sun TNF-OÍ adicionado) . Para analizar la actividad de TNF-OÍ, se removió el medio de cultivo de las células L929 y luego cada concavidad recibió 50 µ? de una mezcla de TNF-a/Xceptor o de control, y 50 µ? de actinomicina D (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) (de una solución de trabajo recién preparada de 4 pg/ml) . Las células entonces se incubaron durante 24 horas a 37°C, 5 % de C02 en una incubadora humidificada . Para medir la viabilidad celular, se adicionaron a cada concavidad 100 µ? de reactivo gradual ATPlite 1 (PerkinElmer, Waltham, MA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, se agitó durante dos minutos, y luego se mide la luminiscencia usando un lector TopCount (Packard) .

Los datos en la Figura 7 demuestran ue todas las proteínas Xceptor, si el ectodominio de TNFRSF1B estuvo en el amino- o carboxi-terminal de las moléculas de proteína de fusión, pueden bloquear la aniquilación celular inducida por TNF-OÍ en este ensayo.

Ejemplo 9 Unión de SMIP a IL6 e Hiper-IL6 por ELISA Se examinó la actividad de unión de Hiper-IL6 (HIL6 o IL6xR) , IL6 humana recombinante (rhIL6) , e IL6R soluble humano para la proteína de fusión SMIP TRU (S6) -100 , 1007, 1008, 1013, 1018, 1019, 1029, y 1038 (SEQ ID N0:672, 673, 674, 676, 678, 679, 684 y 685, respectivamente) , usando el mismo ensayo como en el Ejemplo 1 excepto que se probaron proteínas SMIP en lugar de proteínas Xceptor.

Los datos en la Figura 8 demuestran que todas las proteínas SMIP pueden unirse a HIL6.

Ejemplo 10 Especificidad de unión a Hiper-IL6 y no Otras Citosinas de GP130 Se examinó el efecto de las proteínas de fusión Xceptor en la inducción de la -proliferación de células TF-1 por IL6 y la citosinas de gpl30, IL-11, factor inhibidor de leucemia (LIF) , oncostatina M (OSM) y cardiotrofina- 1 (CT-1) .

Se adicionaron a cada concavidad de una placa de fondo plano de 96 concavidades 0.3xl06 células TF-1 (células humanas de eritroleucemia) en medio fresco de crecimiento (SFB-RP I 1640 al 10 %, L-glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 2 ng/ml de Hu GM-CSF) un día antes del uso en el ensayo de proliferación. Las células se recolectaron y se lavaron dos veces con medio de ensayo (mismo como medio de crecimiento, excepto sin GM-CSF, libre de citosinas) , luego se resuspendieron a 1 x 105 células/ml en medio de ensayo. Para examinar el bloqueo de la actividad de LIF, OSM y CT-1, se pre- incubaron diluciones en serie de los xceptores TNFSFR1 : : JIL-6 TRU (XT6)-1002 (SEQ ID NO: 608), TRU (XT6)-1019 (SEC ID NO: 625), TRU (XT6 )- 1022 (SEQ ID NO: 628) y TRU(XT6) -1025 (SEQ ID NO: 631) con una concentración fija de cada citosina de gpl30 de manera individual o hiper IL-6 (HIL-6) en placas de 96 concavidades durante 1 hora a 37°C, 5 % de C02. Después del período de pre- incubación, se adicionaron a cada concavidad lxlO4 células (en 100 µ?) . La mezcla final de ensayo, en un volumen total de 200 UL/concavidad, que contiene TNFSFR1B : : HIL-6, citosina gpl30 o HIL-6 y células, se incubó a 37°C, 5 % de C02 durante 72 horas. Después de las últimas 4-6 horas de cultivo, se adicionó 3H-timidina (20 i /ml en medio de ensayo, 25 pL/concavidad) . Las células se recolectaron en placas UniFilter-96 GF/c y se determinó la 3H-timidina incorporada usando un lector TopCount (Packard) . El porcentaje de bloqueo = 100 - (cpm de prueba - cpm de control/cpm máximo - cpm de control) *100.

Los resultados mostraron que Xceptor bloqueó la actividad de IL6, pero no IL-11, LIF, OSM o CT-1 (datos no mostrados) , y por lo tanto se unió a hiper IL6, pero no tiene efecto en las otras citosinas de gpl30 probadas .

Ejemplo 11 Unión de SMIP a Hiper- IL6 por ELISA Se examinó la actividad de unión de Hiper- IL6 (HIL6) para las proteínas de fusión SMIP humanizadas referidas como TRU(S6)-1063 - TRU(S6)-1066 (regiones variables de cadena ligera proporcionadas en SEQ ID NO: 801-804, regiones variables de cadena pesada proporcionadas en SEQ ID NO: 807-810, respectivamente) sustancialmente como sigue .

Se adicionaron a cada concavidad una placa de 96 concavidades 100 ul de hiper-IL6 humana 1 ug/ml (IL6R-IL6-mlgG) en PBS, pH 7.2-7.4. La placa se cubrió y se encubó a 4°C durante la noche. Después de lavar cinco veces con PBS-T, se adicionaron 250 µ? de Amortiguador de bloqueo (PBS-T con 3 % de BSA) a cada concavidad, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas .

Se hicieron diluciones en serie de tres veces en 100 ul de amortiguador de trabajo (1 % de BSA en PBS-T) , iniciando a través de 300 ng/ml, de las proteínas de fusión SMIP y como un control negativo, TNFR-Fc. La placa se cubrió y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar cinco veces con PBS-T, a cada concavidad se adicionaron 100 ul de un anticuerpo anti-Fc humana de cabra conjugado con HRP (Pierce, Rockford, IL) , diluido 1:1000. La placa se cubrió se incubó a temperatura ambiente durante 1 horas. Después de lavar cinco veces con PBS-T, a cada concavidad se adicionaron 100 µ? de substrato Quant-BluMR (Pierce, Rockford, IL) la placa se incubó a temperatura ambiente durante 10-30 minutos, y la fluorescencia de midió a 325/420 nm.

Los datos mostrados en la Figura 9 demuestran que todas las proteínas de fusión SMIP probadas pueden unirse a HIL6.

Ejemplo 12 Afinidad de Unión de Varias Proteínas, de Fusión, Antagonistas de IL6 Se determinaron las afinidades de unión y las constantes cinéticas de la interacción de hiper-IL6 (HIL6; monómero o dímero) , y sus componentes IL6 y sIL6R, con diferentes dominios de unión anti-HIL6 en los formatos scFv, ' SMIP, Xceptor y Xceptor inverso se determinaron usando un instrumento BiacoreMR T100 (GE Healthcare, Piscata ay, NJ) .

Se capturaron SMIPS anti-HIL6, Xceptores y Xceptores inversos mediante un anti-Fc humana de ratón monoclonal, que se conjugó de manera covalente a una superficie de carboxilmetil dextrano (CM4) mediante aminas usando clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida y N-hidroxisuccinimida . Los sitios desocupados de la superficie activada se bloquearon por etanolamina. El anticuerpo de captura (referido como anti-hFc) se une al dominio CH2 de Fe de IgG para todas las sub-clases y no mostró disociación discernible de los aglutinantes de HIL6 capturados durante el transcurso del ensayo. En cada ciclo, se capturaron tres diferentes aglutinantes de HIL6 en las celdas 2, 3 y 4 de flujo, en tanto que la celda 1 de flujo se usó como la celda de referencia. Para cada ciclo, se inyectó una concentración única de una molécula relacionada a HIL6 individual durante 150 segundos a 35 microlit os por minuto, y se dejó disociar durante 300 segundos. Al final del ciclo, la superficie se regeneró suavemente usando gCl2 3M, que disocia la proteína unida al anticuerpo de captura anti-hFc. Se realizaron múltiples ciclos para estudiar la unión de HIL6 monomérica o dimérica a diferentes concentraciones, en el intervalo de 0 - 100 nM, para cada conjunto de tres dímeros de HIL6, capturados. Los aglutinantes de HIL6 se capturaron de manera reproducible cada ciclo con CV que no excede 2 %. El experimento se realizó a 25 °C. Se usó la señal asociada con la unión a la celda de referencia para sustraer los cambios refractivos de volumen y se usaron inyecciones en blanco (solo amortiguador) para corregir la deriva y el ruido del sistema. Se determinaron los parámetros cinéticos y las afinidades usando el software de valoración BIA. Se analizaron moléculas de scFv anti-HIL6 en la orientación inversa usando una proteína de fusión de Fe de HIL6 humana/IgG de ratón, dimérica, capturada por un anticuerpo de Fe de IgG anti-ratón policlonal de conejo inmovilizado en la superficie e inyectando diferentes concentraciones de scFv sobre la superficie. Para los componentes de HIL6, IL6 (eBioscience, catálogo no. 14-8069) y sIL6R, se realizó una inyección individual de 100 nM para obtener una valoración cualitativa de la unión. La proteína de fusión de Fe de IgG humano-gpl30 humano (R&D Systems) también se capturó y se interrogó como un aglutinante de HIL6 para propósitos comparativos. La Tabla 3 muestra los resultados obtenidos para los aglutinantes anti-HIL6 en los formatos SMIP y scFv.

Tabla 3 Dímero de Mcncmero de Monómero Dímero de Dímero de Monómero Monómero En chip Fe de hu AFHA de hu de IL6 Fe de Fe de de AFH de de AFH de HIL6 ??£ SIL6R AsIL6R SIL6R AsIL6R GP 130 ND 0.68 - - - - - IRU(S6)- 1.3 2 - - - - - 1002 SEQ ID N3:671) SEQ ?? 1.04 ND ND ND ND ND ND NO:671 (scFV) Dímero de Manóiero de Monómero Dímero de Dímero de Monómero Monómero En chip Fe de hu AFHA de hu de IL6 Fe de Fe de de AFH de de AFH de HIL6 HIL6 SIL6R AsIL6R SIL6R AsIL6R 1KU(S6) - 110 310 - - - - - 1008 S£Q ID N3:674) 1RU(S6)- 200 31 - - - - - 1013 SEQ m ND:676) TKU(S6)- 2.7 2 0.44 - - - - 1019 SEQ m NO: 679) SEQ ID 1.46 ND ND ND ND ND ND NO: 679 (scFv) 1HJ(S6)- 14 14 7.5 - - - - 1022 SEQ ID NO:680) mi(S6)- 4.4 2.6 - + + + + 1025 SEQ ID NO:682) SEQ ?? 21.7 ND ND ND ND ND ND ND:683) (scFv) 1KU(S6)- 230 180 - - - - - 1029 SEQ ID NO:684) Números indican KD (nM) ND No Realizado, + Unión Observada, - Ninguna Unión Observada La Tabla 4 muestra los resultados obtenidos para los aglutinantes de HIL6 en el formato Xceptor con un ectodominio de a. TNFRSF1B en el amino-terminal y un dominio de unión anti-HIL6xR en el carboxi-terminal (TRU(XT6)) o en la orientación inversa (TRU(X6T)).

Tabla 4.

En chip Dinero de Maiómero onómero TNFoí Dinero de Dímero de anémero ancnero Fe de hu de AFH de de IL6 Fe de R Fe de de AFH de de AFH de HIL6 hu HEL6 SIL6R _\sIL6R SIL6R AsII R Enbrel™ ND ND ND 0.0017 ND ND ND ND XT6-1002 61 4.9 0.0031 (SEQ ID NO: 608) XT6-1008 300 440 ND (SEQ ID NO: 614) XT6-1008 ND ND ND ND ND ND ND ND (SEQ ID NO: 669) XT6-1013 270 190 ND (SEQ ID NO: 619) XT6-1019 5.7 17 1.0 ND (SEQ ID NO: 625) XT6-1019 300 1.9 0.57 ND (SEQ ID NO: 670) XT6-1022 17 29 12 ND (SEQ ID NO: 628) XT6-1025 25 6.3 ND + + + + (SEQ ID NO: 631) XT6-1029 49 3000 ND (SEQ ID NO: 635) Números Indican KD (nM) ND No Realizado, + Unión observada, - Ninguna unión observada Estos datos muestran que los dominios de unión anti-hiperIL6 en varios formatos se unieron a hiperIL6 monomérica y dimérica con una variedad de afinidades (desde aproximadamente 2 nM a aproximadamente 3000 nM) y los aglutinantes de más alta afinidad se aproximan a la afinidad de gpi30 para hiperlL6. La mayoría de los dominios de unión son selectivos para hiperIL6 y no se unen de manera apreciable a IL6 o sIL6R. Sin embargo, los dominios de unión TRU(X6T) -1019 y TRU(XT6) -1022 son capaces de unirse estrechamente a IL6 (a una afinidad de aproximadamente 0.44 nM a aproximadamente 12 nM) , en tanto que el dominio de unión TRU (XT6) -1025 se une al receptor (solo datos cualitativos). Ejemplo 13 Unión de Antagonista de IL6a complejo IL6:SIL6R Se combinaron IL6 humana (eBioscience , Catálogo no. 14-8069) e IL6R soluble (R&D Systems, Catálogo no. 227-SR/CF) a 50 nM cada uno en solución salina amortiguada con HEPES . Se estimó que se forman aproximadamente 30 nM de complejo IL6:sIL6R bajo estas condiciones. El complejo se inyectó sobre una superficie de SMIP TRU(S6)-1002 (SEQ ID NO:671). Se capturó (TRU(S6) -1002 como se describe anteriormente en el Ejemplo 12) . También se inyectaron IL6 y SIL6R solos a 50 nM para valorar la unión individual . El sensorgrama se muestra en la Figura 10, que está sustraído de la referencia y del blanco .

Los datos demuestran que TRU(S6) -1002 se une fuertemente al complejo IL6:sIL6R y también se une débilmente al receptor a muy altas concentraciones, pero no se une de manera detectable a IL6 bajo estas condiciones.

Ejemplo 4 Varios Dominios de Unión, Antagonistas de IL6 en Varios Formatos La unión de los dominios de unión anti-IL6 en el formato de anticuerpo, SMIP, Xceptor y anticuerpo humanizado a IL6 y hiper-IL6 (HIL6) se examinó usando BiacoreMR como se describe más adelante los anticuerpos monoclonales de ratón empleados en estos estudios obtuvieron de los hibridomas AH64, AH65, BSF2-77, CLB-8, CLB-12, CLB-16, HH61-08 y HH61-10, que son todos dominios de unión, antagonistas de IL6.

Se capturaron dominios de unión anti-IL6 usando anticuerpo policlonal Fe anti-ratón inmovilizado en el caso de anticuerpos anti-IL6, o un monoclonal Fe anti-humano en el caso de SMIP, Xceptors, y SMIP humanizados. La unión de IL6 a los dominios de unión anti-IL6 se estudió usando cinética de ciclo individual. Se hicieron cinco inyecciones secuenciales de IL6 por ciclo iniciando con la concentración más baja de IL6 (6.4 pM) y progresando a la concentración más alta (4,000 pM) . La velocidad de flujo fue de 45 \iL, por minuto y cada inyección de IL6 duró 7 minutos. Al final de la inyección de más alta concentración de IL6, se dejó a IL6 disociarse durante 30 minutos. Los datos se ajustaron a un modelo de cinética de ciclo individual de unión uno a uno. Se estudió la unión de HIL6 al inyectar una concentración única de HIL6 (desde 6.4 - 4,000 pM) por ciclo durante 7 minutos, y luego al permitir que la HIL6 unida se disociara ya sea durante 30 segundos (de 0 a 800 pM) o una hora (de 0 y 4,000 pM) . Estos datos se ajustaron a un modelo de unión uno a uno. Se realizaron todos los análisis usando el software BIAevaluation . Las constantes cinéticas y las afinidades se proporcionan en la Tabla 5.

Tabla 5 En chip En solución a ( M"1 •s-1 Kd (s-1) KD (pM) mAb AH-65 IL6 3. 2 X 106 2. 2 x 10"5 7 TRU(S6) -1067 IL6 4. 0 X 106 4. 5 x 10"5 11 TRU(S6) -1063 IL6 3. 9 X 10e 1. 9 x 10"4 51 TRU(S6) -1064 IL6 4. 2 X 106 2. 0 x 10"4 48 mAb AH-65 hiper-IL6 2. 0 X 106 2. 4 X 10"5 12 TRU (S6) -1067 hiper- IL6 4. 4 X 10s 1. 2 x 10"4 27 TRU(S6) -1063 hiperIL6 3. 6 X 106 1. 8 x 10"4 50 TRU (S6) -1064 hiperIL6 4. 1 X 106 1. 9 x 10"4 46 mAb BSF2-77 IL6 4 8 X 106 2. 0 x 10~3 410 TRU(S6) -1068 IL6 5 9 X 10s 7. 9 x 10*3 1,350 TRU (XT6) -1068 IL6 1 2 X 10s 4 .6 xlO"3 3,734 mAb BSF2-77 hiperIL6 2 2 X 10ß 9. 6 X 10"4 444 TRU(S6) -1068 hiperIL6 3 4 X 106 3 .2 xlO"3 977 TRU(XT6) -1068 hiperIL6 6 6 X 10s 4 3 x 10~3 645 En chip En solución a (M"1•s-1 Kd (S-1) KD (pM) mAb AH-64 IL6 2. 9 X 106 7 .0 X io-5 24 mAb CLB-8 IL6 2. 3 X 10e 5 .0 X io-5 22 mAb CLB-14 IL6 1. 1 X 106 3 .4 X ícr4 315 mAb CLB-12 IL6 1. 3 X 106 7 .7 X io-4 577 mAb CLB-16 IL6 2. 1 X 106 2 .4 X io-4 112 mAb HH61-08 IL6 2. 6 X 106 6 .8 X io-4 268 HH61-10mAb IL6 1. 4 X 10s 7 .0 X lO"5 49 Los dominios de unión anti-IL6 en varios formatos se unen todos a IL6 con una variedad de afinidades (desde aproximadamente 7 pM a aproximadamente 3,734 pM) . Algunos de los dominios de unión también fueron capaces de unirse a hiperIL6. De estos, se estudiaron los dominios ,de unión de anticuerpos monoclonales AH65 y BSF2-77 en detalle y la afinidad de estos dominios de unión en varios formatos a hiperlL6 varió desde aproximadamente 12 pM a aproximadamente 977 pM. En general, la proteína SMIP y los formatos Xceptor biespecíficos tienen una afinidad de unión que está dentro de 10 veces aquella de los anticuerpos monoclonales progenitores .

Ejemplo 15 Determinación de Sitio de unión de Dominios de Unión anti-IL6 IL-6 se une al receptor gpl30 a través de tres epítopos conservados, referidos como sitios I, II y III. A fin de que se presente la señalización mediante gpl30 se debe formar un complejo hexamérico de señalización. IL-6 forma primero un complejo con IL6Ra por la unión al sitio I. El sitio II es un epítopo compuesto formado por el complejo binario de IL6 con IL6Ra, que reacciona con gpl30. Finalmente, el complejo hexamérico de señalización se forma por la interacción del sitio III con gpl30 (Boulanger et al. (2003) Science 300:2101). Se ha mostrado que los anticuerpos anti-lL6 AH65 y CL-16 actúan como aglutinantes del sitio III, en tanto que el anticuerpo CL-12 anti-IL6 interactúa con el sitio II (Kalai et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249:690). El sitio de unión del dominio de unión TRU-1002 descrito en la presente se determinó como sigue.

A cada concavidad de dos placas de 96 concavidades se adicionaron 100 ul de TNF-RII anti-humano 1 ug/ml (R&D Systems, Minneapolis MN) en PBS, pH 7.2-7.4. Las placas se cubrieron se incubaron durante la noche a 4°C. Después de lavar cinco veces con PBS-T, se adicionaron a cada concavidad 250 µ? de amortiguador de bloqueo (PBS-T con 3 % de BSA) las placas se cubrieron, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas .

Después de lavar cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 ul de TRU (XT6) - 1002 , a una concentración de 0.5 yg/ml en amortiguador de trabajo (WB; PBS-T con 1 % de BSA) , a cada concavidad de una placa. En la segunda placa, se adicionaron 100 ul de 0.5mg/ml TRU (XT6) -1019 a cada concavidad. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas .

Al mismo tiempo, se bloquearon dos nuevas placas con 250 ul de Super Block (Pierce, Rockford IL) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora . Después de lavar cinco veces con PBS-T, se adicionaron las siguientes moléculas, diluidas en serie dos veces en amortiguador de trabajo iniciando a 20 µg/ml (100 ul/concavidad) , a ambas placas: MQ2-13A5 (LM-E13), AH65 (LM-A02), CL-16 (LM-S06), CL-12 (LM-S02) , CL-14 (LM-S04) y S6-A2 (TRU (S6 ) - 1002 ) . El amortiguador de trabajo solo se incubó como un control negativo. A cada concavidad entonces se adicionó un volumen igual (100 ul) de hiper-IL6 humana a 20 ng/ml en amortiguador de trabajo, y los 200 µ??? se mezclaron por pipeteado hacia arriba y hacia abajo tres veces. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora .

Después de la incubación, los 200 ul de mezcla en cada concavidad de la placa se transfirieron a la placa de TRU (XT6 )- 1002 , que se ha lavado cinco veces. Lo mismo se realizó para la segunda placa sobre la placa de TRU(XT6) -1019. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de' lavar cinco veces con PBS-T, a cada concavidad se adicionaron 100 ul de anti-IL6R biotinilado (150 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis MN) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado, se adicionaron a cada concavidad 100 ul de estreptavidina-HRP (Pierce, Rockford IL) , diluido 1:20,000 en amortiguador de trabajo, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar cinco veces con PBS-T, a cada concavidad se adicionaron 100 ul de substrato Quant-Blu (Pierce, Rockford, IL) . La placa se incubó a temperatura ambiente durante 10-30 minutos, y se midió la fluorescencia a 325/420 nm.

Los resultados se muestran en las Figuras 11A y 11B, se indican que TRU(XT6) -1002 se une al sitio III, en tanto que TRU (XT6) -1019 se une al sitio II.

Ejemplo 16 Unión de SMIP y Xceptor a IL6R en Células de Hígado Se examinó la capacidad de TRU (S6 )- 1002 , TRU(XT6)-1019 y el anticuerpo anti-IL6 hu-PMl para unirse a IL6R en células HepG2 derivadas de hígado, como sigue.

Se lavaron células HepG2 en amortiguador FACS y se ajustaron a 2 x 106 células/ml en amortiguador FACS (PBS + FBS al 3 %) . Para las concavidades de una placa de 96 concavidades se adicionaron 50 µL de esta solución (105 células/concavidad) . Las placas se mantuvieron a 37 °C hasta que estuvieron listas para adicionar moléculas diluidas de prueba . Se prepararon diluciones en serie de las moléculas de prueba en amortiguador FACS para dar una solución concentrada de trabajo 2X que se diluyó a IX, cuando se adicionó a las células. Las moléculas diluidas de prueba se adicionaron a las células (50 y las células se incubaron durante 20 min sobre hielo. Se usó IgG entera como un control. Las células entonces se lavaron dos veces con amortiguador FACS y resuspendieron en anticuerpo anti-humano de cabra conjugado con ficoeritrina (Jackson Labs; diluido 1:200 en amortiguador FACS) . Después de que se incuba durante 20 min en hielo en la oscuridad, las células se lavaron dos veces con amortiguador FACS, se re-suspendieron en 200 µ? de PBS y se leyeron en un citómetro de flujo LSRIIMR (BD Biosciences, San José, CA) .

Como se muestra en la Figura 10, TRU(S6)-1002 y TRU (XT6) -1029 no mostraron esencialmente unión a células HepG2.

Ejemplo 17 Bloqueo de SMIP y Xceptor de la Actividad de IL-6 y TNF en Ratones Se examinó la capacidad de las proteínas de fusión SMIP y Xceptor descritas en la presente, para bloquear la producción inducida por IL-6 o TNF de proteína amiloide A sérica (SAA) , como se describe a continuación. La SAA es una de las proteínas principales de fase aguda en humanos y ratones . Se encuentra elevación prolongada de niveles en plasma de SAA en inflamación crónica y conduce a amiloidosis que afecta el hígado, riñon y bazo (Rienhoff et al., (1990) Mol. Biol. Med. 7:287). Se ha mostrado que tanto IL-6 como TNF inducen SAA cuando se administran solos (Benigni et al, (1996) Blood 87:1851; Ramadori et al, (1988) Eur. J. Immunol 18 :1259) . (a) Bloqueo de la actividad de hiper IL-6 Se inyectaron ratones BALB/C hembras de forma retro-orbital con 0.2 mi de PBS, o EnbrelMR (200 ug) , TRU(S6)-1002 (200 ]ig) o TRU(XT6) -1002 (300 ]ig o 500 \ig) en PBS. Una hora más tarde, los ratones se inyectaron IP con 0.2 mi de PBS o 2 ]íg de hiper- IL6 de humano en PBS. Se recolectó suero de ratón a las 2 horas y 24 horas después de la inyección IP. La concentración en suero de SAA se determinó por ELISA, y la concentración de sgpl30 se determinó por un ensayo de receptor soluble de ratón basado en Luminex.

Como se muestra en las Figuras 13 y 14, TRU(S6)-1002 y TRU (XT6 ) - 1002 bloquearon la expresión inducida por hiperIL6 tanto de sgpl30 como de SAA. (b) Bloqueo de actividad de TNF Ratones BALB/C hembras se inyectaron de manera retro-orbital con 0.2 mi de PBS, o EnbrelMR (200 mg) , TRU(S6)-1002 (200 mg) o TRU (XT6 )- 1002 (300 mg) en PBS. Una hora más tarde, los ratones se inyectaron IP con 0.2 mi de PBS o 0.5 \xg de TNF-a de ratón en PBS. Se recolectó el suero de ratón a las 2 horas y 24 horas después de la inyección IP. La concentración en suero de SAA se determinó por ELISA, y se determinó la concentración de sgpl30 por un ensayo de receptor soluble de ratón basado en Luminex.

Como se muestra en las Figuras 15A y 15B, el Xceptor TRU"(XT6) -1002 bloqueó la expresión inducida por TNF-a de SAA, con el nivel de SAA observado a las 2 horas después de la inyección que es similar a aquel visto con EnbrelMR.

EJEMPLO 18 Actividad In vivo de Xceptor Se examina la eficacia terapéutica de las moléculas Xceptor descritas en la presente en modelos animales de enfermedad como se describe a continuación. (a) Mieloma múltiple La actividad de moléculas Xceptor se examina en al menos uno de dos modelos de ratón bien caracterizado de mieloma múltiple, específicamente, el modelo de mieloma múltiple 5T2 (5T2MM) y el modelo de mieloma múltiple 5T33 (5T33MM) . En el modelo 5T33, los ratones se tratan con Xceptores desde el momento de la inyección de células de tumor (modo profiláctico) . En el modelo 5T2MM, los ratones se tratan desde el comienzo de la enfermedad (modo terapéutico) . El efecto del tratamiento en el desarrollo del tumor y la angiogénesis se valora en ambos modelos, con los estudios óseos que se realizan en el modelo 5T2MM.

El modelo murino 5TMM de mieloma se desarrolló inicialmente por Radl et al. (J. Immunol (1979) 122:609; ver también Radl et al. Am. J. Pathol . (1988) 132:593; Radl J.

Immunol TOday (1990) 11:234). Sus características clínicas se asemejan cercanamente a la enfermedad humana: las células tumorales están localizadas en la médula ósea, la concentración de paraproteína sérica es una medida del desarrollo de la enfermedad, se incrementa la neovascularización tanto en el modelo 5T2MM como en el 5T33MM (Van Valckenborgh et al. Am J. Pathol . (1988) 132:593), y en ciertas líneas, se desarrolla una clara enfermedad ósea osteolítica. El modelo 5T2MM incluye crecimiento tumoral moderado y el desarrollo de lesiones óseas osteolíticas . Estas lesiones están asociadas con una disminución en el volumen óseo esponjoso, densidad mineral ósea disminuida y números incrementados de osteoclastos (Croucher et al., Blood (2001) 98:3534). El modelo 5T33MM tiene una captación tumoral más rápida y además de la médula ósea, las células tumorales también crecen en el hígado (Vanderkerken et al., Br. J. Cáncer (1997) 76:451).

Los modelos 5T2 y 5T33MM se han caracterizado de forma más extensiva. Se han formulado anticuerpos monoclonales específicos contra el idiotipo tanto de 5T2 como de 5T33MM permitiendo la detección, con mayor sensibilidad, de la paraproteína sérica por ELISA, y la tinción específica de las células tumorales, tanto por el análisis de FACS como por la inmunotinción de secciones histológicas (Vanderkerken et al., (1997). El análisis de secuencia del gen de VH permite la detección de células por RT-PCR y el análisis por transferencia Northern (Zhu et al. Immunol . (1998) 93:162). Los modelos 5TMM que se pueden usar tanto para experimentos in vitro como in vivo, generan una enfermedad M típica y diferentes métodos están disponibles para valorar la carga tumoral en la médula ósea, concentraciones séricas de paraproteína, angiogénesis de médula ósea (al medir la densidad de microvasos) y lesiones óseas osteolíticas (por una combinación de radiografía, densitometría e histomorfometría) . La investigación de estos últimos parámetros permite el uso de los modelos 5TMM en un escenario preclínico y el estudio del crecimiento y biología de las células de mieloma en un microambiente singénico completo. Ambas moléculas tienen como objetivo las células MM en sí mismas y se pueden estudiar moléculas que tienen como objetivo el microambiente de la médula ósea. Específicamente, en tanto que se puede usar el modelo 5T33MM para estudiar tanto el microambiente como las células MM en sí mismas, el modelo 5T2MM también se puede usar para estudiar la enfermedad ósea asociada a mieloma.

Para estudiar la eficiencia profiláctica de las moléculas Xceptor descritas en la presente, se inyectaron ratones C57BL/KaLwRij con 2 x 106 células 5T33 MM y con Xceptor en el día 0. Los ratones se sacrifican el día 28 y se valora el desarrollo tumoral al determinar la concentración sérica de paraproteína y el porcentaje de células tumorales en células aisladas de médula ósea (determinado por citometría de flujo con anticuerpos anti - idiotípicos o por citomanchas) . Se determina el peso del bazo e hígado y estos órganos están fijan en formaldehído al 4 % para análisis adicional. Se fijan las muestras óseas para procesamiento adicionales incluyendo inmunotinción de CD31 en secciones de parafina y la cuantificación de la densidad de microvasos.

Para estudiar la eficiencia terapéutica de las moléculas Xceptor descritas en la presente, se inyectan ratones con células 5T2MM en el día 0, y se administra Xceptor después del comienzo de la enfermedad, como se determina por la presencia de niveles detectables de paraproteína sérica. Se sacrifican los ratones aproximadamente cinco semanas después de la administración del Xceptor, y se valora el desarrollo tumoral como se describe anteriormente para el estudio profiláctico. Además, se realiza el análisis óseo usando rayos X para determinar el número de lesiones óseas y el área del hueso trabecular, y la tinción de TRAP para evaluar el número de osteoclastos . (b) Artritis reumatoide Se examina la eficiencia terapéutica de las moléculas Xceptor descritas en la presente en al menos uno de dos modelos murinos de artritis reumatoide (AR) , específicamente, la artritis inducida por colágeno (CIA) y modelos de glucosa- 6 - fosfato- isomerasa (G6PI). Cada uno de estos modelos se ha mostrado por otros que son útiles para predecir la eficiencia de ciertas clases de fármacos terapéuticos en AR (ver Holmdahl (2000) Arthritis Res. 2:169; Holmdahl (2006) Immunol . Lett . 103:86; Holmdahl (2007) Methods Mol. Med. 136:185; McDevitt (2000) Arthritis Res. 2.85; Kamradt y Schubert (2005) Arthritis Res . Ther . 7:20). (i) Modelo de CIA El modelo de CIA es el modelo de ratón mejora caracterizado para artritis en términos de su patogénesis y base inmunológica . Además, es el modelo más ampliamente usado de AR y, aunque no es perfecto para predecir la capacidad de los fármacos para inhibir la enfermedad en pacientes, se considera por mucho que es el modelo de elección cuando se investigan nuevos terapéuticos potenciales para AR (Jirholt, J. et al. (2001) Arthritis Res. 3:87-97; Van den Berg, .B. (2002) Curr . Rheumatol . Rep. 4:232-239; Rosloniec, E. (2003) Collagen- Induced Arthritis. In Current Protocols in Immunology, eds. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ) .

En el modelo de CIA, se induce artritis por la inmunización de ratones macho de DBA/ 1 con el colágeno II (CII) en adyuvante completo de Freund (CFA) . Específicamente, se inyectaron ratones de manera intradérmica/subcutánea con CII en CFA en el día -21 y se refuerzan con CII en el adyuvante incompleto de Freund (IFA) en el día 0. Los ratones desarrollan signos clínicos de artritis en el espacio de días del refuerzo con CII/IFA. Un subconjunto de ratones (0 % a 10 %) inmunizados con CII/CFA desarrollan signos de artritis en o alrededor del día 0 sin un refuerzo y se excluyen de los experimentos. En algunos experimentos de CIA, el refuerzo se omite y los ratones en cambio se tratan con Xceptor o control iniciando el 21 días después de la inmunización con CII/CFA (es decir, el día del primer tratamiento es el día 0) .

Los ratones se tratan con proteína de fusión, vehículo (PBS) , o control negativo o positivo en un régimen preventivo y/o terapéutico. El tratamiento preventivo inicia en el día 0 y continúa a todo lo largo del pico de la enfermedad en ratones de control (no tratados) . El tratamiento terapéutico inicia cuando la mayoría de los ratones muestran signos leves de artritis. Enbrel R, que se ha mostrado que tiene buena eficiencia, tanto en los modelos de artritis inducidos por CIA como por G6PI, se usa como un control positivo. Los datos recolectados en cada experimento incluyen puntuaciones clínicas e índice acumulativo de artritis. Los signos clínicos de artritis en el modelo de CIA se clasifican usando una escala de 0 a 4 como se muestra en la Tabla 6 a continuación : Tabla 6. (ii) Modelo de G6PI En el modelo de G6PI, se induce la artritis por inmunización de ratones DBA/1 con G6PI en adyuvante (Kamradt y Schubert (2005) Arthritis Res. Ther. 7:20; Schubert et al., (2004) J. Immunol. 172:4503; Bockermann, R. et al. (2005) Arthritis Res. Ther. 7:R1316; Iwanami, K. et al. (2008) Arthritis Rheum. 58:754; Matsumoto, et al. (2008) Arthritis Res. Ther. 10:R66). La G6PI es una enzima presente virtualmente en todas las células en el cuerpo y no se conoce porque la inmunización induce una enfermedad específica de las articulaciones. Se ha mostrado que varios agentes, tal como CTLA4-Ig, antagonistas de TNF (por ejemplo, EnbrelMR) y anticuerpo monoclonal anti-receptor de IL-6, inhiben el desarrollo de la artritis en el modelo de G6PI .

Se inmunizaron ratones DBA/1 machos con G6PI en Adyuvante Completo de Freund (CFA) a fin de inducir artritis. De forma específica, se inyectaron ratones de manera intradérmica/subcutánea con G6PI en CFA en el día 0 y desarrollan signos clínicos de artritis en el espacio de días de la inmunización. Como con el modelo de CIA analizado anteriormente, los ratones se tratan con Xceptor, vehículo (PBS) , o control negativo o positivo en un régimen preventivo y/o terapéutico. El tratamiento preventivo inicia el día 0 y continúa a todo lo largo del pico de la enfermedad en los ratones control. El tratamiento terapéutico inicia cuando la mayoría de los ratones muestran signos moderados de artritis. EnbrelMR, que se ha mostrado que tiene eficiencia en los modelos de artritis inducidos tanto con CIA como con G6PI, se usa como un control positivo. Los datos recolectados en cada experimento incluyen puntuaciones clínicas e incidencia acumulativa de artritis. Los signos clínicos de artritis en el modelo de G6PI se clasifican usando una escala similar a aquella empleada para el modelo de CIA. (c) Enfermedad de riñon poliquístico La eficiencia de las proteínas de fusión descritas en la presente en el tratamiento de enfermedad de riñon poliqupistico se prueba en modelos murinos como se describe en Gattone et al., Nat . Med. (2003) 9:1323-6; Torres et al.

Nat. Med. (2004) 10:363; ang et al . J. Am. Soc . Nephrol . (2005) 16:846; y Wilson (2008) Curr . To . Dev. Biol . 84:311.

En tanto que esta invención se ha descrito en unión con las modalidades específicas resumidas anteriormente, es evidente que para los expertos en la técnica serán evidentes muchas alternativas, modificaciones y variaciones. Por consiguiente, las modalidades de esta descripción como se expone anteriormente se propone que sean ilustrativas y no limitantes. Se pueden hacer varios cambios sin apartarse del espíritu y alcance de esta descripción como se define en las siguientes reivindicaciones. Todas las publicaciones referidas en la presente se incorporan en la presente como referencia como si se expusieran completamente.

Las SEQ ID NOS : 1-845 se exponen en el listado anexo de secuencias. Los códigos para las secuencias de nucleótidos usadas en el Listado anexo de Secuencias, incluyendo el símbolo "n" , se ajustan a la Norma ST.25 de la WIPO (1998), Anexo 2, Tabla 1.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro de la citada descripción de la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polipéptido aislado que comprende un dominio de unión específico para un complejo IL6/IL6R (IL6xR), caracterizado porque (a) se une al complejo IL6xR con una mayor afinidad que ya sea IL6 o IL6Ra, solos, o se une al complejo IL6xR solo y a IL6R solo con una mayor afinidad que IL6 sola; y (b) aumenta la unión de gpl30 soluble al complejo IL6xR, o compite con gpl30 de membrana para la unión al complejo sIL6xR, en donde el dominio de unión inhibe de manera preferencial la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6 y el polipéptido no es una gpl30.

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio de unión se une al complejo IL6xR solo y a IL6Ro¡ solo con una mayor afinidad que IL6 sola y aumenta la unión de gpl30 soluble a sIL6xR.

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el dominio de unión no inhibe la señalización de las citosinas de la familia gpl30 diferentes de IL6.

4. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el dominio de unión comprende una secuencia que es al menos 80 % idéntica a una o más regiones variables de cadena ligera o a una o más regiones variables de cadena pesada, o ambas, como se lista en SEQ ID NOS:373-496 y 799-810.

5. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el dominio de unión es un dominio de unión de anticuerpo de antígeno del mismo, un Fab, o un scFv.

6. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el dominio de unión comprende una región variable de cadena ligera que contiene secuencias de CDR1, CDR2 , y CDR3 que son cada una al menos 80 % idénticas a al menos una región variable de cadena ligera, CDR1, CDR2 , y CDR3 como se expone en SEQ ID NOS: 373-434 y 799-804, respectivamente.

7. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el dominio de unión comprende una región variable de cadena pesada que contiene secuencias de CDR1 , CDR2 , y CDR3 que cada una son al menos 80 % idénticas a al menos una región variable de cadena pesada CDR1, CDR2 , y CDR3 como se expone en SEQ ID NOS : 435-496 y 805-810, respectivamente.

8. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 caracterizado porque el dominio de unión comprende una región variable de cadena ligera que contiene secuencias de CDRl, CDR2 , y CDR3 que son cada una al menos 80 % idénticas a al menos una región variable de cadena ligera CDRl, CDR2 , y CDR3 como se expone en SEQ ID NOS: 373-434 y 799-804, respectivamente, y comprende una región variable de cadena pesada que contiene secuencias de CDRl, CDR2 , y CDR3 que son cada una al menos 80 % idénticas a al menos una región variable de cadena pesada CDRl, CDR2 , y CDR3 como se expone en SEQ ID NOS:435-496 y 805-810, respectivamente .

9. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 caracterizado porque el complejo IL6xR tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 606.

10. Una proteína de fusión, que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 caracterizada porque está fusionado a (a) un dominio de Fe de inmunoglobulina o uno o más dominios CH de un domino de Fe de inmunoglobulina, o (b) una proteína de unión de proteína de suero .

11. La proteína de fusión de conformidad con al reivindicación 10, caracterizada porque uno o más dominios CH de un dominio de Fe de inmunoglobulina comprende una región constante CH2 y una región constante CH3 , de manera preferente los dominios CH2 y CH3 de IgGl .

12. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque, desde el amino-terminal al carboxi -terminal (a) el dominio de unión de polipéptido específico para IL6xR se fusiona a un ligador (b) el ligador se fusiona a un polipéptido de región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina, y (c) el polipéptido de región constante de CH2 se fusiona a un polipéptido de región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina.

13. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque, desde el carboxi-terminal al amino-terminal , (a) el dominio de unión de polipéptido específico para IL6xR se fusiona a un primer ligador, (b) el primer ligador se fusiona a un polipéptido de región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina, (c) el polipéptido de región constante CH3 se fusiona a un polipéptido de región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina, y (d) el polipéptido de región constante CH2 se fusiona a un segundo ligador.

14. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizada porque el ligador es un polipéptido de región de charnela de inmunoglobulina.

15. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizada porque el ligador se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:497-604 y 823-828.

16. Una proteína de fusión, de unión, de cadena individual, multi-específica, caracterizada porque comprende un primer dominio de unión enlazado covalentemente a un segundo dominio de unión por un dominio interpuesto, en donde ya sea el primero o segundo dominio de unión es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

17. La proteína de fusión de unión de cadena individual, multi-específica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el primer dominio de unión es específico para el complejo IL6xR y el segundo dominio de unión es un ectodominio de receptor que no es un antagonista de IL6.

18. La proteína de fusión de unión de cadena individual multi-específica de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizada porque el dominio interpuesto comprende una región constante de inmunoglobulina o parte de una región constante colocada entre el primero y segundo dominios de unión.

19. La proteína de fusión de unión de cadena individual multi-específica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la región constante de inmunoglobulina está colocada entre un primero y- un segundo ligador.

20. La proteína de fusión de unión de cadena individual multi-específica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-19, caracterizada porque el dominio interpuesto es un dominio de dimerización.

21. Un polinucleótido, caracterizado porque codifica para un polipéptido o proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20.

22. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un polipéptido de conformidad con la reivindicación 21 operablemente enlazado a una secuencia de control de expresión.

23. Una célula hospedera recombinante , caracterizada porque contiene un vector de expresión de la reivindicación 22.

24. Una composición, caracterizada porque comprende un polipéptido o proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

25. Un método para tratar un sujeto humano o mamífero no humano que padece de una enfermedad relacionada a IL6, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un polipéptido, proteína de fusión, o composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la enfermedad es una enfermedad inflamatoria o cáncer.