CN102264390A - Il6免疫治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供识别IL6/IL6受体复合物的结合域多肽和其融合蛋白,以及它们组合物和使用方法。
Description
背景技术
白介素6(″IL6″)是调节宿主免疫应答、炎症、血细胞生成和癌发生的多效细胞因子。IL6的生物学功能由多组件分子系统介导,该系统具有两种不同的信号转导方式,作用于重叠但不完全相同的细胞群。它们称为顺式信号转导(也称为“经典”信号转导)和反式信号转导。
在顺式信号转导中,IL6结合于细胞表面IL6受体,IL6R的配体结合部分称为IL6Rα或CD126(以前称为gp80)。进而,结合于细胞的IL6|IL6Rα复合物结合于不结合配体但参与信号转导的膜蛋白gp130(也称为IL6ST、IL6Rβ或CD130),从而诱导gp130二聚化并启动信号转导。因此,顺式信号转导局限于表达细胞表面IL6Rα的细胞类型亚型,通常仅限于(例如),促分裂原活化B细胞、T细胞亚型、外周单核细胞和某些肿瘤。在细胞表面上形成的三重复合物组装成非常稳定的六聚体,IL6∶IL6Rα∶gp130比例为2∶2∶2(Boulanger等(2003)Science 300:2101)。
在反式信号转导中,可溶性IL6Rα(“sIL6Rα”)与IL6形成的复合物和得到的循环sIL6xR复合物可结合和激活任何表达gp130的细胞(而非也表达IL6Rα的细胞,Taga等(1989)Cell 58:573)。人体中许多,可能是所有或接近所有细胞都表达gp130。由于gp130普遍存在,反式信号转导可影响许多细胞类型,从而有时导致疾病。
膜蛋白gp130也以可溶形式存在(″sgp130″),其可结合循环中的sIL6xR复合物。但是,sIL6xR复合物能够同等良好地结合膜和可溶性gp130(参见Jones等(2005)J.Interferon Cytokine Res.25:241)。因此,摩尔过量的sgp130可抑制反式信号转导(通过降低循环中可用的sIL6xR复合物的含量),这不会显著影响顺式信号转导,因为sgp130对细胞结合的IL6|IL6Rα复合物的亲和力比细胞表面gp130低若干个数量级(参见例如,Jostock等(2001)Eur.J.Biochem.268:160)。因此,有证据显示spg130可用于抑制IL6活性(参见例如,Jostock等(2001)Eur.J.Biochem.268:160)。但是,除IL6外,gp130也是gp130细胞因子家族中常见的信号转导蛋白。这类信号转导蛋白包括白血病抑制因子(LIF)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、神经生成素(NP)、心肌营养素样细胞因子(CLC)、制瘤素M(OSM)、IL-27、IL-31和心肌营养素-1(CT-1)。因此,虽然sgp130可抑制反式信号转导,但将这类化合物给予患者可能产生一些不良的副作用。
多种疾病过程中牵扯到IL-6产量提高,包括阿耳茨海默病、自身免疫病(如类风湿性关节炎、SLE)、炎症、心肌梗塞、佩吉特病、骨质疏松、实体瘤(如结肠癌、RCC前列腺癌和膀胱癌)、某些神经系统癌症、B-细胞恶性肿瘤,如卡斯尔曼病、一些淋巴瘤亚型、CLL和具体的多发性骨髓瘤。在一些情况下,IL-6参与多种增殖通路,因为它能与其他因子,如结合肝素的上皮生长因子和肝细胞生长因子一起发挥作用。
若干IL6和IL6Rα抗体拮抗剂是已知的。例如,就IL6而言,Way等(美国专利申请公开号2007/0178098)公开了IL6的抗体,其从空间上阻断IL6或sIL6xR复合物与gp130的结合(也参见美国专利7,291,721)。例如,就IL6Rα而言,Kishimoto(美国专利5,670,373)公开了抑制IL6活性的IL6Rα的抗体。
附图简要说明
图1A-1C显示通过ELISA特异性检测到,含有与TNFR胞外域融合的各种不同超级(Hyper)-IL6结合域之一的多特异性(交叉受体(XceptorTM))融合蛋白能结合超级-IL6,与单独的IL6和IL6R相比这些多特异性融合蛋白优先结合超级-IL6。经测试,只有两种融合蛋白结合IL6,无一结合sIL6R。
图2显示通过ELISA检测到,含有融合于各种不同超级-IL6结合域之一的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白能结合TNF-α。
图3显示通过ELISA检测到,含有融合于TNFR胞外域的各种不同超级-IL6结合域之一的多特异性融合蛋白可同时结合超级-IL6和TNF-α。
图4显示通过ELISA检测到含有融合于TNFR胞外域的各种不同超级-IL6结合域之一的多特异性融合蛋白能阻断gp130与超级-IL6的结合。
图5A和5B显示含有融合于TNFR胞外域的各种不同超级-IL6结合域之一的多特异性融合蛋白能阻断(A)IL6或(B)超级-IL6诱导的TF-1细胞增殖。
图6显示通过ELISA检测到,含有融合于TNFR胞外域的各种不同超级-IL6结合域之一的多特异性融合蛋白能阻断TNF-α与TNFR的结合。
图7显示含有融合于各种不同超级-IL6结合域之一的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白能阻断TNF-α诱导的对L929细胞的杀伤作用。
图8显示通过ELISA检测到,含有各种不同超级-IL6结合域之一的小模块免疫药物(SMIPTM)融合蛋白(称为TRU(S6)-1004、1007、1008、1013、1018、1019、1029和1038)结合超级-IL6。
图9显示通过ELISA检测到,称为TRU(S6)-1063至TRU(S6)-1066的SMIP融合蛋白结合超级-IL6。
图11A和B显示对本文所述的抗-IL6结合域的结合位点的研究结果。
图12显示含有与IL6结合域融合的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白不结合HepG2细胞。
图13显示含有与IL6结合域融合的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白在小鼠中阻断HIL6诱导的SAA应答。
图14显示含有与IL6结合域融合的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白在小鼠中阻断HIL6诱导的sgp130应答。
图15A和B显示关于含有与IL6结合域融合的TNFR胞外域的多特异性融合蛋白在给药后2小时和24小时阻断TNFα-诱导的小鼠SAA应答的能力的研究结果。
发明详述
本发明总地提供包含对IL6与膜或可溶性IL6受体(IL6Rα)的复合物(在本文中提到膜IL6Rα或可溶性IL6Rα(sIL6Rα)时该复合物称为IL6xR,仅提到IL6与sIL6Rα的复合物时称为sIL6xR)特异性的结合域或结构域的多肽,通过例如,与膜gp130竞争结合sIL6xR、增强可溶性gp130与sIL6xR的结合、对IL6xR复合物的亲和力高于单独的IL6或IL6Rα或者具有上述特性的任何组合,该多肽相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导。在某些实施方式中,对IL6xR特异性的结合域也不会抑制除IL6以外的gp130家族细胞因子的信号转导。在其它实施方式中,这类对IL6xR复合物特异性的多肽结合域还可以是融合于二聚化结构域(如免疫球蛋白恒定区或其亚区,如IgG CH2和CH3结构域)的氨基-或羧基-末端的融合蛋白的一部分,正如在小模块免疫药物(SMIPTM)蛋白或反向SMIP分子(在本文中称为PIMS分子)等中发现的那样。本发明还提供具有多个结合域的融合蛋白,它可以是单特异性(多价)或多特异性的。例如,单特异性多价融合蛋白可具有对相同靶点,如本文所述的IL6xR复合物有特异性的至少两个结合域。如本文所述,具有对IL6xR特异性的结合域的示范性多特异性融合蛋白可包含至少一个对IL6xR以外的靶点,如TNFα或TGFβ特异性的额外结合区或结构域。
而且,本发明提供编码这类结合多肽或融合蛋白的核酸分子,用于重组产生这类分子的载体和宿主细胞,以及在各种诊断和治疗应用,包括治疗和改善疾病或失调的至少一种症状中使用本发明结合多肽或融合蛋白的组合物和方法,所述疾病或失调包括例如过度增殖性疾病(如骨髓瘤)、自身免疫病或炎性疾病(如类风湿性关节炎)。本发明的化合物和组合物也可用作研究IL6和相关分子的生物活性的体外实验和细胞实验研究工具。
在更详细地阐述本发明之前,提供本文所用某些术语的定义可能有助于理解本发明。其它定义在本说明书全文中列出。
在本说明书中,任何浓度范围、百分数范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值,适当时也包括其分数值(如整数的十分之一和百分之一),除非另有说明。另外,本文所述的有关物理特征,例如聚合物亚基、大小或厚度的任何数值范围应理解为包括所述范围内的任何整数,除非另有说明。本文所用术语″约″或″由...组成″至所述范围、数值或结构的±20%,除非另有说明。在本文中,术语“包含”和“包括”可作为同义词使用。应理解,本文所用术语“一个”和“一种”指一个或多个所列举的组件。另选方式的使用(如“或”)应理解为所述另选方式中的一个、两个或任何组合。此外,应理解本申请公开衍生自本文所述结构和取代基的各种组合的单个化合物或化合物组时,就好像每种化合物或每组化合物单独列出那样。因此,特定结构或特定取代基的选择属于本发明范围。
本发明的“结合域”或“结合区”可以是(例如)能够特异性识别和结合生物分子(如IL6、IL6R)或一个以上相同或不同分子的复合物或组装体或聚集体(不论它是稳定的或是瞬变的,如IL6xR复合物)的任何蛋白质、多肽、寡肽或肽。这类生物分子包括蛋白质、多肽、寡肽、肽、氨基酸或其衍生物;脂质、脂肪酸或其衍生物;碳水化合物、糖类或其衍生物;核苷酸、核苷、肽核酸、核酸分子或其衍生物;糖蛋白、糖肽、糖脂、脂蛋白、蛋白脂类或其衍生物;生物学样品中可能存在的其它生物分子;或者它们的任何组合。结合区包括生物分子或其它感兴趣靶点的任何天然产生的、合成的、半合成的或重组产生的结合伙伴。已知各种鉴定特异性结合特定靶点的本发明结合域的实验方法,包括Western印迹、ELISA或分析。
除非另有说明,抗体技术领域技术人员理解的术语各自具有所述领域获得的含义。例如,术语“VL”和“VH”分别指衍生自抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由离散的良好限定的亚区域构成,这些区域称为“互补决定”(CDR)和“构架区”(FR)。术语“CL”和“CH”指“免疫球蛋白恒定区”,分别指衍生自抗体轻链或重链的恒定区,后者还可根据衍生该区域的抗体的同种型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)进一步分为CH1、CH2、CH3和CH4恒定区结构域。恒定区结构域的一部分构成Fc区(″可结晶片段″区),其包含负责免疫球蛋白效应物功能如ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性)、ADCP(抗体依赖的细胞介导的吞噬作用)、CDC(补体依赖性细胞毒性)和补体结合、与Fc受体结合、相对于缺少Fc区的多肽体内半衰期延长、蛋白A结合、可能甚至是胎盘转移的结构域(参见Capon等(1989)Nature,337:525)。而且,含有Fc区的多肽能够发生二聚化或多聚化。在本文中,“绞链区”也称为“接头”,它是介于抗体某一条链的可变结合区和恒定区之间并连接二者的氨基酸序列,本领域已知它能够以绞链形式为抗体或抗体样分子提供柔韧性。
免疫球蛋白的结构域结构适合工程改造,因为在免疫球蛋白分子不同类和亚类之间可交换抗原结合区和产生效应物功能的结构域。有关免疫球蛋白结构和功能的综述参见例如Harlow等编,抗体:实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual),第14章(冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory),冷泉港(Cold Spring Harbor),1988)。有关重组抗体技术的各个方面的详细介绍和信息可参见《重组抗体》教科书(纽约州约翰韦利森出版社(John Wiley & Sons,NY),1999)。有关抗体工程的详细实验方案的集合可参见R.Kontermann和S.Dübel编,抗体工程实验室手册(The Antibody Engineering Lab Manual)(纽约/海德堡的施普林格出版社(Springer Verlag,Heidelberg/New York),2000)。
本文所用的“衍生物”指化学或生物学改性的化合物,其结构类似于母体化合物且(实际或理论上)可从该母体化合物获得。通常,“衍生物”不同于“类似物”,因为母体化合物可以是产生“衍生物”的原料,但母体化合物不一定用作产生“类似物”的原料。衍生物可具有与母体化合物不同的化学或物理特性。例如,与母体化合物相比衍生物可能亲水性更高或反应性改变,例如具有使其靶点亲和力改变的氨基酸变化的CDR。
术语“生物学样品”包括血样、活检样品、组织外植体、器官培养物、生物流体,或任何其它组织、细胞,或者来自对象或生物来源的其它制备物。对象或生物来源可以是(例如)人或非人动物、原代细胞培养物或适合培养的细胞系,包括含有染色体整合的或附加体形式的重组核酸序列的遗传工程改造细胞系、体细胞杂交细胞系、已永生化或可永生化细胞系、已分化或可分化细胞系、转化的细胞系等等。在本发明的其它实施方式中,可怀疑对象或生物来源患有疾病、失调或病症,或处于患上疾病、失调或病症的风险中,所述疾病、失调或病症包括恶性疾病、失调或病症或B细胞疾病。在某些实施方式中,对象或生物来源可以被怀疑患有过度增殖、炎性或自身免疫性疾病或者处于发生这些疾病的风险中,在本发明某些其它实施方式中对象或生物来源可以是已知未患这种疾病、失调或病症,或者不处于患上疾病、失调或病症的风险中。
IL6拮抗剂
如上所述,本发明提供含有对IL6xR复合物特异性的结合区或结构域的多肽,所述结合区或结合域具有以下一种或多种特性:(1)对IL6xR复合物的亲和力高于对单独的IL6或IL6Rα的亲和力,(2)与膜或可溶性gp130竞争结合sIL6xR复合物,(3)相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导,或者(4)不抑制除IL6以外的gp130家族细胞因子的信号转导。在某些实施方式中,根据本发明对IL6xR复合物特异性的结合域具有以下特性:(1)对IL6xR复合物的亲和力高于对单独的IL6或IL6Rα的亲和力,(2)与膜gp130竞争结合sIL6xR复合物,(3)相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导,和(4)不抑制除IL6以外的gp130家族细胞因子的信号转导。例如,对IL6xR特异性的结合区或结合域可以是免疫球蛋白如抗体、Fab、scFv等的可变域或其衍生物。就本发明而言,应理解对IL6xR特异性的结合区或结合域不是本文所述的gp130。
如本文所用,“IL6xR复合物”或“IL6xR”指IL6与IL6受体的复合物,其中IL6受体(也称为,例如,IL6Rα、IL6RA、IL6R1和CD126)是膜蛋白(本文称为mIL6R或mIL6Rα)或可溶形式(本文称为sIL6R或sIL6Rα)。术语“IL6R”包括mIL6Rα和sIL6Rα。在一个实施方式中,IL6xR包括IL6和sIL6Rα的复合物。在某些实施方式中,IL6xR复合物通过一个或多个共价键保持在一起。例如,IL6R的羧基端可通过肽接头融合于IL6的氨基端,以形成在本领域中称为超级-IL6的复合物(参见例如,Fischer等(1997)Nat.Biotechnol 15:142)。超级-IL6接头可由交联化合物、1-50个氨基酸的序列或其组合组成。超级-IL6还可包含二聚化结构域,如免疫球蛋白Fc结构域或免疫球蛋白恒定结构域亚区。在某些实施方式中,IL6xR复合物通过非共价相互作用,例如氢键、静电相互作用、范德华力、盐桥、疏水性相互作用等或其组合保持在一起。例如,IL6和IL6R可天然地非共价结合(如天然情况下,或者作为合成或重组的蛋白),或者各自融合于二聚化结构域,如免疫球蛋白Fc结构域,以进一步提高复合物的稳定性。
本文所用的“gp130”指结合于IL6xR复合物的信号传导蛋白。gp130蛋白可位于膜内(mgp130)、呈可溶形式(sgp130)或任何其它功能形式。示范性gp130蛋白具有GenBank登录号NP_002175.2所列序列或者其任何可溶或衍生形式(参见例如,Narazaki等(1993)Blood 82:1120或Diamant等(1997)FEBS Lett.412:379)。为了说明且不希望受限于理论,mgp130蛋白可结合于IL6/mILR或IL6/sILR复合物,而sgp130主要与IL6/sILR复合物结合(参见Scheller等(2006)Scand.J.Immunol.63:321)。因此,本发明结合域或其融合蛋白的某些实施方式可通过以高于单独IL6或IL6Rα的亲和力结合IL6xR,通过与sIL6xR复合物竞争结合mgp130,优选mgp130,或者通过提高或增强sgp130与sIL6xR复合物的结合,从而抑制IL6xR复合物反式信号转导。当(1)结合域或其融合蛋白阻止gp130结合sIL6xR,且所述结合域结合sIL6xR的亲和力等于或高于gp130与sIL6xR的结合亲和力,或者(2)结合域或其融合蛋白提高、增强或促进sgp130与sIL6xR复合物结合,从而缩短sIL6xR复合物可用于结合mgp130的时间量时,称本发明结合域与gp130“竞争”结合sIL6xR。
如果本发明的结合域和其融合蛋白结合靶分子的亲和力或Ka(即,特定结合相互作用的平衡结合常数,单位是1/M)是(例如)大于或等于约105M-1、106 M-1、107 M-1、108 M-1、109 M-1、1010 M-1、1011 M-1、1012 M-1或1013 M-1,则称其为“免疫特异性”或是能够以所需程度结合,包括“特异性或选择性”结合靶点,而不显著结合试样中的其它组分。“高亲和力”结合域指Ka为至少107M-1、至少108 M-1、至少109 M-1、至少1010 M-1、至少1011 M-1、至少1012 M-1、至少1013 M-1或更高的结合域。或者,亲和力可定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd),单位是M(如10-5 M至10-13 M)。本发明结合域多肽和融合蛋白的亲和力不难用常规技术测定(参见例如,Scatchard等(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660;和美国专利号5,283,173;5,468,614;分析;或等同物)。
在一个方面,本发明IL6拮抗剂结合域对sIL6xR复合物的亲和力是对单独的IL6或IL6Rα的亲和力的至少2倍至1000倍。通过结合sIL6xR复合物,本发明结合域优先抑制IL6反式信号转导。在某些实施方式中,结合域对sIL6xR复合物的亲和力与gp130对sIL6xR复合物的亲和力大致相同-“大致相同”指亲和力相等或高至多约2倍。在某些实施方式中,所述结合域对sIL6xR复合物的亲和力是gp130对sIL6xR复合物的亲和力的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更高。例如,如果gp130对sIL6xR复合物的亲和力为约2nM(参见例如,Gaillard等(1999)Eur.Cytokine Netw.10:337),那么对sIL6xR复合物的亲和力是gp130的至少10倍的结合域的解离常数(Kd)为约0.2nM或更低。
在其他实施方式中,本发明IL6拮抗剂结合域包含具有以下特性的多肽序列,(a)结合sIL6xR复合物的亲和力是结合单独的IL6或IL6Rα的亲和力的至少2倍至1000倍和(b)与gp130竞争结合sIL6xR复合物或增强gp130与sIL6xR复合物的结合。在其它实施方式中,结合sIL6xR复合物的亲和力是结合单独IL6或单独IL6Rα的亲和力的至少2倍至1000倍的本发明多肽结合域也可以(i)相对于IL6顺式信号转导更显著地或优选地抑制IL6反式信号转导,(ii)不抑制除IL6以外的gp130细胞因子家族成员的信号转导,(iii)相对于IL6顺式信号转导优选抑制IL6反式信号转导,不在可检测水平抑制除IL6以外的gp130家族细胞因子的信号转导,(iv)可具有以上两种或多种特性,或者(v)可具有所有上述特性。
在某些实施方式中,本发明的多肽IL6拮抗剂结合域结合sIL6xR复合物的亲和力是结合单独IL6或单独IL6Rα的亲和力的至少2倍至1000倍,并且相对于IL6顺式信号转导能更显著地或优选地抑制IL6反式信号转导。术语“相对于IL6顺式信号转导优选地抑制IL6反式信号转导”指在不显著改变IL6顺式信号转导(即抑制很小、不存在或检测不到)的情况下,将反式信号转导改变至可检测到sIL6xR活性降低的程度。例如,可检测sIL6xR活性的生物标记物(如,在HepG2细胞中急性期表达抗胰凝乳蛋白酶(ACT))来检测反式信号传导抑制。代表性实验可参见Jostock等(Eur.J.Biochem.,2001)-简要说,可刺激HepG2细胞以便在sIL6xR(反式信号传导)或IL6(顺式信号传导)存在下过度表达ACT,然而,加入spg130会抑制sIL6xR诱导的ACT过度表达而不显著影响IL6诱导的表达。相似地,相对于IL6顺式信号传导优先抑制IL6反式信号传导的本发明多肽结合域将抑制sIL6xR诱导的ACT过度表达(即,抑制反式信号传导),而不显著影响IL6诱导的表达(即,不可检测到顺式信号传导降低)。本领域已知的这种和其它试验可用于测定相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导(参见例如,Sporri等(1999)Int.Immunol.11:1053;Mihara等(1995)Br.J.Rheum.34:321;Chen等(2004)Immun.20:59所述的其它生物标记物)。
在其它实施方式中,通过除IL6以外的gp130家族细胞因子进行的信号传导基本不受本发明结合域多肽或其融和蛋白的抑制。例如,IL6xR复合物通过gp130进行的反式信号转导会受到抑制,但一种或多种其它gp130家族细胞因子的信号转导,如通过白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经生成素(neuropoietin、NP)、心肌营养蛋白样细胞因子(CLC)、制瘤素M(OSM)、IL-27、IL-31、心肌营养蛋白-1(CT-1)或其任何组合的信号转导受到的影响很小或不受影响。
此外,结合域与靶分子的相互作用可用作该相互作用的动力学结合或解离的衡量。动力学结合(ka),在本文中也称为kON,是结合相互作用进行的速率。在一个实施方式中,给定未结合分子位于它可以结合的细胞表面区域中的平均时间且给定未结合分子在细胞表面该区域上的浓度时,kON可能是未结合结合域结合靶分子的可能性的衡量。ka(kON)的单位是1/M秒。在某些实施方式中,kON数值可大于约103/M秒、约104/M秒、约105/M秒、约106/M秒、约107/M秒、约108/M秒、约109/M秒、约1010/M秒、或更高。在结合域是scFv的情况下,kON的范围可以从小于约104/M秒至约107/M秒(Ulrik等(2000)Cancer Res.60:6434;Xavier和Willson(1998)Biophys.J.74:2036)。结合域的kON可利用本领域已知方法,例如表面等离振子共振法(Leonard等(2007)J.Immunol.Methods 323:172)进行测定。
动力学解离(kd)(在本文中也称为kOFF)是复合物解离速率的衡量,因此是本发明多肽结合域结合靶分子的‘停留时间’的衡量。kd(kOFF)的单位是1/秒。本领域技术人员应理解,本发明结合域的体内半衰期优选为数天或数周的数量级,然而,虽然结合域浓度可以较低,但靶点可能已经足够因为在疾病状态下IL6和sIL6的产量明显提高(参见例如,Lu等(1993)Cytokine 5:578)。因此,在某些实施方式中,本发明结合域的kOFF为约10-5/秒(如,大约一天)或更短。在某些实施方式中,kOFF范围可以是约10-1/秒、约10-2/秒、约10-3/秒、约10-4/秒、约10-5/秒、约10-6/秒、约10-7/秒、约10-8/秒、约10-9/秒、约10-10/秒或更低(参见Graff等(2004)Protein Eng.Des.Sel.17:293)。
可根据本文所述方法或本领域已知的各种方法产生本发明结合域(参见例如,美国专利6,291,161;6,291,158)。来源包括来自各种物种,包括人、驼科动物(来自骆驼、单峰骆驼或美洲驼;Hamers-Casterman等(1993)Nature,363:446和Nguyen等(1998)J.Mol.Biol.,275:413)、鲨鱼(Roux等(1998)Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)95:11804)、鱼(Nguyen等(2002)Immunogenetics,54:39)、啮齿动物、禽类、羊的抗体基因序列(形式可以是抗体、sFv、scFv或Fab,如噬菌体文库中),编码随机肽文库的序列或编码其它非抗体支架的环区域中工程改造的多种氨基酸的序列,如血纤蛋白原结构域(参见例如,Weisel等(1985)Science 230:1388)、Kunitz结构域(参见例如,美国专利6,423,498)、脂质运载蛋白结构域(参见例如,WO2006/095164)、V样结构域(参见例如,美国专利申请公开号2007/0065431)、C-型凝集素结构域(Zelensky和Gready(2005)FEBS J.272:6179)、mAb2或FcabTM(参见例如,PCT专利申请公开号WO 2007/098934;WO2006/072620),等等。此外,也可通过将合成的单链IL6xR复合物,如人IL6xR复合物或超级-IL6用作方便系统(如小鼠、HuMAb小鼠TC小鼠TM、KM-小鼠美洲驼、鸡、大鼠、仓鼠,家兔等)中的免疫原的传统杂交瘤开发策略来开发本发明结合域。
在示范性实例中,通过筛选与合成的IL6xR复合物的结合,在Fab噬菌体片段文库中鉴定对IL6xR复合物特异性的本发明结合域(参见Hoet等(2005)Nature Biotechnol.23:344)。用于此种筛选的合成的IL6xR复合物包括N-IL6Rα(片段(frag))-L1-IL6(frag)-L2-ID-C结构,其中N是氨基末端且C是羧基末端,IL6Rα(frag)是全长IL6Rα的片段,IL6(frag)是IL6的片段,L1和L2是接头,ID是间插或二聚化结构域,例如免疫球蛋白Fc结构域。
更具体说,用于鉴定对IL6xR复合物特异性的结合域的IL6xR(超级IL6的形式之一)从氨基端到羧基端的结构如下:(a)来自IL6Rα的丢失全长蛋白前110个氨基酸的212个氨基酸的中心片段和取决于所用同种型(参见GenBank登录号NP_000556.1,同种型1或NP_852004.1,同种型2)的羧基端部分,其融合于(2)G3S接头,进而融合于(3)IL6的175个氨基酸的羧基末端片段(即,丢失全长蛋白前27个氨基酸;GenBank登录号NP_000591.1),进而融合于(4)作为如SEQ ID NO:589所示IgG2A铰链的接头,最后融合于由免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域构成的二聚化结构域。在某些实施方式中,由IgG1 Fc结构域组成的所述二聚化结构域中以下一个或多个氨基酸被突变(即,在该位置具有不同的氨基酸):234位的亮氨酸(L234)、235位的亮氨酸(L235)、237位的甘氨酸(G237)、318位的谷氨酸(E318)、320位的赖氨酸(K320)、322位的赖氨酸(K322)或其任何组合(按照EU进行编号)。例如,可将任一上述氨基酸改变(突变)为丙氨酸。在另一实施方式中,IgG1Fc结构域中L234、L235、G237、E318、K320和K322(按照EU进行编号)各自突变为丙氨酸(即,分别是L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A)。
在一个实施方式中,用于鉴定本发明IL6拮抗剂结合域的IL6xR复合物具有如SEQ ID NO:606所示的氨基酸序列。在某些实施方式中,提供了含有IL6xR复合物特异性的结合域的多肽,其中所述IL6xR是sIL6xR且具有如SEQ ID NO:606所示的氨基酸序列。在其它实施方式中,含有IL6xR复合物特异性结合域的多肽(1)对sIL6xR复合物的亲和力高于对单独的IL6或IL6Rα的亲和力,其中所述sIL6xR具有SEQ ID NO:606所示氨基酸序列,(2)与膜或可溶性gp130竞争结合具有SEQ ID NO:606所示氨基酸序列的sIL6xR复合物,(3)相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导,(4)不抑制除IL6以外的gp130家族细胞因子的信号转导,(5)具有特性(1)-(4)的任何组合,或者(6)具有特性(1)-(4)的全部。可用于鉴定本发明结合域或者用作参比复合物来测定任何上述结合特性的其它示范性IL6xR复合物可参见例如,美国专利公开号2007/0172458;2007/0031376;和美国专利7,198,781;5,919,763。
在一些实施方式中,本发明IL6拮抗剂结合域包含对IL6、IL6R或IL6xR复合物(如本文所述),优选对人IL6、人IL6R或人IL6xR复合物特异性的VH和VL结构域。在某些实施方式中,VH和VL结构域是啮齿动物(如小鼠、大鼠)结构域、人源化结构域或人结构域。含有这类VH和VL结构域的结合域的例子分别列于SEQ ID NO:435-496和805-810,以及373-434和799-804。在其它实施方式中,提供了结合IL6xR的亲和力大于结合单独IL6或单独IL6Rα的亲和力,并且与mgp130竞争结合sIL6xR复合物或增加sgp130与sIL6xR的结合的IL6xR复合物特异性多肽结合域,其中所述结合域包含与一个或多个轻链可变区(VL)或一个或多个重链可变区(VH)或二者,分别如SEQ ID NO:373-434和799-804以及435-496和805-810所列的氨基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少100%相同的序列,其中各CDR具有至多三处氨基酸改变(即,许多改变发生在构架区)。
在其它实施方式中,本发明结合域包含对IL6、IL6R或IL6xR复合物特异性的,分别如SEQ ID NO:435-496和805-810以及373-434和799-804所列的VH和VL结构域,它们分别与这种VH结构域、VL结构域或二者的氨基酸序列至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同,其中各CDR含有0-3处氨基酸改变。例如,本发明的VH结构域、VL结构域或二者的氨基酸序列可以与来自TRU(XT6)-1002中的示范性结合域(参见SEQ ID NO:608)的VH结构域(如氨基酸512-631)、VL结构域(如氨基酸649-759)或二者的氨基酸序列至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%相同,其中各CDR具有0-3处氨基酸改变。
在两种或多种多肽或核酸分子序列中,术语“相同”或“相同性百分数”指在比较窗口或指定区域上,采用本领域已知方法如序列比较算法,通过手工比对和目测检查来比较和比对最大对应性时,两个或多个序列或子序列在指定区域相同或其中有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(例如,60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同)。例如,适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的优选算法是BLAST和BLAST 2.0算法,分别可参见Altschul等(1977)Nucleic Acids Res.25:3389和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403。
在本文所述的任何这些或其它实施方式中,VL和VH结构域可以任何取向安置,可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中,连接VH和VL结构域的接头包含SEQ ID NO:497-604和823-828所示的氨基酸序列,如接头47(SEQ ID NO:543)或接头80(SEQ IDNO:576)。多特异性结合域将具有至少两个特异性亚结合域,其类似于羊驼抗体组织;或具有至少四个特异性亚结合域,其类似于成对VH和VL链的更常规的哺乳动物抗体组成。
在其它实施方式中,本发明IL6拮抗剂的特异性结合域可包含一种(优选CDR3)或多种互补决定区(″CDR″),或者多个拷贝的一种或多种这类CDR,这类CDR是由抗-IL6、抗-IL6R或抗-IL6xR复合物scFv或Fab片段的看不清,或者由它们的重链或轻链可变区获得、衍生或设计出的。
本领域以多种方式定义了CDR,包括Kabat、Chothia、AbM和接触定义。Kabat定义基于序列变异性,是最常用的预测CDR区域的定义(Johnson等(2000)Nucleic Acids Res.28:214)。Chothia定义基于结构环区域的定位(Chothia等(1986)J.Mol.Biol.196:901;Chothia等(1989)Nature 342:877)。AbM定义在Kabat和Chothia定义之间作出妥协,它是牛津分子集团(Oxford MolecularGroup)开发的用于抗体结构建模的完整程序包(Martin等(1989)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)86:9268;Rees等,ABMTM,用于抗体可变区建模的计算机程序(a computer program for modeling variable regions of antibodies),Oxford,UK;牛津分子公司(Oxford Molecular,Ltd.))。近年来引入了称为接触定义的另外一种定义(参见MacCallum等(1996)J.Mol.Biol.5:732),该定义基于对可用复合物晶体结构的分析。
通常,重链中的CDR结构域称为H1、H2和H3,它们是从氨基端向羧基端顺序编号的。CDR-H1长约10-12个残基,按照Chothia和AbM定义从Cys之后第四个残基开始,或按照Kabat定义从其后五个残基开始。H1可后接Trp、Trp-Val、Trp-Ile或Trp-Ala。按照AbM定义,H1的长度约为10-12个残基,而Chothia定义则排除了最后四个残基。按照Kabat和AbM定义,CDR-H2从H1末端后15个残基处开始,通常其前接序列Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(但已知许多变异)且通常后接序列Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。按照Kabat定义,H2的长度为约16-19个残基,而AbM定义预测其长度为9-12个残基。通常,CDR-H3从H2末端后33个残基处开始,通常前接氨基酸序列Cys-Ala-Arg且后接氨基酸Gly,其长度范围是3-约25个残基。
通常,轻链中的CDR区称为L1、L2和L3,它们是从氨基端向羧基端顺序编号的。CDR-L1通常大概从残基24处开始,并且通常前接Cys。CDR-L1后的残基总是Trp,以其为首的后接序列为:Trp-Tyr-Gln、Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln或Trp-Tyr-Leu。CDR-L1的长度近似为10-17个残基。CDR-L2从L1末端后约16个残基处开始,通常前接残基Ile-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys或Ile-Phe。CDR-L2长约7个残基。CDR-L3通常从L2末端后33个残基处开始,通常前接Cys,且通常后接序列Phe-Gly-XXX-Gly,其长度约为7-11个残基。
因此,本发明结合域可包含来自抗IL6、抗IL6R或抗IL6xR的可变区的单个CDR3或者可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中,本发明IL6拮抗剂结合域包含VH和VL结构域,其含有构架区以及CDR1、CDR2和CDR3区,其中(a)所述VH结构域包含SEQ ID NO:435-496和805-810中任一项所列的重链CDR3的氨基酸序列;或(b)所述VL结构域包含SEQ ID NO:373-434和799-804中任一项所列的轻链CDR3的氨基酸序列;或(c)所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列;或者所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列,并且VH和VL存在于同一参比序列中。在其它实施方式中,本发明结合域包含对IL6、IL6R或IL6xR复合物特异性的VH和VL结构域,其含有构架区以及CDR1、CDR2和CDR3区,其中(a)所述VH结构域包含SEQ ID NO:435-496和805-810中任一项所列的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列;或(b)所述VL结构域包含SEQ ID NO:373-434和799-804中任一项所列的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列;或(c)所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列;或者所述结合域包含(a)的VH氨基酸序列和(b)的VL氨基酸序列,并且VH和VL氨基酸序列来自同一参比序列。SEQ ID NO:1-186和787-792以及187-372和793-798分别提供示范性的IL6拮抗剂轻链和重链可变区CDR。SEQ ID NO:373-434和799-804以及435-496和805-810分别提供IL6拮抗剂轻链和重链可变区的氨基酸序列。
在本文所述的包含特异性CDR的任何实施方式中,IL6拮抗剂结合域可包含(i)VH结构域,其具有与SEQ ID NO:435-496和805-810中任一项所示VH结构域的氨基酸序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,其中各CDR具有0-3个氨基酸改变;或(ii)VL结构域,其具有与SEQ ID NO:373-434和799-804中任一项所示VL结构域的氨基酸序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,其中各CDR具有0-3个氨基酸改变;或(iii)同时包含(i)的VH结构域和(ii)的VL结构域;或者同时包含来自同一参比序列的(i)的VH结构域和(ii)的VL结构域。
在某些实施方式中,本发明IL6拮抗剂结合域可以是免疫球蛋白样结构域,如免疫球蛋白支架。本发明的免疫球蛋白支架包括scFv、Fab、结构域抗体或仅含重链的抗体。在其它实施方式中,提供了抗-IL6或抗-IL6xR抗体(例如,非人如小鼠或大鼠,嵌合,人源化,人)或Fab片段或scFv片段,其具有与分别由SEQ ID NO:435-496和805-810以及373-434和799-804中任一项列出的VH和VL结构域的氨基酸序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列,并且也可具有以下一种或多种特性:(1)对IL6xR复合物的亲和力高于对单独的IL6或IL6Rα的亲和力,(2)与膜或可溶性gp130竞争结合sIL6xR复合物或增强gp130与sIL6xR复合物的结合,(3)相对于IL6顺式信号转导优先抑制IL6反式信号转导,或者(4)不抑制除IL6以外的gp130家族细胞因子的信号转导。本文所述的任何方法可使用这类抗体、Fab或scFv。在某些实施方式中,本发明提供含有IL6拮抗性结合域(即,可抑制IL6顺式和反式信号转导)的多肽。在其它实施方式中,本发明IL6拮抗剂不抑制除IL6以外的gp130家族细胞因子的信号转导。示范性IL6拮抗剂包括IL6、IL6R或IL6xR特异性的结合域,如免疫球蛋白可变结合域或其衍生物(如抗体、Fab、scFv等)。
或者,本发明结合域可以是除免疫球蛋白以外的支架的一部分。所考虑的其它支架包括A结构域分子、纤连蛋白III结构域、抗脂质运载蛋白,锚蛋白重复工程改造的结合分子、腺连蛋白,库尼茨结构域或蛋白AZ结构域亲和蛋白。
如本文所述,也考虑了本文所述的结合域,如轻链和重链可变区以及CDR的变体和衍生物。在一个实例中,提供将一个或多个氨基酸残基加入特定结合剂氨基酸序列的插入变体。插入可位于蛋白质的任一端或两端,或者可位于特定结合剂氨基酸序列的内部区域内。本发明的变异产物也包含成熟的特定结合剂产物,即去除先导或信号序列且所得蛋白质具有额外的氨基末端残基的特定结合剂产物。所述额外的氨基末端残基可来自另一种蛋白质,或者可包含无法鉴定为来自某具体蛋白质的一个或多个残基。考虑了在-1位上具有额外甲硫氨酸残基的多肽,以及在-2和-1位上具有额外甲硫氨酸和赖氨酸残基的本发明多肽。在提高细菌宿主细胞的重组蛋白产量中,具有额外的Met、Met-Lys或Lys残基(或总地具有一个或多个碱性残基)的变体特别有用。
本文所用的“氨基酸”指天然(天然产生)的氨基酸、取代的天然氨基酸、非天然氨基酸、取代的非天然氨基酸或其任何组合。在本文中,用标准的单字母或三字母代号表示天然氨基酸。天然极性氨基酸包括天冬酰胺(Asp或N)和谷胺酰胺(Gln或Q);以及碱性氨基酸如精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)和其衍生物;以及酸性氨基酸如天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)及其衍生物。天然疏水性氨基酸包括色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)和其衍生物;以及其它非极性氨基酸如甘氨酸(Gly或G)、丙氨酸(Ala或A)、脯氨酸(Pro或P)和其衍生物。中等极性的天然氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)和其衍生物。除非另有说明,本文所述的任何氨基酸可以是D-或L-构型。
取代变体包括氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被去除或用另一残基取代的融合蛋白。在一些实施方式中,取代的性质是保守取代;然而,本发明也包括非保守取代。可按照物理性质以及在蛋白质二级和三级结构中的贡献对氨基酸进行分类。本领域将保守取代认定为用性质相似的氨基酸进行取代。示范性保守取代可参见表1(参见WO 97/09433,第10页,1997年3月13日公开),如下所示。
表1.保守取代I
或者,保守氨基酸可按照Lehninger(生物化学(Biochemistry),第二版;WP出版公司(Worth Publishers,Inc.)NY:NY(1975),第71-77页)进行分组,如下表2所示。
表2.保守取代II
变体或衍生物也可能因使用特定表达系统而具有额外的氨基酸残基。例如,使用将所需多肽表达为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合产物一部分的市售载体能提供在切掉所需多肽的GST组分后,在-1位上具有额外甘氨酸残基的所需多肽。也考虑到在其它载体系统中表达产生的变体,包括将组氨酸标签掺入氨基酸序列,通常位于序列的羧基和/或氨基末端的变体。
也考虑了本发明结合域中一个或多个氨基酸残基被去除的缺失变体。缺失可以在融合蛋白的一端或两端上进行,或者通过去除氨基酸序列内的一个或多个残基进行。
IL6拮抗剂结合域融合蛋白
如本文所示,本发明多肽结合域还可以是融合于间插结构域(如免疫球蛋白恒定区或其亚区)的氨基端、羧基端或两端形成的融合蛋白的一部分。示范性的本发明融合蛋白包括SMIP蛋白、PIMS蛋白、单特异性多价结合域融合蛋白、多特异性结合域融合蛋白等。所述一个或多个结合域可通过本领域已知或本文所述的接头连接于间插结构域。
本文所用的“间插结构域”指一种氨基酸序列,其简单地用作一个或多个结合域的支架以使融合蛋白主要(如,50%或更多融合蛋白)或基本(如,90%或更多融合蛋白)以单链多肽形式存在于组合物中。例如,某些间插结构域可具有结构功能(如间隔、柔韧性、刚性)或生物学功能(如血浆,如人血半衰期延长)。可延长本发明融合蛋白的血浆半衰期的示范性间插结构域包括清蛋白、转铁蛋白、结合血清蛋白的支架结构域等,或其片段。
在优选实施方式中,本发明多特异性融合蛋白的间插结构域是“二聚化结构域”,“二聚化结构域”指能够促进至少两种单链多肽或蛋白质通过非共价或共价相互作用,例如通过形成氢键、静电相互作用、范德华力、二硫键、盐桥、疏水相互作用等或其任何组合而结合的氨基酸序列。示范性二聚化结构域包括免疫球蛋白重链恒定区或亚区(如CH2CH3)。应理解,二聚化结构域也可促进更高级多聚体复合物(包括三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体等)的形成。
“恒定亚区”是本文定义的术语,指对应于或衍生自一个或多个免疫球蛋白恒定区结构域的全部或一部分,但并非来源抗体中发现的所有恒定区结构域的优选的肽、多肽或蛋白质序列。在一些实施方式中,本发明融合蛋白的恒定区结构域缺乏或具有很弱的下述效应物功能:抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)或补体活化和补体依赖性细胞毒性(CDC),同时保持结合某些FC受体(如FCRn结合)的能力并保持较长的体内半衰期。在某些实施方式中,本发明结合域融合于IgG1恒定区或亚区,其中所述IgG1恒定区或亚区中一个或多个以下氨基酸被突变:234位的亮氨酸(L234)、235位的亮氨酸(L235)、237位的甘氨酸(G237)、318位的谷氨酸(E318)、320位的赖氨酸(K320)、322位的赖氨酸(K322)或其任何组合(按照EU进行编号)。
本领域已知在Fc结构域内或外作出可改变Fc与Fc受体(CD16、CD32、CD64、CD89、FcεR1、FcRn)或补体组分C1q相互作用的突变的方法(参见例如,美国专利5,624,821;Presta(2002)Curr.Pharma.Biotechnol.3:237)。本发明的具体实施方式包括含有恒定区或亚区来自人IgG的免疫球蛋白或融合蛋白的组合物,其中结合FcRn和蛋白A的功能被保留,并且Fc结构域不再与其它Fc受体或C1q相互作用或与它们的相互作用很少。例如,本发明结合域可融合于人IgG1恒定区或亚区,其中297位的天冬酰胺(按照EU编号记作N297)被突变成另一种氨基酸,以便减少或消除此位点的糖基化,因而消除了Fc与FcγR和C1q的有效结合。另一示范性突变是P331S,这一突变消除了C1q结合但不影响Fc结合。
在其它实施方式中,免疫球蛋白Fc区可能相对于免疫球蛋白参比序列改变了糖基化模式。例如,可采用各种遗传技术来改变构成糖基化位点的一个或多个特定氨基酸残基(参见Co等(1993)Mol.Immunol.30:1361;Jacquemon等(2006)J.Thromb.Haemost.4:1047;Schuster等(2005)CancerRes.65:7934;Warnock等(2005)Biotechnol.Bioeng.92:831)。或者,可工程改造产生本发明融合蛋白的宿主细胞,以产生改变的糖基化模式。例如,本领域已知的一种方法提供改变的糖基化模式,具体形式是ADCC提高的平分的非岩藻糖基化变体形式。这种变体由含有寡糖修饰酶的宿主细胞表达而来。或者,也考虑用BioWa/Kyowa Hakko的Potelligent技术来降低本发明糖基化分子的岩藻糖含量。在一种已知方法中,提供了用于产生重组免疫球蛋白的CHO宿主细胞,它能通过产生GDP-岩藻糖改变免疫球蛋白Fc区的糖基化模式。
或者,利用化学技术改变本发明融合蛋白的糖基化模式。例如,各种糖苷酶和/或甘露糖苷酶抑制剂提供提高ADCC活性、提高Fc受体结合和改变糖基化模式中的一种或多种所需特性。在某些实施方式中,在含有糖修饰物的培养基中培养表达本发明融合蛋白的细胞,其中所述糖修饰物的浓度能提高所述宿主细胞产生的免疫糖蛋白分子的ADCC,并且小于800μM。在优选实施方式中,在含有浓度为100-800μM,如100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM或800μM的澳粟精胺或几夫碱,更优选澳粟精胺的培养基中培养表达这些多特异性融合蛋白的细胞。美国专利申请公开号2009/0041756或PCT公开号WO 2008/052030中提供了用糖修饰物如澳粟精胺改变糖基化的方法。
在另一实施方式中,免疫球蛋白Fc区可具有影响与效应物细胞Fc受体结合的氨基酸修饰。可利用本领域已知的任何技术,例如Presta等(2001)Biochem.Soc.Trans.30:487所述的方法制备这些修饰。在另一种方法中,可使用Xencor XmAb技术工程改造对应于Fc结构域的恒定亚区,以增强细胞杀伤性效应物功能(参见Lazar等(2006)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)103:4005)。例如,可以使用这种方法产生对FCγR的特异性和结合有所改进的恒定亚区,从而提高细胞杀伤性效应物功能。
在其它实施方式中,与缺少这类间插结构域的相应融合蛋白相比,恒定区或亚区可任选地增加血浆半衰期或胎盘转移。在某些实施方式中,本发明融合蛋白在人体内的延长的血浆半衰期是至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少12、至少18、至少20、至少24、至少30、至少36、至少40、至少48小时,至少数日,至少一周,至少2周,至少数周,至少一个月,至少两个月,至少数个月,或更长时间。
恒定亚区可包含任意以下结构域的一部分或全部:CH2结构域、CH3结构域(IgA、IgD、IgG、IgE或IgM)和CH4结构域(IgE或IgM)。因此,本文所述的恒定亚区指对应于免疫球蛋白恒定区某部分的多肽。恒定亚区可包括衍生自相同或不同的免疫球蛋白、抗体同种型或等位基因变体的CH2结构域和CH3结构域(例如,两者均为IgG1,或者一个是IgG1另一个是IgG2)。在一些实施方式中,CH3结构域被截短,并包含PCT公开号WO2007/146968中列作SEQ ID NO:366-371的羧基末端序列,通过引用将这些序列纳入本文。在某些实施方式中,恒定亚区包含CH2结构域和CH3结构域,它们可任选具有氨基末端接头、羧基末端接头或在两端具有接头。
“接头”是结合或连接其它肽或多肽的肽,如约2至150个氨基酸的接头。在本发明融合蛋白中,接头可将间插结构域(如免疫球蛋白衍生的恒定亚区)连接于结合域,或者接头可连接结合域的两个可变区。例如,接头可以是由抗体绞链区序列获得、产生或设计出的氨基酸序列,将结合域连接于受体的序列,或者是将结合域连接于细胞表面跨膜区或膜锚定物的序列。在一些实施方式中,接头可具有至少一个能够在生理条件或其它标准肽条件(如,肽纯化条件、肽储存条件)下参与至少一个二硫键的半胱氨酸。在某些实施方式中,对应于或类似于免疫球蛋白铰链肽的接头保留了对应于朝向该铰链氨基端设置的铰链半胱氨酸的半胱氨酸。在其它实施方式中,接头来自IgG1铰链,并含有对应于铰链半胱氨酸的一个半胱氨酸或两个半胱氨酸。在某些实施方式中,在间插结构域之间形成一个或多个二硫键,称为链间二硫键。在其它实施方式中,本发明融合蛋白可具有直接融合于结合域的间插结构域(即,没有接头或铰链)。在一些实施方式中,所述间插结构域是二聚化结构域。
此外,结合域可包含VH和VL结构域,这些可变区结构域可通过接头结合起来。示范性可变区结合域接头包括属于(GlynSer)家族的接头,如(Gly3Ser)n(Gly4Ser)1、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)n、(Gly3Ser)n(Gly4Ser)n或(Gly4Ser)n,其中n是1-5的整数(参见例如,分别对应于SEQ ID NO:518、525、542、585、586和603的接头22、29、46、89、90和116)。在优选实施方式中,这些基于(GlynSer)的接头用于连接可变区,不用于将结合域连接于间插结构域。
本发明融合蛋白的间插或二聚化结构域可通过肽接头连接于一个或多个远端或末端结合域。除提供间隔功能外,接头可在融合蛋白内以及融合蛋白和其靶点之间提供适合将融合蛋白的一个或多个结合域适当定向的弹性或刚性。另外,在给予需要的对象如人后,接头可在体外和体内支持全长融合蛋白的表达和纯化蛋白的稳定性,在这些对象中接头优选无免疫原性或免疫原性较低。在某些实施方式中,本发明融合蛋白的二聚化结构域的接头可包含人免疫球蛋白铰链的一部分或全部。
可用于将间插结构域(例如,免疫球蛋白分子衍生的恒定亚区)连接于结合域或者连接结合域的两个可变区的示范性接头可参见SEQ ID NO:497-604和823-828。
本发明考虑到的接头包括例如,衍生自免疫球蛋白超家族成员的任何域间区(如抗体绞链区)或C型凝集素(II型膜蛋白家族)的杆区域的肽。这些接头的长度可以是约2-150个氨基酸、或约2-40个氨基酸、或约8-20个氨基酸、优选约10-60个氨基酸、更优选约10-30个氨基酸、最优选约15-25个氨基酸。例如,接头1(SEQ ID NO:497)长为2个氨基酸,接头116(SEQ ID NO:603)长为36个氨基酸。
除通常的长度考量外,适用于本发明融合蛋白的接头包括选自下组的抗体绞链区:IgG绞链、IgA绞链、IgD绞链、IgE绞链或其变体。在某些实施方式中,接头可以是选自人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、其片段或变体的抗体绞链区(上部和核心区域)。本文所用的作为“免疫球蛋白绞链区”的接头指在CH1羧基端和CH2氨基端(对IgG、IgA和IgD而言)或CH3氨基端(对IgE和IgM而言)之间发现的氨基酸。本文所用的“野生型免疫球蛋白绞链区”指在抗体重链中发现的置于CH1和CH2区之间并连接这两个区域(对IgG、IgA和IgD而言)或置于CH2和CH3区之间并连接这两个区域(对IgE和IgM而言)的天然产生的氨基酸序列。在优选实施方式中,野生型免疫球蛋白绞链区序列是人序列。
根据结晶图象研究,可根据功能和结构将IgG绞链区再分成以下三个区域:上部绞链区、核心或中部绞链区和下部绞链区(Shin等(1992)Immunol.Rev.130:87)。示范性上部绞链区包括IgG1中发现的EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:830)、IgG2中发现的ERKCCVE(SEQ ID NO:831)、IgG3中发现的ELKTPLGDTT HT(SEQ ID NO:832)或EPKSCDTPPP(SEQ ID NO:833)、以及IgG4中发现的ESKYGPP(SEQ ID NO:834)。示范性中部绞链区包括IgG1和IgG2中发现的CPPCP(SEQ ID NO:835)、IgG3中发现的CPRCP(SEQ IDNO:836)和IgG4中发现的CPSCP(SEQ ID NO:837)。虽然IgG1、IgG2和IgG4抗体各自具有一个上部和中部铰链,IgG3具有四个串联铰链-一个是ELKTPLGDTT HTCPRCP(SEQ ID NO:838),三个是EPKSCDTPPP CPRCP(SEQ ID NO:839)。
IgA和IgD抗体看来缺少IgG-样核心区,IgD看来具有两个串联的上部绞链区(参见SEQ ID NO:840和841)。SEQ ID NO:842和843中列出了IgA1和IgA2抗体中发现的示范性野生型上部绞链区。
相反,IgE和IgM抗体包含具有铰链样特性的CH2区域而不是典型的绞链区。SEQ ID NO:844(VCSRDFTPPT VKILQSSSDG GGHFPPTIQLLCLVSGYTPG TINITWLEDG QVMDVDLSTA STTQEGELAS TQSELTLSQKHWLSDRTYTC QVTYQGHTFE DSTKKCA)和SEQ ID NO:845(VIAELPPKVS VFVPPRDGFF GNPRKSKLIC QATGFSPRQI QVSWLREGKQVGSGVTTDQV QAEAKESGPT TYKVTSTLTI KESDWLGQSMFTCRVDHRGL TFQQNASSMC VP)分别列出IgE和IgM的示范性野生型CH2上部铰链样序列。
“改变的野生型免疫球蛋白绞链区”或“改变的免疫球蛋白绞链区”指(a)含有至多30%氨基酸改变(如至多25%、20%、15%、10%或5%氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白绞链区,(b)长度为至少10个氨基酸(如至少12、13、14或15个氨基酸)、含有至多30%氨基酸改变(如至多25%、20%、15%、10%或5%氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白绞链区的一部分,或者(c)包含核心绞链区的野生型免疫球蛋白绞链区的一部分(该部分长度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。在某些实施方式中,野生型免疫球蛋白绞链区,例如含有上部和核心区的IgG1铰链中的一个或多个半胱氨酸残基可被一个或多个其它氨基酸残基(如,一个或多个丝氨酸残基)所取代。另选地或额外地,改变的免疫球蛋白绞链区可使野生型免疫球蛋白绞链区,例如含有上部和核心区的IgG1铰链的脯氨酸残基被另一氨基酸残基(如丝氨酸残基)取代。
可用作连接区的另选的铰链和接头序列可从连接IgV-样或IgC-样结构域的细胞表面受体诸部分制备。当细胞表面受体含有多个串联的IgV-样结构域时在IgV-样结构域之间,以及当细胞表面受体含有多个串联的IgC-样区域时在IgC-样结构域之间的区域也可用作连接区或接头肽。在某些实施方式中,铰链和接头序列的长度是5-60个氨基酸,可能是基本呈柔韧性,但也可能提供更刚性的特征,也可主要含有α-螺旋结构而β-片层结构很少。优选地,序列是在血浆和血清中稳定,并且能耐受蛋白水解切割。在一些实施方式中,序列可含有能形成一个或多个二硫键以稳定该分子的C末端的天然产生的或添加的基序,例如CPPC。在其它实施方式中,序列可含有一个或多个糖基化位点。铰链和接头序列的例子包括CD2、CD4、CD22、CD33、CD48、CD58、CD66、CD80、CD86、CD96、CD150、CD166和CD244的IgV样和IgC样结构域之间或IgC样或IgV样结构域之间的结构域间区。另选铰链也可从非免疫球蛋白超家族成员的II型受体如CD69、CD72和CD161中含二硫键的区域制备。
在一些实施方式中,铰链接头具有一个用于形成链间二硫键的半胱氨酸残基。在其它实施方式中,接头具有两个用于形成链间二硫键的半胱氨酸残基。在其它实施方式中,铰链接头衍生自免疫球蛋白域间区(如抗体绞链区)或II型C-型凝集素杆区(衍生自II型膜蛋白;参见例如,PCT申请公开号WO2007/146968所示的示范性凝集素杆区序列,如该公开文件的SEQ ID NO:111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、287、289、297、305、307、309311、313-331、346、373-377、380或381),这些序列通过引用纳入本文。
在一个方面,本发明融合蛋白包含对IL6、IL6R或IL6xR特异性的结合域,是SMIP蛋白形式。本文记载了制备SMIP蛋白的方法,该方法是本领域已知的(参见美国专利公开号2003/0133939、2003/0118592和2005/0136049)。在某些实施方式中,融合蛋白具有对IL6xR复合物特异性的多肽结合域,其对IL6xR的结合亲和力高于对单独的IL6或IL6Rα的亲和力,并且与gp130竞争结合sIL6xR复合物或能增强gp130与sIL6xR的结合,其中从氨基端到羧基端,(a)所述多肽结合域融合于第一接头,(b)免疫球蛋白重链CH2恒定区或亚区多肽融合于第二接头,(c)免疫球蛋白重链CH3恒定区或亚区多肽融合于CH2恒定区或亚区多肽。或者,SMIP蛋白结构如下所示:N-BD-L1-CH2CH3-C,其中N是所述融合蛋白的氨基末端,BD是抗-IL6xR复合物结合域或scFv,L1是接头,CH2和CH3是免疫球蛋白重链恒定区2和3,C是所述融合蛋白的羧基末端。在一些实施方式中,所述接头是(Gly4Ser)n,其中n是1至6的整数,如46(SEQ IDNO:542),或者所述接头是IgG1、IgA或IgE绞链区,具有0、1或2个半胱氨酸残基的突变IgG1绞链区,如接头47(SEQ ID NO:543)或接头80(SEQID NO:576)。在一些实施方式中,所述融合蛋白可通过或不通过接头融合于除免疫球蛋白恒定区或亚区以外的结构域,以使该融合蛋白在组合物中主要或基本保持单链多肽的状态。
在其它实施方式中,本发明SMIP融合蛋白具有包含轻链可变区和重链可变区的结合域,所述轻链可变区含有各自与SEQ ID NO:373-434和799-804中任一项所示的至少一个轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%-100%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列,其中各个CDR含有0-3个氨基酸改变;所述重链可变区含有各自与SEQ ID NO:435-496和805-810中任一项所示的至少一个重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%-100%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列,其中各个CDR含有0-3个氨基酸改变。在其它实施方式中,本发明SMIP融合蛋白具有与SEQ IDNO:671-694中任一项所示的氨基酸序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同、包含或不包含先导肽序列的氨基酸序列。
在其它实施方式中,SMIP多肽可具有IL6拮抗性结合区或结构域,可测量到它对IL6顺式-和反式-信号转导的抑制。在某些实施方式中,本发明IL6拮抗剂不抑制除IL6以外的gp130家族细胞因子的信号转导。
在其它实施方式中,本发明融合蛋白包含IL6拮抗剂结合域,是PIMS蛋白形式,其中所述结合域位于该融合蛋白的羧基端。制备PIMS蛋白的构建物和方法参见PCT公开号WO 2009/023386。通常,PIMS分子是单链多肽,在氨基端到羧基端的方向上包含间插结构域(例如,衍生自包含来自相同(优选)或不同动物物种的CH2和CH3结构域的免疫球蛋白、免疫球蛋白同种型和/或免疫球蛋白亚类的免疫球蛋白恒定亚区)、接头肽(如免疫球蛋白绞链区)和特异性结合域。在一些实施方式中,PIMS分子还含有位于氨基末端的免疫球蛋白绞链区,所述氨基末端绞链区可能与二聚化结构域和结合域中发现的接头相同或不同。在一些实施方式中,位于氨基末端的接头含有天然产生的或附加的基序(如CPPC),以促进形成至少一个二硫键,从而使多聚化分子的氨基端稳定。因此,一些PIMS分子的示范性结构包括N-二聚化结构域-接头-结合域-C或N-铰链接头-二聚化结构域-接头-结合域-C。在一些实施方式中,该融合蛋白具有间插结构域,其中该融合蛋白在组合物中主要或基本保持单链多肽的状态,或者在组合物中主要或基本是二聚体的状态。
在某些实施方式中,融合蛋白具有IL6拮抗剂多肽结合域,该结合域结合IL6xR复合物的亲和力高于对单独的IL6或IL6Rα的亲和力,并能与gp130竞争结合sIL6xR复合物或增强gp130与sIL6xR复合物的结合,其中从羧基端到氨基端,(a)所述多肽结合域融合于第一接头,(b)所述第一接头融合于免疫球蛋白重链CH3恒定区或亚区多肽,(c)所述CH3恒定区或亚区多肽融合于免疫球蛋白重链CH2恒定区或亚区多肽,(d)所述CH2恒定区或亚区多肽融合于第二接头。在其它实施方式中,本发明PIMS融合蛋白具有包含轻链可变区和重链可变区的结合域,所述轻链可变区含有各自与SEQ ID NO:373-434和799-804中任一项所示的至少一个轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%-100%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列,其中各个CDR含有0-3个氨基酸改变;所述重链可变区含有各自与SEQ ID NO:435-496和805-810中任一项所示的至少一个重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%-100%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列,其中各个CDR含有0-3个氨基酸改变。
在其它方面,本发明融合蛋白包含对IL6或IL6xR特异性的结合域,是多官能结合蛋白的形式,如SCORPIONTM蛋白。本文记载了制备SCORPIONTM蛋白的方法,该方法是本领域已知的(参见PCT申请公开号WO 2007/146968)。其它示范性多官能融合蛋白可参见例如,美国专利申请公开号2006/0051844和美国专利7,166,707。在某些实施方式中,单特异性多价融合蛋白包含第一和第二结合域、第一和第二接头以及二聚化结构域,其中所述二聚化结构域的各端通过接头融合于各自对IL6xR有特异性的免疫球蛋白可变区结合域或其衍生物,如本文所述。或者,SCORPIONTM蛋白结构如下所示:N-BD1-ID-BD2-C,其中BD1是第一结合域,ID是间插结构域,BD2是第二结合域。在一些此类构建物中,ID包含安置在第一和第二结合域之间的免疫球蛋白恒定区或亚区域。在其它实施方式中,所述融合蛋白具有间插结构域,其中所述融合蛋白在组合物中基本或主要保持单链多肽的形式。在一些构建物中,ID是二聚化结构域。
在具体实施方式中,融合蛋白具有至少两个对IL6xR复合物特异性的多肽结合域,所述结合域结合IL6xR的亲和力高于对单独的IL6或IL6Rα的亲和力,并且与gp130竞争结合sIL6xR复合物或能增强gp130与sIL6xR复合物的结合,其中从氨基端到羧基端,(a)第一多肽结合域融合于第一接头,(b)所述第一接头融合于免疫球蛋白重链CH2恒定区或亚区多肽,(c)所述CH2恒定区或亚区多肽融合于免疫球蛋白重链CH3恒定区或亚区多肽,(d)所述CH3恒定区或亚区多肽融合于第二接头,(e)所述第二接头融合于第二多肽结合域。在其它实施方式中,本发明SCORPIONTM融合蛋白具有独立地包含轻链可变区和重链可变区的至少两个结合域,所述轻链可变区含有各自与SEQ ID NO:373-434和799-804中任一项所示的至少一个轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%-100%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列,其中各个CDR含有0-3个氨基酸改变;所述重链可变区含有各自与SEQ ID NO:435-496和805-810中任一项所示的至少一个重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%-100%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列,其中各个CDR含有0-3个氨基酸改变。在一些实施方式中,所述第一接头是(Gly4Ser)n接头,其中n是1至5的整数,例如接头46(SEQ IDNO:542)。在其它实施方式中,所述第一或第二接头是IgG1、IgA或IgE绞链区,或者是具有0、1或2个半胱氨酸残基的突变IgG1绞链区,例如SEQ ID NO:497-604和823-828中所列的任何接头。
在另一方面,如本文所述具有IL6拮抗剂结合域的示范性多特异性融合蛋白可含有至少一个非IL6拮抗性的额外的结合区或结构域。在某些实施方式中,多特异性融合蛋白包含第一和第二结合域、第一和第二接头以及间插结构域,其中所述间插结构域的一端通过接头融合于来自对IL6xR特异性的免疫球蛋白可变区的第一结合域,另一端通过接头融合于第二结合域,它是受体的配体结合胞外域,例如白介素受体胞外域、生长因子受体胞外域(如TGFR)或肿瘤坏死因子超家族受体(TNFSFR)胞外域。在一些实施方式中,采用小于完整胞外域的部分。具体说,采用产生配体结合作用的胞外域内的结构域。例如,考虑到TNF-α拮抗剂结构域可以位于融合蛋白的氨基末端,IL6拮抗剂结合域位于融合蛋白的羧基末端;或者IL6拮抗剂结合域可以位于融合蛋白的氨基末端,而TNF-α拮抗剂可以位于羧基末端。如本文所述,本发明结合域可融合于间插结构域(如免疫球蛋白恒定区或其亚区,如IgG1 CH2CH3)的任一端。而且,两个或多个结合域各自可通过本领域已知或本文所述的相同或不同的接头连接于间插结构域。
这类多特异性融合蛋白,在本文中称为交叉受体分子的示范性结构包括N-BD-ID-ED-C、N-LD-ID-BD-C、N-ED1-ID-LD2-C,其中BD是免疫球蛋白样或免疫球蛋白可变区结合域,ID是间插结构域,而ED是配体结合域,如受体胞外域、脑信号蛋白结构域等。在一些构建物中,ID是二聚化结构域。在一些构建物中,ID可以包含安置在第一和第二结合域之间的免疫球蛋白恒定区或亚区域。在其它实施方式中,所述融合蛋白具有间插结构域,其中所述融合蛋白在组合物中基本或主要保持单链多肽的形式。
在一些实施方式中,本发明多特异性融合蛋白具有TNF-α拮抗剂,其包含TNFRSF胞外域或TNFRSF胞外域的亚结构域,如富半胱氨酸结构域(CRD)1、CRD2、CRD3、50’s TNF结合环、90’s TNF结合环或其任意组合。例如,TNF-α拮抗剂可包含SEQ ID NO:696所示的TNFRSF1A胞外域(该序列中含有或不含天然先导肽序列)或SEQ ID NO:695所示的TNFRSF1B胞外域(该序列中含有或不含天然先导肽序列)。
在具体实施方式中,融合蛋白具有(a)对IL6xR复合物特异性的多肽结合域,其结合IL6xR的亲和力高于对单独的IL6或IL6Rα的亲和力,并且与gp130竞争结合sIL6xR复合物或能增强gp130与sIL6xR复合物的结合,和(b)包含TNFRSF1B胞外域的多肽结合域,其中从氨基端到羧基端或者从羧基端到氨基端,(a)抗-IL6xR结合域或TNFRSF1B胞外域融合于第一接头,(b)所述第一接头融合于免疫球蛋白重链CH2恒定区或亚区多肽,(c)所述CH2恒定区或亚区多肽融合于免疫球蛋白重链CH3恒定区或亚区多肽,(d)所述CH3恒定区或亚区多肽融合于第二接头,(e)所述第二接头融合于抗-IL6xR结合域或TNFRSF1B胞外域。在某些实施方式中,本发明多特异性交叉受体融合蛋白具有包含轻链可变区和重链可变区的IL6xR结合域,所述轻链可变区含有各自与SEQ ID NO:373-434和799-804中任一项所示的至少一个轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%-100%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列,其中各个CDR含有0-3个氨基酸改变;所述重链可变区含有各自与SEQ ID NO:435-496和805-810中任一项所示的至少一个重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%-100%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列,其中各个CDR含有0-3个氨基酸改变。在相关实施方式中,如果不包含天然先导肽序列,所述TNFRSF1B胞外域可包含SEQID NO:695所示的氨基酸序列。在其它实施方式中,本发明交叉受体融合蛋白具有与SEQ ID NO:607-668中任一项所列序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同、含有或不含先导肽序列的氨基酸序列,其中各个CDR含有0-3个氨基酸改变。
通常,这类构建物在本发明多特异性融合蛋白的氨基末端具有I型受体胞外域,或者在本发明多特异性融合蛋白的羧基末端具有II型受体胞外域。具有I型受体胞外域的构建物的例子是在氨基末端具有具有TNF受体超家族(TNFRSF)胞外域且在羧基末端具有IL6xR复合物结合域的构建物。出乎预料的是,在羧基末端具有TNFRSF胞外域的I型受体胞外域也同样有效(参见SEQ ID NO:669和670)。
在本发明多肽具有多个结合域,如结合域-1(BD1)和结合域-2(BD2),其中之一是(例如)抗-IL6xR的情况下,低kOFF值将最大程度提高全价结合的本发明多肽或融合蛋白的抑制活性和浓度,因此其剂量范围宽于具有单独的BD1或BD2的多肽或融合蛋白形式(参见Perelson(1980)Math.Biosci.49:87)。也可能对选择具有高kOFF值的结合域感兴趣。例如,引起所需的信号转导表型优选在复合物中驻留较短时间时,可能需要受体具有高kOFF值(参见Matsui等,(1994)Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)91:12862;Lyons等,(1996)Immunity 5:53)。本领域技术人员应理解,就本文所述的包含两个结合域的组合物,如SCORPIONTM分子而言,BD 1和BD2的kOFF可单独控制。在其它非限制性例子中,可能一个结合域需要具有非常低的kOFF,而另一个结合域需要具有较高的kOFF。这可以使多特异性结合多肽在结合对应于低kOFF BD的靶分子的细胞表面上停留较长时间,同时连续接合对应于高kOFF BD的靶分子。当SCORPIONTM蛋白浓度较低时,这可产生增强信号转导的作用(参见Kalergis等,(2001)Nature Immunol.2:229)。本领域技术人员应理解,可通过工程改造结合域或筛选具有所需动力学特性的结合域来改变Koff(参见Su等(2007)J.Immunol.Methods 322:94;Steukers等(2006)J.Immunol.Methods 310:126;Jermutus等(2001)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)98:75)。
为了高效产生本文所述的任何结合域多肽或融合蛋白,用先导肽促进所表达的多肽和融合蛋白的分泌。预计使用任何常规的先导肽(信号序列)就能指导新表达的多肽或融合蛋白进入分泌通路并导致在先导肽和所述多肽或融合蛋白的连接点上或其附近从成熟多肽或融合蛋白上切掉先导肽。根据本领域已知因素选择特定的前导肽,例如使用易于在先导肽的编码序列起始处或末端包含限制性核酸内切酶切割位点以便于分子工程操作的多核苷酸编码的序列,前提是这类引入序列确定的氨基酸不会不可接受地干扰由新表达的蛋白质的先导肽加工;或者如果在该多肽或融合蛋白成熟过程中不切掉该先导肽,则其不会不可接受地干扰多肽或融合蛋白分子的任何所需功能。本发明的示范性先导肽包括天然先导序列等,如H3N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG(X)n-CO2H(其中X是任何氨基酸、n是0-3)(SEQ ID NO:785)或H3N-MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG-CO2H(SEQ IDNO:786)。
在某些示范性实施方式中,这类蛋白是糖基化的,糖基化模式取决于各种因素,包括表达蛋白质的宿主细胞(如果在重组宿主细胞中制备)和培养条件。
本发明还提供本发明结合域或包含这类结合域的融合蛋白的衍生物。衍生物包括携带插入、缺失或取代氨基酸残基以外的修饰的特异性结合剂多肽。修饰优选是共价修饰,包括例如与聚合物、脂质以及其它有机和无机部分发生化学键合。可制备能延长特异性结合剂多肽的循环半衰期的本发明衍生物,或者可设计该衍生物以提高所述多肽对目的细胞、组织或器官的靶向容量。
在某些实施方式中,可利用本领域已知的延长大分子半衰期的方法延长本发明结合域多肽或其融合蛋白的体内半衰期。例如,本发明包括经共价修饰或衍生而包含一个或多个水溶性聚合物连接体如聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇的融合蛋白(参见例如,美国专利号4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192;4,179,337)。本领域已知的其它有用聚合物包括单甲氧基-聚乙二醇、右旋糖苷、纤维素和其它基于糖的聚合物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化的多元醇(如甘油)和聚乙烯醇、以及这些聚合物的混合物。特别优选的是聚乙二醇(PEG)衍生的蛋白质。水溶性聚合物可以在特定位置键合,例如在本发明蛋白质或多肽的氨基末端,或者随机连接于所述多肽的一个或多个侧链。美国专利6,133,426中记载了使用PEG来提高治疗能力。
这类方法也包括产生将结合域与使结合域融合蛋白的半衰期长于单独结合域的蛋白质融合形成的融合蛋白。这类融合蛋白可包含本身结合于半衰期长的蛋白质,如免疫球蛋白、免疫球蛋白Fc结构域、转铁蛋白、链球菌G蛋白或清蛋白的蛋白质。结合域与稳定的血浆蛋白的这种融合可参见,例如美国专利5,428,130;5,116,964。
本发明的具体实施方式是免疫球蛋白或Fc融合蛋白。这类融合蛋白可具有较长的半衰期,例如数小时、一天或更长时间,或者一周或更长时间,特别是在Fc结构域能够与FcRn,即新生儿Fc受体相互作用时。Fc结构域中与FcRn的结合位点也是细菌蛋白A和G结合的位点。这些蛋白质之间的紧密结合可用作纯化本发明抗体或融合蛋白的手段,例如,在蛋白质纯化过程中使用蛋白A或蛋白G亲和色谱。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员众所周知的。这些技术在某一水平上包括对多肽和非多肽组分进行粗分级。常常需要使用色谱和电泳技术进行进一步纯化,以便实现部分或完全纯化(或纯化至均一)。特别适合制备纯融合蛋白的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦。特别有效的肽纯化方法是快速蛋白质液相色谱和HPLC。
本发明的某些方面涉及纯化,在具体实施方式中,涉及本发明多肽的基本纯化。本文所用术语“纯化”指可与其它组分分离的组分,其中融合蛋白相对于天然可获得状态纯化至任何程度。因此,纯化的蛋白质也指与其天然产生环境相分离的蛋白质。
通常,“纯化”指经过分级去除了各种其它组分的多肽组合物,该组合物基本保持了表达的生物学活性。本文所用术语“基本纯化”指结合域蛋白组合物,其中该蛋白构成该组合物的主要成分,例如占组合物中蛋白质重量的约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约99%或更多。
本领域技术人员能够从本发明中获知定量测定纯化程度的各种方法。它们包括例如,测定活性组分的特异性结合活性,或通过SDS/PAGE分析评估组分中蛋白的含量。评估蛋白质组分的纯度的优选方法是计算该组分的结合活性,将其与初始提取物的结合活性作比较,从而计算纯化程度,在本文中通过“纯化倍数”评价。当然,用于代表结合活性水平的实际单位取决于选择用于跟踪纯化的具体测定技术和表达的蛋白是否具有可检测的结合活性。
适用于蛋白质纯化的各种技术是本领域技术人员众所周知的。这些技术包括例如,用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀,或者通过先热变性再离心进行沉淀;色谱步骤如离子交换、凝胶过滤、反相色谱、羟基磷灰石和亲和力色谱;等电聚焦;凝胶电泳;以及这些技术和其它技术的组合。正如本领域众所周知的那样,可改变进行各种纯化步骤的顺序,或者某些步骤可省略,并仍产生适合制备基本纯化的蛋白质的方法。
多核苷酸、表达载体和宿主细胞
本发明提供编码本发明融合蛋白的多核苷酸(分离或纯化或纯的多核苷酸)、包含这类多核苷酸的载体(包括克隆载体和表达载体)以及用本发明多核苷酸或载体转化或转染的细胞(如宿主细胞)。
在某些实施方式中,考虑了编码本发明结合域,或含有一个或多个这类结合域的融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)。所附实施例中提供了编码SMIP或交叉受体构建物的表达盒。
本发明也涉及包含本发明多核苷酸的载体,具体是重组表达构建物。在一个实施方式中,本发明考虑到包含编码本发明结合域或包含这类结合域的多肽(例如SMIP、PIMS、SCORPION、交叉受体或其它单官能、双官能或多官能融合蛋白)的多核苷酸以及引起或促进这类结合域编码序列的转录、翻译和加工的其它多核苷酸序列的载体。
适合用于原核和真核宿主的克隆和表达载体可参见例如,Sambrook等,《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第二版,冷泉港(Cold Spring Harbor),NY,(1989)。示范性的克隆/表达载体包括可能基于质粒、噬菌粒、噬粒、粘粒、病毒、人工染色体或本领域已知适用于扩增、转移和/或表达所含多核苷酸的任何核酸载体的克隆载体、穿梭载体和表达构建物。
本文所用术语“载体”指能够运输所连接的另一核酸的核酸分子。示范性载体包括质粒、酵母人工染色体和病毒基因组。某些载体能够在宿主细胞中自发复制,而另一些载体可整合到宿主细胞基因组中从而随宿主基因组一起复制。此外,某些载体在本文中称为″重组表达载体″(或简称为″表达载体″),其含有操作性连接于表达控制序列,因此能够指导这些序列表达的核酸序列。
在某些实施方式中,表达构建物衍生自质粒载体。说明性构建物包括修饰的pNASS载体(加利福尼亚州帕洛阿尔托的克隆泰克公司(Clontech,Palo Alto,CA)),其具有编码氨苄青霉素抗性基因、聚腺苷酸化信号和T7启动子位点的核酸序列;pDEF38和pNEF38(CMC ICOS生物技术公司(CMC ICOS Biologics,Inc.)),其具有CHEF1启动子;和pD18(隆萨公司(Lonza)),其具有CMV启动子。其它合适的哺乳动物表达载体是众所周知的(参见例如,Ausubel等,1995;Sambrook等,同上;也参见,例如,加州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen,SanDiego,CA)、威斯康星州麦迪逊的诺华基公司(Novagen,Madison,WI)、新泽西州皮斯卡塔韦的法玛西亚公司(Pharmacia,Piscataway,NJ))的产品目录。可制备包含在合适调控下的二氢叶酸还原酶(DHFR)-编码序列,用来促进融合蛋白产量水平提高的有用构建物,所述产量水平取决于施加合适选择剂(如甲氨蝶呤)后的基因扩增。
通常,重组表达载体包含允许转化宿主细胞的复制起点和选择性标记,和衍生自高表达基因的指导下游结构序列转录的启动子,如上所述。与本发明多核苷酸操作性连接的载体产生克隆或表达构建物。示范性的克隆/表达构建物含有至少一个操作性连接于本发明多核苷酸的表达控制元件,如启动子。也考虑在载体和本发明克隆/表达构建物中采用其它表达控制元件,如增强子、因子特异性结合位点、终止子和核糖体结合位点。本发明多核苷酸的异源结构序列以合适状态与翻译起始和终止序列组装在一起。因此,例如,本文提供的融合蛋白编码核酸可包含在任何表达载体构建物中,形成用于在宿主细胞中表达这类蛋白质的重组表达构建物。
可通过各种方法将合适的DNA序列插入载体中。通常,通过本领域已知方法将DNA序列插入合适的限制性核酸内切酶切割位点。考虑了用于克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术,用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应的标准技术以及各种分离技术。许多标准技术可参见例如,Ausubel等(1993《新编分子生物学实验指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology),马萨诸塞州波士顿的格林出版联合公司和约翰韦利森公司(Greene Publ.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons,Inc.,Boston,MA),);Sambrook等(1989《分子克隆》(Molecular Cloning),第二版,纽约州普莱恩维尤的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY),);Maniatis等(1982《分子克隆》,纽约州普莱恩维尤的冷泉港实验室出版社);Glover(编)(1985《DNA克隆》(DNA Cloning)第I卷和第II卷,英国牛津的IRL出版社(IRL Press,Oxford,UK));Hames和Higgins(编)(1985《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization),英国牛津的IRL出版社);等等。
表达载体中的DNA序列操作性连接于至少一个合适的表达控制序列(如组成型启动子或调节性启动子),以指导mRNA合成。这类表达控制序列的代表性例子包括真核细胞或其病毒的启动子,如上所述。可利用CAT(氯霉素转移酶)载体或具有选择性标记的其它载体从任何所需基因中选择启动子区域。真核启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I。本领域普通技术人员熟知如何选择合适的载体和启动子,本文记载了某些特别优选的包含操作性连接于本发明蛋白质或多肽的编码核酸的至少一个启动子或调节性启动子的重组表达构建物的制备。
也考虑了本发明多核苷酸的变体。变体多核苷酸与本文所述的确定序列的多核苷酸之一至少90%相同,优选95%、99%或99.9%相同,或者能够在严格杂交条件(0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠,约65-68℃;或者0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50%甲酰胺,约42℃)下与确定序列的多核苷酸之一杂交。多核苷酸变体应保持编码具有本文所述功能的结合域或其融合蛋白的能力。
术语“严格”用于指本领域通常理解的严格条件。杂交严格性通常取决于温度、离子强度和变性剂如甲酰胺的浓度。用于杂交和洗涤的严格条件的例子是0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠,约65-68℃;或者0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50%甲酰胺,约42℃(参见Sambrook等,《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第2版,纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.),1989)。
也可采用更严格的条件(如更高的温度、更低的离子强度、更多的甲酰胺或其它变性剂);然而,杂交速率会受影响。在涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下,其它示范性严格杂交条件包括在37℃(用于14个碱基的寡核苷酸)、48℃(用于17个碱基的寡核苷酸)、55℃(用于20个碱基的寡核苷酸)和60℃(用于23个碱基的寡核苷酸)下,用6x SSC、0.05%焦磷酸钠洗涤。
本发明另一方面提供用本发明的任何多核苷酸或载体/表达构建物转化、转染或含有本发明的任何多核苷酸或载体/表达构建物的宿主细胞。利用本领域已知的任何方法,包括转化、转染和转导,将本发明的多核苷酸或克隆/表达构建物引入合适细胞。宿主细胞包括接受离体细胞治疗,包括例如,离体基因治疗的对象的细胞。携带本发明多核苷酸、载体或蛋白质时,考虑作为本发明某一方面的真核宿主细胞除对象自身细胞(如人患者的自身细胞)外还包括VERO细胞、HeLa细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系(包括能够修饰所表达多价结合分子的糖基化模式的修饰的CHO细胞,参见美国专利申请公开号2003/0115614)、COS细胞(如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、HEK293细胞、HepG2细胞、N细胞、3T3细胞、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(如Sf9细胞)、酿酒酵母细胞以及本领域已知可用于表达和任选地分离本发明蛋白质或肽的任何其它真核细胞。还考虑了原核细胞,包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、链霉菌、或者本领域已知适用于表达和任选地分离本发明蛋白质或肽的任何原核细胞。具体说,在由原核细胞分离蛋白质或肽时,考虑可采用本领域已知的用于从包含体提取蛋白质的技术。本领域技术人员根据本文教导能够了解如何选择合适的宿主。考虑了能糖基化本发明融合蛋白的宿主细胞。
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)指含有重组表达载体的细胞。应理解,这类术语不仅指特定细胞,还指该细胞的后代。在连续传代过程中可能因突变或环境影响而发生某些改变,所以这类后代实际上可能不与亲代细胞完全相同,但仍应落入本文所用术语“宿主细胞”的范围内。
可以在经修饰适合激活启动子、选择转化子或扩增特定基因的常规营养培养基中培养重组宿主细胞。本领域普通技术人员不难了解选择用于表达的特定宿主细胞的培养条件,例如温度、pH等。也可利用各种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子包括如Gluzman(1981)Cell23:175所述的猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系,以及能够表达相容性载体的其它细胞系,例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制起点、合适启动子和任选的增强子,还包含任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5′-侧接的非转录序列,例如,本文中关于多价结合蛋白表达构建物的制备中所述。衍生自SV40剪接的DNA序列和聚腺苷酸化位点可用于提供所需的非转录遗传元件。可通过本领域技术人员熟悉的各种方法包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染或电穿孔将所述构建物引入宿主细胞(Davis等(1986)《分子生物学基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology))。
在一个实施方式中,用指导本发明蛋白质或多肽的重组病毒构建物转导宿主细胞。转导的宿主细胞能产生含有所表达的蛋白质或多肽的病毒颗粒,所表达的蛋白质或多肽来自病毒出芽期间掺入病毒颗粒的宿主细胞膜的某部分。
组合物及其使用方法
为了治疗患有与IL6反式信号转导有关的疾病状态的人或非人哺乳动物,通常将本发明结合域制成较大蛋白质的一部分(如上所述),然后按照一次或多次给药的方案给予所述对象,给药量应能有效改善所述疾病的症状。作为多肽,本发明的蛋白质可悬浮于或溶解于药学上可接受的稀释剂,其任选包含其它药学上可接受的赋形剂的稳定剂,这类稀释剂可用于静脉内注射或输注给药,如下文所详述。
药学有效剂量是预防、抑制疾病状况的发生或治疗疾病状态(在某种程度上缓解其症状,优选所有症状)的剂量。药学有效剂量取决于疾病类型、所用组合物、给药途径、所治疗对象的类型、考虑治疗的特定对象的身体特征、同时用药和医学领域技术人员应认识到的其它因素。例如,可根据本发明的结合域多肽或蛋白融合物的强度,给予0.1mg/kg至100mg/kg体重的活性成分(可作为一次剂量给予,每天、每周、每月给予一次,或以任何合适间隔给予)。
在某些实施方式中,IL6的顺式信号传导很少被抑制或不被抑制,即对顺式信号传导的任何抑制都是不显著的,这意味着该抑制作用不存在、无症状或无法检测到。对IL6反式信号传导的抑制程度可能不同,但通常反式信号传导的改变程度对这类信号转导介导或相关的疾病状况有积极作用。在某些实施方式中,用本发明结合域多肽或其融合蛋白抑制IL6反式信号传导可阻滞、终止或逆转疾病进程。
本发明组合物可用于治疗IL6信号转导介导的人或非人哺乳动物的疾病。多种疾病过程中牵扯到IL-6产量和IL-6信号转导水平提高,包括阿耳茨海默病、自身免疫病(如类风湿性关节炎、SLE)、炎症、心肌梗塞、佩吉特病、骨质疏松、实体瘤(如结肠癌、RCC前列腺癌和膀胱癌)、某些神经系统癌症、B-细胞恶性肿瘤(如卡斯尔曼病、一些淋巴瘤亚型、慢性淋巴细胞性白血病,具体说是恶性黑色素瘤)。在一些情况下,IL-6还涉及增殖通路,因为它能与其它因子,如肝素结合性上皮生长因子和肝细胞生长因子作用(参见例如,Grant等(2002)Oncogene 21:460;Badache和Hynes(2001)Cancer Res.61:383;Wang等(2002)Oncogene 21:2584)。因此,在许多病理情况下,阻断IL-6信号转导可能使患者获益。IL-6反式信号转导与多种恶性疾病、自身免疫病或炎性病症有关,包括结肠癌、炎性肠病和类风湿性关节炎。IL6顺式信号转导与恶性疾病和自身免疫病有关,除上述疾病外,还与乳腺癌有关。通常认为,反式信号转导可能与自身免疫病或炎性病症关联度较高,而顺式信号转导与恶性疾病关联度较高(参见例如,Rabe等(2008)Blood 111:1021);Sansone等(2007)J.Clin Invest.117:3988)。
因此,包含本发明结合域的药剂可用于治疗自身免疫病,包括类风湿性关节炎、舍格伦综合征、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、格拉夫斯病、桥本病和卡斯特尔曼代病、急性和慢性炎症、骨质疏松和与骨量损失有关的其它疾病,以及癌症,包括不依赖激素的前列腺癌、B细胞增殖性疾病如B细胞非霍奇金淋巴瘤,以及肾、乳腺、结肠、肺、脑或其它组织的癌症。
在另一方面,本发明提供融合蛋白的组合物。本发明的药物组合物通常包含一种或多种类型的结合域或融合蛋白,以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。这类载体在所用剂量和浓度下应对接受者无毒。用于治疗目的的药学上可接受的载体是药剂学领域众所周知的,参见例如《雷明顿药物科学》(麦克出版公司(Mack Publishing Co.),A.R.Gennaro编,1985)。例如,可采用生理pH的无菌盐水和磷酸缓冲盐水。药物组合物可包含防腐剂、稳定剂、染料等。例如,苯甲酸钠、山梨酸或对羟基苯甲酸酯可作为防腐剂添加,同上,1449。此外,也可采用抗氧化剂和助悬剂,同上。本发明化合物可以游离碱或盐形式使用,这两种形式都落入本发明范围。
药物组合物也可含有稀释剂如缓冲液,抗氧化剂如抗坏血酸,低分子量(小于约10个残基)多肽,蛋白质,氨基酸,糖(如葡萄糖、蔗糖或糊精),螯合剂(如EDTA),谷胱甘肽,以及其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或混有非特异性血清白蛋白的盐水是示范性的合适稀释剂。优选地,用合适赋形剂溶液(如蔗糖)作为稀释剂,将产物配制成冻干物。
也考虑将本发明多特异性融合蛋白组合物与第二种药剂联合给药。第二种药剂可以是本领域接受的作为特定疾病状态(如炎症、自身免疫病和癌症)标准治疗的药剂。考虑到的第二种药剂的例子包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、化疗、放疗或其它活性和辅助性药剂,或其任何组合。
“药学上可接受的盐”指药学上可接受且具有母体化合物的所需药理活性的本发明结合域多肽或融合蛋白的盐。这类盐包括:(1)与以下酸形成的酸加成盐:无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等;或有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成;或(2)母体化合物中存在的酸性质子被金属离子,如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子取代时形成的盐;或与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、N-甲基葡糖胺等的配位化合物。
在具体的示范性实施方式中,通过(例如)推注或输注方式,静脉内给予本发明多肽或融合蛋白。除静脉内给药外,给药途径还包括口服、外用、胃肠道外(如舌下或口颊)、舌下、直肠、阴道和鼻内途径。本文所用术语“胃肠道外”包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内、海绵体内、鞘内、耳道内、尿道内注射或输注技术。配制药物组合物,以使该组合物给予患者后其中所含的活性成分可被生物利用。给予患者的组合物可以是一个或多个剂量单位的形式,例如,片剂可以是单一剂量单位,气溶胶形式的一种或多种本发明化合物的容器中可包含多个剂量单位。
在口服给药中,可存在赋形剂和/或结合剂,如蔗糖、高岭土、甘油、淀粉右旋糖苷、环糊精、藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素。任选地,可存在甜味剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂或其任何组合。任选地,也可使用包衣壳。
在准备进行注射给药的组合物中,可任选包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、助悬剂、缓冲液、稳定剂、等张剂中的一种或多种或其任何组合。
就基于核酸的制剂或包含本发明表达产物的制剂而言,通过,例如,皮内、皮下、肌肉内或静脉内途径、或本领域已知适合在给定情况下使用的任何途径给予约0.01μg/kg至约100mg/kg体重的剂量。例如,优选剂量为约1μg/kg至20mg/kg,特别优选约5μg/kg至10mg/kg。本领域技术人员可以明显看出,给药的次数和频率取决于宿主的反应。
本发明药物组合物可以是能够给予患者的任何形式,例如固体、液体或气体(气溶胶)形式。组合物可以是液体形式,如酏剂、糖浆剂、溶液剂、乳液剂或混悬剂。所述液体可以用于(例如)口服给药或注射递送。
本文所用的液体药物组合物,无论是溶液形式、混悬液形式或其它类似形式,均可包含一种或多种下述组分:无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液(优选生理盐水)、林格溶液、等张氯化钠、不挥发性油如合成的甘油单酯或甘油二酯(可用作溶剂或混悬介质)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂;抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂如乙二胺四乙酸;缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐;和调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。胃肠道外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量药瓶中。生理盐水是优选的添加剂。可注射药物组合物优选无菌。
制剂中也可能需要包含其它组分,例如递送载体,包括铝盐、油包水乳剂、可生物降解的油载体、水包油乳剂、可生物降解的微胶囊和脂质体。这类载体中所用的佐剂的例子包括N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸-D-异谷胺酰胺(MDP)、脂多糖(LPS)、葡聚糖、IL12、GM-CSF、γ干扰素和IL15。
虽然本领域普通技术人员已知的任何合适载体均可用于本发明药物组合物,但可根据给药方式和是否需要缓释而改变载体类型。就胃肠道外给药而言,载体可包含水、盐水、醇、脂肪、蜡、缓冲剂或其任何组合。就口服给药而言,可采用任何上述载体或固体载体,如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁或其任何组合。
本发明考虑到包含本发明药物组合物的剂量单位。这种剂量单位包括例如,单剂量或多剂量药瓶或注射器,包括两室药瓶或注射器,一室包含冻干形式的本发明药物组合物,另一室包含用于重建的稀释剂。多剂量的剂量单位也可以是,例如,用于连接于静脉内输注装置的(输液)袋或管。
本发明也考虑到在单位剂量或多剂量容器如药瓶中包含本发明药物组合物,以及有关将该组合物给予本文所述疾病(如上述疾病)患者的一组说明的药盒。
本说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请、非专利发表物、表格、序列、网页等均通过引用整体纳入本文。以下实施例是为了说明而非限制本发明。
实施例
SMIP和交叉受体序列
具有抗-IL6xR结合域的示范性SMIP和交叉受体(SEQ ID NO:231-292)分子的氨基酸序列分别参见SEQ ID NO:671-694和607-668,该融合蛋白对应的核苷酸表达盒分别参见SEQ ID NO:761-784和697-758(注:成熟蛋白缺少信号肽序列,如SEQ ID NO:671-694和607-668所示)。
在氨基端具有TNFRSF1B胞外域、在羧基端具有抗-IL6xR结合域的交叉受体在本文中称为TRU(XT6)-1001至TRU(XT6)-1062。取向相反的交叉受体-即在氨基端具有抗-IL6xR结合域、在羧基端具有TNFRSF1B胞外域-在本文中称为TRU(X6T)-1008和TRU(X6T)-1019。在本文中,具有抗-IL6xR结合域的SMIP构建物称为TRU(S6)-1002、TRU(S6)-1004、TRU(S6)-1007、TRU(S6)-1008、TRU(S6)-1011、TRU(S6)-1013、TRU(S6)-1014、TRU(S6)-1018、TRU(S6)-1019、TRU(S6)-1022、TRU(S6)-1024至TRU(S6)-1026、TRU(S6)-1029、TRU(S6)-1038、TRU(S6)-1040、TRU(S6)-1047、TRU(S6)-1051、TRU(S6)-1052、TRU(S6)-1054、TRU(S6)-1056和TRU(S6)-1059至TRU(S6)-1061。
基本按Hoet等(2005)Nature Biotechnol.23:344所述,从Fab结合域噬菌体文库中筛选对IL6xR复合物特异性的结合域。通过PCR扩增克隆该结合域-简要说,用PCR SuperMix(加州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen,San Diego,CA))和通过重叠产生G4S接头的合适引物,最初以56℃的退火温度进行9个循环,然后以62℃的退火温度进行20个循环,以便从Fab文库克隆中扩增VL区和VH区。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物,并用凯杰(Qiagen)(加州查特沃斯(Chatsworth,CA))PCR纯化柱纯化。第二轮缝合反应包括将等摩尔的VL和VH产物与扩增缓冲液和水混合,在95℃变性5秒,然后缓慢冷却至室温。为进行扩增,加入dNTP混合物和扩增酶,并在72℃温育10秒。加入外部引物(5′VH和3′VL)后,该混合物以62℃的退火温度和45分钟的延伸反应循环处理35次。对所得的750碱基对的产物进行凝胶纯化,并用EcoRI和NotI消化,然后克隆到质粒pD28中(详见美国专利申请公开号2005/0136049和PCT申请公开号WO 2007/146968)。通过ELISA检测结合活性,如Hoet等(2005)所述。
如下所述检测各种SMIP和本文所述的交叉受体融合蛋白的抗IL6xR活性、抗TNF活性或两种活性。以下实施例中所用的缩写包括以下术语:PBS-T:PBS,pH 7.2-7.4和0.1%吐温20;工作缓冲液:含有1% BSA的PBS-T;封闭缓冲液:含有3% BSA的PBS-T
实施例1
融合蛋白的表达
利用FreeStyleTM 293表达系统(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA)),根据生产商说明书,在293细胞中表达某些本文所述的融合蛋白。
每30ml转染体系中,使用28ml FreeStyleTM 293表达培养基中包含的3×107个细胞。在转染当天,将小份细胞悬液转移到微量离心管中,并用台盼蓝排除法测定细胞团的活力和细胞量。剧烈涡旋该悬液45秒,以分散细胞团,用库尔特计数器(Coulter Counter)和血球计数器测定细胞总数。细胞的活力超过90%。将含有所需细胞的摇瓶放入置于轨道振荡器上的37℃培养箱中。
对每个转染样品,如下所述制备脂质-DNA复合物。用I稀释30μg质粒DNA,至总体积为1ml,温和混合。用I稀释60μl 293fectinTM,至总体积为1ml,温和混合,并在室温下温育5分钟。温育5分钟后,将稀释的DNA加入稀释的293fectinTM中,总体积为2ml,温和混合。将所得溶液在室温下温育20-30分钟,以便形成DNA-293fectinTM复合物。
在温育DNA-293fectinTM复合物时,从培养箱中取出细胞悬液并将合适体积的细胞悬液放入无菌的一次性125ml锥形摇瓶内。就30ml转染体系而言,加入新鲜、预热的FreeStyleTM 293表达培养基至总体积为28ml。
DNA-293fectinTM复合物温育完成后,将2ml DNA-293fectinTM复合物加入摇瓶中。将2mlI,而非DNA-293fectinTM复合物加入阴性对照瓶内。每瓶所含的总体积为30ml,最终细胞密度约为1×106个活细胞/毫升。在放置于轨道摇床上的8% CO2潮湿气氛的37℃培养箱中温育该细胞,摇床旋转速度为125rpm。转染后约7天收获细胞,测定重组蛋白的表达。
如上所述,在293细胞中表达具有IL6拮抗剂结合域的融合蛋白。
实施例2
通过ELISA测定交叉受体与IL6和超级IL6的结合
基本如下所述,检测超级-IL6(HIL6或IL6xR)、重组人IL6(rhIL6)和人可溶性IL6R与交叉受体TRU(XT6)-1002、1019、1025、1042、1058和TRU(X6T)-1019(分别是SEQ ID NO:608、625、631、648、664和670)的结合活性。
HIL6和IL6结合
向96孔板的各孔中加入100μl山羊抗人IgG-Fc(宾夕法尼亚州维斯格鲁甫的杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)),抗体是PBS,pH 7.2-7.4配制的2μg/ml溶液。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后,将250μl封闭缓冲液(含3% BSA或10%正常山羊血清的PBS-T)加入各孔中,将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用PBS-T洗涤该平板三次后,向抗人IgG-Fc包被的平板中一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液从300ng/ml起三倍连续稀释的交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品和人gp130-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D Systems,Minneapolis,MN)),该平板加盖,室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的150pM的人超级IL-6或重组人IL-6溶液,该平板加盖,室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的150ng/ml的抗-人IL-6-生物素(R&D系统公司)溶液,该平板加盖,室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶4,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型链霉亲和素(加州旧金山的甾酶公司),该平板加盖,室温下温育约30分钟。用PBS-T洗涤该平板六次后,加入100微升/孔的3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce,Rockford IL))约3-5分钟,然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
sIL6R结合
向96孔板的各孔中加入100μl山羊抗人IgG-Fc(加州科斯拉梅萨的ICN制药公司),抗体是PBS,pH 7.2-7.4配制的2μg/ml溶液。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后,将250μl封闭缓冲液(含3%BSA或10%正常山羊血清的PBS-T)加入各孔中,将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用PBS-T洗涤该平板三次后,向抗人IgG-Fc包被的平板中一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液从300ng/ml起三倍连续稀释的交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品、阳性对照抗人IL-6R(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)和阴性对照人IgG或人gp130-Fc嵌合体(R&D系统公司),该平板加盖,室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的75pM的重组人sIL-6R(R&D系统公司)溶液,该平板加盖,室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的100ng/ml的抗-人IL-6R-生物素(R&D系统公司),该平板加盖,室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶4,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型链霉亲和素(加州旧金山的甾酶公司),该平板加盖,室温下温育约30分钟。用PBS-T洗涤该平板六次后,加入100微升/孔的3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)约3-5分钟,然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
图1A和1B的数据表明,所有交叉受体融合蛋白,无论TNFRSF1B胞外域位于融合蛋白分子的氨基端或羧基端,均可结合HIL6。而且,这些试验证明,交叉受体蛋白对IL6xR复合物有特异性,因为只有两种交叉受体结合rhIL6(图1B)且没有一种结合sIL6R(图1C)。在相关研究中,发现交叉受体TRU(XT6)-1002和SMIP TRU(S6)-1002能与来自非人灵长动物普通猕猴(Mucaca mulatta)的IL6发生交叉反应。
实施例3
通过ELISA测定交叉受体与TNF-α的结合
基本如下所述,检测TNF-α与交叉受体TRU(XT6)-1002、1042、1058、1019和TRU(X6T)-1019(分别是SEQIDNO:608、648、664、625和670)的结合活性。
向96孔板的各孔中加入100μl山羊抗人IgG-Fc(加州科斯拉梅萨的ICN制药公司),抗体是PBS,pH 7.2-7.4配制的2μg/ml溶液。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后,将250μl封闭缓冲液加入各孔中,将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用PBS-T洗涤该平板三次后,向抗人IgG-Fc包被的平板中一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液从300ng/ml起三倍连续稀释的交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品、阳性对照(依坦西普)和重组人TNFR2(TNFRSF1B)-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)、以及阴性对照人IgG或人gp130-Fc嵌合体(R&D系统公司),该平板加盖,室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的2ng/ml的重组人TNF-α(R&D系统公司),该平板加盖,室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的200ng/ml的抗-人TNF-α-生物素(R&D系统公司),该平板加盖,室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶1,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型链霉亲和素(宾夕法尼亚州维斯格鲁甫的杰克逊免疫研究公司),该平板加盖,室温下温育约30分钟。用PBS-T洗涤该平板六次后,加入100微升/孔的3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)约3-5分钟,然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
图2中的数据表明,测试的所有交叉受体融合蛋白均可结合TNF-α,无论TNFRSF1B胞外域位于融合蛋白的氨基端或羧基端。
实施例4
通过ELISA检测交叉受体双配体结合
基本如下所述地检测融合蛋白TRU(XT6)-1006(SEQ ID NO:612)同时与TNF-α和IL6xR复合物结合。
在96孔板的各孔中加入100μl人HIL-6溶液(5μg/ml的PBS溶液,pH7.2-7.4)。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后,将250μl封闭缓冲液加入各孔中,将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用PBS-T洗涤该平板三次后,向HIL-6包被平板中一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液从300ng/ml起三倍连续稀释的交叉受体TNFRSF1B::HIL6样品。阴性对照仅包括人gp130-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)、(依那西普)和工作缓冲液。该平板加盖并在室温温育1.5小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的2ng/ml的重组人TNF-α(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司),该平板加盖,室温下温育约1.5小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,一式两份地加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的200ng/ml的抗人TNF-α-生物素(R&D系统公司),该平板加盖,室温下温育约1.5小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶1,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型链霉亲和素(宾夕法尼亚州维斯格鲁甫的杰克逊免疫研究公司),该平板加盖,室温下温育30分钟。用PBS-T洗涤该平板六次后,加入100微升/孔的3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)3-5分钟,然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
图3的数据表明交叉受体蛋白可同时结合两种配体(在本例中是TNF-α和超级IL6)。
实施例5
通过ELISA检测交叉受体阻断超级IL6与GP130的结合
基本如下所述地检测交叉受体融合蛋白TRU(XT6)-1004、1006、1007、1008、1013和1019(分别是SEQ ID NO:610、612、613、614、619和625)阻断超级IL6(IL6xR)与可溶性gp130受体的结合。
向96孔板的各孔中加入100μl 0.25-0.5μg/ml人gp130-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)的PBS溶液(pH 7.2-7.4)。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后,将250μl封闭缓冲液(含3%BSA或10%正常山羊血清的PBS-T)加入各孔中,将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用工作缓冲液从50μg/ml起对以下样品品进行连续五倍稀释:交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品、阳性对照人gp130-Fc嵌合体(R&D系统公司)和抗-人IL6R(R&D系统公司)以及阴性对照抗-人IL-6(R&D系统公司)、人IgG或(依那西普)。将等体积的连续稀释的交叉受体样品与超级IL-6混合(超级IL-6终浓度为2.5ng/ml),室温温育1小时。用PBS-T洗涤该平板三次后,向人IgG-Fc包被的平板中一式两份地加入100微升/孔的连续稀释的交叉受体/HIL6混合物、人gp130-Fc嵌合体、抗-人IL6R、抗-人IL-6、人IgG和(依那西普),该平板加盖,室温下温育约1.5小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶10,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型抗-小鼠IgG-Fc(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司),该平板加盖,室温下温育1小时。用PBS-T洗涤该平板六次后,加入100微升/孔的3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(皮尔斯公司)约5-15分钟,然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
图4的数据表明,包含抗-IL6xR结合域的交叉受体蛋白可阻断可溶性gp130与HIL6的结合。
实施例6
交叉受体阻断IL6和超级IL6诱导的细胞增殖
基本如下所述地检测交叉受体融合蛋白TRU(XT6)-1011、1014、1025、1026、1002和TRU(X6T)-1019(分别是SEQ ID NO:617、620、631、632、608和670)阻断IL6或超级IL6(IL6xR)诱导的TF-1细胞增殖。
在用于增殖实验前一天,向96孔平底板的各孔中加入含0.3×106个TF-1细胞(人红白血病细胞)的新鲜生长培养基(10%FBS-RPMI 1640;2mML-谷胺酰胺;100单位/毫升青霉素;100微克/毫升链霉素;10mM HEPES;1mM丙酮酸钠;和2纳克/毫升Hu GM-CSF)。然后收获细胞,并用测定培养基(不含GM-CSF、无细胞因子,其余成分与生长培养基相同)洗涤细胞两次,然后以1×105个细胞/毫升的密度重悬于测定培养基。为了阻断IL-6活性,在96孔板中将连续稀释的感兴趣的TNFSFR1B::抗-HIL-6交叉受体或抗体与固定浓度的重组人IL-6(rhIL-6)(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)或超级IL-6(HIL-6)在37℃ 5%CO2条件下预孵育1小时。所用对照包括人IgG;人gp130-Fc嵌合体(R&D系统公司);抗-hIL-6抗体(R&D系统公司);和抗-hIL-6R抗体(R&D系统公司)。预孵育后,各孔中加入1×1041个细胞(100μl)。最终的测定混合物(总体积为200微升/孔,含有TNFSFR1B::HIL-6、rhIL-6或HIL-6以及细胞)在37℃、5%CO2的条件下温育72小时。在培养的最后4-6小时,加入3H-胸苷(测定培养基配制的20μCi/ml溶液,25微升/孔)。将细胞收集到UniFilter-96GF/c平板上,用TopCount读数器(帕克得公司(Packard))测定掺入的3H-胸苷。数据表示为三复孔的cpm平均值±SD。阻断百分数=100-(测试cpm-对照cpm/最大cpm-对照cpm)*100。
图5A和5B的数据表明,所有交叉受体蛋白,无论TNFRSF1B胞外域位于融合蛋白分子的氨基端或羧基端,均可阻断IL6和超级IL6诱导的细胞增殖。
实施例7
通过ELISA测定交叉受体阻断TNF-α与TNFR的结合
基本如下所述地检测交叉受体融合蛋白TRU(XT6)-1004、1006、1007、1008、1013和1019(分别是SEQ ID NO:610、612、613、614、619和625)阻断TNF-α与TNF受体的结合。
向96孔板的各孔中加入100μl 0.25-0.5μg/ml重组人TNFR2-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)的PBS溶液(pH 7.2-7.4)。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤四次后,将250μl封闭缓冲液(含3% BSA或10%正常山羊血清的PBS-T)加入各孔中,将该平板加盖并在室温下温育2小时(或在4℃温育过夜)。用工作缓冲液从50-250μM起对以下样品品进行连续五倍稀释:交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品、阳性对照(依那西普)和抗-TNF-α(R&D系统公司)以及阳性对照人gp130-Fc嵌合体(R&D系统公司)和人IgG。将等体积的连续稀释的交叉受体样品与TNFα混合(TNFα终浓度为2.5ng/ml),室温温育1小时。用PBS-T洗涤该平板三次后,向重组人TNFR2-Fc包被的平板中一式两份地加入100微升/孔的连续稀释的交叉受体/TNFα混合物、(依那西普)、抗-TNFα、人gp130-Fc嵌合体和人IgG,该平板加盖,室温下温育约1.5小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,加入100微升/孔的用工作缓冲液配制的200ng/ml的抗-人TNF-α-生物素(R&D系统公司),该平板加盖,室温下温育约1-2小时。用PBS-T洗涤该平板五次后,加入100微升/孔的用工作缓冲液1∶1,000稀释的辣根过氧化物酶偶联型链霉亲和素(宾夕法尼亚州维斯格鲁甫的杰克逊免疫研究公司),该平板加盖,室温下温育约30分钟。用PBS-T洗涤该平板六次后,加入100微升/孔的3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)约3-5分钟,然后每孔加入50μl终止缓冲液(1N H2SO4)以终止反应。在450nm读出各孔的吸光度。
图6的数据表明,交叉受体蛋白能阻断TNF-α与TNF受体的结合,这种阻断作用与TNFR-Fc的阻断作用大致相等。
实施例8
交叉受体阻断TNF-α诱导的细胞杀伤作用
基本如下所述地检测交叉受体融合蛋白TRU(XT6)-1011、1014、1025、1026、1002和TRU(X6T)1019(分别是SEQ ID NO:617、620、631、632、608和670)阻断TNF-α诱导的L929细胞杀伤作用。
用培养基(10% FBS-RPMI 1640;2mM L-谷胺酰胺;100单位/毫升青霉素;100微克/毫升链霉素;和10mM HEPES)制备密度为2×105个细胞/毫升L929小鼠成纤维细胞细胞(弗吉尼亚州玛纳萨斯的ATCC(ATCC,Manassas,VA))的悬液,然后将100μl悬液加入平底黑色96孔板的各孔中,在37℃、5% CO2的湿化培养箱中温育过夜。用测定培养基(与培养培养基的成分相同但补充有2% FBS)连续稀释的交叉受体TNFRSF1B::抗-HIL6样品与等体积的重组人TNF-α(rhTNFα;明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)混合,在37℃、5% CO2的湿化培养箱中温育1小时。阳性对照(即,阻断TNFα诱导的L929细胞杀伤作用的药剂)包括(依那西普)、rhTNFR2-Fc嵌合体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)和抗-TNFα抗体(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)。阴性对照包括单独的测定培养基(不加TNF-α)和抗体hIgG(加入TNFα)。为了分析TNFα活性,去除L929细胞的培养基,然后每孔加入50μl TNFα/交叉受体或对照混合物和50μl放线菌素D(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))(4μg/ml新鲜制备的工作溶液)。然后,在37℃、5% CO2的湿化培养箱中温育细胞24小时。为了测定细胞活力,根据生产商说明书每孔加入100μl ATPlite 1步试剂(马萨诸塞州沃尔瑟姆的帕金埃尔默公司(PerkinElmer,Waltham,MA)),振荡2分钟,然后用TopCount读数器(帕克得公司)测定发光。
图7的数据表明,在本试验中所有交叉受体蛋白,无论TNFRSF1B胞外域位于融合蛋白分子的氨基端或羧基端,均可阻断TNF-α诱导的细胞杀伤作用。
实施例9
通过ELISA测定SMIP与IL6和超级IL6的结合
采用基本与实施例1相同的试验(除了用SMIP蛋白代替交叉受体蛋白进行测试),检测SMIP融合蛋白TRU(S6)-1004、1007、1008、1013、1018、1019、1029,和1038(分别是SEQ ID NO:672、673、674、676、678、679、684和685)与超级-IL6(HIL6或IL6xR)、重组人IL6(rhIL6)和人可溶性IL6R的结合活性。
图8的数据表明所有SMIP蛋白均可结合HIL6。
实施例10
结合超级IL6而不是其它GP130细胞因子的特异性
基本如下所述地检测交叉受体融合蛋白对IL6以及gp130细胞因子IL-11、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)和心肌营养蛋白-1(CT-1)诱导TF-1细胞增殖的影响。
在用于增殖实验前一天,向96孔平底板的各孔中加入含0.3×106个TF-1细胞(人红白血病细胞)的新鲜生长培养基(10% FBS-RPMI 1640;2mM L-谷胺酰胺;100单位/毫升青霉素;100微克/毫升链霉素;10mM HEPES;1mM丙酮酸钠;和2纳克/毫升Hu GM-CSF)。收获细胞,并用测定培养基(不含GM-CSF、无细胞因子,其余成分与生长培养基相同)洗涤细胞两次,然后以1×105个细胞/毫升的密度重悬于测定培养基。为了检测对LIF、OSM和CT-1活性的阻断,在96孔板中将连续稀释的TNFSFR1B::抗-HIL-6交叉受体TRU(XT6)-1002(SEQ ID NO:608)、TRU(XT6)-1019(SEQ ID NO:625)、TRU(XT6)-1022(SEQ ID NO:628)和TRU(XT6)-1025(SEQ ID NO:631)与固定浓度的各个gp130细胞因子或者超级IL-6(HIL-6)在37℃、5% CO2条件下单独预孵育1小时。预孵育后,各孔中加入1×104个细胞(100μl)。最终的测定混合物(总体积为200微升/孔,含有TNFSFR1B::HIL-6、gp130细胞因子或HIL-6以及细胞)在37℃、5%CO2的条件下温育72小时。在培养的最后4-6小时,加入3H-胸苷(测定培养基配制的20μCi/ml溶液,25微升/孔)。将细胞收集到UniFilter-96 GF/c平板上,用TopCount读数器(帕克得公司)测定掺入的3H-胸苷。阻断百分数=100-(测试cpm-对照cpm/最大cpm-对照cpm)*100。
结果表明,交叉受体能阻断IL6活性,但不能阻断IL-11、LIF、OSM或CT-1的活性(数据未显示),因此结合于超级IL6,但不结合所测试的其它gp130细胞因子。
实施例11
通过ELISA测定SMIP与超级IL6的结合
基本如下所述,检测称为TRU(S6)-1063-TRU(S6)-1066的人源化SMIP融合蛋白(轻链可变区参见SEQ ID NO:801-804,重链可变区参见SEQ IDNO:807-810)与超级-IL6(HIL6)的结合活性。
向96孔板的各孔中加入100μl 1μg/ml人超级-IL6(IL6R-IL6-mIgG)的PBS溶液(pH 7.2-7.4)。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤五次后,将250μl封闭缓冲液(含3% BSA的PBS-T)加入各孔中,将该平板加盖并在室温下温育2小时。
用100ul工作缓冲液(1% BSA的PBS-T溶液)从300ng/ml起对SMIP融合蛋白进行连续三倍稀释,TNFR-Fc用作阴性对照。该平板加盖并在室温温育1小时。用PBS-T洗涤五次后,各孔中加入100ul以1∶1000稀释的偶联HRP的山羊抗人Fc抗体(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)。该平板加盖并在室温温育1小时。用PBS-T洗涤五次后,各孔中加入100微升Quant-BluTM底物(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)。在室温下温育该平板10-30分钟,在325/420nm测定荧光。
图9的数据表明所有检测的SMIP融合蛋白均可结合HIL6。
实施例12
各种IL6拮抗剂融合蛋白的结合亲和力
用T100仪器(新泽西州皮斯卡塔韦的GE健康护理公司(GEHealthcare,Piscataway,NJ))测定超级-IL6(HIL6;单体或二聚体)及其组件IL6和sIL6R与scFv、SMIP、交叉受体和反向交叉受体形式的不同抗-HIL6结合域的相互作用的结合亲和力和动力学速率常数。
用单克隆小鼠抗-人Fc捕获抗-HIL6 SMIPS、交叉受体和反向交叉受体,该抗体用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺通过胺共价偶联于羧基甲基右旋糖苷(CM4)表面。活化表面的未占据位点被乙醇胺阻断。捕获抗体(称为抗hFc)能结合所有亚类的IgG Fc的CH2结构域,并且在测定过程中没有检测到与捕获的HIL6结合剂有解离。在每个循环中,在流动室2、3和4上捕获三种不同的HIL6结合剂,而流动室1用作参比室。在每个循环中,将单一浓度的单一HIL6相关分子以35微升/分钟的速率注射150秒,然后使其解离300秒。在循环结束时,用3M MgCl2温和地再生该表面,这种试剂能使结合于抗hFc捕获抗体的蛋白质解离。进行多个循环,以研究0-100nM不同浓度下的HIL6单体或二聚体对三种捕获的HIL6结合剂各组的结合。每个循环,可重复地捕获HIL6结合剂,CV不超过2%。在25℃进行该实验。利用与参比室结合相关的信号消减折射变化,利用空白(仅缓冲液)注射校正漂移和系统噪声。用BIA评估软件测定动力学参数和亲和力。利用固定在表面上的兔多克隆抗-小鼠IgG Fc抗体捕获的二聚化的人HIL6/小鼠IgG Fc融合蛋白,并将不同浓度的scFv注射到该表面上,以便反向分析抗-HIL6 scFv分子。就HIL6组件IL6(电子生物科学公司(eBioscience),目录号14-8069)和sIL6R而言,进行一次100nM注射,以便对结合进行定性评估。出于比较目的,还捕获人gp130-人IgG Fc(R&D系统公司)融合蛋白,并作为HIL6结合剂进行检测。表3显示用SMIP和scFv形式的抗-HIL6结合剂获得的结果。
表3.
数字表示KD(nM)
ND未检测,+观察到结合,-未观察到结合
表4显示用氨基端是TNFRSF1B胞外域且羧基端是抗HIL6xR结合域(TRU(XT6))或者反向(TRU(X6T))的交叉受体形式的HIL6结合剂获得的结果。
表4.
数字表示KD(nM)
ND未检测,+观察到结合,-未观察到结合
这些数据显示各种形式的抗-超级IL6结合域结合超级IL6单体和二聚体的亲和力范围(约2nM至约3000nM),以及最高亲和力结合剂接近gp130对超级IL6的亲和力。大多数结合域对超级IL6有选择性,并且不能显著结合IL6或sIL6R。然而,结合域TRU(X6T)-1019和TRU(XT6)-1022能够紧密结合IL6(亲和力约为0.44nM至12nM),而结合域TRU(XT6)-1025能结合受体(只有定性数据)。
实施例13
IL6拮抗剂结合IL6:sIL6R复合物
在HEPES-缓冲盐水中混合人IL6(电子生物科学公司,目录号14-8069)和可溶性IL6R(R&D系统公司,目录号227-SR/CF),浓度各自为50nM。我们估计,在这些条件下形成约30nM IL6:sIL6R复合物。将该复合物注射到TRU(S6)-1002(SEQ ID NO:671)SMIP表面上。(如上述实施例12所述,捕获TRU(S6)-1002)。也单独注射50nM的IL6和sIL6R,以评估单独结合。经过参比和空白消减的传感图(sensorgram)如图10所示。
数据表明,TRU(S6)-1002强烈结合IL6:sIL6R复合物,在高浓度下与受体弱结合,但在这些条件下无法检测到与IL6的结合。
实施例14
各种形式的各种IL6拮抗剂结合域
如下所述用检测抗体、SMIP、交叉受体和人源化抗体形式的抗-IL6结合域与IL6和超级-IL6(HIL6)的结合。这些研究中所用的小鼠单克隆抗体获自杂交瘤AH64、AH65、BSF2-77、CLB-8、CLB-12、CLB-16、HH61-08和HH61-10,它们都是IL6拮抗剂结合域。
在抗-IL6抗体情况下用固定的抗-小鼠Fc多克隆抗体,或者在SMIP、交叉受体和人源化SMIP情况下用抗-人Fc单克隆抗体捕获抗-IL6结合域。利用单循环动力学方法研究IL6与抗-IL6结合域的结合。每次循环中,连续注射五次IL6,从最低IL6浓度(6.4pM)起逐步提高到最高浓度(4,000pM)。流速为45微升/分钟,每次注射IL6持续7分钟。在最高浓度的IL6注射结束时,使IL6解离30分钟。将数据拟合至一对一结合单循环动力学模型。在每个循环中,注射单一浓度的HIL6(从6.4至4,000pM)7分钟,然后使结合的HIL6解离30秒(0-800pM)或1小时(0和4,000pM),以研究HIL6结合。将这些数据拟合至一对一结合模型。用BIA评估软件进行所有分析。动力学速率常数和亲和力见表5。
表5
各种形式的抗-IL6结合域均结合IL6,其亲和力范围是约7pM至约3,734pM。一些结合域也能够结合超级IL6。其中,详细研究了来自单克隆抗体AH65和BSF2-77的结合域,这些不同形式的结合域与超级IL6的亲和力范围是约12pM至约977pM。通常,SMIP蛋白和双特异性交叉受体形式的结合亲和力在亲代单克隆抗体的亲和力的10倍以内。
实施例15
测定抗-IL6结合域的结合位点
IL-6通过三个保守表位(称为位点I、II和III)结合gp130受体。为了通过gp130进行信号传导,必须形成六聚体信号传导复合物。IL-6首先通过结合位点I与IL6Ra形成复合物。位点II是IL6与IL6Ra的二元复合物形成的复合表位,它能与gp130相互作用。最后,通过位点III与gp130的相互作用形成六聚体信号传导复合物(Boulanger等(2003)Science300:2101)。已证明,抗-IL6抗体AH65和CL-16能够用作位点III结合剂,而抗-IL6抗体CL-12能与位点II发生相互作用(Kalai等(1997)Eur.J.Biochem.249:690)。如下所述,确定本文所述的TRU-1002结合域的结合位点。
向96孔板的每孔中加入100ul 1ug/ml抗-人TNF-RII(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司)的PBS溶液,pH 7.2-7.4。将该平板加盖并在4℃温育过夜。用PBS-T洗涤五次后,将250μl封闭缓冲液(含3% BSA的PBS-T)加入各孔中,将该平板加盖并在室温下温育2小时。
用PBS-T洗涤五次后,将100ul用工作缓冲液(WB;含有1% BSA的PBS-T)配制的浓度为0.5μg/ml的TRU(XT6)-1002加入一块平板的各孔中。在第二块平板的各孔中加入100ul 0.5mg/ml TRU(XT6)-1019。室温下温育该平板2小时。
同时,用250ul超级封闭液(Super Block)(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)封闭两块新平板,并在室温下温育1小时。用PBS-T洗涤五次后,将用工作缓冲液从20μg/ml开始连续两倍稀释的以下分子加入这两块平板中(100微升/孔):MQ2-13A5(LM-E13)、AH65(LM-A02)、CL-16(LM-S06)、CL-12(LM-S02)、CL-14(LM-S04)和S6-A2(TRU(S6)-1002)。将单独的工作缓冲液用作阴性对照。然后,将等体积(100ul)的工作缓冲液配制的20ng/ml人超级-IL6加入各孔中,通过上下吹打三次混合这200μL的体积。室温下温育该平板1小时。
温育后,将一块平板各孔中200ul的混合物转移到洗涤了五次的TRU(XT6)-1002平板中。对第二块平板进行相同操作,并转移到TRU(XT6)-1019平板上。室温下温育这些平板1小时。用PBS-T洗涤五次后,向各孔中加入100ul生物素化的抗-IL6R(150ng/ml)(明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司),将该平板在室温下温育1小时。洗涤后,向各孔中加入100ul用工作缓冲液1∶20,000稀释的链霉亲和素-HRP(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)。室温下培育该平板30分钟。用PBS-T洗涤五次后,各孔中加入100微升Quant-Blu底物(伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司)。在室温下温育该平板10-30分钟,在325/420nm测定荧光。
结果见图11A和11B,表明TRU(XT6)-1002能结合位点III,而TRU(XT6)-1019能结合位点II。
实施例16
SMIP和交叉受体与肝细胞上的IL6R结合
如下所述,测试TRU(S6)-1002、TRU(XT6)-1019和抗-IL6抗体hu-PM1与肝衍生的HepG2细胞上的IL6R结合的能力。
用FACS缓冲液洗涤HepG2细胞,并用FACS缓冲液(PBS+3% FBS)调节至2×106个细胞/毫升。向96孔板孔中加入50μL该溶液(105个细胞/孔)。该平板在37℃保温,直到加入稀释的测试分子。用FACS缓冲液制备连续稀释的测试分子,以得到2X工作母液,加入细胞时将其稀释至1X。将稀释的测试分子加入细胞(50微升/孔),将细胞置于冰上孵育20分钟。全IgG用作对照。然后,用FACS缓冲液洗涤细胞两次,并重悬于偶联藻红蛋白的山羊抗人抗体(杰克逊实验室研究公司(Jackson Labs);用FACS缓冲液1∶200稀释)。在冰上避光孵育20分钟后,用FACS缓冲液洗涤细胞两次,重悬于200ul PBS,并在LSRIITM流式细胞仪(加州圣何塞的BD生物科学公司(BD Biosciences,San Jose,CA))上读数。
如图12所示,TRU(S6)-1002和TRU(XT6)-1019基本不结合HepG2(肝)细胞。
实施例17
SMIP和交叉受体在小鼠中阻断IL-6和TNF活性
如下所述,检测本文所述的SMIP和交叉受体融合蛋白在小鼠中阻断IL-6或TNF诱导的血清淀粉样A(SAA)蛋白生产的能力。SAA是人和小鼠中主要急性期蛋白之一。在慢性炎症中发现血浆SAA水平长时间升高,其导致淀粉样变,从而影响肝脏、肾脏和脾脏(Rienhoff等(1990)Mol.Biol.Med.7:287)。单独给予时,IL-6和TNF均能诱导SAA(Benigni等(1996)Blood 87:1851;Ramadori等(1988)Eur.J.Immunol.18:1259)。
(a)阻断超级IL-6活性
对雌性BALB/C小鼠眼窝后(retro-orbitally)注射0.2ml PBS,或者(200μg)、TRU(S6)-1002(200μg)或TRU(XT6)-1002(300μg或500μg)的PBS溶液。一小时后,对小鼠IP注射0.2ml PBS或2μg人超级-IL6的PBS溶液。IP注射后2小时和24小时,收集小鼠血清。用ELISA测定SAA的血清浓度,用基于Luminex的小鼠可溶性受体试验测定sgp130浓度。
如图13和14所示,TRU(S6)-1002和TRU(XT6)-1002阻断超级IL6诱导的sgp130和SAA的表达。
(b)阻断TNF活性
对雌性BALB/C小鼠眼窝后(retro-orbitally)注射0.2ml PBS,或者(200μg)、TRU(S6)-1002(200μg)或TRU(XT6)-1002(300μg)的PBS溶液。一小时后,对小鼠IP注射0.2ml PBS或0.5μg小鼠TNFα的PBS溶液。IP注射后2小时和24小时,收集小鼠血清。用ELISA测定SAA的血清浓度,用基于Luminex的小鼠可溶性受体试验测定sgp130浓度。
实施例18
交叉受体体内活性
如下所述,在疾病动物模型中检测本文所述的融合蛋白的疗效。
(a)多发性骨髓瘤
利用两种良好表征的多发性骨髓瘤小鼠模型,即5T2多发性骨髓瘤(5T2MM)模型和5T33多发性骨髓瘤(5T33MM)模型中的至少一种检测融合蛋白的活性。在5T33模型中,从注射肿瘤细胞时开始用融合蛋白治疗小鼠(预防模式)。在5T2MM模型中,从疾病开始时治疗小鼠(治疗模式)。在两种模型中评估治疗对肿瘤发生和血管新生的影响,还利用5T2MM模型进行骨研究。
5TMM骨髓瘤鼠模型最初由Radl等开发(J.Immunol.(1979)122:609;也参见Radl等,Am.J.Pathol.(1988)132:593;Radl,J.Immunol.Today(1990)11:234)。其临床特征与人类疾病非常类似:该肿瘤细胞位于骨髓,血清副蛋白浓度是疾病发生的衡量,在5T2MM和5T33MM模型中新血管形成增加(Van Valckenborgh等,BrJ Cancer(2002)86:796),在某些品系中明确出现溶骨性骨病。5T2MM模型包括中等肿瘤生长和溶骨性骨损伤的形成。这些损伤与癌性骨体积减少、骨矿物质密度降低和破骨细胞数量增加相关(Croucher等,Blood(2001)98:3534)。5T33MM模型具有更为快速的肿瘤捕获量(tumor take),除骨髓外,肿瘤细胞也在肝中生长(Vanderkerken等,Br.J.Cancer(1997)76:451)。
已经详细鉴定了5T2和5T33MM模型。产生针对5T2和5T33MM的独特型的特异性单克隆抗体,以便通过ELISA以最大灵敏度检测血清副蛋白,通过对组织切片进行FACS分析和免疫染色对肿瘤细胞进行特异性染色(Vanderkerken等,1997)。VH基因的序列分析使得能够通过RT-PCR和Northern印迹分析检测细胞(Zhu等,Immunol.(1998)93:162)。可用于体外和体内实验的5TMM模型产生典型的MM疾病,可使用不同方法评估骨髓中的肿瘤负荷量、血清副蛋白浓度、骨髓血管新生(通过测定微血管密度)和溶骨性骨损伤(利用X光照相、密度测定和组织形态测定的组合)。研究后面这些参数以便在临床前研究中使用5TMM模型,并在完整的同源微环境中研究骨髓瘤细胞的生长和生物学。可研究靶向MM细胞本身的分子和靶向骨髓微环境的分子。具体说,虽然可使用5T33MM模型研究微环境和MM细胞本身,但也可用5T2MM模型研究骨髓瘤相关性骨病。
为了研究本文所述融合蛋白的预防效果,在第0天对C57BL/KaLwRij小鼠注射2×106个5T33MM细胞和融合蛋白。在第28天处死小鼠,通过测定血清副蛋浓度和肿瘤细胞占分离骨髓细胞的百分数评估肿瘤发育情况(通过利用抗独特型抗体的流式细胞术或细胞涂片测定)。将脾脏和肝脏称重,用4%甲醛固定这些器官以便进一步分析。固定骨样品以便进一步加工,包括在石蜡切片上进行CD31免疫染色和对微血管密度进行定量测定。
为了研究本文所述融合蛋白的治疗功效,在第0天对小鼠注射5T2MM细胞,发病后给予融合蛋白,通过是否存在可检测水平的血清副蛋白进行测定。给予融合蛋白大约五周后处死小鼠,如上文预防研究中所述评估肿瘤发育情况。此外,用X射线进行骨分析,以确定骨损伤的数量和小梁骨面积,进行TRAP染色以评估破骨细胞数量。
(b)类风湿性关节炎
利用两种类风湿性关节炎(RA)鼠模型,即胶原诱导性关节炎(CIA)和葡萄糖-6-磷酸异构酶(G6PI)模型中的至少一种模型评估本文所述的融合蛋白的治疗功效。其他人已证明,这些模型均可用于预测某类治疗性药物在RA中的功效(参见Holmdahl(2000)Arthritis Res.2:169;Holmdahl(2006)Immunol.Lett.103:86;Holmdahl(2007)Methods Mol.Med.136:185;McDevitt,H.(2000)Arthritis Res.2:85;Kamradt和Schubert(2005)ArthritisRes.Ther.7:20)。
(i)CIA模型
就其发病和免疫基础而言,CIA模型是表征最好的小鼠关节炎模型。此外,它是最广泛采用的RA模型,虽然在预测药物抑制患者疾病的能力方面并不完美,但仍有许多人认为它是研究RA的潜在新治疗途径的很好的模型(Jirholt等(2001)Arthritis Res.3:87;Van den Berg(2002)Curr.Rheumatol.Rep.4:232;Rosloniec(2003)胶原诱导性关节炎(Collagen-Induced Arthritis).刊于《新编免疫学研究方法》(Current Protocolsin Immunology),Coligan等编,新泽西州霍波肯的约翰韦利父子公司(JohnWiley & Sons,Inc,Hoboken,NJ))。
在CIA模型中,用完全弗氏佐剂(CFA)配制的胶原II(CII)免疫雄性DBA/1小鼠,以诱导关节炎。具体说,在第-21天对小鼠皮内/皮下注射CFA配制的CII,在第0天用不完全弗氏佐剂(IFA)配制的CII加强免疫。在用CII/IFA加强免疫后若干天内,小鼠出现关节炎的临床迹象。一小组用CII/IFA免疫的小鼠(0%-10%)未经加强免疫时,在第0天或第0天左右就出现关节炎迹象,从本实验中排除这些动物。在一些CIA实验中,省去加强免疫,而是在CII/CFA免疫后21天(即第一次处理之日是第0天)开始用交叉受体或对照处理小鼠。
利用融合蛋白、载体(PBS)或者阴性或阳性对照,以预防和/或治疗方案处理小鼠。预防性处理从第0天开始,一直持续到对照(未处理)小鼠的疾病峰值后。治疗性处理从大部分小鼠出现轻微关节炎迹象时开始。已证明对CIA和G6PI诱导的关节炎模型有良好功效的用作阳性对照。在每个实验中采集的数据包括关节炎的临床评分和累积发病率。用0-4分来衡量CIA模型的临床关节炎迹象,如下表6所示。
表6
(ii)G6PI模型
在G6PI模型中,用佐剂配制的G6PI免疫DBA/1小鼠以诱导关节炎(Kamradt和Schubert(2005)Arthritis Res.Ther.7:20;Schubert等(2004)J.Immunol.172:4503;Bockermann等(2005)Arthritis Res.Ther.7:R1316;Iwanami等(2008)Arthritis Rheum.58:754;Matsumoto等(2008)Arthritis Res.Ther.10:R66)。G6PI是基本上所有体内细胞中存在的酶,但尚不清楚为什么免疫诱导特定关节的疾病。在G6PI模型中,许多药剂,如CTLA4-Ig、TNF拮抗剂(如和抗-IL6受体单克隆抗体都能抑制关节炎的发生。
用完全弗氏佐剂(CFA)配制的G6PI免疫雄性DBA/1小鼠,以诱导关节炎。具体说,在第0天对小鼠皮内/皮下注射CFA配制的G6PI,在免疫数天内小鼠发生临床关节炎迹象。如同上述CIA模型那样,利用融合蛋白、载体(PBS)或者阴性或阳性对照,以预防和/或治疗方案处理小鼠。预防性处理从第0天开始,一直持续到对照小鼠的疾病峰值后。治疗性处理从大部分小鼠出现轻微关节炎迹象时开始。已证明对CIA和G6PI诱导的关节炎模型有良好功效的用作阳性对照。在每个实验中采集的数据包括关节炎的临床评分和累积发病率。用类似于CIA模型所用的评分来评估G6PI模型的临床关节炎迹象。
(c)多囊性肾病
利用Gattone等,Nat.Med.(2003)9:1323;Torres等,Nat.Med.(2004)10:363;Wang等,J.Am.Soc.Nephrol.(2005)16:846;和Wilson(2008)Curr.Top.Dev.Biol.84:311所述的鼠模型测试本文所述的融合蛋白在治疗多囊性肾病中的功效。
尽管上文已经结合具体实施方式对本发明进行描述,但是很明显,本领域技术人员可以进行许多的替代、改良和变化。因此,上文所列的本发明实施方式应为说明性,而非限制性。可以在不背离所附权利要求书定义的本发明构思和范围的情况下对其作出各种改变。本文引用的所有公开文献均通过引用纳入本文,就好像全文列于本文那样。
SEQ ID NO:1-845参见所附序列表。所附序列所用的核苷酸序列中的编码(包括符号“n”)符合WIPO标准ST.25(1998),附件2,表1。
Claims (26)
1.一种分离多肽,其包含对IL6/IL6R(IL6xR)复合物特异性的结合域,该结合域,
(a)结合所述IL6xR复合物的亲和力高于结合单独的IL6或IL6Rα的亲和力,或者结合单独的所述IL6xR复合物和单独IL6Rα的亲和力高于结合单独IL6的亲和力;和
(b)增强可溶性gp130与所述IL6xR复合物的结合,或者与膜gp130竞争结合所述sIL6xR复合物,
其中相对于IL6顺式信号转导所述结合域优先抑制IL6反式信号转导,且所述多肽不是gp130。
2.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,所述结合域结合单独的所述IL6xR复合物和单独的IL6Rα的亲和力高于结合单独IL6的亲和力,并能增强可溶性gp130与sIL6xR的结合。
3.如权利要求1或2所述的多肽,其特征在于,所述结合域不抑制除IL6外的gp130家族细胞因子的信号转导。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽,其特征在于,所述结合域包含与如SEQ ID NO:373-496和799-810所示的一个或多个轻链可变区、一个或多个重链可变区、或二者至少80%相同的序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽,其特征在于,所述结合域是抗体或其抗原结合域、Fab或scFv。
6.如权利要求1-5中任一项所述的多肽,其特征在于,所述结合域包含轻链可变区,所述轻链可变区含有分别与SEQ ID NO:373-434和799-804所示的至少一个轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列。
7.如权利要求1-5中任一项所述的多肽,其特征在于,所述结合域包含重链可变区,所述重链可变区含有分别与SEQ ID NO:435-496和805-810所示的至少一个重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列。
8.如权利要求1-5中任一项所述的多肽,其特征在于,所述结合域包含轻链可变区和重链可变区,所述轻链可变区含有分别与SEQ ID NO:373-434和799-804所示的至少一个轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列,所述重链可变区含有分别与SEQ ID NO:435-496和805-810所示的至少一个重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3至少80%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的多肽,其特征在于,所述IL6xR复合物具有SEQ ID NO:606所示的氨基酸序列。
10.一种融合蛋白,其包含权利要求1-9中任一项所述的多肽,所述多肽融合于(a)免疫球蛋白Fc结构域或者免疫球蛋白Fc结构域的一个或多个CH结构域或(b)血清蛋白结合蛋白。
11.如权利要求10所述的融合蛋白,其特征在于,所述免疫球蛋白Fc结构域的一个或多个CH结构域包含CH2恒定区和CH3恒定区,优选IgG1CH2和CH3结构域。
12.一种融合蛋白,其包含权利要求1-9中任一项所述的多肽,其中从氨基端到羧基端,(a)所述对IL6xR特异性的多肽结合域融合于接头,(b)所述接头融合于免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽,和(c)所述CH2恒定区多肽融合于免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽。
13.一种融合蛋白,其包含权利要求1-9中任一项所述的多肽,其中从羧基端到氨基端,(a)所述对IL6xR特异性的多肽结合域融合于第一接头,(b)所述第一接头融合于免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽,(c)所述CH3恒定区多肽融合于免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽,和(d)所述CH2恒定区多肽融合于第二接头。
14.如权利要求12或13所述的融合蛋白,其特征在于,所述接头是免疫球蛋白绞链区多肽。
15.如权利要求12或13所述的融合蛋白,其特征在于,所述接头选自SEQ ID NO:497-604或823-828。
16.一种多特异性单链结合融合蛋白,其包含通过间插结构域共价连接于第二结合域的第一结合域,其中所述第一或所述第二结合域如权利要求1-8中任一项所述。
17.如权利要求16所述的多特异性单链结合融合蛋白,其特征在于,所述第一结合域对所述IL6xR复合物有特异性,所述第二结合域是非IL6拮抗性受体胞外域。
18.如权利要求16或17所述的多特异性单链结合融合蛋白,其特征在于,所述间插结构域在所述第一和第二结合域之间包含免疫球蛋白恒定区或恒定区的一部分。
19.如权利要求18所述的多特异性单链结合融合蛋白,其特征在于,所述免疫球蛋白恒定区位于第一和第二接头之间。
20.如权利要求16-19中任一项所述的多特异性单链结合融合蛋白,其特征在于,所述间插结构域是二聚化结构域。
21.一种多核苷酸,其编码权利要求1-20中任一项所述的多肽或融合蛋白。
22.一种表达载体,其包含操作性连接于表达控制序列的权利要求21所述的多核苷酸。
23.一种重组宿主细胞,其包含权利要求22所述的表达载体。
24.一种组合物,其包含权利要求1-20中任一项所述的多肽或融合蛋白和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
25.一种治疗患有IL6相关疾病的人或非人哺乳动物对象的方法,所述方法包括给予所述对象有效量的权利要求1-21中任一项所述的多肽、融合蛋白或组合物。
26.如权利要求25所述的方法,其特征在于,所述疾病是炎性疾病或癌症。
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