DE10321317A1

DE10321317A1 - Verfahren zum Nachweis des funktionellen IL-6/ sIL-6-Rezeptor-Komplexes und Test-Kit zur Durchführung dieses Verfahrens

Info

Publication number: DE10321317A1
Application number: DE2003121317
Authority: DE
Inventors: Jürgen Dr. Scheller; Stefan Prof. Dr. Rose-John
Original assignee: Christian Albrechts Universitaet Kiel
Current assignee: Christian Albrechts Universitaet Kiel
Priority date: 2003-05-13
Filing date: 2003-05-13
Publication date: 2004-12-23

Abstract

Verfahren zum Nachweis des IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplexes mit folgenden Schritten: Beschichten der Oberfläche des verwendeten Reaktionsgefäßes (1) mit sgp130-Fc (2) und Absättigen der unspezifischen Bindungsstellen mit Albumin, wobei der aus dem Überstand an sgp130-Fc gebundene IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplex (3) von einem gegen den sIL-6-Rezeptor gerichteten Antikörper (4) gebunden wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis des IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplexes und ein Test-Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.
Das Cytokin Interleukin-6 (IL-6) spielt eine zentrale Rolle im Wachstum und in der Differenzierung von hämatopoetischen Zellen, B-Zellen, T-Zellen, Keratinozyten, neuronalen Zellen, endothelialen Zellen, Osteoklasten und Osteoblasten. Darüber hinaus induziert IL-6 die akute hepatische Phase während inflammatorischer Prozesse durch Transkriptionsmodulation mehrerer Leber-spezifischer Gene. Grundsätzlich wird IL-6 spezifisch durch den IL-6-Rezeptor (IL-6R) gebunden, der von Hepatozyten, Monozyten, neutrophilen Granulozyten und einigen T- und B-Zellen, nicht aber von anderen Zelltypen exprimiert wird. Die Bindung des Liganden (IL-6) an seinen membrangebundenen Rezeptor (IL-6-R) führt zur Bindung von zwei membrangebundenen Glykoprotein 130-Molekülen (gp130) an den Rezeptor-Liganden-Komplex IL-6/IL-6-R. Anschließende Homodimerisation der beiden gp130-Moleküle führt zur Phosphorylierung von gp130 und der Trankriptionsfaktoren STAT1 und STAT3 durch Janus-Kinasen, die konstitutiv mit gp130 assoziiert sind. Außerdem werden die Transkriptionsfaktoren NF-IL-6 und AP-1 über den ras/MAP-Kinase-Signaltransduktionsweg aktiviert.
Neben dem membrangebundenen IL-6-Rezeptor sind auch zwei Isoformen eines löslichen IL-6-Rezeptor (sIL-6-R) bekannt, die entweder durch alternatives IL-6-R mRNA Splicen oder durch proteolytisches Abspalten des extrazellulären Anteils des membrangebundenen IL-6-R entstehen können. Auch die sIL-6-R-Isoformen bilden mit IL-6 einen Rezeptor-Liganden-Komplex, der sowohl an den membrangebundenen IL-6-R, als auch an gp130 binden und eine Zellantwort hervorrufen kann. Weil aber gp130 Moleküle ubiquitär, IL-6 Rezeptoren hingegen nur von relativ wenigen, bestimmten Zelltypen (s.o.) exprimiert werden, können Zellantworten auch in Zelltypen, die IL-6-R defitiär sind, hervorgerufen werden. Diese Art der Signaltransduktion wird als „transsignalling" bezeichnet.
Dadurch stellen sowohl der membrangebundene als auch der lösliche IL-6-Rezeptor prinzipielle Regelgrößen für die Regulation der IL-6 Antwort dar, sogar bei Zellen, die keine direkte Wirkung auf IL-6 zeigen. Deshalb ist bei verschiedenen Krankheiten, wie z.B. Morbus Kahler, Morbus Crohn, Morbus Castleman, mesangiale Glomerulonephritis, Osteoporose, Kachexie, rheumatoide Arthritis, Sepsis und AIDS, bei denen erhöhte Plasmakonzentrationen von IL-6 nachgewiesen werden konnten, auch eine Untersuchung des IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplexes notwendig, um die pathophysiologischen Prozesse aufklären zu können.
Weiterhin konnte ein Fusionsprotein entwickelt werden, das aus den funktionellen Domänen von IL-6 und sIL-6-R besteht und biologisch aktiv ist. Dieses als Hyper-IL-6 bezeichnete Fusionsprotein stellt damit einen Sonderfall eines IL-6/sIL-6-R-Komplexes dar, der sich insbesondere für in vitro Experimente zur pharmakologischen Beeinflussung der Bindungseigenschaften des IL-6/sIL-6-R-Komplexes mit sgp130-Fc eignet.

Es sind bereits Verfahren zur Detektion des IL-6/sIL-6-R-Komplexes bekannt. Der IL-6/sIL-6-R-Komplex kann beispielsweise in einem Festphasenenzymimmunoassay (ELISA) immunologisch nachgewiesen werden. Dabei dient ein an die feste Phase gekoppelter gegen IL-6 gerichteter Antikörper als Bindungsstelle für den IL-6/sIL-6-R-Komplex, der über einen gegen den sIL-6-R gerichteten Antikörper und einen sich anschließenden Peroxidase gekoppelten Antikörper in einer Farbreaktion nachgewiesen werden kann.

Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, dass sowohl Antikörper gegen IL-6 als auch gegen IL-6-R verfügbar sein müssen. Weiterhin besteht der Nachteil, dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass mit diesem Verfahren auch modifizierte IL-6/sIL-6-R-Komplexe nachgewiesen werden, die aufgrund einer Modifikation nicht mehr an gp130 binden können und damit in vivo nicht mehr funktionell sind.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, dass den funktionellen IL-6/sIL-6-R-Komplex in einem Imunoassay nachweist.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Beschichten der Oberfläche des verwendeten Reaktionsgefäßes (1) mit sgp130-Fc (2), Absättigen der unspezifischen Bindungsstellen mit Albumin, wobei der aus dem Überstand an sgp130-Fc gebundene IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplex (3) von einem gegen den sIL-6-Rezeptor gerichteten Antikörper (4) gebunden wird.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es erstmals möglich, den in Bezug auf eine Bindung an sgp130-Fc biologisch aktiven IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplex in einem zellfreien System nachzuweisen. Darüber hinaus kann das Verfahren zum High-Throughput-Screening nach potenziellen Antagonisten der (IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplex)/sgp130-Fc-Bindung verwendet werden. Insbesondere bietet sich hierfür das bereits oben genannte als Hyper-IL-6 beschriebene Fusionsprotein an, das neben der allgemeinen Funktion einer Positivkontrolle im Immunoassay, speziell in pharmakologischen Experimenten zum Bindungsverhalten von IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplex an sgp130-Fc eingesetzt werden kann.

Im Folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand einer Zeichnung näher erläutert. Dabei zeigt die einzige Zeichnung den Aufbau des Immunoassays als ELISA.
Ein Reaktionsgefäß (1), das vorzugsweise als Mikrotiterplatte ausgeprägt ist, wird mit sgp130-Fc (2) beschichtet. Die freie Oberfläche wird zur Vermeidung unspezifischer Bindungen an die Reaktionsgefäßoberfläche mit Albumin abgesättigt. Der IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplex oder das Fusionsprotein Hyper-IL-6 (3), das aus den funktionellen Domänen von IL-6 und sIL-6-R besteht, bindet spezifisch an sgp130-Fc (2). Der erste gegen den sIL-6-R gerichtete Antikörper (4) bindet an den IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplex bzw. Hyper-IL-6 (3). Dieser Antikörper (4) wird von einem zweiten Antikörper (5), der mit einer Peroxidase konjugiert ist, gebunden. Der Peroxidaseanteil des zweiten Antikörpers (5) katalysiert eine Farbreaktion, in der eine chemische Substanz von ihrer reduzierten (6) in ihre oxidierte Form (7) überfuhrt wird. Dabei ändern sich die Lichtabsorptionseigenschaften der Substanz, die photometrisch erfasst werden können.
Beispiel:
Das Verfahren wird in diesem Beispiel in 96 well Mikrotiterplatten durchgeführt und umfasst die folgenden Schritte:

1. Beschichtung mit 100 μl sgp130-Fc (0,5 μg sgp130-Fc/ml PBS; Greiner Microlon Best. Nr.: 650061) über Nacht bei RT
2. Platte ausschütteln, 3x waschen mit PBS, ausklopfen auf Zellstoff
3. 2h blockieren mit 200 μl 3% BSA-PBS bei RT
4. Platte ausschütteln, 3x waschen mit PBS, ausklopfen auf Zellstoff
5. 1h Inkubation mit 100 μl Hyper IL-6 (500 ng Hyper IL-6/ml 3% BSA-PBS) bei RT
6. Platte ausschütteln, 3x waschen mit PBS 0,05% Tween, ausklopfen auf Zellstoff
7. 1h Inkubation mit 100 μl Antikörper M91 (0,1 μg M91/ml PBS-3% BSA; Immunotech CD126: IgG1 Maus) bei RT
8. Platte ausschütteln, 3x waschen mit PBS 0,05% Tween, ausklopfen auf Zellstoff
9. 1h Inkubation mit 100 μl anti-Maus IgG1 POD Konjugat (Verdünnung 1 : 1000 in 3% BSA-PBS; Amersham NA931) bei RT
10. Platte ausschütteln, 3x waschen mit PBS 0,05% Tween, ausklopfen auf Zellstoff
11. 30 min Inkubation mit 100 μl 3,3'-5,5'-Tetramethylbenzidine bei 37 °C (BM blue POD-Substrat, löslich; Roche Best. Nr.: 1484281)
12. Beenden der Färbereaktion durch Zugabe von 50 μl 1,8 M H₂SO₄.
13. Messung der Absorption bei λ = 450 nm

Claims

Verfahren zum Nachweis des IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplexes, gekennzeichnet durch Beschichten der Oberfläche des verwendeten Reaktionsgefäßes (1) mit sgp130-Fc (2) und Absättigen der unspezifischen Bindungsstellen mit Albumin, wobei der aus dem Überstand an sgp130-Fc gebundene IL-6/sIL-6-Rezeptor-Komplex (3) von einem gegen den sIL-6-Rezeptor gerichteten Antikörper (4) gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Zugabe wenigstens eines enzymgekoppelten, eine Farbreaktion katalysierenden Antikörpers (5), der gegen den sIL-6-Rezeptor gerichteten Antikörper (4) gerichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Zugabe eines radioaktiv markierten Antikörpers, der gegen den sIL-6-Rezeptor gerichteten Antikörper (4) gerichtet ist.
Test-Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch sgp130-Fc (2), Hyper IL-6 (3), einem gegen den sIL-6-Rezeptor gerichteten Antikörper (4), einem gegen den vorstehend genannten Antikörper gerichteten Antikörper (5), der mit einer Peroxidase konjugiert ist, und einen Farbstoff (6, 7), der von der Peroxidase oxidiert wird und dabei seine Lichtabsorptionseigenschaft ändert, die photometrisch erfasst werden kann.
Test-Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch sgp130-Fc (2), Hyper IL-6 (3), einem gegen den sIL-6-Rezeptor gerichteten Antikörper (4), einem gegen den vorstehend genannten Antikörper gerichteten Antikörper (5), der radioaktiv markiert ist.