DE602004005158T2 - Oberflächenschichts-affinitäts-chromatographie - Google Patents
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Description
- Die Immuno-Chromatographie wird derzeit in zwei Hauptformaten durchgeführt. Das erste wird durchgeführt in Gelen, wenn eine Entwicklung durch passive Diffusion erreicht wird oder elektrochemisch induziert wird, und das zweite wird durchgeführt in Strömung. In den erstgenannten Systemen, in denen Gele zur Anwendung kommen, ist die Radial-Immuno-Diffusion das am weitesten verbreitet verwendete System, bei dem ein vorgeformtes Gel häufig auf einer kreisförmigen Platte angeordnet ist, in der sich eine zentrale Vertiefung in dem Gel befindet, zusammen mit weiteren Vertiefungen, die um die Außenkante des Gels herum angeordnet sind. Antiserum oder Antigen wird in die zentrale Vertiefung gegeben, und Antigen oder Antiserum wird in die peripheren Vertiefungen gegeben. Es erfolgt eine passive Diffusion innerhalb des Gels, und weiße Banden von Immun-Komplex werden in dem Gel aufgrund einer Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes sichtbar. In dem elektrochemischen System wird eine Antikörper-Antigen-Wanderung innerhalb des Gels unter Verwendung eines elektrischen Stroms induziert.
- In den strömungsbasierten Systemen wird der Antikörper oder das Antigen häufig innerhalb einer Patrone immobilisiert, die mit einem Flüssigkeitsstrom-System wie beispielsweise einem Strom-Injektions-Analyse-System angeordnet wird. Das komplementäre Antigen oder der komplementäre Antikörper wird eingespritzt und strömt durch die Patrone, wo spezielle Wechselwirkungen stattfinden. Oft trägt die Komponente, die injiziert wird, eine Markierung, die dann stromabwärts detektiert werden kann, wodurch ein Signal produziert wird. Alternativ dazu erfolgt ein Strömen über eine planare Oberfläche, wie beispielsweise in Seitenstrom-Diffusions-Immuno-Assay-Systemen (lateral flow diffusion immunoassay systems), in denen ein Strömen durch Benetzen einer Membran/Kapillarität induziert wird.
- In dem neuen Format finden die äquivalenten Immunoreaktionen im Strom zwischen einer immobilisierten Komponente und einer Komponente in Lösung (wie oben) statt, jedoch geschieht dies nun auf der Oberfläche eines Eintauch-Streifens, der sich in einer Puffer-Lösung befindet. In diesem Fall erfolgt das Strömen über die Oberfläche des Streifens aufgrund der höheren Dichte einer Lösung, die eines der Immunoreagenzien enthält, das zu Beginn am oberen Ende des Streifens zugegen ist, der selbst in der Puffer-Lösung steht. Da der Streifen nahezu aufrecht steht, perlt diese dünnere Lösung langsam an der Oberfläche des Streifens herunter und präsentiert dem immobilisierten Reagenz auf der Oberfläche des Eintauch-Streifens das Reagenz in der strömenden Phase.
- Damit stellen wir gemäß der Erfindung ein Affinitäts-Chromatographie-Assay-System bereit, das eine immobilisierte, ein Bio-Reagenz enthaltende Komponente und eine ein komplementäres Bio-Reagenz enthaltende strömungsfähige Komponente umfasst, wobei das System dadurch gekennzeichnet ist, dass die immobilisierte Komponente auf einem Eintauch-Streifen oder einer anderen planaren Oberfläche als Träger aufgebracht ist und die strömungsfähige Komponente von hoher Dichte dafür angepasst ist, an dem Eintauch-Streifen herunter zu fließen.
- Damit dieses Phänomen funktioniert, müssen bestimmte Kriterien erfüllt sein. Zum Ersten muss die dichtere Lösung in einem diskreten Volumen gespeichert sein, wenn sie als Schicht über die Oberfläche läuft, und darf nicht schnell in die Hauptmenge der Puffer-Lösung diffundieren. Zum Zweiten muss der Eintauch-Streifen bestimmte Eigenschaften besitzen, die zu einer Anziehung der herab perlenden Oberflächen-Schicht führen, was wiederum zu einer Beibehaltung der Integrität dieser mobilen Phase führt. Um das erste Kriterium zu erreichen, haben wir sorgfältig die Bestandteile der herabperlenden Phase ausgewählt und dabei ein polymeres Mittel wie beispielsweise ein Protein und/oder ein Polysaccharid, ein Detergenz und einen Puffer mit optimalem pH-Wert eingeschlossen, und für das zweite Kriterium verwenden wir eine Membran, die sowohl hydrophob als auch benetzbar ist.
- Das System kann als Immuno-Chromatographie-System und für Assays verwendet werden, die entweder in kompetitiven oder in nicht-kompetitiven Immuno-Assay-Formaten durchgeführt werden. In den erstgenannten ist der immobilisierte Spot entweder ein Antikörper oder ein Antigen. Für einen immobilisierten Antikörper wird ein markiertes Antigen in einer Bande oberhalb des Spots in einem Cellulose-Quadrat abgeschieden. Ein Tropfen einer Probe, die das Antigen enthält, wird auf dieses Quadrat gegeben, und nach einem geeigneten Zeitintervall (1 bis 10 min) wird der gesamte Streifen in eine Puffer-Lösung eingetaucht. Die dichte Mischung aus markiertem und unmarkiertem Antigen strömt über den Spot aus Antikörper, und es findet eine Konkurrenz um eine Bindung statt. Wenn das Antigen an dem Spot immobilisiert wird, ersetzt ein markierter Antikörper das markierte Antigen in dem Cellulose-Quadrat, und der Assay läuft wie vorher ab.
- Das System kann auch in einem nicht-kompetitiven Immuno-Assay-Format durchgeführt werden, wenn ein Spot aus einem Einfang-Antikörper (capture antibody) auf dem Streifen immobilisiert wird. Ein markierter Antikörper wird auf dem Cellulose-Quadrat oberhalb des ersten Spots abgeschieden. Der Streifen wird in die Proben-Lösung gestellt, die das Antigen enthält, so dass das obere Quadrat eingetaucht ist. Es findet nun eine Inkubation statt, während der Antigen in der Lösung durch immobilisierten Antikörper auf dem Spot eingefangen wird. Gleichzeitig wird der markierte Antikörper rekonstituiert in einer dichten Lösung, die über den Spot nach etwa 5 bis 10 min im Anschluss an das Eintauchen des Streifens in die Probe-Lösung fließt. Diese Zeit-Verzögerung macht es möglich, dass Antigen-Moleküle auf dem Spot vor der Ankunft der Oberflächen-Schicht eingefangen werden, die den markierten Antikörper enthält. Dieser zweite Antikörper markiert das eingefangene Antigen auf der Oberfläche des Spots.
- Darüber hinaus kann jede beliebige Markierung verwendet werden. Wenn eine Fluoreszenz-Markierung oder gefärbte Markierung mit dem Antikörper oder Antigen verwendet wird, dann resultiert ein fluoreszierender oder gefärbter Spot im Anschluss an die erste Inkubierung, was den Assay zu einem Ein-Schritt-System macht.
- Wenn eine Enzym-Markierung verwendet wird, dann kann eine modifizierte Folge von Schritten in dem nicht-kompetitiven Assay verwendet werden. In diesem wird nun ein Enzym-markierter Antikörper auf das Cellulose-Quadrat gegeben, das sich am unteren Ende des Streifens unter dem Spot aus immobilisierten Einfang-Antikörper (capture antibody) befindet. Ein zweites Cellulose-Quadrat wird auch wie vorher oberhalb dieses Spots aufgebracht, jedoch enthält dieses eine getrocknete Lösung von Substrat für das Enzym, zuzüglich eines Bio-Polymers wie beispielsweise Dextran. Wie vorher, wird der Streifen in ein begrenztes Volumen Probe gestellt, so dass das obere Cellulose-Quadrat nicht benetzt wird. Die dichte rekonstituierte Lösung von markiertem Antikörper fließt zum unteren Teil des Behälters und bleibt dort als separate Schicht. Gleichzeitig wird Antigen in der Lösung durch den Antikörper auf dem Spot eingefangen. Am Ende dieses Inkubations-Schritts (5 bis 10 min) wird die Lösung unter Verwendung des Eintauch-Streifens gerührt. Dies führt dazu, dass der markierte Antikörper homogen in der Lösung verteilt wird, und der Antikörper kann sich nun an das eingefangene Antigen auf dem Spot binden. Zum Schluss wird das Volumen in dem Behälter so erhöht, dass das obere Cellulose-Quadrat benetzt wird. Das Substrat wird nun als dichte Lösung rekonstituiert, die über den Spot fließt, wenn eine Umwandlung zwischen Substrat und Produkt stattfindet, was zu einem gefärbten Spot führt.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir ein Verfahren zur Durchführung von Immuno-Chromatographie-Assays bereit, das die Verwendung eines Assay-Systems umfasst, wie es oben beschrieben wurde.
- Dieses neue Oberflächen-Schicht-Chromatographie-Phänomen könnte in der Theorie auch als allgemeines Chromatographie-Verfahren zum Trennen von Mischungen zu analysierender Substanzen verwendet werden, wenn die Komponenten unterschiedliche Bindungs-Affinitäten zur Oberfläche haben. Beispielswiese ist es wohlbekannt, dass biologische Polymere wie beispielsweise Proteine und DNS/RNS eine Bindung an Cellulosenitrat eingehen, wenn dieses beim DNS-Blotting bzw. Protein-Blotting im Anschluss an eine Elektrophorese verwendet wird. Wir haben auch beobachtet, dass bei Antikörpern die Bindungsrate an diese Oberfläche empfindlich gegenüber pH-Wert-Änderungen ist [1]. Damit sollte es möglich sein, eine Mischung von biologischen Polymeren auf einen Cellulose-Streifen oberhalb eines Cellulosenitrat-Quadrats einzuführen. Der pH-Wert und die Dichte des verwendeten Puffers wären derart, dass eine Ober flächenschicht-Chromatographie folgt, wenn der Streifen in eine zweite Puffer-Lösung eingetaucht wird, die so gewählt ist, dass sie die Bindung der Bio-Polymere an die Oberfläche optimiert. Unter diesen Bedingungen finden unterschiedliche Bindungs-Wechselwirkungen zwischen den Biomolekülen und der Oberfläche statt, wenn die Schicht der mobilen Phase über die Oberfläche herunterläuft. Dies sollte zur Trennung der Komponenten während dieser Entwicklungs-Phase führen. Der Streifen würde dann entfernt, und die Membran würde unter Anwendung etablierter Verfahrensweisen behandelt und so die nun immobilisierten Komponenten der Mischung visualisiert werden.
- Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf das beigefügte Beispiel veranschaulicht.
- Beispiel 1
- In einem Beispiel dieses neuen Immuno-Chromatographie-Systems, das wir „Oberflächen-Schicht-Immuno-Chromatographie (surface layer immunochromatographiy; SLIC)" nennen, wird ein kleines Quadrat einer Cellulosenitrat-Membran über etablierte Verfahrensweisen mit einem speziellen Antikörper für ein Antigen wie beispielsweise Savinase vorbehandelt und so ein Spot aus immobilisiertem Reagenz produziert. Dieses Quadrat wird auf der Oberfläche eines Kunststoff-Streifens zum Haften gebracht, der mit einer klebrigen Oberfläche vorbeschichtet wurde. Oberhalb dieses Quadrats wird ein zweiter Streifen auf Cellulose zum Haften gebracht, der mit einer getrockneten Lösung desselben Antikörpers imprägniert ist, der mit dem Reporter-Enzym Alkalische Phosphatase markiert ist, zusammen mit Rinderserum-Albumin (BSA) und Tween 20. Die für diese Abscheidung verwendete Lösung ist TRIS (pH 9,3), und es wird ein Volumen von 10 μl verwendet. Die Zusammensetzung dieser Lösung ist 0,1 % (w/v) BSA; 0,1 % (w/v) Tween 20; Enzym-markierter Antikörper, verdünnt auf 1:1.000 in TRIS-Puffer (0,1 M). Die Reagenzien in diesem Format sind bei Lagern bei Raumtemperatur in einem Exiccator auf dem Streifen für wenigstens 14 Tage stabil.
- Um den Test durchzuführen, wird eine Lösung von Savinase (0,3 ml) in TRIS-Puffer in ein Test-Rohr wie beispielsweise eine herkömmliche Mikrotiter-Platte mit 96 Vertie fungen gegeben. Der Eintauch-Streifen wird nun in die Vertiefung eingetaucht, wenn beide Quadrate durch die Probe bedeckt sind. Beim Benetzen treten die Reagenzien innerhalb des Quadrats aus Cellulose in die Lösung über. Aufgrund ihrer höheren Dichte fließt diese Lösung nun als Schicht auf der Oberfläche des Streifens nach unten und passiert gelegentlich das untere Quadrat, das den Spot aus immobilisiertem Antikörper enthält. In dem Zeit-Intervall zwischen dem Eintauchen des Streifens und der Ankunft der fließenden Phase wurden Savinase-Moleküle in der Hauptmenge der Lösung durch die immobilisierten Antikörper auf dem unteren Spot eingefangen. Bei Ankunft der fließenden Phase bindet sich markierter Antikörper an die eingefangenen Antigen-Moleküle wie in einem herkömmlichen ELISA-Test des Sandwich-Typs, wenn die Lösung über den Spot fließt. Diese erste Inkubations-Periode beträgt typischerweise 15 min.
- Der Streifen wird aus der Vertiefung entfernt und in Vertiefungen platziert, die die herkömmlicherweise verwendete Substrat-Mischung für Alkalische Phosphatase enthalten, Bromchlorindolylphosphat (BCIP) und Nitroblau-Tetrazolium-Salz (NBT). Es entwickelt sich eine purpurfarbene/blaue Farbe eine Minute nach der Inkubation, deren Intensität direkt proportional der Menge an Savinase ist, die auf dem Spot während des ersten Inkubations-Schritts eingefangen wurden, und damit auch direkt proportional der Konzentration von Savinase in der Probe. Das obere Quadrat ist ebenfalls purpurfarben/blau gefärbt. Ein Scan für die resultierenden Streifen ist für diese zu analysierende Substanz gezeigt. Es sollte angemerkt werden, dass wir 12 derartige Streifen in einem Kammartigen Format verwenden, da dies ermöglicht, dass eine Analyse von bis zu 96 Proben/Standards (8 × 12) mit einer einzigen Mikrotiter-Platte durchgeführt wird. Es wird angemerkt, dass eine visuelle Diskriminierung zwischen der Null-Probe und dem Standard mit 5 ng/ml klar ersichtlich ist.
- Beispiel 2
- Wie in Beispiel 1 wird ein kleines Quadrat einer Cellulosenitrat-Membran mit einem Spot aus spezifischem Antikörper an der Oberfläche eines Plastikstreifens befestigt.
- Darunter wird ein zweiter Streifen aus Cellulose angeordnet (geschnitten zu Quadraten mit 0,4 × 0,6 cm aus schnell gehärtetem Filterpapier). Dieses Quadrat wird mit 5 μl einer verdünnten Lösung desselben Antikörpers imprägniert, der mit dem Reporter-Enzym Alkalische Phosphatase markiert ist, und zwar in einer Lösung von Blaudextran (3 %, w/v), Dextran (25 %, w/v), alles in TRIS-Puffer mit Azid, pH 9,3 (enthaltend 0,1 % Tween 20 und 0,15 % (w/v) Rinderserum-Albumin). Man lässt die aufgebrachte Lösung bei Umgebungstemperatur 30 min lang trocknen. Ein drittes Quadrat aus schnell gehärtetem Filterpapier wird oberhalb des ersten Quadrats zum Kleben gebracht und wird mit dem Substrat für Alkalische Phosphatase imprägniert. Dieses wird hergestellt durch Zugabe von 15 μl einer Mischung aus 1 % (w/v) Blaudextran, 1 % (w/v) Dextran und einer BCIP-NBT-Vorratslösung. Man lässt dies 60 min lang bei Umgebungstemperatur trocknen, wonach das Quadrat an dem Eintauch-Streifen klebt.
- Die vorbereiteten Eintauch-Streifen werden dann in Mikrokuvetten gegeben, die 0,6 ml Standards oder Proben enthalten. Nach 10 min wird eine blaue Schicht der Lösung an der Basis der Kuvette beobachtet. Die Streifen werden verwendet, um den Inhalt der Kuvetten zu rühren. Dies produziert eine einheitliche blaue Färbung in der ganzen Lösung. Man inkubiert weitere 5 min und gibt dann 500 μl Substrat-Puffer-Lösung zu und bedeckt nun das obere Quadrat auf dem Eintauch-Streifen. Man inkubiert schließlich 10 min und entfernt danach die Streifen und wäscht sie mit Wasser.
- Wenn Kaninchen-Anti-Savinase-Antikörper als Capture- und -Capping-Antikörper in Gegenwart von Savinase-Standards verwendet werden, werden die folgenden Streifen beobachtet, wenn man dem obigen Protokoll folgt.
- Die resultierenden Eintauchstreifen sind in
1 veranschaulicht, worin
A = Null-Standards;
B = 10 ng/ml Standards für Savinase sind.
Claims (20)
- Affinitäts-Chromatographie-Assay-System, umfassend eine immobilisierte, ein Bio-Reagenz enthaltende Komponente, wobei die immobilisierte Komponente Träger-mäßig aufgetragen ist auf einer planaren Oberfläche, und eine ein komplementäres Bio-Reagenz enthaltende strömungsfähige Komponente, dadurch gekennzeichnet, dass die strömungsfähige Komponente dafür angepasst ist, eine dichtere Lösung zu bilden, die langsam an der Oberfläche herunter perlt.
- Affinitäts-Chromatographie-Assay-System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die planare Oberfläche in Form eines Eintauch-Streifens vorliegt, wobei die strömungsfähige Komponente dafür angepasst ist, eine dichtere Lösung zu bilden, die langsam an der Oberfläche des Eintauch-Streifens herunter perlt.
- Affinitäts-Chromatographie-Assay-System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die planare Oberfläche in Form einer an einem Eintauch-Streifen befestigten Membran vorliegt.
- Affinitäts-Chromatographie-Assay-System nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, welches Eigenschaften besitzt, die in einer Anziehung der strömungsfähigen Komponente an der planaren Oberfläche resultieren.
- Affinitäts-Chromatographie-Assay-System nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran sowohl hydrophob als auch benetzbar ist.
- Affinitäts-Chromatographie-Assay-System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die strömungsfähige Komponente eine höhere Dichte aufweist als die Lösung der Masse des Puffers.
- Affinitäts-Chromatographie-Assay-System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bio-Reagenz ein Antigen oder ein Antikörper ist.
- Affinitäts-Chromatographie-Assay-System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die strömungsfähige Komponente in einem getrennten Volumen gehalten wird.
- Affinitäts-Chromatographie-Assay-System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten der strömungsfähigen Komponente einschließen: ein Bio-Polymer, ein Detergens und einen Puffer mit einem pH-Wert, der ein optimales Binden des Bio-Polymers an der planaren Oberfläche sicherstellt.
- Affinitäts-Chromatographie-Assay-System nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Assay entweder ein kompetitives oder ein nicht-kompetitives Immuno-Assay ist, das Gebrauch von Kombinationen von markiertem Antigen oder markiertem Antikörper mit ihren komplementären, unmarkierten Gegenstücken macht.
- Affinitäts-Chromatographie-Assay-System nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung eine Fluoressenz-Markierung oder eine gefärbte Markierung ist.
- Verfahren zur Durchführung eines Affinitäts-Chromatographie-Assays, welches die Verwendung eines Assay-Systems nach Anspruch 1 umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein Eintauch-Streifen die planare Oberfläche liefert.
- Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Eintauch-Streifen im wesentlichen aufrecht in einer Puffer-Lösung aufgestellt wird.
- Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die strömungsfähige Komponente in Nachbarschaft zu dem oberen oder unteren Teil des Eintauch-Streifens verteilt wird.
- Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren das Trennen von Mischungen zu analysierender Substanzen umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten unterschiedliche Bindungsaffinitäten für die Oberfläche haben.
- Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren einen Ein-Schritt-Assay umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren das Trennen biologischer Polymere umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Polymere gewählt sind aus Proteinen und DNS/RNS.
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