PT1585986E - Cromatografia de afinidade em camada superficial - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE EM CAMADA SUPERFICIAL" A imunocromatografia é actualmente realizada em dois formatos principais. 0 primeiro é realizado em geles em que o desenvolvimento é feito por difusão passiva ou é induzido electroquimicamente, e o segundo é realizado em fluxo. No primeiro que utiliza geles, a imunodifusão radial é o sistema mais vulgarmente utilizado com um gel pré-formado frequentemente posicionado dentro de uma placa circular em que está presente um poço central no gel conjuntamente com poços adicionais localizados em torno da periferia do gel. Anti-soro ou antigénio é colocado no poço central e antigénio ou antissoro é colocado nos poços periféricos. Ocorre difusão passiva dentro do gel e observa-se bandas brancas de imunocomplexo no gel devido à formação de complexo anticorpo-antigénio. No sistema electroquimico a migração do sistema anticorpo/antigénio dentro do gel é induzida utilizando uma corrente eléctrica.

Nos sistemas à base de fluxo, o anticorpo ou antigénio é frequentemente imobilizado dentro de um cartucho que está regulado com um sistema de fluxo liquido tal como um sistema de análise por injecção de fluxo. 0 antigénio ou anticorpo complementar é injectado e flui através do cartucho onde ocorrem interacções especificas. Frequentemente o componente que é injectado tem um marcador que pode ser detectado a jusante, produzindo assim um sinal. Alternativamente ocorre fluxo sobre uma superfície planar como em sistemas de imunoensaio por difusão de fluxo lateral em que o fluxo é induzido por molhagem da membrana/capilaridade. 1

No novo formato as imunorreacções equivalentes têm lugar em fluxo entre um componente imobilizado e um em solução como acima mas isto ocorre agora na superfície de uma tira de imersão colocada dentro de uma solução tampão. Neste caso o fluxo através da superfície da tira ocorre devido à densidade mais elevada de uma solução contendo um dos imunorreagentes que está inicialmente presente no topo da tira que está ela própria é na solução tampão. Uma vez que a tira está praticamente vertical esta solução mais densa lentamente desce pela superfície da tira apresentando o reagente na fase que escoa ao reagente imobilizado na superfície da tira de imersão.

Assim de acordo com a invenção é proporcionado um sistema de ensaio por cromatografia de afinidade compreendido por um componente imobilizado contendo um biorreagente e um componente capaz de escoar contendo um biorreagente complementar caracterizado por o componente imobilizado estar suportado numa tira de imersão ou outra superfície planar e o componente de alta densidade capaz de escoar estar adaptado para escoar pela tira de imersão abaixo.

Para que este fenómeno funcione têm de ser cumpridos certos critérios. Em primeiro lugar a solução mais densa tem de ficar retida num volume discreto à medida que passa como uma camada sobre a superfície em vez de se difundir rapidamente na massa da solução tampão. Em segundo lugar a tira de imersão tem de possuir certas propriedades que resultam em atracção da camada de superfície que móvel conduzindo de novo a retenção da integridade desta fase móvel. Para conseguir o primeiro critério escolheu-se cuidadosamente os constituintes da fase móvel para incluir um agente polimérico tal como uma proteína e/ou um polissacárido, um detergente e um tampão com pH óptimo, e para a segunda utiliza-se uma membrana que é tanto hidrófoba como 2 molhável. 0 sistema pode ser utilizado como um sistema de imuno-cromatografia e os ensaios podem ser realizados em formatos de imunoensaio competitivo ou não competitivo. No primeiro a mancha imobilizada é anticorpo ou antigénio. Para anticorpo imobilizado, deposita-se um antigénio marcado numa banda acima da mancha num quadrado de celulose. Uma gota de amostra contendo o antigénio é adicionada a este quadrado e após um intervalo adequado (1-10 min) toda a tira é imersa numa solução tampão. A mistura densa de antigénio marcado e não marcado flui sobre a mancha de anticorpo e tem lugar competição para ligação. Se o antigénio estiver imobilizado na mancha, um anticorpo marcado substitui o antigénio marcado no quadrado de celulose e o ensaio decorre como anteriormente. 0 sistema também pode ser realizado num formato de imunoensaio não competitivo quando uma mancha de anticorpo de captura está imobilizada na tira. O anticorpo marcado é depositado no Quadrado de celulose acima da primeira mancha. A tira é colocada na solução da amostra contendo o antigénio de modo que o quadrado superior é imerso. Tem agora lugar a incubação durante a qual o antigénio na solução é capturado pelo anticorpo imobilizado na mancha. Ao mesmo tempo o anticorpo marcado é reconstituído numa solução densa que escoa sobre a mancha após cerca de 5-10 minutos após a inserção da tira na solução da amostra. Esta retardação permite que as moléculas de antigénio sejam capturadas na mancha antes da chegada da camada superficial contendo o anticorpo marcado. Este segundo anticorpo marca o antigénio capturado na superfície da mancha.

Além disso pode utiliza-se um marcador qualquer. Se se utilizar um marcador fluorescente ou corado com o anticorpo ou antigénio, então resultará uma mancha fluorescente ou corada 3 após a primeira incubação, tornando o ensaio um sistema num único passo.

Se se utilizar um marcador enzimático então pode utilizar-se uma sequência modificada de passos no ensaio não competitivo. Neste, anticorpo marcado com enzima é agora adicionado ao quadrado de celulose ligado ao fundo da tira por baixo da mancha de anticorpo de captura imobilizado. Um segundo quadrado de celulose é também fixado como antes acima desta mancha mas este contém uma solução seca de substrato para a enzima mais um biopolimero, tal como dextrano. A tira é colocada num volume limitado de amostra como anteriormente de modo a não molhar o quadrado de celulose superior. A solução reconstituída densa de anticorpo marcado escoa para o fundo do recipiente e fica ai como uma camada separada. Ao mesmo tempo o antigénio em solução é capturado pelo anticorpo na mancha. No final deste passo de incubação (5-10 minutos) a solução é agitada utilizando a tira de imersão. Isto faz com que o anticorpo marcado seja distribuído homogeneamente dentro da solução e o anticorpo pode agora ligar-se ao antigénio capturado na mancha. Finalmente o volume no recipiente é aumentado para molhar o quadrado de celulose superior. O substrato é agora reconstituído como um solução densa que escoa sobre a mancha quando a conversão de substrato em produto tem lugar resultando numa mancha colorida.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é proporcionado um método de realização de ensaios imuno-cromatográficos que compreende a utilização de um sistema de ensaio tal como aqui descrito anteriormente.

Este novo fenómeno de cromatografia em camada superficial podia, em teoria, ser também utilizado como um método cromatográfico genérico para separação de misturas de analitos se os componentes tiverem diferentes afinidades de ligação para 4 a superfície. Por exemplo, é bem conhecido que polímeros biológicos, tais como proteínas e ADN/ARN, se ligam a nitrato de celulose uma vez que isto é utilizado em transferência de ADN e proteínas após electroforese. Também se observou que para anticorpos a velocidade de ligação a esta superfície é sensível ao pH [1] . Assim deve ser possível introduzir uma mistura de polímeros biológicos numa tira de celulose por cima de um quadrado de nitrato de celulose. 0 pH e a densidade do tampão utilizado seriam tais que vai ocorrer cromatografia em camada superficial quando a tira é imersa numa segunda solução tampão escolhida para optimizar a ligação dos biopolímeros à superfície. Nestas condições, terão lugar diferentes interacções de ligação entre as biomoléculas e a superfície à medida que a camada da fase móvel se desloca ao longo da superfície. Isto deve conduzir à separação dos componentes durante esta fase de desenvolvimento. A tira seria então retirada e a membrana tratada para visualizar, utilizando métodos estabelecidos, os componentes da mistura agora imobilizados. A invenção será agora ilustrada com referência aos exemplos anexos.

Exemplo 1

Num exemplo deste novo sistema imunocromatográfico que é designado Imunocromatografia em Camada Superficial (SLIC), um pequeno quadrado de membrana de nitrato de celulose é pré-tratado por meio de métodos estabelecidos com um anticorpo específico para um antigénio, tal como savinase, para produzir uma mancha de reagente imobilizado. Este quadrado é fixo à superfície de uma tira de plástico pré-revestida com uma superfície aderente. Acima deste é fixa uma segunda tira de celulose impregnada com uma solução seca do mesmo anticorpo 5 marcado com a enzima repórter fosfatase alcalina, conjuntamente com albumina de soro de bovino (BSA) e Tween 20. A solução utilizada para esta deposição é Tris (pH 9,3) e utiliza-se um volume de 10 yL. A composição desta solução é 0,1% p/v de BSA, 0,1% p/v de Tween 20, anticorpo marcado com enzima diluído 1:1000 em tampão Tris (0,1 M). Os reagentes neste formato quando armazenados à temperatura ambiente num exsicador são estáveis na tira durante pelo menos 14 dias.

Para realizar o ensaio, uma solução de savinase (0,3 mL) em tampão Tris é colocada num tubo de ensaio tal como uma placa de microtitulação com 96 poços. A tira de imersão é agora inserida no poço quando ambos os quadrados são cobertos pela amostra. Ao serem molhados, os reagentes dentro do quadrado de celulose passam para solução. Devido à sua densidade mais elevada esta solução escoa agora como uma camada pela superfície da tira abaixo, e eventualmente passa sobre o quadrado inferior contendo a mancha de anticorpo imobilizado. No intervalo de tempo entre a imersão da tira e a chegada da fase que escoa, moléculas de savinase na solução em massa terão sido capturadas pelos anticorpos imobilizados na mancha inferior. Por chegada da fase que escoa, o anticorpo marcado vai ligar-se às moléculas de antigénio capturadas como num ELISA de tipo sanduíche convencional, à medida que a solução escoa sobre a mancha. Este primeiro período de incubação é tipicamente 15 minutos. A tira é retirada do poço e colocada em poços contendo a mistura de substrato vulgarmente utilizada para fosfatase alcalina, fosfato de bromocloroindolilo (BCIP) e sal nitro-azul de tetrazólio (NBT). Desenvolve-se uma cor púrpura/azul após incubação durante 1 minuto, cuja intensidade é directamente proporcional à quantidade de savinase capturada na mancha durante o primeiro passo de incubação, e portanto à concentração de savinase na amostra. O quadrado de cima também fica corado de 6 púrpura/azul. É apresentado uma imagem digitalizada das tiras resultantes para este analito. Deve notar-se que se utiliza 12 dessas tiras num formato semelhante a um pente uma vez que isto permite que a análise de até 96 amostras/padrões (8x12) seja realizada com uma só placa de microtitulação. Notar-se-á que é claramente observada a discriminação visual entre o zero e o padrão a 5 ng/mL.

Exemplo 2

Como no exemplo 1, um pequeno quadrado de membrana de nitrato de celulose com uma mancha de anticorpo especifico é fixa a superfície de uma tira de plástico. Abaixo desta é colocada uma segunda tira de celulose (cortada como quadrados 0,4 x 0,6 cm de papel de filtro endurecido, de filtração rápida) . Este quadrado é impregnado com 5 pL de uma solução diluída do mesmo anticorpo marcado com a enzima repórter fosfatase alcalina, numa solução de azul de dextrano, (3% p/v), dextrano (25 p/v), todos em tampão Tris com azida, pH 9,3 (contendo 0,1% de Tween 20 e 0,15 (p/v) de albumina de soro de bovino). Deixa-se secar a solução aplicada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Um terceiro quadrado de papel de filtro endurecido de filtração rápida é fixo acima do primeiro quadrado e é impregnado com o substrato para fosfatase alcalina. Este é preparado por adição de 15 pL de uma mistura de 1% (p(v) de azul de dextrano, 1% (p/v) de dextrano e solução mãe de BCIP-NBT. Deixa-se secar durante 60 minutos à temperatura ambiente altura em que o quadrado é fixo à tira de imersão.

As tiras de imersão pré-preparadas são então adicionadas a microcuvetes contendo 0,6 mL de padrões ou amostras. Após 10 minutos observa-se uma camada azul de solução na base da cuvete. As tiras são utilizadas para mexer o conteúdo das 7 cuvetes. Isto produz uma coloração azul uniforme através da solução. Incubar durante mais 5 minutos depois adicionar 500 yL de solução tampão de substrato para cobrir agora o quadrado de cima na tira de imersão. Incubar durante 10 minutos finais, depois retirar as tiras e lavar com água.

Quando se utiliza anti-savinase de coelho como os anticorpos de captura e selagem na presença de padrões de savinase, observa-se as seguintes tiras quando é seguido o protocolo descrito acima.

As tiras de imersão resultantes estão ilustradas na Figura 1, na qual: A = padrões zero, B = 10 ng/mL de padrões de savinase

Lisboa, 6 de Junho de 2007

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Sistema de ensaio por cromatografia de afinidade compreendendo um composto imobilizado contendo um biorreagente, estando o referido composto imobilizado suportado numa superfície planar, e um componente capaz de escoar contendo um biorreagente complementar, caracterizado por o composto capaz de escoar estar adaptado para formar uma solução mais densa que se move lentamente pela superfície abaixo.
2. 2. Sistema de ensaio por cromatografia de afinidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a superfície planar estar na forma de uma tira de imersão, em que o referido componente capaz de escoar está adaptado para formar uma solução mais densa que se move lentamente pela superfície da tira de imersão abaixo.
3. 3. Sistema de ensaio por cromatografia de afinidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a superfície planar estar na forma de uma membrana fixa a uma tira de imersão.
4. 4. Sistema de ensaio por cromatografia de afinidade de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 3, que possui propriedades que resultam na atracção do componente capaz de escoar para a superfície planar.
5. 5. Sistema de ensaio por cromatografia de afinidade de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a membrana ser simultaneamente hidrófoba e molhável. 1
6. 6. Sistema de ensaio por cromatografia de afinidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o componente capaz de escoar ter uma densidade mais elevada do que a da massa da solução do tampão.
7. 7. Sistema de ensaio por cromatografia de afinidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o biorreagente ser um antigénio ou um anticorpo.
8. 8. Sistema de ensaio por cromatografia de afinidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o componente capaz de escoar ficar retido num volume discreto.
9. 9. Sistema de ensaio por cromatografia de afinidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os constituintes do componente capaz de escoar incluírem um biopolímero, um detergente e um tampão com um pH que assegura ligação óptima do biopolímero à superfície planar.
10. 10. Sistema de ensaio por cromatografia de afinidade de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o ensaio ser um imunoensaio competitivo ou não competitivo utilizando combinações de antigénio marcado ou anticorpo marcado com os seus parceiros complementares não marcados.
11. 11. Sistema de ensaio por cromatografia de afinidade de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o marcador ser um marcador fluorescente ou corado.
12. 12. Processo de execução de um ensaio por cromatografia de afinidade que compreende a utilização de um sistema de ensaio de acordo com a reivindicação 1. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado 2 13. por uma tira de imersão proporcionar a superfície planar.
13. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a tira de imersão estar colocada substancialmente verticalmente numa solução tampão.
14. 15. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o composto capaz de escoar ser administrado em posição adjacente à parte superior ou inferior da tira de imersão.
15. 16. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o processo compreender a separação de misturas de analitos.
16. 17. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por os componentes terem diferentes afinidades de ligação para a superfície.
17. 18. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o processo compreender um ensaio com um só passo.
18. 19. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o processo compreender a separação de polímeros biológicos.
19. 20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por os polímeros biológicos serem seleccionados de proteínas e ADN/ARN. Lisboa, 6 de Junho de 2007 3