JP2006515425A - 表面層アフィニティークロマトグラフィー - Google Patents

Abstract

バイオ試薬を含有する固定化成分と相補的バイオ試薬を含有する流動性成分とを含むアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステムであって、固定化成分が浸漬ストリップ上または平面上に担持され、流動性成分が高密度な浸漬ストリップを流れ落ちるようになっていることを特徴とするシステムを提供する。また、そのようなアッセイシステムの使用を含むアフィニティークロマトグラフィーアッセイの実行方法も開示する。

Description

免疫クロマトグラフィーは現在、２つの主要フォーマットで行われている。第１のフォーマットは、展開が受動拡散によって達成されるかまたは電気化学的に誘発される場合に、ゲル内で行われ、第２のフォーマットは、流体の中で行われる。ゲルを使用する前者のフォーマットでは、放射状免疫拡散が最もよく用いられるシステムである。このシステムでは、前もって形成されたゲルが円板内に設置され、そこではゲル内に中心ウェルが存在すると共に、さらなるウェルがゲルの縁部を取り囲むように配置される。抗血清または抗原を中心ウェルに入れ、抗原または抗血清を周辺ウェルに入れる。ゲル内で受動拡散が起こって、免疫複合体の白いバンドが、抗体−抗原複合体形成により、ゲル内に認められる。電気化学的システムでは、ゲル内での抗体／抗原移動が電流を使って誘発される。

フロー型システムの場合、抗体または抗原は、フローインジェクション分析システムなどの液体フローシステムを使って流量調整されるカートリッジ内に固定化されることが多い。相補的な抗原または抗体が注入されてカートリッジ内を貫流すると、そこで特異的相互作用が起こる。注入される成分は、多くの場合、下流で検出することができるラベルを持ち、それによってシグナルを生成する。あるいは、流れは、膜の濡れ／毛管現象によって流れが誘発される側方流動拡散免疫アッセイシステムの場合のように、平面的表面上で起こる。

新しいフォーマットでは、上記のように、流体の中で同等の免疫反応が固定化された成分と溶液中の成分との間で起こるが、ここではこれが緩衝溶液内に存在する浸漬ストリップの表面で起こる。この場合、緩衝溶液中に直立しているストリップの上部に最初に存在する免疫試薬の一つを含有する溶液の密度が高いために、ストリップの表面を横切る流れが生じる。ストリップはほぼ垂直なので、この高密度溶液は、浸漬ストリップの表面上の固定化試薬に流動相中の試薬を提示しながら、ストリップの表面をゆっくりと流れ落ちる。

したがって本発明者らは、本発明により、バイオ試薬を含有する固定化成分と相補的バイオ試薬を含有する流動性成分とを含むアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステムであって、固定化成分が浸漬ストリップ上または他の平面上に担持され、高密度な流動性成分が浸漬ストリップを流れ落ちるように構成されていることを特徴とするシステムを提供する。

この現象が機能するには、一定の基準が満たされなければならない。第１に、前記高密度溶液は、緩衝溶液のバルク中に迅速に拡散するのではなく表面上を層として通過するように、分画された容量で保持されなければならない。第２に、浸漬ストリップは、この移動相の完全性の保持をもたらす転がり表面層の吸引を生じさせる一定の特性を持たなければならない。第１の基準を達成するために、本発明者らは、タンパク質および／または多糖などのポリマー剤、洗剤および至適ｐＨの緩衝剤を含むように、転がり相の構成要素を注意深く選択した。また、第２の基準を達成するために、本発明者らは、疎水性であり、かつ濡らすことができる膜を使用する。

このシステムは、免疫クロマトグラフィーシステムとして、そして競合免疫アッセイフォーマットまたは非競合免疫アッセイフォーマットで行われる免疫クロマトグラフィーアッセイとして、使用することができる。前者の場合、固定化スポットは抗体または抗原である。固定化抗体の場合は、セルロース四角片中のスポットの上方にバンドとして標識抗原を沈着させる。１滴の抗原含有試料をこの四角片に添加し、適切な時間（１〜１０分）後に、ストリップ全体を緩衝溶液に浸漬する。標識抗原および非標識抗原の高密度混合物が抗体のスポット上を流れて、結合に関する競合が起こる。抗原をスポットに固定化する場合は、セルロース四角片中の標識抗原を標識抗体で置き換え、アッセイを上述の手順で進める。

捕捉抗体のスポットをストリップ上に固定化する場合は、このシステムを非競合免疫アッセイフォーマットで行うこともできる。標識抗体を、第１スポットの上方にあるセルロース四角片に付着させる。抗原を含有する試料溶液に、ストリップを、上側四角片が浸漬されるように入れる。ここでインキュベーションを行い、その間に、溶液中の抗原がスポット上の固定化抗体に捕捉される。同時に、標識抗体が高密度溶液中で再構成され、その高密度溶液は、ストリップを試料溶液に挿入してから約５〜１０分後にスポットの上を流れる。このタイムラグは、標識抗体を含有する表面層が到達する前に、抗原分子がスポット上に捕捉されることを可能にする。この第２抗体は、スポットの表面にある捕捉抗原を標識する。

さらに、任意のラベルを使用することができる。蛍光ラベルまたは着色ラベルを抗体または抗原と共に使用する場合は、第１インキュベーション後に蛍光スポットまたは着色スポットが生じ、そのアッセイは一段階システムになる。

酵素ラベルを使用する場合は、変更された手順を非競合アッセイに使用することができる。この場合は、固定化捕捉抗体のスポットの下方、ストリップの最下部に取り付けたセルロース四角片に、酵素標識抗体を添加する。このスポットの上方には、上記と同様に第２のセルロース四角片も取り付けるが、これは乾燥した酵素基質溶液＋デキストランなどの生体ポリマーを含有する。このストリップを、上側セルロース四角片が濡れないように限られた体積の試料に、上記と同様に入れる。標識抗体の高密度復元溶液は容器の最下部に向かって流れ、そこに独立した層として留まる。同時に、溶液中の抗原はスポット上の抗体に捕捉される。このインキュベーションステップ（５〜１０分間）の終了時に、ストリップを使って溶液を撹拌する。これによって標識抗体は溶液内に均一に分布し、抗体はスポット上の捕捉された抗原に結合することができる。最後に、上側セルロース四角片が濡れるように、容器中の体積を増加させる。基質はここで、スポット上を流れる高密度溶液として再構成され、基質から生成物への変換が起こると、着色スポットが得られる。

本発明のさらにもう一つの態様によれば、本発明者らは、上述したアッセイシステムの使用を含む免疫クロマトグラフィーアッセイの実行方法を提供する。

理論上、この新しい表面層クロマトグラフィー現象は、固定化成分および流動化成分が当該表面に対して異なる結合親和性を持つ場合は、分析物混合物を分離するための一般クロマトグラフィー法として使用してもよい。例えば、タンパク質およびＤＮＡ／ＲＮＡなどの生物学的ポリマーが硝酸セルロースに結合することは、電気泳動後のＤＮＡブロッティングおよびタンパク質ブロッティングに利用されているので、よく知られている。本発明者らは、抗体に関して、この表面への結合速度がｐＨ感受性であることも観察した［１］。したがって、生物学的ポリマーの混合物を、セルロースストリップ上に硝酸セルロース四角片の上方に導入することができるはずである。使用する緩衝液のｐＨおよび密度は、表面への生体ポリマーの結合を最適化するように選択された第２緩衝溶液中にストリップを浸漬した場合に、結果として表面層クロマトグラフィーが起こるようなｐＨおよび密度であるだろう。これらの条件下では、移動相の層が表面上を転がる際に、生体分子と表面との間で様々な結合相互作用が起こるだろう。この結果、この進行期間中に固定化成分および流動化成分が分離されなければならない。次に、ストリップを取り出し膜を処理して、確立された方法を用いて固定化されている混合物成分を視覚化するとよい。

以下に実施例を挙げて本発明を例示する。

本発明者らが表面層免疫クロマトグラフィー（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｌａｙｅｒ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＳＬＩＣ）と称するこの新しい免疫クロマトグラフィーシステムの一例では、硝酸セルロース膜の小さい四角片を、確立された方法により、サビナーゼなどの抗原に対する特異抗体で前処理をして、固定化試薬のスポットを作る。この四角片を、粘着表面でプレコートされたプラスチックストリップの表面に貼付ける。その上に、レポーター酵素アルカリホスファターゼで標識した同じ抗体の溶液の乾燥物をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）と共に含浸させた第２のセルロースストリップを貼付ける。この沈着に使用する溶液はトリス（ｐＨ９．３）であり、１０μｌの体積を使用する。この溶液の組成は、０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡ、０．１％ｗ／ｖ ツイーン２０、トリス緩衝液（０．１Ｍ）で１：１０００希釈した酵素標識抗体である。このフォーマットの試薬類は、デシケーター中、室温で保存した場合、少なくとも１４日間はストリップ上で安定である。

アッセイを行うために、トリス緩衝液中のサビナーゼ溶液（０．３ｍｌ）を通常の９６ウェルマイクロタイタープレートなどの試験管に入れる。次に、浸漬ストリップをウェルに入れると、両四角片が試料によって覆われる。濡れることにより、セルロース四角片中の試薬類は、溶液状態になる。次に、この溶液は、密度が高いので、ストリップの表面を層として流れ落ち、最終的に、固定化抗体のスポットを含有する下側四角片を通り過ぎる。ストリップの浸漬から流動相の到達までの期間中に、バルク溶液中のサビナーゼ分子は下側スポット上の固定化抗体によって捕捉されているだろう。流動相が到達すると、溶液がスポット上を流れる際に、通常のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡの場合と同様に、標識抗体が、捕捉された抗原分子に結合する。この第１インキュベーション期間は典型的には１５分間である。

ストリップをウェルから取り出し、よく使用されるアルカリホスファターゼ用基質混合物、すなわちブロモクロロインドリルリン酸（ＢＣＩＰ）およびニトロブルーテトラゾリウム塩（ＮＢＴ）を含有するウェルに入れる。１分間のインキュベーション後に紫／青色が生じ、その強度は第１インキュベーションステップ中にスポット上に捕捉されたサビナーゼの量に正比例し、したがって試料中のサビナーゼの濃度に正比例する。上部四角片も紫／青色に着色する。この分析物について、得られたストリップの走査像を示す。本発明者らが、１２本の上記ストリップを櫛状のフォーマットで使用していることに注目すべきである。なぜなら、これにより９６個までの試料／標準（８×１２）を一つのマイクロタイタープレートで行うことが可能になるからである。ゼロ標準と５ｎｇ／ｍｌ標準との視覚的区別が明確に認められることがわかるだろう。

実施例１と同様に、特異抗体のスポットを持つ硝酸セルロース膜の小さい四角片を、プラスチックストリップの表面に取り付ける。その下に、第２のセルロースストリップ（高速硬質濾紙から０．４×０．６ｃｍの四角片として切り出したもの）を置く。この四角片に、ブルーデキストラン（３％ｗ／ｖ）、デキストラン（２５ｗ／ｖ）溶液［いずれも、アジドを含むｐＨ９．３のトリス緩衝液（０．１％のツイーン２０および０．１５（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含有する）に溶解したもの］中の、レポーター酵素アルカリホスファターゼで標識した同じ抗体の希釈溶液５μｌを含浸させる。適用した溶液を周囲温度で３０分間乾燥させる。高速硬質濾紙の第３の四角片を、第１四角片の上方に貼付けて、アルカリホスファターゼの基質を含浸させる。これは、１％（ｗ／ｖ）ブルーデキストラン、１％（ｗ／ｖ）デキストランおよびＢＣＩＰ−ＮＢＴ原液の混合物１５μの添加によって調製する。それを周囲温度で６０分間乾燥させてから、その四角片を浸漬ストリップに貼付ける。

次に、前もって調製した浸漬ストリップを、０．６ｍｌの標準または試料を含有するマイクロキュベットに加える。１０分後に、青い溶液層がキュベットの底に観察される。ストリップを使ってキュベットの内容物を撹拌する。これにより溶液全体が均等に青く着色する。さらに５分間インキュベートした後、基質緩衝溶液５００μｌを加えて、浸漬ストリップ上の上部四角片が覆われるようにする。最後に１０分間インキュベートした後、ストリップを取り出し、水で洗浄する。

ウサギ抗サビナーゼ抗体をサビナーゼ標準の存在下で捕捉抗体およびキャッピング抗体として使用した場合、上記のプロトコールを従うと、以下のストリップが観察される。

得られた浸漬ストリップを示す。図中、Ａ＝ゼロ標準、Ｂ＝１０ｎｇ／ｍｌのサビナーゼ標準である。

Claims (19)

1. バイオ試薬を含有する固定化成分と相補的バイオ試薬を含有する流動性成分とを含むアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステムであって、固定化成分が浸漬ストリップ上または平面上に担持され、高密度な流動性成分が浸漬ストリップを流れ落ちるようになっていることを特徴とするアッセイシステム。
2. 前記流動性成分がバルク溶液よりも高い密度を持つことを特徴とする、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステム。
3. 前記免疫試薬が抗原または抗体であることを特徴とする、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステム。
4. 前記流動性成分が分画された容量で保持されることを特徴とする、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステム。
5. 流動相の構成要素が生体ポリマー、洗剤および至適ｐＨの緩衝剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステム。
6. 前記固定化成分が前記流動性成分の吸引を引き起こす特性を有することを特徴とする、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステム。
7. 前記流動性成分の前記吸引が膜によって達成されることを特徴とする、請求項６に記載のアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステム。
8. 前記膜が疎水性であり、かつ濡らすことができることを特徴とする、請求項７に記載のアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステム。
9. 前記アッセイが、標識抗原または標識抗体とそれらの相補的非標識対応物との適当な組合せを使用する競合免疫アッセイまたは非競合免疫アッセイであることを特徴とする、請求項３に記載のアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステム。
10. 前記ラベルが蛍光ラベルまたは着色ラベルであることを特徴とする、請求項９に記載のアフィニティークロマトグラフィーアッセイシステム。
11. 請求項１に記載のアッセイシステムの使用を含むアフィニティークロマトグラフィーアッセイの実行方法。
12. 前記浸漬ストリップが緩衝溶液中に実質上垂直に立てられることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記流動性成分が前記浸漬ストリップの上側部分または下側部分に隣接して分配されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
14. 前記方法が分析物混合物の分離を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
15. 前記固定化成分および流動性成分が前記平面に対して異なる結合親和性を持つことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
16. 前記方法が一段階アッセイを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
17. 前記方法が生物学的ポリマーの分離を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
18. 前記生物学的ポリマーがタンパク質およびＤＮＡ／ＲＮＡから選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
19. 実質上、実施例に関して説明したとおりである、アフィニティークロマトグラフィーアッセイシステムまたは方法。

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